JPH07503605A - Δ６−デサチュラーゼによるガンマリノレン酸の製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Δ６−デサチニラーゼによるガンマリルン酸の製造リノール酸（１８：　ｚ）（ ＬＡ）は、酵素Δ６〜デサチコラーゼによつてガンマリルン酸（１８：　３）（ ＧＬＡ）に変換される。この酵素、またはこれをエンコード（ｅｎｅｏｄａ）す る核酸が、ＬＡ−生成細胞中に移入されると、ＧＬＡが生成される。本発明は、 そのΔ６−デサチニラーゼ遺伝子からなる核酸を提供する。

より詳しくは、Δ６−デサチ二ラーゼ遺伝子のプロモータ、コーディング領域、 及び停止領域からなる核酸である。さらに本発明は、異型の調節配列との機能的 複合（ｆｕｎｃＨｏｎａｌ　ｅｏｍｂｌ＋＋ａｔｉｏｎ）におけるへ〇−デサテ ーラーゼのコーディング領域からなる再配列構造を指向する。本発明の核酸と再 配列構造は、トランスジェニック（ｒｒａｎｕｅｎｌｃ）生体において有用であ る。

リノール酸（Ｃ＋ｓΔ９・１２）及びα−リルン酸（Ｃ１＠Δ１２．１ｓ）のよ うな不飽和脂肪酸は、を椎動物によって合成されない必須食物的要素である。な ぜならば、を椎動物細胞は脂肪酸の６９位に二重結合を導入することはできるが 、６９位の二重結合と脂肪酸随のメチル末端との間に付加的二重結合を導入する ことはできないからである。それらは他の生成物の前駆体であるから、リノール 酸及びα−リル／酸は必須脂肪酸であり、通常は植物源から得られる。リノール 酸は、は乳類によってγ−リルノ酸（ＧＬＡ、Ｃ＋＊Δ６＠・＋７）に変換され 、それは今度はアラ＋トノ＃（２０二４）ｌζ変換される。そのアラキト／酸は 、はとんどのプロスタグランジノの必須前駆体であるので非常にｆｆｉ要である 。

す／−ル酸の食物的供給品は、それが結果的にＧＬＡ及びアラキドン酸に変換さ れることによって、ＧＬＡとアラキト／酸に対する食物的要求を満足する。しか し、飽和脂肪の消費と、過コレステロール血症、アテローム性動脈硬化症、及び 冠状疾伯に対する感受性に関連した他の化学的疾病のようなａｉ上の危険との関 係が実証されている。一方、不飽和脂肪酸の消費は、血液コレステロール濃度の 減少及びアテローム性動脈硬化症の危険性の低下に連関している。食物的ＧＬＡ の治療上の利点は、ＧＬＡがアラキト／酸の前駆体となり、引き続きプロスタグ ランジン合成に貢献することによると考えられる。従って、リノール酸よりも不 飽和性の高いＧＬＡを消費することは、潜在的な健康上の利点を有している。

しかしながら、ＧＬＡは、商業的に生育した収穫植物には実際上存在しない。

リノール酸は、酵素Δ６−デサチニラーゼによりＧＬＡに変換される。Δ６−デ サチュラーゼは、約３５９のアミノ酸からなり、膜に結合したドメイン（ｄｏｍ ａｉｎ）と、脂肪酸の脱飽和の活性サイトを有している。この酵素が、ＧＬＡで はなくリノール酸を固有に生成する細胞中に移入されると、ＧＬＡが生成される 。本発明は、Δ６−デサチュラーゼをエンフードする遺伝子を供給することによ って、機能的なΔ６−デサチコラーゼを含み、ＧＬＡを生成することのできるト ランスジェニック生体を生み出すことを可能にする。多量のＧＬＡの生成を可能 にしすることに加えて、本発明は、ＧＬＡの新しい食物源を提供する。

本発明は、ｉ＊されたΔ６−デサチュラーゼ遺伝子を指向する。特に、Δ６−ゾ サチユラーゼプａモータ、コーディング領域、及び末端領域からなる単離された 遺伝子である。

さらに本発明は、Δ６−デサチニラーゼプａモータ、コーディング領域、及び末 端領域からなる発現ベクターを指向する。

また本発明は、異型調節領域、すなわちΔ６−デサチュラーゼ遺伝子から導かれ ない因子との機能的複合Ｉこおｌするムロ−デサチュラーゼコーディング領域か らなる発現ベクターを指向する。

本発明のベクターからなる細胞及び生体、及びそのような生体の子孫もまた、本 発明で提供される。

本発明は、さらに単離された細菌のΔ６−デサチュラーゼを提供し、さらに細菌 のΔ６−デサチコラーゼをエンコードする単離された核酸を指向する。さらに本 発明は、ガンマリルン酸（Ｇ　Ｌ　Ａ）含有量の増加した植物の製法を提供し、 そ“は・↑発明０単離さｔ′Ｌｔ″核酸で０植物細胞０形質転換と・そ０植物細 胞からのＧＬＡ含有置装増加した植物の再生からなる。

耐寒性（ｃｈ目１ｉｎｇ　Ｉｏｒｅｒａｎｔ）植物の製法もまた、本発明によっ て提供される。

図１は、／ネコンスチス（江貼」工工旺■）Δ６−デサチエラーゼ（パネルＡ） 及びΔ１２−デサチュラーゼ（パネルＢ）の演鐸されたアミノ酸配列のヒトロバ ／−・ブロワ１イル（ｂｙｄｒｏｐｍｔｂｙ　ｐｒｏｆｉｌｅ）を示す。推定の 膜スパンニノグ（ｓｐａｎｎｉ、、）領域は実線で示した。疎水性イノデフクス （ｉｎｄｅｘ）は、１９アミノ酸残基のウィンドサイズ（ｗｉｎｄｏｗ　５ｉｚ ｅ）で計算した（キテ（ｋｙｔａ）他、（１９０）、Ｊ、Ｍｏ１ｅｅ、旧ｏ１゜ 庄）０ 図２は、野生型（パネルＡ）及びトランスジェニック（パネルＢ）のアナバエＬ （組ルｕｎ）のガス液体クロマトグラフィープロファイルを与える。

図３は、コス之ド（ｃｏｓ＊ｌｄｌ　ｃ　Ｓ　ｙ　７５、Ｃ３Ｖ　ｌ　３及びｃ ｓｙ７の地図を、黴なり合い及びサブクローンとともに示した図である。ｃｓｙ ７５、ｃＳｙ７５−３．５及びｃＳｙ７の起源は、斜めの点線で示した。不活性 化された制限サイトは括弧で示した。

図４は、野生型（パネル＾）及びトラノスノエニブク（／イネル８）の夕／＜コ のガス液体クロマトグラフィープロファイルを与える。

本発明は、Δ６−デサテコラーゼをエンコードするＯｌｇされた核酸を提供する 。

Δ６−デサテ、ラーゼをエンコードするｔｔ１酸を同定するために、Ｇ　Ｉ−Ａ を生成する生体からＤＮＡを単離した。その生体は、例えば、動物細胞、ある種 の真菌（例えばｆｆｉ三と１（蝕Ωセ二江１３））、ある楢のｌ１ｌｌ’１ｍ（ 例えばンネフノスチス）あるいはある橿の植物（ボラージ（ｂｏｒａｚａ）、オ エノセラ（Ｏｅｎｏｔｂａｒａ）、クラノツ（ｅｕ丁ｒａｒ＋Ｌｓｌ）であって よい。ゲノム遺伝子の単離は、サムブルーフ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他、（＋９＋ １９Ｌ　分子クローニノグ：研究室マニュアル、コールド・スプリング・／へ− ）（−（ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈ暑ｒｂｏｒｌ、二ニーヨーク、に例示され ているような、当業者によく知られた方法を変形して行なった。ｍｕされたＤＮ Ａは、物理的方法または酵素的分解によって断片にＤｒａｇ會ｅｎｔ）され、例 えばノ（クテリオフ１−ジやコスミドベクターといったｊ！ｌ宜のベクターに、 サムブルーフ他＜１９ｇ９）の文献に見られるような公知の方法の変形によって クローンされる。本発明のＤＮＡを含んでいる発現ベクターを、特にここで考庄 する。Δ６−デサチュラーゼをエンコードするＤＮＡは、機能獲得分析（Ｂａ１ ｍ　ｏ（ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ）で同定することができる。断片 （こされたＤＮＡを含むベクターが、例えば感染、トランスコンジ二ゲー７３ン （ｔｒａｎ８ｅｏれｊＢａｔｉｏｎ）、移入によって、ＧＬＡではなくり／−ル 酸を生成する生体に転移される。ここで使用する”形質転ｍ（ｔｒａｎｓｒｏｒ ■ａｔｉｏｎ）”は、一般に外来のＤＮＡを宿主細胞に取り入れることを意味す る。再配列ＤＮＡを宿主生体に導入する方法は、当業者にはよ（知られており、 例えば、サムブルーフ他（１９１９）に見いだされる。これらの生体によるＧＬ Ａの生成（例えば機能の獲得）は、例えばガスクロマトグラフィーまたは他の当 業者に知られた方法によ、て検定されるｏＧＬＡを生成させられる、例えば、ベ クターの導入によって獲得された機能を有する生体は、Δ６−デサチコラーゼを エンコードする発現ＤＮＡによって同定され、そのＤＮＡは、その生体から再生 される。再生されたＤＮＡは、再び断片にされ、発現ベクターでりａ−ンされ、 Δ６−デサチニラーゼをエンコードするＤＮＡがより特異的に定義されるように 、上記の方法によってさらに検定される。

