JPH07504082A

JPH07504082A - Ｍ．Ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのプロモーター及び免疫原性配列の発現のためのその使用

Info

Publication number: JPH07504082A
Application number: JP5507458A
Authority: JP
Inventors: マーレイ，アラン; ゲオルギイユ，マリナ; ジクケル，ブリジツト
Original assignee: アンステイテユ・パストウール; マシー・ユニバーシテイ
Priority date: 1991-10-25
Filing date: 1992-10-23
Publication date: 1995-05-11
Also published as: NZ244901A; US5968815A; FR2682967A1; EP0666917A1; WO1993008284A1; FR2682967B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】２８、投与した動物又はヒト宿主における抗体の産生を誘起するため、又は好ましくは防御抗体の産生、及び／又は細胞性免疫応答、特にＴＬＣ応答の誘発に寄与するために十分な量の請求項２３又は２４に記載の組換え細胞宿主を含むことを特徴とする免疫原性組成物。

明細書本発明は、所定の細胞宿主においてヌクレオチド連鎖をクローニング又は発現させることが可能なヌクレオチド配列に係る。

本発明のヌクレオチド配列はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓから得ることができる。

マイコバクテリウムのうちでは、例えば結核症に対するワクチン接種の範囲で世界中で広く使用されているＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕａ＋　ｂｏｖｉｓのアビルレント株であるＢ　ＣＧ　（ｂａｃｉｌｌｅ　ｄｅ　Ｃａｌｍｅｔｔｅ　ｅｔ　Ｇｕ６ｒｉｎ）を初めとする所定の株が特に知られている。ＢＣＧはその生物学的特徴により、組換えワクチンの開発の有利な候補である。細胞壁は非常に有効なアジュバントとして機能し、ただ１同棲種するだけで長期間の免疫を誘起することができる。ＢＣＧは繰り返し免疫感作時さえも重大な副作用を生じることは稀である。

ＢＣＧ接種接種時異的免疫の誘発は、Ｔ細胞が主要組織適合遺伝子複合体（略称ＭＨＣ）の産物に会合したマイコバクテリウムの抗原を有するマクロファージと反応すると開始する。感作されたＴ細胞のクローンは増殖してリンフ才力インを産生じ、リンフ才力インはマクロファージを活性化して桿菌を非特異的に排除する。更に、ヘルツ＜−’ｒ細胞はＢ細胞のクローンの増殖を誘発し、抗体産生をもたらす。

特に複製又は組み込みベクターに関する知識を利用することにより、ＢＣＧにおいて異種遺伝子をクローニング及び発現させる試みが既に行われている。例えば、マイコノ（クテリウム（特にＢＣＧ又はＭｙｃｏｂａｃｒｉｕ＋ｓ　Ｋａｎｓａｓｉｉ）により排出される主要タンパク質であるα抗原との融合ポリペプチドとしてＨＩＶ−１のｇａｇタンパク質のエピトープがクローニングされ、抗生物質耐性遺伝子がその固有の調節領域の制御下に発現された。ＢＣＧ組換え体における異種抗原の発現を最適化するために、本発明者らはマイコノくクテリウムにおいて機能的な遺伝子調節単位を特徴付けるべく研究を行った。

本発明者らはマイコバクテリウム又は他の細胞宿主において所与の核酸を発現させることが可能なヌクレオチド配列をＭｙｃｏｂａｃｒｉｕｉ　ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓから単離及び特徴付けし、これを報告した。

核酸なる用語は、その組成、長さ又は起源（抽出により得られるか又は合成により得られるか）に関係なく、クローニング及び／又は発現され得る全ヌクレオチド配列を意味する。

Ｍ、ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　（以下の文中では１ｉｐｔｂとも呼称する）を利用して種々の研究が行われており、Ｇｒｅｅｎら（ＮｕｃＬｅｉｃ＾ｃｉｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｖｏｌ、１７　（２２）　１９８９．９０６３− ９０７２頁）は特にこのマイコバクテリウムの挿入エレメントを特徴付は及び配列決定し、このエレメントをｌ５９００と命名した。

Ｇｒｅｅｎらによると、この挿入エレメントは３９９アミノ酸のタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム０ＲＦ１１９７を含む。

本発明者らは、他のマイコバクテリウム株、特に１ｌｕｒｒａｙン試験を実施することにより、λｇｔｌｌゲノムバンクのスクリーニングによりＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ種の特異的配列を検討した。

この際に、本発明者らはＧｒｅｅｎらにより記載されているエレメントｌ５９００に隣接するフラグメントを含む特異的ＤＮＡ配列に着目した。

本発明者らは、潜在的トランスボザーゼをコードし且つ挿入エレメントｌ５９００上に含まれるオープンリーディングフレームの相補的逆配列の５′部分に隣接する配列の存在をつきとめた。この新規配列はプロモーターの機能を有すると共に、転写及び翻訳の調節に重要なシグナルを含み得る。

核酸のクローニング及び／又は発現に使用可能な本発明のヌクレオチド配列は、ａ）図２に示す配列又はこの配列の１部分であって、該部分の制御下におかれた核酸の発現に関与し得る任意部分、ｂ）下記条件下で配列ａ）の相補的配列とハイブリダイズする配列から選択される配列（１）を含むことを特徴とする。

本発明の範囲で有用な配列■の１部分は、例えばそのプロモーター及び最初の８アミノ酸を欠失するβ−ガラクトシダーゼの遺伝子を含むプロモーター及び翻訳シグナル認識ベクターの上流に配列Ｉの所定の１部分をクローニングする等の試験を実施することにより決定され得る。

試験実施条件は、図７〜９の構築物に対応する記載に基づいて設定することができる。こうして試験した本発明の範囲内で有利な配列Ｉの１部分を用いて、種々の細胞宿主（例えば放線！Ｉ）でβ−ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質を合成する。

核酸のクローニング及び／又は発現に使用可能な本発明の特に有利な第１のヌクレオチド配列は、ａ）下記ヌクレオチド配列：ＧＡＴ　ＣＣＣＧＴＧ　ＡＣＡ　ＡＧＧ　ＣＣＧ　導入Ｇ　ＡＧＣＣＣに　ＣＧＡ　ＣＣＧ　ＴＧＣＧＧＴ　ＣＧ’ｒＣＧＡ　ＣＧＡ　ＣＣＧ　ＡＧ’Ｔ　ＣＴＣＡＧＣＡＧＡ　ＣＣＣＣｃＴ　ＧＧＴ　ＧＡＡ　ＧＧＧ　ＴＧＡ　ＡＴＣ＋１ＧＡＣＡＧＧ　ＴＡＣＡＣＡ　ＣＡＧ　ＣＣＣＣＣＡ　ＴＡＣＡＣＴ　ＴＣＧ　ＣＴＴ　ＣＡＴ　ＧＣＣＣ’！？λＣＧ　ＧＧＧ　ＧＧＣＧＧＣＣＡＡ　ＣＣＣＡＣＡ　入ＧＧ　ＡＣＡ　ＴｒＣＴＣＡ又はこの配列の１部分であって、特に転写開始部位（＋１位）と、該部分により形質転換される所定の細胞宿主のポリメラーゼＲＮＡの認識及び固定に必要であり、特に転写開始部位に対して一１０位に配列［ＴＡＣＡＣＴ］を含み且つ転写開始部位に対して一３５位に配列［ＴＣＧＡＣＡ］を含むエレメントとを含む任意部分、ｂ）下記条件下で配列ａ）の相補的配列とハイブリダイズする配列を含むことを特徴とする配列（ｎ）である。

上記ハイブリダイゼーション条件を以下に説明する。

例えばハイブリダイゼーションを試験することが所望される配列から決定されるプローブを使用し、このプローブを”Ｐ　（１０＠ｃｐｍ／ｍｌ）で標識し、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＰＥ、２００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ及び１０ＸＤｅｎｈａｒｔ）中で６５℃で１６時間被験配列と接触させる。次に、ハイブリダイゼーションを実施する膜をｌ５ＳＣ，０，１％ＳＤＳ溶液で周囲温度（２０℃）で３０分間２回洗浄した後、０、ｌ５ＳＣ，Ｑ、１％ＳＤＳで６５℃で３０分間２回洗ＮａＣｌ　９００ｍＭＮ　ａ　Ｈ２Ｐ　Ｏｓ　４５０　ｍ　ＭＮ　ａ、　２　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　５　ｍ　Ｍｆｉｃｏｌｌ　２．５ｇ／ｌポリビニルピロリドン　２．５ｇ／ＩＢ　Ｓ　Ａ　（ＰｅｎｔｅｘフラクシＥＩ：／Ｖ）２．５ｇ／１ＮａＣＩ　１５ｍＭクエン酸Ｎａ３　ｏ、ｉ％＋１を付したヌクレオチドＡは本発明の範囲内の所定の転写開始部位に対応し、この部位の上流のヌクレオチド配列は、該ヌクレオチド配列を所定の核酸配列のクローニング又は発現のためのプロモーターとして配列を使用可能な細胞宿主のポリメラーゼＲＮＡの認識及び固定エレメント（領域−３５〜−１０）を含む。

領域−３５〜−１０は＋１部位に対して位置付けられる。

上記配列（配列■及び■）は上記転写開始に必要な最小配列と、転写及び／又は発現の調節に役割を果たし得るこの配列の上流及び下流のフラグメントを含む。

例えばこれらの配列は、リポソームの固定に関与するシャインーダルガルノの配列型の連鎖［Ａ　ＡＧＧ　ＡＧ］を含む。

細胞宿主中でヌクレオチド連鎖を発現させることが可能な別のヌクレオチド配列は、本発明によると、ａ）下記ヌクレオチド配列：＋１ＴＣＣＡＣＡＧＧ　ＴＡＣＡＣＡ　ＣＡＧ　ＣＣＣＣＣＡ　ＴＡＣ入ＣＴ　ＴＣＣｉ　ＣｆＴ　ＣＡｂ）下記条件下で配列ａ）の相補的配列とハイブリダイズする配列、Ｃ）核酸の転写活性に関与するこの配列の任意部分から選択されるＤＮＡ配列（ｍ）を含むことを特徴とする。

１１■又は■とのハイブリダイゼーション能により定義される配列ｂ）は、１又は複数のヌクレオチドのレベルにおいて修飾されているにも拘わらず、核酸の転写に関与する配列Ｉ、■又は■の特性を維持する本発明の配列の変異体をいずれの場合も与える。変異体のレベルに導入され得る修飾は例えば、ヌクレオチドの置換、挿入、欠失又は逆位である。

含むヌクレオチド配列は、核酸配列の所与の配列を発現させるためのプロモーターとして機能し得るヌクレオチド連鎖を含む。

本発明のヌクレオチド配列が連鎖■を含む場合、このような配列を以下の文中では「プロモーターを含む配列」とも呼称する。

場合により配列■は、連鎖Ｉにおいて必ずしも配列■と隣接せずに所与の核酸の発現のためにＩに関与し得る配列Ｉのフラグメントと共に使用され得る。

上記配列は、Ｍ、　ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのＤＮＡから抽出・精製により得ることもできるし、化学的合成により得ることもできる。

本発明の別の実施態様によると、上記連鎖１１■又は■を含むヌクレオチド配列の全変異体は、連鎖１１■又は■の機能性、特に所与の宿主中のヌクレオチド配列の転写時にプロモーターの機能を果たす能力を維持するという事実により定義され得る。

配列■を取り囲むヌクレオチド配列Ｉ又は配列Ｈのエレメントは、少なくとも部分的に欠失していてもよいし、場合によっては置換していてもよい。例えば転写開始部位に対してヌクレオチド＋２〜＋４１位に含まれる配列は、Ｍｐｔｂにおいて配列■の下流に天然に存在する配列に対して外来性の配列により全部又は一部を置換され得、この外来配列は所定の宿主においてリポソームにより認識され得るシャインーダルガルノの配列を含む。

