JPH07507055A - 眼の創傷の治癒における血小板誘導化成長因子の使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 眼の創傷の治癒における血小板誘導化成長因子の使用発明の背景 本発明は眼の創傷、特に角膜の創傷の治癒（１１合）を刺激するために血小板誘 導化成長因子（ＰＤＧＦ）を使用することに関する。

角膜の創傷は眼への外傷によって頻繁に生起し、例えば自動車事故、工場の事故 、及び兵器が原因の創傷時に起こる場合がある。眼の創傷はまた、白内障の手術 、貫通性角膜移植術、緑内障フィルタリング手術、網膜再装着などの網膜手術、 及びレーザー角膜切断又は放射角膜切開術などの開側手術など、手術時の回避し 得ない結果としても起こる。非癒合角膜潰瘍はまた、糖尿病などの病因的に非外 傷の原因から起こる場合もある。

これらの創傷の治癒は遅（、困難であることが多く、そして外傷又は手術の術後 経過からの回復を複雑にさせることがある。従って、眼の創傷、具体的には角膜 創傷の治癒を促進させる容易な適用方法がめられている。

さらに、角膜創傷の治癒の質は貧弱であることが多く、痕跡形成や他の視覚障害 を引き起こす。従って、角膜創傷の治癒の質を改善できる方法がめられている。

最近、創傷の治癒、特にヒフの治癒を促進させるために成長因子を使用すること に多くの注目が集まっている。成長因子は細胞を遊走させ、分化させ、トンスフ ォーミングさせ、又は成熟させて分裂させる物質である。この因子は、多くの別 個の正常及び悪性の哺乳動物細胞型から普通は単離することのできるポリペプチ ドである。成長因子のなかには、遺伝子操作された細菌（大腸菌（エシェリヒア ・コリ））及び酵母などの微生物から産生され得るものがある。例えば、Ｍｏ１ ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｆｏｕｎｄ 　Ｒｅｐａｉｒ（１９８６）の第１０章及び第１１章を参照のこと［これを引用 によって本明細書に包含させる］。成長因子の中には、表皮成長因子（ＥＧＦ） 、トランスホーミング成長因子α及びβ（ＴＧＦα、ＴＧＦβ３、及びＴＧＦβ ２）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）　、インスリン様成長因子（ＩＧ’Ｆ）、 神経成長因子（ＮＧＦ）　、及び血小板誘導化成長因子（ＰＤＧＦ）などがある 。これらはＲｏｂｅｒｔｓｏｎらの米国特許第４，９３９，１３５号に記載され ている〔これを引用によって本明細書に包含させる〕。

ＰＤＧＦをヒフ及び結合組織の創傷治癒の促進に使用することは研究されている 　［Ａｎｔｏｎｉａｄｅｓら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　 、　Ｕ、　Ｓ、＾、８８：５６５−５６９（１９９１）　G　Ｃｒｏｍａｃｋら 。

Ｊ、　Ｔｒａｕｍａ　３０：５１２９−１３３（１９９０）　ＨＲｏｓｓら、　 Ｐｈ１ｌｏｓ　Ｔｒａｎｓ、Ｒ，Ｓｏｃ、Ｌｏｎｄ、（Ｂｉ盾戟A　）　３２ ７：１５５−１６９（１９９０）］。しかしながら、角膜の状態はヒフや結合組 織とは本質的に相違している。例えば、角膜の上皮は、有意な量のＥＧＦを含有 する涙液によって持続的に洗浄されている。１つの成長因子が存在すれば、他の 成長因子の応答が妨害され、又は干渉され得ると考えられている［Ａｄｅｌｍａ ｎ−Ｇｒｉｌｌら、Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｃｅ１１、Ｂｉｏｌ、　５１：３２２−３ ２６（１９９０）］　。従って、ヒフ又は接合組織とは反対に角膜組織において 働き、他の成長因子の存在下でさえも角膜創傷の治癒を促進するよう働くことの できる成長因子がめられている。

さらに、角膜の神経再支配（ｒｅ−ｉｎｎｅｒｖａｔｉｏｎ）は非常に望ましい ものであるが、治癒期では遅れることが多い。神経再支配が失敗すると、角膜上 皮細胞の維持不全など、機能喪失が起こることがある。従って、角膜創傷治癒を 促進する処置は、神経再支配をも促進するのが望ましい。

概　要 哺乳動物の角膜創傷の治癒の質をＰＤＧＦの適用によって促進及び／又は改善す る方法は上記の要求を満たすものである。この方法は、（１）眼科学的に適合す る血小板誘導化成長因子の溶液を製造し、そして（２）血小板誘導化成長因子を 角膜に適用することによって刺激される角膜の上皮細胞及び／又は角膜実質細胞 の増殖を介して促進される治癒であって、臨床的に検出できるその治癒を促進す るに充分な量の上記溶液を、角膜創傷が生じた時に又はその後に哺乳動物の角膜 に適用すること、を特徴とするものである。

血小板誘導化成長因子はＡＡイソ型、ＡＢイソ型、ＢＢイソ型、及びそれらの混 合物から選択することができる。好ましくは、血小板誘導化成長因子はＢＢイソ 型である。

１つの好ましい態様では、血小板誘導化成長因子は、以下の１１９アミノ酸のる ： 上記の溶液剤中における血小板誘導化成長因子の濃度は約１０＊ｇ／ｍｌから約 １１０００Ｉ１／諺ｌとすることができる。好ましくは、約５０ｔｇ／露ｌがら 約５００ｕｇ／ｍｌの濃度である。最も好ましくは、約１００ｇｇ／ｍ１の濃度 である。

上記の溶液剤は、角膜の創傷が生じた後に角膜へ少な（とも１回又はそれ以上適 用することができる。好ましくは、１回から３回、例えば創傷が生じた約２時間 、約８時間、及び約２４時間の後に溶液剤を適用する。あるいは、溶液剤は角膜 創傷が生じた時に角膜に１回又はそれ以上適用することができる。

その創傷は外科的レーザーの作用によって引き起こされ、又は糖尿病の結果であ る場合がある。

臨床的に検出できる治癒には角膜創傷治癒の質の改善がある。角膜創傷治癒の質 の改善には、再発性角膜潰瘍での上皮の異常な面皮形成における臨床的に検出で きる減少、又は痕跡形成の臨床的に検出できる減少、又はその両者が包含され得 る。

ＰＤＧＦの適用はさらに、少なくとも角膜上皮の部分を神経除去する角膜創傷が 生じた後の角膜上皮における臨床的に検出できる神経再支配をも促進することが できる。ＰＤＧＦは、角膜上皮の臨床的に検出できる神経再支配を促進するに充 分な量で適用する。このことはＰＤＧＦ処置が有している予想外の効果の１っで ある。

本発明は別の態様として、角膜創傷治癒の質を促進及び／又は改善するための哺 乳動物の角膜に適用する医薬組成物であって、（１）水、 （２）少なくとも約１０μｇ／Ｉ７！の血小板誘導化成長因子を含有する眼科学 的に適合する血小板誘導化成長因子の溶液、及び（３）そのｐＨを約５から約８ の範囲内に調節する緩衝液、を含有する組成物を提供する。この組成物は投与単 位剤形であることができる。

本発明は別の態様として、角膜創傷治癒の質を促進及び／又は改善するための哺 乳動物の角膜に適用する医薬組成物の調製用錠剤であって、（１）創傷治癒の質 を促進及び／又は改善するに充分な血小板誘導化成長因子の量、及び （２）　このような錠剤を製造するのに適している眼科学的に許容される非毒性 の賦形削、 を含有する錠剤を提供する。

図面の簡単な説明 上記した、及び別の本発明の特徴、局面及び利点は以下の説明、添付の請求の範 囲及び次に説明する添付図面を参照することによって容易に理解されるであろう ： 第１図は哺乳動物の角膜を模式図によって説明するものであり、角膜及び上皮の 神経支配から構成される層を示している。

第２図は、角膜再上皮形成の促進における種々の型のＰＤＧＦ及びＥＧＦなどの 成長因子の処置の結果を示すグラフであり、ここでは、残っている創傷領域のバ ーセンテイジを時間に対してプロットしている（ＰＢＳ＝リン酸緩衝化食塩水の 対解く成長因子無し））。

第３図は、最初の手術の７１Ｐ！間後における第２図の結果を表す棒グラフであ る。

第４図は第２図のように、角膜の再上皮形成を促進させる１００５ｇ／ｍ／及び １０ｕｇ／ｘｉのＢＢイソ型ＰＤＧＦによる処置の結果を示すグラフである。

第５図は第２図のように、角膜の再上皮形成を促進させる１０ａｇ／ｍ／の種々 のイソ型ＰＤＧＦによる処置の結果を示すグラフである。

第６図は前角膜切除術の後に治癒を促進させる種々のイソ型ＰＤＧＦ及びＥＧＦ による処置の結果を示すグラフであり、ここでは残りの創傷領域のパーセンテイ ジを時間に対してプロットしている。

第７図は前角膜切除術の後に治癒を促進させる１００μｌのＢＢイソ型ＰＤＧＦ による処置の結果を示す同様のグラフである。

第８図は、最初の手術の７１時間後における第６図の結果を表す棒グラフである 。

第９図は、角膜の引張応力を増大させるＰＤＧＦ処置の結果を表す棒グラフであ る。

第１０図は、角膜の引張強度の別の測定値である角膜組織の分裂時間を増大させ るＰＤＧＦ処置の結果を表す棒グラフである。

第１１図は、応力及びひずみに抗する角膜組織の抵抗能を増大させるＰＤＧＦ及 びＥＧＦ処置の結果を表す棒グラフである。

第１２Ａ図は、手術の９日後の対照角膜の切片の光学顕微鏡写真である。

第１２Ｂ図は、１００１１ｇ／１１のＢＢイソ型ＰＤＧＦを手術後の最初の２４ 時間経過後に３回投与した場合の、手術の９日後の角膜の切片の光学顕微鏡写真 である。

第１３図は、コラーゲン収縮の原因である線維芽細胞の活性化に対するＰＤＧＦ の効果を測定するためのｉｎ　ｖｉｔｒｏゲル収縮検定において、種々の用量の ＰＤＧＦで処置した結果を示す棒グラフである。

