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JPH07503143A - Ｈｃｖ単離物のタイピング法 - Google Patents

Ｈｃｖ単離物のタイピング法

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JPH07503143A
JPH07503143A JP6512767A JP51276794A JPH07503143A JP H07503143 A JPH07503143 A JP H07503143A JP 6512767 A JP6512767 A JP 6512767A JP 51276794 A JP51276794 A JP 51276794A JP H07503143 A JPH07503143 A JP H07503143A
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JP6512767A
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ロツソー，ルデイ
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＨＣＶ単離物のタイピング法 本発明はＨＣＶ単離物の遺伝子型を決定するための、ＨＣＶの５°非翻訳領域由 来の配列を標的とするプローブの使用に関する。
本発明はまた、ＨＣＶ単離物の遺伝子型決定法に関する。
本発明はさらにＨＣＶ単離物の遺伝子型を決定するためのキットに関する。
Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣｖ）は、非＾、非Ｂ（ＮＡＮＢ）肝炎の大部分を引き起 こす陽性鎖でエンベロニブを持つＲＮＡウィルスの一族である。それらのゲノム 組織はペスチウイルス科（Ｐｅｓｔｉｖｉｒｉｄａｅ）およびワラビウィルス科 （Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）と親密な関連性を示す。幾つかの原型単離物の完 全なゲノムを包含するｃＤＮＡクローン配列はすでに完璧に決定されている（Ｋ ａｔｏら、１９９０　；Ｃｈｏｏら、１９９１　；Ｏｋａｍｏｔｏら、　１９９ １：Ｔａｋａｍｉｚａｗａら、　１９９１；Ｏｋａｍａｔｏら、　１９９Q ｂ）。これらのゲノムは約９５００塩基対の長さである。、、ＫａｔｏＳＴａｋ ａｍｉｚａｗａおよびＣｈｏｏにより報告された単離物は、３０１０または３０ １１アミノ酸の塩基読み取り枠（ＯＲＦ）を含み、ならびにＯｋａｍｏｔｏによ り報告された単離物は３０３３のアミノ酸をコードする。これらの単離物を比較 すると、エンベロープ（Ｅ）および非構造領域（ＮＳ）はかなりの変異性を表す が、一方５°非翻訳領域（ＵＲ）、およびより程度が低いが、コア領域は高度に 保存されていることが示されている。
ＮＳ３領域のクローン配列を使用して、Ｋｕｂｏら（１９８９）は日本と米国の 単離物を比較し、はぼ８０％のヌクレオチド、および９２％のアミノ酸相同性を 見い出した。配列変異性の存在は、５’　ＵＲ，コア、およびＥｌ領域が入手で きた時にさらに証明された（ＩＩｃ−ＪｌおよびＩＣ−Ｊ４　：Ｏｋａｍｏｔｏ ら、Ｌ９９Ｑ）。日本の研究所では幾つかのＮＳ５断片を単離した後、Ｋ１およ びに２のふたつの群が記述された（Ｅｎｏｍｏｔｏら、　１９９０）。“アメリ カ様（＾ｍｅｒｉｃａｎ−１ｉｋｅ）”単離物ＰＴ−１をＫｌ（これは日本では より一般的であった）と比較すると、それらは親密な関連性を示したが、群間の ヌクレオチド同一性が約８０％の異なるサブタイプであった。Ｋ２配列は、Ｋｌ およびＰＴ−１の両方によりわずかに関連しているだけである。なぜならばその 相同性が核酸を基準としてわずか６７％、アミノ酸を基準として７２％観察され たからである。さらにに２はふたつの群（Ｋ２ａおよびに２ｂ）に分類でき、そ れらは約８０％の群間のヌクレオチド相同性を示した。５’　ＵＲでのヌクレオ チド配列分析では、Ｋ１とＰＴ−１との間で９９％の同一性を、ならびににに１ とに２との間で最高９４％の同一性が示され、この分析は５°ＵＲを使用して制 限断片鎖長冬型（ＲＦＬＰ）、ならびにＩＩＣＶをＫｌおよびに２群に分類する こと可能にする（Ｎａｋａｏら１９９１）。さらにＩＩｃ−Ｊ６およびＩＩｃ− Ｊ８の完全な配列により、第二群に関する証拠が得られ、ふた−）（７）配列は に２群と関連していた（Ｏｋａｍｏｔｏら、１９９１　；Ｏｋａｍｏｔｏら１９ ９２ｂ）。４ツノ支脈（すナワチタイブエ：ｔｌＣＶ−１およびＩＩｃＶ−１１ ；　タイプＩＩ　：ＨＣＶ−Ｊ、　−ＢＫ、　ＩＩＣ−Ｊ４：タイプＩＩ［：Ｉ ＩＣ−Ｊ５；タイプＩＶ：ＨＣ−Ｊ８）を含むＩＩｃＶの系統発生系図がＯｋａ ｍ。
ｔｏらにより提案された（１９９２ｂ）。しかし、タイプＩとタイプ■との間、 ならびにタイプ■とタイプ■との間に７９％の核酸配列相同性を観察することが できる。第一群間（タイプＩおよび■）、ならびに第二群間（タイプ■および■ ）には程度の低い相関性が６７−６８％存在するだけである。さらに新たなＩＩ ｃＶタイプ、ＨＣＶ−ＴがＮＳ５領域を研究した後にタイ国で検出された（Ｍｏ ｒｉら、１９９２）。ＨＣＶ−Ｔはすべての他の既知のＮＳ５配列と６５％の相 同性を有し、ならびにふたつの群（ＨＣＶ−ＴａおよびＩＩｃＶ−Ｔｂ）が検出 でき、これらはまた約８０％の核酸相同性を示した。英国の単離物に見い出され た同様な新規群と、タイプＩから■との系統発生的関連の解明は、５°υＲ１コ ア、ＮＳ３およびＮＳ５領域の保存部分を分析することにより可能であった（Ｃ ｈａｎら、　１９９２ａ）。新たな系統発生系図が提案され、これによれば゛タ イプ１°はタイプＩおよび■、°タイプ２°はタイプ■および■、ならびに′タ イプ３°およびそれらの有する単離物Ｅ−ｂｌからＥ−ｂ８、ならびにＩ（ＣＶ −Ｔに対応した。゛タイプ３°由来の単離物の５’　ＩＩＲ配列の中には他者（ Ｂｕｋｈら、１９９２；Ｃｈａら、　１９９２；Ｌｅｅら、１９９２）により報 告されたものもあった。
幾つかの特許出願はタイプｔｕｃｖｔｓｔｅｉ物のゲノム由来のプローブにより ＨＣＶの存在を検出する問題点に取り組んだ（国際公開第９２１０２６４２号、 欧州特許第４１９１８２号、欧州特許第３９８７４８号、欧州特許第４６９４３ ８号および欧州特許第４６１８６３号）。さらに、ＨＣＶ単離物の５’　ｔｌＲ は一般的な１ｌｃｖ検出のためのプローブおよびプライマーを設計するためのよ い候補になることが証明された（Ｃｈａら、１９９１；Ｉｎｃｈａｕｐｓｅら、 １９９１）。しかし、これらの特許出願のいずれも、分析すべき試料中に存在す るＨＣＶのタイプおよび／またはサブタイプを同定するだめの方法を与えていな い。
種々のＨＣＶ遺伝子型感染は種々の血清学的反応性（Ｃｈａｎら、１９９１）、 ならびに種々のインターフェロンＩＦＮ−γ処置への応答（Ｐｏｚａｔｔｏら、 １９９１；Ｋａｎａｉら、１９９２；Ｙｏｓｈｉｏｋａら、１９９２）を生じる ことが実証され、ＩＩＣＶ遺伝子型決定の重要性が強調されている。現在まで、 このことはコード領域、マタは５’　ＵＲでの莫大な配列決定に関する努力によ り、あるいはコアープライマーのタイプ−特異的な組み合わせを使用するＨＣＶ 　ｃＤＮ＾についてのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＢ）により（Ｏｋａｍｏｔｏ ら、　１９９２ａ）、あるいは５’　ＵＲまたはＮＳ５領域内の（ＲＦＬＰ）分 析により（Ｎａｋａｏら、１９９１　；Ｃｈａｎら、１９９２ｂ）達成されただ けであった。しかしこれらのいずれの上記特許出願および公開も、分析すべき試 料中に存在するＩＩｃＶのタイプまたはサブタイプを同定するための信頼しうる 方法を提供していない。それはこれらの方法では特にタイピングが労働を要し、 ならびにサブタイピングはさらに労働荷重であるか、あるいは不可能と思われる からである。この点でＬｅｅら（１９９２）ノ、ＩＩＣＶ単離物Ｔ　、Ｔ）　ル １ＩｃＶ３２４とＨＣＶ３２４Ｘ間ヲ、これう単離物のゲノムの５’　ＵＲ由来 のＰＣＲ断片により識別する試みは注目できる。その結果はこれら５’　ＵＲプ ローブは、それらが誘導されたそれぞれの単離物のゲノムとは特異的反応性を表 さないことを実証している。
従って本発明の目的は、生物学的試料中に存在する１種の、または数種のｎｃｖ 遺伝子型の存在を迅速かつ確実に決定する方法、および決定した単離物（または 複数の単離物）を確実に分類する方法を提供することである。
もうひとつの本発明の目的は、未知のＩＣＶタイプまたはサブタイプを同定する 方法を提供することである。
本発明のもうひとつの目的は、感染した生物学的流体を、ゲノムの水準で明白に タイプまたはザブタイプと関連した種々の血清学的群に分類できる方法を提供す ることである。
本発明のもうひとつの目的は、Ｉ（ＣＶの種々のタイプまたはサブタイプの存在 、または不存在を迅速に検出するためのキットを提供することである。
本発明は少なくともひとつのプローブの使用に関し、生物学的試料中に存在する ＩＩＣＶ単離物の遺伝子型を決定するために、該プローブは（ｉ）ひとつのｎｃ ｖ単離物の被検体鎖中に存在する、５゛非翻訳領域（ＵＲ）のヌクレオチド−２ ９１位から一６６位に伸長するドメイン中の、遺伝子型に特異的な標的領域にハ イブリダイズすることができ、または該プローブは（ｉｆ）任意の上記に定義し たプローブに相補的である。
本発明は好ましくは、約５から約５０ヌクレオチド、より好ましくは約１０から 約４０ヌクレオチド、ならびに最も好ましくは約１５から約３０ヌクレオチドを 含有する少なくともひとつのプローブの使用に関し、該プローブは（ｉ）例えば 図２のｃＤＮＡ配列により表されるようなｃＤＮ＾配列によって表されるひとつ のＨＣＶ単離物のヌクレオチド−２９１位から一６６位に伸長するドメイン中に ある、被検体鎖中に存在する遺伝子型に特異的な標的領域にハイブリダイズする ことができ、ここでヌクレオチドの位置を示す負の番号は、ＨＣ１’ポリタンパ ク質をコードする塩基読み取り枠の初めのＡＴＧコドンより前にあるヌクレオチ ドから始まっている。あるいは該プローブは（ｉｆ）生物学的試料中に存在する ＩＩＣＶの（インビトロ）遺伝子型決定のために上記に定義したプローブと相補 的であり、該試料はＨＣＶ陽性であると事前に同定されているかもしれない。
上記方法は他のＨＣＶ単離物との相同性の割合に従い、該単離物を分類するため に使用することができ、単離物が同じタイプに属するという事実によれば： 完全ゲノム中の核酸水準で７４％より高い相同性を表す；または、ヌクレオチド ７９３５位と８２７４位との間にあるＮＳ５領域中の核酸水準で７４％より高い 相同性を表す： またはその完全なポリタンパク質はアミノ酸水準で７８％より高い相同性を表す ７　またはアミノ酸２６４６位と２７５８位の間にあるそのＮＳ５領域は、アミ ノ酸水準で８０％より高い相同性を表す：ならびにＩＩＣＶ単離物が同じサブタ イプに属するという事実によれば、完全ゲノムにおいて核酸水準で９０％より高 い相同性、かつ完全ポリタンパク質において、アミノ酸水準で９０％より高い相 同性を表す。
より好ましくは上述の方法は、以下の事実に従うＩＩｃＶ単離物の分類に関する 、 （１）ヌクレオチド７９３５と８２７４との間（Ｃｈｏｏら、１９９１）、また は８２６１と８６００との間（Ｋａｔｏら、１９９０）、または８３４２と８６ ８１との間（Ｏｋａｍｏｔｏら、１９９１）にあるＮ５５ｂ領域中の核酸配列の 系統発生的分析に基づき、同じＨＣＶタイプに属する単離物は、０．３４より低 いヌクレオチドディスタンスを表し、通常は０．３３より低（、より通常では０ ．３２より低く、および同じサブタイプに属する単離物は０．１．３５より低く 、通常は０．１３より低く、より通常では０゜１２５より低いヌクレオチドディ スタンスを表し、その結果、同じタイプに属するが、異なるサブタイプの単離物 は０．１３５から０．３４の範囲の通常では０．１４から０．３３の範囲、より 通常では０．１５から０．３２の範囲を表す、ヌクレオチドディスタンスを表し 、そして異なるＩＩｃＶタイプに属する単離物は０．３４より高（、通常は０３ ５より高く、より通常では０．３６より高いヌクレオチドディスタンスを表し、 （２）ヌクレオチド３７８と９５７との間にあるコア／Ｅｌ領域中の核酸配列の 系統発生的分析に基づき、同じＩＩｃＶタイプに属する単離物は、０．３８より 低く、通常は０．３７より低く、より通常では０３６より低いヌクレオチドディ スタンスを表し、そして同じサブタイプに属する単離物は０１７より低く、通常 は０１６より低く、より通常では０，１５より低いヌクレオチドディスタンスを 表し、その結果同じタイプに属するが、異なるサブタイプの単離物は０１５から ０３８の範囲の通常では０．１６から０．３７の範囲の、より通常では０．１７ から０．３６の範囲のヌクレオチドディスタンスを表し、そして異なるＨＣＶタ イプに属する単離物は０．３６より高く、通常は０．３６５より高（、より通常 では０．３７より高いヌクレオチドディスタンスを表し、（３）ヌクレオチド４ ６６４と５２９２との間（Ｃｈｏｏら、１９９１）、または４９９３と５６２１ との間（Ｋａｔｏら、１９９０）、または５０１７と５６４５との間（Ｏｋａｍ ｏｔｏら、１９９１）にあるＮＳ３／ＮＳ４領域中の核酸配列の系統発生的分析 に基づき、同じＨＣＶタイプに属する単離物は、０．３５より低く、通常は０． ３４より低く、より通常では０．３３より低いヌクレオチドディスタンスを表し 、そし゛（同じサブタイプに属する単離物は０．１９より低く、通常は０．１８ より低く、より通常では０．１７より低いヌクレオチドディスタンスを表し、そ の結果同じタイプに属するが、異なるサブタイプの単離物は０．１７から０．３ ５の範囲、通常では０．１８から０．３４の範囲、より通常では０．１９から０ ．３３の範囲のヌクレオチドディスタンスを表し、そして異なるＩＩｃＶタイプ に属する単離物は０．３３より高く、通常は０．３４より高く、より通常では０ ．３５より高いヌクレオチドディスタンスを表す。
“遺伝子型決定”という用語は、タイピングおよび／またはサブタイピングのい ずれかを言う。ＨＣＶ単離物を°遺伝子型決定°するための方法とは、少なくと も部分的にはＩＩｃＶ単離物を遺伝子型に分類することと考えられている。１ｉ ｃｋ’遺伝子型゛は関連した配列を持っＨＣＶ単離物の群である。
そのような関連配列は上記および実施例９に説明したようなヌクレオチドディス タンスを示すものとして定義される。より大きな群（ＩＩｃＶタイプ）、とより 小さい群（ＩＩＣＶサブタイプ）とは関連していることが示された。
ＨＣＶタイプはいつでもひとつ以上のＨＣＶサブタイプを含んでいる。したがっ て、遺伝子型決定法は、サブタイピング（ＨＣＶサブタイプへの分類）の不必要 なＨＣｖ単離物のタイピング（ＨＣＶタイプへの分類）を目的とすることができ 、または好ましい態様においてはサブタイピングを目的とすることができる。サ ブタイプへの分類は、本質的にタイプへ分類するためのデータを提供することが 理解されるべきである。
“遺伝子型に特異的な標的領域”という表現は、図２および４からすぐに導き出 すことができる５゛非翻訳領域（ＵＲ）中の種々のＨＣＶ遺伝子型間で観察され る少な（ともひとつのヌクレオチド変異を言う。