例えば＋２〜＋４１位に含まれるこの配列は、細菌起源の外来配列、例えばシャインーダルガルノの配列を含む大腸菌により置換され得る。

本発明は更に、所与の核酸の転写又は翻訳に関与し得る−３５〜−１０領域又はシャインーダルガルノ（ＳＤ）の配列の外側の配列Ｉ又は■の任意部分の使用にも係る。

本発明は更に、上記ヌクレオチド配列と、このプロモーターの制御下で所定の細胞宿主においてクローニング及び／又は発現を得ることが所望される少なくとも１種の核酸配列を含むことを特徴とする組換えヌクレオチド配列にも異なる起源のペプチドもしくはポリペプチドをコードする異種配列であり得る。

Ｍｐｔｂにおいて配列Ｉ又は■に天然で隣接する配列に対応しない限り、核酸配列は異種配列であるとみなされ、この天然に隣接する配列の一部は図２に示す７１６ｂｐの連鎖に対応する。

従って、本発明の手段は、本発明のヌクレオチド配列のめに使用され得る。

組換え配列は、所定の宿主（例えば大腸菌のような細菌）でコーディング配列をクローニングするためと、その後、この配列を別の宿主（例えば放線菌、特にマイコバクテリウム株、特に８００株）に移入して発現させるためのいずれにも使用することができる。

本発明は、任意の型の核酸配列、特に抗原特徴を有するペプチド、ポリペプチド又はタンパク質（ポリペプチドと総称する）をコードする配列をクローニング又は発現させるために利用することができる。

本発明は例えば、本発明の上記ヌクレオチド配列１１■又は■の制御下におかれた少なくとも１種の核酸配列が、免疫原性又は免疫原性にされ得るペプチド又はポリペプチドをコードすることを特徴とする、上記定義に合致する特定の組換え配列に係る。

例えば本発明の組換え配列に組み込まれる発現させるべき核酸配列は、病原生物の特徴的配列゛であり得る。病原物質は例えばウィルス、寄生虫、細菌である。

特に、Ｍ、　１ｅｐｒフチリア、破傷風に関与する桿菌、リュージュマニア、サルモネラ、所定のトレポネーマ、百日咳毒素並びに他の病原性及びウィルス性微生物、特に流行性耳下腺炎ウィルス、風疹ウィルス、ヘルペスウィルス、インフルエンザウィルス、住血吸虫、赤痢菌、ナイセリア、ボレリア、狂犬病ウィルス、ポリオウィルス、肝炎ウィルス、ＡＩＤＳ　ＨＩＶ、ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ −Ｔ１及ＵＳ　ＩＶウィルス並びに腫瘍ウィルスを挙げることができる。

発現させるべき核酸配列は更に、例えばヘビ又は昆虫毒の免疫原性配列をコードし得る。

従って組換えヌクレオチド配列は、本発明の同一ヌクレオチド配列の制御下で、場合により異なる生物に特徴的な複数の抗原コーディング配列を含み得る。

好ましくは、本発明は発現させるべき核酸配列がレトロウィルスＨＩＶのペプチド又はポリペプチド（例えばエンベローブペプチドもしくはポリペプチド、又はＮｅｆタンパク質、ＨＩＶ−１もしくはＨＩ　Ｖ−２のペプチドもしくはポリペプチド）をコードすることを特徴とする組換え配列に係る。

本発明の実施範囲内で他の核酸配列を使用することもでき、例えばマイコバクテリウムの抗原又は免疫原性配列、特にビルレンスに関与する遺伝子及び防御能を有する抗原に対応するタンパク質又はタンパク質フラグメントを挙げることかできる。「防御能を有する」抗原とは、特に抗体産生又は細胞型（特にＴＬＣ型）の免疫応答の誘発により防御免疫応答を誘起又は助長し得る抗原を意味する。

本発明のヌクレオチド配列が場合により別の生物に属する１又は複数の所定のハプテン又はエピトープの発現の制御に関与するような組換え配列を構成することも予想できる。更に、これらのハプテン又はエピトープは抗原又は一般には、特に細胞宿主の表面における発現のため、更にはハプテン又はエピトープの分泌のためにキャリヤータンパク質として使用可能なポリペプチドをコードする配列に会合し得る。

会合なる用語は、組換え配列中に存在し且つ細胞宿主中での発現時にその個体性を維持する種々の配列間のハイブリッドコーディング配列の形成即ちコーディングエレメントとしてのオペロンの会合又は融合遺伝子の発現に起因する融合タンパク質の形成を意味する。

本発明のヌクレオチド配列１、■又は■は発現させるべきヌクレオチド配列の上流でこの配列と同相内、又は発現させるべき核酸配列の下流に配置され得る。コーディング配列に対するその位置の選択は、所定の宿主における所望の発現率に応じて決定され得る。

従って、本発明の組換えヌクレオチド配列において本発明のヌクレオチド配列及び発現させるべき核酸配列は融合オペロンを構成し得る。この場合に複数の核酸が存在するならば、配列の制御下で個体化産物として発現される。

本発明の別の実施態様によると、ヌクレオチド配列Ｉ、■又は■及び発現させるべき核酸配列は融合遺伝子を構成する。この場合、複数の核酸が使用されるときにはこの遺伝子の発現産物はハイブリッドタンパク質又は融合タンパク質により構成される。

ルレントＢｃＧ株）、グラム陰性菌（例えば大腸菌）又はダラム陽性菌（例えば枯草菌）における核酸配列のクローニング及び／又は発現のための上記ヌクレオチド配列の使用に係る。

更に、上記定義による連鎖１１■もしくは■又はその変異体を含むヌクレオチド配列を夫々その組み込み又は複製に必須ではない部位に含むことを特徴とする組み込み型又は複製型のクローニング及び／又は発現ベクターも本発明の範囲に含まれる。

従って、これらのベクターは染色体外で複製すること又は逆に染色体中、より一般には当該エレメントが取り込まれる宿主のゲノムの成分（この宿主中に存在するプラスミド又はバクテリオファージを含む）中に組み込まれたエレメントとして複製することが可能である。

本発明のベクターは更に、上記組換えヌクレオチド配列により夫々その組み込み又はその複製に必須でない部位を修飾されていることを特徴とし得る。

も一部を含む。この配列は有利にはプロモーターを含む配列の下流、好ましくはプロモーターと異種核酸配列の間に配置される。有利には、０ＲＦ２のこの部分は図２に示したようなＭｐｔｂの７１６ｂｐの連鎖に対応する。

本発明を実施するために十分なベクターの例としては、プラスミド、トランスポゾン、ファージ又は配列の発現に使用可能な池の任意のベクターを挙げることができる。特に、場合により本発明の実施のための中間プラスミドとして有利なプラスミドは、仏国、パリに所在のＣｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌｅ　ｄｅｓ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓに１９９１年１０月２３日付けで寄託番号１−１１５７で寄託され、ベクターｐＵＣ１８にクローニングされた７１６ｂｐフラグメント（見上ｔｌ／ＢａｍＨＩ）を含む大腸菌株（Ｍｙｃ７５８）である。

このプラスミドは特に、制限部位Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩ　／　Ｂ　ｇ　Ｉ　ＩＩ（プロモーターｐａｎ）及び連結配列（リンカ−）により画成される配列Ｈに対応する本発明のプロモーターを含む。

ベクターの例としては、ｐＡ　Ｌ　５０００　（Ｒａｎｚｉｅｒら。

ド、Ｔｎ６１０及びＩ　Ｓ　６１００　（ｌｌａｒｔｉｎら、１９９０．　Ｎａｔ２２６５−２２７２）　、Ｉ　Ｓ　６１１０　（Ｔｈｉｅｒｒｙら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ３１１１−３１１５）　、　Ｄ　２　９　（Ｔｏｋｕｎａｇａら、１９６４．　Ｊ、Ｅｘｐｔｌ、１Ｉｅｄ、。

ヌクレオチド配列の他のエレメントを本発明のベクターに取り込んでもよいし、又はこのような他のエレメントが存在してもよい。このような他のエレメントは例えば発現マーカーであり、この点ではカナマイシン又はバイオマイシンのような抗生物質耐性遺伝子を挙げることができる。

他の調節エレメントとしてはコーディング配列の発現に関与する配列も挙げられ、特にオペレーター型の配列即ち排出、宿主の膜のレベルでの暴露、異種配列の発現産物の排泄又は分泌を助長し得るエレメントを挙げることができる。

本発明は更に、上記組換えヌクレオチド配列又は上記ベクター中に含まれる発現させるべき核酸配列の発現を可能にする条件下で該組換えヌクレオチド配列又はベクターにより形質転換されていることを特徴とする組換え細胞宿主にも係る。

本発明の実施に特に有利な細胞宿主は、その表面への暴露、更に該宿主に含まれる発現させるべき核酸配列の発現産物の排泄もしくは分泌又は細胞質内局在条件下におけるその合成を可能にする宿主である。

特定の宿主は例えば放線菌株、好ましくはアビルレントれているワクチンを構成するために使用されているバストウール研究所のアビルレントＢＣＧ株）である。

一方、本発明者らはＭｐｔｂの特異的プロモーターを含む配列が放線菌以外の株で機能し得ること、例えば大腸菌のようなグラム陰性菌で機能し得ることを立証した。この配列はダラム陽性菌（例えば枯草菌又はストレプトミセス）でも使用することができる。

本発明の組換え細胞宿主の製造に適した方法は例えば５ｎａｐｐｅｒ　Ｓ、ら（１９８８，ＰＮＡＳ　［ＩＳＡ　８５：６９８５−６９９１）の記載によるエレクトロポレーション又は例えばＬａｚｒａｑ　Ｒ，ら（１９９０゜このプロモーターの有利な特性と、選択された株、特に抗原又は免疫原性配列のアビルレント株で発現できることを考慮すると、本発明は抗体産生を誘起するため、又は該当組成物を投与した動物もしくはヒト宿主において好ましくは防御抗体の産生に寄与するために十分な量の上記基準に合致する組換え細胞宿主を含むことを特徴とする免疫原性組成物を提案する。

この免疫原性組成物は、配列１１■又は■の制御下で発現される核酸配列の発現産物が抗体産生を誘起し得る条件下におかれている限り、抗体産生により所定の病原物質に対する防御応答を誘起するため及び細胞型の免疫応答を誘導するために使用することができる。免疫原性組成物は、タンパク質又は別の成分により開始される抗体産生を刺激するためにブースター組成物としても使用され得る。

免疫原性組成物の投与後に生じる応答は細胞型であり得、組成物は特にＴＬＣ型の配列であり得る。

従って、本発明は細胞宿主（特にＢＣＧ）と発現させるべき核酸配列の発現産物との両方に対する抗体が産生されるような混合ワクチン型のワクチンを製造することができる。

ワクチンの製造に有利な特性以外に、本発明の組換え細胞宿主を含む組成物は免疫療法を実施するためにも使用可能である。

免疫療法のためのこのようなワクチン又は組成物は動物又はヒトで使用することができ、皮肉、皮下、経口、エアゾール又は経皮経路により投与することができる。十分な防御を得るためには例えばブースター形態で複数回投与することが必要である。

