JPH07505290A

JPH07505290A - オリゴヌクレオチドの合成

Info

Publication number: JPH07505290A
Application number: JP5517255A
Authority: JP
Inventors: マクレアン，マイケル・ジョセフ; ホランド，デーヴィッド; ガーマン，アンドリュー・ジョーン; シェッパード，ロバート・チャールズ
Original assignee: ゼネカ・リミテッド
Priority date: 1992-04-03
Filing date: 1993-04-02
Publication date: 1995-06-15
Also published as: DE69307689T2; CA2131994A1; ATE148129T1; RU94042224A; EP0633891B1; FI109702B; EP0633891A1; US5552535A; AU4042493A; US5393877A; NO943660D0; AU674847B2; GB9207381D0; WO1993020092A1; FI944568A0; NO943660L; NO309482B1; FI944568L; DE69307689D1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】オリゴヌクレオチドのＡ本発明はオリゴヌクレオチドの合成方法と、この方法の実施中に用いられる新規な化合物とに関する。

オリゴヌクレオチド配列はリンカ−、アダプター、合成遺伝子の構成ブロック、合成調節配列（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）、プローブ、プライマーとして及びその他の目的に用いるためにルーチンに合成されており、このような配列を製造するための幾つかの方法が開発されている。これらの方法は、固相担体に適当に保護された第１ヌクレオチドを開裂可能な結合によって最初に結合させた後に、成長するヌクレオチド鎖に個々のヌクレオチドの前駆物質を連続的に反応させ、前駆物質の各付加が幾つかの化学反応を含むことに基づく。現在、単独のオリゴヌクレオチドの製造に最も一般的に用いられる方法はホスホロアミダイト（ｐｂｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）化学に基づく、これはカルーサース（Ｃａｒｕｔｂｅｒｓ）等によって、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　１９８１．２２（２０）１８５９〜６２頁に、コスタ −αｏｓｔｅｒ）等によって、米国特許第４７２５６７７号に、及びエム、ジェイ、ガイド（１１，Ｊ、Ｇａ１ｔ）じオリゴヌクレオチド合成、実用的アプローチ”、夏ＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　０ｘｆｏｒｄ　３５〜８１頁）によって詳しく述べられている。

ホスホロアミダイト化学を用いるオリゴヌクレオチドの製造を可能にする、数種類の自動化ＤＮＡ合成装置が現在、商業的に入手可能である。担体上の個々のヌクレオチドの前駆物質の逐次反応によって単独（Ｉｏｎｅ）オリゴヌクレオチドが如何に形成されるかの具体的な説明は、Ａｐｐｌｉｅｄ　旧ｏｓｙｓｔｅｍｓＤＮＡ合成装置モデル３８０８のプロトコール、特にその第２部に述べられており、これはここに参考文猷として関係する。

オリゴヌクレオチドの需要の急激な増加に応じて、商業的合成装置のスループットを増加させる、すなわち１日あたりに合成されるオリゴヌクレオチド数を増加させる改良が望まれる。

我々は今回、成長するオリゴヌクレオチド鎖に必要に応じて導入される開裂可能なリンカ一部分を用いて、同じ担体上に２個以上のオリゴヌクレオチドを合成することができるオリゴヌクレオチドの迅速かつ効果的な製造方法を開発した。

本発明の第１態様によると、下記工程・（＋）固相担体に結合した開裂可能な第４リンク（ｌｉｎｋ）上に第１オリゴヌクレオチドを形成する工程と；（ｔｉ）該第１オリゴヌクレオチドに開裂可能なリンカ一部分を結合させる工程と（＋ｍ）該開裂可能なリンカ一部分上に第２オリゴヌクレオチドを形成する工程と（〜）該開裂可能な第１リンクと該開裂可能なリンカ一部分とを開裂させて、複数のオリゴヌクレオチドを得る工程とを含む複数のオリゴヌクレオチドの合成方法において、開裂可能なリンカ一部分が式（１）・［式中、ＡＩとＡ２の一方又は両方が式（ａ）。

（式中、Ｒ１とＲ２はそれぞれ独立的に、Ｈ１任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアリールオキシ、ハロゲン１、シアノ、ニトロ、任意に保護されたヒドロキシ、任意に保護されたオキシカルボニル、任意に保護されたＮＨ２、又は電子吸引基であり：ＹはＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２、ＮＨｌＳ又はＯである）で示される二価基であり：Ｅは有機スペーサー基であり、ＡＩ又はＡ２によって表される残りの基は式（ｂ）：（式中、ｎは１〜５の値を有し、星印で標識された炭素原子は式（１）中に示される酸素原子に結合し、各Ｒ３は独立的にＨ又は任意に置換されたアルキルを表す）で示される基である］によって示される前記方法を提供する。

Ａ１とＡＩが両方とも式（ａ）によって示されることが好ましく、ｎは好ましくは１〜３の値であり、より好ましくは２である。

担体は好ましくは、例えば自動化オリゴヌクレオチド合成に用いられるような固相担体である。好ましい固相担体は、例えば、米国特許第４，４５８．０６６号に開示されるような改質無機ポリマー、シリカゲル、ボラシル（Ｐｏｒａｓｉｌ）　Ｃ。

ケイソウ土ＰＤＭＡ、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリカＣＰＧ　（ＬＣＡＡ）又は、例えばＡｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　ＤＮＡ合成装置モデル３８０Ｂに用いられるような、制御多孔質ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｅｄ　ｐｏｒｅ　ｇｌａｓｓ）である。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの合成に用いられるような通常の方法によって、例えば上記自動化オリゴヌクレオチド合成装置にホスホロアミダイト化学を用いることによって、個々のヌクレオチドの前駆物質から形成することができる。第１オリゴヌクレオチドは好ましくは、技術上周知であるような、加水分解可能な基（例えば、塩基不安定性基（ｈａｓｅ−１ａｂｉｌｅ　ｇｒｏｕｐ））によって担体に結合させる。

本発明の第１態様は、エム、ジェイ、ガイドによって述べられた上記方法に従って、固相担体上のデオキシリボースの３°　ヒドロキシから３°〜５゛方向に逐次構成される、式（１）の開裂可能なリンカ一部分によって分離された、２°− デオキシアデノシン（ｄＡ）　、２°　−デオキシグアノシン（ｄＧ）　、２° −デオキシシチジン（ｄ　Ｃ）及び２°−デオキシチミジン（ｄＴ）のホスホロアミダイトの種々な組合せを用いた２オリゴヌクレオチドの形成によって説明される。合成後に、この配列は式：［式中、Ｘは開裂可能なリンクである］で示される。

リンカ一部分：と、第１オリゴヌクレオチドを固相担体に結合させるリンクＸとを開裂した後に、２個のオリゴヌクレオチドが得られる：このようにして、単独固相担体上に２個のオリゴヌクレオチドが合成された。

開裂可能なリンカ一部分が第１オリゴヌクレオチドと第２オリゴヌクレオチドとを３°酸素と５′酸素によって、より好ましくは、各オリゴヌクレオチド上に１つの、ホスフェート（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ホスフィツト（ｐｈｏｓｐｈｉｔｅ）、リン酸エステル、亜リン酸エステル又はＨ−ホスホン酸エステルによって結合させることが好ましい。

開裂可能な第１リンクのアイデンティティ　（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）は重要であるとは考えられないが、好ましくは塩基不安定性であり、例えば、塩基不安定性エステル基を含むリンクのような、自動化オリゴヌクレオチド合成装置に用いられる、任意の開裂可能なリンクである。