第１４図は、実施例１にて説明する、大腸菌発現ベクターｐｃＦＭ１１５６にお いてｒＰＤＧＦ　Ｂｕｓを発現させるのに使用したＤＮＡ配列、及び得られたｒ ＰＤＧＦ　ＢＢｅのタンパク質配列のダイアグラムである。

説　明 本発明者らは、血小板誘導化成長因子（ＰＤＧＦ）を哺乳動物の角膜の創傷に適 用すると、その創傷の治癒が実質的に促進することを発見した。

天然のヒトＰＤＧＦはダイマーを形成する２つのポリペプチド鎖から構成される 。２つの鎖とは１２４アミノ酸から構成されるＡ、ＩＩと１６０アミノ酸から構 成されるＢ鎖である。各鎖はノスティン残基を有しており、それらはジスルフィ ド結合を介して結合している。鎖は別個に同定され、配列決定された［Ｗａｔｅ ｒｆｉｅｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ　３０４：３５−３９（１９８３）　ＨＤｏｏｌ ｉｔｔｌｅら、５ｃｉｅｎｃｅ　２２１：２７５−２７７（１９８３）　F　Ｂ ｅｔｓ ｈｏｌ　ｔｚら、Ｎａｔ、ｕｒｅ　３２０：６９５−６９９（１９８６）　＋　 １ｅｉｃｈら、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、１９８：３４４−３４W（１９８６） ：　Ｒｏｐｐｅら、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　２２３：２３４−２４６（１９８ ７）］　。活性な成長因子は２つの鎖、ＡＡ又はＢＢホモダイマー又はＡＢヘテ ロダイマーの組合わせ体として組み立てられ得る。これら種々の組合わせ体はイ ソ型と呼ばれる。

異なるイソ型は別個のクラスのＰＤＧＦレセプターと結合し［Ｂｏｖｅｎ−Ｐｏ ｐｅら。

Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６４：２５０２−２５０８（１９８９）］　、そ れらが作用する細胞上において別個の働きをする［５ａｃｈｉｎｉｄｊｓら、　 Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６５：１０２３８−１０２４３（１９９０）］− 各レしプターは１つのサブユニット及び１つのみのサブユニットとしか結合せず 、従って１つのダイマーＰＤＧＦ分子は２つのレセプター分子と結合することが できる［５ａｃｈｌｎｉｄｉｓら、前掲〕。

創傷の治＄を促進する基本的な方法は、（１）眼科学的に適合する血小板誘導化 成長因子（ＰＤＧＦ）の溶液を製造し、そして（２）血小板誘導化成長因子を角 膜に適用することによって刺激される角膜の上皮細胞及び／又は角膜実質細胞の 増殖を介して促進される治癒であって、臨床的に検出できるその治癒を促進する に充分な量の上記溶液を、角膜創傷が生じた時に又はその後に哺乳動物の角膜に 適用すること、を特徴とするものである。

ＰＤＧＦを角膜に適用すると、促進治癒の質も改善させることができる。ＰＤＧ Ｆが基底膜成分の上皮分泌を誘発させる事実があるゆえに、治癒の質が改善され るであろうが、これは、癒合後の再発性角膜潰瘍における異常な上皮面皮形成の 減少などから測定される。さらに、切開術後の角膜組織学はコラーゲン修復率の 増大を示すが、これは活性化された多数の角膜実質細胞が切開部分の回りに存在 することによって示され、このことが形成される痕跡の減少を導（のであろう。

従って、「創傷治癒の質」なる用語は本明細書では、再発性角膜潰瘍における異 常な上皮面皮形成の臨床的に検出できる減少、痕跡形成の臨床的に検出できる減 少、又はその両者のいずれかによって定義される。

特に重要なことは、ＰＤＧＦを適用すれば、角膜の構造的完全性及び機能を保護 するうえで重要である角膜上皮の神経再支配をも促進できる事実である。創傷後 の眼表明に角膜の神経支配及び感覚が復帰することは、角膜上皮の維持にとって 重要である。上皮創傷後の眼表面領域の神経再支配は以後、上皮障害の修復と関 係すると考えられる。従って、角膜の神経再支配は、上皮が速く治癒した角膜に おいてより速く修復される。

角膜上皮を神経支配する神経を含む角膜のダイアグラムを第１図に示す。上皮を 除去するといっても起こるようにこの神経を切断すると、角膜の治癒は大きく制 限され得る。

■、眼科学的に適合する溶液剤 Ａ、血小板誘導化成長因子 「血小板誘導化成長因子Ｊ　（ＰＤＧＦ）なる用語は本明細書では、天然のヒト ＰＤＧＦのあらゆるイソ型と同じ生理学的活性を実質的に有する、起源を問わな いあらゆるポリペプチド又はポリペプチドの複合体を意味するために使用してい る。ＰＤＧＦは当業界にて実施される方法によって製造することができる：例え ば、ヒト又は動物組織からの単離、固相ペプチド合成などの化学的合成、及び細 菌、酵母又はＰＤＧＦを産生するように遺伝子操作された培養セルラインによる 生産が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＤＧＦなる用語はさらに、以下 の変異体も包含しているが、これらに限定されない＝（１）天然に存在するＰＤ ＧＦとはグリコリル化パターンが異なっているＰＤＧＦの変異体、（２）化学修 飾したＰＤＧＦの誘導体、（３）天然のヒトＰＤＧＦと配列を比較した場合に１ つ又はそれ以上のアミノ酸置換、付加又は欠失を有する遺伝子操作されたＰＤＧ Ｆ活性を有する分子、例えばシスティン残基が他のアミノ酸残基に変換された突 然変異体、及び天然のヒトＰＤＧＦとは異なるアミノ酸残基の数を有する分子な ど、及び（４）　ＰＤＧＦに関与するポリペプチドが他の異種タンパク質、例え ば細菌又は酵母タンパク質と融合されている融合タンパク質。具体的には、以下 の組換え分子が本明細書にて使用するＰＤＧＦの定義に包含される：（１）ｖ− ｓｉｓを発現するのに従来使用されている発現系によって酵母から産生される、 いわゆる「内皮型」の、各鎖が１１０アミノ酸残基を有しているＡＡイソ型の変 異体［Ｋｅｌｌｙら、　ＥＩＩＢＯＪ、　４：３３９９−３４０５（１９８５） 　；Ｃｏ１１ｉｎｓら、　Ｎａｔｕｒｅ３２８：６２１−６２４（１９ｇ？）　 ；　Ｔｏｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ　３２８：６１９−６２１（１９８７）］　；（ ２）以下の実施例１及び２に、及びＴｈｏ＋＊ａｓｏｎのＰＣＴ出願番号ＷＯ９ １１０８７６１（これを引用によって本明細書に包含させる）に記載されている ようにして大腸菌から産生される、１１９アミノ酸の組換え誘導した再折りたた みＢ鎖ホモダイマー：及び （３）遺伝子的に操作した酵母から産生される、各鎖が１０９アミノ酸残基を有 しているＢＢイソ型の変異体［Ｋｅｌｌｙら、前掲］。

ＰＤＧＦはＡＡイソ型、ＢＩ３イソ型、ＡＢイソ型、又はそれらの混合物である ことができる。好ましくは、ＰＤＧＦはＢＢイソ型である。

ＰＤＧＦの特に好ましい型は以下の配列を有する１１９アミノ酸の組換え的に誘 導される再折りたたみＢ鎖ホモダイマーである。

５−Ｌ−Ｇ−５−Ｌ−Ｔ−ニー八−Ｅ−Ｐ−Ａ−Ｍ−Ｐ−Ｐ−Ｃ−Ｖ−Ｅ−Ｖ− Ｑ−Ｒ−Ｃ−Ｓ　−Ｇ　−Ｃ−Ｃ−Ｎ−Ｎ−Ｒ−Ｎ−Ｖ−Ｑ−Ｃ−Ｒ−Ｐ−Ｔ− Ｑ−Ｖ−Ｑ−Ｌ−Ｒ−Ｐ−Ｖ−Ｑ−Ｖ−Ｒ−に−ニーＥ−１−Ｖ−ｆｔ−に−に −Ｐ−１−Ｆ−に−に−Ａ−Ｔ−Ｖ−Ｔ−Ｌ−Ｅ−Ｄ−Ｈ−Ｌ−ＡｍＣ−に−Ｃ −Ｅ−Ｔ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｐ−Ｖ−Ｔ−Ｒ−５−Ｐ−Ｇ−Ｇ−５−Ｑ−Ｅ −Ｑ−Ｒ１このＰＤＧＦの型は以下では［ｒｐＤＧＦ　ＢｕｓＪと一般に呼称す るが、これはインビトロ突然変異誘発を受けたｖ−ｓｊｓの発現によって生産さ れる。インビトロ突然変異誘発により、ｖ−ｓｉｓタンパク質に見いだされるア ミノ酸の６．７．１０１．１０７、及び１１４位のアミノ酸残基をヒトＰＤＧＦ のＢヒト鎖に見いだされるアミノ酸と置換し、１２０位に終止コドンを挿入する 。次いで、得られた突然変異遺伝子を大腸菌用の発現ベクター、ｐｃＦＭ１１５ ６に挿入し、ｒＰＤＧＦ　Ｂ＋＋ｓを発現させる。次いで、ブロッキング剤とし てグルタチオンを使用し、発現されたＰＤＧＦをダイマーに再折りたたみする。