“ＨＣＶポリタンパク質”という用語はサブタイプ１ｂに属するＨＣＶ−Ｊ単離 物のＨＣＶポリタンパク質を言う（Ｋａｔｏら、１９９０）。
“プローブという表現は、相補性に基づいて特定のＨＣＶ単離物中に存在する標 的配列とハイブリッドを形成する任意のポリヌクレオチドに対応する。そのよう なプローブにはＤＮＡ、ＲＮＡ、または合成ヌクレオチド類似体を含む。本発明 のプローブは、固体支持体に固定された被検鎖と共にインキュベートすることが できる。本発明の好ましい態様においては、プローブそれ自体を固体支持体に固 定することができる。これらのプローブはさらに捕獲プローブを含むことができ 、このプローブは次に直接的、または間接的に固体支持体に結合する結合分子に カップルされることを特徴とするか、あるいは標識プローブを含んでもよく、こ の標識プローブは検出しつる標識を持っているのが特徴である。
本発明は生物学的試料中に存在するＩＩＣＶ単離物の遺伝子型決定法に関し、そ の方法は以下の二種を含んで成る・−試料中のりボヌクレオチド、またはデオキ シリボヌクレオチドが接近できるように作られた試料を、必要に応じて適当な変 性条件下で少なくともひとつのプローブと接近させ、該プローブは（１）ひとつ のＨＣＶ単離物の５゛非翻訳領域のヌクレオチド−２９１位がら一６６位に伸長 するドメイン中の領域とハイブリダイズすることができ、または該プローブは（ 五）任意の上記に定義したプローブに相補的であり、ならびに−該プローブと同 定すべきＩＩＣＶ単離物のヌクレオチド配列との間にあるいは形成された複合体 を検出する。
本発明はまた生物学的試料中に存在するＨＣＶ単離物の遺伝子型決定法に関し、 その方法は以下の工程を含んで成るニー試料中のりボヌクレオチド、またはデオ キシリボヌクレオチドが接近できるように作られた試料を、必要に応じて適当な 変性条件下で、好ましくは約５から５０の、より好ましくは約１０から約４０ヌ クレオチドの、最も好ましくは約１５から約３０ヌクレオチドの少なくともひと つの該プローブと接触させ、該プローブは（１）例えば図２中のｃＤＮＡ配列に より表されるｃＤＮ八配列配列り表されるひとつのＩＩＣＶ単離物の５’　ＬＩ Ｒのヌクレオチド−２９１位から一６６位に伸長するドメイン中の領域とハイブ リダイズすることができ、ここでその位置の負の番号はＨＣＶポリタンパク質を コードする塩基読み取り枠の初めの＾ＴＧコドンより前にあるヌクレオチドから 始まっており、あるいは該プローブは上記に定義したプローブに相補的であり、 一該プローブと同定すべきＨｃｖ単離物のヌクレオチド配列との間にあるいは形 成された複合体を検出し、およびハイブリダイゼーションパターンから存在する ＩＩｃＶ単離物のタイプ（または複数のタイプ）を判断する。
上述の方法は、他のＨＣＶ単離物との相同性の割合に従って該単離物を分類する 方法と考えることができ、単離物が同じタイプに属するという事実によれば： 完全ゲノム中の核酸水準で７４％より高い相同性を表す：または、ヌクレオチド ７９３５位と８２７４位との間にあるＮＳ５領域中の核酸水準で７４％より高い 相同性を表す。
またはその完全なポリタンパク質はアミノ酸水準で７８％より高い相同性を表す 、　またはアミノ酸２６４６位と２７５８位の間にあるＮＳ５領域は、アミノ酸 水準で８０％より高い相同性を表す】ならびに同じサブタイプに属するＨＣＶ単 離物は、完全ゲノム中の核酸水準で９０％より高い相同性、かつ完全ポリタンパ ク質中のアミノ酸水準で９０％より高い相同性を表す。
より好ましくは、上記方法は以下の事実によるＨＣＶ単離物の分類に関し、 （１）ヌクレオチド７９３５と８２７４位との間（Ｃｈｏｏら、１９９１）、ま たは８２６１と８６００との間（Ｋａｔｏら、１９９０）、または８３４２と８ ６８１との間（Ｏｋａｍｏｔｏら、１９９１）にあるＮ５５ｂ領域中の核酸配列 の系統発生的分析に基づき、同じＨＣＶタイプに属する単離物は、０３４より低 く、通常は０．３３より低（、より通常では０．３２より低いヌクレオチドディ スタンスを表し、そして同じサブタイプに属する単離物は０．１３５より低く、 通常は０．１３より低く、より通常では０１２５より低いヌクレオチドディスタ ンスを表し、その結果同じタイプに属するが、異なるサブタイプの単離物は０． １３５から０．３４の範囲、通常では０．１４から０３３の範囲、より通常では ０１５から０．３２の範囲のヌクレオチドディスタンスを表し、そして異なるＨ ＣＶタイプに属する単離物は０゜３４より高く、通常は０．３５より高く、より 通常では０３６より高いヌクレオチドディスタンスを表し、 （２）ヌクレオチド３７８と９５７との間にあるコア／Ｅｌ領域中の核酸配列の 系統発生的分析に基づき、同じＨＣＶタイプに属する単離物は、０．３８より低 く、通常は０．３７より低く、より通常では０．３６より低いヌクレオチドディ スタンスを表し、そして同じサブタイプに属する単離物は０．１７より低く、通 常は０．１６より低く、より通常では０１５より低いヌクレオチドディスタンス を表し、その結果同じタイプに属するが、異なるサブタイプの単離物は０１５か ら０．３８の範囲、通常では０．１６からｏ、３７の範囲、より通常では０．１ ７から０．３６の範囲のヌクレオチドディスタンスを表し、そして異なるＨＣＶ タイプに属する単離物は０．３６より高（、通常は０３６５より高く、より通常 では０．３７より高いヌクレオチドディスタンスを表し、（３）ヌクレオチド４ ６６４と５２９２との間（Ｃｈｏｏら、１９９１）、またはヌクレオチド４９９ ３と５６２１との間（Ｋａｔｏら、１９９０）、またはヌクレオチド５ｏ１７と ５６４５との間（Ｏｋａｍｏｔｏら、１９９１）にあるＮＳ３／ＮＳ４領域中の 核酸配列の系統発生的分析に基づき、同じＨＣＶタイプに属する単離物は、０． ３５より低く、通常は０．３４より低く、より通常では０．３３より低いヌクレ オチドディスタンスを表し、そして同じサブタイプに属する単離物はｏ、１９よ り低く、通常は０１８より低く、より通常では０．１７より低いヌクレオチドデ ィスタンスを表し、その結果同じタイプに属するが、異なるサブタイプの単離物 は０゜１７から０．３５の範囲、通常では０．１８から０，３４の範囲、より通 常では０．１９から０．３３の範囲のヌクレオチドディスタンスを表し、そして 異なるＨＣＶタイプに属する単離物は０．３３より高ぐ、通常は０．３４より高 く、より通常では０．３５より高いヌクレオチドディスタンスを表す。
“被検体鎖”という用語は、生物学的試料中に存在するがもじれない配列を含有 すると疑われる一本の、または二本鎖の核酸分子に対応し、該被検体鎖は直接的 に検出されるか、または増幅後に検出される。この被検体鎖は好ましくは陽性の 、または陽性鎖のＲＮＡ５ｃＤＮ＾または増幅されたｃＤＮ＾である。
“生物学的試料”という表現は、ＨＣＶ配列を含有する任意の生物学的試料（組 織または流体）を言い、より具体的には血液、血清または血漿試料を言う。
タイプまたはサブタイプ特異的標的領域間（あるとすれば）と、上述のプローブ 間に形成されたハイブリッドの検出は、使用するレポーター分子（ｒｅｐｏｒｔ ｅｒ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の性質（プローブ上、または標的とする被検体鏡上の いずれかに存在する）に依存し、ならびに比色、蛍光、放射検出、または従来技 術を含む任意の他の方法による手段によって測定することができる。
“（ＨＣＶ）単離物”という用語は自然に感染したヒト、または実験的に感染さ せた動物から得たＣ型肝炎ウィルスの遺伝物質を含有する任意の生物学的流体を も言い、ならびにインビトロの実験で得たＣ型肝炎ウィルス遺伝物質を含有する 流体を言う。例えば、インビトロ培養実験由来の細胞および生育培地の両方をＩ ＩｃＶ遺伝物質の源として使用することができる。
”ハイブリダイズ”、または゛標的°゛という表現は、任意の周知技術に従い行 われるハイブリダイゼーション実験を言い、ならびに相同的標的（ひとつまたは ２〜３の誤対合を含む）、または好ましくは完全な相同的標的（誤対合は認めら れない）の検出を可能とする。
本発明において、感受性のあるＰＣＲ法が、入れ千秋に重複した万能プライマー の組み合わせ（ｓｅｔ　ｏｆ　ｎｅｓｔｅｄ、　ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ｐｒｉｍ ｅｒ）を用いて、高度に保存された５’　ＯＲのために使用された。これらプラ イマーの位置および配列は、すでに報告されているタイプ１および２配列、なら びにタイプ３配列ＢＲ５６（図２）から誘導された。得られた増幅生成物を、５ ゛υＲの可変領域に対して定位の、膜片上に平行線として固定された（逆−ハイ ブリダイゼーション法：ｒｅｖｅｒｓｅ−ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｐｒｉ ｃｉｐｌｅ）オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる。このハイブリダイゼ ーションアッセイは、ラインプローブアッセイ（ｌｉｎｅ　ｐｒｏｂｅ　ａｓｓ ｅｙ：ＬｉＰＡ）と呼ばれるが、迅速なアッセイであり、この方法により以前は 不完全に記載されたｚ４、Ｚ６およびＺ７（Ｂｕｋｈら１９９２）と同様の単離 物が検出された。これらＩＩｃＶ株に関する新しいタイプ４の分類が提案されて いる。ＢＥ９５およびＢＥ９６、ならびにＳ＾１（Ｃｈａら、１９９２）と同様 な他の単離物が識別でき、タイプ５ａのような単離物を分類することが提案され ている。１ｔＫ２（Ｂｕｋｈら、１９９２）と同様な単離物を区別することがで き、新たなタイプ６ａの分類が提案されている。
単離物ＢＥ９８中に新たな遺伝子型が検出され、この単離物をＨＣｖタイプ３、 サブタイプ３ｃに分類することが提案されている。別の新たな配列がＧＢ４３８ 中に検出され、これは４ｆに分類することができた。このＬｉＰＡ法は、患者血 清中に存在するＨＣＶタイプおよびそれらのサブタイプを容易かつ早く決定する ことを可能にする。
本発明の好適な態様によれば、少なくともふたつのプローブを含むプローブの組 が使用される。
好適な態様によれば、本発明の方法において、使用するプローブは以下のひとつ のドメイン中の少なくとも５ヌクレオチドの領域を標的とする・ ａ）図２のヌクレオチド−２９３位からヌクレオチド−２７８位に伸長するもの ｂ）図２のヌクレオチド−２７５位からヌクレオチド−２６０位に伸長するもの Ｃ）図２のヌクレオチド−２５３位からヌクレオチド−２３８位に伸長するもの ｄ）図２のヌクレオチド−２４４位からヌクレオチド−２２９位に伸長するもの ｅ）図２のヌクレオチド−２３８位からヌクレオチド−２２３位に伸長するもの ｆ）図２のヌクレオチド−１７０位からヌクレオチド−１５５位に伸長するもの ｇ）図２のヌクレオチド−１４１位からヌクレオチド−１１７位に伸長するもの ｈ）図２のヌクレオチド−８３位からヌクレオチド−６８位に伸長するもの ｉ）図２のヌクレオチド−１０３位からヌクレオチド−８８位に伸長するもの ｊ）ヌクレオチド−１４６位からヌクレオチド−１３０位に伸長するもの。
領域−１７０から−１５５、および−１４１から−１１７はウィルスＲＮＡ中の 同じステム（ｓｔｅｍ）の部分となることができる゛直線配列中の可変領域を表 す。したがってひとつの領域中での突然変異は、もうひとつの領域のもうひとつ の突然変異により補われ、ＲＮＡ二重二重形成が可能となるが、またはならない 。変異は他の新しいタイプのＨＣＶにも同じ位置で同様に起こると思われ、それ ゆえにこれらの可変領域は現在の、および未だ発見されていないが、今後発見さ れるであろうすべてのＨＣｖタイプを識別するための道具となるであろう。
もうひとつの態様によれば、本発明は少なくとも以下のひとつの配列を標的とす るような配列を含んで成るプローブに関する：ＡＡＴＴＧＣＣＡＧＧＡＣＧＡＣ Ｃ（配列番号：５）ＴＣＴ　ＣＣＡ　ＧＧＣＡＴＴ　ＧＡＧ　Ｃ（配列番号二６ ）ＣＣＧ　ＣＧＡ　ＧＡＣＴＧＣＴＡＧ　Ｃ（配列番号ニア）ＴＡＧ　ＣＧＴ　 ＴＧＧ　ＧＴｒ　ＧＣＧ　Ａ　、　（配列番号：　８　）ｎＲＣＣＧ　ＧＲＡ　 ＡＧＡ　ＣＴＧ　Ｇ　（配列番号：　９　）ＴＧＲＣＣＧ　ＧＧＣＡＴＡ　ＧＡ Ｇ　Ｔ　（配列番号：１０）ＴＴＡ　ＣＣＧ　ＧＧＡ　ＡＧＡ　ＣＴＧ　Ｇ　（ 配列番号：１１）ＴＧＡ　ＣＣＧ　ＧＡＣＡＴＡ　ＧＡＧ　Ｔ　（、配列番号： １２）ＡＡＴ　ＣＧＣＴＧＧ　ＧＧＴ　ＧＡＣＣ（配列番号＝１３）ＴｒＴ　Ｃ ＴＧ　ＧＧＴ　ＡＴＴ　ＧＡＧ　Ｃ（配列番号：１４）ＴＣＴ　ＴＧＧ　ＡＧＣ ＡＡＣＣＣＧ　Ｃ（配列番号＝１５）ＴＣＴ　ＴＧＧ　ＡＡＣＡＡＣＣＣＧ　Ｃ （配列番号＝１６）ＡＡＴ　ＹＧＣＣＧＧ　ＧＡＴ　ＧＡＣＣ（配列番号＝１７ ）ＴＴＣＴｒＧ　ＧＡＡ　ＣＴＡ　ＡＣＣＣ（配列番号：１８）ＴｒＴ　ＣＣＧ 　ＧＧＣＡＴｒ　ＧＡＧ　Ｃ（配列番号：１９）ＴＴＧ　ＧＧＣＧＹＧ　ＣＣＣ ＣＣＧ　Ｃ（配列番号：２０）ＣＣＧ　ＣＧＡ　ＧＡＴ　ＣＡＣＴＡＧ　Ｃ（配 列番号、２１）ＣＣＧ　ＧＧＡ　ＡＧＡ　ＣＴＧ　ＧＧＴ　Ｃ（配列番号：２２ ）ＣＣＧ　ＧＡＡ　ＡＧＡ　ＣＴＧ　ＧＧＴ　Ｃ（配列番号：２３）ＡＣＣＣＡ ＣＴＣＴ　ＡＴＧ　ＣＣＣＧ　（配列番号、２４）ＡＣＣＣＡＣＴＣＴ　ＡＴＧ 　ＴＣＣＧ　（配列番号：２５）ＡＴＡ　ＧＡＧ　ＴＧＧ　ＧＴｒ　ＴＡＴ　Ｃ ，（配列番号＋　２６　）ＴＣＴ　ＧＣＧ　ＧＡＡ　ＣＣＧ　ＧＴＧ　Ａ　（配 列番号：２７）ＡＡＴ　ＴＧＣＣＡＧ　ＧＡＹ　ＧＡＣＣ（配列番号：２８）Ｇ ＣＴ　ＣＡＧ　ＴＧＣＣＴＧ　ＧＡＧ　Ａ　（配列番号・２９）ＣＣＧＣＧＡＧ ＡＣＹＧＣＴＡＧＣ（配列番号・３０）本図２のヌクレオチド−１７０位からヌ クレオチド−１５５位に伸長するもの、および図２のヌクレオチド−８３位から ヌクレオチド−６８位に伸長するもの、 本図２のヌクレオチド−１４１位からヌクレオチド−１１７位に伸長するもの、 および図２のヌクレオチド−８３位からヌクレオチド−６８位に伸長するもの、 本図２のヌクレオチド−１７０位からヌクレオチド−１５５位に伸長するもの、 および図２のヌクレオチド−１４６位からヌクレオチド−１３０位に伸長するも の、 本図２のヌクレオチド−１３２位からヌクレオチド−１１７位に伸長するもの、 および図２のヌクレオチド−１４６位からヌクレオチド−１３０位に伸長するも の、・ 本図２のヌクレオチド−１４６位からヌクレオチド−１３０位に伸長するもの、 および図２のヌクレオチド−１０３位からヌクレオチド−８８位に伸長するもの 。
本発明はまたニ 一次の配列：　ＴＴＣ丁ＴＧ　ＧＡＡ　ＣＴＡ　ＡＣＣＣ。
−またはＴがＵに置換された対応する配列−または上記に定義した配列に相補的 な配列を標的とするような配列を有するプローブに関する。