本発明の組換え細胞宿主は、特に工業規模で任意のタンパク質又はペプチドを製造するためにも使用できる。例えば、抗生物質を製造するために本発明を使用することができる。

本発明の池の特徴及び利点は以下の実施例及び図面に明示される。

子１ａｃＺは二重線により示す。ｐＡＭ３をＢａｍＨＩ／Ｐｓｔ■で消化し、７１６ｂｐのフラグメントを生成し、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎシステムを使用することにより１％アガロースゲル上で回収した。Ｂ　ａｍＨＩ／Ｐ　ｓ　ｔ　Ｉで消化したプラスミドｐＮＭ４８２にフラグメントを連結し、ｐＡＭ３１０を生成した。コンピテント大腸菌株ＭＣ１０６１を連結産物で形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬｕｒｉａ−Ｂｒｏｔｈ　（ＬＢ）培地に細胞をプレートした。プラスミドの制限地図を調べることにより、組換えプラスミドｐＡＭ３１０を担持するクローンを回収した。酵素Ｓｍａｌ／Ｄｒａｌで消化することによリｐＡＭ３１０から得た３、８ｋｂフラグメントを０゜８％アガロースゲル上で溶離し、その開放末端をｐＲＲ３の５ｃａ１部位に連結し、ｐＡＭ３２０を生成した。この構築物では遺伝子Ａｐ’　（アンピシリン耐性遺伝子）は分断されている。大腸菌細胞ＭＣ１０６１を形質転換し、コロニーを表現型Ｋｍ’Ａｐ’により選択した。これらの組換え体のＤＮＡをアルカリ溶菌により調製し、エレクトロポレーシヨン１こよりＭ、ｓｍｅｇｍａｔｉｓ　ｍ　ｃ　”　１５５　（Ｓｎａｐｐｅｒら・１９９０、１ｌｏｌｅｃ、１ｌｉｃｒｏｂｉｏ１．４：１９１１−１９１９）を形質転換するために使用した。

１１ｉＶ２：　ｐＡＭ３から得た７１６ＭのＢａｍＨＩ／Ｐｓｔｌフラグメントのヌクレオチド配列及び。ｒｆ２のＮ末端１８５アミノ酸。

ＳＤ＝シャインーダルガルノ；＋１＝転写開始部位。

Ｃ３：ｉｖ（静脈内）接種から４０日後に採取したマウス血清上のＥＬＩＳＡｏＢａｌｂ／ＣマウスをｐＡＭ３２０又はＢＣＧ株１１３７Ｐ２で形質転換した１０’　ＣＦＵのｒ−ＢＣＧでｉｖ経路で免疫感作した。免疫感作しない複数のマウスを対照として使用した。血清を免疫感作から４０日後に採取し、試験した。

抗β−ガラクトシダーゼ抗体をＥＬ　Ｉ　ＳＡ法により検出した（Ｅｎｇｖａｌ　Ｅ、及びＰｅｒｌｍａｎ　Ｐ、　１９７１．　Ｉ閣ｓｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　針８７１−８７４）。微量滴定プレートをウェル当たり１μｇのβ−ガラクトシダーゼで被覆した。アルカリホスフェート（Ｂｉｏｓｉｓ）で標識した抗マウスイムノグロブリンヤギ抗体で抗β−ガラクトシダーゼ抗体を検出した。各値はマウス４又は５匹の血清プールに対応する。

客４　：　１０’　ＣＦＵのＢＣＧ＋ｐＡＭ３■及びＢＣＧ株１１７３Ｐ２Ｓを皮下経路で免疫感作したＢａ１ｂ／Ｃマウスのリンパ節細胞の増殖応答。

免疫感作した１群のマウスにＩＦＡＯ，１ｍｌを接種した。２週間後、β−ガラクトシダーゼ、ＡＰＨ３’　、ＰＰＤ及びＣｏｎＡに対するＬＮ細胞（リンパ節細胞）の増殖応答を試験した。

殴ｊ：特異的ＣＤＪ＋及びＣＤＢ＋リンパ球の増殖。

Ｂａ１ｂ／Ｃ７ウスをｌ０ＣＦＵのＢＣＧ　１１７３Ｐ２　（ａ）及びｒ−ＢＣＧ＋ｐＡＭ３２０　（ｂ）で皮下経路で免疫感作した。２週間後、抗ＣＤ４　（ ○）又は抗ＣＤ８（・）モノクローナル抗体の存在下でＰＰＤ（１０μｇ／ｍ１）（ａ）及びβ−ガラクトシダーゼ（０，０１ａ　ｇ／ｍ１）（ｂ）に対するＬＮ細胞の増殖応答を試験した。

図６＝マウスのＬＮ細胞のインターフェロンγ応答。

ａ）ＢＣＧ　１１７３Ｐ２で免疫感作したマウス。

ｂ）ｌμｇ／ｍ、］　β−ｇａｌ（・）、１０μｇ／ｍ１ＰＰＤ　（０）　、２．５μｇ／ｍｌ　ｃｏｎＡ　（△）で刺激後にｒ−ＢＣＧ　（＋ｐＡＭ３２０）で免疫感作したマウス。

図７：ＩａｃＺに隣接するプロモーターＰａｎのクローニング。

ｐａｎ上のＰＣＲｏＰＣＲ条件：３５サイクル。

２分間９５℃で変性、２分間５５℃でアニーリング、２分間７２℃で伸長。

１０μＭプライマー、１０ｎｍｏｌ　ｄＮＴＰ、ｐＡＭ３の標的ＤＮＡを含む反応容量５０μｍ。

図８：ｐＳＬ　１１８０のＭＣＳにおけるＰＣＲ産物のクローニング。

ＰＣＲにより得られた産物をＸｂａｌ／Ｎｄｅｌで消化ｈａｒｍａｃｆａ）に連結し、ｐＷＲ３０を得た。

図９ａ及び図９ｂ：ｐＷＲ３１，ｐＷＲ３２及びｐＷＲ３３の構築の概略説明図。

図７．８．９では、プライマーＰ１及びＰ２を使用することにより、ＰＣＲ（遺伝子増幅）を利用してｐＡＭ３から７１６ｂｐフラグメントを産生した。このフラグメントにクローニングし、プラスミドｐＷＲ３０を形成した。１ａｃＺ遺伝子に隣接する部位にｐａｎをクローニングするのための準備時に、ｐＮＭ４８２の截頭遺伝子１ａｃＺの前にプロモーターｐｌ及び遺伝子Ｃ１ｌをクローニングした。こうして、ｐＬを含む上流の配列の制御下の機能的融合タンパク質ＣＩＩ −ＬａｃＺを生成すると共に、その後の構築を可能にするポリリンカーを生成した。更にプラスミドｐＴＧ９５２をＸＨＯＩで消化し、その末端をクレノウフラグメントで充填した。次に、ＢａｍＨＪで消化後にプラスミドから５３０ｂｐフラグメントを回収し、ｐＮＭ４８２のＳｍａＩ／ＢａｍＨ１部位にクローニングした。

従つて、生成されたプラスミドｐｌｐＪＮはλのプロモーターｐｌの制御下のβ −ガラクトシダーゼの機能的遺伝子を有していた。ｐＪｐＪＮにｐａｎをクローニングするために、ｐＷＲ３０上でＥｃｏＲＩ／乱ｇｉｒｌにより消化した。１５９ｂｐフラグメントをＧｅｎｅｃｌｅａｎで精製いＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩで消化したｐｌｐＪＮにクローニングし、ｐＷＲ３１を得た。大腸菌株をこのプラスミドで形質転換し、アンピシリン及びＸ−ｇａｌの存在下で培養すると、青色のコロニーが形成された。次にＥｃ。

スミドｐＲＲ３に連結した。ｐＲＲ３においてオペロンの２方向を得た。大腸菌及びＭ、ｓｍｅｇｍａｔｉｓをＸ−ｇａｌの色原体基質の存在下で培養すると、細菌をこれらの２種の構築物（ｐＷＲ３２，ｐＷＲ３３）　で形質転換することにより青色のコロニーが形成された。

辺土０：ｏｒｆ２の配列。

疫感作した動物血清からの抗体の応答。

！ｉｏ１２　：融合物ｐＡＮ−ＯＲＦ２−Ｎｅ　ｆ　（Ｓ　ＩＶ）　を含むプラスミドの構築。プラスミドｐＴＧ３１４８はｐＴＧ９５９（Ｇｕｙら、１９８７．　Ｎａｔｕｒｅ　３３０：２６６−２６９）に由来するベクターであり、ｎｅｆ遺伝子を含む刀ユＬＬ　Ｉ　１フラグメントをクローニングしたものである。

このフラグメントはプロウィルスとして組み込まれたウィルスＳＩＶ（ｍａｃ２５１）を含むサル細胞から単離した。プラスミドｐＢ１ｕ　ｅ　／　ｐ　Ａ　Ｍ　７１２はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔｌＩｓＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に由来し、ｐＡＮ−ＯＲＦ２を含み且つｐＡＭｌから切り出したＢａｍＨＩ／Ｐ二ｓｔｉフラグメントをポリリンカーのＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩ部位の間にクローニングしたものである。

設置ユ；ポリペプチド０ＲＦ２−Ｎｅ　ｆ　（Ｓ　ＩＶ）０）発現のウェスタン型分析。分子量マーカーをレーン１の左側に示す。レーン１：タンパク質Ｎｅｆ（ＳＩＶ）を含むバキュロウィルスの抽出物。レーン２　：　ＢＣＧ抽出物。レーン３及び４ニブラスミドｐＳＮ２５を担持する組換えＢＣＧの２種の抽出物。

レーン５及び６：プラスミドｐＳＮ２６を担持する組換えＢＣＧの２種の抽出物。

接種したＢＡＬＢ／Ｃマウスのリンパ節から採取した細胞の増殖応答の分析。免疫感作プロトコルはＣｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ会議（Ｖａｃｃｉｎｅ、　１９９１年９月）の報告と同一であり、ｆｉｎｔｅｒら、１９９１　（Ｇｅｎｅ　１０９：４７−５４）にも記載されている。

タンパク質上の位置（Ｎ→Ｃ末端）に従って図３の縦軸に示す種々のペプチドでｉｎ　ｖｉｔｒｏ刺激後に刺激音測定した。３種のペプチド濃度（０，１，１及び１０μｇ／ｍ＋）を使用した。ペプチドに従ってこれらの濃度の一方又は他方について増殖最大値を観察した。図３は最大値を示す。同様に、部組換えＢＣＧで感作したマウスから増殖を測定した。得られた値は常に２５００ｃｐｍ未満であった（但し、ペプチド８４〜９６で刺激した場合には５００Ｑｃｐｍの値が観察された）。免疫感作しないマウスで実験した処、２５０ｃｐｍ未満の値であった。

Δ１１ニブラスミドｐＴＧ５１６７゜該プラスミドはｐＴＧ１８６ボリ（Ｇｕｙら、１９８７）に由来し、ＨＩＶＩ／ＭＮのタンパク質ＧＰ１６０をコードする遺伝子を担持するＢｇｌ　Ｉ　Ｉ−ＥｃｏＲＩフラグメントをポリリンカーにクローニングしたものである。

図１６：融合物ｐＡＮ−ＯＲＦ　２−Ｅｎ　ｖ　（ＨＩ　Ｖｌ／ＭＮ）を担持するプラスミドｐＬＡ１２及びｐＬＡｌ３の構築。

１１１７：プラスミドｐＬＡ１２及びｐｌ、Ａ１３を担持するＢＣＧによるポリペプチド０ＲＦ２−Ｅｎｖ　（ＨＩＶＩ／ＭＮ）の発現。１：ＨＩＶ−Ｌ　ＬＡＩのタンパク質ｇｐ１２０゜２　：　ＢＣＧ標準、細胞抽出物。３　：　ＢＣＧ −ｐＬＡｌ２、細胞抽出物。４　：　ＢＣＧ−ｐＬＡｌ　３、細胞抽出物。５　：　ＢＣＧ−ｐＬＡｌ２、培養上清。６　：　ＢＣＧ−ｐＬＡｌ３　培養上清。

図１８；プラスミドｐＬＡ１２及びｐＬＡｌ３を担持するＢＣＧを接種したマウスのリンパ節から抽出した細胞の増殖応答。

４匹のＢａ１ｂ／ｃｖウスに１０’ｃｆｕのＢＣＧ−ｐＬＡｌ２、他の４匹にＢＣＧ−ｐＬＡｌ３、更に他の４匹に標準ＢＣＧ１１７３Ｐ２を皮肉注射した。１４日後、末梢リンパ節を採取して増殖試験を行った。ＨＩＶＩ−ＬＡＩのタンパク質ｇｐ１２０を使用して、組換えＢＣＧにより産生された融合タンパク質０ＲＦ２−領域ｖ３と接触させたリンパ節細胞の増殖を誘発した。