さらに詳細なｒＰＤＧＦ　Ｂ＋＋ｓの製造は以下の実施例１及び２にて説明する 。

所望のｒＰＤＧＦ　Ｂｕｓを入手するための遺伝子構築物は、当業者に知られて いるＰＤＧＦ　Ｈの多くの組換え生産方法のいずれかを改変することによって、 製造することができる。例えば、ｖ−ｓｉｓ遺伝子をまず改変してヒト対応物Ｃ −５ｉｓを入手し、又はそのｃ−ｓｉｓを出発物質として使用し、次いで１１１ 位から１６０位のいずれかのアミノ酸位置に終止コドンを置換した後、所望の宿 主細胞をトランスフェクトする。終止コドンは、先に存在するコドンの部位特異 的突然変異誘発によって、ｃ−ｓｉｓ又は改変ｖ−ｓｉｓ前駆タンパク質コード 化配列内に設置するのが好ましい。

あるいは、前駆タンパク質をコードする配列を合成するか、又はｃ−ｓｉｓ遺伝 子もしくは改変ｖ−ｓｉｓ遺伝子からまずカルボキシ末端付近の適当な制限部位 を削除（カットバック）し、次いで、使用する特定のベクター及び宿主細胞系に とって好ましいコドンを使用して、前駆タンパク質コード化配列のカルボキシ末 端を再構築して所望の終末位置（約１１１から約１６０）とする。Ｔｈｅｅｃ− ｓｉｓ遺伝子又は改変ｙ−ｓｉｓ遺伝子も、ここでも選択するベクター及び宿主 細胞系にとって好ましいコドンを使用し、アミノ末端付近の適当な制限部位で切 断してもよく、そのアミノ末端を所望の開始位置にまで切断する。天然に存在す る出発物質又は合成出発物質、又はそれらの組合わせ物を使用するかに関係無く 、終止コドンは、前駆タンパク質コード化配列の所望のカルボキシ末端アミノ酸 の後、即ち約１１１から１６０位のアミノ酸位置のいずれかの後に設置しなけれ ばならない。

組換えＰＤＧＦを入手するための好ましい方法では、ｖ−ｓｉｓ遺伝子をＣ−５ ｉｓ遺伝子が入手されるように改変し、次いで、又はそれと同時に、終止コドン を改変遺伝子の所望の位置に配置させる。次いで、その終止コドンを含有するＣ −５ｉｓ前駆タンパク質のコード化配列をベクターに挿入し、それを所望の原核 生物宿主細胞をトランスフェクトするために使用する。

より好ましくは、組換えＰＤＧＦを入手するために使用する前駆タンパク質コー ド化配列はｃ−ｓｉｓ遺伝子の同族体である。ｃ−ｓｉｓ同族同族体前駆タンパ ク−コード化配列大腸菌宿主細胞にて発現させるために好ましいコドンを含有す るよう構築すればよい。ｃ−ｓｉｓ遺伝子の同族体は、部位突然変異誘発するこ と及び、適当なタンパク質分解開裂部位に存在する末端をタンパク質開裂した後 、ｃ−ｓｉｓと合成カルボキン及びアミノ末端とを連結することの両者によって 入手することができる。

ｖ−ｓｉｓ遺伝子は、組換えＰＤＧＦを入手するための前駆タンパク質被覆配列 を入手するための良好な出発物質である。例えば、１−１１９アミノ酸をコード する領域では、ｖ−ｓｉｓ遺伝子が組み込まれているタンパク質とｃ−ｓｉｓを コードするＰ　Ｄ　Ｇ　Ｆ　＋　＋　＊前駆タンパク質との間では５つのアミノ 酸の相違しか存在しない。これら５つのアミノ酸のうち、ｖ−ｓｉｓ遺伝子にお ける２つはインビトロ突然変異誘発手法によって改変することにより、２つのア ミノ酸がＰＤＧＦ　Ｂ、、、前駆タンパク質における対応する残基と同じである タンパク質をコードするＤＮＡ配列を創製することができる。コドン１０１及び １０７に所望の変化を導入するには、ＤＮＡのインビトロ突然変異誘発の多くの 方法を利用することができる。このような方法は当業者に周知である。例えば、 アメルンヤン［＾ｒ１ｉｎｇｔｏｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ、イリノイ］の「オリゴヌ クレオチド特異的インビトロ突然変異誘発系」キットのための教示パンフレット に記載されているＥｃｋｓｔｅｉｎ及びその共同研究者の方法［Ｔａｙｌｏｒら 、　Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、１３：８７６４−８７８５（１９８５）　 ；　Ｎａｋａｍａｙｅ　＆　Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ ｓ、　１４：９６７−９６９（１９８６）］は、アミノ酸１０１のイソロイシン 残基をスレオニン残基に、及びアミノ酸１０７のアラニン残基をプロリン残基に 変換するうえで特に有用である。

次いで、アミノ酸１０１及び１０７のインビトロ突然変異誘発の後、アミノ酸２ ４に相当する位置で切断する制限酵素ＢｇｌＩＩによって改変ｖ−ｓｉｓＤＮＡ のアミン末端を削除する。最初の２４アミノ酸を包含するその遺伝子の上流部分 は、下流のＢｇｌｎ切断突然変異ｖ−ｓｉｓＤＮＡを以下のいずれかをコードす る合ｌＤＮＡ断片と連結することによって回復させることができる：（１）ＡＴ Ｇ翻訳開始コドン：（２）アミノ酸１のセリン残基、及び（３）　ｃ−ｓｉｓコ ード化前駆タンパク質の最初の２４アミノ酸の残り。この方法では、他の３つの 変異体アミノ酸のうちの２つ、即ちアミノ酸６のセリン残基、及びアミノ酸７の バリン残基がヒトＰＤＧＦ　Ｂにおけるそれらの位置に存在するアミノ酸（それ ぞれスレオニン及びイソロイシン）に変換され、ｖ−ｓｉｓによってコードされ ている上流の前駆アミノ酸は除去される。

同様の方法によってカルボキン末端から削除することにより、アミノ酸１１４が 改変され、そして同時にアミノ酸１２０が終止コドンと置き換わっている合成断 片とそのカルボキシ末端とを置換できる。好ましくは、突然変異されたＶ−Ｓｉ ｓＤＮＡを、アミノ酸１１２に相当する位置で切断する制限酵素Ｓｍａｌで切断 する。次いで、Ｐ　Ｄ　Ｇ　Ｆ　Ｂ　＋　＋　ｅ前駆タンパク質の１１２−１１ ９アミノ酸及び１２０位の翻訳終止コドンをコードする合成りＮＡ断片をＳｍａ ｒ切断した突然変異ｖ−ｓｉｓＤＮＡと連結させればよい。得られた合成りＮＡ もアミノ酸１１４にてスレオニン残基に代わってグリシン残基をコードしており 、５番目の変異アミノ酸がＰＤＧＦ　Ｂ、、、前駆タンパク質内の対応するアミ ノ酸に変換されている。

前駆タンパク質のコード化配列の最終ＤＮＡ構築物は、ＰＤＧＦ　Ｂのアミノ酸 １−１１９とＮ末端における付加的なメチオニン残基とを要求する。このＰＤＧ Ｆ　Ｂ、、、遺伝子はｐｃＦＭ１１５６などの適当な発現ベクター内に連結すれ ばよく、次いでそれを適当な宿生細胞系に形質転換又はトランスフェクトし、好 ましくは大腸菌宿主細胞などの原核生物に行い、そうすればＮ末端メチオニンは その宿主細胞内の生合成後にインビボにて除去される。（ある種の大腸菌株はＮ 末端メチオニンを除去できないので、そのアミノ酸末端に付加的なアミノ酸残基 を含有する組換え産物が産生される。） このような組換えＰＤＧＦ　Ｂを生産するための好ましい発現系は、上記の原核 生物細胞培養系を、好ましくは大腸菌を包含するものである。

組換えＰＤＧＦ同族体をクローニングし発現するための遺伝子操作方法は、１９ ８９年１２月１９日出願の米国特許出願第４５４．７９４号、及び１９９０年１ ２月１３日出願の第６２４．４５１号に開示されており、これらは引用によって 本明細書に包含される。

本発明にて有用であるｒＰＤＧＦ　Ｂ同族体は、当業者に既知の多くの方法のい ずれかによって、得られた宿主細胞培養ペーストがら単離し、再折りたたみし、 精製することができる。好ましい再折りたたみの方法は米国特許出願第４５１゜ ４８５号に記載されており、これは引用によって本明細書に包含される。

好ましい再折りたたみの方法では、ジスルフィドのブロッキング剤を使用してモ ノマー性の混合ジスルフィド中間体を創製し、それにより還元され、かつ折りた たまれていないモノマーｒＰＤＧＦの遊離スルフヒドリルをブロックする。これ により、還元ｒＰＤＧＦのスルフヒドリル基が単離及び精製の際にジスルフィド 結合を成熟前に形成するのを防止する。同時に、この改変により、ｒＰＤＧＦ中 間体が水溶液に溶解するようにする。この溶解性の結果として、選択する水性１ 墳に存在する力を使用することによって、ブロックされたモノマー中間体がその 生物学的に活性なコンホメーションをとるようにすることができ、次いで非ブロ ッキングが起こり得る。通常、非ブロッキングによってダイマー型のＰＤＧＦが 生成され、このダイマー内では、所望の鎖内及び鎖間ジスルフィド結合の形成に よってダイマー構造が適所で［ロック（ｌｏｃｋ）Ｊされる。