本発明の例として、シアノバクテリアのンネコシスチス　パステウア・カルチャ ー・フレク／ＩＩン（Ｐａｓｔｅｕｒ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｌｏｎ ｌ　（Ｐ　ＣＣ）　６８０　Ｂ、アメリカンタイプ・カルチャー・コレクシ１ノ （＾ａｅｒｉｃａｎ　ｔｙｐｅ　ＣｕＨｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ＞　（Ａ ＴＣＣ）２７１８４から、ランダム（ｒａｎｄｏｍ）　Ｄ　Ｎ　Ａを単離し、コ スミドベクターにクローンし、ＧＬＡ欠損ンアノバクテリアの７ナバ工ナ菌株Ｆ ＣＣ７１２Ｇ、ＡＴＣＣ２７８９３へのトランスコンジ二ゲーシ璽ンによって導 入した。７ｆｌ＜ｚｆリノール酸からのＧＬＡの生成は、ガスクロマトグラフィ ーによって監視し、対応するＤＮＡフラグメントを単離した。

単離されたＤＮＡは、例えばサムブルーフ他（１９８９１に見られるような、当 業者によく知られた方法により配列した。

本発明によれば、Δ６−デサチーラーゼ遺伝子からなるＤＮＡがｌ５１１１され た。

特に、Δ６−デサチュラーゼ遺伝子からなる３、５８８キロベース（ｋｂ）ＤＮ Ａが、ノアツバクチリアのンネフ／スチスから単離された。その３．５８８ｋｂ ＤＮＡのヌクレオチド配列が同定され、配列番号；　ｌに示した。潜在的コーデ ィング領域を決定するオープンリーディングフレーム＋ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎ ｇ　ｆｒａｍｅ）は、ヌクレオチド３１７から１５０７及び２００２から３０８ １に存在する。Δ６−デサチュラーゼのエンコードに役割をはたしうるヌクレオ チドを決定するために、Δ６−デサテーラーゼ活性を与える３、５８８ｋｔ）フ ラグメントを、それぞれが１つのオープンリーディングフレームを持つ２つのサ ブフラグメントに開裂させた。フラグメントＯＲＦ　１は、ｌから１７０４のヌ クレオチドを含み、一方フラグメント０ＲＦ２は、１７０５から３５８８のヌク レオチドを含む。それぞれのフラグメントは＋前方向及び後方向て、ンアノメイ クテ１ノア・カルボ牛シラーゼ・プロモータを含んでいる相方の発現ベクター（ ＡＭ５４２、ウー−り（ｖｏｌｋｌ也、（１９川、ｌ’ｒｏｅ、１Ｉｉｔ１．Ａ ｃ１ｄ、Ｓｅ１．υＳＡ比ＩＳもｌ＞　ｌこサブクローンされる。結果的な構造 （ＰＩえば、０ＲＦＩ　（Ｆ）、０ＲＦＩ　（Ｒ）、０ＲＦ２　（Ｆ）、及び０ ＲＦＩ（Ｒ））は、通常の方法により、野生型のＬＬ二五ヱＰＣＣ７１２０１ご 複合される（例えば、ウオーク他、（１９川、Ｐｒｏｃ、Ｎ１ｔ１．Ａｃ１ｄ、 Ｓｃｉ、ＵＳ＾８１．１５６１参照）。アナ／イエナの複合細胞は、選択媒体（ リフブカｕ＋＋ｐｐｋａ）（已、（＋９７９）Ｊ、Ｇｅｎ　Ｍｉｅｒｏｂｌｏｌ 、厘１１．１に従うＢＧＩ　ＩＮ＋３０μｇ／ｍ＋のネオマイシン（ｎｅｏｍｙ ｃｉｎ）を含む標準鉱物媒体）での２週間の成長の後の、死んだＩト演合細胞の 茶色のＩ〈ツクグラウンド上の、ネ第５グリーンコロニー（Ｎｅｏ”　（ｒｅｅ ｎ　ｅｏｌｏｎｉｅｓｌと同定された。そのグ１ノーノコロニーは選択され、選 択液体媒体（ＢＧＩ　ＩＮ＋１５ｔ＋ｇ／ｍ１Ｌｔ−Ｆインン）中で成長される 。脂質を、前及び後方同に配向したＯＲＦ　１及び０ＲＦ２構造を含むトランス フンシュガント（丁ｒａｎｓｃｏｎｌｕｇａｎ＋）力）ら、標準的な方法（例え ｌｉ　ダーマー（Ｄａｈｍｅｒ）他、＋１９川Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ＾ｍｅｒｌ ｃａｎ　Ｏｉｌ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ　６６．５４３j で抽出する。比較のために、アナＩイエナ及び乙１エヱ五二五の野生型の培地力 ゝらも脂質を抽出した。脂肪酸メチルエステルカ（ガス液体クロマトグラフィー （ＧＬＣ）、例えば、水素火炎イオノ化検出機とキャピラＩ）−カラムを備えた トレイカー　（Ｔｒａｃｔｏｒ）　−５６０ガス液体クロマトグラフ５こより分 析された。ＧＬＣ分析の結果を表１に示す。

［以下余白］ 表１：野生盟及びトランスコン二・１り　シアノバクテリアにおけるＣ１８［１ １１Ｆｊｌｌの発生 ＧＬＣ分析による検定では、ＧＬＡ欠損ＬＬ二五二は、前方向の０ＲＦ２を含む 構造がトランスコン：）、Ｓゲーフンンによって導入されたときに、ＧＬＡ生成 の機能を獲得する。カルボキンラーゼプロモーター６二対して後方向の０ＲＦ２ 、あるいは両方向の０ＲＦＩの構造を含むトランスコンノ１ゲー７豐ンは、ＧＬ Ａ生成を示さなかった。この分析は、１８８４ｂｐフラグメントを持つた単一の オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ２）が、Δ６−デサチュラーゼをエンコ ードすることを示している。１８８４ｂｐフラグメントは、配列番号；３に示し た。

これは、図１　（Ａ）及び（Ｂ）に各々示したように、Δ６−デサチュラーゼと Δ１２−デサチｊラーゼ（ワダ（Ｗａｄａ）他、＋１９９０）、ネーチｗ　−（ Ｉｌａｔｕｒｅ）、３４７）との間のヒトロバシーブミツアイルの全体的な類似 性によって実証される。

Δ６−デサチュラーゼをエンコードする単離された核酸は、上述の機能獲得分析 または交雑プローブとしてアナバエナΔ６−デサチュラーゼをエンコードする単 離された核酸を使用した核酸交雑技術により、他のＧＬＡ生成生体から同定され る。ゲノム及びｃ　ＤＮＡクローニング法が当業者に知られており、本発明によ って熟慮される。交雑プローブは、オリゴヌクレオチド・プローブを含む、配列 番号：　ｌに示した全ＤＮＡ配列、あるいはそれらの制限フラグメントまたは他 の７ラグメノトからなることができる。交差交雑による相同遺伝子のクローニン グの方法は、当業者にはよく知られており、例えば、サムブルーフ（１９８９） やベルブ（Ｂｅｔ　ｔｚ）他（１９８３）ｚンザイモロジー（Ｅｎｚｙｍｏｌｏ ｇｙ＞における方法、１００．２６６に見いだせる。

Δ６−デサチュラーゼをエンコードするＤＮＡの導入により、ＧＬＡ生成の機能 を獲得するトランスジェニック生体は、オクタデカテトラエン酸（１８：４Δ・ ］・ｌｆｆ１・Ｉｓ）生成の機能もまた獲得する。オクタデカテトラエン酸は、 通常、魚油及びボラギナセアエ（Ｂｏｒｘｇｌｎａｅｅｍａ）族（フレイブ（Ｃ ｒａｌｇ）他、（１９６４）ｌＡｍｅｒ、ｏｉｌ　Ｃｈｅｓ、Ｓｏｃ、　４１． ２０９−２１１　；　グロス（Ｇｒｏｓｓ）他、（＋９７６）Ｃａｎ、　Ｊ、　 ＰｌａｎＬ　Ｓｃ１．５６D６５９−６６４） に属するい（つかの植物種に存在する。本発明のトランスジェニック生体におい ては、オクタデカテトラエン酸は、Δ６−デサチ講ラーゼによるα−リルン酸の さらなる脱飽和、もしくはΔ１５−デサチ１ラーゼによるＧＬＡの脱飽和の結果 得られる。