図１９：ＥＬＩＳＡ試験により測定した抗ペプチドｖ３抗体の割合。

ｐＬＡ１２で形質転換したＢＣＧ　５ｘｌＯ＠ｃｆｕを含有するワクチン調製物を５匹のマウスに静脈内注射した。

他の５匹には同一量の組換えＢＣＧ　ｐＬＡ１３、他の５匹には遺伝子１ａｃＺを発現するが、遺伝子０ＲＦ２−１３ｎｖ’　を発現しない同一量の組換えＢＣＧを注射し、「未処置」マウスには注射しなかった。１４日後に採血し、２週間後に融合タンパク質０ＲＦ２−ｅｎｖ’の特異抗体率の変化を測定した。

ＥＬ　Ｉ　ＳＡ試験時には、血清中に存在する抗体により認識され得る抗原として、抗体５Ｃ−Ｄ　（Ｋ２４−１）により認識されるｇｐ１２０ｖｗ（ａａ３０６〜ａａ３２５）のＶ３系の２０アミノ酸のペプチドを使用した。

Δ又ユニプラスミドｐＴＧ２１０３゜該プラスミドはｐＴＧ９５９　（Ｇｕｙら、　１９８７）Ｌ：由来し、ＨＩＶＩ／ＬＡＴのタンパク質Ｐ２４をコードする遺伝子を担持するＢｇ　ｌ　Ｉ　Ｉ／ＥｃｏＲＩフラグメントをポリリンカーにクローニングしたものである。

図２１：融合物ｐＡＮ−ＯＲＦ２−ｇａｇ　（ＨＩＶＩ／ＬＡｌ）を担持するプラスミドｐＬＡ２２及びｐＬＡ２３の構築。

１１２２　：　ＢＣＧによるポリペプチドＯＲＦ２−Ｇａｇ　（ＨＩＶＩ／ＬＡＩ）の発現。　、ｔｔｅ＾、　Ｌ’１ｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｂａｃｉｌｌａｉｒｅ　ｅｔ　ｌａ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｅ　ｃｈｅｚ１’ｈｏｍｍｅ　ｅｔ　ｃｈｅｚ　ｌｅｓ　ａｎｉｉａｕｘ、　Ｐｒｏｃｅｓｓｕｓ　ｄ’１ｎｆｅｃｔｉｏｎｅｔ　ｄｅ　ｄｅｆｅｎｓｅ、Ｅｔｕｄｅ　ｂｉｏｌｏｇｉｑｕｅ　ｅｔ　ｅｘｐ６ｒｉｓｅｎｔａｌｅ、　Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ　ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ、　Ｍａｓｓｏｎ編、　Ｐａｒｉｓ、　１９２ｇ）を種々のＢＣＧ組換え体（ｒ−ＢＣＧ）の構築のための宿主として使用した。下記実験で使用した他の細菌、ファージ及びプラスミドについては表Ｉに記載する。５ａｕｔｏｎ培地ａｒ　ｌｅ　ＢＣＧ　ｐ　８１１−　Ｍａｓｓｏｎ編、　１９２８）上に蓋膜が形成されるまでＢＣＧを培養し、一般形態又は分散培養物形態のワクチン調製物を生成した。まず最初に、１０Ｍｇ／ｍｌカナマシインを含有するＬｏｗｅｎｓｔｅｉｎ−Ｊｅｎｓｅｎ培地（Ｊｅｎｓｅｎ　Ｋ、、　Ｔｏｗａｒｄｓ　ａ　５ｔａｎｄａｒｄ　ｏｆ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍｅｔｈｏｄｓ、　４ｔｈ　Ｒｅｐ、Ｓｕｂｃｏｍｗ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍｅｔｈｏｄｓ、　Ｂｕｌｌ　ＩＪｎｉｏｎ　Ｉｎｔｅｒｎａｔ、　ａｇａｎｉｎｓｔ　Ｔｕｂｅｒｃ、、　１９５７．２７：１４６−１６６）上でｒ−ＢＣＧの細菌クローンを培養した後、５ａｕｔｏｎ培地に移した。

これらの培養物をｉｎ　ｖｉｔｒｏ発現分析及び動物の免疫感作に使用した。Ｒａｎｅｓら（１９９０）　Ｊ、Ｂａｃｔ、　１７２：　２７９３−２７９７に記載に方法に従ってＭ、　ｓｍｅｇｍａｔｉｓ及び大腸菌株を培養した。

ＮＺ　Ｙｅｔ　Ｊｏｕｒｎａｌ）　５０　ｍ　ｇをホモジナイゼーション用緩衝液（ＮａＣＩ　Ｏ，ＩＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　０．０３Ｍ、　ｐＨ７，５，ＥＤＴＡ　Ｏ，００６Ｍ）に再懸濁し、ガラスピーズ（直径０．４５〜０．５ｍｍ）２ｍｌと混合し、Ｂｒａｕｎ回転式ホモジナイザーで最大速度で４℃で２分間撹拌した。遠心分離及びフェノール／クロロホルム抽出後、ＤＮＡを９５％エタノールで沈殿させ、ＲＮアーゼを含まない０．１ｍｇ／ｍｌ　ＤＮアーゼで処理した。再びフェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿後、ＤＮＡを水に再懸濁した（Ａ　２６０／２８０比＝１゜８）。

Ｍ、　ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの遺伝子バンク構築使用した方法はＹｏｕｎｇら（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　（１９８５）８２：　２５８３−２５８７）の記載をＭｕｒｒａｙら（ＮＺ　Ｙｅｔ、Ｊ、（１９８９）　３７：４７−５０）により変形したプロトコルに基づいた。バンクは２．２Ｘ１０’の組換えバクテリオファージを含んでいた。

大腸菌Ｙ１０９０中で増幅後、組換え体は約８５％となり、これは３ｘｌＯ”　ＰＦＵ／ｍｌの力価に対応した。

菫、　ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのλｇｔｌｌバンクのスクリーニングに、　ａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　（Ｍ　ｐ　ｔ　ｂ　）及びＭ、　ｐｈｌｅｉの完全染色体ＤＮＡをプローブとして使用することにより、溶菌ファージ（上記Ｙｏｕｎｇら）を含むベトリ皿から膜に移すことにより得られたＤＮＡの分別ハイブリダイゼーションによりバンクをスクリーニングした。Ｍｐ　ｔ　ｂのＤＮＡとのハイブリダイゼーション後に陽性シグナルを与えるが、墓。

助±１とはハイブリダイズしない組換えバクテリオファージをその後の分析のために維持した。蓋ａｎｉａｔｉｓら（ＪｏＭｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ：　ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎ、Ｙ、　（１９８２））により記載されているようなプレート溶菌法を使用することにより組換えバクテリオファージを増殖させた。

ＤＮＡの取り扱い０．５％臭化エチジウムを含有する０、８％又は１％アガロースゲル上でＤＮＡフラグメントを分離した。ＤＮＡをゲルから溶離し、製造業者の指示に従ってＧｅｎｅｃｌｅａｎ　ＩＩキット（Ｂｉｏｌｏｌ　Ｉｎｃ　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ）を使用することにより精製した。

上記Ｍａｎｉａｔｉｓらの文献に記載の標準方法を使用することによりプラスミドにおけるフラグメントのクローニング及び大腸菌の形質転換を実施した。上記Ｒａｎｅｓの記載に従ってマイコバクテリウムの形質転換を行った。

ヌクレオチド配列の決定ＤＮＡを音波処理により任意に切断し、フラグメントをＭ１３に任意にクローニングした。５ｅｑｕｅｎａｓｅキツト（ＵＳＢ）及びｄＧＴＰの類似体である７ −ジアザ−ｄＧＴＰを使用することによりジデオキシ鎖終止法によりクローンを配列決定した。５ｔａｄｅｎら（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

−プログラムを使用することにより、任意に得たフラグメントからの配列データのオーバーラツプを調べ、解析を行った。

ＲＮＡの調製増菌ＡＤＣＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ（Ｄｉｆｃｏ）と２５μｇ／ｍｌカナマイシンを補充した培地７Ｈ９で３７℃で中間対数増殖期までＭ、　ｓ＋ｉｅｇｍａｔｉｓ　Ｍ　Ｙ　Ｃ７６０株１００ｍ１の培養物を培養した。遠心分離後に細胞を収集し、新鮮な同一増殖培地で洗浄し、１％（ｐ／ｖ）のトリイソプロピルナフタレンスルホン酸ナトリウム及び６％（ｐ／ｖ）の４−アミノサリチル酸ナトリウムを含有する培地に再懸濁した。ガラスピーズ（４，５〜５．５ｍｍ）１４ｇを加え、混合物を撹拌装置で２×２分間激しく撹拌した。上清をフェノール／クロロホルムで２回抽出し、水相中の核酸を０．３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６）の存在下でプロパン−２−オールで沈殿させた。１０分間８０００ｒｐｍで遠心分離後、遠心分離沈渣を１００％エタノールで洗浄し、周囲温度で１０分間乾燥し、ＤＥＰＣで処理した蒸留水１ｍｌに再懸濁した。

ＲＮＡを４Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６）３容の存在下で一２０℃で１８時間沈殿させ、遠心分離により収集し、蒸留水に再懸濁した（光学密度０Ｄ２６０／２８０　２．０）。

ＲＮＡをプロパン−２−オール中の沈殿として一２０℃で維持した。

転写物のマツピングプラスミドｐＡＭ３１１をＢｓ５ＨＩＩで直線化して５°伸長物を生成し、ウシ腸アルカリホスファターゼで脱リン酸化した。Ｇｅｎｅｃｌｅａｎキットを使用してプラスミドを精製後、ＤＮＡを制限酵素！−ト」工Ｉで切断し、１％アガロースゲルから３．ｌｋｂフラグメントを単離した。

ポリヌクレオチドキナーゼ（１０単位）を使用することにより５゛　ヒドロキシル末端をＡＴＰ　（γＲ”Ｐ）　（比活性３０００Ｃｉ／ｎｍｏ　１）で放射性標識した。Ｎ１ｃｋカラム（Ｐｈ　ａ　ｒｍａ　ｃ　ｉ　ａ）に通すことにより、取り込まれなかったマーカーを抽出した。

ＲＮＡ（４０ｇｇ）及び放射性標識ＤＮＡプローブ（０゜１μｇ）を総量３０μ Ｉの蒸留水中で混合し、脱イオン化ホルムアミド２４０μＩを加え、混合物を１００℃に３分間加熱した。迅速水冷後、ハイブリダイゼーション用緩衝液１０Ｘ　（０，２Ｍ　ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ，ｐＨ６゜４、　ＮａＣ１４Ｍ、　ＥＤＴＡ　２０ｍＭ）３０μｍを加え、６０℃で３時間インキュベーションを行った。

ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドをエタノール３容で一２０℃で１６時間沈殿させた。１５分間４℃で遠心分離後、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，６）　、２８０ｍＭ　ＮａＣ１゜５ｍＭ　ＺｎＣＩｚ及び２０　ｕ　ｇ／ｍ　Ｉの変性サケ精子ＤＮＡを含有する緩衝液１００μｌに核酸沈渣を再懸濁した。

その後、ヌクレアーゼＳ１　２μｍ（４７２単位）を加え、３０分間２０℃で消化させた。２．５Ｍ　ＣＨｓ　Ｃ００ＮＨ１及び５０ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８）を含有する溶液２５μｌを加えることにより反応を停止した。キャリヤーＤＮＡ（変性サケ精子ＤＮＡ）１μｇの存在下でＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドをプロパン−２−オールで沈殿させた。

８０％エタノールで洗浄後、沈渣を蒸留水５μｍ及び停止溶液（９５％ｖ　／　ｖホルムアミド、２０ｍＭ　ＥＤＴＡ。

０．０５％ブロモフェノールブルー、０．０５％キシレンシアツールＦＦ）７μ Ｉに再懸濁した。混合物を１００℃に５分間加熱した後、６％ポリアクリルアミドを含有する配列決定用ゲルに充填した。