本発明はまた、２種のプローブの組、または２種のプローブの混合物に関し、こ こで各２種のプローブは１０から４０の連続的ヌクレオチドから成り、およびこ こで２種のプローブは以下のドメインの対の中からそれぞれ選ばれたふたつの領 域をそれぞれ標的とする：本図２のヌクレオチド−１７０位からヌクレオチド− １５５位に伸長するもの、および図２のヌクレオチド−１４１位からヌクレオチ ド−１１７位に伸長するもの、 本図２のヌクレオチド−１７０位からヌクレオチド−１５５位に伸長するもの、 および図２のヌクレオチド−１０３位からヌクレオチド−８８位に伸長するもの 、 本図２のヌクレオチド−１４１位からヌクレオチド−１１７位に伸長するもの、 および図２のヌクレオチド−１０３位がらヌクレオチド−８８位に伸長するもの 、 本図２のヌクレオチド−１７０位からヌクレオチド−１５５位に伸長するもの、 および図２のヌクレオチド−８３位からヌクレオチド−６８位に伸長するもの、 本図２のヌクレオチド−１４１位からヌクレオチド−１１７位に伸長するもの、 および図２のヌクレオチド−８３位からヌクレオチド−６８位に伸長するもの、 本図２のヌクレオチド−１７０位からヌクレオチド−１５５位に伸長するもの、 および図２のヌクレオチド−１４６位からヌクレオチド−１３０位に伸長するも の、 本図２のヌクレオチド−１３２位からヌクレオチド−１１７位に伸長するもの、 および図２のヌクレオチド−１４６位からヌクレオチド−１３０位に伸長するも の、 本図２のヌクレオチド−１４６位からヌクレオチド−１３０位に伸長するもの、 および図２のヌクレオチド−１０３位からヌクレオチド−８８位に伸長するもの 。
好適な態様によれば、本発明は少な（ともひとつの次のＨＣＶタイプ：１ｌＣｖ タイプ１、ＨＣｖタイプ２、ＩＩｃＶタイプ３、ＨＣＶタイプ４、ＨＣＶタイプ ５、オヨヒＨＣＶタイプ６に属するＩＩｃＶ単離物を、それらが含まれると思わ れる生物学的試料中からタイピングする法に関し、以下の工程を含んで成るニー 試料中のりポヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドがすでに接近できる ようにされている上記試料を、必要に応じて適当な変性条件下で、図２および４ 中のｃＤＮＡ配列により表されるＩＩｃＶ単離物の５°ＵＲのヌクレオチド−２ ９１位からヌクレオチド−６６位に伸長するドメイン中の領域とハイブリダイズ することができる少なくともひとつのプローブと接触させ、ここでヌクレオチド 位置の負の番号はＨＣｖポリタンパク質をコードする塩基読み取り枠の初めのコ ドンよりも前にあるヌクレオチドから始まっており、あるいは該プローブは上記 に定義したプローブに相補的でありニ ー該プローブと標的領域間にあるいは形成された複合体を検出し。
一観察されたハイブリダイゼーションパターンから存在する１１ＣＶタイプを判 断する。
好適な態様によれば、本発明は少な（ともひとつの次のＨＣＶタイプ、ＨＣｖタ イプ１、ＩＩＣＶタイプ２、ＩＩｃＶタイプ３、ＩＩＣＶタイプ４、ＩＩＣｖタ イプ５、オヨヒＨＣＶタイプ６に属するＩＩＣＶ単離物のタイピング法に関し、 ならびに使用するプローブは以下の標的領域、またはＴがＵに置換された該領域 、あるいはそのように定義した領域に相補的な領域のひとつを標的とすることが できるようになっている。
ＨＣＶタイプ１および６について： ＡＡＴＴＧＣＣＡＧＧＡＣＧＡＣＣ（Ｎｏ、５）ＴＣＴＣＣＡＧＧＣＡＴＴＧＡ ＧＣ（Ｎｏ、６）ＡＡＴＴＧＣＣＡＧＧＡＹＧＡＣＣ（Ｎｏ、２８）ＨＣＶタイ プ１について： ＧＣＴＣＡＧＴＧＣＣＴＧＧＡＧＡ（Ｎｏ、２９）ＴｒＲＣＣＧＧＲＡＡＧＡＣ ＴＧＧ（Ｎｏ、９）ＴＧＲＣＣＧＧＧＣＡＴＡＧＡＧＴ（Ｎｏ、１０）ＴｒＡＣ ＣＧＧＧＡＡＧＡＣＴＧＧ（Ｎｏ、１１）ＴＧＡＣＣＧＧＡＣＡＴＡＧＡＧＴ（ Ｎｏ、１２）ＣＧＴＡＣＡＧＣＣτＣＣＡＧＧＣ（Ｎｏ、３２）ＣＣＧＧＧＡＡ ＧＡＣＴＧＧＧＴＣ（Ｎｏ、２２）ＣＣＧＧＡＡＡＧＡＣＴＧＧＧＴＣ（Ｎｏ、 ２３）ＡＣＣＣＡＣＴＣＴＡＴＯＣＣＣＧ（Ｎｏ、２４）ＡＣＣＣＡＣＴＣＴＡ ＴＧＴＣＣＧ（Ｎｏ、２５）ＡＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴｒＴＡＴＣ（ｔＪｏ、２６ ）ＧＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴｒＣＣＴＧ（Ｎｏ、３３）ＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡｎ’ ＴＧＧＧ（Ｎｏ、３４）゛ｒ口’ＣＴＧＧＧＴＡＴｒＧＡＧＣ（Ｎｏ、１４）Ｃ ＣＧＣＧＡＧＡＴＣＡＣＴＡＧＣ（Ｎｏ、２１）ＣＣＧＣＡＡＧＡＴＣＡＣＴＡ ＧＣ（Ｎｏ、３６）ＧＡＡＴＣＧＣＣＧＧＧＴＴＧＡＣ（Ｎｏ、５４）ＨＣＶ　 ９イブ４１：′Ｌ１て　ＧＡＧＴＧＴＴＧＴＡＣＡＧＣＣＴ（Ｎｏ、３７）ＧＡ ＧＴＧＴＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴ（Ｎｏ、３９）ＡＡＴ　ＣＧＣＣＧＧ　ＧＡＣＧ ＡＣＣ（Ｎｏ、　４０）ＡＡＴＧＣＣＣＧＧＣＡＡＴｒＴＧ（Ｎｏ、４１）ＡＡ ＴＣＧＣＣＧＡＧＡＴＧＡＣＣ（Ｎｏ、４２）ＡＡＴＧＣＴＣＧＧＡＡＡＴＴｒ Ｇ（Ｎｏ、４３）ＡＡＴＣＧＣＣＡＧＧＡＴＧＡＣＣ（Ｎｏ、４９）ＴＧＣＣＴ ＧＧＡＡＡＴＴＴＧＧＧ（Ｎｏ、５０）ＧＧＡＡＴＣＧＣＣＡＧＧＡＣＧＡ（Ｎ ｏ、５３）ＡＡＴＴＧＣＣＧＧＧＡＣＧＡＣＣ（ト）ｏ、　４７）ＴＣＴＣＣＧ ＧＧＣＡＴｒＧＡＧＣ（Ｎｏ、４６）ＧＡＧＴＧＴＣＧＡＡＣＡＧＣＣＴ（Ｎｏ 、４４）配列中、ＹはＣまたはＴを表し、そしてＫはＧまたはＴを表すが、ある いは使用するプローブは上記に定義したプローブの中から選択されたふたつのプ ローブの組である。
本発明はまた生物学的試料中に存在するＩ（ＣＶ単離物のタイプ（および複数の タイプ）を決定する上記方法の使用に関する。
“タイプという用語は、その群の他の単離物のゲノムに対して、ＨＣＶ単離物の 完全なゲノムが核酸水準で７４％より高い相同性を表す、またはＩ（Ｃｖ単離物 のヌクレオチド７９３５位と８２７４位間にあるＮＳ５領域が核酸水準で７４％ より高い相同性を表す、またはＩＩＣＶ単離物の完全なポリタンパク質がアミノ 酸水準で７８％より高い相同性を表す、またはそのアミノ酸２６４６位と２７５ ８位間にあるＮＳ５領域がアミノ酸水準で８０％より高い相同性を表すＩＩＣＶ 単離物の群に対応し、ここで上記番号は、ＨＣＶ−Ｊ単離物のＨＣＶポリタンパ ク質の最初のＡＴＧコドンまたはメチオニンから始まる（Ｋａｔｏら、１９９０ ）。
異なるタイプのＨＣＶに属する単離物は核酸水準で７４％より低（、かつアミノ 酸水準で７８％より低い相同性を表す。同じタイプに属する単離物が、同じサブ タイプに属する時、核酸水準で通常約９２から９５％、かつアミノ酸水準で９５ から９６％の相同性を表し、ならびに同じタイプに属するが異なるサブタイプに 属するものは核酸水準で約７９％、かつアミノ酸水準で８５−８６％の相同性を 表す。より好ましくはＩＩｃＶ単離物の分類は以下の事実に従い行われるべきで ある、 （１）ヌクレオチド７９３５と８２７４との間（Ｃｈｏｏら、１９９１）、また は８２６１と８６００との間（Ｋａｔｏら、１９９０）、または８３４２と８６ ８１との間（Ｏｋａｍｏｔｏら、１９９１）にあるＮ５５ｂ領域中の核酸配列の 系統発生的分析に基づき、同じＩＩｃＶクイブに属する単離物は、０．３４より 低く、通常は０．３３より低く、より通常では０．３２より低いヌクレオチドデ ィスタンスを表し、そして同じサブタイプに属する単離物は０１３５より低く、 通常は０．１３より低く、より通常では０゜１２５より低いヌクレオチドディス タンスを表し、その結果同じタイプに属するが、異なるサブタイプの単離物は０ １３５から０．３４の範囲、通常は０゜１４から０．３３の範囲、より通常では ０．１５から０．３２の範囲のヌクレオチドディスタンスを表し、および異なる ＩＩｃＶタイプに属する単離物は０．３４より高く、通常は０．３５より高く、 より通常では０．３６より高いヌクレオチドディスタンスを表し、 （２）ヌクレオチド３７８と９５７との間にあるコア／Ｅｌ領域中の核酸配列の 系統発生的分析に基づき、同じＨＣＶタイプに属する単離物は、０．３８より低 く、通常は０．３７より低（、より通常では０．３６より低いヌクレオチドディ スタンスを表し、そして同じサブタイプに属する単離物は０．１７より低く、通 常は０．１６より低（、より通常では０．１５より低いヌクレオチドディスタン スを表し、その結果同じタイプに属するが、異なるサブタイプの単離物は０．１ ５から０．３８の範囲、通常では０．１６から０．３７の範囲、より通常では０ ．１７から０．３６の範囲のヌクレオチドディスタンスを表し、そして異なるＨ ＣＶタイプに属する単離物は０．３６より高く、通常は０．３６５より高く、よ り通常では０．３７より高いヌクレオチドディスタンスを表し、（３）ヌクレオ チド４６６４と５２９２との間（Ｃｈｏｏら、１９９１）、またはヌクレオチド ４９９３と５６２１との間（Ｋａｔｏら、１９９０）、またはヌクレオチド５０ １７と５６４５との間（Ｏｋａｍｏｔｏら、１９９１）にあるＮＳ３／ＮＳ４領 域中の核酸配列の系統発生的分析に基づき、同じＨＣＶタイプに属する単離物は 、０．３５より低く、通常は０３４より低く、より通常では０．３３より低いヌ クレオチドディスタンスを表し、そして同じサブタイプに属する単離物は０．１ ９より低（、通常は０．１８より低く、より通常では０１７より低いヌクレオチ ドディスタンスを表し、その結果同じタイプに属するが、異なるサブタイプの単 離物は０゜１７から０．３５の範囲、通常では０１８から０．３４の範囲、より 通常では０．１９から０．３３の範囲のヌクレオチドディスタンスを表し、そし て異なるＩ（ＣＶタイプに属する単離物は０．３３より高く、通常は０．３４よ り高く、より通常では０３５より高いヌクレオチドディスタンスを表す。
本発明の好適な態様によれば、タイプ１を同定するために、配列番号５．２８お よび６を用いて設計された任意のプローブを使用することができる：タイプ２を 同定するために、配列番号８から１２、または２２から２６、および３２から３ ４を用いた任意のプローブを使用することができる：ならびにタイプ３を同定す るために、配列番号１３．１４．３６．２１、または５４を用いた任意のプロー ブを使用することができる。ならびにタイプ４を同定するために、配列番号１７ ．１８、または１９および３７がら４３、および配列番号４９．５０および５３ を用いた任意のプローブを使用することができる。
プローブ４４から４７はタイプ５を、プローブ４８はタイプ６を同定するために 使用できる。
以下の領域は特定のタイプを識別するために使用できる：タイプ２について一２ ３８位から一２２３位間にある領域、タイプ４について−２４４から一２２９位 間にある領域、タイプ３について一２５３位から一２３８位間、または−２７５ 位から一２６０位間、または−２９３位から一２７８位間にある領域。
−２位のヌクレオチドはさらに特定のタイプまたはサブタイプ間を識別するため にも使用できる。
本発明の方法はまたＨＣＶのサブタイプを識別および分類することを含んで成り 、ここで上述のプローブに加えて、以下の標的領域とハイブリダイズするプロー ブ、あるいはＴがＵに置換されている該領域、またはこのように定義した領域に 相補的な領域も使用される、ＨＣＶタイプ１、ｉブタイブ１ａについてＣＣＣＣ ＧＣＡＡＧＡＣＴＧＣＴＡ（Ｎｏ、３１）ＨＣＶタイプ１、サブタイプ１ｂにつ ＬｌでＣＣＧＣＧＡＧＡＣＴＧＣＴＡＧＣＣＮｏ、７）ＣＣＧＣＧＡＧＡＣＹＧ ＣＴＡＧＣ（Ｎｏ、３０）配列中ＹはＣまたはＴを表し、 ＨＣＶタイプ２、サブタイプ２ａに２いて。
ＴＴＲＣＣＧＧＲＡＡＧＡＣＴＧＧ（Ｎｏ、９）ＴＧＲＣＣＧＧＧＣＡＴＡＧＡ ＧＴ（Ｎｏ、ＩＱ）ＣＣＧＣ３ＧＡＡＧＡＣ丁ＧＧＧＴＣ（Ｎｏ、２２）ＡＣＣ ＣＡＣＴＣＴＡＴＧＣＣＣＧ（Ｎｏ、２４）配列中ＲはＡまたはＧを表し、 ＨＣＶタイプ２、サブタイプ２ｂについてＩＴＡＣＣＧＧＧＡＡＧＡＣＴＧＧ　 （Ｎｏ、１１）ＴＧＡＣＣＧＧＡＣＡＴＡＧＡＧＴ（Ｎｏ、１２）ＣＣＧＧＡＡ ＡＧＡＣＴＧＧＧＴＣ（Ｎｏ、２３）ＡＣＣＣＡＣＴＣＴＡＴＧＴＣＣＧ（Ｎｏ 、２５）ＨＣＶタイプ２、サブタイプ２ｃについて。
ＧＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴｒＣＣＴＧ（Ｎｏ、３３）ＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＴＴＴ ＧＧＧ（Ｎｏ、３４）ＨＣＶタイプ３、サブタイプ３ａについてＡＡＴＣＧＣＴ ＧＧＧＧＴＧＡＣＣ（Ｎｏ、１３）ＴＴＴＣＴＧＧＧＴＡＴｒＧＡＧＣ（Ｎｏ、 １４）ＴＫＴＣＴＧＧＧＴＡＴｒＧＡＧＣ（Ｎｏ、３５）配列中にはＧまたはＴ を表し、 ＨＣＶタイプ３、サブタイプ３ｂについてＴＴＴＣＣＧＧＧＣＡＴＴＧＡＧＣ（ Ｎｏ、１９）ＡＡＴＣＧＣＣＧＧ　ＧＡ丁ＧＡＣＣ（Ｎｏ、３８）ＣＣＧＣＧＡ ＧＡＴＣＡＣＴＡＧＣ（Ｎｏ、２１）ＨＣＶタイプ３、サブタイプ３Ｃについて ＧＡＧＴＧＴＣＧＴＡＣＡＧＣＣＴ　（Ｎｏ、５１）ＧＡＡＴＣＧＣＣＧＧＧＴ ＴＧＡＣ（Ｎｏ、５４）゛「ローＣＣＧＧＧＣＡＴＴＧＡＧＣ（Ｎｏ、１９）Ｃ ＣＧＣＧＡＧＡＣＴＧＣＴＡＧＣ（Ｎｏ、７）ＨＣＶタイプ４、サブタイプ４ａ または４ｄについてＡＡＴＣＧＣＣＧＧＧＡＴＧＡＣＣ（ｔＪｏ、３８）Ｌ丁Ｃ ＣＧ　ＧＧＣＡＴＴ　ＧＡＧ　Ｃ（Ｎｏ、　１９）ＡＡＴ　ＧＣＣＣＧＧ　ＣＡ Ａ　ＴＴＴ　Ｇ　（Ｎｏ、　４１）ＡＡＴ　ＣＧＣＣＧＧ　ＧＡＣＧＡＣＣ（Ｎ ｏ、　４０）タイプ４、サブタイプ４ｃについて ＡＡＴＣＧＣＣＧＡＧＡＴＧＡＣＣ（Ｎｏ、４２）ＡＡＴＧＣＴＣＧＧＡＡＡＴ ｒＴＧ（Ｎｏ、４３）ＴＧＣＣＴＧＧＡＡＡＴＴＴＧＧＧ（Ｎｏ、５０）ＧＧＡ ＡＴＣＧＣＣＡＧＧＡＣＧＡ（ｈＪｏ、５３）ＣＣＧＣＧＡＧＡＣＴＧＣＴＡＧ Ｃ（Ｎｏ、７）タイプ４、サブタイプ４ｅについて： ＡＡＴＣＧＣＣＧＧＧＡＣＧＡＣＣ（Ｎｏ、４０）ＧＡＧＴＧＴＴＧＴＧＣＡＧ ＣＣＴ（Ｎｏ、３９）ＡＡＴＧＣＣＣＧＧＣＡＡＴｒＴＧ（ｈＪｏ、４１）タイ プ４、サブタイプ４ｆについて ゛「ローＣＣＧＧＧＣＡｎ″ＧＡＧＣ（Ｎｏ、１９）ＡＡＴＣＧＣＣＧＧＧＡＴ ＧＡＣＣ（Ｎｏ、３８）ＧＡＧＴＧＴＣＧＴＡＣＡＧＣＣＴ（Ｎｏ、５１）ＣＣ ＧＣＧＡＧＡＣＴＧＣＴＡＧＣ（Ｎｏ、７）タイプ４、サブタイプ４ｇ（暫定的 ）について。
ＴＧＣＣＴＧＧＡＡＡＴＴＴＧＧＧ（Ｎｏ、５０）ＧＧＡＡＴＣＧＣＣＡＧＧＡ ＣＧＡ（ｈＪｏ、５３）タイプ４、サブタイプ４ｈ（暫定的）について・ＡＡＴ ＣＧＣＣＡＧＧＡＴＧＡＣＣ（Ｎｏ、４９）ＴＧＣＣＴＧＧＡＡＡＴＴＴＧＧＧ （Ｎｏ、５０）または使用するプローブは定義したプローブの中から選択された ふたつのプローブの組である。
本発明はまた分析すべき生物学的試料中に存在するＩＩｃＶサブタイプ（および 複数のザブタイプ）の上記決定方法の使用に関する。
゛サブタイプという用語は、同じ群の他の単離物のゲノムの対応部分に対して、 ＩＩＣＶ単離物の完全なゲノムまたは完全なポリタンパク質が、核酸水準および アミノ酸水準の両方で９０％より高い相同性を表す、またはＯＣＶ単離物のヌク レオチド７９３５位と８２７４位間にあるＮＳ５領域が核酸水準で８８％より高 い相同性を表すＨＣＶ単離物の群を言う。ここで上記番号は、長ＯＬＲの開始コ ドンのアデニン残基から始まる。異なるＩＩＣＶサブタイプに属し、かつ同じＨ ＣＶタイプに属する単離物は、核酸水準で７４％より高く、かつアミノ酸水準で ７８％より高い相同性を表す。