０ＲＦ２、例えばΔ６−デサチコラーゼをエンコードするオーブンリーディング フレームによってエンコードされた３５９アミノ酸を、配列番号：　２に示した 。

さらに本発明は、配列番号：２のアミノ酸をエンコードする他のヌクレオチド配 列を熟慮する。例えば遺伝コードの同義性から得られるそのような配列の同定は 、当業者の知識の範囲内である。さらに、当業者は、上述した機能獲得分析によ り、Δ６−デサチエラーゼをエンコードする０ＲＦ２を含む１８８４ｂｐフラグ メントのより小さなサブフラグメントを同定することができる。

本発明は、そのようなΔ６−デサチュラーゼのポリペプチドフラグメント及びＬ ＡをＧＬＡに変換する活性を有しているその核酸を考慮する。

本発明の他の態様では、１８８４ｂｐフラグメノト、またはΔ６−デサチコラー ゼ遺伝子のプロモーター、コーディング配列及び停止領域を含むより小さなフラ グメントは、例えば、Δ６−デサチ誹ラーゼプロモーター及び停止領域が機能的 であるような／アノバクテリアに転移される。従って、本発明では、再配列Δ６ −デサチュラーゼを生成する生体が提供される。本発明のさらなる態様では、再 配列生体から、タンパク質精製の標準的な方法、例えば、アウスベル（＾ｕｓｕ ｂｅｌ）他、（１９８７）、分子生物学での最近の議定書（ＣｕｌｌｅｎＬ　Ｐ ｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｉｙ）、Ｉ゛リリー フ版社（Ｇｒｅｅｎ　Ｐｕｂｌｌｓｈｌ＋＋ｇ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ）、二Ｘ −トク、で精製された、単離されたΔ６−デサチュラーゼを提供する。

Δ６−デサチ５ラーゼをエンコードするＤＮＡを含むベクターもまた、本発明に よって提供される。適当なベクターが、多くの生体におけるΔ６−コーディング 配列の発現を指向するように構成されることができることは、当業者には明かで ある。レプリカ可能な（ｒｅｐｒｉｃａｂｌｅ１発現ベクターが特に好ましい。

ここに説明するレプリカ可能な発現ベクターは、例えばΔ６−デサチュラーゼの ような設計された（ｃｌｅｓｉｒｅｄ）遺伝子の制御された発現のために設計さ れた（ｅｎｇｌｎｅｅｒａｄ）　Ｄ　Ｎ　ＡまたはＲＮＡ分子である。好ましく は、ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、フスミド、またはウィルス である。例えば、ウオーク他、＜１９８４）Ｐｒｏｃ、Ｎａ１１．＾ｃａｄ、　 Ｓｃ１．ＵＳＡ、＋５６１−１５６５及びブストス（Ｂｕｓｔｏｓ）他、（＋９ ９＋）Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１V４゜ ７５２５−７５３３、のような、／ヤトルベクターもまた本発明に従って考慮さ れる。サムブルーフ（１９８９）、ゴエデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ１編、（１９９０ １、エノザイモロジーの方法（Ｍａｔｂａｄｓ　ｉｎ　ＥｎｚｙｓｏｌｏｇＦ） 、アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｉ■ｉｅ　Ｐｒｅｓｓ）、及びパーパル（Ｐ ａｒｂａｌｌ　（１９８１１）、分子クローニングの実用ガイド（Ｐｒａｃｔｉ ｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｌｎｇ）、フッ７・ウ ィリー・アンド・サン（Ｊｏｈｎ　Ｗ＋ｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ、　Ｉｎｃ、 、）は、Δ６−デサチコラーゼをエンコードする核酸中に挿入され発現されるこ とのできるベクターの詳細な総説を提供する。そのようなベクターは、Δ６−デ サチ１ラーゼをエンコードする核酸の発現に影響を与えることのできる核酸配列 をも含んでいる。遺伝子生成の発現に影響を与えることのできる配列因子は、プ ロモーター、促進因子、上流側活性化配列、転写停止信号及びポリアゾニレ＝ン 言ン（ｐｏｔｙａｄｅｎｙｌｉｔｌｏｎ）サイトを含む。構成及び組織特異的プ ロモーターを考える。植物細胞の転換のために、カウリフラワー（ｃａｕｌｉｆ ｌｏｗｅｒ）モザイクウィルス（（ａＭＶ）３５Ｓプロモーター、及び植物種子 成熟の間に調節されるプロモーターは特に興味深い。すべてのそのようプロモー ター及び転写調節因子は、単一または組み合わされて、このレプリカ可能な発現 ベクターにおける使用が考慮され、それは当業者に知られている。ＣａＭＶ３５ ５プロモーターは、例えばレストレボ（Ｒｅｇｔｒｅｐｏ）他、（＋９９０ＪＰ ｌａｎｔＣｅ１１．２９ｇ？、に説明されている。遺伝的に設計され、突然変異 した調節配列もまた考慮される。

当業者は、特別な宿主細胞における発現に好適なベクターまたは調節因子を同定 することができる。例えば、アナバエナのカルボキノラーゼをエンコードする遺 伝子からのプロモーターからなるベクターで、Δ６−デサチエラーゼのコーディ ング領域に操作可能に（ｏｐｅｔａｂｌｅ）結合され、さらにンネコシスチスか らの停止信号に操作可能に結合しているものは、シアノバクテリアでのΔ６−デ サチュラーゼの発現に適している。本明細書における「操作可能に結合した」と は、プロモーター及び停止配列が、転写の調節に効果的に機能することを意味す る。さらなる例として、トランスジェニック植物でのΔ６−デサチュラーゼの発 現に適したベクターは、Δ６−デサチ１ラーゼコーディング領域に実施可能に結 合し、さらに種子（ｓｅｅｄｌ停止信号またはノパリノ（ｎｏｐａｌ　１ｎｅ） 　／ンターゼ停止信号に実施可能に結合したへりアンチエン（ｈｅｌｉａｎｔｈ ｉｎｉｎ）、ナビン（ｎａｐｉｎ）、またはグリシノから導かれた種子４！興的 プロモ一ター配列からなることができる。

特に、本出願人が１９９１年４月８日に出願し、審査中の米国出願番号６８２゜ ３５４及びそれに記載した参考文献に開示されているヘリア／チニン調節因子は 、本発明のΔ６−デサチュラーゼの発現を指向するプロモーター因子と考えられ る。

ここで考慮した機能を維持した、ここで説明した核酸配列または調節因子の修飾 は、本発明の範囲内である。そのような修飾は、挿入、置換、及び欠失、特に遺 伝コードの同義性を反映するｆｉｔｔｌを含んでいる。

そのようなハイブリッドベクターを構成する襟準的技法は、当業者にはよ（知ら れており、サムブルーフ他（１９８９）や、広まっている再配列ＤＮＡ技術の無 数の研究室マニュアルに見いだせる。ＤＮＡのフラグメントをリゲート（Ｉｉｇ ａｔａ）するために、多くの方法が広まっており、その選択は、ＤＮＡフラグメ ントの末端の性質による。本発明によって、ハイブリッドベクターに、クローニ ング、発現またはブロセッ／／グを促進する他の配列因子、例えば信号ペプチド をエンコードする配列、小胞体でのタンパク質の保持に必要なＫＤＥＬをエンコ ードする配列、またはＷ棹体へのΔ６−デサチーラーゼを指向するトラ７ジノト （Ｌｒａｎｓ口）ペプチドをエンコードする配列が含まれることが考慮される。

そのような配列は、当業者には知られている。最適なトラ７ジノトベブチドは、 例えばファン・デミ・ブロイク（Ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｂｒｏａｅｋ）他、（１９Ｍ ５）、ネイチャー、３１３．３５８に記述されている。前核及び真核信号配列は 、ミバエリス（Ｍｉｅｈａｅｌ　ｉｓ）他、（１９８２）、＾ｎｎ、Ｒｅｖ、Ｍ Ｉｃｒｏｂｉａ１３１４２５に記述されている。

