JPH07505412A - Ｃｔｌ応答の誘導 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＣＴＬ応答の誘導 本発明は、免疫化による宿主内での特異的な細胞障害性のＴ細胞応答の誘導（ｉ ｎｄｕｃｔｉｏｎ）およびこのような誘導に用いる医薬製剤（ｆｏｒｍｕｌａｔ ｉｏｎ）に関する。

ウィルスに感染した後、哺乳動物の宿主は抗体と細胞障害性Ｔ細胞の両者の応答 を開始し、続いて同じグループ由来のウィルスに対する防護が永続する。しかし 、局所もしくは全身での抗体の活動だけが感染力を中和し、宿主細胞から放出さ れる自由細胞溶解性ウィルスが拡散するのを阻害するが、抗体は、ウィルスが一 旦宿主細胞に侵入し感染すると、感染を抑制することができない。抗体依存性細 胞媒介細胞障害性（ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｄｅｐｅａｄｅｎｔ　ｃｅｌｌ−ｍｅｄ ｉａｔｅｄ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）　（ＡＤＣＣ）または抗体依存性補体 媒介溶解性（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ− ｍｅｄｉａｔｅｄＩｙｓｉｓ）はライスル抗原を発現する感染細胞を破壊できる 機構であるが、そのＣＴＬ応答が、ウィルス感染細胞を特異的に殺す主な機構で あると考えられる。したがってこのようなウィルス感染細胞を殺すことができる 細胞障害性Ｔ細胞の誘導は免疫応答の重要な一面である。

ＣＴＬは、Ｔ細胞受容体を介して感染細胞のＭＨＣクラス１分子に発現される抗 原ペプチドを認識する。またＣＴＬはＣＤ８゛も発現する。そしてこのＣＤ８は Ｔ細胞受容体とクラスＩＭＨＣ分子十ペプチドの相互作用を安定化する。この同 族相互作用は溶解機構を介して感染細胞を殺すに至る。ウィルスの表面抗原はラ イスルサイクルの初期に発現できるので、感染細胞の死は一般にウィルスの複製 より先に起こる。ＨＩＶ感染細胞に対する強力なＣＤ８＋ｖｅｒリンパ球活性を 有するＨＩＶ陽性個体には長期生存が増大している（Ｈｅｓｓｏｌら、Ａｍ、　 Ｊ、　Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ、。

３０巻、１１６７頁、１９８９年）。したがって長期間続く有効なＣＴＬ応答は 予防ワクチンおよび免疫治療ワクチンとして重要であり、かつ抗ウイルスワクチ ンを開発する戦略の必要条件である。

特にＣＴＬ応答は、例えばＨＩＶ、Ｈ３ＶおよびＨＰＶのような何れの治療ワク チンについて必須の要素であろう。またＣＴＬは生体内（ｄｅ　Ｐｌａｅｎら、 Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃｅｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８５巻、２２７４ −２２７８頁、１９８８年）および生体外（Ｉｔｏら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、 、　４６巻３０１１〜３０１７頁、１９８６年）の両方で腫瘍細胞を殺すことが できるので、腫瘍関連抗原に対するＣＴＬの誘導は癌治療に役立つことは明らか である。

またＣＴＬ応答は、プラスモディウム・ファルシパルム（ＰＩａｓｍｏｄｉｕｍ 　ｆａｌｃｉｐａｒｕａ＋　）のサーカムスボロンゾイト（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏ ｒｏｚｏｉ　ｔｅ）タンパク質由来の合成ペプチド（国際特許公開第ＷＯ−９０ ００４０２号：米国保健省）およびゴノコッカス（Ｇｏｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、 ボルデテラ・ベルッッシス（Ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）　（ ヨーロッパ特許公開第０４３１２３７号；　Ｈｏｅｃｈｓｔ　ＡＧ社）、リステ リア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属またはレイシマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）属の ような細菌由来のペプチドに対して検出されている。

粒状抗原の担体系が、酵母のレトロエレメント（ｒｅｔｒｏｅｌｅｍｅｎｔ）Ｔ ｙおよびレトロウィルスのｇａｇタンパク質が自己集合してウィルス様粒子（Ｖ ＬＰ）およびウィルス由来粒子（ＶＤＰ）を形成する性能に基づいて開発されて いる（国際特許公開第ＷＯ−８８０３５６２号および同第ＷＯ−８８０３５６３ 号参照）。これらの担体系は、例えばウィルスエピトープのような第二の抗原性 アミノ酸配列に融合された自己性部分を含有している。ポテンシャルワクチンと して多くの注目を集めた一つの抗原性ウィルスタンパク質は、ＨＩＶ−１の外皮 糖タンパク質のｇｐ１２０である。Ｖ３ループとして知られている上記タンパク 質の領域に対する抗体はウィルスの感染性を中和することができる。この領域は 約４０個のアミノ酸を含有し、ＨＩＶ分離株間にかなりの配列変動があるが、分 離株の約６０％が共通配列ＧＰＧＲＡＦをもっている。ＨＴＶのｇｐ１２０のｖ ３領域を含有するＴｙ：ＶＬＰは強力な免疫原であり、体液性（抗体）応答とＴ 細胞応答の両者を誘発させる。例えばフロインドアジュバントまたはＡＨ中、分 離株１［Ｂ由来Ｖ３領域を保有するＴｙＶＬＰ（Ｖ３：Ｔｙ−ＶＬＰ）でウサギ を免疫化すると、優れた抗体と中和力値が得られるＣＧｒｉｆｆｉｔｈｓら、Ｊ 、　Ｖｉｏｌｏｇｙ。

６５巻、　４５０〜４５６頁、１９９１年）。

またハイブリッドＩ［［Ｂ　Ｖ　３　：　Ｔｙ−ＶＬＰｖ、子は、ミョウバンア ジュバントまたは食塩水中に存在している場合、ｖ３特異的Ｔ細胞のブライミン グ（ｐｒｉｍｉｎｇ）を起こす（Ｈａｒｒｉｓら、［ＭＭＵＮＯＬ。

印刷中１９９２年）。これらの特異的Ｔ細胞は、ＨＩＶ−ＩＩ［［Ｂ分離株の組 換えｇｐ１２０およびｖ３３ループ成ペプチドの両者を認識する。Ｉ［［Ｂ　Ｖ 　３　：　Ｔｙ−ＶＬＰテプライムされたＣ５７ＢＬ／６ｖウス由来のリンパ節 細胞は、Ｉ［［Ｂ（４０個の残基）およびＭＮ　（３９個の残基゛）のＶ３ルー プ配列の両者を示す合成ペプチドによる生体外刺激に対して強力に応答する。

Ｔｙ由来のハイブリッドＶＬＰとｇａｇ由来のハイブリッドＶＤＰは有用なワク チンの可能性がある。これらのハイブリッドは、この粒子系にウィルスエピトー プが与えられて特異的なＣＴＬ応答が得られる場合はさらに一層有用である。現 在までＣＴＬを誘導する方法は大部分が、強力なアジュバントを用い短いペプチ ドで動物を免疫化することに基づいている。

ＨＴＶ由来のタンパク質に対するＣＴＬ応答は、このウィルスに対するワクチン の開発が急を要するので特に興味がある。

ＨＩＶ−１ｇｐ１６０（ｇｌ１１２０（７）前駆体）に対して特異的なＣＴ　Ｌ 　ハ、ＦＣＡ／Ｆ（Ａアジュバント混合物（Ｈａｒｔら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８８巻、９４４８頁、１９９１年）を利 用し、Ｔ１ｇｐ１２０Ｔ細胞エピトープＣＣｅａｓｅら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ、　８４巻、４２４９頁、１９８７年）およ びｖ３ループＢ細胞エピトープ（Ｐａｌｋｅｒら、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８５巻、１９３２頁、１９８８ 年）を含有するハイブリッド合成ペプチドを使用して、ＢＡＬＢ／ｃマウス中に インビボでプライムさせることができる。また特異的なＣＴＬが、ｇｐ１６０由 来のペプチドフラグメントによって誘導されている（１第ＷＯ−８９０７１１２ 号；米国保健省）。またＨＩＶ−１逆転写酵素の保存エピトープを保持するペプ チドもアジュバント中に入れて投与するとＣＴＬを誘導する（国際特許公開第Ｗ Ｏ−９１１３９１０号、米国国立癌研究所）。またＣＴＬ応答は、アジュバント に入れた、ＨＩＶコアタンパク質ｐ２４とｐ１７由米のペプチドフラグメントに 対して起こすこともできる（国際特許公開第ＷＯ−９１０９８６９号および間第 ＷＯ−９１０１９９６号；英国医療審議会）。

“核タンパク質ペプチドに対するインフルエンザウィルス特異的ＣＴＬは、ＢＡ ＬＢ／ｃマウスをリポペプチド接合体で免疫化させた後に誘導されており（Ｄｅ ｒｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、　３４２巻、５６１頁、１９８９年）およびフロイン ト完全アジュバント（ＦＣＡ）中の合成ペプチドによって誘導されている（Ｇａ ｏら、Ｊ、　［ｍｍｕｎｏｌ、、　１４７巻、３２６８頁、１９９１年）。ＦＣ Ａ中の、ヘマグルチニンの免疫原性決定因子を保育するペプチドによるＣＴＬ応 答の誘導はヨーロッパ特許公開第０３６６２３８号（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ　Ｂ ｅｅｃｈａｍ社）に開示されている。

リンパ性脈絡髄膜炎ウィルス（ＬＣ＆ＩＶ）特異的ＣＴＬは、フロイント不完全 アジュバント（ＦＩＡ）中の、核タンパク質Ｔ細胞エピトープに相当する遊離合 成ペプチドを用いて、ＢＡＬＢ／ｃマウス内に誘導されている（Ａｉｃｈｅｌｅ ら、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、　１７１巻、１８１５頁、１９９１年）。ＬＣ ＭＶの感染に対する防護の程度は、免疫化マウス内でＬＣ貯特異的ＣＴＬ応答を 開始する性質と関連があった（Ｓｃｈｕｌｚら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ ａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８８巻、９９１頁、１９９１年）。ＦＣＡもしく はＦＩＡ中の遊離合成ペプチドにょるＬＣＭＶｉタンパク質特異的ＣＴＬの誘導 もＣＤ４＋ｖｅｒ細胞の助けを要°することが報告されている（Ｆａｙｏｌｌｅ ら、Ｊ、［ｍｍｕｎｏｌ、、　１４７巻、４０６９頁、１９９１年）。

Ｂ６マウスのセンダイウィルス感染に対する防護は、ＦＩＡ中のセンダイウィル ス核タンパク質ペプチドによる免疫化を行った後に達成されている（Ｋａｓｔら 、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ。

ＵＳＡ、　８８巻、２２８３頁、１９９１年）。このタンパク質ペプチドは高レ ベルのセンダイウィルス特異的ＣＴＬを誘導した。そしてこのようなセンダイウ ィルス特異的ＣＴＬクローンは致命的に感染したマウスを防御することができる （Ｋａｓｔら、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｗｅｄ、。

１．６４巻、７２３頁、１９８６年）。またこのセンダイ核タンパク質ペプチド は、皮下に注射した場合、アジュバントなしで低レベルの応答を誘導したが、静 脈注射を行った場合には該応答を誘導しなかった。

乳癌中に存在する上皮性腫瘍抗原（Ｈａｒｅｕｖｅｎｉら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ ｌ。

Ａｃｅｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８７巻、９４８４〜９５０２頁、１９９０年 ）および黒色腫関連機タンパク質ｐ　９７ＣＥｓｔｉｎら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ。