より好ましくはＨＣＶ単離物のタイプまたはサブタイプへの分類に関する上記方 法は以下の事実に従い行われるべきである、（１）ヌクレオチド７９３５と８２ ７４との間（Ｃｈｏｏら、１９９１）、または８２６１と８６００との間（Ｋａ ｔｏら、１９９０）、または８３４２と８６８１との間（Ｑｌ（Ｂｍｏｔｏら、 １９９１）にあるＮ５５ｂ領域中にある核酸配列の系統発生的分析に基づき、同 じＩＩＣＶタイプに属する単離物は、０．３４より低く、通常は０．３３より低 く、より通常では０３２より低いヌクレオチドディスタンスを表し、そして同じ サブタイプに属する単離物は０．１３５より低く、通常は０．１３より低く、よ り通常では０．１２５より低いヌクレオチドディスタンスを表し、その結果同じ タイプに属するが、異なるザブタイプの単離物は０．１３５から０．３４の範囲 、通常では０１４から０３３の範囲、より通常では０．１５から０．３２の範囲 のヌクレオチドディスタンスを表し、そして異なるＨｃｖタイプに属する単離物 は０３４より高く、通常は０３５より高く、より通常では０．３６より高いヌク レオチドディスタンスを表し、 （２）ヌクレオチド３７８と９５７との間にあるコア／Ｅｌ領域中にあるの核酸 配列の系統発生的分析に基づき、同じＩＩＣＶタイプに属する単離物は、０．３ ８より低く、通常は０３７より低く、より通常では０．３６より低いヌクレオチ ドディスタンスを表し、そして同じサブタイプに属する単離物は０．１７より低 く、通常は０１６より低く、より通常では０．１５より低いヌクレオチドディス タンスを表し、その結果同じタイプに属するが、異なるサブタイプの単離物は０ ．１５から０．３８の範囲、通常では０．１６から０．３７の範囲、より通常で は０．１７から０．３６の範囲のヌクレオチドディスタンスを表し、そして異な るＨＣＶタイプに属する単離物は０．３６より高く、通常は０．３６５より高く 、より通常では０．３７より高いヌクレオチドディスタンスを表し、（３）ヌク レオチド４６６４と５２９２との間（Ｃｈｏｏら、１９９１）、またはヌクレオ チド４９９３と５６２１との間（Ｋａｔｏら、１９９０）、またはヌクレオチド ５ｏ１７と５６４５との間（Ｏｋａｍｏｔｏら、１９９１）にあるＮＳ３／ＮＳ ４領域中の核酸配列の系統発生的分析に基づき、同じＨＣＶタイプに属する単離 物は、０．３５より低く、通常は０３４より低く、より通常では０．３３より低 いヌクレオチドディスタンスを表し、そして同じサブタイプに属する単離物は０ ．１９より低く、通常は０．１８より低く、より通常では０．１７より低いヌク レオチドディスタンスを表し、その結果同じタイプに属するが、異なるサブタイ プの単離物は０１７から０．３５の範囲、通常では０．１８から０．３４の範囲 、より通常では０．１９がら０．３３の範囲のヌクレオチドディスタンスを表し 、そして異なるＨＣＶタイプに属する単離物は０．３３より高く、通常は０．３ ４より高く、より通常では０．３５より高いヌクレオチドディスタンスを表す。
これらの基準を使用してＩＩｃＶ単離物は少なくとも６つのタイプに分類するこ とができる。
数種のサブタイプは、５’　ＵＲ，および７９３５位と８２７４位の間にあるＮ Ｓ５の部分を含むコード領域、およびヌクレオチド３１７と９５７の間にあるＣ ／Ｅｌ領域の相同性に基づき、ならびにＢｕｋｈらにより記載された（１９９３ ）単離物Ｚ１とＤＫ１３との比較に基づき、確実にタイプ１．２．３および４に 識別できる（１ａ、　Ｉｂ、　２ａ、　２ｂ、　２ｃ、　３ａ、　３ｂ、　３ｃ 、　４ａ、　４ｂ、　４ｃ、　４ｄ、　４ｅおよび４ｆ）。
さらにタイプ４のサブタイプ４ｇおよび４ｈへの細分は試案であり、５’　ＵＲ 中の差異に基づくだけである。報告されたほとんどの単離物、および本発明のタ イピング系により提案された分類の総覧を表１に与える。
本発明の好適な態様によれば、配列番号３１を使用したプローブはサブタイプ１ ａを同定するために使用でき；配列番号７および３０を使用したプローブはサブ タイプ１ｂを同定するために使用でき；配列番号９．１０．２２、または２４を 使用した任意のプローブはサブタイプ２ａを同定するために使用でき；配列番号 １１．１２．２３、または２５を使用した任意のプローブはサブタイプ２ｂを同 定するために使用でき：配列番号３３、または３４を使用した任意のプローブは サブタイプ２ｃを同定するために使用でき：配列番号１３．１４または３５を使 用した任意のプローブはサブタイプ３ａを同定するために使用でき：配列番号３ ８．１９および２１を使用した任意のプローブはサブタイプ３ｂ、４ａまたは４ ｄを同定するために使用でき、配列番号３８、または４１を使用した任意のプロ ーブはサブタイプ４ｂを同定するために使用でき：配列番号４２、または４３を 使用した任意のプローブはサブタイプ４Ｃを同定するために使用でき；配列番号 ３９．４０または４１を使用した任意のプローブは同定するために使用でき４ｅ 、　５１．３８．１９または７：４ｆ；配列番号４９、または５０を使用した任 意のプローブは推定上のサブタイプ４ｈを同定するために使用でき；配列番号５ ０、または５３を使用した任意のプローブは推定上のサブタイプ４ｇを同定する ために使用できる。
本発明の方法の好適な態様によれば、識別すべき）ＩＣＶタイプまたはサブタイ プはＩＩＣＶのための万能プローブにより同定することができ、それは以下のひ とつの領域を標的とするようなものである。
ＴＴＧ　ＧＧＣＧＹＧ　ＣＣＣＣＣＧ　Ｃ（Ｎｏ、２０）ＴＣＴ　ＧＣＧ　ＧＡ Ａ　ＣＣＧ　ＧＴＧ　Ａ　（Ｎｏ、２７）本発明の方法のもうひとつの有利な態 様によれば、ハイブリダイゼーションの工程は標的する領域を含有するデオキシ リボヌクレオチドまたはりボヌクレオチドの増幅工程によって進められ、有利に 以下の工程を含んで成る。
一タイプまたはサブタイプを決定すべき単離物を含有すると思われる生物学的試 料を、標的する領域を含むプライマーの組と接触させ、ここで該プライマーはＩ ＩＣＶゲノムの保存領域と相補的であり、および好ましくはプライマーはＨＣＶ ゲノムの５゛非翻訳保存領域に相補的であり、該プライマーは好ましくは少な（ とも８個の連続的ヌクレオチド、より好ましくは約１５個の、さらにより好まし くは１５個より多（の連続的ヌクレオチドを有し、該連続的ヌクレオチドはそれ ぞれ図２および４のヌクレオチド−３４１からヌクレオチド−１７１に伸長する 領域、およびヌクレオチド−６７からヌクレオチド−１に伸長する領域から選ば れた配列に相補的である。
あるいは、アンチセンスプライマーもコア領域に伸長することができ、あるいは プライマーの組は５’　ＯＲおよびコア領域の両方（ＰＣＨの１断片中にか、ま たはそれぞれふたつの領域のためのプライマーの組）を増幅することを目的とし てもよいか、または目的とする。したがって、コア領域からのプローブは、コア ＰＣＲ生成物中の（サブ）タイプに特異的な領域にハイブリダイズすることがで き、ダイブおよび／またはサブタイプをさらに識別するためのプローブアッセイ 工程に含めることができ、−例えば上述のプライマーの組によるポリメラーゼ連 鎖反応を介し標的領域を増幅させ、あるいはシボキンゲニンまたはビオチンのよ うな標識を増幅標的配列に取り込み、ここで該増幅は２０から８０回繰り返され 、有利には３０から５０回繰り返される。
本発明の好適な態様によれば、被検体鎮は酵素的または化学的に、インビボまた はインビトロのいずれかでハイブリダイゼーションの前に修飾される。核酸化合 物にレポータ一群をカップリングさせるための多くの系が記載され、それらはビ オチンまたはシボキンゲニンのような標識の使用に基づいている。本発明のさら なる別の態様によれば、サンドイッチハイブリダイゼーションを使用できる。好 適な態様において、被検体鎖に存在する標的配列はｃＤＮＡに転換され、ここで 該ｃＤＮＡはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：５ａｉｋｉら、１９８８）、リガ ーゼ連鎖反応（ＬＣＲ；　Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、１９８８；Ｗｕ　＆　Ｗａｌ ｌａｃｅ、　１９８９：Ｂａｒａｎｙ、　１９９１）、核酸配列を基本とした増 幅（ＮＡＳＢ＾；Ｇｕａｔｅｌｌｉら、１９９０；Ｃｏｍｐｔｏｎ、　１９９１ ）、転写を基本とした増幅系（ＴＡＳＨＫｗＯｈら、１９８９）、鎖置換増幅（ ＳＡＤ：Ｄｕｃｋ、　１９９０；Ｗａｌｋｅｒら、１９９２）またはＱｂレプリ カーゼによる増幅（ｌｉｚａｒｄｉら、１９８８；Ｌｏｍｅｌｉら、１９８９） のような任意の周知技術によって増幅される。
ｃＤＮ＾増幅工程は好ましくはＰＣＲ法の手段により行われ、次の工程から成る ことができる・ （ａ）ポリメラーゼ連鎖反応法のために、検出すべき標的配列を含むプライマー の組を提供し。
（ｂ）［的領域をポリメラーゼ連鎖反応を介して（ａ）のプライマーの手段によ り増幅させ：ならびに同工程中に、適当な標識分子を増幅樟的中に取り込むこと ができ、該標識分子は好ましくはシボキンゲニンまたはビオチンである。
“プライマー”と言う用語は、ＩＩｃＶゲノム由来のｃＤＮＡまたはＲＮＡのセ ンス鎖またはアンチセンス鎖の保存領域に相補的なオリゴヌクレオチド配列に対 応し：好ましくはＨＣＶゲノムの５′非翻訳保存領域、ならびにより好ましくは 一３４１位から一１７１位および一６７位から一１位を含むＨＣＶゲノムの５° 非翻訳領域の保存、またはコア領域の保存領域から選択される。
本発明の有利な態様において、本方法は増幅が二重のＰｃｔ？段階から成り、各 段階に特別なプライマーの組が関与し、該第一段階はヌクレオチド−３４１から −ヌクレオチド−１８６に伸長する領域、およびヌクレオチド−５２からヌクレ オチド−１に伸長する領域から選ばれた外側のプライマー、ならびに特に以下の 組： ＣＣＣＴＧＴ　ＧＡＧ　ｆ；ＡＡ　ＣＴＩＩ　ＣＴＧ　ＴＣＴ　ＴＣＡ　ＣＧＣ （Ｎｏ、　１　）ＧＧＴ　ＧＣＡ　ＣＧＧ　ＴＣＴ　ＡＣＧ　ＡＧＡ　ＣＣＴ　 （Ｎｏ、　２　）あるいはこれらの相補鎖が関与し、 配列中、ＷはＡまたはＴを表し、ならびに該第二段階はヌクレオチド−３２６か らヌクレオチド−１７１に伸長する領域、およびヌクレオチド−６８がらヌクレ オチド−１に伸長する領域から選ばれた入れ子状に重複したプライマー、ならび に特に以下の組： ＴＣＴ　ＡＧＣＣＡＴ　ＧＧＣＧＴＴ　ＡＧＴ　ＲＹＧ　ＡＧＴ　ＧＴ　（Ｎｏ 、　３）ＣＡＣＴＣＧ　ＣＡＡ　ＧＣＡ　ＣＣＣＴＡＴ　ＣＡＧ　ＧＣＡ　ＧＴ 　（Ｎｏ、　４）配列中ＲはＡまたはＧ１およびＹはＴまたはＣを表し、あるい はこれらの相補鎖が関与するものである。
本発明のこの態様によれば、二重’ＰＣＲは第一回目では配列番号１および２に 表される、またはそれらの相補的配列を含む外側プライマーを使用して行われ、 ならびに第二回目では配列番号３および４に表される、またはそれらの相補的配 列を含む入れ子状に重複したプライマーを使用して行われる。
“適当な標識分子”という用語は、増幅のポリメラーゼ段階中に取り込まれる標 識ヌクレオチドの使用を含むことができ、５ａｋａｉら（１９８８）およびＢｅ ｊら（１９９０）、ならびに当業者に周知の任意技術によって説明されるような ものである。
本発明で記載されているアッセイは当業者にとって明らかない（っがの方法によ って改良することができる。例えばｃＰＣＲ反応は、ＲＮ八−捕獲工種により進 めることができる。
さらに別の態様によれば、本発明は少なくともひとつのオリゴヌクレオチドブラ イマーを含んで成る組成物に関し、該プライマーは好ましくは少なくとも１５個 の連続的ヌクレオチドを有し、該連続的ヌクレオチドは、それぞれヌクレオチド −３４１位からヌクレオチド−１７１位に伸長する領域、およびヌクレオチド− ６７位からヌクレオチド−１位に伸長する領域（図２の）から選ばれた配列に相 補的であるか、またはそれらの相補鎖である。
さらに別の態様によれば、本発明は好ましくは少な（とも１５個の連続的ヌクレ オチドを有する少なくともひとつのオリゴヌクレオチドプライマーを含んで成る 組成物に関し、該連続的ヌクレオチドは以下の任意の配列から選ばれる。
ＣＣＣＴＧＴ　ＧＡＧ　ＧＡＡ　ＣＴＷ　ＣＴＧ　ＴＣＴ　ＴＣＡ　ＣＧＣ（Ｎ ｏ、　１　）ＧＧＴ　ＧＣＡ　ＣＧＧ　ＴＣＴ　ＡＣＧ　ＡＧＡ　ＣＣＴ’（Ｎ ｏ、２　）ＴＣＴ　ＡＧＣＣＡＴ　ＧＧＣＧＴＴ　ＡＧＴ　ＲＹＧ　ＡＧＴ　Ｇ Ｔ　（Ｎｏ、　３）ＣＡＣＴＣＧ　ＣＡＡ　ＧＣＡ　ＣＣＣＴＡＴ　ＣＡＧ　Ｇ ＣＡ　ＧＴ　（Ｎｏ、４）配列中、Ｗは＾またはＴを表し、ＲはＡまたはＧを表 し、およびＹはＴまたはＣを表し、 あるいはこれらの相補鎖である。
有利な態様によれば、生物学的試料に含有されるすべてのＨＣＶ単離物の同時タ イピングに関する本発明の方法は、以下の要素のひとつを、上記に定義したプロ ーブがすでに固定化されている固体支持体と接触させる工程を含んで成る。
一試料中の遺伝物質がハイブリダイゼーションできるようにされている該生物学 的試料、 −または該生物学的試料中に含有された精製された遺伝物質、−または精製され た遺伝物質に由来する単一のコピー、−または精製された遺伝物質に由来する増 幅されたコピー。
本発明の好適な態様によれば、上記に定義したプローブは固体支持体に固定化さ れている。
”固体支持体”という用語は、オリゴヌクレオチドプローブがカップルできる任 意の支持体について言うことができ、ただしオリゴヌクレオチドはそのハイブリ ダイゼーション特性を保持しており、かつハイブリダイゼーションのバンクグラ ウンドは低く保持されている。通常固体支持体はマイクロタイタープレートまた は膜（例えばナイロンまたはニトロセルロース）である。
膜への適用または固定化に先立ち、核酸プローブを修飾することは固定化を容易 にするため、またはハイブリダイゼーション効率を向上させるために便利である 。そのような修飾は、例えばポモポリマーティリング、脂肪族基、Ｎｉ１２基、 Ｓｌ＋基、カルボキシル基のような種々の反応性基のカップリング、またはビオ チンまたはハプテンのカップリングを包含することができる。
本発明の有利な態様によれば、本方法は上記に定義した任意のプローブを以下の 要素いずれかと接触させることから成るニー試料中の遺伝物質がハイブリダイゼ ーションできるようにされている該生物学的試料、 −または該生物学的試料中に含有された精製された遺伝物質、−または精製され た遺伝物質に由来する単一のコピー、−または精製された遺伝物質に由来する増 幅されたコピー、ここで該要素は予め支持体上に固定化されている。
本発明はまた新規単離物のタイピングに関する。
より具体的には、本発明は既知のタイプまたはサブタイプとは異なる新規＋１ｃ Ｖタイプまたはサブタイプの検出法および識別法に関し、該方法は以下の工程を 含んで成る。
一生物学的試料中のＩＩｃＶ単離物が既知のどのタイプまたはサブタイプに属す るかを上記に定義した方法により決定し、ここで該生物学的試料はあるいはＩＩ ＣＶ抗原または抗体アッセイ、または上記に定義したようなＩＩｃＶについての 万能プライマーを使用することにより予めＨＣＶ含有であると決定されていても よ（、 −上記に定義したふたつの任意のドメインから選ばれた領域を標的にすることが できる少なくともひとつのプローブと陽性的にハイブリダイズしない試料が観察 された場合には、その試料中に存在するＨＣＶタイプの完全なゲノムを配列決定 するか、あるいは決定すべき新規タイプおよび／またはサブタイプの相当する５ ゛非翻訳領域の部分（または複数の部分）を配列決定する。