本発明のさらなる態様は、本発明のΔ６−デサチニラーゼをエンフードするＤＮ Ａを含む、シアノバクテリア以外の生体を提供する。本発明で考慮されるトラン スジェニック生体は、バクテリア、ンアノバクテリア、細菌、及び植物と動物を 含む。本発明の単離されたＤＮＡは、感染、トランスフェクシフン、形質転換ま たはトランスコンノユゲーンーンのような当業者に知られた方法で宿主に導入さ れる。そのような生体に本発明のＤＮＡを移転する方法は、広く知られており、 サムブルーフ他（１９０）などの文献に与えられている。

植物の形質転換方法の変法は知られている。そのΔ６−デサチュラーゼ遺伝子は オル／ｘ　（Ｈｏｒｓｅｈ）ら　（１１８５）　５ｃｉｅｎｃｅ　２２７．１２ ２９によって開示されたような葉片の形質転換−組換え手法により植物の内部に 導入することができる。プロトプラスト培養（ホルン、５（Ｉｌｏｒｅｈ）ら　 （１９８４１５ｃｉｅｎｃｅ　２２３．４９６；デブロック（ＤｅＢｌｏｃｋ） ら　（１９８４）　ＥＭＢＯＪ、　２．２＋４３；　バートン（Ｂａｒｔｏｎ） ら　（１９９３）　Ｃｅ１１３２、１０３３）のような、形質転換の別な方法も また使用でき、さらにそれらは本発明の範囲内である。好適な実施態様において 植物はアグリバクテリウム誘導ベクターで形質転換される。しかしながら、別な 方法は植物細胞内に本発明のΔ６−デサチニラーゼ遺伝子を挿入することにより 利用し得る。同様に近縁の方法は、バイオリスチブクアブローチ（フレイン（Ｈ ｅｉｎ）ら　（１９Ｍ７）　Ｎａｔｕｒａ　３２７．　ＴＯ）、電気泳動、化学 的に誘導されたＤＮＡの取入れ、さらにウィルス又はベクターとしての花粉の使 用を含む。

形質転換方法が必要な時、本発明のΔ６−デサチュラーゼ遺伝子は植物の形質転 換ベクター、例えばビバ７　（Ｒｅｖａｎ）　＋１９８４１　Ｎｕｃｌｅｉｃ　 Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１２．８１１１によって開示されたバイナリ−ベクター を挿入することができる。植物の形質転換ベクターはアグロバクテリウム　チュ ーメファノエノス（＾ｇｒｏｂａｅｔａｒｉｕｍ　ｔｕ■ｅｆａｃｉｅｎｓ）の 自然遺伝子転移／ステムの変型によって誘導することができる。その自然／ステ ムは形質転換された植物に転移されるＴ−ＤＮＡとして知られる、ラージセグメ ントを含んだラージＴｉ（腫瘍−誘導性）−プラスミドを備える。そのＴＩプラ スミドの別のセグメント、その対向する領域はＴ−ＤＮＡ転移の原因となる。そ のＴ−ＤＮＡ領域は末端反復によって境される。バイナリ−ベクターの変更にお いて腫瘍−誘発遺伝子は削除されており、そしてその対向するｑｔａｃｏｍ能は 、Ｔ−ＤＮＡｔｌ界配列により墳された転移外来ＤＮＡに利用される。そのＴ− 領域は又、抗生物質抵抗性のための選択可能なマーカーと、転移のための挿入配 列のための多岐クローニングサイトとを含む。そのような工学的な株は一解除し た（ｄｉｇ訂冒ａｄ）−八、　ｌｕｗａｆｉｃｉｅｎｓ株として知られており、 そして植物の核のゲノム内のＴ−Ｇａ域によって境される配列の転移の能力を与 える。

表面ＭＩＩした葉片は、′解除した（ｄｉｓａｒｍｅｄ）　−外来ＤＮＡ含有＾ 、　ｔｕｓｅｆａｃｉｅｎｓを接種し、２日間培養し、そして抗生物質含有培地 に転換する。形質転換された芽（ｓｈｏｏｔｓ）は適当な抗生物質を含む培地中 で出根させた後に選択され、土壌に移して再生する。

本発明の別な態様は、本発明の分離されたＤＮＡを包含した遺伝子導入植物又は これら植物の子孫を提供する。単子葉植物と双子葉植物との両方の植物が企図さ れる。植物細胞は上述された植物形質転換方法のいずれかによってΔ６−デサチ ュラーゼをエンコードする分離されたＤＮＡで形質転換される。カルス培養又は 葉片で通例であるが、形質転換された植物細胞は、当業者の１つの周知方法によ り完全な遺伝子導入植物内で再生される（例えばホルノｘ　（１ｌｏｒｓｅｈ） ら　（８４６１５ｅｌｅｎｅｅ　２２７．１１２９）。好ましい実施態様におい て、遺伝子導入植物はヒマワリ、ナタネ、トウモロコン、タバコ、落花生及び大 豆である。Δ６−デサチュラーゼをエンコードするＤＮＡを遺伝する形質転換植 物の子孫に由来し、形質転換植物からの種子又は切断片が遺伝子導入植物系列を 維持するのに使用される。

本発明は更に、ＧＬＡの含量を増加した遺伝子導入植物を提供するための方法を 提供する。この方法は＋　ＧＬＡを欠損又は欠乏しているが、ＬＡを含んだ植物 細胞内へΔ６−デサチコラーゼをエンフードする導入性ＤＮＡと、遺伝子導入細 胞からのＧＬＡ含重が増加された再生植物とを包含する。殊に、商業的栽培作物 植物は、ヒマワリ、大豆、ナタネ、トウモロコノ、落花生及びタバコを非限定的 に含む、遺伝子尋人生体として企図される。

本発明は更に、ＧＬＡを含む遺伝子尋人生体を提供するための方法を提供する。

この方法はＧＬＡを欠損或いは欠乏しているがＬＡを含む生体の中にΔ６−デサ チニラーゼをエンコードするＤＮＡを導入することを備える。別な実施態様にお いて、ＧＬＡとＬＡの両方が欠乏する生体の中に６１２−デサテーラーゼとΔ６ −デサチュラーゼをエンコードしたＤＮＡを備える１つ又はそれ以上の発現ベク ターを導入ことを備える。従って、ＬＡとＧＬＡの両方が欠乏した生体は、Δ１ ２−デサチュラーゼの発現によって生産が誘発され、かつＧＬＡがΔ６−デサチ ュラーゼの発現のために生成される。Δ１２−デサチ１ラーゼ又はΔ１２−デサ チメラーゼとΔ６−デサチエラーゼをエンコードしたＤＮＡを備える発現ベクタ ーは、当業者における周知の組換え技術の方法（サムブルーフ（５ａｓｂｒｏｏ ｋ）ら。

１９ｆｉ９）及びΔ１２−デサチ１ラーゼの公表された配列（ワダ（ｗｍｄａ） ら（１９９０１Ｎａｚｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　３４７．２００−２０３）に よって構成することができる。加えて、ンアノバクテリア由来のΔ１２−デサチ コラーゼの配列番号：　１　（Ｓ［！Ｑ、　ＩＤ　ＮＯ：１）てエンコードした ｚｏｏｚ−ａｏｇ＋ｔ＊酸が本発明によって発見されている。従って、この配列 は主体発現ベクターを構成するのに使用することができる。殊に、商業的栽培作 物植物が遺伝子導入植物として企図され、非限定的に、ヒマワリ、大豆、ナタネ 、トウモロコシ、落花生及びタバコを含む。

本発明は更に、植物における寒冷寛容性を誘発することの方法を示す。寒冷感受 性は細胞膜中の脂質の相転移によるものであろう。相転移ｉ度は履脂貢中の脂肪 酸の不飽和度に依存し、それ故、例えばＬＡからＧＬＡに転換するへ６−デサチ ュラーゼを導入することによって不飽和の度合を増加させれば耐寒性を誘引又は 改善できる。従って、本発明方法は植物細胞内にΔ６−デサチ１ラーゼをエンコ ードしたＤＮＡを導入することと、その遺伝子導入植物細胞から耐寒性を改善し た植物を再生することを備える。好適な実施態様において、その植物はヒマワリ 、大豆、ナタネ、トウモロコ／、落花生及びタバコの植物である。