８５巻、１０５２〜１０５６頁、１９８８年）はワクシニア中に発現されている 。マウスおよびサルをこれらの構造体で免疫化すると、体液性および細胞性の防 御免疫応答が誘発される。

’ＣＴＬ応答はいくつかの小さなペプチドフラグメントに対して実証されている が、抗原が細胞関連形もしくは分解形で存在していない場合、ＣＴＬ応答は外因 性全タンパク質による免疫化では容易には誘導されない。リポソーム中の可溶性 タンパク質を静脈投与するとＣＤ８＋ｖｅ　ＣＴ　Ｌ応答を誘導できる（　Ｒｅ ｄｄｙら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１４８巻、１５８５頁、１９９２年）　。

ＦＣＡ、Ｆ　ＩＡまたは緩衝食塩水中ではなくて免疫刺激性複合体（［ＳＣＯＭ ）中に入れた組換えｇｐ１６０は、ＢＡＬＢ／ｃ７ウス中に旧Ｖ−１外皮特異的 ＣＴＬ活性を誘導することができる（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｎａｔｕｒｅ、　 ３４４巻、８７３頁、１９９０年）。またＨ１ｖ外皮ｇＰ１６０（７）　Ｖ　３ 　領域に対して特異的なＣＴＬ応答は、ＨＩＶのＩ［［Ｂ、ＭＮおよびＲＦの分 離株のＶ３領域を発現する生きている組換えワクシニアウィルスによって誘導さ せることができる。その特異性は、ｌＳＣ０Ｍ中の組換えｇｐ１６０によって誘 導される特異性と同等である。また細胞障害性Ｔ細胞応答はワクシニアに組み込 まれたｖＳｖ抗原からも得られている（米国特許第４７３８８４６号）。

国際特許公開第ＷＯ−９０１１０８５号〔分子生物学研究所Ｑｌｏｌｅｃｕｌａ ｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ））には、腫瘍細胞から単離した細胞 質膜をコートした５μｍのビーズで免疫化した後、マウスにＣＴＬ応答が誘導さ れることが報告されている。これらのビーズは非常に薄いので、この方法に基づ いてヒトの治療剤もしくは予防剤を開発するのはかなり難しいようである。

したがって、ＣＴＬ応答を誘発する現在の方法すべてに関連する大きな問題があ る。第一に、ＣＴＬ応答はある種の小さなペプチドフラグメントによる免疫化に よって誘導できるが、小さなペプチドは弱い抗体反応を誘発できる。さらに異系 交配集団では、異なるＭＨＣクラスＩおよびクラス■のハブロタイブの個体は異 なるペプチドのエピトープに応答し、多くのペプチドは可能性があるハブロタイ ブすべてをプライムするのに必要であろう。しかし、大きな粒状抗原による免疫 化でＣＴＬ応答が起こるかというと決して確実ではない。というのは、入手し得 る証拠のほとんどが全タンパク質による免疫化によってＣＴＬ応答が起こらない ことを示しているからである。

第二に、誘導されている大きな免疫原に対するこれらのＣＴＬ応答は、ヒトに使 用することが認可されていない強力なアジュバントもしくは生きているベクター が存在している必要がある。例えば、ＦＣＡ、ＦＩＡまたは緩衝食塩水中ではな くてｌＳＣ０Ｍ中ニ入れた組換えＨＩ　Ｖ　ｇｐ１６０１ｔ、ＨＩＶ−１外皮特 異的ＣＴＬ活性をＢＡＬＢ／ｃマウス内に誘導した。ヒトにｌＳＣ０Ｍを使用す ることの認可はすぐに間に合わないように思われる。またｖ３領域を発現する組 換えワクシニアウィルスはＨＩＶ外皮ｇｐｔｅ。

のｖ３領域に対して特異的ＣＴＬ応答を誘導するが、ワクシニアによる免疫化は 免疫を抑制された患者に使用する場合の安全性および有効性について懸念がある 。

したがって、予防と免疫治療を目的として用いる場合にワクチンの効能を増大す るため、哺乳動物の免疫化に応答してＣＴＬ応答を誘発する安全で有効な方法が 要望されている。

ＣＴＬ応答を改善できる方法は二つあるということが原理上考えられる。第一に 、通常用いられているのと異なるアジュバントが改善された作用を得るためにめ られており、ある組合せのアジュバントがある環境内では特に有効であることも あり、そのため現在多くの会社がムラミルトリペプチドのような新しいアジュバ ントを探究している。第二の方法は、当該技術分野の研究者が、ＣＴＬ応答を増 大させるため彼等の研究において実際に研究してきた領域であり、抗原自体の性 質を改善する方法である。

本発明は上記のいずれの方法にもよらない。本発明は、アジュバントの存在が、 たとえ体液性応答を誘発するのに適切かもしくは望ましくても、逆説的にＣＴＬ 応答を抑制するということを発見し認識したことに基づいている。

本発明の第一の態様によれば、本発明はタンパク質の粒状抗原からなるアジュバ ントを含有していない滅菌医薬製剤を提供するものである。

上記の製剤は、国際特許公報第ＷＯ−８８０３５６２号、同第ＷＯ−８８０３５ ６３号およびヨーロッパ特許公開第０１７５２６１号に具体的に開示されている 製剤とは異なっている。というのはこれらの刊行物には、アジュバントを含有し ない滅菌ワクチン製剤を具体的に例示されていないからである。これらの刊行物 では、ワクチン製剤へのアジュバントの添加を任意の特徴として考察しているこ とはたしかであるが、当該技術分野の当業者は、アジュバント（例えば水酸化ア ルミニウム、これはヒトに使用することが認可されている）を添加するように仕 向けられることは避けることができなかったのであろう。というのはこのような ステップは本発明がなされる前には通常のことと見なされてきたからである。現 在認可されているすべてのサブユニットワクチン（例えばＢ型肝炎のワクチン） および死菌ワクチン（例えばインフルエンザのワクチン）はアジュバントとして 水酸化アルミニウムの存在下で供給されている。

粒状抗原は複数の自己集合性タンパク質分子を含有していても・よい（“タンパ ク質”という用語には前後関係から許されるならば、糖タンパク質、リポタンパ ク質およびその外の翻訳後にまたは他の方法で修飾されたタンパク質が含まれ、 かつ“タンパク質の″という用語は上記のことに対応して解すべきである）。自 己集合体タンパク質分子は互いに同じでも異なっていてもよく、タンパク質分子 の非相同集合体からなる粒状抗原およびタンパク質分子の相同集団からなる粒状 抗原は本発明で使用できる。

粒状抗原が形成される自己集合性タンパク質分子は各々、所第二のアミノ酸配列 に融合された、自己集合性特性を育する第一のアミノ酸配列を含有している。本 発明に育用な自己集合性タンパク質分子と粒状抗原は、国際特許公開第８８０３ ５６２号および同第８８０３５６３号に具体的かつ一般的に開示されているもの でもよく、両刊行物の内容は法律が許す程度の本願に援用するものである。国際 特許公開第８８０３５６２号と同第８８０３５６３号の特定の実施例は粒状抗原 に関する実施例であり、その粒状抗原の自己集合性部分は、酵母レトロトランス ポゾン（例えば酵母Ｔｙ）がコードする要素由来のものであり、このような粒状 抗原は“ウィルス様粒子またはＶＤＰと呼ぶ。国際特許第ＷＯ−８８０３５６２ 号および同第ＮＯ−３８０３５６３号にも粒状抗原が開示され、この粒状抗原の 自己集合性部分はウィルス（特にレトロウィルスのｇａｇ遺伝子）によってフー ドされ、このような粒状抗原はウィルス由来粒子またはＶＤＰと呼ぶ、これら粒 状抗原は一般に直径が１μｍより小さく、サイズは１１００ｎより小さく、例え ば１０〜２０ｎｍが一般的である。

上記の第二アミノ酸配列は一般に、適切な宿主中に細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴ Ｌ）応答を誘導で゛きるエピトープとして機能する配列を含有している。このよ うな配列は便宜上ＣＴＬエピトープと呼称する。このＣＴＬエピトープは抗原配 列の一部または抗原配列に付加した部分である。認識されるヒトＣＴＬエピトー プの例としては、Ｈ［Ｖ−１ｇｐ１２０（ＤＴＩ、　Ｔ２およびｖ３ループのエ ピトープならびにＨＩＶ−１ｇｐ４１のＴｈ４．１エピトープである。

また本発明の特に好ましい実施態様としては、上記第二のアミノ酸配列内のＣＤ ４Ｔ細胞エピトープがあり、その機能はＣＤ４Ｔ゛細胞の産生を刺激することで ある（Ｔヘルパー細胞としても知られている）。具体的に述べると、ＣＴＬ応答 を起こす粒子は、酵母ルートロ要素Ｔｙ、または旧Ｖ−ＩＳ）Ｉ［Ｖ−２、ＨＴ ＬＶ−１、ＨＴＬＶ−Ｉｆ、１（ＴＬＶ−ＩＩＩ、Ｓ　ＩＶＳＢ　ＩＶｌＥＬＡ Ｖ、ＣＩＡＶ。

マウス白血病ウィルス、モロニーマウス白血病ウィルスおよびネコ白血病ウィル スのようなレトロウィルスのｇａｇタンパク質由来の自己集合性配列を含有して いてもよい。あるいは、自己集合性タンパク質は池の特にウィルスの起源由来の ものでもよく、Ｂ嬰肝炎ウィルスの表面抗原が一例であり、これはヨーロッパ特 許公開第０１７５２６１号の対象である。他の例としては、Ｂ型肝炎コア抗原、 ブルータングウィルス、ヒト乳頭腫ウィルスおよび単純ヘルペスウィルスＩとＩ ならびにＨＳＶ−６がある。

その抗原配列は病因学的作因または腫瘍由来もしくはこれらの関連する配列に対 応していてもよい。病因学的作因としてはウィルス、細菌、真菌または寄生生物 のような微生物が挙げられる。ウィルスとしては次のものがある。すなわちレト ロウィルス例えばＨＩＶ−１，ＨＩＶ−２、）ＩＴＬＶ−Ｉ、１（ＴＬＶ−ＩＩ 、ＨＴＬＶ−１［、ＳＩＶ、Ｂ　ＩＶ、ＥＬＡＶ、ＣＩＡＶ、？ウス白血病ウィ ルス、モロニーマウス白血病ウィルスおよびネコ白血病ウィルス；オルトミクソ ウィルス例えばインフルエンザＡ型もしくはＢ型ウィルス：パラミクソウィルス 例えばパラインフルエンザウィルス、流行性耳下腺炎ウィルス、麻疹ウィルス、 ＨＳＶおよびセンダイウィルス；パポーハラウィルス例えばＨＰＶ　、アレナウ イルス例えばヒトもしくはマウスのＬＣＭＶ、ヘパドナウィルス（ｈｅｐａｄｎ ａｖｉｒｕｓ）例えばＢ型肝炎ウィルス；ヘルペスウィルス例えばＨＳＶ、ＶＺ Ｖ、ＣＭＶまたはＥＢＶである。腫瘍関連もしくは腫瘍由来の抗原としては例え ば、タンパク質のヒト腫、瘍抗原例えば黒色腫関連抗原、または上皮腫瘍関連抗 原例えば乳癌もしくは結腸癌由来の抗原がある。

抗原配列としては、寄生生物例えばプラスモディウム・ファルシパルム（Ｐｌａ ｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）由来のもの、または細菌例えばナイセ リア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ）、リス テリア属（Ｌｉｓｔｅｒｊａ）の細菌由来のものがある。