Ｂ　即 眼科学的に適合する溶液剤内でのＰＤＧＦの濃度は、約１．０μ１ｇ／ｍｆがら 約１００ｕｔｚ／ｍｌとすることができる。好ましくは、その濃度は約５０μｇ ７ｍｌから約５００μｇｈｌである。最も好ましくは、ＰＤＧＦの濃度は、１０ ０μｇ／票ｌである。

ＰＤＧＦを含有する眼科学的に適合する溶液剤は好ましくは、水中で製造する。

この溶液剤はイオン性又は非イオン性の生理学的に許容される界面活性剤、及び 通常の保存剤、抗−細菌又は抗−真菌剤も含有することができる。例えば、この 溶液剤はエタノール、グルセロール、ヒドロキシメチルセルロール、プロピレン グリコール、ポリエチレングリコール、ポリオキンエチレンソルビタン、又は植 物油を含有することができる。通常の抗−細菌、抗−真菌又は保存剤としては、 パラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどを 挙げることができる。これらの成分のすべては、眼にとって眼科学的に許容され る濃度で存在する。さらに、緩衝液を使用し、生理学的ｐＨ又はそれよりも若干 低いｐＨ１即ち約５から約８までの範囲のｐＨ内にその組成を維持させることが できる。緩衝液はホウ酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、重炭酸塩、又はトリス塩酸 などとすることができる。この溶液剤は、塩化ナトリウム及び／又は糖などの通 常の浸透圧的に活性な材料を添加することによって等張にすることができる。溶 液剤には、アルブミンなどのタンパク質担体又は安定化剤を含有する他の安定化 剤を含有することができる。溶液剤はさらに、ラノリン誘導体及び／又は他の油 などの緩和薬（ｅｍｏｌｌｉｅｎｔｓ）を保証し、適用を簡便かつ容易にし、ま た寛容性を増大させることができる。この溶液剤はまた、感染を制御するために 抗生物質を含有することもできる。

本発明の別の聾様は、哺乳動物の角膜に適用する、創傷治癒の質を促進及び／又 は改善するための医薬組成物である。この組成物には、上記の眼科学的に適合す る溶液剤、又は活性成分もしくは活性成分群、即ち創傷治癒の質を促進及び／又 は改善するに充分な血小板誘導化成長因子の量を、錠剤を製造するために適して いる非毒性の眼科学的に許容される賦形剤を含有する錠剤が包含される。この溶 液剤は投与単位剤形で調製することができる。錠剤にとっての賦形剤としては、 炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム又は重炭酸ナトリウム、乳酸、又はリン酸カル シウムなどの不活性希釈剤、デンプン、ゼラチン又はアラビアガムなどの結合剤 、及びステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、又はタルクなどの滑沢剤が挙 げられ、これらはＰＤＧＦ及び他の成分と共に含有される。上記の錠剤は、その 錠剤を水、エタノールを混合した水又は池の適当な液体に溶解することにより角 膜適用に適したＰＤＧＦの眼科学的に適合する溶液剤が調製できるように、前調 製することができる。錠剤中のＰＤＧＦの濃度は、錠剤を溶解して溶液剤を調製 すると、その溶液剤中のＰＤＧＦの濃度が上記の濃度限界内となるような濃度で ある。

１１、ＰＤＧＦ溶液剤の適用 本発明において角膜の創傷治癒を促進させる方法を実施するには、臨床的に検出 できる治癒を促進するに充分な量の溶液剤を、角膜創傷が生じた時、又はその後 に哺乳動物の角膜に適用する。治癒は、血小板誘導化成長因子を角膜に適用する ことによって刺激される角膜の上皮細胞及び／又は角膜実質細胞の増殖を介して 促進される。好ましくは、眼科学的に適合するＰＤＧＦの溶液剤は角膜の神経再 支配をも促進するように適用する。通常、溶液剤は約１０から約５００μｌの量 を角膜に直接適用するが、好ましくは約５０μｌである。適用する溶液剤の量及 びその溶液剤中のＰＤＧＦの１度は、眼及びスリットランプを用いる写真術の評 価ならびに９者の臨床観察事項に基づくなどして、当業者が容易に決定できる。

溶液剤は角膜に多数回適用することができる。好ましくは１又はそれ以上適用す る。より好ましくは、１から３回適用する。この適用は創傷が生じる、又は手術 操作の約２時間後、約８時間後、及び約２４時間後に行うことができる。

本発明の手法は、基底膜が無傷のままである上皮露出（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　 ｄｅｎｕｄｅＩＩｅｎｔ）の場合、及び基底膜が除去されている前角膜切開術の 後においても使用することができる。本発明の方法はさらに、切開などの支質創 傷の処置にも使用することができる。

具体的には、本発明の手法は、眼への外傷に起因する創傷、及び外科的レーザー の適用などの外科処置に起因する創傷の創傷治癒の質を促進し及び／又は改善す るために使用することができる。この外科処置には、白内障の手術、貫通性角膜 移植術、緑内障フィルタリング手術、網膜再装着などの網膜手術、及びレーザー 角膜切断又は放射角膜切開術などの開削手術などの手術が含まれる。本発明の手 法はまた、糖尿病の非癒合角膜潰瘍などの病因的に非外傷の原因から起こる損傷 の創傷治癒の質を促進及び／又は改善するために使用することもできる。

基底膜の存在又は不存在及び角膜の障害又は創傷の程度によって、ＰＤＧＦの用 量を調節する必要のある場合がある。これは、上記の手法に従って行うことがで き、当業者の技術常識の範囲内である。同様に、少な（とも角膜上皮の部分が神 経除去される角膜創傷が生じた後に、上記の手法に従ってＰＤＧＦにより角膜を 処置すれば、臨床的に検出できる角膜上皮の神経再支配を促進させることができ る。

以下に実施例を挙げて、本発明を例示する。これらの実施例は単なる例示を目的 とするものであり、いかなる意味においても本発明の範囲の限定を意図するもの でない。

第１４図に示すＰＤＧＦ　Ｂｌ□をコードする前駆タンパク質コード化配列は出 発物質としてｖ−ｓｉｓ遺伝子を使用して構築した。

アミノ酸１０１及び１０７の変換 サル肉腫ウィルスのレトロウィルス遺伝子のクローンであるプラスミドｐＣ６０ ［Ｗｏｎｇ−３ｔａａｌら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２１３：２２６−２２８（１９ ８１）１１μｇを制限酵素５ａｉｌ及びＸｂａＴによって消化し、次いで得られ た１１８３塩基対の断片を、ｋｌａｎｉａｔｉｓら。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ 、コールド０スプリング０ハーバ−０ラボラトリ−＜１９８２）に記載されてい る手法に従って、低融解温度アガロースゲル中の電気泳動分離によって精製した 。次いで、精製した断片をそのゲルから切り出した。同時に、Ｍ１３ｍｐ１９　 ＤＮＡ０．２μｇも５ａｉｌ及びＸｂａｌで消化し、大きな７２４５塩基対のバ ンドを低融解ゲルから同様に切り出した。切り出したゲル切片を共に６５℃で融 解し、次いで３７℃に冷却した。大きな７２４５塩基対のＭ１３ｍｐ１９断片を 含有するゲル及び１１８３塩基対ｖ−ｓｉｓ断片を含有するゲルの１／４を混合 し、５ｔｒｕｈｌ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、　３：４５２−４５３（１ ９８５）に従って連結した。連結したＤＮＡをＥ、ｃｏｌｉ　（大腸菌）Ｋ１２ 株ＰＣＩに形質転換し、液体培養中にてＭ１３ベクターの明瞭なプラークを選択 し増殖した。Ｍ１３ｍｐ１９ベクター内における１１８３塩基対ｖ−ｓｉｓ断片 の存在は、ファージＤＮＡの２本鎖複製型（ＲＦ）の調製及び制限断片地図分析 ［１１ｅｓｓｉｎｇら、　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　９：３０９−３２ １（１９８１）］によって確認した。

このようにして入手したＭ１３ｍｐ１９／ｖ−ｓｉｓファージを液体培養中にて 増殖させ、１本ＩＪＩＤＮＡを単離した（Ｍｅｓｓｉｎｇら、前掲）。このＤＮ Ａを、オリゴヌクレオチド特異的インビトロ突然変異誘発の鋳型として使用し、 １０１及び１０７残基のアミノ酸をヒトＰＤＧＦ　Ｈの対応するアミノ酸に変換 した。この工程の最初の段階では、イソロイシン１０１をコードするＡＴＡコド ンをスレオニンをコードするＡＣＡに変換し、さらにアラニンをコードするＧＣ ＴコドンをプロリンをコードするＣＣＴに変換した。

Ｍ１３ｍｐ１９／ｖ−ｓ　ｉｓ１本鎖重鎖Ａ１０μｇを以下の配列を有するリン 酸化オリゴヌクレオチド８ｐＩＩＯ１とアニーリングした：５’ＧＧＴＣＡＣＡ ＧΩＣＣＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＣＡＣＴΩＴＣＴＣＡＣＡＣ３’、−ノ配列は、 Ｄｅｖａｒｅら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　＋１．３ ．　Ａ、　７９巻、　ｐｐ３１７９−３１８Q．１９８ ２のナンバー系を使用するｖ−ｓｉｓ遺伝子のヌクレオチド４２８３−４３１６ と相同的である。このオリゴヌクレオチド内の下線を引いた塩基はｖ−ｓｉｓ配 列からヒトＰＤＧＦ　Ｂ配列への変化を示している。突然変異オリゴヌクレオチ ド上でＤＮＡ合成を開始し、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼ１のクレノー断 片を用いてチオヌクレオチド三リン酸を使用し、次いでＴ４ＤＮＡリガーゼで連 結させることにより完全な突然変異体ストランドを合成した。残った１本鎖鋳型 Ｍ１３ｍｐ　１９／ｖ−ｓ　ｉ　ｓ　ＤＮＡはニトロセルロースフィルターによ る濾過により取り出した。突然変異されていないストランドは制限エンドヌクレ アーゼＨｉｎｄ■とのインキュベートにより切れ目を入れる。次いで、切れ目の 付いた突然変異されていないストランドを、上記の突然変異ストランドを鋳型と して用いてデオキ／ヌクレオチド三リン酸により再重合化した。その結果、最終 産物の両ＤＮＡストランドには所望の突然変異が含有されていた。このＤＮＡを Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｋ　１２株ＴＧ１に形質転換した。プラークを選択し、液体培 養中にて増殖させ、１本鎮ＤＮＡを単離した。Ｓａｎｇｅｒら、　Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、υ、Ｓ、＾、、　７４：５４６３−５４６ ７（１X７ ７）のノデオキシヌクレオチド三リン酸方法によって、得られたＤＮＡの配列決 定を行い、所望の突然変異が含有されていることを確認した。