以下の実施例により本発明をさらに説明する。

［以下余白］ 実施例１ 株と培養条件 ／ネコ７スチス（Ｓｙｎｅｃｈｏｓｙｓｔｉｓ）　（ＰＣＣ６８０３，＾丁ＣＣ ２７１８４）、γナノイエナ（Ａｎａｂａｅｎａ）　（ＰＣＣ１１２０，＾ＴＣ Ｃ２７８９３）、ンネフフカス（Ｓｙｎａｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）　（ＰＣＣ７９ ４２、＾丁ＣＣ３３９１２）は、白熱う／ブの照射（６０μＥ、ｍ−２，５−１ ）のもとてＢＧ１１Ｎ＋墳地（リブ力（Ｒｌｐｐｋａ）　ら　［＋９７９］　Ｊ 、　Ｇｅｎ、　Ｍｌｅｒｏｂｌｏｌ、ＩＩｌ、ｌ−６１）中、３０℃で光独立栄 養的に培養した。コスミドとプラスミドカイ選択され、かつマニアチス（ｋｌｉ ｎｉａ山）　ら　（１９８２）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｌｎｇ：　Ａ　 Ｌａｂｏｒａｔｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、フ−１１）’Xブ１ｙンク ゛＾様゛−ラ本゛う）訃、】−レ）’　１７’曽り゛、二、−１−り１．１．よ って開示されたｔＩｌｌ準濃度での抗生物質を補足したＬＢ培地上で大腸ｍ　（ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ）　Ｄ　Ｈ５ａ株中で増殖した。

［以下余白］ 実施例２ ７ネコンスチス（Ｓｙｎａｃｈｏｃｙｓｒｌｇ）コスミドゲノミツクライブラリ ーの構成ンネコンステス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｇ）　（ＰＣＣ６８０３） からの総ゲノミフクＤＮＡ（７ｏｔａｌ　ｇｅｌｎｏ■ｉｃ　ＤＩＩＡ）は５ａ ｕ３Ａで消化し、かつン嘗ｍ密度勾配法（アウスベルら（１９Ｍ７１　Ｃｕｒｒ ｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　Ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ（ｙ、　 Ｇｒｅｅｎ　Ｐｕｂｌｌｉｈｌｎ（O１ｔｏｅｌｉ ｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｌｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒｓｅｌｅｎｅｅ、ニスートウ）によっ て分別した。３０力１ら４０ｋｂのＤＮＡ断片を含んだフラクンジンを選択し、 さらにコスミドベクター、ｐＤＵＣＡ７（ブイケマ（Ｂｕｉｋｅｓａ）ら　［１ ９９＋１　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｌｏｌ、　ｌ）３゜１８フ１−ｔｕｓ）のＲａｍ Ｈ＋サイトを脱すノ酸化して連結した。その連結されたＤ　Ｎ　Ａ　１１オース ペル（＾Ｕｓｕｂｅｌ）ら（１９川によって開示されたようにインビトロで）ぐ １ケージし、さら喜こノく、ケージされたファージは、Ａｖａ　ＩとＥｃｏ４７ １１メチラーゼヘル／ぐ−プラスミド、ブイケｖ　（９ｕｉｋｅｍｓ）ら（１９ ９１）により開示されたようなｐＲＬ５２８を含んだ大ｍｍ　（Ｅ、　ｃｏｌｉ ）　Ｄ　Ｈ５α株中で増殖した。総数１１５２個のコロニーを任意に分離し、１ ２個の９６穴のミクロタイタープレート（ｍＬｅｒｏＬＩＬｅｒ　ｐｌｉｔａｓ ）　ｌこ個々に保持した。

ｒ以下糸白］ 実施例３ アナバエナ中のＧＬＡの機能獲得発現 繊維状ノア／バクテリアであるアナノイエナ（ＰＣＣ７１２０）はＧＬＡが欠乏 して（するが、ＧＬＡの前駆体であるリノール酸を著しい置含有している（図２ ；表２）。

実施例２に示されたシネコシスチス　コスミド　ライブラリーは、ＧＬＡを生産 するトランスフンジエガン）　（ｔｒｉｎｓｃｏｎｊｕｇｉｎｔｉ）を同定する ためにアナ／イエナ（ＰＣＣ７＋２０１に接合された。ＬＬ二五ヱ細胞をＢＧＩ ＩＮ＋ＧＩＩＮ＋のミプドーログ（■ｉｄ−１ｏｇ）相まで生育し、ｍ１当たり 約２ｘ１０８１１胞の最終濃度まで同じ媒体中で再度懸濁した。アンビンリンを 含有するＬＢ中に生育された大ＩＩＩ菌（［！、　ＣＯ口）ＲＰ４（バーカート （Ｑｕｒｋｉｒｄｔ）他［１９７９］　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍ＋ｃｒｏｂｉｏ１． １１４．３４１−３４８）の！１ドーログ相培養物を洗浄し、新鮮なＬＢｋＩ体 中で再度懸濁した。次１こ、アナバエナとＲＰ４とを混合し、５％のＬＢを含有 するＢＧＩＩＮ＋平板上に均平板化げた。５０μｇ／ｍｌのカナマイシンと１７ ．５μｇ　／　ｍ　ｌのクロラムフェニコールとを含有するＬＢ平板上にコスミ ドゲノム　ライブラリーをレプリカ培養し、続いてヱｆ、（五ｌ−とＲＰ４とを 含有するＢＧＩＩＮ＋平板上にｔ平板化した。３０℃で２４時間インキユベー７ 璽フン行った後、３０μｇ／ｍｌのネオマイシンを下に置いた：そしてトランス クノノ誹ガントが発現するまで３０℃でインキ二べ一シｙ）を続けた。

個々のトランスコアシュガントを接合の後に隔離し、１５μｇ　／　ｍ　＋のネ オマイシンを何する２ｍｌのＢＧＩＩＮ＋ＧＩＩＮ＋で生育した。脂肪酸メチル エステルを以下の様に１０個のトランスコアシュガントのプールを含有する培養 物と野性！！！培養物とからＩ！整した。野性型及び遺伝子導入のンア／ノイク テリア培養物を遠心分離によって収集し、蒸留水を用いて二度洗浄した。脂肪酸 メチルエステルをダーマー＋Ｄｉｂｓａｒ）他（１９８９）Ｊ．＾ｍａｒ．　Ｏ ｉｌ．　Ｃｈｅ＋＋．　Ｓｏｃ．　６６４４ｍ−５４８に記載されているこれら の培養物から抽出し、キャピラリーカラムと水素炎イオン化検出器とを備えたト ラフ−（Ｔｒａｃｏｒ）−５６０　（３０ｍｘ０．２５ｍｍ．ＦＳＯＴスベロノ クス（Ｓｕｐａｒｏｘ）　ｌ　ｌに接続、オールテ１り　γノ／エーソ　インコ ーホレーテッド（ＡＩｌｌｅｃｈ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　Ｉｎｃ．）、イリノ イ州）を用いてガス液体グロマトグラフイ−（ＧＬＣ）によって分析した．ｌ￥ Ｉ肪酸の同定のために、標準（シグマケミカルカンパニー（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｉ 閣ｉｃａｌ　Ｃｏ．）より取得）の保持時間およびコクロマトグラフィー（ｅｏ ｅｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いた。平均の脂肪酸組成を、内部の標準に 標準化されたそれぞれのＣ１８脂肪酸のピーク領域の割合として決定した。

図２に代表的なＧＬＣプロファイルを示す。Ｃ１ｇ脂肪酸メチルエステルを示す 。ピークは脂肪酸メチルエステルの既知の標準を用いて溶離時間を比較すること によって同定し、ガスクロマトグラフィー−質量分析法によって確定した。パネ ルＡは野性型Ｔ　ｔ　ｓ五二の脂肪酸のＧＬＣ分析を描いている。矢印はＧＬＡ の移動時間を指している。パネルＢはｐＡＭ５４２＋１．８Ｆをもつアナバエナ のトランスコアシュガントの脂肪酸のＧＬＣプロファイルである。ＧＬＡを生産 した２つのＧＬＡ生産プール（２５Ｑトラノスフノジコガントを表わす２５ブー ルのもの）が同定された。それぞれのＧＬＡ陽性プールの個々のトランスコンシ ュガントを分析してＧＬＡ生産をめた；著しい水準のＧＬＡを発現しかつそれぞ れＣｓｙｔａ及びｃＳｙ７５のコスミドを含有する（図３）、別々のプールから 得られた２つの個々のトランスコンシュガントＡＳ１３及びＡＳ７５を同定した 。これらのコスミドは長さ約７．５　ｋ　ｂの領域で１１復する。ｃｓｙ７５の ３．５ｋｂＮｈｅｌフラグメントをベクターｐＤυＣＡ７中でリフローンしくｒ ｅｅｌｏｎａｄ）、ＧＬＡの機能獲得発現を生じるアナバエナに転移した（表２ ）。