好ましい自己集合性配列は、酵母レトロエレメントＴｙまたはレトロウィルス特 にＨ［Ｖ−１のｇａｇタンパク質である。

特に好ましい第二のアミノ酸配列は、レトロウィルス、パラミクロウィルス、ア レナウイルスもしくはヘパドナウィルスまた°はヒト腫瘍細胞由来のウィルスも しくは腫瘍の抗原ＣＴＬエピトープに対応する抗原配列である。

その例としては下記のもの由来のエビ！・−ブが挙げられる。

１）ＨＩＶ（特１：　Ｈ［Ｖ−１）　ｇｐ１２０．２）ＨＩＶ（特１：　Ｈ［Ｖ −１）　ｐ２４．３）インフルエンザウィルスの核タンパク質、４）ＬＣＭＶの 核タンパク質、 ５）ＨＰＶＬＩおよびＨＰＶＬ２のタンパク質、６）　ｐ　９７黒色腫関連抗原 、 ７）　ＧＡ７３３−２上皮腫瘍関連抗原、８）上皮腫瘍関連抗原由来のＭＬＩＣ −１反復配列、９）マイコバクテリウムｐ６ １０）マラリアＣ８ＰもしくはＲＥＳＡの抗原、ならびに１１）ヒト乳頭腫ウィ ルスＥ５およびＥ７他の成分、特に脂質は、抗原性に関与しているが、存在して いてもよい。ウィルス由来の粒子は一般に感染性核酸を含有していない。

本発明は、複数の異なる融合タンパク質からなる本発明の製剤で免疫化すること によって、ウィルスエピトープ領域の変異体°の抗原のようないくつもの異なる 抗原に対してＣＴＬ応答を誘発するのに有用である。ＴｙもしくはＨ［Ｖ−１ｇ 　ａ　Ｈの自己集合性部分が一連のＨＩＶ　Ｖ３領域に融合されてなる粒子が好 ましい。

天然の配列の機能をもっているかまたは天然配列由来のものであるといわれる配 列は天然の配列と同一であってもよく、また場合によっては天然配列と同一の方 が好ましい。しかし、天然配列と同一でない配列が完全にかつ適切に作用し、し かも場合によってはより優れた作用をすることがあるということが分かっている 。そのためそのような配列を使用することは除外しない。したがって本発明には 、天然の配列と同じ（適切な）機能を定性的にもっているが、異なるアミノ酸も しくはヌクレオチド塩基の組成を存する配列が含まれる、天然配列および同じ機 能を定性的に有する池の配列は、通常実質的に相同である。

そしてこの相同性は少な（とも５０％、６０％、７０％もしくは８０％であるか またはさらに少なくとも９０％、９５％もしくは９９％であり、数値が大きいほ ど好ましい。

あるいはまたは付加的に、本発明に有用なヌクレオチド配列は、その機能がめら れている天然配列と雑種を形成してもよく、または遺伝子コードの縮重を除いて 前記のように雑種を形成°させる。雑種形成は緊縮条件下で行われる（Ｍａｎｉ ａｔｉｓら、“Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　二　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　”　、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ、　３８７〜３８９頁、１９８２年参照）。雑種形成の緊縮条件 の例は、４ｘＳＳＣ，６５℃にて雑種を形成し、続いてＯ８ｌ　ｘＳＳＣで６５ °Ｃにて１時間洗浄する条件である。別の雑種形成条件の例は、５０％ホルムア ミド、４ｘＳＳＣ，４２℃である。

雑種形成が緊縮条件下で行われない場合、雑種形成は緩和条件下でもよい。この ような非緊縮雑種形成条件の例は５０″Ｃにおける４ＸＳＳＣまたは４２°Ｃに おける３０〜４０％のホルムアミドによる雑種形成である。

本発明の製剤は、予防用または特に免疫治療用のワクチンとして作用である。ワ クチンは生理的に許容できる非毒性担体中での粒状抗原からなることができる。

滅菌は一般に、非経口投与用ワクチンにとって必須のことである。好ましい生理 的に許容できる非毒性担体は滅菌生理食塩水または滅菌ＰＢＳである。

本発明のワクチンは２種以上の抗原が存在してもよい。上記のように、異なる抗 原のカクテルを使ってもよく、または二つ以°上のエピトープを有する粒状抗原 の均一集団を使うことができるであろう。ワクチンは異なる粒状抗原の混合物を 含有していることが実際には一層簡便であろう。

本発明の第一の態様による製剤は滅菌されている。滅菌は便利ないずれかの方法 でも達成することができる。例えば０．２２μｍのフィルターによる濾過滅菌が 特に適切である。

本発明の第二の態様によれば、細胞障害性Ｔ細胞応答を誘導するのに用いる、ア ジュバントを含有しない免疫治療用もしくは予防用の医薬ワクチン製剤を製造す るのに、タンパク質の粒状、抗原が使用される。

本発明は、細胞障害性Ｔ細胞応答を誘導する方法すなわち、タンパク質の粒状抗 原を含有しアジュバントを含有しない製剤を被検者に投与することからなる方法 に作用であることは理解されるであろう。その投与計画は医師または臨床家の指 導のもとに行われ一般に作動であるが非毒性であるように行われる。

製剤は、−回の投与または数回の投与で投与してもよい。反復投与計画を、日、 週、月または数の期間にわたって実施してもよい。しかしＣＴＬ応答については 一回の投与が好ましい。

本発明には、非感染性抗原に対する充分な体液性（抗体）および細胞性（ＣＴＬ および好ましくはＴヘルパー細胞）の免疫応答を刺激する特別の用途がある。こ の用途は、アジュバントなしの免疫原（例えば本発明の第一の態様によるアジュ バントなしの製剤の形態）を投与してＣＤ８ＣＴＬ、ＣＤ４Ｔ細胞およびＢ細胞 の応答をプライムし、およびアジュバントを加えた免疫原を投与してＣＤ４＋ｖ ｅＴ細胞およびＢ細胞のコンパートメントを追加刺激（ｂｏｏｓｔ）することか らなる組合わせ方法によって達成す゛ることかできる。適切なアジュバントの例 としては、原型（ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ）のムラミルジペプチドのごときムラミル ジペプチド化合物、水酸化アルミニウム、サポニンおよびリポソームがある。

したがって本発明の第三の態様によって、第一のアジュバントなしのタンパク質 粒状抗原製剤と、第三のアジュバントを加えたタンパク質粒状抗原製剤からなる 免疫治療用または予防用のワクチン注射キットが提供される。この第一と第二の 製剤は一般に滅菌されている。

本発明の第四の態様によって、免疫治療もしくは予防に適合している疾患、特に ウィルスなどの微生物の感染症もしくは癌を治療もしくは予防する際に、組合わ せてまたは同時にまたは逐時投与するのに用いる、上記の第一と第二と製剤を含 有する製品が提供される。

本発明は、免疫治療または予防を行う方法、すなわち本発明の・第一の態様によ るアジュバントを含有しない製剤（ＣＴＬ応答を刺激する）、およびアジュバン ト含有製剤（体液性応答を刺激する）の作動量を被検者に投与することからなる 方法に有用である。投与計画はやはり医師または臨床家の指導下にあり、一般に 有効であるが非毒性であるように行われる。

本発明の各態様の好ましい特徴は、第一の態様については必要に応じて変更され る。

下記の実施例は本発明を例示するものであり、いずれにしろ本発明の範囲を限定 しない。これらの実施例は次の図面を参照する。

図ＩＡＳ　ＩＢおよびｌＣは、ハイブリッドＶ　３　：　ＴＶ−ＶＬＰｌ、１ｍ よる生体内ＣＴＬブライミングを示す（図ＩＡは実施例１に関連し、図ＩＢとＩ Ｃは実施例２に関連している）。

図２Ａと２Ｂは、ハイブリッドＶ　３　：　ＴＹ−ＶＬＰによる強力なＶ３特異 的ＣＴＬ応答の迅速誘導を示す（図２Ａは実施例３に関連し図２Ｂは実施例４に 関連している）。

図３は実施例５に関連し、Ｍ　Ｎ　Ｖ　Ｅ　：　ＴＹ−ＶＬＰによる免疫化の後 のＭＮＶ３特異的ＣＴＬ応答を示す。

図４は実施例６に関連し、Ｖ３特異的ＣＴＬ応答を誘導する際に、ハイブリッド Ｖ　３　：　ＴＶ−ＶＬＰの方が、ｖ３ペプチドおよびｇｐ１２０より優れてい ることを示す。

図５は実施例７に関連し、ＧＡＧ−Ｖ３粒子を用い、フロイント完全アジュバン トもしくは水酸化アルミニウムを含有するがあるいはアジュバントなしでＢＡＬ Ｂ／ｃマウスを免疫化した後のＶ３特異的ＣＴＬ応答を示す。

実施例１ アジュバントなしのハイブリッドＶ　３　：　ｒｙ−ｖｔ、ｐによる生体内ＣＴ Ｌブライミング ハイブリッドＶ　３　：　ｒｙ−ｖｔ、ｐの免疫原性を試験した。ハイブリッド Ｖ　３　：　Ｔｙ−ＶＬＰＩ；！、国際特許公開第ＮＯ−３８０３５６２号の実 施例３の方法に事実上したがって製造した。プロティンｐ１のアミノ酸１〜３８ １をコードする端を切り取った（　ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）Ｔ　Ｙ　Ａ遺伝子を有 するプラスミドｐＯＧｓ４０のＢａｍＨ１部位に、ｇｐ１６０のアミノ酸２９５ 〜３３４をコードする合成物（°ロスアラモスデータペース′、Ｉ［Ｂ　ＨＸＢ ２　Ｖ　３　ループ）を挿入した（　ｐＯＧｓ４０は国際特許公開第Ｎｏ−８８ ０３５６２号に記載されているｐＭＡ５６２０の誘導体である。

すなわちｌ＋ＭＡ５６２０のＰＧＫプロモーターは、ＰＧＫ遺伝子の５’非＝＋ −ティンク領域およびＧＡＬＩＩＯプロモーター（ヨーロッパ特許公開第０２５ ８０６７号）の上流活性化配列からなるハイブリッドプロモーターで置換されて いる〕。国際特許公開第ＮＯ−８８０３５６２号に記載されているようにして、 上記の得られたプラスミドで酵母の細胞を形質転換したがＶ３：Ｔｙ融合タンパ ク質が高レベルで発現した。その自己集合性Ｖ　３　：　ｒｙ−ｖｔ、ｐを、ス クロース密度勾配法、次いでサイズ排除クロマトグラフィーで精製しＦＣＡ、ミ ョウバンまたは食塩水中の１［［Ｂ　Ｖ　３　：　ｒｙ−ｖｔ、ｐを皮下に注射 することによってＢＡＬＢ／Ｃマウス（Ｈ−２’）を免疫化した。アジュバント なしのワクチンは投与する前に０．２２μｍのフィルターを用いてフィルター滅 菌を行うことができた。４６日目に反復投与した後、牌細胞を取り出して、４０ 量体（４０ｍｅｒ）のＩ［［’Ｂ　Ｖ　３ループペプチドおよび２％Ｒａｔ　Ｃ ｏｎＡ上澄み液（ＲＣＡＳ）で７日間生体外で再刺激し、次いで４０量体のＩＢ Ｖ３ペプチドとともにインキュベートしたｓ＋クロム標識化ｐ８１５標的細胞（ Ｈ−２４）に対して試験した（ｐ８１５細胞はＭＨＣクラス■を発現しないので 、ＭＨＣクラスＩと連係して該ペプチドを提供するにすぎない。ＣＴＬはある種 のペプチド配列を認識するがＭＨＣクラスＩと連係する場合しか認識しない）。