血清学的試験マウス血清をＥＬＩＳＡにより試験し、以下の方法に従つてβ−ガラクトシダーゼに対する特異抗体を検出した。ＰＢＳ緩衝液中、１０μｇ／ｍｌ精製β−ガラクトシダーゼで３７℃で１時間、４℃で１６時間９６穴マイクロタイターブレー）（Ｎｕｎｃ）を被覆した。０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで３回洗浄後、ＢＣＧ抽出物を４℃で１６時間予め吸収させ処理した血清を希釈用緩衝液（ＰＢＳ＋０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０．　１％　ＢＳＡ）で希釈し、ウェルに加えて３７℃で２時間放置した。３回洗浄後、アルカリホスファターゼ（Ｂｉｏｓｙｓ、　Ｃｏｍｐｉａｇｎｅ）に結合したウサギ抗マウスＩｇＧ及び１ｍｇ／ｍｌのｐ　−ニトロフェニルホスフェートを基質として使用することにより、４０５ｎｍでフォトメトリーにより抗体力価を決定した。

で処理した大腸菌細胞中でβ−ガラクトシダーゼ活性を測６週齢雌Ｂａ１ｂ／ｃマウスをＩｆｆａ　Ｃｒｅｄｏから入手した。細胞性免疫応答を追跡するために、１０フコロニー形成単位（ＣＦＵ）のＢＣＧ株をマウスの尾の付は根に皮下（Ｓ　Ｃ）経路で接種した。免疫感作から１４日後にリンパ節細胞を採取し、増殖応答を調べた。マウスの対照群には食塩溶液中の不完全フロインドアジュバント（■Ｆ　Ａ、　）を投与した。抗体産生を追跡するために、１群のマウスにＢＣＧ株５×１０・ＣＦＵを静脈内（ｉｖ）経路で接種した。数匹のマウスには１０ ’　ＣＦＵを２１日間隔で３回静脈内にブースター接種した。免疫感作から２８日後及び各ブースターから１４日後に血清サンプルを採取し、抗体を滴定した。

１０’　ＣＦＵのＢＣＧを接種（ｉｖ）Ｌ、てから２力月後に牌臓から回収したＢＣＧのＣＦＵ数を決定することにより、種々のＢＣＧ株の安定性を分析した。

特異抗体の増殖応答免疫感作から１４日後に３匹のマウスから採取した鼠径リンパ（ＬＮ）節から細胞懸濁液を調製し、２ｍＭＬ−グルタミン、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、５Ｘ１０’Ｍ　２−メルカプトエタノール及び１０％ウシ胎児血清（Ｆ　ＣＳ）を含有するＲＰＭＩ　１６９０　（Ｇｉｂｃｏ）に再懸濁した。ＬＮ細胞を適切な抗原の存在下で９６穴平底培養プレート（Ｃｏｒｎｊｎｇ）に４Ｘ１０５細胞／穴の割合で培養した。使用した抗原の濃度は、ＡＰＨ３’　及びβ−ガラクトシダーゼ０，０１μｇ／ｍ！並びに精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）１０μｇ／ｍ！であった。非特異的陽性反応対照として、コンカナバリンＡ　（ＣｏｎＡ）を２．５μｇ／ｍｌの濃度で加えた。所定の細胞懸濁液は刺激せずにおいた。各試験は３回ずつ行った。培養物を３７℃で５日間インキュベートし、最後の２２時間は７％ＣＯ２を含有する湿潤空気雰囲気下、０，４μＣｉ／穴の三重水素化メチルチミジン（３ＨｄＴｈｄ　１ｍＣ１＝３７ＫＢ２　Ａｍｅｒｓｈａｍ）の存在下でインキュベートした。次に細胞をガラス繊維フィルター（＾ｕｔｏＩｌａｓｈ　２０００　Ｄ）’ｎａｔｃｈ）上で採取し、取り込まれた放射能を測定した。結果を（カウント毎分（ｃｐｍ）−バックグラウンド雑音）の関数として表した。３回の培養の平均の標準誤差を決定した。非刺激対照培養物のバックグラウンド雑音の値は１０’ｃｐｍ未満であった。

抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８モノクローナル抗体増殖に関与するＴ細胞のサブグループの比を決定するために、Ｔ細胞のサブグループに対するモノクローナル抗体を種々の濃度のＬＮ細胞培養物に加えた。Ｄｉａｌｙｎａｓ　Ｃ，Ｐ。

ら、１９８４．　Ｊ、ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｎｅ　３１．　ｐ　２４４５−２４５１に記載の方法に従ってＬ３Ｔ４　（ＣＤ４＋）（特異的抗マウスＣＤ４＋ラツトハイブリドーマＧＫＩ−５）及びＬＹＴ２（ＣＤ８＋）（特異的抗マウスＣＤ４＋ラツトハイブリドーマＨ３５１７−２）を作成した。要約すると、腹水からモノクローナル抗体を得るために、まず最初に１０６個のハイブリドーマに対応する細胞をヌードマウスに接種した。硫安沈殿により抗体を収集した。２８０ｎｍの光学密度によりタンパク質の量を試験した。

サイトカインの測定増殖試験の目的でＬＮ細胞培養物の上清中でインターフェロンγの合成を測定した。多重サンドイッチ原理（Ｇｅｎｚｙｍｅ）を使用する固相酵素免疫試験によりインターフェロンγのレベルを決定した。上清を希釈した（１７２〜１／１０）。標準インターフェロンγを希釈し、試験の直線間隔の内側の値（１２８〜８２００ｐｇ／ｍｌ）を得た。

λｇｔｌｌゲノムバンクを構築し、Ｍ、　ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＤ　Ｎ　Ａ　８１１強（ハイブリダイズするが、Ｍ、　ｐｈｌｅｉのＤＮＡとはハイブリダイズしない組換えファージを個々に取り出し、ファージ溶菌のストックを調製するために使用した（　１ｌａｎｉａｔｉｓら、上記文献）。これらの組換え体の１つを追加試験のために任意に選択した。そのゲノムは３．８ｋｂの挿入部を含む。制限酵素ＥｃｏＲ１及びＢａｍＨＩで消化することによりこのフラグメントからマイコバクテリウムＤＮＡを回収した。こうして４個のフラグメントを得、アガロースゲル上で分離した。フラグメントの１つである１、６ｋｂフラグメントをゲルから溶離し、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩにより消化したプラスミドｐＧＥＭ−２に連結した。大腸菌コンピテント細胞Ｄ　Ｈ５ａ　（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ　ＭＤ、米国）を製造業者の指示に従って連結混合物で形質転換した後、１００μｇ　／　ｍ　Ｉのアンピシリンを含有するＬＢ培地を含むプレートに加えた。ただ１つのコロニーを選択し、上述のＭａｎｉａｔｉｓらの文献により記載されている標準方法を使用することにより、十分な量の組換えプラスミドｐＡＭ３を調製するために使用した。

ｐＡＭ３を化学的プローブキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）で標識し、ドツトプロット試験でプローブとして使用した処、Ｎ、ｐａｒａ物はＭ、　ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ型の株、ウシ、ヒツジ及びヤギ起源の２３Ｍｐｔｂ単離物並びにクローン病ヒト患者の単離物ヲ含ンテイタ。プラスミドｐＡＭ３はＭ、ａｖｉｕａ　５ｅｒｏｖａｒ２及び３、Ｍ、　１ｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、　Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ株Ｈ３７Ｒｖ　。

Ｍ、ｂｏｖｉｓＳＭ、ｐｈｌｅｉＳＭ、ｓ＋ｓｅｇａ＋ａｔｉｓ又はＮ、　ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓとハイブリダイズしなかった。

配列解析７１６ｂｐｃ７）ＢａｍＨＩ／Ｐｓ　ｔ工Ｉフラグメントのヌクレオチド配列を図２に示す。配列を解析して転写及び翻訳の開始のコンセンサスシグナルを調べた処、−３５（８３〜８８位）の潜在的領域、−１０（１０６〜１１１位）の領域及び１４７〜１５２位のシャインーダルガルノ（ＳＤ）の配列が判明した。ＳＤ配列には１６０位の開始コドンＡＴＧから長いオーブンリーディングフレーム（ＯＲＦ）ＯＲＦ２が続く。フラグメントのヌクレオチド配列解析の結果、挿入エレメントＩ　Ｓ　９００　Ｍ、ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓとの相同が判明した。１５３〜７１６セグメントは１３９００（Ｇｒｅｅｎら（１９８９）　Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓ、Ｒｅｓ、　１７：９０６３−９０７３）の配列１４５１〜８８８に一致する。０ＲＦ２はこのエレメントのｏｒｆｌ１９７の潜在的トランスボザーゼの転写と逆方向である。セグメント１〜１５２はｌ５９００の配列の外側にある。

ｏｒｆ２はデータベース中に含まれる配列に比較するならば他の配列と類似性がない。ｌ５９００をＭｐｔｂの種々の単離物のサザンプロット試験のためのゲノムプローブとして使用すると、単離物の起源とは無関係にほぼ同一の多重バンド図式が得られる（　ＭｃＦａｄｄｅｎら（１９８７）Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃに組み込まれることを示唆している。ｌ５９００の終点に隣接する制限された数の配列が報告されていることから、ｌ５９００は保存されたヌクレオチド配列を含むと思われる（　Ｇｒｅｅｎら（１９８９）　Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、１７：　９０６３−９０７３）。

図２に示すシャインーダルガルノ（Ｓ　Ｄ）の配列ＡＡＧＧＡＧはエレメントＩｓに隣接している。このＳＤ配列の相補的逆配列（ＣＴＣＣＴＴ）は、Ｍｐｔｂのクローン病の患者からのヒト単離物のゲノムバンクに由来するクローンｐＭＢ２２に含まれるＩ　５９００について報告されているフランキング配列に一致する。

０ＲＦ２の分析及び発現転写及び翻訳レベルにおける０ＲＦ２の発現を調べるために、プラスミドＩ）　ＮＭ　４８２　（Ｍｉｎｔｏｎら（１９８４）　Ｇｅｎｅ　３１：　２６９−２７３）の複数のクローニング部位（ＭＣ８）を含むフラグメントのＢａｍＨＩ及びＰｓｔ１部位間に、ｐＡＭ３の７１６ｂｐのＢａｍＨＩ／Ｐｓｔ１７ラグメントをクローニングした。ＭＣＳは、最初の８個の末端アミノ酸と転写及び翻訳開始シグナルを欠失するβ−ガラクトシダーゼの截頭遺伝子（ｌａｃＺ）に隣接する。適切な調節シグナル及び下流のコーディング配列を含む適正に整列されたセグメントを導入することにより、表現型ＬａｃＺ＋を与えるハイブリッド遺伝子を形成することができる。ｏｒｆ２は上述のように構築される遺伝子１ａｃＺに対して同相であり、翻訳産物はｏｒｆ２の１８５アミノ酸を含む融合タンパク質ｏｒｆ２−β−ガラクトシダーゼとして発現され得ると予想される。一方、大腸菌ＭＣ１０６１を形質転換しても、Ｌａｃ”により形質転換されたコロニーは産生されなかった。マイコバクテリウム系における融合遺伝子ｏｒｆ２−１ａｃＺの発現を検討した。その結果、融合遺伝子を含む３．８ｋｂ　Ｓｍａｌ／Ｄｒａｌフラグメントはマイコバクテリウムと大腸菌の間のシャトルプラスミドであるプラスミドｐＲＲ３のＳｅａ　１部位に自由な末端を有するフラグメントとして連結され、ｐＡＭ３２０を生成していた。エレクトロポレーションによりＭ、　ｓｍｅｇｍａｔｉｓをこのプラスミドで形質転換した後にカナマイシン及びＸ− ｇａｌの存在下で培養した処、３日以内に青色のコロニーが現れた。ＢＣＧをこのプラスミドで形質転換するために同様の実験を行った処、はぼ２１日以内に青色のコロニーが得られた。こうしてｏｒｆ２をβ−ガラクトシダーゼとの融合タンパク質として発現させることができた。