例えば炭化水素鎖のような、開裂したリンカ一部分の有機残渣は、このような残基が及ぼしうるような、オリゴヌクレオチドの性質への不利な影響を避けるために、開裂工程（Ｉｖ）後にオリゴヌクレオチドに結合して留まらないことが好ましい。

本発明の第１態様は、工程（ｉ＋）と（Ｕを任意の望ましい回数、例えば１〜１００回、又は好ましくは１〜５回繰り返して、それぞれ開裂可能なリンカ一部分によって結合された、さらに多くのオリゴヌクレオチドを製造することを含む。

容易に理解されるように、工程（紅）と（ｆｆｌ）を繰り返すと、予め形成されたオリゴヌクレオチドに結合した開裂可能なリンカ一部分上に他のオリゴヌクレオチドが形成され、このオリゴヌクレオチドは予め形成されたオリゴヌクレオチドと同じものでも又は異なるものでもよい。

開裂可能なリンカ一部分を塩基加水分解によって開裂して、個々のオリゴヌクレオチドの混合物を得て、これを必要に応じて精製及び分離することができる。

例えばアンモニア水溶液、メチルアミンのような、任意の適当な塩基が使用可能である。

この明細書において、′オリゴヌクレオチド１なる用語はオリゴデオキシリボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド及びこれらの類似体（例えば、保護基を有するような類似体）を含み、メチルホスホネート及びホスホロチオエート又はホスホロジチオエートジエステルバックボーンを有するようなものを含み、本発明の方法によって、オリゴヌクレオチドがオリゴデオキシリボヌクレオチド、特に２°　−オリゴデオキシリボヌクレオチドと共に通常合成される。好ましいオリゴヌクレオチドはオリゴデオキシリボヌクレオチドであり、本質的に一本鎖であり、好ましくは少なくとも２塩基から、より好ましくは少なくとも５塩基から、特に１０塩基から２００塩基までの長さである。

ＤＮＡ合成装置の使用者に対して、本発明の方法は装置をより効果的に使用し、その結果、特にオリゴヌクレオチドの製造及び精製の費用を減するという利益を与える。

従って、本発明によると、ＤＮＡ合成装置はそのカラムのいずれがで、各オリゴヌクレオチドの間での再プログラム化なしに、２個以上のオリゴヌクレオチド（同じ又は異なる）を製造することができる。従って、就業日外の時間に１個のオリゴヌクレオチドの合成を完成した時に、合成装置は操作を介入せずに他のオリゴヌクレオチドの製造を続けることができる。このことはこのような装置の生産性を有意に高めることができる。

本発明の方法はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法のためのプライマーの合成に特に有用である。現在、合成されるオリゴヌクレオチドの大きな割合がこの目的のためである。このようなプライマーは典型的にベアで必要であり、本発明の方法はベアでのオリゴヌクレオチドの製造を可能にするので、好都合である。

このことは単一カラム合成装置を用いる場合に及び／又は時間外作業（ｏｕｔ− ｏｆ　ｈ。

ｕｒｓ　ｗｏｒｋｉｎｇ）のための重度に用いられる設備にとって特に有利である。

個々のヌクレオチドの前駆物質が５°酸素原子において保護されたヌクレオシドホスホロアミダイトであり、任意に塩基保護されることが好ましい。例えば、緩和な酸又はアルカリによる処理によって脱離可能である保護基によって、ヌクレオシド塩基を保護する方法は技術上周知である。アデニンとシトシンは任意に置換されたＮ−ベンゾイル基によって、グアニンはＮ−イソブチリル基によって保護することができる。チミンとウラシルは一般に保護を必要としない。アデニンとグアニンはジメチルホルムアミド又はフェノキシアセチル基によっても保護することができ、シトシンはインブチリル基によって保護することができる。保護されたオリゴヌクレオチドを担体から分離した後に、保護基を脱離することが好ましい。用いる化学に依存して、保護基の脱離前、中又は後にリンカ一部分を開裂することができる。保護基が塩基水溶液、特に濃アンモニア水溶液又はメチルアミンによる処理によって脱離可能であることが好ましい。本発明の好ましい実施態様では、保護基の脱離とリンカ一部分の開裂とが１工程で実施されることができるように、開裂可能なリンカ一部分は塩基性又はアルカリ性条件下で開裂可能である。用いる典型的な塩基性条件は、保護されたオリゴヌクレオチドを塩基と、例えば濃アンモニア水溶液、メチルアミン又は両方の混合物と、又は例えばメタノール性水酸化ナトリウムと混合することである。この反応は例えば室温（２０℃）〜１００℃、より好ましくは５０〜９０℃、特に約５５〜６０℃の温度において実施される。この反応は典型的に４８時間、特に２４時間までの期間にわたって、特に約５〜２４時間にわたって実施される。開裂がこれらの条件下で完成するように、リンカ一部分を選択することが好ましい。

開裂を実施するために、他の塩基、好ましくは揮発性塩基を用いることもできる。これらは好都合には、好ましくは１０〜７０％の濃度での水中の有機アミシン、例えばピペリジン、ジエチルアミン又はトリエチルアミンである。

この方法への使用に適した、個々のヌクレオチドの前駆物質の例としては、５° 　−ジメトキシトリチル−Ｎ−４−ベンゾイル−２°　−デオキシシチジン、５ °　−ジメトキシトリチル−Ｎ−２−インブチリル−２゛　〜デオキシグアノシン、５°　−ジメトキシトリチル−Ｎ−６−ベンゾイル−２゛　−デオキシアデノシン、及び５°　−ジメトキシトリチルチミジンの２−シアノエチル−Ｎ、　Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホロアミダイトが挙げられる。

オリゴリボヌクレオチドの合成のための前駆物質は、例えばオリゴデオキシリボヌクレオチドのための前駆物質と同じである、但し、この場合には、リボースの２゛位置に保護されたヒドロキシル基、例えば、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ基が存在する、又はクルアケム（Ｃｒｕａｃｈｅ鳳）社からの２°　− ０−Ｆｐｍｐホスホロアミダイトである。

５°ホスフエート基を有するオリゴヌクレオチドの使用に関心が高まっている（例えば、ヒグチ（Ｈｉｇｕｃｈｉ＞とオフマン（Ｏｃｋｓ＋ａｎ）　（１９８９）　、Ｎｕ　ｃ　］、　Ａ　ｃｉｄ　Ｒｅｓ、１ヱ（１４）、５８６５頁を参照のこと）。それ故、５°ホスフエート基を有するオリゴヌクレオチドを生成する合成方法は重要である。

従って、本発明の方法は、他の態様として、工程（柑）がそれぞれ３゛位置と５゛位置にヒドロキシとホスフェートとから選択された基を有する望ましいオリゴヌクレオチドを生ずる。

式（１）の開裂可能なリンカ一部分は、通常のオリゴヌクレオチド合成と同様な方法で、個々のヌクレオチドの前駆物質の代わりに、式（３）の試薬を用いて第１オリゴヌクレオチドに結合させることができる。

従って、本発明は式（３）：［式中、ＡＩ、Ａ２、Ｅは前記で定義した通りであり、Ｚｌは陛下安定性保護基であり；−０−ＰＡはホスホロアミダイト基、ホスフェート基又はＨ−ホスホネート基である］で示される化合物を提供する。

Ｚｌによって表される、適当な陛下安定性保護基は当業者に自明であり、ティ。

ダブリュ、グリーン（Ｔ、　Ｌ　Ｇｒｅｅｎ）、Ｗｉｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅによる“有機合成における保護基°に述べられている基を含む。このような保護基の例には、メトキシトリチル（オリゴリボヌクレオチド合成のためにのみ好ましい）、ジメトキシトリチル、ビキシル、インブチルオキシカルボニル、ｔ−ブチルジメチルシリル等の保護基がある。