ＩＩ［Ｂ　Ｖ　３　：　ｒｙ−ｖｔ、ｐをアジュバントなしで注射することによ って、高レベルのｎＩＢ■３特異的ＣＴＬが誘導された（図ＩＡ）。低レベルの ＣＴＬ活性が、ＦＣＡ中のＩ［Ｂ　Ｖ　３　：　ｒｙ−ｖｔ、ｐによって免疫化 されたマウス由来のエフェクター細胞中に、最高のＥＡＴ比（１００：１）にお いて検出された。ミョウバンアジュバントを用いて、有意なＣＴＬブライミング は全く誘導されなかった。ペプチド感作がない場合、これら３群のエフェクター 細胞いおいていずれのＥ：Ｔ比でも、対照のｐ８１５が殺されることはなかった （＜５．０％）。

図Ｉ八についてさらに詳しく述べると、ＢＡＬＢ／ｃマウスは、ミョウバン中（ ・）、ＦＣＡ（０）中またはアジュバントなしで（閣）、２００μｇ（７）Ｉ［ ＢＶ　３　：　Ｔｙ−ＶＬＰを、θ８目と４６日目に皮下注射によって免疫化し た。７０日目に、１群当り２頭のマウスから膵臓を取出し、単個細胞浮遊液を調 製してプールした。

プールされた膵臓細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＴＣＭ−ＰＣＳ）および５　ｕ 　ｇ　／ｍｌノ４０量体１［ＩＢＶ３ペプチド（ＣＲＢ　Ｌｔｄ、社）を含有す るＲＰＭ１６４０培地（１０ｄ）中で７日間生体外で再刺激した。２４時間後、 ＣｏｎＡで刺激されたラット膵臓細胞（２９）由来で硫酸アンモニウムで濃縮さ れた上澄み液を、［Ｌ−２および他のサイトカイン類の起源として添加した（最 終容積濃度２％）。７日後、エフェクター（Ｅ）細胞を一回洗浄し、ＴＣＭ−Ｐ ＣＳ中に再懸濁し、その１００μβづつを、底がＵＲＮのウェル９６個を有する 微量滴定プレートの３個もしくは４個づつのウェル内の各種のＥ：Ｔ比の標的Ｔ 細胞（ＩＸＩＯ’／ウェル）１００μｌに添加した。標的細胞は、２０ｕｇ／ｍ ｌの４０量体Ｉ［［ＢＶ３ペプチドとともに３７°Ｃで一夜インキユベートした ｐ８１５　（Ｈ−２’）細胞（Ｉ　Ｘ　ｔｏ’／ｄ）であった。ペプチドでルス されたｐ８１５細胞と対照ｐａ１５細胞をＩ　ＩＣｒで標識しく３７°Ｃで１時 間、２０μＣｉ細胞）、次いで洗浄した後エフェクターに添加した。４〜５時間 後、各ウェルから１００μｌの上澄み液を取り出して計数を行った。比溶解率（ ％）（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　１ｙｓｉｓ）を、１００Ｘ　（（試験カウント数−自 然発生カウント数）／最大カウント数−自然発生カウント数）〕として計算した 。

最大放出量（ｍａｘｉｍｕｍ　ｒｅｌｅａｓｅ）は、１００μｊ７の５％Ｔｒｉ ｔｏｎ−ＸＩ００を１００μｌの標的細胞に添加することによって１１４製した 。Ｖ３　：　Ｔｙ−ＶＬＰでプライムされたエフェクター細胞の存在下での対照 標的細胞のバックグランド比溶解率は、いずれのＥ：Ｔ比でも５％を越えなかっ た。標的細胞からの自然放出量は１１％（ｐ８１５細胞＋ペプチド）および１０ ．１％（＋１８１５細胞、ペプチドなし）であった。誤差のバーは平均値からの 標準誤差を示す。

実施例２ ハイブリッドＶ　３　：　’ｒｙ−ｖｔ、ｐによって誘導されるＣＴＬの特異性 上記実施例１に記載されているのと同様にして、アジュバントなしでＩ［Ｂ　Ｖ 　３　：　ｒｙ−ｖｔ、ｐで免疫化したマウス由来の膵臓細胞を、４０量体１［ ＢＶ　３ペブドを用いて生体外で再刺激し、生成したエフェクター細胞を、４０ 量体の１［［ＢＶ３ループペプチド、またはｖ３ループの中央部分を表わす１５ 量体のＩ［［ＢＶ３ペプチドとともにインキュベートしたｐ８１’ｌＪ的細胞に 対して試験した（表１）。ｐ８１５標的細胞は、４０量体のｖ３ループペプチド または、Ｖ３ループの先端ペプチドとともに予めインキニーベートされると、ｖ ３特異的ＣＴＬによって標的細胞として認識された（図ＩＢ）。Ｉ［［Ｂ　Ｖ　 ３　：　Ｔｙ−ＶＬＰでプライムされたエフェクター細胞は、分離株特異的であ り、ＭＮもしくはＲＦ分離株のｖ３ループ配列を示すペプチドとともにインキニ ーベートされたｐ８１５細胞を認識しなかった（１００：１のＥ：Ｔ比で比溶解 率く５％）。ｐ８１５　（）ｌ−２つ細胞がＥＬ−４（Ｈ−２つ標的細胞で置換 された場合、特異的なキリング（Ｋｉｌｌｉｎｇ　）はなかった（データは示し ていない）。Ｅ：Ｔ比を一定に保持して長いＩ［ＢＶ　３ペプチドと短いＩＩｒ ＢＶ　３ペプチドを滴定したところ、５０％の溶解を行うのに必要な濃度差は２ ２−１ｏの差であった（図１ｃ）。これらのデータハ、Ｉ［Ｂ　Ｖ　３　：　’ ｒｙ−ｖｔ、ｐｉ＝　ヨッテ誘導され６ＣＴＬの特異性は、　ｔＳＣＯＭ中でｇ ９１６０および組換えｇｐ１６０を発現する組換ワクシニア（２４，１７）によ って誘導されるＣＴＬの特異性を類似していること示している。またこれらの結 果は、１５量体のｖ３ペプチドは、４０量体のｖ３ペプチドよりはるかに有効に 、ＭＨＣクラスＩ分子によってｐａ１５細胞上に提供できることを示している。

大きいペプチドは、２５２１分子によって最適の長さで与えられる前に、ｐ８１ ５細胞によるインターナリゼーションとプロセシングまたは細胞外分解が必要の ようである。外因性で可溶性のタンパク質抗原は、ＣＴＬを認識するようｐ８１ ５細胞でプロセスされないことが知られている（　ＣａｒｂｏｎおよびＢｅｖａ ｎ。

Ｊ、εＸＰ、　ＩＪｅｄ、、　１７１巻、３７７頁、１９９０年）が、小さなポ リペプチドのプロセシングについてはほとんど報告されていない。

図ＩＢについてより詳しく説明すると、上記図ＩＡ（実施例１・）に関連して免 疫化れた２頭のマウスから得てブール−した膵臓細胞を６２日目に集め、次いで ４０量体のＩＩＩＢＶ３ペプチドを用いて上記のようにして生体外で９日目再刺 激を行った。エフェクター細胞と、４０量体のｎｌ［ＢＶ３ペプチド２０μｇ／ −とともｌ：　（０）　、１５量体（ＤＩ［ＢＶ３ループｆ−／ブペプチド７３ ４　２０μｇ／−とともに（璽）またはペプチドなしく口）で上記のように予め インキニーベートしたｐ８１５細胞に対するＣＴＬ活性について検定した。自然 放出値は、１５．９％（ｐ８１５細胞＋４０量体のｖ３ペプチド）　、１３．６ ％　（ｐ８１５細胞＋１５量体Ｖ　３　ｔＬ、−ブチツブペプチド）、および１ ６．３％（ｐ８１５細胞、ペプチドなし）であった。

図ＩＣについてさらに詳しく述べると、ＣＴＬ検定は図ＩＡ（実施例１）に関連 して記載したエフェクター細胞を用い、かつ４０量体のＩ［ＩＢＶ３ループまた は１５量体のＩ［［ＢＶ３ループペプチドを育するｐ８１５標的細胞は各種濃度 で被検定物に直接添加した。Ｅ、Ｔ比は５０：１であった。ｐ８１５細胞からの 自然放出値はＢＡＬＢ／ｃマウスに、アジュバントなしで一回筋肉内注射した■ Ｂ　Ｖ　３　：　ＴＶ−ＶＬＰの投与応答作用を試験した。膵臓は先の実験の場 合よりはるかに早い時点（１８日目）に取り出した。十分なＣＴＬブライミング が、与えられた４種の投与量のすべての場合に誘導された（Ｉ］　２　Ａ）。Ｃ ＴＬ活性のピークは、２０μｇの投与量で免疫化されたマウスから生成されたエ フェクター細胞に認められた（１０：１のＥＡＴ比で比溶解率が５０％）。５μ ｇ投与量の方が１００μｇ投与量および５０μｇ投与量の場合より優れたＣＴＬ 応答を示した（ＣＴＬ応答は、５μｇ投与量では２７：ｌのＥ：Ｔ比で比溶解率 が５０％であった）。このことは、免疫原が多すぎると、このルートによるこの 時点ではＣＴＬブライミングに対して作置な作用があることを示している。これ らのデータは、ハイブリッドＶ　３　：　Ｔｙ−ＶＬＰが迅速かつ十分なＣＴＬ 応答をもたらす強力なＣＴＬ免疫原であることを示している。

抗ＣＤ４（ＧＫＩ−５）および抗ＣＤ８　（５３−６−７２）のラットモノクロ ーナル抗体（Ｍａｂ）をＣＴＬ被検被検定直接添加したところ、ＣＴＬ活性の選 択的阻害が、抗ＣＤ８Ｍａｂで処理した培養物にのみ認められたが（５０：１と ２５＝ｌのＥＡＴ比でそれぞれ２９．０％と３６．７％の阻害率）、これはその エフェクター細胞がＣＤ８＋ｖｅであることを示している。さらにＣ５７ＢＬ／ ６　（Ｈ−２１）マウスを１００μｇの■Ｂ　Ｖ　３　：　ＴＶ−ＶＬＰで免疫 化したところＣＴＬブライミングを誘導しなかった（標的としてＥＬ−４細胞を 使用した。データは記載していない）が、とのことはＩ［ＩＢＶ３特異的ＣＴＬ はＨ−２１遺伝子座で制限されていることを示している。

図２Ａについてさらに詳しく述べると次のとおりである。食塩水ニイれたＩ［Ｉ ＢＶ３　：Ｔｙ−ＶＬＰ　１００μｇ　（０）　、５ｏｔｔｇ　（・）、２０μ ｇ（ロ）または５μｇ（閣）をＢＡＬＢ／ｃマウスに筋肉内に注射して免疫化し た。１８日目に、プールした牌細胞（ｌグループ当り２個の膵臓）を４０量体ｖ ３ペプチドを用いて６日間再刺激し、次いで図ＩＡに記載したのと同様に４０量 体ｖ３ペプチドでパ・ルスされたｐ８１５標的細胞または対照のｐａｔｓ標的細 胞の比溶解率についてエフェクター細胞を試験した。対照標的細胞の比溶解率は すべての投与量に対して、すべてのＥ：Ｔ比で〈５．０％であった。自然放出量 は１１．５％（ｐ８１５細胞＋ｖ３ペプチド）および１３．５％（ｐ８１５細胞 、ペプチドなし）であった。繰返し試験データの標準誤差はく５％であった。