アミノ酸６及び７の変換 次の工程では、ｖ−ｓｉｓタンパク質内の６及び７位の位置に存在するアミノ酸 由来のアミノ酸６及び７がヒトＰＤＧＦ　Ｂ内に存在するアミノ酸に変化してい る合成りＮＡ断片と、突然変異ｖ−ｓｉｓ遺伝子の５′部分とを置き換えた。

この合成断片はヒトＰＤＧＦ　Ｂのセリン１のコドンの直前にある翻訳開始ＡＴ Ｇコドン、ならびにＥ、ｃｏｌｉ　リポゾームと結合するための提示配列及び以 下に記載する所望のＥ、ｃｏｌｉ発現ベクターへの連結のための制限部位をも提 供した。この合成りＮＡ断片は、Ｄｅｖａｒｅら、前掲のナンバーリング系にお けるｖ−ｓｉｓ遺伝子のヌクレオチド４０６１に位置するＢｇｌｎ部位に配置さ せた。

Ｍ１３ｍｐ１９ベクター内に存在するＢｇｌｎ部位はこの工程とｖ１維に絡んで おりこの工程を妨げるので、突然変異ｖ−ｓｉｓ遺伝子をまず、ＢｇｌＩＩ部位 を含有しない市販されているプラスミドベクターｐｔＪｃ１８に移動させた。Ｍ １３ｍｐ１９／ｖ−ｓｉｓ突然変異ＲＦ　ＤＮＡを５ａｉｌ及びＢａｍＨｌで制 限し、得られた１１９３塩基対の断片を低融解温度アガロースゲルを使用する電 気泳動によりて単離した。この断片を、これも事前に５ａｉｌ及びＢ鉗Ｈ１で制 限しておいたプラスミドｐＬ’ｃ１８と連結した。得られた連結ＤＮＡを市販の Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２株ＤＨ５に導入し、得られた形質転換体をアンピシリン の存在下に発育させることで選択した。コロニーを選択し、液体培養中で発育さ せた。単離したプラスミドＤＮＡを、ｖ−ｓｉｓ挿入体の存在に関して制限マツ ピングで分析した。

ｐＵｃ１８／ｖ−ｓ　ｉｓ突然変異ＤＮＡを、突然変異ｖ−ｓｉｓ挿入体の直上 流のｐＵｃ１８のポリリンカー内を切断する）（ｉｎｄＩ［＋で制限し、また、 成熟タンパク質産物のアミノ酸２４に相当する、Ｄｅｖａｒｅらのナンバーリン グ系のヌクレオチド４０６１のｖ−ｓｉｓＤＮＡ内を切断するＢｇｌｍで制限し た。この制限によって得られた大きな３５６５塩基対断片を低融解温度アガロー スゲルの電気泳動によって単離した。この断片を以下の配列を有する合成２重鎖 ＤＮＡ断片と連結した： この合成りＮＡ断片はその上流（左側）末端にＨｉｎｄｌＩ［の「粘着」末端を 、その下流（右側）末端にＢｇｌＨの「粘着」末端を含有している。さらに、Ｘ ｂａ１部位（ＴＣＴＡＧＡ）が合成りＮＡ内のＨｉｎｄｌ［Ｉ　ｒ粘着」末端の 直下流に存在しており、このことは、以下に説明するように、発現ベクターのＸ ｂａ１部位への連結のためのＸｂａｌによる以後の制限を可能にしている。

得られた連結ＤＮＡをＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２株ＤＨ５に導入し、アンピシリン 含有培地上の発育によって形質転換体を選択した。得られたコロニー由来のプラ スミドＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼマツピングによって分析し、合成りＮＡ 断片の存在を調べた。この時点で、Ｉ）ＵＣ１８／ｖ−ｓ　Ｉｓ構築物は突然変 異Ｖ−ＳＩＳ遺伝子を含有しており、アミノ酸番号６．７．１０１及び１０７は ヒトＰＤＧＦに存在するアミノ酸に変化しており、その５゛末端はセリン１の直 前のＡＴＧコドンによる翻訳が開始するよう改変されていた。

アミノ酸１１４の変換及びアミノ酸１２０の終止コドンの置換次の工程では、ア ミノ酸番号１１４のコドンをＡＣＴからＧＧＴに変化させ、最終タンパク質産物 内のスレオニンをグリシンに置換させた。さらに、ｖ−ｓｉＳては、ＧＣＣがア ラニンをコードしているコドン番号１２０を翻訳終止コドンＴＡＡに変化させた 。このような構築により得られたリングくり質産物は、１１９残基のアルギニン で終止している。これらの変化は共に、コドン番号１１２内に位置するＳｍａ１ 部位の後に合成りＮＡ断片を挿入することによって１工程で行った。

上記のようにして生成させたｐＵｃ１８／ｖ−ｓｉｓ突然変異ＤＮＡを５ｅａｌ で制限し、Ｄｅｖａｒｅら、前掲のナンバーリング系内のｖ−ｓｉｓ配列のヌク レオチド４３２４にて切断し、またＥｃｏＲＩで制限し、ｐＵｃ１８のポリリン カー内のｖ−ｓｉｓ挿入体の直下流を切断した。

ｖ−ｓｉｓタンパク質のＣ末端部分及び３′−非翻訳配列をコードして（する、 Ｓｍａｌ及びＥｃｏＲ１部位間の小さな断片（５１０塩基対）を、低融解アガロ ースゲルの電気泳動によつて取り出した。大きな断片（約３５３０塩基対）を以 下の配列を有する合成りＮＡ断片と連結した：ここでは、１１４位の新たなグリ シン残基をコードするＧＧＴコドン及び１２０位に導入されたＴＡＡ終止コドン に下線を付している。この合成りＮＡ断片：よ、その上？Ｍ（左側）末端に、Ｓ ｍａｌによるｖ−ｓｉｓ突然変異配列の制限によって創製される平滑末端と連結 するための平滑末端を含有し、またその下流（右側）末端に、ＥｃｏＲＩによる ｐＵｃ１８ポリリンカーの制限によって創製されるＥｃ。

Ｒ１末端と連結するためのＥｃｏＲＩｒ粘着」末端を含有している。得られた連 結ＤＮＡをＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２株ＤＨ５に導入し、アンピシリン含有培地上 にて発育させて形質転換体を選択した。得られたコロニーから得たプラスミドＤ ＮＡを分析し、制限マツピングにより合成りＮＡ断片の存在を調べた。

ＰＤＧＦ　Ｂ、ｌ。の発現 最終工程では、完全な突然変異ｖ−ｓｉｓ遺伝子をｐＵｃ１８から取り出し、そ れを発現ベクターｐｃＦＭ１１５６に連結した。プラスミドｐｃＦＭ１１５６は 既知のプラスミド、ｐＣＦＭ８３６から調製した。プラスミドｐ　ＣＦＭ８３６ の製造は米国特許第４．７１０．４７３号に記載されている（この明細書の相当 する部分、特に実施例１から７を引用によって本明細書に包含させる）。ｐＣＦ Ｍ１１５６をｐＣＦＭ８３６から製造するため、２つの内生Ｎｄｅ　Ｉ制限部位 を切断し、！露された末端をＴ４ポリメラーゼで充填し、充填された末端を平滑 末端連結した。

次いで、得られたプラスミドをＣ１ａｌ及びＫｐｎｌで消化し、切除ＤＮＡ断片 を、以下の配列のＤＮＡオリゴヌクレオチドと置き換えた・ｐｃＦＭ１１５６ベ クターは上流Ｘｂａ１部位と下流の多くの制限部位の１つとの間に、外来遺伝子 を挿入するための領域を含有している。この場合、下流のＥｃｏＲＩ部位を利用 した。このようにして作成したｐＵＣ１８／ｖ−６ｉ　ｓ突然変異ＤＮＡをＸｂ ａｌ及びＥｃｏＲＩで制限し、小さな３８３塩基対の断片を低融解温度アガロー スゲルの電気泳動によって単離した。この断片を、これもＸｂａｌ及びＥｃｏＲ Ｉで制限しておいたｐｃＦＭ１１５６　ＤＮＡに連結した。得られた連結ＤＮＡ をＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２株ＦＭ５　（ＡＴＣＣ＃６７５４５）に導入し、カナ マイノン含有培地上で発育させて形質転換体を選択した。得られたコロニーから 得たプラスミドＤＮＡを分析し、制限マツピングにより挿入ＤＮＡ断片の存在を 調べｔ二。

最終の発現プラスミドは開始メチオニンから始まり、以後にヒトＰＤＧＦ　Ｂ饋 配列のアミノ酸１−１１９が後続するタンパク質をコードする挿入ＤＮＡ配列を 含有していた。原核生物Ｅ、ｃｏｌｉ宿主細胞は合成後にはＮ末端メチオニンを 除去するので、産生される最終タンパク質は、ヒトＰＤＧＦ　Ｂのアミノ酸１− １１９に対応している。