Ｅは好ましくは炭素原子２〜１５個、より好ましくは２〜６個の長さを有する有機スペーサー基である。Ｅは好ましくは、任意にエーテル、チオエーテル、アミノ又はアミドによって割り込まれた、アルキル、アルケニル、アリール又はアラルキルスペーサー基である。Ｅによって表される好ましい基は、任意に置換されたフェニレン、Ｃト、アルキレン、より好ましくは−ＣＨ，ＣＨ，−である。

Ｒ１とＲ２は好ましくは、それぞれ独立的に、Ｈ：直鎖又は分枝鎖Ｃ１−６アルキル、特にメチル、エチル、プロピル、ブチル若しくはｔ−ブチル；又はＣ＋− Ｓアルコキシ、特にメトキシ、エトキシ、プロポキシ及びブトキシ、特にメトキシ；ハロゲン、シアノ、ニトロ、フェノキシ、任意に保護されたヒドロキシ：任意に保護されたオキシカルボニル：又は任意に保護されたＮＨ２である。

Ｙは好ましくは、ＣＨＩ、ＣＨｔ　Ｃ）（ｚ、ＮＨ又は０１より好ましくはＣＨ，、ＣＨ２ＣＨを又はｏｌ特にＯである。

各Ｒ３は、独立的に、好ましくはＣＩ４アルキル、特にメチル、エチル、プロピル若しくはブチル、又はより好ましくはＨである。

任意の置換基はＲ１とＲ２に関して定義した通りである。

式（ｂ）によって表される基の例として、−＊ＣＨ２ＣＨ！−３ｏ！−ＣＨｌ− ＣＨ１−及び　＠ＣＨＣＨｓ　ＣＨｚ　ＳＯ２ＣＨＩ　ＣＨ２−が挙げられる。

理解されるように、−０−ＰＡがＨ−ホスホネート又はホスホロアミダイトである場合に、これらは、例えばヨウ素又は過酸化物の水溶酸を用いる、この方法の操作中にそれぞれリン酸ジエステル又はリン酸トリエステル基に酸化される。

Ｈ−ホスホネートの場合には、工程輸）後かっ工程（ｉｖ）前に酸化が行われることが好ましいが、ホスホロアミダイトの場合には、工程（ｉ）及び工程（Ｕ中に酸化が行われることが好ましい。

リン酸エステル基とＨ−ホスホネート基の例として、遊離酸形でそれぞれ式。

［式中、Ｚ２は保護基、好ましくは塩基不安定性保護基、例えば２−クロロフェニル又は２．４−ジクロロフェニル基である］で示される基が挙げられる。

好ましくは、−０−ＰＡは一般構造式：［式中、Ｒ６とＲ６は、それぞれ独立的に、任意に置換されたアルキル、特にｃトイアルキル：任意に置換されたアラルキル、特に任意に置換されたベンジル；炭素原子１０個までを有するシクロアルキルとシクロアルキルアルキル、例えばシクロペンチル又はシクロヘキシルであるか：又はＲ６とＲ１は、それらが結合する窒素原子と共に任意に置換されたピロリジン若しくはピペリジン環を形成するか：又はＲ５とＲ６は、それらが結合する窒素原子と一緒に考える場合に、窒素、酸素及び硫黄から成る群からの１個以上の付加的ペテロ原子を含む、飽和窒素複素環を形成する。ＲＡとＲ，は好ましくはイソプロピルである１で示されるホスホロアミダイトである。

Ｒ７は水素原子、又は保護基、例えばホスフェート保護基を表す。ホスフェート保護基の例として、任意に置換されたアルキル基、例えばメチル、２−シアノエチル、２−クロロフェニル、２．　２．　２−）ジハロ−１，１−ジメチルエチル、５−クロロキン−８−イル、２−メチルチオエチル及び、フェニル環が例えばハロゲン（例えば塩素）又はＮＯ２から選択される基によって任意に置換される２−フェニルチオエチル基が挙げられる。Ｒ７は好ましくはメチルであり、より好ましくは２−シアノエチルである。

当業者によって理解されるように、本発明の化合物はシス形又はトランス形のいずれでも存在することができる。しかし、化合物のトランス形は緩慢な開裂速度を有するので、末端有機ホスフェート基を有するオリゴヌクレオチドを生じ、これは末端がブロックされる必要があるような場合に用いられる。

式（３）化合物は、本発明の方法によって説明したように、第１オリゴヌクレオチドと第２オリゴヌクレオチドとの間に式で示される開裂可能なリンカ一部分を結合させるために適した試薬である。適当な条件下、例えば濃水酸化アンモニウムによる処理下で、この化合物は開裂して、式（３）化合物の有機残基を含まない目的オリゴヌクレオチドを生ずる。このことは、遊離の又はリン酸化した３° 又は５°末端を含むオリゴヌクレオチドが望ましい場合に、特に重要である。

式（３）化合物の有用性は上記式（２）の配列の製造に関して説明することができる。例えばＡ２が式（ａ）で表される場合には、式ｄ　（ＡＧＣＴＡ）のオリゴヌクレオチドが５°　−ＯＨ基を有して生じ　Ａｍが式（ｂ）で表される場合には、式ｄ　（ＡＧＣＴＡ）のオリゴヌクレオチドが５−ホスフェート基を有して生ずる。従って、式（３）化合物においてＡ２を（ａ）及びＣｂ）から適当に選択することによって、本発明の方法は、本発明の方法によって製造される第１、第２及びその後のオリゴヌクレオチドが３°位置にヒドロキシ基を有し、５° 位置にヒドロキシを有するか又はホスフェート基を有するかを選択することができるという大きな利点を有する。

−０−ＰＡがホスホロアミダイトである式（３）化合物は式。

を有する化合物を式：Ｘ’−ＰＡの化合物とＣＨＲＣＩ□中で塩基としてジ（Ｎ −イソプロピル）エチルアミンを用いて反応させることによって製造することができる。ＰＡは、−〇−が存在しない点を除いては、−０−ＰＡに関して上述したように、好ましくはホスホロアミダイトであり、Ｚ’１Ａ’ＳＥ及びＡｍは前記と同じであり、Ｘｌは脱離基、例えばＣ１又はＢｒである。

式（３）中の一〇−ＰＡが前述したようにリン酸エステル基である場合には、式（３）化合物は式：を有する化合物を対応遊離リン酸エステルのトリアゾリド（ｔｒｉａｚｏｌｉｄｅ）とエム。

ジエイ、ガイドが上記文献に述べている方法と同じ方法を用いて反応させることによって製造することができる。

式（３）中の一〇−ＰＡが前述したようにＨ−ホスホネート基である場合には、を有する化合物をＰｃｔ、と１．　２．　４−トリアゾールの存在下でビー、シー。

フローラ−（Ｂ、　Ｃ，Ｆｒｏｅｂｌｅｒ）等のＮｕｃｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　（１９８１）、１４．５３９９〜５４ｏ７頁が述べている方法と同じ方法を用いて反応させることによって製造することができる。

式：を有する化合物は、例えば、式：を有する化合物を式８０−Ａ！−ＯＨの化合物と、好ましくは適当な非プロトン性溶媒中で、例えば上記ＤＣＣＩ又は１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３ −エチル力ルポジイミドのような適当な縮合剤を用いて反応させることによって製造することができる。