実施例４ ！［Ｂ　Ｖ　３　：　Ｔｙ−ＶＬＰカ、ＭＨＣクラスＩのプレゼンテーション（ Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏ口）に対する正しい抗原プロセシング経路に入ることが できるということを確認するため、ｐ８１５細胞を、Ｉ［ＢＶ３　：　Ｔｙ−Ｖ ＬＰ、４０量体１［ＢＶ　３ペプチドまたは非ハイブリッドの対照ｒｙ−ｖｔ、 ｐを用いて一夜パルスした。次にこれらの標的細胞と対照（７）ｐ８１５細胞ヲ ５ｌＣｒテ標識を付けて、Ｉ［Ｂ　Ｖ　３　：　Ｔｙ−ＶＬｌ’テ誘導されたエ フェクターＣＴＬに対して試験した。ｖ３ペプチドで、パルスされた標的細胞お よびＩ　Ｂ　Ｖ　３　：　’ｒｙ−ｖｔ、ｐでパルスされた標的細胞はＶ３特異 的ＣＴＬによって有効に殺された（図２Ｂ）。このことはｐ８１５細胞が粒状免 疫原をプロセスしてＭＨＣクラス■分子にＣＴＬエピトープを発現できることを 示している。これらの細胞は、クラスＩのプレゼンテーションに対して可溶性タ ンパク質をプロセスしないことはすでに報告されている（Ｃａｒｂｏｎｅおよび Ｂｅｖａｎ、　Ｊ、Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、　１７１巻、３７７頁、１９９０年） 。

ＩＥ２Ｂについてさらに詳しく説明すると次のとおりである。

上記の投与量ｌＯＯμのグループ由来のエフェクター細胞を、４０量体ｖ３ペプ チド（５０μｇ／　５　Ｘ　１０’細胞）　、Ｉ［ＩＢＶ　３　：　Ｔｙ−ＶＬ Ｐ（ｌｏｎμｇ／　５　Ｘ　ｌｏ’細胞）もしくは対照ｃ７）Ｔｙ：ＶＬＰ（１ ００μｇ１５Ｘ１０’細胞）で−夜パルスされたｐ８１５細胞または抗原なしの ９８１５細胞について試験した。ＥＡＴ比は６０：１であった。

ＭＮＶ　３　：　Ｔｙ−ＶＬＰテ誘導されるｖ３特異的ＣＴＬ（７）特異性以前 のデータは、ＭＮＶ３ループが、Ｈ−２Ｄ’によって制限されるＣＴＬエピトー プを含有していることを示していた。ＢＡＬＢ／ｃｖ　’ｙ　スをハイブリッド ＭＮ　Ｖ３　：Ｔｙ−ＶＬＰ　１００μｇを筋肉内注射して免疫化し、このハイ ブリッドがＭＮＶ３特異的ＣＴＬ応答を誘導するかどうかを試験した。かなりの レベルのＣＴＬｉ性が、ＭＮでパルスされたｐ８１５細胞に対して検出されたが Ｉ［ＢもしくはＲＦのペプチドでパルスされたｐ８１５細胞に対しては゛それほ ど検出されなかった（図３）。Ｉ［ＢＶ３ペプチドでパルスされたｐ８１５細胞 のキリングは、ＲＦＶ３ペプチドとパルスされていないｐ８１５細胞にみとめら れたキリングをわずかに越え増大したが、これは低レベルの交差反応性を反映し ているのであろう。それ故、ハイブリッドＶ　３　：　ｒｙ−ｖｔ、ｐ免疫原は 、アジュバントを必要とせず、かつ比較的低い投与量で、生きているワクシニア ｇｐ１６０およびアジュバント［ＳＣ０Ｍを加えた組換えｇｐ１６０によって誘 導されるのと類似の特異性を有するＣＴＬをプライムできるようである。

、図３は、ＭＮＶ　３　：　Ｔｙ−ＶＬＰテ免疫化した後（７）ＭＮＶ３特異的 ＣＴＬ応答を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスにハイブリッドＶＬＰ　１００μｇを筋 肉内注射して免疫化した。８８目に膵臓を取り出し、プールした牌細胞（２個の 膵臓）を、ＭＮＶ３ペプチド（５μｇ／−）で６日間再刺激を行った。それぞれ ２０μｇ／−のＩ［Ｂ（■）、（ロ）もしくはＲＦ（・）のｖ３ループペプチド で一夜パルスしたかまたはペプチドなしく０）のｐ８１５標的細胞に対して検定 した。自然放出量は、１７．６％（ｐ８１５＋　Ｉ［Ｂ　Ｖ　３ペプチド）、１ ８．７％（ｐ８１５＋ＭＮＶ　３ペプチド）　、１９．８％（ｐ８１５＋ＲＦＶ ３ペプチド）および１７．７％（ｐ８１５細胞、ペプチドなし）でＶ　３　：　 ｒｙ−ｖｔ、ｐ、組換えｇｐ１２０およびｖ３合成ペプチドの比較免疫原性 合成ペプチド（４０量体Ｉ［［ＢＶ３ループ）および組換えｇｐ１２０によって アジュバントなしでハイブリッドＶ　３　：　ｒｙ−ｖｔ、ｐをＣＴＬブライミ ングすることによって免疫原性を比較するため、８ＡしＢ／ｃマウスを、当量の Ｖ３ループ投与量（２μｇ／マウス）の３タイプのＶ３ループ免疫原およびはる かに高い投与量のｖ３ペプチド（投与量・　１００μｇ）で免疫化した。Ｉ［［ ＢＶ３：ＴＹ−ＶＬＰを筋肉内注射して免疫化させたマウス由来のエフェクター 細胞は、約４．１のＥ：Ｔ比において５０％のキリングを示したが、皮下注射の ルートではそれほど有効でなかった（１０：ｌにおいて５０％比較溶解率）。ｇ ｐ１２０で誘導されたエフェクター細胞は、ＩＩＩ　Ｂ　Ｖ　３　：　ＴＹ−Ｖ ＬＰで誘導されたエフェクター細胞より約２５倍効力が小さかった。モしてｖ３ ペプチドで誘導されたエフェクターのキリングは、　１００μｇ／マウスの投与 量でさえも１００：１の比で１０．３％に過ぎなかった（図４）。

正常な牌細胞をｖ３ペプチドを用いて生体外で再刺激したところｖ３特異的ＣＴ Ｌを誘導しなかった。このことはこの系で我々が検出したＣＴＬは生体内でのプ ライミングによるものであることを確証している。Ｖ　３　：　ｒｙ−ｖｔ、ｐ で免疫化したマウス由来の新鮮で再刺激されていない牌細胞のｖ３特異的ＣＴＬ はこれまで検出されていないことは興味深い。上記のことは、適当な標的細胞を 殺すことができるようになるまでに追加の刺激（分化）を必要とするＣＤ８＋ｖ ｅ前駆体ＣＴＬが、生体内のブライミングによって増殖し、そしてさらに生体内 で追加刺激を行っても上記の刺激を与えないようであることを示している。

図４は、バイブ’Ｊ−／ドＶ　３　：　Ｔｙ−ＶＬＰカ、Ｖ３特異的ＣＴＬ応答 の誘導についてはｖ３ペプチドおよびｇｐ１２０より優れていることを示してい る。ＢＡＬＢ／ｃマウスは次のように免疫化した。４゜量体１１１［ＢＶ３ペプ チド１００μｇ（ロ）または２μｇ（・）、組換えｇｐ１２０　（７フイ＝テイ テ精製したｒｇｐ１２０．　ＣＨＯ由来）ＭＲＣＯＡ［ＬＰ）２３μｇ　（０） もしく　ＩＬ　Ｉ［［Ｂ　Ｖ　３　：　Ｔｙ−ＶＬＰ２０μｇ　（■）を筋肉内 注射し、まタハＩ［［ＢＶ３　：Ｔｙ−ＶＬＰ２０μｇヲ皮下注射しく△）で免 疫化した。また（ム）は免疫化させなかったマウスを示す。２５日目に、プール した牌細胞（ｌグループ当り、２信の牌［１）をＩＩｒＢＶ３ペプチドで６日間 再刺激し、次いでエフェクター細胞を図ＩＡについて述べたようにして検定した 。自然放出量は１２．３％（ｐ８１５＋Ｖ３ペプチド）および１２．４％（ｐ８ １５細胞、ペプチドなし）であった。各Ｅ：Ｔ比における対照ｐ８１５標的細胞 の比溶解率値（％）を、ペプチドパルスされたｐ８１５細胞の比溶解率値から差 引いて正味の比溶解率値（％）をめた。対照ｐｓ１５標的細胞の１００：ｌのＥ ＡＴ比における比溶解率は２１．１％（ｒｇｐ１２０）、８．８％（Ｖ３ペプチ ド、２　μｇ）、１３．９％　（Ｖ　３ペプチド、１００μｇ＞　、０　％　（ ＩＩＩＢＶ　３　：　ＴＶ−ＶＬＰ、筋肉内注射）、７，７％ＣＭＢＶ３　：Ｔ ｙ−ＶＥ、Ｐ皮下注射）および０％（非免疫）であった。繰返し試験の標準誤差 はく５％であった。

端を切り取った２８２部分によって形成されたハイブリッド粒子の製剤をｖ３ペ プチドに融合させ、以下のように処理した。

ＨＩＶ−１ｇ　ａ　ｇ構造体をプラスミドｐＯＧｓ２から誘導した。ｐｏｃＳ２ は、プラスミドｐＳＰ６４　（Ｍｅｌｔｏｎら、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ ｓ、、１２巻、７σ３５頁、１９８４年）に、Ｓｓｔ　Ｉ　−Ｂｅｔ　Ｉ制限フ ラグメントとして挿入された旧Ｖ−ＩＢ１（１０のヌクレオチド６７８〜２４７ ｏを含有している。

このｇａｇ遺伝子はヌクレオチド７９０〜２３２５によってコードされている。

便利なりａｍＨＩフラグメント上にｇａｇ遺伝子を与えるために、　ｐｏｃｓ２ を、Ｂａ１３１ｚキソヌクレアーゼとＢａｍＨＩリンカ−を用いて修飾した。ｇ ａｇフラグメント３′末端を修飾するために、プラスミドｌｌ０ＧＳ２をＳａｌ ［で開裂させ、Ｂａ１３１エキソヌクレアーゼで数回消化し、次いで過剰のＢａ ｍＨＥリンカ−（ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧ）の存在下で再連結を行った。得られた プラスミドの欠、失末端部をＤＮＡ配列決定法でめた。プラスミドｐＯ３１１は 、ＢａｍＨ１部位がｇａｇ終止コドンに対して＋４９の位置にある欠失誘導体で ある。ｇａｇフラグメントの５′末端を修飾するために、ｐＯＧｓ２をＥｃｏｒ ｌで開裂し、Ｂａ１３１エキソヌクレアーゼで数回消化し、次いで過剰０）　Ｂ ａｍＨＩリンカ−（ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧ）　（７）存在下で再連結させた。そ の欠失末端部をＤＮＡ配列決定法でめた。プラスミドｐＯＧｓ１２は、Ｂａｗｌ 　［部位がｇａｇの開始コドンＡＴＧに対して−２２の位置にある欠失誘導体で ある。ＢａｍＨ［部位が０両側に隣接しているｇａｇ遺伝子を提供するＰＯＧＳ ＩＩ由来のＢｇｌ　ＩＦ　−Ｂｇｌ　Ｉ［フラグメントで置換した。得られたプ ラスミドをｐＯＧＳ１５と命名した。