生物学的試料中に存在する新規ＨＣＶタイプおよび／またはサブタイプの検出法 および識別法は、有利には以下の工程を含んで成る（ここで新規タイプを同定す る場合にはタイプ１、タイプ２、タイプ３、タイプ４、タイプ５、夕・ｒプロと は異なるものであり；新規サブタイプを同定する場合にはタイプＩＩＩＣＶ単離 物についてはサブタイプ１ａおよび１ｂ、タイプ２単離物についてはサブタイプ ２ａ、　２ｂおよび２ｃ、タイプ３単離物についてはサブタイプ３ａ、　３ｂお よび３ｃ、タイプ４単離物についてはサブタイプ４ａ、　４ｂ、　４ｃ、　４ｄ 、　４ｅ、　４ｆ、　４ｇおよび４ｈ；タイプ５単離物についてはサブタイプ５ ａ；タイプ６単離物についてはサブタイプ６ａとは異なるものである）−分析す べき生物学的試料中のＩＩｃＶ単離物（複数のＩＩｃＶ単離物）が既知のどのタ イプ（複数のタイプ）またはサブタイプ（複数のサブタイプ）に属するかを上記 に定義した本発明の方法により決定し、ここで該生物学的試料はあるいはＨＣｖ 抗原または抗体アッセイ、または上記に定義したようなＨＣｖについての万能プ ライマーを使用する手段により予めＩＩＣｖ含有であると決定されていてもよく 、−上記に定義した任意のタイプ特異的またはサブタイプ特異的ドメインから選 ばれた領域を標的にすることができる少なくともひとつのプローブとハイブリダ イズしない試料が観察された場合には、より具体的にはタイプｌについて配列番 号５．２８および６と、タイプ２について配列番号８から１２または２２から２ ６および３２がら３４と、タイプ３について配列番号１３．１４．３６．２１、 または５４と、ならびにタイプ４について配列番号１７．１８．１９．３７から ４３．４９．５０および５３と；ならびにサブタイプ１ｂについて配列番号７お よび３ｏと、サブタイプ１ａについて配列番号３１と、サブタイプ２ａについて 配列番号９１０２２または２４と、サブタイプ２ｂにつぃて１１．１２．２３ま たは２５と、サブタイプ２ｃについて配列番号３３または３４と、あるいはサブ タイプ３ａについて配列番号１３．１４または３５と、サブタイプ３ｂ、４ａま たは４ｄについて配列番号３８．２１、および１９と、サブタイプ４ｂについて 配列番号３８または４１と、サブタイプ４ｃについて配列番号４２または４３と ：サブタイプ４ｅについて配列番号３９．４０または４１と、サブタイプ４ｆに ついて；配列番号５１．３８．１９または７と：推定のサブタイプ４ｈについて は配列番号４９または５０と：推定のサブタイプ４ｇについては配列番号５０ま たは５３とハイブリダイズしない試料が観察された場合には、試料中に存在する ＨＣＶタイプの完全なゲノムを配列決定するか、あるいは決定すべき新規タイプ および／またはサブタイプの相当する５°非翻訳領域の部分（または複数の部分 ）を配列決定する。
“新規単離物”とは、上述した９つの領域のいずれともハイブリダイズできない か、または現在知られているＩＩｃＶのタイプまたはサブタイプのひとつに適合 すると正しく判断できる反応性を示すことができない単離物に対応する。本発明 のこの特別な態様も以下の工程により行うことができる： （ａ）ＨＣｖ抗体−陽性血清、または臨床的なＮＡＮＢ肝炎試料、または無作為 な試料群をｃＰＣＲ（ｃＤＮＡ　ＰＣＲ）により調査し、（ｂ）すでにｃＰＣＲ 生成物を得た、これらの試料を使用してＩＩｃＶ　ＬｉＰＡを行い、ならびに （Ｃ）異常な反応性を表すＰＣＲ断片をクローニングおよび配列決定する。
本発明はまた生物学的試料中に存在するＨＣＶ、および／または１１１ｖ、およ び／またはＨＢＶ、および／またはＩＩＴＬＶのタイプ（複数のタイプ）ならび にサブタイプ（複数のサブタイプ）の決定法に関し、この方法は以下の工程を含 んで成るニ ー以下のプローブを提供し、 本上記に定義した少なくともひとつのプローブ、好ましくはプローブは上記に定 義したものであり、ＨＣＶの遺伝子型決定（タイピングおよび／またはサブタイ ピング）が可能であり、ならびに以下の少なくともひとつのプローブ 本上記生物学的試料中に存在しうるＩＩＩＶタイプｌおよび／またはタイプ２の オリゴヌクレオチドを検出できるプローブ、ならびに／または 本上記生物学的試料中に存在しうるＩＩＢＶサブタイプ、および／またはｓＡｇ 突然変異体および／またはｃＡｇ突然変異体のオリゴヌクレオチドを検出できる プローブ、ならびに／または本生物学的試料中に存在すると疑われるＩＩＴＬＶ −Ｉおよび／またはＨＴＬＶ−ＩＩのオリゴヌクレオチドを検出できるプローブ 、−あるいは上記に定義したプライマーの組に加えて、少な（ともひとつの次の プライマーを提供してもよ＜　：ＰＣＲ反応の手段により、ヒト免疫不全症ウィ ルス（ＩＩＩＶ）、および／またはＩＩＢＹ、および／またはヒトＴ細胞リンフ ォトコピツク（ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）ウィルス（ＩＩＴＬＶ）オリゴヌク レオチドのそれぞれを増幅させるためのプライマーの組、ならびに生物学的試料 中に存在するかもしれないＨＣＶ、およびＩＩＢＶおよび／またはＩＩＩＶおよ び／または）ＩＴＬＶのいずれかを増幅させ、−上述した上記定義のプローブと 本試料中の遺伝物質がすでにハイブリダイゼーションできるようにされている生 物学的試料、 本または上記生物学的試料中に含有された精製された遺伝物質、 本または精製された遺伝物質由来の単一コピー＊または精製された遺伝物質由来 の増幅コピーとを、プローブとＩＩＣＶならびに少なくともひとつの次のウィル ス、ＩＩＢＹ。
および／またはＩＩＩＶ、および／またはＩＩＴＬＶの単離物の標的配列とがハ イブリダイゼーションできる条件下で接触させ、−使用したプローブと生物学的 試料に存在するかもしれない標的領域との間に形成した可能性のある複合体を検 出する。
本態様によれば、生物学的試料中に存在するＨＣＶのタイプまたはサブタイプに 加えて、本発明はまたＨＴＬＶ、　ＨＩＶ、　ＨＢＶのような任意の他の親から 伝播したウィルスの単離物のタイプまたはサブタイプを決定する方法に関し、ひ とつの同−片にプローブを包含することを特徴とし、かっ該プローブはニ ー上記ｎｃｖの種々のタイプおよび／またはサブタイプ−ヒト免疫不全症ウィル スＩＩＩＶ−１およびＨＩＶ−２−ヒト■細胞リンフォトロゴツクウィルスＨＴ ＬＶ−１およびＩＩＴＬＶ−一種々の１１８表面抗原（ＨＢｓＡｇ）変異体また はＩＩＢコア抗原（ＩＩＢｃＡｇ）またはＨＢブレコアＡｇ変異体、に特異的に ハイブリダイズすることを特徴とする。
いくつかの試験試料において、種々の標的配列の特異的検出が臨床的な関連性を 同時に提供する。これらのそれぞれの標的配列について、別個のハイブリダイゼ ーション試験が対応するプローブを使用して行われるべきである。（従来）技術 を構成する種々のタイプ／サブタイプに特異的なプローブの組み合わせは、本発 明により説明されるような新規かつ創意あるＨＣＶタイプ／サブタイブー特異的 プローブと組合わさり、ひとつの膜片上で、親から伝播したヒトのウィルス性疾 患のための容易かつ信頼性のある一般的タイピングシステムを提供することがで きた。もし被検路の増幅が必要な場合には、プライマーの組を分別および分類す べきウィルス生体自体について提供できる。
本発明はまた固体支持体に関し、具体的には膜片に関し、その表面の既知の位置 には以下のプローブ、またはそれらの相補鎖、または上述したプローブであって ＴがＵに置き換えられたものから選択されたものを含む・ 一上記の配列番号５．６．７．８．９．１０．１１．１２．１３．１４．１５． １６．１７．１８．１９．２０．２１．２２．２３．２４．２５．２６．２７． ２８から５４および９３から９６、ならびにこれらのプローブと、ＩＩｃＶ単離 物が、区別されるべき生物学的試料中に含まれると思われるＨＣＶのリボまたは デオキシリボヌクレオチド鎖との間に、ハイブリダイゼーションがあるがどうが を決定するための対照を含む。
本発明の特に好適な態様によれば、プローブは膜片に対して（横）線を引く様式 （ｌｉｎｅ−ｗｉｓｅ　ｆａｓｈｉｏｎ）で固定化されている。
本発明のこの好適な態様においで、各プローブの組は膜片の定められた位置に適 用され、配列番号５．６．７．８．９．１０．１１．１２．１３．１４．１５． １６．１７．１８．１９、２０．２１．２２．２３．２４．２５．２６．２７、 配列番号２８から５４、および配列番号９３から９６から選択されたプローブ、 ならびに結合体が結合するための対照線を含む。
本発明の好適態様の方法は、ＨＣＶ感染のタイプを素早く決定することを可能に する。このアッセイは少な（とも６つの異なるＩＩｃＶタイプ間を識別し、およ び少なくとも１８サブタイプ間を識別する能力を提供し、ならびにＩＩＣＶの新 規タイプまたは（サブ）タイプを調査する良い道具である。
例えば新規サブタイプｌｃ、　ｌｄおよびタイプ７、ならびに他の新規（サブ） タイプは上述した領域中に特別な突然変異を含んでも良く、これは新規配列由来 のタイプ−特異的プローブの手段によって特異的検出のために使用できる。
本発明はまたＨＣＶ単離物を含有すると思われる生物学的試料から少なくともひ とつのＨＣＶ単離物をインビトロで識別するための、ならびにＩＩＣＶタイプサ ブタイプに従い分類するためのキットに関するものであり、該キットは以下のも のを含むニ ー上記に定義された任意のプローブから選択された少なくともひとつのプローブ 。
−これらプローブと）ＩＣＶ単離物のｃＤＮＡおよび／またはＲＮＡとの間で行 われるべきハイブリダイゼーション反応を可能にする緩衝液を作成するために必 要な緩衝液または成分、−適当である時には、ハイブリダイゼーションの進行か ら生成するハイブリッドを検出するための手段。
本発明はまたＩＩｃＶ単離物を含有すると思われる生物学的試料から少なくとも ひとつのＩＩｃＶ単離物をタイピングするための、ならびにＩＩＣＶタイプおよ びサブタイプに従い分類するためのキットに関するものであり、該キットは以下 のものを含む・ 一場合によって、上記に定義されたひとつの万能ブローブー一本発明の任意のプ ローブから選択される少なくともひとつのプローブ、 −これらのプローブとＨＣＶ単離物のｃＤＮＡおよび／またはＲＮＡとの間で行 われるべきハイブリダイゼーション反応を可能にする緩衝液を作成するために必 要な緩衝液または成分、−適当である時には、ハイブリダイゼーションの進行か ら生成するハイブリッドを検出するための手段。
この態様によれば、本発明はまたＨＣＶ単離物の遺伝子型決定（タイピングおよ び／またはサブタイピング）のためのキットに関しニー上記に定義したプローブ の組、優先的に固体支持体に固定化されており、より優先的にはひとつの同一の 膜に固定化されており、−場合によって上記に定義したプライマーの組、−ハイ ブリダイゼーション行うために、および形成したハイブリッドを検出するのに必 要な緩衝液の組、を含む。
本発明はまた少なくとも以下のひとつのＩＩｃＶタイプＣＩＩｃＶタイプ１、Ｈ ＣＶタイプ２、ＨＣｖタイプ３、ｔＩＣＶタイプ４、ＩＩｃｖタイプ５、Ｈｃｖ タイプ６）ニ属するＨＣｖ単離物のタイピングのためのキットに関し、該キット は少なくともひとつの上記に定義したプローブ、　−これらプローブと上記ＦＩ ＣＶ単離物のｃＤＮＡｓおよび／またはＲＮＡ５との間で行われるべきハイブリ ダイゼーション反応を可能にする緩衝液を作成するために必要な緩衝液または成 分ニ ー適当な場合にはハイブリダイゼーションの進行から生成するハイブリッドを検 出するための手段、を含む。
本発明は有利には、ＩＩＣＶタイプおよびサブタイプを識別ならびに分類するた めのキットに関し、該キットはニー少なくともひとつの上記に定義したプローブ 、−これらプローブと上記ＨＣＶ単離物のｃＤＮＡｓおよび／またはＲＮＡ５と の間で行われるべきハイブリダイゼーション反応を可能にする緩衝液を作成する ために必要な緩衝液または成分ニー適当な場合にはハイブリダイゼーションの進 行から生成スるハイプリントを検出するための手段、を含む。
配列番号１から５４および９３から９６由来のすべてのプローブは新規である。
さらに配列番号１８．２９．３３．３４．３５．４０．４２．４３．４７．４９ および５４のプローブは新規配列に由来する。
入れ千秋に重複したＰＣＲ断片の長さを示すエチジウムブロマイドで染色したア ガロースゲル。各対のレーン＾はＢｌｏ−１ｌ−ｄＵＴＰを取り込んだＰＣＲ断 片を表ず。レーンＢはＢｌｏ−１ｌ−ｄＵＴＰ無しのＰＣＲ断片である。１：血 清ＢＲ２８，２・血清ＢＲ２４，３：血清ＢＲ２９，４：血清ＢＲ３３，５，血 清ＢＲ３６，６および７：陰性対照血清、８・血清ＪＰ６２．９血清ＢＲ２３， １０・鋳型無しのｃＰＣＲ対照、Ｍ分子量マーカー。
第２図 ４種の異なるＩＩｃＶタイプ由来の単離物の５’　ＵＲヌクレオチド配列の整合 配列。箱で囲ったヌクレオチドは４種の異なる群をタイピングするために使用し たプローブの位置を示す。下線を引いたヌクレオチドは各群内をサブタイピング するために使用される。はとんどの配列のヌクレオチド−１４０から一１３９間 の間隔にはいくつかタイプ４単離物中の挿入が対応する。
プローブの番号は表４に使用する番号と一致する。
！１丙 いくつかの典型的な血清についてのＨＣＶ　ＬｉＰＡタイピングの結果。片は１ ９の平行した線を含む。
Ａニブローブ５（配列番号５）；Ｂニブローブ６（配列番号６）；Ｃニブローブ ７（配列番号７）；Ｄニブローブ８（配列番号８）：Ｅニブローブ２６（配列番 号２６）　；　Ｆ　ニブローブ２２（配列番号２２）おヨヒブローブ２４（配列 番号２４）；Ｃニブローブ１０（配列番号１０）：Ｈニブローブ１３（配列番号 １３）；Ｉニブローブ１４（配列番号１４）；Ｊ・プローブ２１（配列番号２１ ）：にニブローブ１５（配列番号１５）；Ｌニブローブ１６（配列番号１６）； Ｍニブローブ１７（配列番号１７）；Ｎニブローブ１９（配列番号１９）　；　 ０、プローブ１８（配列番号１ｇ）；Ｐニブローブ１５５（アンチセンスプロー ブ・５′−ＧＧＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＧＣＴＧ−３’　Ｘ配列番号９７）；Ｃニ ブローブ２７（配列番号２７）；Ｒニブローブ２０（配列番号２０）　；　Ｓ結 合体の結合のための対照ライン。
片（ストリップ）を以下の血清のＰＣＲ生成物とハイブリダイズさせた二片に血 清ＢＲ５、片２：血消ＢＲ１２：片３：血清ＢＲ１８、片４．血清ＢＲ２２：片 ５：血清ＢＲ１９、片６．血清ＢＲ９５：片７：血消ＢＵ７９、片８：血清ＢＲ ２３、片９：血清ＪＰ６３゜ ！ユ回 新規単離物（ＢＨ９０、ＢＨ３１、ＢＨ９２、ＢＨ９３、ＢＨ９４、ＢＨ９５、 ＢＨ９６、ＢＨ９７、ＢＨ９８、ＢＨ９９、ＧＢ４８、ＧＢ１１６、ＧＢ３５８ 、ＧＢ５６９、ＧＢ５４９、ＧＢ８０９、ＣＡ１１１６００、ＣＡＭ７３６、Ｇ Ｂ４７ｇ、ＧＢ７２４、およびＣＢ４３ｇ）、ナラび１．：　ＩＩＣＶ　９　イ ブ１ａ（ＨＣＶ−１）、１ｂ（ＨＣＶ−Ｊ）、２ａ（ｔｌｃ−Ｊ６）、２ｂ（Ｉ Ｉｃ−Ｊ８）、３ａ（ＢＨ５６）、３ｂ（ＩＩｃＶ−ＴＲ）、５（ＳＡＩ）、６ （ＨＫＩ）ノ１ｌＣＶ５’非翻訳領域のヌクレオチド配列の整合配列。この整合 配列を構成するために使用した配列は、ＥＭＢＬデータベースから取り、以下の 受け入れ番号を有する：　’　Ｍ６２３２１、”０１０７４９．３Ｄ００９４４ 、’１１０１２２１、’Ｄ１３４４８、’Ｄ１１４４３．７Ｍ８４８３８、およ び８Ｌ０８１５６゜ヌクレオチド−２２０から−１８０の間の配列は示されてい ないが、それらはすべての単離物中でＨＣＶ−１と同一である。°−°ヌクレオ チドはＩＩＣＶ−１中の対応するヌクレオチドと同一である；−１４５から−１ ４４の間に作られた空所゛１．″は、整合配列がＣＡ挿入を有するタイプ６配列 を持つと認められる：はとんどのヌクレオチド中の−１３８と−１３７の間に作 られた空所°、′は、整合配列がその位置で特別なヌクレオチドを有する配列を 保存する。本は第２図に表される−２２０と一１８０残基の間の保存ＨＣｖ配単 離物ＢＥ９０．　ＢＥ９１．　ＢＥ９２．　ＢＥ９３．　ＢＥ９５．　ＧＢ３５ ８、ＧＢ５４９およびＧＢ８０９のＮＳ５配列のアミノ酸配列、ならびに表６に 記載された既知の配列の整合配列。