式：を有する化合物は、式：　Ｚ’−０−ＡＩ−ＯＨの化合物を式ＨＣｈＣＥ　Ｃ０ｘＨの化合物の活性化形と、好ましくは適当な非プロトン性溶媒中で、モル当量の塩基の存在下において反応させることによって製造することができる。ジカルボン酸は活性化して、酸無水物、酸塩化物又は他の適当な誘導体として存在させることによってヒドロキシル基によって作用させることができるか、又はこの反応を上述のようなカップリング剤の存在によって仲介させることができる。

式：Ｚｌ−０−Ａ’−ＯＨの化合物は、式：Ｉ（Ｏ−ＡＩ−ＯＨの化合物を式Ｚｌ−ＣＩ（又はＺｌの他の適当な活性化形）と、好ましくは適当な非プロトン性溶媒中で、モル当量の塩基の存在下において反応させることによって製造することができる。

Ａ１が上記式（ａ）である場合には、式：　Ｚｌ−０−ＡＩ−ＯＨの化合物は好ましくは、メチルアミンを用いたメタノール中での式：　Ｚｌ−０−Ａ’−０− ＣＯ−ｐｈ化合物の脱ベンゾイル化によって製造される。式：　Ｚｌ−０−ＡＩ −０−Ｃ０−ｐｈ化合物は、式：ＨＯ−Ａ’−０−Ｃｏ−Ｐｈ化合物とｚ’−ｘ ’　＜式中、Ｘ＋は脱離基、例えばＣＩである）との反応によって製造される。

式（３）化合物とその前駆物質との上記製造方法では、Ｚｌ、Ａ’、Ｅ、Ａ２、本発明の他の態様によると、好ましくは３“及び５゛酸素原子によって、式ニｒ式中、ＡＩ％Ｅ及びＡ２は前記で定義した通りである］を有する開裂可能なリンカ一部分を含む１個以上の基を用いて連結させた２個以を有する開裂可能なリンカ一部分を各オリゴヌクレオチドに、Ｈ−ホスホネート、ホスフェート、ホスフィツト、リン酸エステル又は亜リン酸エステル結合を介して結合させることが好ましい。オリゴヌクレオチドの中の１個を担体に結合させることが好ましい。

Ｈ−ホスホネート結合は式：ＨＰ　（＝Ｏ）−を有し、好ましいリン酸エステル結合は式：　−Ｐ　（−〇）−０Ｒａ−を有し、好ましいホスフィツト結合は式ニーＰ　（−ＯＲＢ）　−（式中、Ｒ６は前記と同じである）を有する。

本発明を下記非限定的実施例によって説明する：寒施透１試墓へ上の製造これは、以下の１〜４と番号を付けた製造法を用いて合成した。ＤＭＴは４゜４ ′　−ジメトキシトリチルである。

工　１−　！己ヒＡ　の　゛　：０℃の乾燥ピリジン（１００ｍｌ）中の１．４−アンヒドロエリトリトール（１０，４ｇ、１００ミリモル）の溶液に、塩化ベンゾイル（１４ｇ、１００ミリモル）を撹拌しながら滴加した。添加が終了したときに、溶液を室温に温度上昇させ、撹拌をさらに２時間続けた。この溶液に、４．４−ジメトキシトリチルクロリド（３７，４ｇ、１１０ミリモル）と４−　（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジン（１００ｍｇ）とを加え、混合物を室温において１６時間撹拌した。溶媒を回転蒸発によって除去し、残渣をジクロロメタンに再溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液によって３回洗浄した。ジクロロメタン溶液を無水硫酸ナトリウムの添加によって乾燥させ、濾過した。濾液をガム状になるまで蒸発させ、メチルアミンによって飽和したメタノール中に再溶解した。得られた溶液を室温において、ＴＬＣによって出発物質が検出されなくなるまでインキュベートした。溶媒を回転蒸発によって除去し、残渣を最少量のジクロロメタン／メタノール（９／１）に再溶解して、シリカクロマトグラフィーカラムに負荷した。同じ溶媒による溶出によって、標題化合物を白色泡状物（２２ｇ、５４％）として得た。

’ＨＮＭＲ：　（δ、ＣＤＣｌ、）：３．３５．ＩＨ，多重線、ＣＨＯＨ；３．５゜２Ｈ，二重線、−ＣＨｚ−；３．７５，８Ｈ，複合多重線、ＤＭＴ−ＯＣＨ，６゜９、　４Ｈ，複合多重線、芳香族ニア、２５−７．　５．　９Ｈ，複合多重線、芳香族。

２−　Ａの造：工程１からの生成物（Ｌｏｇ、２４．６ミリモル）を乾燥ピリジン（１５０ｍｌ）中に溶解し、無水コハク酸（Ｌｏｇ、１００ミリモル）を加えた。溶解が終了したときに、４−　（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジン（５００ｍｇ）を加え、溶液を室温において一晩撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残留ピリジンをトルエンとの反復同時蒸発（ｒｅｐｅｔｅｄ　ｃｏ−ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）によって除去した。残渣をジクロロメタン（５００ｍｌ）中に再溶解して、水冷１０％クエン酸溶液によって３回洗浄した。有機層を分離し、乾燥させ（硫酸ナトリウム）、濾過し、ガム状になるまで蒸発させて、これを最少量のジクロロメタン／メタノール（９／１）に再溶解して、シリカクロマトグラフィーカラムに負荷した。同じ溶媒による溶出によって、標題化合物を白色泡状物（９，７ｇ、７８％）として得た。

’ＨＮＭＲ：　（δ、ＣＤＣＩｇ）　＋　２．　７５．　４Ｈ，多重線、２ｘＣＯＣＨ，；２、　９ト３．２．　２Ｈ，２疑似三重線、　−ＣＨｚ　；３．　７５．　８Ｈ，複合多重Ｉ１．２ｘ−ＯＣＨｓと　ＣＨｔ　：　４．２．ＬＨ，複合多重線、ＤＭＴ−ＯＣＨ。

５、Ｏ，ＬＨ，多重線、ＣＦ（ＯＣｏ、６．９．４Ｈ，複合多重線、芳香族ニア。

２５−７．　５．　９Ｆ（、複合多重線、芳香族。

工　３−　と八　の　造２工程２からの生成物（１０ｇ、１９．５ミリモル）を、１．４−アンヒドロエリトリトール（１０，４ｇ、１００ミリモル）を含む乾燥ピリジン（２００ｍｌ）中に溶解した。この溶液に、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドヒドロクロリド（アルドリッヒ（Ａｌｄｒｉｃｈ）、３．　７５　ｇ、１９゜５ミリモル）を加えた。溶液を室温において一晩撹拌した、この時点でジクロロメタン・メタノール（１９：　１）にょるＴＬＣは出発物質が存在しないことを示した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残留ピリジンをトルエンとの反復同時蒸発によって除去した。残渣を酢酸エチル中に再溶解して、飽和炭酸水素ナトリウム溶液によって３回、水によって１回洗浄した。有機層を分離し、乾燥させ（硫酸ナトリウム）、濾過し、減圧下でガム状になるまで蒸発させて、これを最少量のジクロロメタン　メタノール（１９：１）に再溶解して、シリカクロマトグラフィーカラムに負荷した。同じ溶媒による溶出によって、標題化合物を無色ガム状物（９゜５ｇ、７９％）として得た。

１）（ＮＭＲ：　（δ、ＣＤＣ１ｇ）　：　２．　７５−２．　９．　５Ｈ，多重線、２ｘＣＯＣＨｚ＋−ＯＨ：３．２．２Ｈ，多重線、　ＣＨｚ　；３．６５ −３．８５，１０Ｈ９複合多重線、２ｘ　０ＣＨｘと２ｘ　ＣＨｔ　；３．　９　４．　１．　２Ｈ，多重線、−ＣＨ２−；４．２．ＩＨ，複合多重線、ＤＭＴ −０−ＣＨ，４，４，ＩＨ。