塩基配列決定のために、ｃｓｙ７５−３．５の３．５ｋｂ　Ｎｈｅ　Ｉ７ラグメ ントの２つのＮｈｅ　Ｉ／Ｈｉｎｄ　ＩＩＩサブフラグメノトＣｓｕｂｆｒａｕ ｅｎｔｓ）（　１　、　８及び＋　７ｋｂ）を＋ｐブルースクリプト＋ｐＢＬＵ ＥｓｃＲＩＰＴ）”　（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔｉｇｅｎｅ）　（図３）に サブクローンした（ｓｕｂｃｌｏｎｅｄ）ａ　マニアチｘ　（ｋｌａｎｌａＬｉ ＄１他（１９８２１及びアウスベル（＾ｕｓｕｂｅｌ）他（１９８７）に記載さ れているような標準分子生物学法を行った。ｐｓｓｔ．ａのジデオキシ（ｄｌｄ ｅｏｘＦ）塩基配列決定（サノガー（Ｓａｎｇｅｒ）他［１９７７］Ｐｒｏｃ． 　Ｎａｉｌ．　Ａｃｉｄ．　Ｓｅｔ．　ＬＩＳＡ　７４．５４６３−５４６７） をアドバ／スト　ＤＮＡ　チクノロシーズラボラトリ−（＾ｄｖａｎｃｅｄ　Ｄ ＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　（テキサス　Ａ＆ Ｍ大学、生物学部）によって合成された特定のオリゴヌクレオチドブライマーを 用いることによって両標準に関して＋７−クエナーゼ＜ＳＥＱＩＩＥＩＩＡＳＥ ）＋（ユナイテッド　ステーソバイオケミカル（υｎｉｐｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　 Ｂｉｏｅｈｅ＋＋ｉｃａｌ））を用いて行ったＯ　ＤＮＡ塩ａＥＩＥ列決定分析 はデベロウ（Ｏｅｖｅｒａｕｘ）他（１１１１４１Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　 Ｒａｓ．　１１８Ｂ１−３９５、によって記載されているようなにｃＧ（ウィス コンシン州、マジンン（Ｍａｄｌｓｏｎ））ソフトウェアを用いて行った。

ンアノバクテリアのカルボ手ンラーゼに関して前進及び後進の両方向で、Ｎｂ２ 　１　／Ｈ　Ｉ　ｎ　ｄｌｌｌの両サブフラグメントを接合発現ベクターＡＭ５ ４２に転移し、接合によって２に導入した。前進方向（ＡＭ５　４　２−　１． ８　Ｆ）中の！。

８ｋｂフラグメントを含有するトランスフンシュガントは著しい量のＧＬＡとオ クタデカテトラエン酸を生産した（図２：表２）。他の構成物、すなわち後進方 間の１．８ｋｂフラグメントか前進及び後進方向の１．７　ｋ　ｂフラグメント かのｔｌずれか、を含有するトランスフンシュがントは検知可能な水準のＧＬＡ を生産しなかった（表２）。

図２は、野性型アナバエナからの抽出物のＣ１８脂肪酸プロファイル（図２Ａ） を前進方向にあるｃｓｙ７５−３．５の１．８　ｋ　ｂフラグメントを含有する 遺伝子導入のアナバエナのもの（図２８）と比較している。ＡＭ５４２−１．８ Ｆからの脂肪酸メチルエステルのＧＬＣ分析は、真正のＧＬＡｋＩ準と同様の保 持時間をもつピークを示した。ガスクロマトグラフィー−質量分析法（ＧＣ−Ｍ Ｓ）によるこのピークの分析によって、このピークがＧＬＡ対照試料と同じ質量 フラグメント化パターンを有することが確定した。ポリ不飽和脂肪酸の変化した 水準を有する遺伝子導入のアナバエナは、成長速度及び形態において野性型と同 様であった。

Ｅ以下余白］ 野性型及び遺伝子導入のノアツバクチリア中のＣ　Ｉ　ＢｆｌｉｌＲｈａの組成 １８０、ステアリン酸；　１ｇ：１．　オレイン酸，１８２、リノール酸；　１ ８：：Ｈα）、αーリルノ酸，　１８．３（γ）、γ＝リルン酸，】８４、オク タデカテトラエン酸実施例４ Δ６とΔ１２デサチェラーゼ遺伝子での７ネココカス（鉦胚分二ユ１ｕ）の転換 Δ１２−デサチコラーゼ遺伝子を含有する第３フスミドであるｃＳｙ７が、刊行 されたシネコンスチスΔ１２−デサテーラーゼ遺伝子配列（ワダ他［１９９Ｇ］ 、ネイチャー（Ｉｆｆンドン）！４７．２００−２０３＞から合成されたオリゴ ヌクレオチドでシネコシス二五遺伝子ライブラリを選抜することにより単離され た。Δ１２−デサチュラーゼ遺伝子を含有するこのコスミドからの１．７ｋｂＡ ｖａｌ断片は、同定サレ、ｃｓｙ１３がΔ６−デサチコラーゼ遺伝子だけでなく Δ１２−デサチ、ラーゼ遺伝子も含有することを証明するプローブとして使用さ れた（図３）。ゲノミ、クサザンブｏ　１）　（ｇａｎｏｓｉｅ　５ｏｕｔｈｅ ｒｎ　ｂｌｏｔ）分析はさらに、両Δ６−とΔ１２−デサチ二ラーゼ遺伝子がシ ネコシスチスゲノムに独特であるので、Ｃ１８脂肪酸脱飽和中に含まれた両機能 遺伝子はンネコシスチスゲノム中に密接に架橋していることを示した。

単細胞ンアノバクテリウム／ネコフカス（ＰＣＣ７９４２）は、す／−ル酸とＧ ＬＡ（３）を共に欠いている。Δ１２とΔ６−デサチニラーゼ遺伝子は個々にク ローニングされ、外来ＤＮＡのシネコツカスゲノム中への組み込みに必要な配列 を含んだシャトルベクターであるｐＡＭ８５４（ブストス（ＢｕｓＬｏｇ）他［ １９９１］、Ｊ、Ｂａｅｔａｒｉ。

１、１７４．７５２５−７５３３）中にともにクローニングされる（Ｇｏｌｄｅ ｎ他、　［１９ｇ？］酵素の方法、ｌｓ３．２１に−２１１）。ンネココカスは 、これらの遺伝子構造で形質転換され、コロニーが選ばれた。脂肪酸メチルエス テルがトランスジェニック／ネココカスから抽出され、ＧＬＣにより分析された 。

野性型の７ネココカスの主要な脂肪酸がステアリノ酸（１８：Ｏ）とオレイノ酸 （１８：　Ｉ）であることを表２は示している。ｐＡＭ８５４−Δ１２で形質転 換されたノネコフカスは、主要な脂肪酸に加えてリノール酸（１８：２）を発現 した。ｐＡＭ８５４−Δ６とΔ１２によるトランスフォーマント（ｔｒａｎｓｆ ｏｒｍａＮ）は、リノール酸塩とＧＬＡ　（表１）を共に製造した。これらの結 果は、両Δ１２−とへ６−デサチュラーゼ遺伝子を含有しているンネココカスが 、Ｃ１８脂肪酸のΔ１２位置に第２二重結合を、八〇位置に第３二重結合を導く 能力を得たことを示している。しかしながら、ｐＡＭ８５４−Δ６を有するトラ スフォーマント中で脂肪酸組成の変化が観察されず、このことは、Δ１２デサチ ュラーゼにより合成された基質の不在中で、Δ６−デサチ１ラーゼが不活性であ ることを示している。この実験はさらに、１．８ｋｂＮｈｅｌ／Ｈ１ｎｄｌｌｌ 断片（図３）が、乙ネコンスチスΔ６−デサチエラーゼ遺伝子のコーディング及 びプロモータ領域を共に含有することを確信させる。多不飽和脂肪酸の改められ たレベルを持つトランスジェニブク二土三二り五は、成長速度と形態が野性型と 類似していた。

［以下余白］ 実施例５ Δ６−デサチ５ラーゼのヌクレオチド配列、機能性Δ６−デサチ講ラーゼ遺伝子 を含有するｃＳｙ７５−３．５の１，８ｋｂ断片のヌクレオチド配列が同定され た。３５９アミノ酸のポリペプチドをエンコードするオーブンリーディングフレ ームが明らかにされた（■４）。カイト−ドウリトル水治療分析（カイト他［１ ９４２］Ｊ、Ｍｏ１．８１ｏ１．＋５７．１Ｏ５−１３２）　１１、トランスメ ンブランドメインを再現し得る疎水性アミノ酸の２つの領域を明らｂｓ＋こした く図ＩＡ）。さらには、Δ６−デサチュラーゼの水治療のプロファイル１ヨ、Δ １２−デサチーラーゼ遺伝子（図ＩＢ；ワダ他）とΔ９−デサチニラーゼ（Ｔｈ ｉｅｄｅ　ｌ也［１９８６］　ｊ　、Ｂｌｏｔ、Ｃｈｅ■、２６１．１３２３０ −１３２１５）のそれに類似してＬする。しｂ）シな力（ら、乙ＬＬＺ五り五Δ ６−とΔ１２−デサチニラーゼの間の配４１類似性（よ、ヌクレオチドレベルで ４０％より少なく、アミノ酸レベルで約１８％である。