Ｃ末端の７５個の残基が除かれたｇａｇ遺伝子を作るために、合成のオリゴマー ５ＥＡＧＡＧ１０８および５ＥＡＧＡＧ１０９を、ＢｇｌＩ［で予め開裂された ｐＯＧｓ５５４中に挿入した。この挿入によって、Ｂｇｌ■部位の下流に終止コ ドンとＢａｍＨ１部位が生成する。得られたプラスミドはｐＯＧｓ５６２と命名 され、ＢａｍＨＩカセットとして、端を切り取られたｇａｇ遺伝子を含有してい る。

端を切り取られたＨＩＶ−１ｇ　ａ　ｇ遺伝子およびｖ３ループ配列を含有する 融合遺伝子を、ＨＩＶ−１分離株ＨＸＢ２　（Ｆｉｓｈｅｒらの１９８６年の前 記文献）由来のｖ３ループ配列をコードする合成オリゴマーをプラスミドｐＯＧ ｓ５６２のＢｇｌｌ［部位に挿入することによって製造した。得られたプラスミ ドはｐＯＧｓ５６３と命名され、ＲａｍＨ［カセットとして、ｇａｇ　（端を切 り取られている）：ｖ３ループ融合遺伝子を含有している。

上記の端を切り取られたｇａｇ／Ｖ３ループカセットを、Ｂａｍ旧フラグメント としてＰＯＧＳ５６３から切り取り、バキュロウィルス発現ベクターｐＡｃＲＰ ２３中にクローン化してｐＯＧｓ５７４を生成さ・せな。プラスミドｐＡＣＲＲ ２３は、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆ ｏｒｎｉｃａ）の核多角体病ウィルス（ＡｃｎＰ■）由来の強力なポリへドリン プロモーターおよびＡｃＮＰＶ配列が両側に隣接している異種遺伝子を挿入する ためのユニークＲａｒｎ旧９部位をもっている。またプラスミドｐＡｃＲＰ２３ は、イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）中のプラスミドを複製し選択する配列をもって いる（Ｍａｔｓｕｕｒａら、Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、、　６８＠、１２３ ３頁、１９８７年）。このｇａｇ遺伝子誘導体はこのベクターのＢａｍＨＩ部位 にクローン化されると前記ポリへドリンプロモーターに開園される。

スボドブテラ・ギペルダ９　（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ９ ）（ＳＦ９）と命名された細胞系（ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍ１ｔｈ、　Ｔｅｘ ａｓ　ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａＩ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　５ｔａｔｉｏｎ　Ｂ ｕｌｌｅｔｉｎ　Ｎｏ、　１５５５）は、鱗翅目昆虫の細胞系ＩＰＬＢ−３ｆ２ ＋−ＡＥ　（Ｖａｕｇｈｕら、Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ、１３巻、２１３頁、１９７７ 年）のクローナル誘導体であるが、これを使用した。１０％の熱不活性化ウシ胎 児血清（ＩＣＮ−ＦＬＯＷ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、米国）＋５０１０／ Ｔｎｌのペニシリンおよび５０■／−のストレプトマイシン（Ｇ　ＩＢｃｏ−Ｓ ＲＬ社、英国）を含有するＴＣｌｏｏ（Ｇ［ＢＣＯ−ＢＲＬ社、英国）からなる 培地中で、細胞を、浮遊培養法で増殖させた。

組換えバキュロウィルスを、相同ＤＮＡ配列間の生体内組換えの現象を利用して 調製した。ウィルス（ＡＣＮＰＶ）　Ｄ　Ｎ　ＡおよびプラスミドＤ　Ｎ　Ａ　 （ｐＯＧｓ５５３、　ｐＯＧｓ５５６、　ｐＯＧｓ５７２またはｐＯＧｓ５７４ ）を、塩化カルシウム沈殿法によってＳＦ９昆虫細胞中に導入し、４８時間後に 子孫を回収した（ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉ　ｔｈの前記文献・）。組換えバ キュロウィルスを、Ｂｒｏｗｎ＆Ｆａｕｌｋｎｅｒプラーク検定法（Ｂｒｏｗｎ およびＦａｕｌｋｎｅｒ、　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、、　３６巻、３６１ 頁、１９７７年）で、ポリヘトリン陰性表現型に基づいて選択した。プラークを 精製した後、組換えウィルスの高力値のウィルス株を調製し、その力値をプラー ク検定法で測定した。

上記細胞を、感染してから４８時間後に収穫し、１０００　ｇで遠心分離してペ レット化した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した後、その細胞を溶解し、 次いで粒子を標準の方法によって収、穫した。

ＣＴＬ応答はＧＡＧ　：　Ｖ３粒子による免疫化を行った後に測定した。ＧＣＡ 中、水酸アルミニウムのアジュバントとともにまたはアジュバントなしで２０μ ｇの投与量で、マウスに一回筋肉内に投与した。アジュバントなしの製剤は投与 する前に０．２２μｍのフィルターでフィルター滅菌できた。牌細胞を２８日後 に取り出し、Ｉ［Ｖ３ループの配列に対応する４０量体の１［［ＢＶ３ペプチド を用いて６日間生体外でクローン増殖させることによって膨張させた。

このようにして誘導されたエフェクター細胞を、対照ｐ８１５細胞、またはＩｆ ｆＢＶ３の４０量体ペプチドで標識を付けたｐ８１５細胞に対するその細胞障害 活性について試験した。

Ｉ［Ｂペプチドで標識した標的細胞の高レベルの比溶解率が、アジュバントなし で免疫化されたマウス由来のエフェクター細胞を用い、６日後に観察され、そし てこれは低ＥＡＴ比で滴定された（図５）。低レベルの比溶解率はＦＣＡで免疫 化されたマウス由来のエフェクター細胞を用いた場合にみとめられた。

Ｂ型肝炎粒状表面抗原によるＣＴＬ応答の誘導Ｂ型肝炎の表面抗原が粒子中に集 合することができることは以前に報告されている（ヨーロッパ特許願公開第０１ ７５２６１号）。

このタンパク質はいくつものＣＴＬエピトープを含有している（Ｍｏｒｉｙａｍ ａら、５ｃｉｅｎｃｅ、　２４８巻、３６１〜４頁、１９９０年）。したが、り て、ＣＴＬ応答は、米国、カリフォルニア州所在のＢｉｏｎｉｋｅ社から入手可 能なり型肝炎表面抗原粒子でマウスを免疫化した後に測定することができる。マ ウスには、アジュバントなしで５〜１００μｇの範囲の投与量で一回、滅菌筋肉 内投与を行う。

て、７〜１２日間生体外でクローン増殖させることによって膨張させた。このよ うにして誘導されたエフェクター細胞は、対照細胞またはＢ型肝炎表面抗原で標 識を付けた細胞である同族ハブロタイブの細胞とともにインキュベートされると 、ＭＨＣクラスＩ抗原が上記ＣＴＬエピトープに対応するペプチドを有するこれ らの標的細胞が溶解する。

Ｂ型肝炎コア抗原中に存在するいくつかのＣＴＬエピトープが報告されている（ 例えばＥｈａｔａら、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、、　８９巻、３３２〜 ３３８頁、■９９２年ＨＧｕｉｌｈｏｔら、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、、６６巻、２６ ７９〜２６７８頁、１９９２年ＨＰｅｎａら、Ｊ、　ＥＸＰ、　Ｍｅｄ、、１７ ４巻、１５６５〜１５７０頁、１９９１年）。マウスは、アジュバントなしでＢ 型肝炎コア抗原粒子を５〜１００μｇの範囲の投与量で一回、滅菌筋肉内投与を 受ける。牌細胞を２０日後に取り出し、Ｂ型肝炎コア抗原を用いて、７〜１２日 間生体外でクローン増殖させることによって膨張させた。このようにして誘導さ れたエフェクター細胞は、対照細胞またはＢｕ肝炎コア抗原で標識をつけた細胞 である同族ハブロタイブの細胞とともにインキュベートされると、ＭＨＣクラス Ｉ抗原が上記のＣＴ　Ｌエピトープに対応するペプチドをもっている標的細胞が 溶解する。

Ｂ型肝炎表面抗原が、Ｂ型肝炎表面抗原由来の粒子形成配列および第二の生物活 性配列を含有するハイブリッド粒子中に集合できることはすでに報告されている （ヨーロッパ特許公開第０１７５２６１号）。上記の第二の非相同配列はＣＴＬ エピトープを含有しているようである。ヨーロッパ特許公開第０１７５２６１号 に記載されているように、Ｂ型肝炎表面抗原由来の粒子形成配列およびＢ型肝炎 表面抗原のＮ末端に融合したＨＩＶ−１１１［Ｂ変異体のｖ３ループ配列からな るハイブリッド粒子を、ＢＡＬＢ／ｃマウスのＣＴＬ応答を測定するのに使用す る。マウスには、アジュバントなしで５〜１００μｇの範囲内の投与量で一回滅 菌筋肉内投与を行う。牌細胞を２０日後に取り出し、Ｉ［ＩＢＶ３ループの配列 に対応する４０量体またはそれより小さいＩ［［ＢＶ３ペプチドを用いて生体外 で７〜１２日間クローン増殖をさせることによって膨張させた。このようにして 誘導されたエフェクター細胞は、対照のｐｓｔｓ細胞または４０量体のＩ［ＢＶ ３ペプチドで標識をつけたｐ８１５細胞とともインキュベートされると、ＭＨＣ クラスＩ抗原が上記ＣＴＬエピトープに対応するペプチドをもっている標的細胞 が溶解する。

Ｂ型肝炎コア抗原由来の粒子形成配列およびＨＩＶ−１のＩ［ＩＢ変異体のｖ３ ループ配列由来のＣＴＬエピトープを含有する第二配列を有するハイブリッド粒 子を使用して、ＢＡＬＢ／ｃマウスのＣＴＬ応答を測定した。マウスには、アジ ュバントなしで５〜１００μｇの範囲内の投与量で一回滅菌筋肉内投与を行う。

牌細胞を２０日後に取り出し、次に、Ｉ［［ＢＶ３ループの配列に対応する４Ｇ 量体もしくはそれより小さいＩ［［ＢＶ３ペプチドを用い生体外で７〜１２日間 クローン増殖をさせることによって膨張させる。

このようにして誘導されたエフェクター細胞は、対照ｐ８１５細胞または４０量 体ＩＢＶ３ペプチドで標識を付けたｐ８１５細胞とともにインキュベートすると 、ＭＨＣクラスＩ抗原が上記ＣＴＬエピトープに対応するペプチドをもっている 標的細胞が溶解する。

ブルータングウィルス（ＢＴＶ）のＶＦ６とＶＦ６のコアタンパク質はともに、 中空のＢＴＶコア様粒子粒子成することができる（Ｆｒｅｎｃｈ、　Ｔ、Ｊ、お よびＲｏｙ、　Ｐ、、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、、　６４巻、１５３０〜１５３６頁 、１９９０年）。ＣＴＬ応答は、このようなブルータングウィルスの粒子でマウ スを免疫化した後に測定する。マウスには、アジュバントなしで５〜１１００ｕ の範囲の投与量で一回滅菌筋肉内投与を行う。牌細胞を２０日後に取り出し、Ｖ Ｐ３／ＶＰ７粒子を用い生体外で７〜１２日間クローン増殖させて膨張させる。

このようにして誘導されたエフェクター細胞を、対照細胞またはＶＰ３／“ＶＰ ７粒子で標識をつけた細胞である同族へプロタイプの細胞とともにインキュベー トすると、ＭＨＣクラスＩ抗原が上記ＣＴＬエピトープに対応するペプチドを有 する標的細胞が溶解する。

ブルータングウィルスのＶＦ６とＶＦ６のコアタンパク質は、ＢＴＶ外層キャプ シドタンパク質ＶＰ２およびＶＦ６とともに発現されると非感染性の二重外殻タ ンパク質を形成することができる（Ｆｒｅｎｃｈ、　Ｔ、Ｊ、、　Ｍａｒｓｈａ ｌｌ、　Ｊ、Ｊ、Ａ、およびＲｏｙ、　Ｐ、、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、。