１１９アミノ酸のＰＤＧＦタンパク賀の発現は、その発現プラスミドを含有する 細菌細胞を培養物が所望の光学密度になるまで発育させ、次いでその培養物を４ ２℃にお（する数時間の発育にノットさせることによって確認した。培養細胞の 試料を４２℃までのノットの前に、及びそれ以後に数回取り出した。細菌タンパ ク質の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析では、見かけ分子量が１４ ．６Ｋｄである主要なバンドが温度−誘発細菌細胞に存在しているが、インキュ ベート前の細胞には存在しないことが観察された。このタンパク質は、６００ｎ ｍの光学密度１．０にまで発育させた細菌培養物１リツトル当たり約２５−４０ 冒ｇのレベルで存在していた。

Ｅ、ｃｏｌｉ　ｒ　ＰＤＧＦ　Ｂｔｕの一次構造の確認Ｅ、ｃｏｌｉ−産生ＰＤ ＧＦ　ＢＩＩｍの予想アミノ酸配列及び均一性を確認するため、３つの異なるロ ット由来の組換え産物を既知の手法、より完全には実施例２に記載するようにし て封入体から精製し、次いで分析用ゲル電気泳動及びタンパク質配列決定によっ て分析した。

アミノ酸配列分析は、無傷のｒＰＤＧＦ　Ｂの配列分析の確認及び、４−ビニル ピリジンによって誘導化した還元ｒＰＤＧＦ　Ｂの消化により入手されるトリプ ノン処理及びＳｖ８プロテアーゼペプチドの配列分析によって行った。配列決定 は、４７０Ａ及び４７７Ａ配列決定装置［＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅ＋ ＋ｓ、　Ｉｎｃ、、フォスター・／ティー、カルフォルニア〕を用いて行った。

この分析により、Ｅ、ｃｏｌｉ宿主細胞由来のｒＰＤＧＦ　Ｂ１ｎ産物は、第１ ４図に示す予想配列を有していることが確認された。

実施例１により入手した精製Ｅ、ｃｏｌｉ　ｒＰＤＧＦ　ＢＩＨをさらに、還元 条件下（加熱下、５％２−メルカプトエタノール）及び非還元（加熱しない）条 件下でＳ　Ｄ　Ｓ　−Ｐ　、Ａ　Ｇ　Ｅ分析にもかけた。電気泳動分析は、Ｂｉ ｏ　Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　［リノチモンド、カルフォルニア〕か ら入手した分子量標品と共に、３−２７％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で行 った。ゲル上のタンパク質は、クーマシー・ブリリアント・ブルーによる染色の 後に検出した。３−２４μｇの試料量では、検出されたバンドは、Ｅ、ｃｏｌｉ 　ｒＰＤＧＦ　ＢＢ。に由来するものだけであった；ダイマーに相当する約３０ ．０００ｍｗにバンドが観察された。還元すると、バンドは見かけの分子量約１ ５．０００で観察され、これはモノマーに相当するものである。

実施例１由来の収穫（即ち、濃縮）した、ｒＰＤＧＦ　Ｂｕｓを含有するＥ、ｃ ｏｌｉペースト約１．５−１．６ｋｇを再折りたたみのために取り出した。温度 を４℃に維持しつつ、Ｅ、ｃｏｌｉペーストを２０ｎＭエチレンジアミン四酢酸 二ナトリウム（ＥＤＴＡ）９容量（ｖ／ｗ）に墾濁した。１４．０００ｐｓｉの 圧力及び１２℃の温度でマントン−ガラリン（ｌｌａｎｔｏｎ−Ｇａｕｌｊｎ） ホモジナイザーを使用し、懸濁した細胞ペーストを細胞溶解した。細胞溶解物を 即座に３．ｅｏｏｘｃ；で６０分間（４℃）遠心し、上清を廃棄し、封入体ｒＰ ＤＧＦ　Ｂを含有するベレットを採取した。

得られたベレットを８．５Ｍ尿素、領　１Ｍグリノン（ｐＨ３，０）１４容量（ 〜・／Ｗ）に懸濁し、３０分間撹拌した。他方、焼結ガラス漏斗中にＳＥ−セフ ァロース６［ファルマ／ア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ウップサラ、スエーデン］ りロマトグラフィー引脂を入れることによって、重力によって水分がその市販の 樹脂から排出できるようにし、その樹脂を脱イオン水で洗浄し、もう一度水分排 出した。再懸濁したベレットの撹拌を続行しつつ、排水した樹脂２．　４ｋｇを そのベレット懸濁液に加えた。３０分後に撹拌を中止した。樹脂を静置し、上清 を廃棄した。

８．５Ｍ尿素、０．１Ｍグリノン（ｐＨ３，５）５リツトルを静置した樹脂に加 えた。得られた混合物をさらに５分間攪拌し、樹脂を再び静置し、上清を廃棄し た。

次いで、８．５Ｍ尿素、２０ｎＭ　リン酸（ｐＨ３，０）５リツトルをその樹脂 に加えた。得られた混合物を再び５分間撹拌し、樹脂を再度静置し、上清を廃棄 した。その静置した樹脂に８，５Ｍ尿素、２００Ｍリン酸（ｐＨ３，０）の新た な５リツトルを加えた。この混合物を撹拌下に、水銀２５インチに等しい減圧下 に３０分装いた。次いで、減圧を止め、混合物をノチオトレイトール（ＤＴＴ） 中、５ｎＭとし、１０Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）でそのｐＨを７．　７１ ：調節した。

減圧に戻し、混合物を３０分間撹拌した。減圧下のまま、撹拌を中止し、４Ｉｌ ｌｌＷを静置し、上清の９０％を廃棄した。冴られた樹脂を即座に、その残りの 液でスラリー化し、直径２５ｃ１のカラム（バッチカラム）中に注加し、フロー ・アダプターを備え付け、窒素ガスを噴霧しておきまた噴霧している８、５Ｍ尿 素、２０ｎＭ　リン酸ナトリウム（Ｎａｚ）Ｉ　Ｐ　０４）　［緩衝液Ａ］を用 いて１０分間、１００ｃｍ／時で樹脂を充填した。フロー・アダプターを樹脂の 表面にまで下げ、カラムを流速２５ｃｍ／時で新たな緩衝液入で洗浄し、溶出液 の２８０ｎｍにおける吸光度が一定になるようにした。

次いで、バンチカラムの出口を、新たなＳＥ−セファロースｌ＋［ファルマシア ］を充填し緩衝液Ａで平衡化した別の２５ＣｍＸ　２０ｃｍカラム（分離カラム ）の入り口とつなげた。次いで、窒素ガスを噴霧しておきまた噴霧している１０ ０％緩衝液Ａから１００％緩衝液Ｂ　（８，５Ｍ尿素、２０ｎＭ　Ｎａ２ＨＰＯ ａ、０．４ＭＮａＣｊ、ｐＨ７，７）の８０リツトル直線グラジエントによって バッチカラム及び分離カラムを流速２５ｃｍ／時で分離した。カラムから流出し た適当な画分を即座にプールし、減圧下に置いた。収量は、発酵ブロスｌリット ル当たり０．４５−０．９０ｇであった。

変性ｒ　Ｐ　Ｄ　Ｇ　Ｆ　Ｂ　＋　Ｉｅを含有する溶液は要すれば、吸光度０． 　４−０．　５０Ｄになるまで希釈した。次いで、モノマー性タンパク質溶液を 、酸化グルタチオン中、Ｏ，ＬＭとし、そのｐＨを１０ＭＮａＯＨで８．０に調 節した。溶液を再ぴ減圧下におき、１８から２４時間撹拌した。減圧を止め、こ こに誘導化されたモノマー性ｒＰＤＧＦｆｉ合ジスルフィド中間体を塩酸で処理 してそのｐＨを３゜０にまで下げた。得られた溶液を最初の容量の１／２にまで 濃縮し、次いでアミコン”ＹＭｌｏ［＾１Ｉｉｃｏｎ　Ｉｎｃ、、デンバー、マ サチューセッツ］限外濾過膜を使用し、まず８．５Ｍ尿素、領　１Ｍ酢酸（４容 量）に対して、次いでＯ，１Ｍ酢酸（４容量）に対して透析した。最終タンパク 質濃度は１．　５　２．　０ｍｇ／ｍ１　（に、％２８０ｎｍ＝０．４６）であ り、ｒＰＤＧＦ−３−８−Ｇの純度は〉８５％であり、その収量は発酵ブロス１ リツトル当たり０．４５−０．９０ｇであった。

ｒＰＤＧＦ−９−８−Ｇ溶液を２０−Ｍ　トリスで０．１＋＋ｇ／ｉｆに希釈し て、再折りたたみを行った。次いで、０，１Ｍ酢酸中、１Ｍシスティンを終濃度 １■Ｍになるまでこの溶液に加え、そのｐＨをＮａＯＨで８．０に調節した。誘 導化モノマーｒ　ＰＤＧＦ−３−３−Ｇ中間体をブロックさせずに所望のダイマ ー最終産物の鎮内及び鎖間ジスルフィド結合の形成を開始させるため、得られた 溶液を１６時間撹拌し、次いで酢酸中に０．１Ｍとした。収量は発酵ブロス１リ ツトル当たり０．３２−０．６３であった。