ｏｒｆ２の発現を定量するために、ｐ　ＡＭ３２０又はｐＲＲ３で形質転換したＭ、ｓｍｅｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ及び大腸菌においてβ−ガラクトシダーゼの活性レベルを測定した。

結果を表■に示す。融合遺伝子ｏｒｆ２−］ａｃＺを生息させるｐＡＭ３２０で形質転換したＭ、ｓｍｅｇｍａ　ｔ　ｉたＭ、ｓｍｅ　ｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ株では活性は全（検出されなかった。ｐＡＭ３２０で形質転換した大腸菌株では低活性レベル（５／７単位）しか検出されなかった。これらの結果から明らかなように、融合物ｏｒｆ２−１ａｃＺは大腸菌では発現されず、ｏｒｆ２はマイコバクテリウムで特異的に発現されると予想される。

転写分析ｐＡＭ３２０の内部における融合遺伝子ｏｒｆ２−１ａｃＺの転写開始部位をヌクレアーゼＳ１による高分解マツピングにより決定した。実験の結果、配列の転写開始部位は１１９位のｏｒｆ２の上流に位置することが判明した（図４）。第２の開始部位はマイコバクテリウム配列の外側に存在する。これには２つの理由が考えられる。まず第１には、ＲＮＡの調製中に共沈した少量のシャトルプラスミドとプローブとのハイブリダイゼーションに起因すると考えられ、あるいはｐＲＲ３のアンピシリン耐性遺伝子を介する転写結果の読み取りに起因すると考えられる。これらの結果及びβ−ガラクトシダーゼとの融合タンパク質の発現から明らかなように、エレメントＩ　８９００に隣接するプロモーターエレメントＰａｎはｏｒｆ２の発現を制御することが可能である。こうして、隣接する染色体プロモーターにより挿入配列の内側に位置する遺伝子の発現を誘導できることが初めて立証された。

融合オペロンｏｒｆ２−］ａｃＺの構築プロモーターｐａｎの活性をより明確に特徴付けるために、ｏｒｆ２を欠失させ、遺伝子］ａｃＺとの融合オペロンを構築した（図７．８及び９）。

ｐＷＲ３２及びｐＷＲ３３は２方向に融合物ｐ　ａ　ｎ、　−ＬａｃＺを含むｐＲＲ３の組換え体である（図９）。大腸菌又はＭ、　ｓｒｎｅｇａａｔｉｓをこれらの構築物で形質転換した後、カナマイシン及びＸ−ｇａｌの存在下で培養した処、２種類の細菌で青色のコロニーが得られた。従って、ｐａｎはＬａｃ−Ｚとの融合オペロン中に存在するときには大腸菌中で機能的であるが、ｏｒｆ２との融合遺伝子中に存在するときには非機能的である。

ｐＷＲ３２はｐＡＭ３２０と同一レベルのβ−ガラクトシダーゼ活性を誘発した。一方、ｐＷＲ３３による活性レベルは大腸菌におけるレベルの１０倍であった。これは、融合遺伝子ｐＡＭ−１ａｃＺの上流のプロモーターの構成活性に起因すると思われる。

特異的細胞性免疫応答固有の調節領域の制御下でホスホトランスフェラーゼＡＰ　Ｈ３’　を発現し且つｐａｎの制御下でＩａｃＺを発現するプラスミドｐ　ＡＭ３２０を生息させるＢＣＧ組換え体を皮下経路でＢａ１ｂ／ｃマウスに接種した。免疫感作から１４日後にＬＮ細胞の増殖応答を分析した。種々の抗原によるｉｎ　ｖｉｔｒｏ刺激に対して特異的応答が観察された（図４）。］　ａｃＺ及びＡＰＨ３°を発現するｒ−ＢＣＧで免疫感作したマウスのＬＮ細胞のみがβ−ガラクトシダーゼ及びアミングリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ３°）によるｉｎ　ｖｉｔｒｏ刺激に応答して増殖した。Ｐ　Ｐ　Ｄ　（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ　：タンパク質精製誘導体）の抽出物に応答する細胞増殖は、部組換えＢＣＧ株で免疫感作したマウスのＬＮ細胞の場合と同様であった。免疫感作しなかった動物のＬＮ細胞はＣｏｎＡのみに応答して増殖した。この非特異的増殖は全動物群で同一程度の大きさであった。

ＣＤｄ＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞は抗ＣＤｄ＋及び抗ＣＤｓ十モノクローナル抗体による増殖の代替阻害により上記増Ｎ細胞培養物に抗ＣＤ４抗体を添加後ではβ− ガラクトシダーゼに対する特異的応答の７０％の阻害が観察された。

同様の実験で培養物に抗ＣＤ８抗体を添加後では３０％の阻害が観察された。これらの結果から明らかなように、ＣＤ４＋Ｔ細胞のサブグループのほうが強い応答が得られる。

ＣＤＪ＋Ｔ細胞の異なる２つの集団はマウスにおける免疫応答の調節に寄与する。ＣＤ４＋Ｔ細胞のサブグループＴＨ１はインターロイキン−２（ＩＬ２）及びインターフェロンγを産生し、マクロファージを優先的に活性化し、病原物質の細胞内成長を遮断又は阻害する。ＣＤＪ＋Ｔ細胞の別のサブグループＴＨ２はＩＬ４、）Ｌ５を含む他のリンフ才力インを産生じ、体液性応答の誘導に関与する。特異抗原で刺激したＬＮ細胞の培養物の上清中にインターフェロンγの顕著な産生が検出された（図６）。これらの値はＰＰＤ又はｃｏｎＡによる刺激後に得られる値よりも僅かに低かった。しかしながら、標準曲線の最低値が１ｏｏｐｇ／ｍｌであったことを考慮すると、産生値はなお顕著である。部組換えＢＣＧにより免疫感作した動物から単離したＬＮ細胞によるインターフェロンγの産生は、ＰＰＤ又はＣｏｎＡによるｊｎ　ｖｉｔｒｏ刺激後のみに観察された。

抗体応答２種のＢＣＧ株を静脈内接種から４週間後及びｉｖダブ−ターの各々から１４日後に採血した。β−ガラクトシダーゼに対する抗体は、β−ガラクトシダーゼを発現するｒ−ＢＣＧで免疫感作した動物血清からＥＬ　Ｉ　ＳＡ試験により検出された（図３）。各ブースター後に抗体応答の増加が観察された。結果を図１１に示す。第１回、次いで第２回目のブースター後に抗体率の著しい増加が観察された。

第３回目のブースターでは抗体率の増加は生じなかった。

β−ガラクトシダーゼに対する抗体は部組換えＢＣＧで免疫感作した動物の血清中で検出された。この応答はβ−ガラクトシダーゼを発現するｒ−ＢＣＧにより誘発される応答よりも著しく低（、ＢＣＧによるポリクローナル活性化に起因すると予想される。免疫感作しないマウスでは抗体は検出されなかワた。これらの結果から明らかなように、体液性応答はｐａｎの制御下で外来（異種）抗原を発現するｒ−ＢＣＧにより誘起され得る。β−ガラクトシダーゼをモデル系として選択したが、ワクチン接種の目的で有用な任意の型の抗原を使用することができる。

種々のｒ−ＢＣＧ株のｉｎ　ｖｉｖｏ安定性ｉｖ接種から２力月後に牌臓ホモジネートからＢＣＧ桿菌を回収した。表■は、この試験で使用した種々のｒ−ＢＣＧクローンが部組換えＢＣＧ株に類似の挙動を有することを示す。カナマイシン及びＸ−ｇａｌを含有する培地にｒ−ＢＣＧ株をプレート後、青色の２．０ＸＩＯ’　ＣＦＵが得られたが、これに対してカナマイシンによる選択の不在下で培地中で培養後は７．４Ｘ１０’　ＣＦＵであった。

従って、２力月間ｉｎ　ｖｉｖｏ増殖後にｒ−ＢＣＧ集団の約２７％が安定である。この割合は、長期間免疫原刺激に必要な標的器官のマクロファージにおいてＢＣＧを増殖及び維持できる値である。

結論以上の結果から明らかなように、固有の制御領域下でＡＰＩ３′をコードし且つｐａｎの制御下でβ−ガラクトシダーゼをコードするプラスミドを生息させるｒ −ＢＣＧ株は、マウスにおいてこれらの抗原の特異的な細胞性及び体液性免疫応答を誘起し得る。これらのポリペプチド抗原はｒ−ＢＣＧの細胞質中に位置付けられる。ＢＣＧについて上述したように、ｒ−ＢＣＧの誘導体はマクロファージの内側で増殖し、ＭＨＣの分子と会合してβ−ガラクトシダーゼのペプチドを提供すると予想・される。この結果、増殖することにより応答するＴリンパ球による認識が生じる。

ＬＮ細胞はｉｎ　ｖｆｔｒｏ刺激に応答して強い増殖を示した。ＣＤｄ＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞はＣＤ４＋細胞７０％及びＣＤＳ＋細胞３０％の百分率で増殖応答に関与することが判明した。インターフェロンγの産生は細胞サブグループＴＨＩの有効な役割を示唆している。これらの細胞は細胞内病原物質の排除に必要な７マクロフアージの活性化に関与する。抗体の検出力価は、体液性応答の誘発に役割を果たすＴ細胞サブグループＴＨ２の協同も示唆している。

マウスで２力月ｉｎ　ｖｉｔｒｏ増殖後に主要な転位なしにこれらのｒ−ＢＣＧ株の２７％が回収されるという事実から明らかなように、これらの株は記憶免疫応答を誘発し得る。ファージ又はプラスミドにより媒介される組み込みにより、更に十分な安定性を有しており且つ連続刺激により長期間存続する免疫応答を誘発するｒ−ＢＣＧ株を構築することができる。

嚢」−細菌株、ファージ及びブラ不圭−１細菌　説明　供給先又は参考文献細菌株　マシー大学バストウール研究所形質転換用レセプター株Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＩＩ５α　大腸菌で複製するプラスミドによる　Ｍａｎｉａｔｉｓら形質転換用レセプター株ｐＵ１４ｇ　高コピー数ベクター　ＭｕｒｒａＹらｐＧＥＭ−２高コピー数ベクター　Ｐｒｏｍｅｇａの市販品ｐＮＭ４８２　プロモーター検出用ベクター　ＭｉｎｔｏｎらｐＲＲ３大腸菌−マイコバクテリウム　ＲａｎｅｓらシャトルベクターｐＡＭ−３粗■の１．　ｅｋｂのゆＲＩ／馬湿）ＩＩ　明細書に記載フラグメントを含む組換体ｐＧＥＭ−２ｐＡＭ３１０　ｐ＾ト３の７１６ｋｂのＢａｍ１ｌＩ／ＰｓｔＩ　明細書に記載フラグメントを含む組換体ｐＮＭ４８２ｐＡＭ３２０　ｐＡＭ３１０の３．８ｋｂのＤｒａＩ／５ＩｌａＩ　明細書ニ記載フラグメントを含む組換体ｐＲＲ３ｐＡＭ３１１　ｐＡＭ−３の７１６ｂｐのＢａｍ１ｌＩ／ＰｓｔＩ　明細書に記載フラグメントを含む組換体ｐＵＣ＋　ｓｐＡＭ３１２　Ｍｐｔｇの１．６ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ　明細書に記載フラグメントを含む組換体ｐＵＣ＋５ｐＳＬ　１．１８０　ｐＵｃ、８の誘導体　ＰｈａｒｍａｃｉａｐＷｌ？３０　Ｍユ■／焦税Ｉ（１６８ｂｐ）のＰＣＲによる　明細書に記載消化産物を含む組換体ｐｓｔ、　１１８０ｐＴｃＴ９５９　λのプロモーターＰＬを含む　ＴｒａｎｓｇｅｎｅプラスミドｐＩｐＪＮＩ　ｐＴＧ　９５９のＸｈｏＩ／ＢａｗＨＩ　明細書に記載フラグメントを含む組換体ｐＮＭ４８２ｐＷＲ３１ｐＷＲ３０の４巴ＲＩ／町ＩＩフラグメント　明細書に記載（１５９ｂｐ）を含む組換体ｐＩｐＪＮｐＷＲ３２＋ｐＷＲ３３２方向にｐＷＲ３１のＥｃｏＲＩ／Ｄｒａ工　明細書に記載フラグメント（３，８ｋｂ）を含む組換体ｐＲＲ３煮Ｕ　ｒ−ＢＣＧ（＋　ｐＡＭ３２０）のｉｎ　ｖｉｖ＋）安定性］、、０’ＣＦＵのＫａｎ−カナマイシンをＩＶ接種から２力月後のマウス骨髄のホモジネートから回収したＢＣＧ　ＣＦυ点旦　組換え宿主生物のβ−ガラクトシダーゼ活性（単位１ｍｇ本）＊　６００ｎｒａの光学密度がら推定される乾燥重量（１＋ｏｇ［乾燥重量・Ｊ／ｌ１１１＝　６０Ｏｒ＋ｍの光学密度３．７単位）Ｎ、　Ｄ、　＝検出せず。