多重線、ＣＨＯＨ；５．０と５．　１．　２Ｈ，２多重線、２ｘＣＨＯＣＯ；６．９゜４Ｈ，複合多重線、芳香族、７．　２５−７．　５．　９Ｈ，複合多重線、芳香族。

４−　への°：工程３からの生成物（２ｇ、３．　３ミリモル）を、乾燥ジクロロメタン（５０ｍｌ）中に溶解し、この溶液を乾燥アルゴン流下で撹拌した。この溶液に、乾燥ジイソプロピルエチルアミン（２，７ｍ１．１６ミリモル）と２−シアノエチル −Ｎ、　Ｎ−ジイソプロピルアミノクロロホスフィン（１，０５ｍ１．４．７２ミリモル）とを加えた。この溶液を乾燥アルゴン流下、室温において３０分間撹拌した、この時点でジクロロメタンコトリエチルアミン（１９：１）によるＴＬＣは出発物質が存在しないことを示した。乾燥メタノール（５ｍｌ）の添加によって反応を停止させ、溶液を酢酸エチル（２００ｍｌ）によって希釈した。この溶液を等量の飽和塩化ナトリウム溶液によって３回、水によって１回洗浄した。

有機層を分離し、乾燥させ（硫酸ナトリウム）、濾過し、ガム状になるまで減圧下で蒸発させて、これを最少量のジクロロメタン：トリエチルアミン（１９：１）に再溶解して、シリカクロマトグラフィーカラムに負荷した。同じ溶媒による溶出によって、標題化合物Ａ１を無色ガム状物（１，８ｇ、６５％）として得た。

’ＨＮＭＲ：　（δ、ＣＤＣｌ５）　：１．　１　１．　３．　１２Ｈ，多重線、４ｘＣＨ、−，２，６，２Ｈ，多重線、ＣＨ２ＣＮ；２．８　３．２．６Ｈ，多重線、２ｘＣＯＣＨ２と−ＣＨ，−；３．５−３．９．１４Ｈ，複合多重線、２ｘ　０ＣＨｓ。

２ｘ　ＣＨＣＣＨｓ＞、ＰＯＣＨｚ　、２ｘ　ＣＨｚ　；４．０　４−２．３Ｈ。

複合条［１線、−ＣＨｚとＤＭＴ−ＯＣＨｓ；　４．５．ＩＨ，多重線、ＣＨ− ０−Ｐ；５．　０．　ＩＨ，多重線、ＣＨＯＣｏ、５．３．ＩＨ，多重線、ＣＨＯＣＯ；６゜８、　４Ｈ，多重線、芳香族、７．　２−７．　５．　９Ｈ，複合多重線、芳香族。

実施例１の２オリゴヌクレオチドのＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３ＢＯＢ　ＤＮＡ合成装置に添付されたプロトコールを用いて、固相担体上に第１（通常の）開裂可能なリンクを介して、５°−ジメトキシトリチル−Ｎ４−ベンゾイル−２°　−デオキシシチジン、５ °　−ジメトキシトリチル−Ｎ！−インブチリル−２°　−デオキシグアノシン、５′　−ジメトキシトリチル−Ｎ“−ベンゾイル−２゛　−デオキシアデノシン、及び５°−ジメトキシトリチルチミジン（クルアヶム（Ｃｒｕａｃｈｅｓ））の３’　−（２−シアノエチル）−Ｎ、Ｎ−ジインプロピルアミノホスホロアミダイトを個々のヌクレオチドの前駆物質として用いて、オリゴヌクレオチドを形成した。開裂可能なリンカ一部分を第１オリゴヌクレオチドに試薬Ａ１によって結合させた。試薬Ａ１を無水アセトニトリル中にＯ，ＩＭの濃度まで溶解し、この溶液を含むボトルをＤＮＡ合成装置のスペア−試薬ポートの１つに取り付けた。（通常の）開裂可能なリンク（スクシニルグリシルグリシルアミノプロビル、クルアヶム）を用いて結合した５°−保護ヌクレオシド（この場合にはデオキシアデノシン）を有する制御多孔質ガラス又は固相担体を含むカラムを合成装置に取り付けた。Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３８０Ｂ　ＤＮＡ合成装置に用いられる標準合成サイクルを用いて、下記配列：（５°）ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−Ｌ’　−ＴＣＧＡ　（３’　）（開裂可能なリンカ一部分Ｌ°は試薬Ａ１を用いて導入される）を合成するように、この合成装置をプログラムした。カップリング（ｃｏａｐｌｉｎｇ）、酸化、キャッピング及び脱トリチルに用いる反応工程の持続時間と試薬量は、試薬Ａ１のカップリングを含めて、各カップリングに関して同じであった。カラムの通常の濃アンモニア洗浄を実施して、オリゴヌクレオチドを回収ビン中に放出するように、この合成装置をプログラムした。

このようにして、この合成装置は（ａ）３”−ＯＨ基と（通常の）開裂可能な第１リンクとを用いて、制御多孔質ガラス担体に結合したオリゴヌクレオチドと、ヌクレオチド前駆物質との連続反応によって配列（５°−３’　）ＴＣＧＡの第１オリゴヌクレオチドを形成する工程と；　（ｂ）第１オリゴヌクレオチドに開裂可能なリンカ一部分を試薬Ａ１によって結合させる工程と；　（Ｃ）配列　（５°−３°）ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴを有する開裂可能なリンカ一部分上に第２オリゴヌクレオチドを形成して、式：［式中、−Ｌ’　−は次式：で示される開裂可能なリンカ−であり、式−Ｐ　（０）（ＯＣＨ２ＣＨＩＣＮ） −０−を有する基によって第１オリゴヌクレオチドと第２オリゴヌクレオチドとの５°酸素と３°酸素にそれぞれ結合する；Ｘはスクシニルグリシルグリシルアミノプロピルスペーサーに含まれる開裂可能な第１リンクである］によって説明されるように、開裂可能なリンカ一部分によって分離され、開裂可能なリンクによって固相担体に結合した２個のオリゴヌクレオチドを生成する工程を実施する。この合成装置は本発明の方法における工程（ｄ）におけるようにアンモニウム処理によって開裂可能な第１リンクＸの開裂をも実施する。

アンモニウム溶液中に溶出したオリゴヌクレオチドを含むビンに、４０％メチルアンモニウム水溶液１ｍｌを加え、次に、このビンを５５℃において１６時間インキュベートし、減圧下で蒸発乾固させた。残渣を水１ｍｌ中に再溶解した。

他の５個のオリゴヌクレオチドも上述したように通常の操作によって、但しメチルアミンによる処理を省略して合成した。これらは上記メチルアミン処理によって生成した生成物の分析に用いられる対照分子を表すように設計した。これらのオリゴヌクレオチドは下記配列を有した：１）（５・）−胃πππ（３°）２１　（５’ｌ　ＴＣＧＡ　（３’）３１　＋ｓ’ｔ　？０，２°　ｆｉ　（３’１４１　（Ｓ’ｌ　ＰＯ，”　’ｍ；＾　（３′）Ｓ）　＋Ｓ’ｌ　τコ１−ττＴ門−丁ｃｃ＾　（コ１）従って、オリゴヌクレオチド１）と２）は開裂可能なリンクを含むオリゴヌクレオチドの開裂から予想される生成物と同じ長さと配列を有し、オリゴヌクレオチド３．４及び５は開裂可能なリンクを含むオリゴヌクレオチドの部分開裂から予想される生成物を表す。