［以下余白］ 実施例６ シアノバクテリアルΔ６−デサチエラーゼのタバコへの転移シアノバクチリアル Δ６−デサチ１ラーゼ遺伝子は植物発現ベクターに移動させられ、遺伝子転移技 術に媒介されたアグロバクテリウムを使用してタバコに転移された。転移された デサチユラーゼが葉で好適に発現され、種子を育成すること、及びデサチェラー ゼ遺伝子生成物が細胞質膜状構造もしくは葉緑体を標的としていることを確信す るために、シネフ／スチスΔ−デサチュラーゼオーブンリーディングフレーム（ ＯＲＦ）で各種発現カセットが構成された。これらのカセットの構成は欠配を含 む。（＋）全ての植物組織もしくは各単に成育する橿中のΔ６−デサチュラーゼ 遺伝子発現をさせるための、ヒマワリへりアンチ二ノ遺伝子から誘導された３５ ｓプロモータもしくは種子特異的プロモータ。（目）新合成されたΔ６−デサチ 二ラーゼをＥＲに標的するために、ニンジン伸張遺伝子もしくはヒマワリへりア ンチニン遺伝子のいずれかからの推定される信号ペプチド。（ｉｉＤΔ６−デサ チユラーゼＯＲＦのｃｏｏＨ一端末でのＥＲルーメン保留信号配列（ＫＤＥＬ） 。そして、　（ｉｖ）Δ６デサチ１ラーゼを葉緑体に標的とするための最適化さ れたトラフジ１トベブチド。３５ｓプロモータは、レストレボ（Ｒｅ１ｔｒｅｐ ｏ）他（１９９０）により記載されたｐＲＴＬ２の誘導体である。最適化された トラフジ１トベブチド配列は、７アノデブロツク（Ｖａｎ　ｄａ　Ｂｒｏｅｃｋ ）他（１９８５）によって記載されている。ニンジン伸張信号ペプチドはチェノ （Ｃｈｅｎ）他（１９＋１ｓｌＥＭＢｏ　Ｊ、９．２１４５により記載されてい る。

トランスジェニックタバコ植物は、細胞質膜状構造保留配列（ＫＤＥＬ）に融合 されたンネコンスチスΔ６デサチエラーゼ遺伝子とＣａＭＶ３５Ｓプクモータに よりドライブされた伸張信号ペプチドとからなる牛メランアノバクテリアルデサ チコラーゼ遺伝子を含有するように生成された。トランスジェニックタＩ（コゲ ／ミ１りＤＮＡのＰＣＲ増大は、Δ６デサチ二ラーゼ遺伝子が夕、（コゲ／ムに 導入されたことを示す。これらのトランスジェニックタバコ植物の葉の脂肪酸メ チルエステルが抽出され、ガス液体クロマトグラフィ（ＧＬＣ）により分析され た。これらのトランスジェニックタバコは、ＧＬＡをかなりの量蓄積したく図４ ）。図４は、ＧＬＣにより定量された脂肪酸メチルエステルを示す。脂肪酸メチ ルエステルの既知のＩｊＡ！ｌＩと溶離時間を比較することによりピーク（１同 定された。従って、脂肪酸代謝中に含まれるパハくクチリアｌし遺伝子（±、変 化した脂肪酸組成を有スルトランスジエ二ブク植物を生成するのに使用サレｉｌ Ｘ＋。

［以下余白］ 配列リスト （１）一般情報 （１）出願人二　トーツス、テリー　Ｌ。

レディー、アブｙ　（Ａｖｕｔｕ）　Ｓ。

ヌフチオ、マイケル フレイ／エンド（Ｆｒｅｙｇｇｌｎｅｔ）、ノ首−ジス　Ｌ。

（１１）発明の名称；デルタ６−デサチニラーゼによるガンマリルン酸の製造 （■１）配列の数：３ （ｉｖ）通信アドレス： （Ａ）名宛人ニスカリ−、スコツト、マーフィルブレ１サー（Ｂ）通り：　４０ ０ガーデンンテイプラザ（Ｃ）市：ガーデン／ティ （Ｄ）州：ニー−ヨーク （Ｅ）国：米国 ＣＦ）郵便番号：１１５３０ （Ｖ）コンビコータ読取リフォーム： （Ａ）媒体＃！ニア０ブビーディスク （Ｂ）：＋ンヒ二−タ：　１口Ｍ　ＰＣフンパーティプル（Ｃ）オペレーティン グ／ステム：　ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯ５（Ｄ）　７７　ト　＋７　ｘ、７　 ：　Ａ’　ｆ７Ｈ７リリーＸ＃１．ＯＪ’　−’Ｊ’　ｍノ＄１．２ｓ（ｖ＋ン 現出願データ （Ａ）出願番号：指定 （Ｂ）出願臼・１９９２年１月０８日 （Ｃ）分類： （ｖＩＩυ代理人／代理情報 （Ａ）氏名＝７１クナルティ、ウィリアム　Ｅ（８）登録番号：　２２６０６ （Ｃ）引例／名簿番号：　８３８３Ｚ ＧＧＡＴＯＣＣＣＧＣＣＴＡＧＡＡＡＧＭ　ＣＧＴ’ｒＧＧＣＣＴＧ　Ｃ０ＣＣ ＡＡＴＡテＣＡＡＣＣＯＡＧＣＣＧ　ＡＡＧＣＣＡＴｒＧＴ@１０２０ （２）配列番号：２の情報 口→配列の特徴： （Ａ）長さ：３５９アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）分子の型：タンパク質 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：２： Ｍｅｔ　Ｌａａｕ　Ｔｈｒ　八ｌａ　Ｏｌｕ　Ａｒｇ　ｌｉ＠　Ｌｙｅ　ｔｈｅ 　丁ｈｒ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｏｌｙ　Ｉ”ｈｅ　＾窒X １ｓ　ｉｏ　ｔｓ ＾ｒｇ　ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ａｌｓ　 Ｔｙｒ　ｔｈｅ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　１Ｉｉｓ＋　Ｏｌｙ　Ｌ■■ Ｐｈｅ　Ｐｒｃ＋　Ｖａｌ　＾ｒａ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇａｙ　Ｃｙｓ　ＭＬ！ ｔ　ｖａｌ　Ｌｅｕ　八ｌａ　ｌｉｅ　入１ａ　Ｌｅｕ　Ａ撃■ ６５　７０　７５　Ｉｎ ＾１ａ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ａ＋ｎ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　ｌ１ｌｓ　Ａｓｐ 　八１ａ　八ｓｎ　ｌ１ｌｓ　Ａｓｎ　八ｌａ　Ｔｙｒ　５■■ ａｓ　９０　ｑｓ Ｓｅｒ　Ａｓｎ　ｔ’ｒａ　ｌｌｌ５　ｌｉｅ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｖａｔ　Ｌｅ ｕ　Ｇｌｙ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　ｔｌｈｅ　uａ） Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｓｅｔ　Ｓｅｔ　Ｐｈｅ　ｔ、ｅｕ　Ｔｒｐ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ 　Ａｒｇ　ｌ１ｌｓ　Ａｓｎ　丁ｙｒ　Ｌ４ｕ　ｌｌｌ５１撃撃■ 丁ｈｒ　Ｔｙｒ　丁ｈ【　Ａｓｎ　１１１！　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　ＩＩｌ、Ａｓｐ 　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｔｉｅ　ｌｌｌ５　Ｇｌｙ　八ｔｐ　０Pｙ ＾１ａ　Ｖａｔ　Ａｒｇ　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　 ｌ１ｌｓ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　Ａｒ９　ｉ’■■ ＧｉｎＧｉｎＰｈ＠ＴｙｒＩｌｅＴｒｐＧｌｙＬｅｕＴｙｒＬｅｕＰｈ＠１ｉｅ ＰｒｏＰｈｅＴｙｒ丁ｒｐ１も５１フ０１フ５ Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　 Ａｇｎ　Ｌ、ｙｓ　Ｃ１ｙ　ｂｙｓ＋　Ｔｙｒ　ｈｉｓ　八Tｐ Ｉｌｌｓ　Ｌｙｓ　１１ｅ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　ｔｈｅ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ 　Ｇｌｕ　Ｌ、ｅｕ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　しａｕ　Ｇ撃■ １１ｅ　Ｌ、ｙｓ　しｅｕ　Ｌ１１％Ｉ　Ｔｒｐ　Ｌ、＠ｕ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　 ｖｓｌ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｌｅｖｌ　Ｐｒｏ　Ｌ、ｅｕ　Ａ撃＝@Ｌｅｕ Ｇｌｙ　Ｐｈａ　Ｓｅｔ　ｌｉｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　ｌｉｅ　 Ｏｌｙ　八１ｓ　Ｓ＠ｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｈｅｔ丁ｈｒ　Ｔｙｒ　Ｇ ｌｙ　ｌｉｅ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　ｌｉｅ　Ｐｈｅ　Ｍｅｔ　Ｌ ｅｕ　八Ｌａ　ｌ１ｌｓ　リａｌ　Ｌｅ■ Ｇｌｕ　ｓｅｒ　丁ｈｒ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　 にＧｌｙ　Ｇｌｕ　Ｓｅｔ　Ｇｌｙ　＾１＠　ｌｉｅ　＾５■ ２１６０　２６５　２フＯ Ｍｐ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ａｌａ　ｌｉｅ　Ｃ１客　Ｇｉｎ　Ｉｌｅ　Ａｒ９　丁 ｈｒ　Ｔｈｒ　Ａｉｍ　Ａｇｎ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｔｈｒ２７５　２＠０　２８ ５ Ａｓｎ＾＠ｎＰｒ６ｒｌｅ＠ＴｉｐｈｅｎＴｒｐｒｌ＋ｅｃｙｓＧｌｙＱｌｙＬ ｅｕ＾５ｈＩＩＩｓＯ１ｎＶａ１丁ｈｒ　）Ｉｌｇ　１１１１　しｅｕ　Ｐｈ＝ 　ｒｒｏ　Ａｓｎ　ｌｉｅ　Ｃｙｓ　１ｌｉｓ　Ｉｌｅ　ｌ１ｌｓ　Ｔｙｒ　Ｐ ｒｏ　Ｇｌｈ@Ｌｅｕ Ｇｌｕ　Ａｓｒ＋　Ｉｌｅ　ｌｉｅ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｇｌｎ 　Ｇｌｕ　ｔ’ｈ＠　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　し凾■ ）２５　３３０　〕３５ Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｔｌ＋ｒ　Ｐｈ＝　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ａｌａ　ｌｉｅ 　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ａｇｎ　Ｔｙｒ　八ｒｑ　Ｔｒｐ　Ｌｅ■ Ｇｌｕ　Ａｉｍ　Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　ＡＩＡ　５ａｒ（２）配列番号：３ の情報 （１）配列の特徴： （Ａ）長さ：１８８４塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）ｊｌの数二二本鎖 （Ｄ）トポロジー：ｕＩ鎖状 （１皿）分子の型：　ＤＮＡ　（ゲノミック）（ｘｉ）配列の記載；配列番号： ３： ＾ＧＣＴｒＣＡＣＴｒ　ＣＧＧＴｒＴｒＡＴＡ　ＴｒＧＴＧＡＣＣＡ丁　ＧＧＴ ＴＣＣＣＡＧＧ　ＣへＴＣＴＧ（ＴＣＴ　ＡＧＧＧＡＧＴＴsＴ　Ｇ。