第６図 配列番号３２を使用したプローブを含むラインプローブアッセイ、タイプ１およ び２血清で試験した。１．タイプ２ａ血消ＢＥ８２．２．タイプ２ａ血清ＪＰ６ ２．３．タイプ２ｂ血清ＢＥ９１、Ａ結合体対照、Ｂ、プローブ２０および２７ 、Ｃ，プローブ８、Ｄ、プローブ２６、Ｅ、プローブ３２（配列番号３２）。
第７図 配列番号３３および３４を使用したプローブを含むラインプローブアッセイ、タ イプ２ａ、　２ｂ、および２ｃ血清で試験した。１．タイプ２ａ血消ＪＰ６２． ２゜タイプ２ｂ血消ＢＥ９１．３．タイプ２ｃ血清ＢＥ９２、Ａ、結合体対照、 Ｂプローブ２０および２７、Ｃ，プローブ８、Ｄ、プローブ２６、Ｅ、プローブ ３２、Ｆ。
プローブ２２、Ｇ、プローブ２４、Ｈ，プローブ２３、■、プローブ２５、Ｊ、 プローブ３３（配列番号３３）、Ｋ、プローブ３４（配列番号３４）。
第８図 配列番号３１．３７および３８を使用したプローブを含むラインプローブアッセ イ、タイプ４血清で試験した。１、タイプ４ａ血清ＧＢ１１６．２．血清ＧＢＩ Ｉ３．３．タイプ４ｆ血清ＧＢ４３８、Ａ、結合体対照、Ｂ、プローブ２０およ び２７、Ｃ，プローブ３７（配列番号３７）、Ｄ、プローブ３８（配列番号３８ ）、Ｅ、プローブ１９、Ｆ、プローブ３１（配列番号３１）、Ｇ、プローブ７゜ 第９図 配列番号４４．４５．９５および４６を使用したプローブを含むラインプローブ アッセイ、タイプ４ａおよび５ａ血清で試験した。１．タイプ５ａ血清ＢＥ９５ ．２、タイプ４ａ血清ＧＢ１１６、Ａ、結合体対照、Ｂ、プローブ２０および２ ７、Ｃ。
プローブ４４（配列番号４４）、Ｄプローブ４５（配列番号４５）、Ｅ、プロー ブ４６（配列番号４６）、Ｆ、プローブ３１（配列番号３１）、Ｇ、プローブ７ ゜第１Ｏ図 配列番号９３．９４．９５および９６を使用したプローブを含むラインプローブ アッセイ、タイプ４ａおよび５ａ血清で試験した。１．タイプ４ａ血清ＧＢＩＩ ６．２．タイプ５ａ血清ＢＥ９５、Ａ、結合体対照、Ｂ、プローブ２０および２ ７、Ｃ，プローブ９３（配列番号９３）を濃度０．４ｐｍｏｌ／ｕｌで適用、Ｄ 、プローブ９４（配列番号９４）を濃度２．５ｐｍｏｌ／ａｌで適用、Ｅ、プロ ーブ９４（配列番号９４）を濃度１、　Ｏｐｍｏ１＃１で適用、Ｆ、プローブ９ ４（配列番号９４）を濃度０．４ｐｍｏｌ／Ｂ　１で適用、Ｇプローブ９５（配 列番号９５）を濃度２．５ｐｍｏｌ／μｉで適用、Ｈ，プローブ９５（配列番号 ９５）を濃度１．　Ｏｐｍｏ１／１１で適用、■、プローブ９５（配列番号９５ ）を濃度０．４ｐｍｏ１＃１で適用、Ｊ　プローブ９６（配列番号９６）を濃度 ０．４ｐｍｏｌ＃＋１で適用。
種々の分類系の概観。
点ｌ 第３図に示される結果の解説。
飢 １１ＣＶ　ＬｉＰ＾タイピングおよびＩＩＣＶ抗体アッセイの最終結果。
血清学と関連したタイピングの要約が与えられている。ｌＮＮ０−ＬＩＡ　ＩＩ ＣＶ＾ｂアッセイはＮＳ４エピトープを使用したひとつの系列、ＮＳ５エピトー プを使用したひとつの系列、およびコアエピトープを使用した４つの系列を含む 。コア系列について最高点が与えられただけである。信号の強さは数で与えられ る二〇＝陰性；９−不確定；１−３−陽性。抗体試験の最終的解釈はＬＩＡｔｌ ＩＩに与えられる：１＝陽性；０＝陰性；９−不確定。　Ｉｎｎａｔｅｓｔ　Ｈ ＣＶＡｂで試験した血清の信号対ノイズの比が与えられている血清もある。
ム プライマーおよびプローブのヌクレオチド配列、位置および方向。
嚢」− １１ｃＶの新タイプおよびサブタイプから設計された新プローブの概観。
分類が可能な、または向上したタイプおよびサブタイプ、配列、および配列番号 を示す。
本はすべての単離物をタイピングまたはサブタイピングしていなしプローブを表 し、該タイプまたはサブタイプを表すことが見いだされた。下線の文字は暫定的 なサブタイプへの分割を表す。
煮立 ＢＥ９０．　ＢＥ９１．　ＢＥ９２．　ＢＥ９３．　ＢＥ９５．　ＧＢ３５ｇ、 　ＧＢ５４９．およびＧＢ８０９と、公表されているヌクレオチド７９３５から ８２７４（本発明中で使用した番号に従う）由来のＨＣＶ　ＮＳ５領域中の配列 との間の配列相同性。同一サブタイプ内の相同性得点は際立っている。相同性を 計算するために使用した公表配列はＥＭＢＬのデーターベースから取り、以下の 受け入れ番号を持つ：　Ｉ　Ｍ６２３２１．２０１０７４９．３Ｍ６７４６３、 ’Ｄ９０２０８、’Ｘ６１５９６、’Ｌ０２８３６．７Ｍ８４７５４、’Ｄ１０ ７５０、’Ｄｌｌ１６８；００１１７１．１°５３８２０４．１１Ｍ５８３３５ 、’　２０１００７８、’　３０１００７９、”　０１００８０、＋５［１１０ ０８１、ｌ　６ＤＯＯ９４４、および”　ＤＯ１２２１゜これらすべてが完全ゲ ノムを表すが、ＮＳ５配列カ公表サレテイル１２、＋３．１４．１５おヨヒ”Ｉ ；！除＜。”ｉ；ｔｃｈｉｒａｎの特許（国際特許第９２／１９７４３）、配列 番号１８に公開されている。
実施例 世界の各地から得たＨＣＶ単離物の天然変異体を研究するために、ＨＣＶ単離物 のタイピングおよびサブタイピングに関する迅速な手段をラインプローブアッセ イ（ＬｉＰＡ）の様式で開発した。
本質的に、取り込まれたビオチン化ｄＵＴＰを含有するｃＰｃＲ断片を、ニトロ セルロース膜上に固定化したオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる。安定 なハイブリダイゼーション二重鎖を次にストレプトアビジン−標識アルカリホス ファターゼにさらし、続いてＮＢＴにトロ４２ブルーテトラゾリウム）およびＢ ＣＩＰ（ブロモクロロ−インドリルリン酸）で発色させる。ｃＰＣＲ断片は任意 のＨＣＶ　ＲＮＡの５°ＵＲから、高度に保存されたプライマーの組を使用して 合成される。タイピングに使用されるオリゴヌクレオチドは、ｃＰＣＲ断片の内 部のタイブー特異的可変部に対して向けられている。事実、直線配列中の−１７ ０と一１５５位との間、および−１３２と一１１７位との間の可変領域が、折り たたまれたウィルスＲＮＡ中のステムの部分となることができ、第一領域の突然 変異が第二領域のもうひとつの突然変異により補足され、ＲＮＡの二重鎖形成が できるか、またはできない。変異および保存はＨＣＶの他の新タイプにも同一位 置で同様に起こると思われ、それゆえにこの可変領域は現在の、および未だ発見 されていないが今後発見されるであろうすべてのＨＣＶタイプを識別するための 道具として残るかもしれない。さらに、５′［ＩＲと比較してより高い可変性が コア、ＮＳ３およびＮＳ５領域中で観察され、これらの領域中で、万能プライマ ーの組を採用するタイピングはもはや理にかなったものではないだろう。
本発明で提案した命名は暫定的なものであり、国際委員会により提出されるかも しれない新しいガイドラインに従いさらに補正に供されることにもなろう。例え ばサブタイプ４ａはもうひとつのタイプ４サブタイプ（４Ｃまたは４ｅのような ）に変更されるかもしれないし、ならびにタイプ４はタイプ５または６に変更さ れるかもしれない。そのような場合にはタイプ４ａは例えば６Ｃになるかも知れ ない。しかし新しい分類が、本発明で提案されたプローブの手段によりタイプま たはサブタイプに分類された単離物の特定群の分類を妨害するものではないだろ う。
１、タイピングおよびサブタイピングのために使用した血清試料６１のブラジル 人試料（ＢＲＩからＢＲ６１）を、ＩＩｃＶ抗体ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｉｎｎ。
ｔｅｓｔ　ＨＣＶ　Ａｂ、　イノンエネテイ−７クス＋　Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉ ｃｓ）およびＩｎｎｏＬＩＡ　ＩＩｃ’／＾ｂ試験（イノジェネティックス）で 試験した。初めの２３の血清試料は（ＢＲｌからＢＲ２３）は、ＡＬＴレベルが 高い、またはＩｎｎｏ−ＬＩＡの結果が陽性である血液透析者、あるいは受容者 がＮＡＮＢ肝炎疾患を発病している供与者の血液、のいずれかから採取した。他 の１４（ＢＲ２４からＢＲ３７）の血清試料は無作為に選択した：残りの２４の 血清は（ＢＲ３８からＢＲ６１）は、それらのＬＩ八へりターンに基づき選択し た。後者のほとんどがＬＩＡのＮＳ４およびＮＳ５合成ペプチドと僅かに陽性、 不確定、または陰性の反応性を示した。以下の血清もこのタイピング試験に含ま れた１日本人の２種のプール血清（ＪＰ６２および６３）、ベルギー人の６種の 血清（ＢＥ６４からＢＥ６９）、オランダからの４種の血清（ＮＨ２ＯからＮＥ ７３）、ブルンディーからの６種の血清（Ｂ［Ｉ７４からＢＵ７９）およびガボ ンからの２種の血清（ＧＢ８０およびＧＢ８１）。これらはすべてＩｎｎｏ〜Ｌ ＩＡ　ＨＣＶＡｂアッセイ系で試験された。血清ＢＵ７４からＢｔ１７８は抗− コア抗体について陽性であるだけだったが、一方血清ＢＵ７９はＮＳ５系にのみ 反応した。２種のがホン人から血清はＬＩＡ　Ｉ（ＣＶ陰性（Ｉｎｎｏ−ＬＩＡ 　ｔｌｃＶ）、）ＩＩＶ陰性（ＩｎｎａｔｅｓｔＨＩｖ）であったが、ＨＴＬＶ 陽性（ＩｎｎｏｔｅｓｔＨＴＬＶ）であった。ベルギーからの１種の血清（ＢＥ ６９）およびオランダからの１種の血清（ＮＥ７３）は完全に陰性であった。Ｎ Ｅ−血清の３種（ＮＥ７１からＮＥ７３）が第二世代のＲＩＢ八試へ（オルソダ イアグノスティックス社：０ｒｔｈ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　Ｉｎｃ、）に陰 性であったので選択した。
２、　ｃＰＣＲ，ＰＣＲ生成物の分析、およびクローニングＰＣＲ反応に使用し たプライマーは、種々のＩＩＣＶタイプの５”　ＯＲの保存領域に相補的であっ た。タイプ１およびタイプ２配列（Ｋａｔｏら、１９９０　；Ｎａｋａｎｏら、 １９９１；Ｏｋａｍｏｔｏら、１９９１）、ならびに我々のタイプ３クローン（ ＢＲ５６；受は入れ番号Ｄ１３４４８、ＣＣＪＪＢ／ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋ 　ＤＮＡデータベース、１９９２年１０月２１日寄託）をアニーリングさせるた めに、縮退が含まれた。外側ＰＣＲプライマー配列（ＩｃＰｒ９８、配列番号１ および１ｌｃＰｒ２９、配列番号２）、ならびに入れ子状に重複したＰＣＲブラ イ？　−（ｔｌｃＰｆ９５、配列番号３および１ｌｃＰｒ９６、配列番号４）を 表４に表す。種々の血清タイプの検出のために使用したプローブも表４に掲示す る。すべてのオリゴヌクレオチドは３９２ＤＮ＾／ＲＮ＾合成機（アブライドバ イオシステムズ；Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で合成した。
ウィルスＲＮＡを、わずかに変更を加えたが本質的（こＣｈｏｍｃｚｙｎｋｉお よび５ａｃｃｈｉ（１９８７）＋ｍ記ｆｉサレタヨウｌ：抽出シｔコ。ＲＮＡを ２（ｌｌ１ｇのＤｅｘｔｒａｎ　Ｔ５０Ｑ（ファルマシア；Ｐｈａｒｍａｃｉａ ）と共沈させた。このＲＮＡＮレベレトを簡単１こ乾燥し、１０μｍのＤＥＰＣ −処理ｌＩ２０中に再せ濁した。２μｍの１５０ｎｇ／μｍの無イ乍為プライマ ー（ｒａｎｄｏｍ　ｐｒｉｍｅｒ：ファルマシア）を加え、６５’Ｃで１０分間 変性させｔコ後、第−鎮のｃＤＮＡ合成を２ｈｌについて２５０のＩＩＰＲＩ（ アマジャム：＾ｍｅｒｓｈａｍ）、５０ｈＭのｄＡＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＴＴ ＰおよびｄＧＴＰ、　ｌｘＡＭＶ緩衝液（ストラタジーン；Ｓｔｒａｔａｇｅｎ ｅ）、および２，５ＵのＡＭＶ−ＲＴ（ストラタジーン）の存在下１こで４２° Ｃで行った。生成したｃＤＮへの７１１１を外側ＰＣＲ中で４０サイクルにわた って増幅させ、各サイクルは全容量５０１１１で９５℃で１分、５５℃で１分、 および７２°Ｃで１分力）ら構成されていた。溶液を最終濃度２００μＭのｄＡ ＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＴＴＰおよびｄＧＴＰ、１ｘＴａｑｉｌ衝液（ストラタ ジーン；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、０．２＋ｌｌｌの各プライマー、ならびにＩ ＵのＴａｑポリメラーゼ（ストラタジーン）（こ調整した。第一回の増幅生成物 の１μｍを、入れ子状に重複したプライマーで再度、同一組成の緩衝液中で４０ サイクル増幅させた。ＩＩｃＶタイピンク゛）二つ（１て；よ、入れ子状に重複 したＰＣＲは４０ｕＭのＢｌｏ−１１ｄＬＩＴＰ（ングマ；Ｓｉｇｕｍａ）およ び１６ｈＭのｄＴＴＰを含有した。外側、および入れ子状に重複したＰＣＲ生成 物の両方を次に２％の低融点にノーブノーティーノー、エフエムンー：ＮｕＳｉ ｅｖｅ　ＧＴＧ　ＦＭＣ）／１％ウルトラブユア（Ｕｌ、ｔｒａ　Ｐｕｒｅギブ コ　ビーアールエル：アガロースゲルを使用した電気泳動に供した。エチジウム ブロマイド染色後、ＰＣＲ断片をアガロースケルから切り小腰ＤＮＡを０．４５ μｍｌｌＶ膜（ミ１ノポア．ＭｉｌＬｉｐｏｒｅ）を通過させる遠心により回収 して、２度のフェノール／クロロホルム抽出および２度のエーテル抽出を行うこ と（二より精製し、沈殿させ、続いてＴ４ポリメラーゼ（ベーリンガー；Ｂｏｅ ｈｒｉｎｇｅｒ）で処理し、Ｔ４キナーゼ（ベーリンガー）でリン酸化し、最終 的にｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳ（−Ｘストラタジーン）の脱リン酸化Ｅｃｏ 　ＲＶ部位に連結した。プラスミドＤＮＡの調製は、アルカリ溶解法（Ｍａｎｉ ａｔｉｓら、１９８２）に記載されているように行った。配列決定反応は、デア ザＧ／Ａ丁７シークエンシングミツクス（Ｄｅａｚａ　Ｇ／Ａ　ｓｅｑｕｅｎｃ ｉｎｇ　ｍｉｘｅｓ：ファルマシア）を使用することにより、Ｉ７およびＴ３プ ライマーを用いて二重鎖プラスミドＤＮＡについて行った。
これらの配列決定反応の結果を第２図に表す。以下の配列がＤＮＡデータベース に寄託された（ＢＲ５６　：ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／シーンバンク受は入れ番号Ｄ １３４４８；ＢＵ７４：ＤＤＢＪ／ＥＭＬ／シーンバンク受は入れ番号Ｄ１３４ ４９　；ＢＵ７９　：受は入れ番号０１３４５０；ＧＢ８０：受は入れ番号０１ ３４５１　；ＧＥ８１　：受は入れ番号０１３４５２：ＧＰ６２：受は入れ番号 Ｄ１３４５３）。
ＨＣｖ−感染患者からの血清ＲＮＡをｃＤＮＡ合成のための鋳型として使用し、 これを次に入れ子状に重複したＰＣＨのための鋳型とした。ふたつのプライマー の組が、外側反応のためにはＩｃＰｒ９８（配列番号ｌ）およびＩｃＰｒ２９（ 配列番号２）、ならびに入れ子状に重複した反応のためには）ＩｃＰｒ９５（配 列番号３）およびＩｃＰｒ９５（配列番号４）（表４）が設計された。これら４ 種のプライマーは公表された配列（Ｋａｔｏら、１９９０　；　Ｎａｋａｏら、 １９９１　；Ｏｋａｍｏｔｏら、１９９１）、ならびに単離物ＢＲ５６（第２図 参照）の非翻訳領域から得たクローンの配列に合うように選択された。入れ子状 に重複したＰＣＲの結果の増幅生成物は２３５塩基対（ｂｐ）の長さである。Ｂ ｉｏ−１　１−ｄＵＴＰの取り込みにより、アガロースゲル電気泳動後に視覚的 に明らかな移動度の減少がある（第１図）。