上記工程（ｄ）において製造されるオリゴヌクレオチド混合物をＰｈａｒｍａｃｉａ　Ｍｏｎｏ−Ｑカラム上でのバッファーＢ中Ｏ〜２５％バッファーＡの線状傾斜（ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ）を用いて、３５分間にわたって分析した、この場合にバッファーＡは５０ｍＭトリス−クロリド（ｐＨ７，５）であり、バッファーＢは５０ｍＭトリス−クロリド７８００ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ７，５）であった。これらの条件下で、対照オリゴヌクレオチド１）は２９分間の反応時間を有し、対照配列２）は９分間の反応時間を有し、対照配列３）は３２分間の反応時間を有し、対照配列４）は１３分間の反応時間を有し、対照配列５）は３９分間の反応時間を有した。

上記工［（ｄ）で製造したオリゴヌクレオチド混合物のＨＰＬＣプロフィルはオリゴヌクレオチド１と２の存在に一致するピークのみを示し、開裂可能なリンクの完全な切断が生じて、所望の生成物を生成したことを立証した。

天施倒ｌ１−　への造：；７．　２５−７．　５　（９Ｈ，ｍ、芳香族）。

工　２−Ｉｌ己　八　の製造゛工程１からの生成物（４ｇ、６．　２ミリモル）を、乾燥ジイソプロピルエチルアミン（４，４ｍｌ、２５ミリモル）を含む乾燥ジクロロメタン（５０ｍｌ）中に溶解し、２−シアノエチル−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノクロロホスフィン（１，６７ｍ１．７．４４ミリモル）を滴加しながら、この溶液を乾燥アルゴン流下で撹拌した。この溶液をアルゴン下、室温においてさらに３０分間撹拌した、このときにジクロロメタン：トリエチルアミン（１９：　１）中でのＴＬＣは出発物質が存在しないことを示した。乾燥メタノール（５ｍｌ）の添加によって反応を停止させ、溶液を酢酸エチル（２００ｍｌ）によって希釈した。この溶液をブライン（ｂｒｉｎｅ）　（３ｘ　２００ｍ　ｌ）と水（２００ｍｌ）とによって洗浄した。有機層を分離し、乾燥させ（ＭｇＳ０４）、濾過し、ガム状になるまで蒸発させて、これを最少量のジクロロメタン：ヘキサン：トリエチルアミン（４２：　５５　：　３）に再溶解して、シリカクロマトグラフィーカラムに負荷した。同じ溶媒による溶出とそれに続くジクロロメタン：トリエチルアミン（１９・１）による溶出とによって、標題化合物を無色ガラス状物（３，８ｇ、７２．　５％）として得た。

（２Ｈ，ｍ、　−ＣＨｚ−）　；　３．４５−３．６　（６Ｈ，ｍ、　Ｃ旦２ＳＯ！と２ｘＣ旦ｚＯＰ）；　３．７−４．Ｏ（ＩＯＨ，ｍ、２ｘ−ＯＣＨｓ、ＣＨｚ−及び−Ｃ旦ｚｓＯＪ　；　４．２　（ＩＨ，ｍ、　ＤＭＴ−ＱＣ旦）　；　４．５　（２Ｈ，ｍ、　−Ｃ旦ｚＯｃｏ）；　５．Ｏ（ＩＨ，ｍ、Ｃ旦０ＣＯ）　；　６．　９　（４Ｈ，ｍ、芳香族）ニア、２　７．　５　（９Ｈ，ｍ、芳香族）。

実施例Ａ試薬Ａ１の代わりに無水アセトニトリル中にＯ，ＬＭの濃度に溶解した試薬Ａ１を用いたことを除いて、実施例２の方法を繰り返して、固相担体に結合した２個のオリゴデオキシリボヌクレオチドを合成した。

開裂可能なリンクによって固相担体に結合した２個の該オリゴヌクレオチドは実施例２に記載した式によって説明されるが、この式において−Ｌ°−は式：によって示される開裂可能なリンカ−である。

本発明の方法の工程（ｄ）後に見い出される２個の該オリゴヌクレオチドは実施例２に述べたオリゴヌクレオチド１と４に同じであることが判明し、このことは開裂可能なリンクの切断と、本発明の方法の工程（ａ）において形成されたオリゴヌクレオチドの５°　−ヒドロキシルのホスホリル化とを実証した。

実施医旦工程」二）聾１■グ隠造これは、以下の（ａ）〜（ｆ）と番号を付けた製造法を用いて合成した。ＤＭＴは４．４゛　−ジメトキシトリチルである。

−ジメトキシテトラヒドロフランの　造メカニカルスターラーを備えた、５リツトル三つロフラスコ中のテトラヒドロフラン（５００ｍｌ）中に２．５−ジヒドロ−２，５−ジメトキシフラン（５０ｇ、アルドリッヒ、シス／トランス混合物）を溶解した。フラスコの内容物を一５℃に冷却し、フラスコ内容物の温度を４〜６℃の範囲に維持するような速度で激しく撹拌しながら、水（２２５０ｍｌ）中の過マンガン酸カリウム（６１，９ｇ）を滴加した。この添加は８０分間を要した。反応混合物を次に１５時間にわたって撹拌状態にして、室温に温度上昇させた。沈殿した二酸化マンガンをセリ力に通して濾別し、ＴＨＦ　（２００ｍｌ）によって洗浄した。無色透明な濾液を蒸発させ、残渣を酢酸エチル（２００ｍｌ）と共に、フラスコ壁に付着した物質がなくなるまで、激しく振とうした。ＫＯＨの微細な沈殿をガラスシンター（ｇｌａｓｓ　５ｉｎｎｔｅｒ）上で濾別し、酢酸エチルで洗浄した。濾液を回転蒸発させて、標題化合物を金色シロップ（２４，４ｇ、３８．６％）として得た。この化合物は主として、ｄｉ生成物（２０％）で汚染されたメソ生成物（８０％）であった。

１３Ｃ−ＮＭＲ：ｌ成物　ＣＨｓＯ５５，４６２ｐｐｍす工生成惣　ＣＨｓｏ　５６．４５１ｐｐｍ（ｂ）下記化合惣例警逍上上記工程（ａ）からの生成物（１，７ｇ）を乾燥ピリジン（１０ｍｌ）中に溶解し、４−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（１００ｍｇ）を加えた。混合物をスワーリングして（ｓｗｉｒｌｅｄ）、固体を溶解して、塩化ベンゾイル（１，２ｍ１）を加えた。この混合物を２０℃において１６時間放置した。

この混合物を回転蒸発させ、残留ピリジンをトルエンとの反復同時蒸発によって除去した。

残留油状物を酢酸エチルとＩＭＨＣＩ（各４０ｍ１）とに分配した。有機層を水、Ｉ　Ｍ　Ｎ　ａ　ＨＣＯｓ及び飽和ブライン（各４０ｍ１）によって連続的に洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、回転蒸発させた。残留油状物をジクロロメタン／メタノール（１９／１）に再溶解して、シリカカラムに負荷した。