６４巻、５６９５〜５７００頁、１９９０年）。ＣＴＬ応答は、このような二重 殻ブルータングウィルス粒子でマウスを免疫化した後に測定する。マウスには、 アジュバントなしで５〜１１００ｕの範囲の投与量で一回滅菌筋肉内投与を行う 。牌細胞を２０日後に取り出し、次いで、二重殻ブルータングウィルス粒子を用 い生体外で７〜１２日間クローン増殖させることによって膨張させる。このよう にして誘導されたエフェクター細胞は、対照細胞または二重数ブルータングウィ ルス粒子で標識を付けた細胞である同族バブロタイブの細胞とともにインキュベ ートされると、ＭＨＣクラス■抗原が上記エピトープに対応するペプチドをもっ ている標的細胞が溶解する。

ブルータングウィルスのＶＦ６とＶＦ６のタンパク質は、ＶＦ６のＮ末端におい て融合されている非相同の生物活性配列を含有するハイブリッド粒子中に集合す ることができる。上記配列はＣＴＬエピトープを含有しているようであるブルー タングウィルスのＶＦ６とＶＦ６のコアタンパク質およびＨ［Ｖ−１のＩ［Ｂ変 異体のＶ３ループ配列からなるハイブリッド粒子を用いて、ＢＡＬＢ／ｃマウス のＣＴＬ応答を測定する。マウスには、アジュバントなしで、５〜１００μｇの 範囲の投与量で一回、滅菌筋肉的投与を行う。牌細胞を２０日後に取出し、Ｉ［ ＩＢＶ３ループの配列に対応する４０量体もしくはそれより小さいＩ［［ＢＶ３ ペビチドを用い生体外で７〜１２日間クローン増殖させることによって膨張させ た。

このようにして得られたエフェクター細胞は対照ｐ８１５細胞または４０量体の Ｉ［ＢＶ３ペプチドで標識を付けたｐ８１５細胞とともにインキュベートされる と、ＭＨＣクラスＩ抗原が上記ＣＴＬエピトープに対応するペプチドをもってい る標的細胞が溶解する。

ハイブリッド二重殻粒状ブルータングウィルスによるＣＴＬ応答の誘導 ブルータングウィルスのＶＦ６、ＶＦ６、ＶＦ６およびＶＦ６のタンパ゛り質は 、ＶＦ６のＮ末端に融合された非相同の生物活性配列を含有するハイブリッド粒 子中に集合することができる。このような非相同配列はＣＴＬエピトープを含有 しているようである。

ブルータングウィルスのＶＦ６、ＶＦ６、ＶＦ６およびＶＦ６のタンパク質なら びに旧Ｖ−１のＩ［Ｂ変異体のＶ３ループ配列からなるハイブリッド粒子を使用 してＢＡＬＢ／ｃマウスのＣＴＬ応答を測定する。マウスには、アジュバントな しで、５〜１００μｇの範囲の投与量で一回、滅菌筋肉的投与を行う。牌細胞を ２０日後に取り出し、Ｉ［［ＢＶ３ループの配列に対応する４０量体またはそれ より小、さい１［［ＢＶ　３ペプチドを用い生体外で７〜１２日間クローン増殖 をさせることによって膨張させる。エフェクター細胞は４０量体のＩＢＶ３ペプ チドで標識をつけられ、その結果、ＭＨＣクラスＩ抗原がＣＴＬエピトープに対 応するペプチドをもっている標的細胞が溶解する。

ヒト乳頭腫ウィルス−Ｌ２（マイナーキャプシド）タンパク質（ＲＰＶ−Ｌ２） はいくつものＣＴＬエピトープを含有していると考えられる。Ｔｙに融合された ＨＰＶ−Ｌ２のハイブリッド粒子（ＨＰＶ−Ｌ２　：　ＴｙＶＬＰ）は、次のよ うにしてベクターｐＯＧｓ３４８を構築することによって調製した。Ｔｙ遺伝子 およびヒト乳頭腫ウィルスＬ２遺伝子を含有する融合遺伝子が、Ｌ２遺伝子の塩 基番号４５６８〜４８６５に対応する３００塩基対の配列を、ｐＯＧｓ４０のＢ ａｍＨＥのクローニング部位に挿入することによって製造された。得られたプラ スミドを用いて、国際特許公開第ＷＯ−８８０３５６２号に記載されているよう にして、酵母株を形質転換した。ＨＰＶ−Ｌ２　：　ＴＹＶＬＰが高レベルで発 現された。これをスクロース密度勾配方法およびサイズ排除クロマトグラフィー で精製し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥで分析した。ハイブリッド粒子を滅菌し、その２０ μｇを用い、アジュバントなしで、−回筋肉内投与を行ってマウスを免疫化した 。免疫化を行うのに３系統のマウスすなわちＢａ１ｂ／ｃ　（Ｈ２つ、Ｃ３Ｈ／ Ｈｅｊ（Ｈ２”）およびＣ５７ＢＬ／６　（）１２’）を使用した。牌細胞を２ ０日後に取り出し、ハイブリッド）ＩＰＶ−Ｌ２　：　ＴＹＶＬＰを用い生体外 で７〜１２間クローン増殖を行わせて膨張させる。このようにして誘導されたエ フェクター細胞を、対照細胞またはＨＰＶ−Ｌ２　：　ＴＹＶＬＰで標識をつけ た細胞である同族ハブロタイブの標的細胞とともにインキュベートすると、ＭＨ Ｃクラス■抗原が上記ＣＴＬエピトープに対応するペプチドをもっている標的細 胞が溶解する。Ｂａ１ｂ／Ｃマウスに対する同族ハブロタイブの細胞はｐ８１５ 細胞であり、Ｃ３Ｈマウスに対する同族ハブロタイブの細胞はＬＢＲＭ−３３− ＩＡＳ細胞であり、およびＣ５７マウスに対する同族ノ１プロタイプの細胞はＥ Ｌ４細胞である。

マカク内のＶ　３　：　Ｔｙｖｔ、ｐによるＣＴＬ応答の誘導１［Ｂと、ＭＮの Ｖ　３　：　ＴＹＶＬＰを上記のようにして調製した。

マ′カクを、アジュバントなしで、２００μｇの少なくとも一回の滅菌筋肉的投 与によって免疫化を行った後、末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）を４０量体またはそ れより小さいｖ３ペプチドを用いて生体外で７〜１２間膨張させてエフェクター 細胞を生成させることによってＣＴＬ活性を評価した。またＰＢＬをＰＨＡもし くはＣｏｎＡで刺激し、４０量体もしくはそれより小さいｖ３ペプチドで標識つ けて標的細胞を得た。標的細胞とエフェクター細胞をインキュベートすると、Ｍ ＨＣクラスＩの抗原が上記ＣＴＬエピトープに対応するペプチドをもっている標 的細胞が溶解する。

１［［ＢとＭＮのＶ３　：　ｇａｇＶＬＰを上記のようにして調製した。マカク を、アジュバントなしで、２００μｇの少なくとも一回の滅菌筋肉的投与によっ て免疫化した。免疫化を行った後、末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）を４０量体もし くはそれより小さいｖ３ペプチドまたはｇａｇＶＤＰを用いて膨張させてエフェ クター細胞を生成させることによってＣＴＬ活性を評価した。またＰＨＢＬをＰ ＨＡもしくはＣｏｎＡで刺激し、次いでｇａ、ｇ−ＶＤ’Ｐ　、オーバーラッピ ングｇａｇペプチドまたは４０量体もしくはそれより小さいｖ３ペプチドで標識 をつけて標的細胞を得た。

標的細胞とエフェクター細胞をインキュベートすると、ＭＨＣクラスＩの抗原が 上記ＣＴＬエピトープに対応するペプチドをもっている標的細胞が溶解する。

ＨＩＶｐ２４タンパク質はＣＴＬに対するエピトープを含有していることが報告 されている（Ｎｉｘｏｎ、　Ｄ、Ｐ、　ら、Ｎａｔｕｒ、　３３６巻、４′８４ 〜４８７頁、１９８８年）。ハイブリッドｐ　２４−ＴｙＶＬＰを国際特許第Ｗ Ｏ−０８８０３５６号に開示されているようにして製造した。マカクを、アジュ バントなしで、２００μｇの投与量で一回の滅菌筋肉内投与で免疫化した。ＣＴ Ｌ活性は、ｐ２４−ＶＬＰまたはオーバーラッピングｇａｇペプチドを用いて末 梢血液白血球（ＰＢＬ）を膨張させてエフェクター細胞を生成させることによっ て、免疫化してから１４日後に評価した。またＰＢＬはＰＨＡもしくはＣｏｎＡ で刺激し、次いでｇａｇ−ＶＤＰまたはオーバーラッピングｇａｇペプチドで標 識をつけて自所在性（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）標的細胞を得た。標的細胞とエフ ェクター細胞をインキュベートすると、ＭＨＣクラスＩ抗原が上記ＣＴＬエピト ープに対応するペプチドをもっている標的細胞が溶解する。

ＨＩＶのＣＴＬエピトープで重要になる可能性がある三つはＴＩ、　Ｔ２および Ｔｈ４．１である。これらのエピトープに対応するペプチド配列は下記のとおり である。

ＴＩ＋　ＩＫＱＩ［ＮＭＷＱＥＶＧＫＡＭＹＡＰＴ２：　ＭＨＥＤＩＩＳＬＷＤ ＱＳＬＫＰＣＶＫＴｈ４．１：　ＥＧＴＤＲＶ　ＩＥＶＶＱＧＡＣＲＡ　ＩＲＴ ｙに縦方向−列に融合された上記３種のエピトープのバイブ’Ｊ　７　ト粒子（ ＴＩＴ２Ｔｈ４．１　：　ＴＹＶＬＰ）　ｔ；！ベクターｐＯＧｓ３４６を構築 することによって製造した。融合遺伝子は、これら３種のエピトープに対応する ＤＮＡ配列を、縦方向−列に、ｐＯＧｓ４０のＢａｍＨ［クローニング部位に挿 入することによって製造した。得られたプラスミドを用い、国際特許公開第Ｎｏ −８８０３５６２号に記載されているようにして酵母株を形質転換した。ＴＩＴ ２Ｔｈ４．　ｌ　：　’ｒｙｖしＰが高レベルで発現された。これをスクロース 密度勾配法およびサイズ排除クロマトグラフィーで精製し、ＳＯＳ／ＰＡＧＥで 分析した。ハイブリッド粒子は滅菌し、２０μｇを用い、アジュバントなしで一 回、筋肉内投与することによってマウスを免疫化した。

免疫化には、３系統のマウス：　Ｂａ１ｂ／ｃ　（Ｈ２つＣ３Ｈ／Ｈｅｊ（Ｈ２ ’）およびＣ５７／ＢＬ６　（Ｈ２’）を使用した。牌細胞を２０日後に取り出 し、ＴＩ、　Ｔ２およびＴｈ４．１に対応する合成ペプチドを用い生体外で７〜 １２日間クローン増殖を行い膨張させる。このようにして誘導されたエフェクタ ー細胞を、対照細胞、またはＴＩ、　Ｔ２および・Ｔｈ４．１のペプチドで標識 を付けた細胞である同族ハブロタイブの標的細胞とともにインキュベートすると 、ＭＨＣクラスＩの抗原が上記ＣＴＬエピトープに対応するペプチドをもってい る標的細胞が溶解する。そのハブロタイブが使用されるマウスの系統と同族であ る細胞は実施例１６に示しである。