０ＲＦ２に会合したプロモーターＰＡＮの使用例；ウィルス抗原の発現及び該抗原を発現するＢＣＧによる特異的免疫応答の誘発オーブンリーディングフレーム０ＲＦ２に会合したプロモーターＰＡＮを使用してＢＣＧ中で複数のウィルス抗原を発現させた。これらのウィルス抗原を発現するＢＣＧ株をマウスに接種後にこれらのウィルス抗原に対する免疫応答を観察した。

これらの試験１゛ではＳＩＶ株Ｍａｃ２５１及びＨＩＶのウィルス抗原の発現を試験した。ＳＩＶ又はＨＩＶの配列は、文献”Ｉｌｕｍａｎ　ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ　ａｎｄ　ＡＩＤＳ　１９９１”（ａ　ｃｏｍｐｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ａｎｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ、Ｍｙｅｒｓ　Ｇ、ら編、Ｔｈｅｏｒｉｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｐｈｙｓｆｃｓ刊、Ｇｒｏｕｐ　Ｔ−１０，Ｍａｉｌ　５ｔｏｐ　Ｋ７１０．　Ｌｏｓ　Ａｌａｍｏｓ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｌｏｓ　Ａｌａｍｏｓ、　Ｎｅｗ　Ｍｅｘｉｃｏ　８７５４５　米国）を参考にした。

１）ＳＩＶのｎｅｆ遺伝子ＳＩＶのｎｅｆ遺伝子の全体を０ＲＦ２のアニ謬」工１部位に挿入した。このために、ＳＩＶのｎｅｆ−遺伝子を含むフラグメントをＰＣＲによりｉｎ　ｖｊｔｒｏ合成した。２種のオリゴヌクレオチドＳＮｉ　（５’　ＣＣＣＣＴＧＣＡＧＡＧＡＴＣＴＡＴＧＧＧＴＧＧＡＧＣＴＡＴＴ３’　）及びＳＮ２　（５’　ＡＡＡＡＡＧＣＴＴＴＴＡＧＣＣＴＴＣＴＴＣＴＡ、ＡＣＴＴ３’　）がＡＰＰＬＩＧＥＮＥ社により合成されている。これらのオリゴヌクレオチドを使用してＴＲ酵素により切断し、プラスミドｂ　／　ｐ　Ａ　Ｍ　７１２にクローニングした（図１２）。ＳＩＶのｎｅｆを担持する組換えプラスミドをｐＳＮ２４と命名した。このプラスミドから末端をフレノウ酵素により充填し、得られたフラグメントをｐＲＲ３の５ｃａＩ部位に２方向にクローニングした。

得られたプラスミドをｐＳＮ２５及びｐＳＮ２６と命名した。

プラスミドｐＳＮ２５及びｐＳＮ２６をエレクトロボレ■に感染したサル血清を使用することにより、融合ポリペプチド０ＲＦ２−Ｎｅｆをウェスタンプロットによりラベルした（図１．３）、０ＲＦ２−Ｎｅ　ｆ　（Ｓ　ＩＶ）を発現するＢＣＧをマウスに接種後、ペプチドＮｅｆ（ＳＩＶ）による刺激後のリンパ節細胞の増殖試験を使用することにより、Ｎｅｆ（ＳＩＶ）に対する細胞型免疫応答を観察した。

ペプチドはＡＮＲＳに由来する。これらのペプチドはペプチド１〜１５．１６〜３０．４０〜６０及び２２１〜２３５であり、番号は完全Ｎｅｆタンパク質上のＮ末端アミノ酸及びＣ末端アミノ酸の位置に対応する。種々のペプチドで得た応答の大きさを図１４に示す。ＨＩＶＩのＮｅｆについて上述したように、Ｔ　（ＣＤ４）及びＴ　（ＣＤ８）リンパ球が関与していると思われる。

２）ＨＩＶＩ　ＭＮ株のｅｎｖ遺伝子このために、ＳＩＶの几互工のクローニングと同様にクローニングを行った。タンパク質ＧＰ１２０のアミノ酸２４２〜３３５のポリペプチドをコードする遺伝子フラグメントをＰＣＲによりｉｎ　ｖｉｔｒｏ合成した。２種のオリゴヌクレオチドＪ　ＥＮＶＭＮ３　：　５’　ＣＧＡＣＴＧＴＡＡＡＡＡＴＧＴＡＣＴＧＡＣＧＴＣＣＣＣＣ３’及びＪＥＮＶＭＮ４　：　５’　ＴＡＡΔＡＧＣＴＴＴＴＡＣＴＣＧＧＴＧＴＣＧＴＴＣＧＴＧＴＣ３’　がＡＰＰＬＩＧＥＮＥにより合成されている。これらのオリゴヌクレオチドを使用してＴｒａｎｓｇｅｎｅにより構築されたプラスミドｐＴＧ５１６７からｅｎｖ遺伝子を増幅した（図１５）。増幅したフラグメントは制限部位Ｐｓｔｌ及びＨｉ　ｎ　ｄ　ｍを有する。

フラグメントを対応する制限酵素により切断し、尺１去Ｉ及びＨｉｎｄＩ［Ｉ部位の間でプラスミドｂ　／　ｐ　Ａ　Ｍ　７１２にクローニングした（図１６）。得られたプラスミドをｐＬＡｌｌと命名した。該プラスミドは０ＲＦ２のＮ末端部分に対応する５５４ｂｐとｅｎｖ遺伝子のＮ末端部分に対応する６８６ｂｐを含む融合遺伝子０ＲＦ２−ｅｎｖを含む。融合物ＰＡＮ−ＯＲＦ２−ｅｎｖを酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉ　ｎ　ｄ　ｍによる二重切断によりｐＬＡｌｌから切り出した。フラグメントの両端をフレノウポリメラーゼにより充填した。得られたフラグメントをｐＲＲ３のＳｃａ　Ｉ部位にクローニングし、インサートの方向に沿ってプラスミドｐＬＡ１２及びｐＬＡ１３を生成した。プラスミドｐＬＡ１２及びｐＬＡ１３をエレクトロポレーションによりＢのモノクローナル抗体５Ｃ −Ｄ　（Ｋ２４−１）を使用することによりウェスタンプロットにより融合物０ＲＦ２−Ｅｎｖの発現を検出した。図１７に示すように、予想分子量（４５，５ｋＤａ）の融合ポリペプチドの発現が観察された。

融合物０ＲＦ２−Ｅｎｖを発現するＢＣＧをマウスに接種した。接種から１５日後、タンパク質ＧＰ１２０による刺激後にリンパ節細胞のｉｎ　ｖｊｔｒｏ増殖応答が観察された（図１８）。この場合もＴ　（ＣＤ４）及びＴ　（ＣＤ８）リンパ球が関与していると思われる。他のマウスにはＩＶ経路で接種し、２８日後にブースターを行った。注射後の種々の時点で採血した。ブースターから１５日後にタンパク質ＧＰ１２０又はＢＣＧにより発現されるＥｎｖの部分に対応するペプチドを使用することにより、ＥＬＩＳＡ試験により高い抗体率が検出された（図１９）。

３）ＨＩＶＩ　ＬＡＩ株のｇａｇ遺伝子上記と同様の構築物を使用することにより、ウィルスＨＩＶＩ　ＬＡＩのタンパク質Ｐ２４（最初の２１７アミノドＥＭＬ３　：　５’　ＧＧＧＣＧＣＧＣＴＣＴＣＧＡＧＴＡＴＧＡＧＡＡＣＴＴＴＡＡＡＴＧＣＡ３’及びＥＭＬ５　：　５’　ＧＴＴＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＣＡＡＡＡＣＴＣＴＴＧＣ３゛並びに’ｒｒａｎｓｇａｎｅにより構築されたプラスミドｐＴＧ２１０３　（図２０）を鋳型として使用することにメントを酵素Ｘｈｏ　Ｉ及びＥｃｏＲＩにより切断し、プラ合物ＯＲＦ２−Ｇａｇを得、プラスミドｐＬＡ２１を生成した（図２１）。このプラスミドを酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで切断することにより、融合物ＯＲＦ２−Ｇａｇを担持するＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントをｐＬＡ２１から切り出した。フラグメントの両端をクレノウボリメラーゼにより充填し、得られたフラグメントをｐＲＲ３のＳｃａ　１部位にクローニングし、プラスミドｐＬＡ２２及びｐＬＡ２３を生成した。これらのプラスミドをエレクより４６．５ｋＤａのポリペプチドとして発現される（図２２）。