同じ溶媒による溶出によって、目的化合物を白色固体（Ｌ　ｌ１ｇ、３８％）とＣＨｘＯ：　５５．６８０と５５．９５１ｐｐｍＣ）（ＯＨとＣＨＯＣＯニア５．０１６と７７．９７３ｐｐｍＣＨＯＣＨｓ：　１０７．１３６と１０９．８９９ｐｐｍＣａＨｓ：　１２８．５７６．１２９．３００．ｉ２９．９５及び１３３．９５２ｐｐｍ旦０：　１６６．０７６ｐｐｍ（ｃ）下記化合物Ω製造！上記工程（ｂ）からの生成物（２，４７ｇ）　、４．　４°−ジメトキシトリチルクｏ＋）Ｆ　（３，１２ｇ）及びＤＭＡＰ　（０，１５ｇ）を乾燥ピリジン（２０ｍｌ）中で室温において１６時間撹拌した。溶媒を回転蒸発によって除去し、残留ピリジンをトルエンとの反復同時蒸発によって除去した。残渣を酢酸エチルと水（各５０ｍ１）とに分配し、有機層をＩＭ　炭酸水素ナトリウム溶液によって、次に飽和ブライン（各２０ｍ１）によって洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、油状物になるまで回転蒸発させ、これをメタノール中メチルアミンの溶液（１２０ｍ１．７．５Ｍ）中に溶解して、室温において２４時間インキュベートした。この溶液を濾過し、濾液を油状物になるまで回転蒸発させ、これを最少量の石油（ｂ、ｐ、６０〜８０℃）／酢酸エチル（３／２）中に再溶解して、シリカカラムに負荷した。同じ溶媒による溶出によって、目的化合物（２，３ｇ）を白色泡状物として得、これをもはや特徴づけ（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ）を行わずに次の工程に直接用いた。

（ｄ）試薬Δ１Ω製造工上記工程（ｃ）からの生成物（２，２８ｇ）を乾燥ピリジン（２０ｍｌ）中に溶解し、無水コハク酸（０，５５ｇ）とＤＭＡＰ　（０，４ｇ）とを加えた。この混合物をスヮーリングして、固体を溶解した後に、室温において」、６時間放置した。溶媒を回転蒸発によって除去し、残留ピリジンをトルエンとの反復同時蒸発によって除去した。残渣を酢酸エチルと１０％（Ｗ／Ｖ）クエン酸（各５０ｍ１）とに分配した。有機層を水と次に飽和ブライン（各５０ｍ１）とによって洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、油状物になるまで蒸発させて、これを最少量のジクロロメタン／メタノール（１９／１）に再溶解して、シリカカラムに負荷した。同じ溶媒による溶出によって、標題化合物を無色ガラス状物（１゜９８ｇ、７１．４％）として得た。

”Ｃ−ＮＭＲ：ＯＣＣＨ！　ＣＨ！　ＣＯのｃＨｔ基：２８．７９０ｐＩ）ｍと２８，９３９ｐ１）ｍＣＨｘＯＡ　ｒ　：　５４．　９８８　ｐｐｍＣＨｓＯＨｘ２　：　５５．２５１ｐｐｍＣＨｘＯＡｒ　：　５６．０３９ｐｐｍＣＨＯＤＭＴとＣＨＯＣＯニア５．５１８ｐｐｍと７６．４２４ｐｐｍＤＭＴの第４級Ｃ：１０６．５７２ｐｐｍと８７．１９４ｐｐｍＡｒＣＨ：１１３．２４５ｐｐｍ、１２７．８２１ｐｐｍ、１２８．３３７ｐｐｍ、１２９．１６０ｐｐｍ、１３０．２５０ｐｐｍ及び１３０．２８０ｐｐｍＡｒ第４級Ｃ：１３９．８９３ｐｐｍ、１３６．０３５ｐｐｍ、１４４．８５５ｐｐｍ及び１５８．８５９ｐｐｍＣｏｏ：１７０．８７９ｐｐｍＣｏｏ：１７７．５４０．ｐｐｍ（ｅ）下記化合物Ω製造：溶解し、Ｎ、Ｎ−ジシクロへキシルカルボジイミド（０，３８４ｇ、０．５ｍｅｑ）を加えた。フラスコをスワーリングすることによって固体を溶解した後に、１時間２０℃に放置した。ジシクロヘキシル尿素を濾別し、ジクロロメタン（３ｇ２ｍｌ）によって洗浄した。濾液と洗液を一緒にし、回転蒸発させた。これに、乾燥ピリジン（６ｍｌ）中の工程（１）生成物（０，７０８ｇ、１．２７ｍｅｑ）の溶液を加えた。溶解が終了したときに、フラスコを２０℃に３９時間放置し、次に回転蒸発させた。残留ピリジンをトルエンとの反復同時蒸発によって除去した。残留油状物を最少量のジクロロメタン：メタノール（９６：４）中に溶解し、シリカカラムに負荷した。同じ溶媒による溶出によって、標題化合物を黄色泡状物（０，７６４ｇ、６３．４％）を得た。

’ＨＮＭＲδ（ＣＤＣＩｇ）：２．６−２．８　（４Ｈ，ｍ、２ｘＣＯＣ旦、）；３．２５−３．５　（１２Ｈ，４ｓ、　４ｘ−ＯＣＨｓ）　；　３．８　（６Ｈ，ｓ、　２Ｈ）；５．Ｏ（２Ｈ，ｍ、２ｘＣＨＯＣＯ）；５．１５　（２Ｈ，ｍ、２ｘＣＨＯＣＨｓ）　；　６．　９　（４Ｈ，ｍ、芳香族）　；７．　１− ７．　５５　（９Ｈ，ｍ、芳香族）（ｆ）試墓人主の型造。

工程（ｅ）からの生成物（０，５ｇ、０．７０２ミリモル）を、乾燥ジイソプロピルエチルアミン（０，４９５ｍ１．２．８１ミリモル）を含む乾燥ジクロロメタン（１５ｍｌ）中に溶解し、２−シアノエチル−Ｎ、　Ｎ−ジイソプロピルアミノクロロホスフィン（０，１８９ｍ１．０．８４３ミリモル）を滴加しながら、この溶液を乾燥アルゴン流下で撹拌した。溶液をアルゴン下、室温においてさらに３０分間撹拌し、このときにジクロロメタンニトリエチルアミン（１９：１）中でのＴＬＣは出発物質が存在しないことを示した。乾燥メタノール（５ｍｌ）の添加によって反応を停止させ、この溶液を酢酸エチル（２００ｍｌ）によって希釈した。この溶液をブライン（３ｇ２００ｍｌ）と水（２００ｍｌ）とによって洗浄した。有機層を分離し、乾燥させ（ＭｇＳＯ＜）、濾過し、ガム状物になるまで蒸発させ、これを最少量のジクロ口メタン：ヘキサンコトリエチルアミン（４２：５５：３）中に再溶解し、シリカカラムに負荷した。同じ溶媒による溶出と次のジクロロメタン：トリエチルアミン（１９：１）による溶出とによって、標題化合物を無色ガラス状物（０，５２ｇ、８１．３％）を得た。

’ＨＮＭＲδ（ＣＤＣＩｇ）：１．１−１．３　（１４Ｈ，ｍ、２ｘＣ旦（ＣＨｓ）　２）　；　２．５　（２Ｈ，ｍ、　Ｃ旦２ＣＮ）　；　２．６−２．８　（４Ｈ，ｍ、　２ｘＣＯＣ旦２）：３．２　３．６　（１４Ｈ，ｍ、　４ｘ−ＯＣＨｓとＣ旦ｚＯＰ）；３゜８　（６Ｈ，ｓ、２ｘＡｒＯＣ旦、）：４．０　（ＩＨ，ＤＭＴ−ＱＣ旦）；４．３（ＩＨ，ｍ、　ＣＨＯＣＨｓ）　；　４．４− ４．６　（２Ｈ，ｍ、　Ｃ旦ｏｃＨｘとＣ旦ＯＰ）　；　５．　Ｏ（２Ｈ，ｍ、　２ｘＣ旦０ＣＯ）；５．２０　（２Ｈ，ｍ、２ｘＣＨＯＣＨ３）　；　６．　９　（４Ｈ，ｍ、芳香族）　；　７．　１−７．　５　（９Ｈ，ｍ、芳香族）。