すべての異なるＩＩｃＶタイプについてＤＮＡ断片の大きさが同じであることは 、制限酵素消化またはハイブリダイゼーションのような第二の実験が分類に必要 であることを示唆している。それゆえに平行線として適用されているＩＩｃＶ− 特異的オリゴヌクレオチドプローブを含有している膜片が開発された。これらの 片は、合成中にビオチン化ヌクレオチドが中に取り込まれた５’　ＯＲのＰＣＲ 増幅ＤＮＡ断片とハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションの後、アルカリ フォスファターゼで標識したストレプトアビジンヲ加え、ハイブリダイゼーショ ン中に形成されたビオチン化ハイブリッドに結合するようになる。ＮＢＴ／ＢＣ ＩＰとインキュベーションした後、紫色の沈殿が現れる。
３、ラインプローブアッセイ（ＬｉＰ＾）片の調製１５−ｍａｒのオリゴヌクレ オチド（種々のタイプまたはサブタイプのＨＣＶに特異的である；表４、番号５ から２７）の３′末端にｐｏｌｙ−（ｄＴ）尾を以下のように付けた：２０Ｉ） ＋１１０１のプライマーを２５μｍの緩衝液中（３，２＋ｎＭのｄＴＴ、　２５ ｍＭのＴｒｉｓ、　ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、　０．１Ｍのカコジル酸ナトリウム 、１ｍＭのＣｏＣｌ２．０．１ｍＭのジチオスレイトール、および６００のター ミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ファルマンア）を含有する ）にて３７°Ｃで１時間インキュベーションした。反応を２．５ＩＩｌの０．５ Ｍ　ＥＤＴＡ、（ｐｔ１８．０）を加えて止め、ならびに２０ＸＳＳＣ（Ｍａｎ ｉａｔｉｓら、１９８２）で最終濃度が６ｘＳＳＣとなるまで希釈し、２．５ｐ ｍｏｌのオリゴヌクレオチド／μｍを反応させた。
この溶液のｌｐｍｏｌをニトロセルロース膜上に４ｍｍ離して適用した。結合体 用の対照として、ビオチン化ＤＮＡを並べて適用した。オリゴヌクレオチドを８ ０℃に２時間焼いて膜に固定した。膜を次に４−ｍｍの片に切断した。
４　、　ＬｉＰ＾試験ハイブリダイゼーションおよび発色１０＋＋１の入れ子状 に重複したＰＣＲ増幅生成物（取り込まれたＢｌｏ−１１ｄＬＩＴＰ含有）をｌ ｈｌの４００ｍＭ　ＮａＯＨ／１０ｍＭ　ＥＤＴＡと混合し、室温（ＲＴ）で１ ０分間イアキュベーンヨンする。次に１ｍＭの予め暖めた（３７°Ｃ）ハイブリ ダイゼーション緩衝液（３Ｍの塩化テトラメチルアンモニウム、（ＴＭＡＣｌ、 メルク：Ｍｅｒｃｋ）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６，８）、１ｍＭの ＥＤＴＡ、５×デンハーツ溶液（Ｍａｎｉａｔｌｓら、１９ｇ２）、０．６％（ Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ、および１１００ｊ／ｍｌの剪断サケ精子ＤＮ＾を含む）を加え 、ハイブリダイゼーションを水浴中にて振盪しながら４２℃で２時間行う（Ｊａ ｃｏｂｓら、１９８８）。片を、ＲＴで５分間、１ｍＭの予め暖めた（３７℃） の洗浄緩衝液（３Ｍ　ＴＭＡＣＩ、０．２％ＳＤＳ、　５０＋ｎＭ　Ｔｒｉｓ、 ｌＩＣｌＸｐＨ８，０）で２回洗浄し、次に５１℃で３０分間ストリンンエント な洗浄、ならびに簡単な洗浄工程をＲＴで行う。この時点で洗浄緩衝液をすすぎ 溶液（Ｒｉｎｓｅ　５ｏｌｕｔｉｏｎ：ＮａＣ１、Ｔｒｉｔｏｎ、　０．５％Ｎ ａＮ３を含むリン酸緩衝液：イノーリパ（Ｉｎｎｏ−Ｌｉｐａ）、イノジエネテ イツクス（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）、アントワープ、ベルギー）に交換し、 片をＲＴで２回、１ｍＭですすぐ。最終的に、片を結合希釈物（Ｃｏｎｊｕｇａ ｔｅ　Ｄｉｌｕｅｎｔ：Ｎａｃｌ、Ｔｒｉｔｏｎ、タンパク質安定化剤、０．１ ％ＮａＮ３を含有するリン酸緩衝液：イノ−リア（Ｉｎｎｏ−Ｌｉａ）、イノジ エネティックス、アントワープ、ベルギー）ですすぎ、４０００Ｘに希釈したス トレプトアビジンを含有する結合希釈物とインキュベーションし、アルカリフォ スファターゼ（ギブコＢＲＬ）でさらにＲＴで３０分間標識する。片を再度すす ぎ溶液で３回、基質希釈物（Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　Ｄｉｌｕｅｎｔ：ＮａＣ］お よびＭｇＣ１２を含有するＴｒｉｓ緩衝液：イノ−リア、イノジエネティックス 、アントワープ、ベルギー）で１回洗浄する。
発色はＢＣＩＰおよびＮＢＴを基質希釈物に加えて、この片をＲＴで３０分間イ ンキュベーションすることにより行う。発色は緩衝液を蒸留水と交換することに より停止する。
５、ＨＣＶタイプ１．２および３間を識別するためのＬｉＰＡタイプ３に対する プローブのための配列を血清ＢＲ５６（受は入れ番号Ｄ１３４４８）由来のｃＰ ＣＲクローンから得た。公表されたタイプ１配列をＢＲ５６と比較した時、４か ら６個の変異を含む１６ヌクレオチドのふたつの領域が、いつも観察された。驚 くことには、タイプ２配列が入手できるようになった時、これらふたつの領域で の変異が再び維持されていたことである。ゆえに、タイピング用プローブの位置 はこれらの領域中から選ばれ、その領域はタイプ間で比較的低程度の相同性を有 するが、ひとつのタイプの中ではよく保存されていた。第−片は全部で８つの別 個に固定化されたオリゴヌクレオチドが適用された。それらのふたつはＨＣＶタ イプ１（ＨｃＰｒ１２４、配列番号５、および１ｌｃＰｒ１２５、配列番号６） に、４つはＩＩｃＶタイプ２（ＨｃＰｒ１３６、（配列番号９）およびｔｌｃＰ ｒ１３７、（配列番号１０）はｎｃｖタイプ２ａに、ＨｃＰｒ１２６（配列番号 １１）およびＨｃＰｒ１２７（配列番号１２）はタイプ２ｂに）に対し、ならび にふたつはＩＩＣＶタイプ３（ｔｌｃＰｒ１２ｇ、配列番号１３、およびＨｃＰ ｒ１２９、配列番号１４）ＩＩｃＶに対するものであった（表４）。
ｃＰＣＲ生成物を２３種のブラジル人血清（ＢＲＩからＢＲ２３）から合成し、 ならびにハイブリダイゼーション後にその中の１７がタイプ１の１６ｍａｒを認 識した。４種のタイプ３血消がタイプ２ａ血渭と共に見いだされた。血清ＢＲ２ ３をタイプ１およびタイプ３と−１−・インフエクションさせた。２種の日本人 のプール血清を続いて試験した：ＪＰ６３はタイプｌおよびタイプ２ａプローブ と反応し、ＪＰ６２ブールの大部分がタイプ２ａ配列を含有していた。プライマ ーＨｃＰｒ９５（配列番号３）とＨｃＰｒ９６（配列番号４）との間の領域のｃ ＰＣＲクローニングおよび配列決定後、ＪＰ６２（第２図）はタイプ２ａである と確定した。タイプ２ｂプローブであるＨｃＰｒ１２６（配列番号１１）および ｌ１ｃＰｒ１２７（配列番号１２）は、ＪＰ６２がそれらとは反応しなかったが 、それぞれたった１つか、および２つのヌクレオチドがＪＰ６２（受は入れ番号 ＤＩ３４５３）の配列と異なっていた。それゆえに、選択したハイブリダイゼー ションおよび洗浄の条件はたいへんストリンジェントであり、このアッセイでは わずかひとつの誤対合もハイブリダイゼーションを許さない。
６、サブタイプ間の識別 すべての入手可能なタイプ１コード配列を注意深く比較した後、ふたつのサブタ イプ（ｌａおよびｌｂ）を７９％の平均ゲノム相同性で明らかに区別できる。５ °ＵＲ領域において、ＨＣＶ−ＪとＨＣＶ−１との間にたったふたつの変異が、 入れ子状に重複したＰＣＲ生成物領域に観察されただけで、９８．８％の相同性 を示した。ＨＣＶ−１（ｌａ）とＩＩｃＶ−Ｊ（ｌｂ）との間にはわずかふたつ の変異が存在したが、−９９位で観察されるＡからＧへの転換はこれまでに調査 したすべてのタイプ１ｂ単離物で起こることが観察された。それゆえに、プロー ブＨｃＰｒ１３８（配列番号７）へのハイブリダイゼーションは、Ｇへ置換した 領域にも広がるが、タイプ１ｂ単離物であることを示している。
すべての入手しつるタイプ３の５’　ＵＲ配列（本発明：　Ｂｕｋｈら、１９９ ２ＨＣｈａｎら。
１９９２；Ｌｅｅら、１９９２）を比較する時、−１３９位での、共通なＧ（タ イプ３ａ；ＨｃＰｒ１４０、配列番号１５）の存在、またはよりまれであるが＾ （タイプ３ｂ：ＨｃＰｒ１３９、配列番号１６）の存在により、単離物をふたつ の群に分割できた。タイプ２ａとタイプ２ｂとの間（またはに２ａとに２ｂとの 間）の識別は上記に報告したように可変領域中で行うことができた。
タイプ１および３についてのこれらすべてのタイプーおよびサブタイブー特異的 プローブの組み合わせ（表４）は、１７種のブラジル人血清（すでにタイプ１を ８つの１ａタイプ、および９つのタイプ１ｂ血清に特徴ずけられたもの）を分け ることを可能にする。４つのタイプ３血清のうち３つがタイプ３ａ系とハイブリ ッドを形成した。コーインフェクンヨンさせた血清ＢＲ２３のｃＰＣＲ断片中の 異なる分子がタイプ１ｂおよびタイプ３ａの系とハイブリダイズした（第３図、 第８片）。
別の３８のブラジル人血ｆｉ　（ＢＲ２４からＢＲ６１）をこの新しいＬｉＰＡ で試験した。
これらの血清を選択するにあたっての最も有力な基準は、ＮＳ４およびＮＳ５エ ピトープに関する抗体の不存在であった。なぜならば以前の報告ではタイプ２お よびタイプ３抗−ＮＳ４抗体と、タイプＩ　ＮＳ４抗原との間に低度の交差反応 があったからである（Ｃｈａｎら、１９９１）。３８のブラジル人血清のうちの １２がタイプ１ａと、１４がタイプ１ｂと、９がタイプ３ａと、２がタイプ３ｂ と、ならびにひとつはタイプ１ｂおよびタイプ３ａとのコーインフエクションで あると決定できた。すべての試験したブラジル人血清はタイプを決定できたと結 論した。タイプ３サブタイプ間の識別に関連性があるかどうかを決定することが 残る。ＴａおよびＴｂ単離物の５°ＯＲ由来の配列データ（Ｍｏｒｌら、１９９ ２）は公表されてないので、我々のタイプ３ａおよび３ｂの分割は未だ試験的な ものである。血清学および塩基の読み取り枠についてのさらなるデータが、タイ プ３およびタイプ４のサブタイプの決定を確立するためには必要である。
７　タイプ４単離物の同定およびタイプ４−特異的プローブのＬｉＰＡへの編入 ６人のブルンディー人血清（ＢＬ１７４からＢＵ７９）から増幅したＰＣＲ断片 は、片上のいずれのｌ　５−ｍｅｒとも反応できなかった。これらブルンディー 人試料（ＢＵ７４　：受は入れ番号別３４４９（これはＢＵ７６と同一）、およ びＢＵ７９　：受は入れ番号０１３４５０；第２図）からの３つのＰｃｔ？断片 をクローン化し、配列決定した。
以前記載されたほとんどのタイプとは明らかに異なる配列が得られた。
ブルンディー人試料は互いに、およびＺ６（Ｂｕｋｈら、１９９２）と関連して おり、タイプ３またはタイプ２よりもタイプｌにより高い相同性を表す。しかし タイプ１とのほとんどの相違は、ここでも可変領域に位置していた。最も驚くべ き発見は、ＢＵ７４およびＢＵ７６において、−１３９位と一１４０位の間にひ とつの余分なヌクレオチドが存在することである。この結果は新規＋ＩＣＶタイ プ（複数のタイプ）またはサブタイプ（複数のタイプ）が存在することに賛成の 議論を支持し、これを暫定的にタイプ４と呼ぶ。これらアフリカ人から増幅でき たウィルスの５°ＵＲ配列は、以前記載されたタイプとは、互いに大変異なった 。それゆえにこれらの単離物は暫定的にタイプ４と命名した。アフリカから得ら れた同様な配列が、Ｂｕｋｈら（１９９２）の研究でも見られたが、ひとつはオ ランダからのものであった。第２図は、ヌクレオチド−２９１と−５５の間の領 域において、この群内では最大８種の変異が可能であることを表す。タイプ４は さらにいくつかのサブタイプから構成されるようであり、すなわちこれらのサブ タイプはタイプ１のサブタイプとは異なるようである。
これらのデータを得た後、ＬｉＰＡは３つの点で改良された。第一にオリゴヌク レオチドＨｃＰｒ１４２（配列番号２０）（ひとつの縮退を持つ）が、ＰＣＢ生 成物の存在を確認するための万能＋＋ＣＶプローブとして高度に保存された領域 から選択された（表４）。第二に、３種のオリゴヌクレオチド（ＨｃＰｒ１４４ 、配列番号１７（ひとつの縮退をもつ）、ＨｃＰｒ１４５、配列番号１８および ＋ＩｃＰｒ１４６、配列番号１９：表４）をタイプ４配列の同定のために合成し た。第三に、万能タイプ２プローブを可変領域の外側から選択した（ＩｌｃＰｒ １４７、配列番号８、表４）、なぜならタイプ２の検出のだめの万能プローブを 、−１７０位と一１５５位の間、および−１３２位と一１１７位との間の領域か ら選ぶことができなかったからである。
この様式のＬｉＰＡで、ブルンディー人血清（表３）からの６ＰＣＲ断片を期待 どおりタイプ４に分類した（第３図、第６および７片）。ふたつのガボン人血清 、オランダからの４血清および６つのベルギー人血清も調査に含めた。
ＧＢ８０からタイプ４ＨＣＶ５’　ＵＲが増幅でき、これをクローン化し、およ び配列決定した（第２図）。他のガボン人血清ＧＢ８１はタイプ２（クローン化 され、配列決定された、第２図）の変異体とタイプ４のコーインフエクションを 表した。後者はＢＵ７９と同じタイピングパターン（第３図、第７片）を与えた 。ＧＢ８１とタイプ２およびタイプ４プローブとの反応が、タイピングプローブ 間の予期せぬ交差反応により起こるのか、または単にコーインフエクションの結 果なのかを確かめるために、ｃＰＣＲ生成物をクローン化し、１７の別個のコロ ニーをＰＣＲおよびＩＩＣＶ　ＬｉＰＡに供した。１０（５９％）コロニーがタ イプ４の挿入を含み、および７つがタイプ２を含み（４１％）、明らかに同−血 清内で２つのタイプのＨＣＶのコーサーキュレーション（ｃｏ−ｃｉｒｃｕｌａ ｔｉｏｎ）を示していた。３つのＮＥ−血清は０ｒｔｈｏ　ＲＩＢＡ試験に陰性 、およびＩｎｎｏ−ＬＩＡｌｌｃＶ　Ａｂ試Ｍｌ：陽性（ＮＨ４Ｉ）、不確定（ ＮＥ７２）または陰性（ＮＥ７３）なノテ、タイプ３ａ単離物が存在することを 示すことができた。第４のＮＥ血清は、０ｒｔｈｏ　ＲＩＢＡおよびｌＮＮ０− ＬＩＡの両方によい反応性を示すが、タイプ１ａ単離物を含有した。最終的に、 分析した６つのベルギー人血清から、ＢＥ６４からＢＥ６７がタイプｌｂ株に感 染していた。イタリアからの患者１人（ＢＥ６８）はタイプ２ａ感染であり、な らびにＢＥ６９はタイプ３ａ配列を含有した。後者は慢性の、ウィルス性一様の ＮＡＮＢ肝炎の症例から得たものであったが、すべての第二世代アンセイ、なら びに抗−ＮＳ３、抗−Ｅｌおよび抗−Ｅ２リサーチアッセイに陰性であった。こ の血清はきわめて低いウィルス価を有し、および２年の開に採取された４つの別 個の試料で、第二回のＰＣＲ（ｉｔにわずかに陽性になり、ＨＣＶ診断では入れ 千秋に重複したＰＣＲの必要性を示した。入れ千秋に重複したＰＣＲ断片の配列 は、ＢＲ５６と同一であった。タイプ３株が示す変異は大変少ないので、このこ とは驚くことではなかった。