ｐＡＭ３１０　ｐＲＲ３ＡＭ３２０図１（ｂ）図１（ｃ）図１（ｄ）図１（ｅ）図１（ｆ）ＣＡＴ　ＣＣ：　ＧＴＧ　ＡＣλ　ＡＧＧ　ＣＣＧ　ＡＡＧ　ＡＧＣＣＣＧ　ＣＧＡ　ＣＣＧ　ＴＧＣＧＧＴ　ＣＧＴ　ＣＧＡ　ＣＣＡ１０１　（−１０１＋１ＣＡＧ　ＣＣＧ　ＣＣＡ　ＴＡＣ入ＣＴ　ＴＣＧ　ＣＴＴ　ＣＡＴ　ＧＣＣＣＴＴ　ＡｃＧ　ＧＧＧ　ＧＧＣＧＧＣＣＡＡ　ＣＣ０図４図５（ａ）ＢＣｏ　１１７３Ｐ２ｒ−ＢＣＧ　◆　ρＡＭ　３２０図６（ｂ）図８ｐＴＧ９５９　ｐＮＭ４８２８．６ｋｂＷＲ３１８，５ｋｂ　図９　（ａ）図９（ｂ）図９（ｃ）図９（ｆ）ＧＡＴ　ＣＣＣＧＴＧ　ＡＣＡ　ＡＧＧ　ＣＣＧ　ＡＡＧ　ＡＧＣＣＣＧ　ＣＧＡ　ＣＣＧ　ＴＧＣＧＧＴ　ＣＧＴ　ＣＧＡＣＧＡ　ＣＣＧ　ＡＣＴ　ＧＴＧ　ＡＧＣＡＧＡ　ＣＣＣＣＣＴ　ＧＧＴ　ＧＡＡ　ＧＧＧ　ＴＧＡ　ＡＴＣＧＡＣＡＧＧｌｌｃ　１３０ＴｋＣＡＣＡ　ＣＡＧ　ＣＣＧ　ＣＣＡ　ＴＡＣＡＣＴ　ＴＣＧ　ＣＴＴ　ＣＡＴ　ＧＣＣＣＡＴ　ＡＣＧ　ＧＧＧ　ＧＧＣＧＧＣＣＡＡ　ＣＣＣＡＧＡ　ＡＧＧ　ＡＧＡ　丁ＴＣＴＣＡ　ＡＴＧ　ＡＣＧ　ＴＴＧ　ＴＣＡ　ＡＧＣＣＧＣＣＧＣＭｅｔ　Ｔｈｒ　Ｌ＠ｕ　５ｅｒＳｅｒ　ｋｒｑ　ＡｒｇＧＧＴ　ＡＧＴ　ＧＧＴ　ＴＧＣＧＧＧ　ＧＴＧ　ＧＴＡ　ＧＡＣＡＧＣＧＴＧ　ＧＴＣＧＣＧ　ＣＡＧ　ＣＡＴ　ＧＧＣＧｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｓｅｔ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｇｌｒ＋　Ｈｉｓ　ＧｌｙＣＣＡ　ＣＡＧ　ＧＡＣＣＴＴ　ＧＡＧ　ＧＣＧ　ＧＣＧ　ＧＣＧ　ＧＧＣＣＡＧ　ＧＧＣＧＡＧ　ＧＡＣＧＧＣ７丁ＧＰｒｏ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　入１ａ　Ａｌａ　入１ａ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　ＬｅｕＧＧＴ　ＧＴＧ　ＧＣＧ　ＴＴＴ　ＴＣＣＴＴＣＧＧＴ　ＧＣＧ　ＴＴＴ　丁ＣＧ　ＧＴＣＧＴＡ　ＧＴＡ　ＣＧＴ　ＧＣＧＧｌｙ　Ｖａｌ　入１ａ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｓａｒ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　八１ａ図１０　（ａ）図１０　（ｂ）ＧＴＡ　ＡＣＴ　ＡＣＣＣＧＣＧＧＣＧＴＧ　ＡＴＧ　ＧＡＣＣＧＴ　ＧＣＧ　ＣＣＣＧＧＧ　ＭＴ　ＡＴＡ　ＭＧＶａｌ釦ｒ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｍａｔ、Ａｓｐ　Ａｘ：ｑ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　工１ｅ　Ｌｙｓｌ、１３０　１１５０　’　１１７０ＣＡＧ　ＣＣＧ　ＣＴＧ　ＣＣＣＧＧＣＡＧＣＧＡＴＧＡＧ　ＣＭ　ＧＧＣＧＡＴ　ＣＡＧ　ＣＡＡ　ＣＧＣＧＧＣＧｉｎ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｇ工ｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　ＧｌｙＧＣＣＧＣＣＧＧＣＧＴＴ　ＧＡＧ　ＧＴＣＧＡＴ　ＣＧＣＣＣＡ　ＣＧＴ　ＧＡＣＣＴＣＧＣＣＴＣＣＡＴＣＡｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｌａｕ　Ａｌａ　Ｓｅｒ工１ｅＧＧＣＣＡｊｔ　ＣＧＴ　ＣＧＴ　ＣＡＣＣＧＣＣＧＣＡＡＡ　ＴＣＡ　ＡＣＴ　ＣＣＡ　ＧＣＡ　ＧＣＧ　ＣＧＧ　ＣＣＴＧｌｙ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｐｒ。

ＣＧＴ　ＣＧＴ　ＴＧＧ　ＣＣＡ　ＣＣＣＧＣＴ　ＧＣＧ　ＡＧＡ　ＧＣＡ　ＡＴＣＧＣＴ　ＧＣＧ　ＣＧＴ　ＣＧＴ　ＣＣＴＡｒｇ　Ａｒｇ　丁ｒｐ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｒｇ　人工ａ　工ｌｅ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｒｇ　入ｒｇ　ＡｒｇＴＡＡ　ＴＡＡ　ＣＣＡ　ＴＧＣＡＧＴ　ＭＴ　ＧＧＴ　ＣＧＧ　ＣＣＴ　ＴＡＣＣＧＧ　ＣＧＴ　ＣＣＡ　ＣＧＣＣＣＧＥＲＡＴＣＣＭ　ＴＣＧ　ＣＡＴ　ＣＴＣＴＣＡ　ＡＴＴ　ＡＧＣＧＧＴ　ＣＧＡ　ＧＴＣＧＴＣＧＣＧ　ＧＧＡ　ＣＧＣＧＣＣＣＣＧ　ＡＡＣＡ、ＣＣＣＴＴ　ＣＡＡ　ＧＡＡ　ＡＧＧ　ＴＡＡ　ＧＧＡ　ＡＴＴ図１０　ＣＣ）ＩＪＳＮＩ及びＳＮ２を使用するｎｅ　ｆ　７ラグＪ：／）ＯＰＣＲ合成　図１２　”ｐＴＣ３１４８連結ｓＮ　２４Ｘｂａｌ−Ｈ４ｎｄｌ１１　’ へへ ← へ図１３ペプチド図１５図１６　（ａ）図１６　（ｂ）図１６　（ｃ）図１６　（ｄ）図１６　（ｅ）図１６　（ｆ）、。、ｌ　１　２３４５６４６−　・　１１し　、　−ロｌＦ２−１３図エフ図１８図１９図２０ｐＬＡ２１　ｐＲＲ３図２１　（ａ）図２１　（ｂ）図２１　（ｃ）図２１　（ｄ）図２１　（ｅ）図２１　（ｆ）図２２ ρＣＴ／ＥＰ　９２１０２４３１フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，、６識別記号　庁内整理番号ＣＩ　２　Ｒ１：１９）（７２）発明者　ジクケル、ブリジットフランス国、７５０１４・パリ、リュ・ダゲール・８Ｉ

Claims

【特許請求の範囲】１．所与のヌクレオチド連鎖を細胞宿主中で発現させることが可能なヌクレオチド配列であって、ａ）以下の配列：【配列があります】又は該配列の１部分であって、該部分の制御下におかれた核酸の発現に関与し得る任意部分、ｂ）配列ａ）の相補的配列とハイプリダイズする配列から選択される配列１を含むことを特徴とするヌクレオチド配列。２．ａ）下記ヌクレオチド配列：【配列があります】又は該配列の１部分であって、特に転写開始部位（＋１位）と、該部分により形質転換される所定の細胞宿主のポリメラーゼＲＮＡの認識及び固定に必要であり、特に転写開始部位に対して−１０位に配列［ＴＡＣＡＣＴ］を含み且つ転写開始部位に対して−３５位に配列［ＴＣＧＡＣＡ］を含むエレメントとを含む任意部分、ｂ）配列ａ）の相補的配列とハイプリダイズする配列から選択される配列ＩＩを含むことを特徴とする請求項１に記載のヌクレオチド配列。３．ａ）下記ヌクレオチド配列：【配列があります】ｂ）配列ａ）の相補的配列とハイブリダイズする配列、ｃ）核酸の転写活性に関与するこの配列の任意部分から選択される配列ＩＩＩを含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の、所与のヌクレオチド連鎖を細胞宿主中で発現させることが可能なヌクレオチド配列。４．少なくとも転写開始部位に対して＋２〜＋４１位に含まれる配列が、請求項３に記載の配列ＩＩＩの下流に天然に存在する配列に対して外来性の配列により全部又は一部を置換されており、前記外来配列がシャイン−ダルガルノ配列を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載のヌクレオチド配列。５．請求項１から４のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列と、このプロモーターの制御下に所定の細胞宿主中でクローニング及び／又は発現を得ることが所望される少なくとも１種の核酸配列を含むことを特徴とする組換えヌクレオチド配列。６．請求項１から４のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列の制御下におかれた発現させるべき少なくとも１種の核酸配列が、免疫原性又は免疫原性にされ得るペプチド又はポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項５に記載の組換え配列。７．発現させるべき核酸配列が、レトロウイルスＨＩＶのペプチド又はポリペプチド、例えばエンベロープペプチドもしくはポリペプチド、又はＮｅｆ、ＨＩＶ −１もしくはＨＩＶ−２のペプチドもしくはポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項５又は６に記載の組換え配列。８．発現させるべき核酸配列が、マイコバクテリウムのコーディング配列、好ましくはビルレンスに関与するタンパク質又は保護能を有する抗原をコードする配列であることを特徴とする請求項５又は６に記載の組換え配列。９．発現させるべき核酸配列が１又は複数の所定のエピトープをコードすることを特徴とする請求項５から８のいずれか一項に記載の組換え配列。１０．請求項１から４のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列が発現させるべき核酸配列の上流で同相に配置されていることを特徴とする請求項５から９のいずれか一項に記載の組換えヌクレオチド配列。１１．請求項１から４のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列及び発現させるべき核酸配列が融合オベロンを構成することを特徴とする請求項５から１０のいずれか一項に記載の組換えヌクレオチド配列。１２．プロモーター及び発現させるべき核酸配列が融合遺伝子を構成することを特徴とする請求項５から１０のいずれか一項に記載の組換えヌクレオチド配列。１３．Ｍｐｔｂと異なる細胞宿主、特に放線菌、特にＭ．ｂｏｖｉｓ、例えばアビルレントＢＣＧ株、大腸菌のようなグラム陰性菌又は枯草菌のようなグラム陽性菌において核酸配列をクローニング及び／又は発現させるための請求項１から４のいずれか一項に記載の配列の使用。１４．組み込み又は複製に夫々必須でない部位に請求項１から４のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする組み込み型又は複製型のクローニング及び／又は発現用ベクター。１５．組み込み又は複製に夫々必須でない部位において請求項５から１２のいずれか一項に記載の組換えヌクレオチド配列により修飾されていることを特徴とする組み込み型又は複製型のクローニング及び／又は発現用ベクター。１６．請求項１から４のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列の下流にＯＲＦ２と呼称されるＭｐｔｂ配列の一部を更に含むことを特徴とする請求項１５に記載のベクター。１７．プラスミド、トランスポゾン又はファージであることを特徴とする請求項１４から１６のいずれか一項に記載のベクター。１８．Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌｅ　ｄｅｓ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓに１９９１年１０月２３日付けで寄託番号１−１１５７で寄託され、ベクターｐＵＣ１８にクローニングされた７１６ｂｐのフラグメント（ＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩ）を含む大腸菌株に含まれることを特徴とする請求項１７に記載のベクター。１９．請求項１から４のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列が、該配列により制御される核酸配列の上流に配置されていることを特徴とする請求項１４から１８のいずれか一項に記載のベクター。２０．請求項１から４のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列が、該配列により制御される核酸配列の下流に配置されていることを特徴とする請求項１４から１８のいずれか一項に記載のベクター。２１．発現マーカーを含むことを特徴とする請求項１４から２０のいずれか一項に記載のベクター。２２．ベクターに含まれる核酸配列を所与の細胞宿主中で発現させるのを調節するエレメントを更に含むことを特徴とする請求項１４から２１のいずれか一項に記載のベクタ２３．組換え配列又はベクターに含まれる核酸配列の発現を可能にするような条件下で請求項５から１２のいずれか一項に記載の組換えヌクレオチド配列又は請求項１４から２２のいずれか一項に記載のベクターにより形質転換されていることを特徴とする組換え細胞宿主。２４．前記宿主に含まれる核酸配列の発現産物の表面暴露、更には排出、分泌又は排泄が可能であることを特徴とする請求項２３に記載の組換え細胞宿主。２５．放線菌、好ましくはＢＣＧ株のようなＭ．ｂｏｖｉｓのアビルレント株であることを特徴とする請求項２３又は２４に記載の組換え細胞宿主。２６．グラム陰性菌、例えば大腸菌であることを特徴とする請求項２３又は２４に記載の組換え細胞宿主。２７．グラム陽性菌、例えば枯草菌又はストレプトミセスであることを特徴とする請求項２３又は２４に記載の組換え細胞宿主。２８．投与した動物又はヒト宿主における抗体の産生を誘超するため、又は好ましくは防御抗体の産生、及び／又は細胞性免疫応答、特にＴＬＣ応答の誘発に寄与するために十分な量の請求項２３又は２４に記載の組換え細胞宿主を含むことを特徴とする免疫原性組成物。