０．５Ｍグリシン、ｐＨ３，５（緩衝液Ｃ）又は０．０５Ｍグリシン、０゜４Ｍ 　ＮａＣｌ、ｐＨ３，５（緩衝液Ｄ）のいずれかで平衡化した制御孔ガラス（ｃ ｏｎｔｒａｉｌｅｄ　ｐｏｒｅｇｌａｓｓ）　［ＣＰＧ、　ｐｇ−３５０−４０ ０９６Ｍ”／ｇ、平均直径３８２人、／グマ・ケミカル・カンパニー、セント・ ルイス、ミズーリ］の１１゜３Ｘ５ｃ＋＋カラム上に、再折りたたみ化ダイマー ｒＰＤＧＦ溶液を載せた（ローディングした）。ｒＰＤＧＦ酸化後溶酸化力溶液 にローディングした後、そのカラムを流速４０ｃ＋＋／時の平衡緩衝液で洗浄し た。次いで、緩衝液Ｃ又はＤから開始して、緩衝液Ｃ中、２Ｍグアニジニウム・ クロライド又は緩衝液り中、８Ｍ尿素のいずれかで終わらせるグラジェント５リ ツトルをここでも流速４０Ｃｍ７時で適用して、精製されたｒＰＤＧＦ　Ｂ＋＋ ＊ホモダイマーをそのカラムから溶出させた。

純粋なｒ　ＰＤＧＦ　Ｂａｔｏホモダイマーの適当な両分をプールした。収量は 発酵ブロス１リツトル当たり０．２５−０．５ｇであった。

実施例３ 実施例３では、角膜上皮細胞の有糸分裂の速度及び表面欠損が閉じる動きの速度 を増大させる物質の能力を評価する。これらの結果は、治癒していない角膜潰瘍 又は剥離に使用した場合のＰＤＧＦの効能の指標である。

ニューシーラント・アルピノ（ＮＺＡ）（白子）ウサギにケタミノ５ｍｇ／ｋｇ 及びキラジン（ｘｙｌａｚｉｎｅ）　３０■ｇ／ｋｇを皮下注射し、全身麻酔し た。プロパラカイノ（ｐｒｏｐａｒａｃａｉｎｅ）　（眼）１滴を用いて眼の局 所麻酔も行った。角膜Ｇｉｌナイフを使用して、角膜上皮の全体をゆっくりと取 り出した。この際、基底膜が損なわれないよう注意した。フルオレセイン・ナト リウム５０μｌを眼に滴下して欠損部を染色し、コバルト・ブルー励振器フィル ターに備え付けたスリットランプで創傷の写真を撮った。手術の２時間、８時間 及び２４時間の時点にＰＤＧＦ５０μｒを１１００ｕ／ｍｅでウサギの眼に投与 した。使用したＰＤＧＦは先の実施例２にて調製したｒＰＤＧＦ　Ｂ＋＋ｅであ った。手術後８４時間までに定期的に創傷の写真を撮り、得られた眼の写真をコ ンピューター画像分析にかけて創傷領域を決定し、残っている創傷領域のパーセ ンティンを示す「治癒曲線」を入手した。このパーセンティンが小さければ、起 こっている治癒過程の程度が大きい。

得られた結果を第２図から第５図に示す。１０ＣｈｇｈｌＰＤＧＦでは、２４時 間で検出できる、創傷の閉塞まで続行する治癒速度の増大が認められた（第２図 及び第３図）。この試験では、ＰＤＧＦのＢＢホモダイマーは他の２つのイソ型 よりも若干効果的であるようである（第３図）。ＩＣｈｇｈｌでは、その効果は 変動し、ＰＤＧＦのＢＢイソ型の実質的な創傷治癒活性を示す実験もあったが（ 第４図）、他の実験では、その低い濃度ではいずれのＰＤＧＦイソ型も殆ど又は 全く効果を示さなかった（第５図）。この低用量での実験（第４図及び第５図） から導かれる結論は、１０ｐｇ１ｍｌのＰＤＧＦのＢＢイソ型は全く効果を有さ ないか、又は角膜上皮の創傷治癒の速度を増大させるかのいずれかである。結果 は個々の実験で相違した。これらの結果は、手術後の眼の表面に存在する炎症の レベルと相関し得る可能性がある。ＰＤＧＦペプチドのタンパク質分解の速度及 び炎症は炎症の激しい眼にて増大するであろう。

実施例４の実験は、基底膜が存在しない状態にて治癒する上皮の能力を評価する ものである。臨床的には、これは、潰瘍自身が角膜支質に侵入している細菌性角 膜潰瘍後の治癒の指標とすることができる。また、このタイプの治癒は臨床的な 角膜切除術の後にも起こる。前角膜切除術は、基底膜を形成し増殖しつつ上皮細 胞が支質コラーゲンを透過して移動しなければならないのでより厳格な試験であ る。

ウサギを実施例３のようにして麻酔した。６．Ｏ１遮蔽角膜穿孔器を使用し、角 膜表面をマークし、中央−角膜深部の境界領域の輪郭を描いた。プラットホーム 鉗子を用いて、マークした領域内の上皮及び前支質部分を層状境界物と共に取り 出した。角膜上皮細胞の実験（実施例３）における手法と同じ手法によって、投 与及び創傷の評価を行った。使用したＰＤＧＦは、上記の実施例２にて調製した ｒＰＤＧＦ　ＢＩｌであった。

得られた結果を第６図、第７図及び第８図に示す。１１００ａ／ｍｌでは、すべ ての成長因子群（ＰＤＧＦのＡＡ、ＡＢ及びＢＢイソ型ならびにＥＧＦ）が対照 （リン酸緩衝化食塩水中、０．１％ウシ血清アルブミン）よりも速く治癒した（ 第６図、第７図）。ＰＤＧＦのＢＢイソ型は、眼を調査した際に視覚的にも、ま た７１時間の時点の棒グラフ（第８図）から認めることができるようにグラフか らも、治癒の増大が最も劇的であることを示した。

実施例５の引張強さ実験は、角膜支質の治癒に対する物質の効果を評価するもの である。支質は角膜の厚さのうち中央の８９％を占め、規則的な矢において光り の波長の１／２よりも低い長さで分離されている筋原線維を含有するＩ型コラー ゲンのラメラから構成されている。この筋原線維はグリコサミノグリカン基質に よってその回りが包まれている。このことは、角膜に透明度を与え、そして大部 分の角膜構造強度を付与するうえで重要である。この手法の臨床的な意義は、開 削手術の際の眼内手術（即ち、白内障）、及び角膜外傷の後の治癒の指標である か否かである。

ウサギを実施例３のようにして麻酔した。引張応力試験のため、１２：００から ６００にて９．０−ｔの切り込み（切開）を角膜中央に入れた。４つの中断１０ ．０ナイロン縫合糸によって、その切り込みを閉じた。手術の２時間、８時間及 び２４時間後に試験溶液５０μｌを眼に投与した。この試験溶液に使用している ＰＤＧＦは先の実施例２にて調製したｒＰＤＧＦ　ＢＢｓであった。治癒期間の 終わりの２１日目に、ウサギを殺し、角膜を単離した。切り込みに垂直に角膜中 央から４．（ｂｙのストリップ（細長い片）を切断した。次いで、得られた組織 ストリップをインストロン・マテリアルズ試験装置（Ｉｎｓｔｒｏｎ■ａｔｅｒ ｉａｌｓ　ｔｅｓｔｉｎｇ閣ａｃｈｉｎｅ）にクランプし、その組織を引き千切 るのに要する「応力」の力を測定する。その装置によって適用される力の増大を コンピュータープログラムによって跳ね上げさせる。従って、最初の試験では、 切り込みを引き千切るのに要する力とそうなるのに要する時間の両者を記録した 。

第２の研究では、ＰＤＧＦＳＥＧＦ及び対照間で比較した。この研究では、切り 込みを引き千切るに要する力を、対照に対するパーセンティンとして「応力の合 計」を表す。切り込み部分が切れる前に変形する角膜の能力を「ひずみの合計」 と呼び、これも対照に対するパーセンティンとして表す。「ひずみの合計」は、 支質の基質であるゲルコサミノグリカンの存在の指標と考えられる。

引張強さ実験の結果を第９図−第１１図に示す。両研究ともに、ＰＤＧＦ処置角 膜を対照と比較すると、角膜及び切り込み強度が増大することを示した。第１の 研究では、要する引張強さが３６％増大しており（第９図）、破壊時間は５０％ 増大した（第１０図）。

さらに、第２の実験は、ＰＤＧＦ処置がＥＧＦ処置よりも創傷の強度を３２％増 大させることを示した。ＰＤＧＦ処置した角膜はさらに、ひずみに抗する能力を ＥＧＦ処置角膜よりも３０％増大させた（第１１図）。

これらの試験の角膜の光り顕微鏡写真を第１２Ａ図及び第１２Ｂ図に示す。第１ ２Ａ図は、切り込みから９日後における対照角膜の切開部分の光り顕微鏡写真で ある。角膜上皮は厚くなり、切り込み内にプラグを形成した。この切開部分には 活性化された角膜実質細胞は殆ど認められなかった。これは、創傷治癒の初期の 段階を示している。

第１．２　Ｂ図は、手術後の最初の２４時間にわたり３回、ＰＤＧＦのＢＢイソ 型を１００μｇ／ｓ７！投与した、術後９０目の角膜の切開部分の光り顕微鏡写 真である。上皮のプラグを表面に動かすと、切り込み領域は多くの活性化角膜実 質細胞によって充填されていた。これは、創傷治癒のより進んだ段階を示してお り、このことは、手術後短期にＰＤＧＦを適用すると、治癒の速度を加速し治癒 の質を改善させる両者によって創傷冶陰の経過を進行させる、ＰＤＧＦの効能を 示唆するものである。

実施例６のゲル収縮検定は、コラーゲン収縮を引き起こすように線維芽細胞を活 性化させるという物質の効果を測定するためのインビトロ検定である。このタイ プの相互作用は、角膜支質内の活性の指標とすることができる。