実施例旦固相担体に結合した２個のオリゴヌクレオチドを合成するために、実施例２の方法を繰り返したが、但し、この場合には、試薬Ａ１の代わりに、Ｏ，ＩＭの濃度まで無水アセトニトリル中に溶解した試薬Ａ３を用いた。

開裂可能なリンクによって固相担体に結合した２個のオリゴヌクレオチドは実施例２に記載した式によって説明され、この式中、−Ｌ”−は式：によって示される開裂可能なリンカ−である。

本発明の方法の工程（ｄ）後に見い出される２個のオリゴヌクレオチドは実施例２に述べたオリゴヌクレオチド１と２に同じであることが判明し、このことは該開裂可能なリンクの切断と目的生成物の生成とを実証した。

補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成　６年１０月　３日

Claims

【特許請求の範囲】１．下記工程：（ｉ）固相担体に結合した開裂可能な第１リンク上に第１オリゴヌクレオチドを形成する工程と；（ｉｉ）該第１オリゴヌクレオチドに開裂可能なリンカー部分を結合させる工程と；（ｉｉｉ）該開裂可能なリンカー部分上に第２オリゴヌクレオチドを形成する工程と；（ｉｖ）該開裂可能な第１リンクと該開裂可能なリンカー部分とを開裂させて、複数のオリゴヌクレオチドを得る工程とを含む複数のオリゴヌクレオチドの合成方法において、開裂可能なリンカー部分が式（１） ▲数式、化学式、表等があります▼（１）［式中、Ａ１とＡ２の一方又は両方が式（ａ）：▲数式、化学式、表等があります▼（ａ）（式中、Ｒ１とＲ２はそれぞれ独立的に、Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアリールオキシ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、任意に保護されたヒドロキシ、任意に保護されたオキシカルボニル、任意に保護されたＮＨ２、又は電子吸引基であり；ＹはＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２、ＮＨ、Ｓ又はＯである）で示される二価基であり；Ｅは有機スペーサー基であり；Ａ１又はＡ２によって表される残りの基は式（ｂ）：▲数式、化学式、表等があります▼（ｂ）（式中、ｎは１〜５の値を有し、星印で標識された炭素原子は式（１）中に示さされる酸素原子に結合し；各Ｒ３は独立的にＨ又は任意に置換されたアルキルを表す）で示される基である］によって示される前記方法。２．開裂可能なリンカー部分の開裂が、それぞれ３′と５′位置に、ヒドロキシ及びホスフェートから選択される基を有する複数のオリゴヌクレオチドを生ずる請求項１記載の方法。３．開裂可能なリンカー部分の開裂が、それぞれ３′位置に、ヒドロキシ基を有する複数のオリゴヌクレオチドを生ずる請求項１又は２に記載の方法。４．工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を自動化オリゴヌクレオチド合成装置を用いて実施し、工程（ｉｖ）を塩基性条件下で２０〜１００℃の温度において最大限４８時間まで実施する請求項１〜３のいずれかに記載の方法。５．式（１）の開裂可能なリンカー部分が請求項６〜１８のいずれかに記載の式（３）化合物から誘導される請求項１〜４のいずれかに記載の方法。６．式（３）： ▲数式、化学式、表等があります▼（３）［式中、Ａ１とＡ２の一方又は両方が式（ａ）：▲数式、化学式、表等があります▼（ａ）（式中、Ｒ１とＲ２はそれぞれ独立的に、Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意にに置換されたアルコキシ、任意に置換されたアリールオキシ、又は電子吸引基であり；ＹはＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２、ＮＨ、Ｓ又はＯである）で示される二価基であり；Ｅは有機スペーサー基であり；Ａ１又はＡ２によって表される残りの基は式（ｂ）▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ｎは１〜５の値を有し、星印で標識された炭素原子は式（３）中に示さされる酸素原子に結合し；各Ｒ３は独立的にＨ又は任意に置換されたアルキルを表す）で示される基であり；Ｚ１は酸不安定性保護基であり；−Ｏ−ＰＡはホスホロアミダイト基、リン酸エステル基又はＨ−ホスホネート基である］で示される化合物。７．Ａ１とＡ２が両方とも式（ａ）を有する請求項６記載の化合物。８．Ａ１が式（ａ）を有する基であり、Ａ２が式（ｂ）を有する基である請求項８記載の化合物。９．ＹがＯ又はＣＨ２である請求項６〜８のいずれかに記載の化合物。１０．Ｅが、任意にエーテル、チオエーテル、アミノ又はアミド基によって割り込まれた、アルキル、アリール又はアラルキルスペーサー基である請求項６〜９のいずれかに記載の化合物。１１．Ｅが任意に置換されたフェニレン又はＣ２−６アルキレンである請求項１０記載の化合物。１２．Ｒ１とＲ２がそれぞれ独立的にＨ、アルキル又はアルコキシである請求項６〜１１のいずれかに記載の化合物。１３．Ｒ３が独立的にＣ１−４アルキル又はＨである請求項６〜１２のいずれかに記載の化合物。１４．Ｚ１がジメトキシトリチルである請求項６〜１３のいずれかに記載の化合物。１５．Ｏ−ＰＡが式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ５とＲ６はそれぞれ独立的に、炭素数１０までの、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアラルキル、シクロアルキル及びシクロアルキルアルキルであるか、又はそれらが結合する窒素原子と共に、任意に置換されたピロリジン若しくはピペリジン環を形成するか、又はＲ５とＲ６は、それらが結合する窒素原子と共に考えられる時に、窒素、酸素及び硫黄から成る群から選択される１個以上の付加的ヘテロ原子を任意に含む飽和窒素複素環を形成し；Ｒ７は水素又は保護基を表す］で示されるホスホロアミダイトである請求項６〜１４のいずれかに記載の化合物。１６．式（ａ）基において、Ｙが０であり、Ｒ１とＲ２が両方とも水素又はメトキシであり；式（ｂ）基が−■ＣＨ２ＣＨ２−ＳＯ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である請求項６〜１５のいずれかに記載の化合物。１７．Ａ１とＡ２が両方とも式（ａ）を有し、ＹがＯであり、Ｒ１とＲ２が両方とも水素又はメトキシであり；Ｅが−ＣＨ２ＣＨ２−であり、Ｚ１がジメトキシトリチルであり、Ｏ−ＰＡが式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ５とＲ６はそれぞれイソプロピルであり、Ｒ７は２−シアノエチルである］で示されるホスホロアミダイトである請求項６〜１６のいずれかに記載の化合物。１８．Ａ１が式（ａ）［式中、ＹがＯであり、Ｒ１とＲ２が両方とも水素又はメトキシである］を有し；Ａ２が−■ＣＨ２ＣＨ２−ＳＯ２−ＣＨ２ＣＨ２−であり、Ｚ１がジメトキシトリチルであり、Ｏ−ＰＡが式：▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ５とＲ６は両方ともイソプロピルであり、Ｒ７は２−シアノエチルである］で示されるホスホロアミダイトである請求項６〜１７のいずれかに記載の化合物。１９．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ａ１、Ｅ、Ａ２は請求項６〜１８のいずれかで定羲された通りである］で示される開裂可能なリンカー部分を含む１個又は複数の基によって連結した２個以上のオリゴヌクレオチドを含む化合物。２０．複数のオリゴヌクレオチドを合成するための請求項６〜１８のいずれかで定羲された化合物の使用。