ＴＧＣＣＴＴＧＧｃＡ　ＴｒＧＡＡＧＣＡ八八　へＴＧＧへへＡへＡＴ　ＣＣＣ ＴＣＱ丁八ＡＡ　へＣＴ八丁へＡＴＣＧ　八ＡＧＣＣｍＣＴ@１４４０ σＴ丁ａｃｃｃｃｃｃ　ｃへＣＣ＾へへ丁ｃｃ　ｃｃａ八丁へＣＴＧＡ　ＣＣ入 ＾＾ＧＧＴ丁Ｇ　ＡＴＧτＴＧＧＣＡＴ　ＴＧＣＴＣＣ八＾OＣへ　１５００ ＾Ｃ＾＾＾＾ＴＴ丁Ｔ　ＡＴＣ（ＡＴＣＡＧＣ丁ＡＧＣ１１１１１４トランスジ ェニック　タバコ タ、（：１葉（野生型）力、ら。　（十Δ６）デサチュラーゼがらのフロントペ ージの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　９１０４　 Ｚ　９３５９−４ＢＣ１２Ｐ　７／６４　７４３２−４Ｂ ／／（Ｃ１２Ｎ　１５１０９ Ｃ１２Ｒ１：０１） （Ｃ１２Ｎ　９１０４　Ｚ Ｃ１２Ｒ１：０１） （８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、　Ａ Ｕ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　Ｃ３，ＨＵ、ＪＰ、　ＫＲ，ＰＬ、　Ｒ○、　Ｒ Ｕ、　ＵＳＩ Ｃ１２Ｒ１：０１） （７２）発明者　ナッシオ、マイケル アメリカ合衆国　テキサス　７７８４１　カレッジ　ステーション　（番地なし ）　ピーオーボックス　５５３ （７２）発明者　フレッシネ、ジョルジュフランス国　サン　ジュール　オー　 モンドール　リュ　ドウ　ネルヴリュウ　２１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．細菌のΔ６−デサチュラーゼをエンコードする単離された核酸。 ２．£列番号：３のヌクレオチドからなろ請求項１の核酸。 ３．４求項１の核酸でエンコードされたアミノ酸配列をコードする単離された核 酸。 ４．前記核酸がペクターに包含された請求項１から３のいずれかの核酸。 ５．前記単離された核酸の遺伝子生成の発現に影響を与えることのできるプロモ ーター及び／又は停止信号に操作可能に結合した請求項４の単離された核酸。 ６．前記プロモーターがΔ６一デサチュラーゼプロモーター、アナパエナ・カル ボキシラーゼプロモーター、ヘリアンチニンプロモーター、グリシンプロモータ ー、ナピンプロモークー、あるいはヘリアンチニン組織特異的プロモーターであ る請求項５の単離された核酸。 ７．前記停止信号がシネコシスチス停止信号、ナビン・シンターゼ停止信号また は種子停止信号である請求項５の単離された核酸。 ８．前記単離された核酸が、トランスジェニック生物に含まれる請求項１から７ のいずれかの単離された核酸。 ９．前記トランスジェニック生物が、細菌、真菌、植物細胞または動物である請 求項８の単離された核酸。 １０．請求項９のトランスジェニック植物細胞から再生された植物または子孫。 １１．前記植物が、ヒマワリ、大豆、トウモロコシ、タバコ、落花生、ナタネで ある請求項１０の植物。 １２．（ａ）請求項１から７のいずれかの単離された核酸を植物細胞に移転し、 （ｂ）前記植物細胞から、ガンマリノレン酸（ＧＬＡ）含有量の増加した植物を 再生することからなる、ＧＬＡ含有量の増加した植物の製法。 １３．前記植物が、ヒマワリ、大豆、トウモロコシ、タバコ、落花生、ナタネで ある請求項１２の製法。 １４．ガンマリノレン酸（ＧＬＡ）欠損または欠乏の生物でのＧＬＡの生成を誘 導する方法であって、前記生物を請求項１から７のいずれかの単離された核酸で 形質転換すろことからなる方法。 １５．ガンマリノレン酸（ＧＬＡ）及びリノール酸（ＬＡ）欠損または欠乏の生 物でのＧＬＡの生成を誘導する方法であって、前記生物を、バクテリアΔ６−デ サチュラーゼをエンコードする単離された核酸及びΔ１２−デサチュラーゼをエ ンコードする単離された核酸で形質転換することからなる方法。 １６．ガンマリノレン酸（ＧＬＡ）及びリノール酸（ＬＡ）欠損または欠乏の生 物でのＧＬＡの生成を誘導する方法であって、前記生物を、バクテリアΔ６−デ サチュラーゼをエンコードする単離された核酸及びΔ１２−デサチュラーゼをエ ンコードする単離された核酸からなる発現ベクターの少なくとも一つで形質転換 することからなる方法。 １７．前記Δ６−デサチュラーゼをエンコードする単離された核酸が、配列番号 ：１のヌクレオチド３１７から１５０７からなる請求項１５または１６のいずれ かの方法。 工８．ガンマリノレン酸欠損または欠乏の生物でのオクタデカノニン酸の生成を 誘導する方法であって、前記生物を請求項１から７のいずれかの単離された核酸 で形質転換することからなる方法。 １９．前記生物が、細菌、真菌、植物または動物である請求項１８の方法。 ２０．ａ）植物細胞を請求項１から７のいずれかの単離された核酸で形質転換し 、 ｂ）前記形質転換した植物細胞から、耐寒性の向上した植物を再生することから なる請求項１から７のいずれかの単離された核酸の、耐寒性の向上した植物の製 造での用途。 ２１．前記植物が、ヒマワリ、大豆、トウモロコシ、タバコ、落花生、ナタネで ある請求項２０の用途。 ２２．単離されたバクテリアΔ６−デサチュラーゼ。 ２３．配列番号：２のアシノ酸配列を有する請求項２２の単離されたバクテリア Δ６−デサチュラーゼ。