この検定を実施するにあたり、組織培養ウェルの底をアガロースで被覆した。

１型コラーゲン及び線維芽細胞の混合物をそのアガロース表面上に置いた。この 混合物にマトリックスを形成させた。得られたマトリックスの上端の培地に試験 物質（０，０１１０（ｂｇ／ｍｒ（７）ＰＤＧＦ）を添加した。使ＪｌｌたＰＤ ＧＦＩ；に先の実施例２にて調製したｒＰＤＧＦ　Ｂ＋＋ｏであった。２つの時 点（３日及び６日）にて、ウェルの壁から離れるコラーゲンマトリックスの陥没 を、残りのゲル即ちマトリックス領域の決定によって測定した。

得られた結果を第１３図に示す。ＰＤＧＦの用量と３日及び６８目の濃縮物の量 との闇には、１０ｍｇ／ｍｒ用Ｉまでの範囲で用量−作用的な相関関係があった 。

１００璽ｇｈｌでは、その効果は１０ｍｇ／ｍＺよりも若干低く、このことはレ セプターが飽和したことを示しているのかもしれない。

この検定は、角膜支質内のコラーゲン収縮を引き起こす線維芽細胞の活性化を示 す。

本発明の利点 本発明に従って角膜創傷の治癒を促進させる方法は、角膜の上皮細胞及び／又は 角膜実質細胞の増殖及び活性化を介して臨床的に検出できる治癒を促進させるう えて有効である。この方法には比較的少ない成分しか必要でなく、実行が容昌で ある。最も意義ある点は、この方法が、角膜の機能及び構造を回復させるうえて 重要な因子である角膜上皮の神経再支配（ｒｅ−ｉｎｎｅｒｖａｔｉｏｎ）を促 進させることである。本発明の方法は、角膜表面の障害を基底膜の存在下に治癒 し、また基底膜の不存在下に角膜上皮を虐使させる両者で有効であり、また眼内 手術、穿通性角膜移植術、開削手術又は角膜外傷の後の治癒を促進させる。本発 明の方法はさらに、例えば糖尿病が原因の非癒合性角膜油瘍などの、角膜の非外 傷性病原損傷の処置にも有用である。本発明の方法は、手術後に使用される他の 角膜又は眼内処置に適合している。

本明細書に記載した実施例は、正常な状態にある角膜上皮がＰＤＧＦに特異的な レセプターを有していることが知られていない場合でさえも、創傷治癒を促進す るうえてＰＤＧＦが有効であることを示している。このことは、角膜創傷の治癒 を刺激するのにＰＤＧＦを使用することが予期し得ない効果であることを示して いる。

本発明を特定の好ましい態様を用いて相当に詳細に説明したが、別の態様もあり 得る。従って、以下の請求の範囲の思想及び範囲は、本明細書に記載する好まし い態様の記載に限定されるものでない。

創傷宿賃域％ 口 創傷＠ｊｌｉｄ％ 創傷領域％ 創傷領域％ 分裂時間（秒） 対照に対するパーセンテージ 国際謂査１１１１失 国際調査報告 フロントページの続き （８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ 、ＴＤ。

ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ。

ＣＺ、ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　Ｌ Ｕ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎ。

、　ＮＺ、　ＰＬ、　ＰＴ、　ＲＯ，ＲＵ、　ＳＤ、　ＳＥ、　ＳＫ。

Ａ （７２）発明者　ウィーラー、ラリ−・エイアメリカ合衆国９２７１５カリフオ ルニア州アーヴイン、ヴアリー・ツユ−１８番 （７２）発明者　二コルソン、マーシェリー・エイアメリカ合衆国９０２７２カ リフオルニア州パシフイツク・パリセイズ、モニュメント・ストリート１２３８ 番

Claims (32)

【特許請求の範囲】
1. １．哺乳動物の角膜創傷の治癒を促進させる方法であって、（ａ）眼科学的に適 合する血小板誘導化成長因子の溶液を製造し、そして（ｂ）血小板誘導化成長因 子を角膜に適用することによって刺激される角膜の上皮細胞及び／又は角膜実質 細胞の増殖を介して促進される臨床的に検出できる治癒を促進するに充分な量の 上記溶液を、角膜創傷が生じた時に又はその後に哺乳動物の角膜に適用すること 、を特徴とする方法。
2. ２．血小板誘導化成長因子がＡＡイソ型、ＡＢイソ型、ＢＢイソ型及びそれらの 混合物から選択される、請求項１に記載の方法。
3. ３．血小板誘導化成長因子がＢＢイソ型である請求項２に記載の方法。
4. ４．溶液中の血小板誘導化成長因子の濃度が約１０μｇ／ｍｌから約１０００ｋ ｇ／ｍｌである、請求項１に記載の方法。
5. ５．溶液中の血小板誘導化成長因子の濃度が約５０μｇ／ｍｌから約５００ｋｇ ／ｍｌである、請求項４に記載の方法。
6. ６．溶液中の血小板誘導化成長因子の濃度が約１００μｇ／ｍｌである請求項５ に記載の方法。
7. ７．血小板誘導化成長因子が、アミノ酸配列：【配列があります】 を有する１１９アミノ酸の組換え的に誘導された再折りたたみＢ鎖ホモダイマー である、請求項１に記載の方法。
8. ８．溶液を角膜の創傷が生じた後に角膜へ１回又はそれ以上適用する、請求項１ に記載の方法。
9. ９．溶液を角膜へ１回から３回適用する、請求項８に記載の方法。
10. １０．創傷が生じた約２時間、約８時間、及び約２４時間の後に溶液を適用する 、請求項９に記載の方法。
11. １１．角膜創傷が生じた時に角膜に１回又はそれ以上適用する、請求項１に記載 の方法。
12. １２．創傷が外科的レーザーの作用によって生じたものである、請求項１に記載 の方法。
13. １３．創傷が糖尿病の結果である請求項１に記載の方法。
14. １４．哺乳動物の角膜上皮の創傷治癒の質を改善する方法であって、（ａ）眼科 学的に適合する血小板誘導化成長因子の溶液を製造し、そして（ｂ）角膜創傷の 治癒の質を改善するに充分な量の上記溶液を、角膜創傷が生じた時に又はその後 に哺乳動物の角膜に適用すること、を特徴とする方法。
15. １５．角膜創傷治癒の質の改善が、上皮の痂皮形成における臨床的に検出できる 減少、及び痕跡形成の臨床的に検出できる減少のうちの少なくとも１つである、 請求項１４に記載の方法。
16. １６．血小板誘導化成長因子がＡＡイソ型、ＡＢイソ型、ＢＢイソ型及びそれら の混合物から選択される、請求項１４に記載の方法。
17. １７．血小板誘導化成長因子がＢＢイソ型である請求項１６に記載の方法。
18. １８．血小板誘導化成長因子が、アミノ酸配列：【配列があります】 を有する１１９アミノ酸の組換え的に誘導された再折りたたみＢ鎖ホモダイマー である、請求項１４に記載の方法。
19. １９．哺乳動物の少なくとも角膜上皮の部分が神経除去される角膜創傷が生じた 後の角膜上皮における臨床的に検出できる神経再支配を促進させる方法であって 、 （ａ）眼科学的に適合する血小板誘導化成長因子の溶液を製造し、そして（ｂ） 臨床的に検出できる角膜上皮の神経再支配を促進するに充分な量の上記溶液を、 少なくとも角膜上皮の部分が神経除去された角膜創傷が生じた時に又はその後に 哺乳動物の角膜に適用すること、を特徴とする方法。
20. ２０．血小板誘導化成長因子がＡＡイソ型、ＡＢイソ型、ＢＢイソ型及びそれら の混合物から選択される、請求項１９に記載の方法。
21. ２１．血小板誘導化成長因子がＢＢイソ型である請求項２０に記載の方法。
22. ２２．血小板誘導化成長因子が、アミノ酸配列：【配列があります】 を有する１１９アミノ酸の組換え的に誘導された再折りたたみＢ鎖ホモダイマー である、請求項１９に記載の方法。
23. ２３．哺乳動物の角膜に適用する、角膜創傷治癒を促進するための医薬組成物で あって、 （ａ）水、 （ｂ）少なくとも約１０μｇ／ｍｌの血小板誘導化成長因子を含有する眼科学的 に適合する血小板誘導化成長因子の溶液、及び（ｃ）そのｐＨを約５から約８の 範囲内に調節する緩衝液、を含有する医薬組成物。
24. ２４．血小板誘導化成長因子がＡＡイソ型、ＡＢイソ型、ＢＢイソ型及びそれら の混合物から選択される、請求項２３に記載の組成物。
25. ２５．血小板誘導化成長因子がＢＢイソ型である請求項２４に記載の組成物。
26. ２６．溶液中の血小板誘導化成長因子の濃度が約１０μｇ／ｍｌから約１０００ μｇ／ｍｌである、請求項２４に記載の組成物。
27. ２７．溶液中の血小板誘導化成長因子の濃度が約５０μｇ／ｍｌから約５００μ ｇ／ｍｌである、請求項２６に記載の組成物。
28. ２８．溶液中の血小板誘導化成長因子の濃度が約１００μｇ／ｍｌである請求項 ２７に記載の組成物。
29. ２９．血小板誘導化成長因子が、アミノ酸配列：【配列があります】 を有する１１９アミノ酸の組換え的に誘導された再折りたたみＢ鎖ホモダイマー である、請求項２３に記載の組成物。
30. ３０．投与単位剤形である請求項２３に記載の組成物。
31. ３１．角膜創傷の治癒を促進するための哺乳動物の角膜に適用する医薬組成物の 調製用錠剤であって、 （ａ）創傷の治癒を促進するに充分な血小板誘導化成長因子の量、及び（ｂ）こ の錠剤を製造するのに適している眼科学的に許容される非毒性の賦形剤、 を含有する錠剤。
32. ３２．血小板誘導化成長因子がＢＢイソ型である請求項３１に記載の錠剤。