インフルエンザ核タンパク質の構築 インフルエンザ（ウィルス株：　Ａ　ＰＲ／８゜３４）の核タンパク質ペプチド （残基１４７〜１５８）　ＴＹＺＲＴＲＡＬＶＴＧは、ＢＡＬＢ／ｃ　（ｌ（２ ’　ハブロタイブ）マウスによって認識されるＣＴＬエピトープを含存している 。その残基Ｒは１５６位におけるペプチド配列から除いた。

というのはこの残基を欠失させるとＣＴＬ活性が約１０００倍に高くなくことが 分かったからである。上記の該タンパク質（ＮＰ）ペプチドをコードするオリゴ ヌクレオチドは、ｐＯＧＳ４０酵母発現ベクター中の酵母ＴＹＡ遺伝子の３′末 端に、Ｂａｌ　ＩＩ　−Ｂａｍフラグメントとしてクローン化した。これら配列 の構築の配列ベリフィケーション（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏ ｎ）によって、ＮＰペプチドをコートするフラグメントの一重挿入（ｐＯＧｓ３ ５３）および二重挿入（ｐＯＧｓ）が生した。ｐＯＧｓ３５３と３５４を用いて 酵母株ＭＣ２を形質転換してＴＹ　：　ＮＰ融合体を得た。０ＧＳ３５３と３５ ４をスンプレップ（Ｓｐｉｎ　ｐｒｅｐ　）分析に付したところ粒子の優れた収 率を示した。ハイブリッドＴＶ−ＶＬＰを種々の投与量で用いてＢＡＬＢ／ｃマ ウスを免疫化してペプチド特異的ＣＴＬ活性を評価した。

上記ＮＰペプチドを用いてｐ８１５ｆｆ的細胞を感作し、牌細胞を生体外で再刺 激した。インフルエンザ特異的ＣＴＬの誘導は、Ｖ３特異的ＣＴＬを検定するの に用いる先に述べた検定法を使用して評価した。

ハイブリッドＢ型肝炎コア：ＨＲＶ抗原粒子によるＣＴＩ、応ＢＹ肝炎コア抗原 由来の粒子形成配列およびヒトライノウィルス（ＨＲＶ）由来のエピトープを含 有する第二配列を有するハイブリッド粒子は、Ｂｒｏｗｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ、 　９巻、５９５〜５０１頁、１９９１年の方法にしたがって製造することができ る。ＨＲＶ−２のｖＰ２タンパク質由来の中和部位を、Ｈｅｐ　８３７粒子の免 疫優性領域内に入れ、そのハイブリッドタンパク質を用いてマウスのＣＴＬ応答 を測定する。マウスには、アジュバントなしで５〜１００μｇの範囲の投与量で 一回、滅菌筋肉内投与を行う。牌細胞を２０日後に取り出し、ＨＲＶエピトープ に対応するペプチドを用い生体外で７〜１２日間クローン増殖を行うことによっ て膨張させる。このようにして誘導されたエフェクター細胞を、同族ハブロタイ ブの標的細胞、すなわち対照細胞またはＨＲＶエピトープに対応するペプチドで 標識をつけた細胞とともにインキュベートすると、ＭＨＣクラスＩの抗原が上記 ＣＴＬエピトープに対応するペプチドをもっている標的細胞が溶解する。

Ｂ型肝炎コア抗原由来の粒子形成配列および口蹄疫ウィルス（ＦＭＤＶ）由来の エピトープを含有する第二の配列を育するハイブリッド粒子は、Ｂｅｅｓｌｅｙ ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、８頁、６４〜６４８頁、１９９０年の方法 にしたがって製造することができる。ＦＭＤＶの主要免疫原性エピトープをＨｅ ｐＢコア粒子のＮ末端に融合させ、得られたハイブリッドタンパク質を用いてマ ウスのＣＴＬ応答を測定する。マウスには、アジュバントなしで、５〜１００μ ｇの範囲の投与量で一回、滅菌筋肉内投与を行う。牌細胞を２０日後に取り出し 、ＦＭＤＶエピトープに対応するペプチドを用いて生体外で７〜１２日間クロー ン増殖を行わせることによって膨張させる。このようにして誘導されたエフェク ター細胞を、同族ハブロタイブの標的細胞、すなわち対照細胞またはＦＭＤＶエ ピトープに対応するペプチドで標識をつけた細胞とと・もにインキュベートする と、ＭＨＣクラスＩの抗原が上記ＣＴＬエピトープに対応するペプチドをもって いる標的細胞が溶解する。

図ＩＡ ３．７：１　１１．１：１　３１３：１　１００：ＩＥＡＴ比 図ＩＢ ペプチド濃度（μｇ／ｒｎＩり （）ＭＮＶＩ　ペプチド　＋ＲＦ　Ｖ３　ペプチド＋ＩＩＩＢＶ３ペプチド　※ ペプチドなし図２Ａ ＥＡＴ比 ｐｓ１５標的細胞とともにインキュベートしたもの図４ １．８：１５．５：１１５．６，１５０．ＩＥＡＴ比 図５ Ｅ：Ｔ比 国瞭謹審斡牛 フロントページの続き （７２）発明者　バーンズ、ニゲル、ロバート。

イギリス国、オックスフォード　オーエックス４５エルワイ、カウリー、ウォト リントン　ロード（番地ないブリティッシュ　バイオ−テクノロジー　リミテッ ド（７２）発明者　アダムス、サリー、エリザベスイギリス国、オックスフォー ド　オーエックス４５エルワイ、カウリー、ウオトリントン　ロード（番地なし ）ブリティッシュ　バイオ−テクノロジー　リミテッド（７２）発明者　キンゲ スマン、アラン、ジョンイギリス国、オックスフォード　オーエックス４５エル ワイ、カウリー、ウオトリントン　ロード（番地なし）ブリティッシュ　バイオ −テクノロジー　リミテッド（７２）発明者　キンゲスマン、スーザン、マリー イギリス国、オックスフォード　オーエックス４５エルワイ、カウリー、ウォト リントン　ロード（番地なし）ブリティッシュ　バイオ−テクノロジー　リミテ ッド（７２）発明者　ハリス、ステファン、ジョンイギリス国、オックスフォー ド　オーエックス４５エルワイ、カウリー、ウォトリントン　ロード（番地なし ）ブリティッシュ　バイオ−テクノロジー　リミテッド（７２）発明者　ゲアリ ング、アンドリュー、ジョン、バーバート イギリス国、オックスフォード　オーエックス４５エルワイ、カウリー、ウォト リントン　ロード（番地なし）ブリティッシュ　バイオ−テクノロジー　リミテ ッド

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. １．タンパク質の粒状抗原からなり、アジュバントを含有しない減菌医薬製剤。
2. ２．粒状抗原が複数の自己集合性タンパク質分子からなる請求の範囲１記載の製 剤。
3. ３．粒状抗原がタンパク質分子の相同集団からなる請求の範囲２記載の製剤。
4. ４．自己集合性タンパク費分子が各々、細胞障害性リンパ球（ＣＴＬ）応答を適 切な宿主内に誘導できるエピトープ（“ＣＴＬエピトープ”）を有し、かつ所望 の抗原特異性または所望の抗原特異性のうちの一つを有する第二アミノ酸配列に 融合された自己集合性を有する第一アミノ酸配列からなる請求の範囲２または３ に記載の製剤。
5. ５．第二アミノ酸配列が、ＣＤ４Ｔ細胞の産生を刺激する機能を有する配列（“ ＣＴＬエピトープ”）を含有する請求の範囲４記載の製剤。
6. ６．自己集合性配列が酵母のレトロエレメントＴｙ由来の配列である請求の範囲 ４または５に記載の製剤。
7. ７．自己集合性配列がウイルス由来の配列である請求の範囲４または５に記載の 製剤。
8. ８．自己集合性配列がレトロウイルスのｇａｇタンパク質由来の配列である請求 の範囲７に記載の製剤。
9. ９．レトロウイルスが、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−Ｉ Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＳＩＶ、ＢＩＶ、ＥＬＡＶ、ＣＩＡＶ、マウスマウス白 血病ウイルス、モロニーマウス白血病ウイルスまたはネコ白血病ウイルスである 請求の範囲８記載の夏剤。
10. １０．レトロウイルスがＨＩＶ−Ｉである請求の範囲８記載の製剤。
11. １１．自己集合性配列が、Ｂ型肝炎（の表面抗原もしくはコア抗原）またはブル ータングウイルス（の内部キャプシドもしくは外部キャプシド）由来の配列であ る請求の範囲７記載の製剤。
12. １２．抗原の配列が、ウイルスタンパク質由来の配列である請求の範囲４〜１１ のいずれか一つに記載の製剤。
13. １３．ウイルスが、レトロウイルス、オルトミクソウイルス、パラミクロウイル ス、パポーバウイルス、アレナウイルス、ヘパドナウイルスまたはヘルペスウイ ルスである請求の範囲１２記載の製剤。
14. １４．ウイルスがＨＩＶ−１である請求の範囲１３記載の製剤。
15. １５．抗原の配列が、腫瘍に関連するタンパク質由来の配列である請求の範囲４ 〜１１のいずれか一つに記載の製剤。
16. １６．腫瘍に関連するタンパク質が、黒色腫関連抗原または上皮性腫瘍関連抗原 である請求の範囲１５記載の製剤。
17. １７．抗原の配列が寄生生物由来の配列である請求の配列４〜１１のいずれか一 つに記載の製剤。
18. １８．寄生生物がブラスモディウム・ファルシパルムである請求の範囲１７記載 の製剤。
19. １９．抗原の配列が細菌由来の配列である請求の範囲４〜１１のいずれか一つに 記載の製剤。
20. ２０．細菌がゴノッカス属、ボルデテラ・ペルツッシス、リステリア属、マイコ バクテリア属またはレイシュマニア属の細菌である請求の範囲１９記載の製剤。
21. ２１．第二アミノ酸配列少なくとも一部分が１）ＨＩＶ（特にＨＩＶ−１）ｇｐ １２０、２）ＨＩＶ（特にＨＩＶ−１）ｐ２４、３）インフルエンザウイルスの 核タンパク質、４）ＬＣＭＶ核タンパク質、 ５）ＨＰＶＬ１もしくはＨＰＶＬ２タンパク質、６）ｐ９７黒色腫瘍関連抗原、 ７）ＧＡ７３３−２上皮性腫瘍関連抗原、８）上皮性腫瘍関連抗原由来のＭＵＣ −１反複配列、９）マイコバクテリウムｐ６ １０）マラリアＣＳＰもしくはＲＥＳＡの抗原、または１１）ヒト乳頭腫ウイル スＥ５もしくはＥ７由来の配列である請求の範囲４〜２０のいずれか一つに記載 の製剤。
22. ２２．細胞障害性Ｔ細胞応答を誘導するための、アジュバントな．しの医薬製剤 を製造する場合のタンパク質粒状抗原の用途。
23. ２３．被検体に細胞障害性Ｔ細胞応答を誘導する方法であって、タンパク質の粒 状抗原からなるアジュバントを含有しない製剤を被検体に投与することからなる 方法。
24. ２４．第一の、アジュバントを含有しないタンパク質粒状抗原製剤、および第二 の、アジュバントを含有するタンパク質粒状抗原製剤からなる免疫治療用または 予防用ワクチン投与キット。
25. ２５．免疫治療または予防に適合している疾患、特に微生物感染症または癌を治 療もしくは予防する際に、組合せてもしくは同時にもしくは逐次投与するのに用 いる、請求の範囲２４記載の第一と第二の製剤からなる製品。