全部で１９の種々のオリゴヌクレオチドを第３図に示すようなＬｉＰＡ片様式に 使用した。い（っがのオリゴヌクレオチドは同じＩＩｃｖサブタイプに対してい るので、タイプ２ａのためにプローブＨｃＰｒ１５６（配列番号２２）ｔ４（Ｃ Ｐｒ１５８（配列番号２４）とともにプールした。タイプ４に対するオリゴヌク レオチドは別個に適用した、なぜならこの時点ではコード領域がらの配列情報が 極めて少なく、したがってサブタイプへの分割（あるとすれば）は未だできない からである。いくっがのタイプ４配列中の余分な塩基の存在により、この群をさ らにサブタイピングする試みの基礎をっ（ることかできる。いくつかの代表的血 清で得られた結果を第３図に表す。これらの片の解釈は表２に与えられる。
この調査で６１のＰＣＲ−陽性ブラジル人１１ＣＶ血清のタイプが決定された。
２０（３３％）ノ血清ハタイブ１ａＨＣＶ感染ヲ有シ、２３（３８％）ｌｔター ｉ”７’ｌｂ、　１（１，５％）はタイプ２ａ、１５（２４，５％）はタイプ３ 、および２（３％）の血清はコーインフエクションであることが分かった。コー インフエクションされた血清であることはＢＲ２３（第１図、レーン９；第３図 、片８）により図示される。残る２０の血清を５つの異なる国から集めた：８つ の血清がアフリカにあるふたつの国から得たものであった。
症例ＢＥ６７のような少数の場合において、タイプ１ｂＰＣＲ断片は３ｂサブタ イププローブＨｃＰｒ１３９（配列番号１６）を認識した。これは血清ＢＥ６７ のＴｂ配列が一１３９位でＴの代わりに八を有することを推定することにより説 明できる。ＪＰ６２（受は入れ番号Ｄ１３４５３）配列で得た結果は、オリゴヌ クレオチド中のひとつの誤対合力いイブリダイゼーション信号を認めない点から 、この推定がさらに支持される。単離物−特異的変異は５°ＵＲ中に散在してい るので、タイプが与えられた単離物が別のタイプのサブタイピングプローブとハ イブリダイズすることも可能である（第３図、片６および７を参照）。そのよう な反応性は、調べた単離物中にサブタイピングプローブの配列が存在することを 示すにすぎない。しかしＧＢ８１について調査したように、血清がコーインフエ クションしていない限り、多くのタイピングプローブとの反応性は観察されなか った。
一般的に、タイプｌａ　ｃＰｃＲ生成物がＬｉＰＡでハイブリダイズする時、プ ローブＨｃＰｒ１２４（配列番号５）、ｔｌｃＰｒ１２５（配列番号６）および ＨｃＰｒ１４２（配列番号２０）の配列が入れ子状に重複したｃＰＣＲ断片中に 存在しなければならない。したがって１８４ｂｐ（第２図）のうちの４８ｂｐ（ ２６％）が、即座にわかる。同じ理由から、ＩＩｃＶ　Ｊタイプと同様な単離物 は配列中の３３％、ＨＣＪ６タイプは３５％、ＢＲ５６タイプは３４％、Ｚ６お よびＢＵ７７タイプは２６％、ＢＵ７４タイプは４１％、ならびにＢ［Ｉ７９タ イプは３２％が知られていると計算することができる。しかし、１５−ｍｅｒの いくつかの縮退から情報が損失することを考慮しなければならず、したがってこ れらの割合は最大値である。にもかかわらず、この研究法はハイブリダイゼーシ ョン法による配列決定の考え方を支持するものである（Ｓｔｒｅｚｏｓｋａら、 １９９１）。
ＬｉＰＡと、我々のＬｎｎｏ−ＬＩＡ　ＩＩＣＶ　Ａｂアッセイのこれら血清の 抗体反応性とを比較する時（表３）、遺伝子型とそれらの表現型（血清型）との 間のいくつかの相関が明らかになる。ベル°ギー、オランダ、ガボン、およびブ レンディーからのタイプ３および４血清すべての第二世代の抗体アッセイとの反 応は、わずかに陽性、不確定、または陰性である。わずかに陽性の反応はほとん どが抗−コア抗体により起こるが、ＬＩＡ　ＮＳ４およびＮＳ５エピトープに対 する抗体は通常存在しない。これは免疫的交差反応を起こすわずかに異なるだけ のエピトープをコードする、コア配列の高度な保存に合致する。ＮＳ４およびＮ Ｓ５領域に対するエピトープは高可変領域に位置し、はとんどの免疫的交差反応 を起こすことはできない。現在の抗体アッセイはタイプ１エピトープを含んでい るので、タイプ２、タイプ３およびタイプ４感染血清の数％が陰性の結果を示す であろうことは可能である。しかし、タイプ３ブラジル人血清がタイプＩ　ＮＳ ４およびＮＳ５抗原と交差反応しないという結論を、我々の結果からは導くこと ができない（表３）。無作為に選択した１４の血清（ＢＲ２４から３７：表３） については、ＬＩＡ反応性と９つのタイプ１ウイルスとの間に１００％の相関が あった。４つのタイプ３血清かう２ツ（ＢＲ３４およびＢＲ３６）がＮＳ４と反 応し、３つが（ＢＲ３３，ＢＲ３４およびＢＲ３５）がＮＳ５と反応した。ＢＲ ３７はコーインフェクションゆえに考慮されなかった。単一のタイプに感染した ７７の血清のすべての血清学的データを分析した時、タイプ１血清の５８％およ び４４％がそれぞれＮＳ４およびＮＳ５エピトープを認識した。これらの割合は やや低く、それは選択基準のためである。タイプ３血清については、３７％およ び５３％がそれぞれＮＳ４およびＮＳ５と反応した。より高い交差反応性は高− 危険群で観察することができ、それは例えばヨーロッパの血液提供者を対象とし た結果と比較した場合のブラジルから得たこれら試料である（本発明およびＣｈ ａｎら、１９９２）。そのような交差反応する血清は多回感染によって誘導され ることができ、その中には同時に生じるものもある゛が、その他は続けて起こる だろう。
前の抗−ＨＣＶ記憶は新たなＨＣＶ感染により二次免疫され、ひとつのタイプの ウィルスのコーサーキュレーションを起こすことができ、別のタイプに対する抗 体を生じた。このような説明は、血清ＢＲ５６に関してあてはまり、この血清は ＩＩＣＶタイプ３と決定されたが、タイプ１コア、Ｅｌ、　Ｅ２．　ＮＳ３．　 ＮＳ４およびＮＳ５に対する抗体を含んでいた（データは示さず）。抗−タイプ ３抗体がこの血清に存在するかどうかを決定することが残る。
免疫応答の差異に加えて、種々のＨＣＶタイプは長期肝臓疾患に対する種々の経 過も表し、それらはすでに報告されている（Ｏｋａｍｏｔｏら、　１９９２ａ） 。
結論として、ＬｉＰＡは＋１（Ｊ感染のタイプを迅速に決定できる。このアッセ イは異なる４つのＨＣＶタイプおよび８つのサブタイプ間を識別する能力を有し 、新らたなタイプを決定するための良い手段である。
さらに、このアッセイはｃＰＣＲ反応をＲＮＡ−捕獲ＰＣＲと交換することによ りさらに改良できる。最終的に、このアッセイは遺伝子型、将来的に血清型と、 臨床状態または疾患の結果との関連を確立するさらなる道具となることが証明で きた。
８、新規タイプおよびザブタイプの識別、およびそれらを分類するために有用な プローブ ベルギーから得た単離物ＢＥ８２、ＢＥ９０、ＢＥ９１．　ＢＥ９２、ＢＥ９３ 、ＢＥ９４、ＢＥ９５、ＢＥ９６、ＢＥ９７、ＢＥ９８　：カボ゛／から得たＧ Ｈ４８、ＧＢ１１６、ＧＢ３５ｇ、ＧＢ５６９、ＧＢ５４９、ＧＢ８０９、ＧＢ ４８７、ＧＢ７２４およびｃＢ４３８；カメルーンから得りＣＡＭ６００おヨヒ ｃＡＭ７３６：をさらに研究するために確保した。なぜなら実施例３および４に 従い、プローブ５から２７を含むＬｉＰＡによる遺伝子型の決定後に、異常な反 応性が観察されたからである。５゛非翻訳領域の配列を、実施例２に記載された ように配列番号１．２．３および４を使用する入れ子状に重複したプライマーに よるＰＣＲ法、クローニングおよび配列決定後に得た。これらのほとんどの単離 物に関するＮＳ５コード領域中の配列情報が得られ、既知の配列との整合配列を 第５図に表す。各サブタイプに関する典型的単離物のＮＳ５核酸、およびアミノ 酸配列の相同性を、公表された単離物の配列と共に表６に与える。この計算は第 ４図に与えるように、タイプおよびサブタイプへの分類を可能にする。いくつか の原型配列を持つこれら新規の単離物の５′非翻訳領域のヌクレオチド整合配列 も第４に与えられる。
ＨＣＶ−１と比較すると数個の変異が観察できる。５°非翻訳領域中の同一変異 は、コード領域中の同様な配列と相関するので、そのような変異は本発明におい て、新規タイプおよびサブタイブー特異的プローブを設計するために採用する。
ＢＥ８２はサブタイプ１ｂの単離物であるが、−９４位でＣ変異を表し、それゆ えにプローブ７とは反応できなかった。ＮＳ５領域を配列決定した後に、この単 離物がサブタイプ１ｂに属するものと結論できた。ゆえにプローブ３゜（−９４ 位でＴおよびＣの縮退を含む）はサブタイプ１ｂのより良い遺伝子型決定をする ことができるはずである。
ＢＥ９０は、別のサブタイプ１ｂ単離物であるが、−１５９位でＴ変異を、およ び−１２６位でＣ変異を表すので、万能プローブ２ｏおよび２７、ならびにサブ タイピングプローブ７とのみ反応した。ＮＳ５領域の配列決定では、単離物がサ ブタイプ１ｂに属することが分かった。プローブ２８（Ｔおよび一１２６位での Ｃの縮退を含む）はタイプ１および６のよい遺伝子型決定ができるはずである。
単離物ＢＥ９２は万能プローブ２ｏおよび２７に加えて、プローブ８および２６ とのみ反応した。すなわちこの単離物はタイプ２と分類できるが、サブタイプを 決定することはできなかった。それはプローブ２３．２４．２５または２６との 反応性が観察できなかったからである。配列決定した後に、ふたつの新らたなモ ティーフをまさに観察することができた：　ＧＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＧ （プローブ３３１：ヨリ包含サレル）、おヨヒＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＴＴＴＧＧ Ｇ（プローブ３４により包含される）。ＮＳ５領域の配列決定では、同一タイプ 内の分類と矛盾しないタイプ２ａとタイプ２ｂ単離物との相同性が明らかになっ たが、別のサブタイプではサブタイプ２ｃが提案された。
単離物ＢＥ９３およびＢＥ９４はサブタイピング用プローブ１４と、いかなる反 応性を表さなかった。５゛非翻訳領域およびＮＳ５領域を配列決定した後、これ らの単離物は３ａサブタイプに属すると結論した。ゆえに、プローブ３５のよう に一１１８位でＣおよび＾の縮退を含むプローブはサブタイプ３ａのよりよい遺 伝子型決定を可能にするはずである。
単離物ＧＢ４８、ＧＢ１１６、ＧＢ３５８およびＧＢ５６９は、ＬｉＰＡにおい てプローブ１７および１９で陽性のハイブリダイゼーション信号を表し、すでに 報告されているタイプ４単離物と同一であることを示すが、単離物ＧＢ５４９お よびＧＢ８０９は万能プローブとしか反応しなかった。５°非翻訳領域、および ＮＳ５の一部分の配列が得られた。第５および６図、ならびに表６からＧＢ３５ ８により表される単離物はタイプ４の同じサブタイプに属すると結論でき、それ はサブタイプ４ａと提案される。しかし、ＧＢ５４９およびＧＢ８０９のいずれ もサブタイプ４ａ、　４ｂおよび４ｄ単離物と、ならびに互いに低い相同性を表 すが、ＧＢ８０９はＺ４と同じサブタイプに属すると思われる。これらの相同性 は同じタイプ４への分類に対応するが、タイプ４の異なるサブタイプへの分類で ある：ＧＢ５４９はサブタイプ４ｅへ、およびＧＢ８０９はサブタイプ４ｃへ分 類することが提案される。単離物ＧＢ１１６．　ＧＢ３５８およびＧＢ５６９が ら得た配列すべては、プローブ３８で検出可能であるモティーフＡＡＴＣＧＣＣ ＧＧＧＡＴＧＡＣＣ１ならびに、プローブ１９で検出可能であるモティーフＴＴ ＴＣＣＧＧＧＣＡＴＴＧＡＧＣを表す。したがってプローブ３８および１９は、 サブタイプ４ａの検出および分類に有用である。プローブ３８はサブタイプ４ａ 、　４ｂ、　４ｄ、　４ｆおよび３ｂに特異的であり、一方ブローブ１９はサブ タイプ３ｂ−、４ａ、および４ｄを認職するが、新タイプ３ｃおよび４ｆともハ イブリダイズする。興味深いことには、新タイプ３ｂ配列）ＩＣＶ−ＴＲがこれ らのプローブと交差反応する。しカルタイプ３−特異的プローブ２１との反応性 から、３ｂは依然タイプ３と分類できる。
ＧＢ５４９も特徴的な−Ｔニーｒイー７を表す。モーｒ　イー７　ＡＡＴＣＧＣ ＣＧＧＧＡＣＧＡＣＣはプローブ４０テ検出でき、および配列ＡＡＴＧＣＣＣＧ ＧＣＡＡＴＴＴＧ１１プロ−フ４１テ検出しつる。したがってプローブ４ｏおよ び４１はサブタイプ４ｂのサブタイピングに有用である。
ＧＢ８０９と同一の反応性は、ＬｉＰＡにおいてカメルーンがら得たふたつの試 料ＣＡＭ６００およびＣＡＭ７３６で得られた。ＮＳ５領域を配列決定した後、 これらの試料はＧＢ８０９と同一のサブタイプに属すると結論でき、ならびに５ ゛非翻訳領域を配列決定した後に、すでにＧＢ８０９に存在するふたつの同一モ ティーフが再び検出された。すなわちプローブ４２で検出しうるモチイー　７　 ＡＡＴＣＧＣＣＧＡＧＡＴＧＡＣＣ，およびプローブ４３テ検出しうるＡＡＴＧ ＣＴＣＧＧＡＡＡＴＴＴＧがサブタイプ４ｃに特徴的であることが分かり、プロ ーブ４２および４３はサブタイプ４ｃの検出および分類用に有用であると思われ る。しかしｚ４は、同じサブタイプ４ｃへの分類に対応するＥ１領域中に相同性 を示すが、ここでも独自な５’　ＵＲ配列を表し、プローブ７．５ｏおよび５３ で検出できる。
単離物ＧＢ４８７．　ＧＢ７２４およびＢＥ９７の５°非翻訳領域中の新規配列 が検出された。これらの単離物に関して、ボード領域の配列情報に基づくのでは ない新なサブタイプの分類が暫定的に提案された。すべて３種の単離物がプロー ブ５０で検出可能な配列、ＴＧＣＣＴＧＧＡＡＡＴＴＴＧＧＧｔ１４ｔ。ＧＢ４ ８７ハ７’ローブ４９で検出可能な独自の配列ＡＡＴＣＧＣＣＡＧＧＡＴＧＡＣ Ｃを表し、暫定的にサブタイプ４ｈに分類される。ＧＢ７２４およびＢＥ９７は 、両方ともプローブ５３で検出可能な配列、ＧＧＡＡＴＣＧＣＣＡＧＧＡＣＧＡ を含有し、暫定的にサブタイプ４ｇに分類される。
タイプ４単離物は、通常−２３８位にＴ、および−２３５位に＾を表す。それゆ えに、プローブ３７．３８および５１はより良いタイプ４の遺伝子型決定を行う ことができるはずである。
別の例において、ＢＥ９５はＬｉＰＡにおいてプローブ７および１７とのみハイ ブリダイズするが、すべての他の単離物とコード領域における低い約６８％の相 同性を表す。しかしＢＥ９５と同じサブタイプへの分類（サブタイプ５ａと提案 される）で一致し、ＢＥ９５に対する相同性を表すＢＥ９６は除外する。ＢＥ９ ５．　ＢＥ９６およびＳＡＩはすべてプローブ４４で検出可能な同じモティーフ 、Ｇ＾ＧＴＧＴＣＧＡＡＣＡＧＣＣＴ　＋プローブ４５および４７で検出可能な ＾＾ＴＴＧＣＣＧＧＧＡＹＧＡＣＣ。
プローブ４６で検出可能なＴＣＴＣＣＧＧＧＣＡＴＴＧＡＧＣを表す。したがっ てプローブ４４．４５．４６および４７はタイプ５ａの遺伝子型決定のために有 用である。
配列はＢｕｋｈら（１９９２）により公表され、それらは独自のＣ＾挿入を−１ ４４および一１４５位の間に含む。これらの単離物は暫定的にタイプ６と分類さ れ、およびプローブ４８の手段によって検出できる。
新たなＣ型肝炎ウィルスが単離物ＢＥ９８から発見され、これはＬｉＰＡでプロ ーブ１９とのみ反応した。５°非駐訳領域の配列には、プローブ５４で検出しう る新たなモティーフ、ＧＡＡＴＣＧＣＣＧＧＧＴＴＧＡＣが含まれる。コア領域 の配列決定により、遺伝子型３ａおよび３ｂに対しおよそ等しく相違する相同性 を表す配列が明らかとなり、この原型配列には新たなタイプ３Ｃが提案される。
単離物ＧＢ４３８は、プローブ３８および１９で検出しうるサブタイプ４ａに典 型的な配列モティーフを含有するが、Ｅ１領域ではやはり異なる配列を表し、タ イプ４ａ内の新たなサブタイプを表し、これをサブタイプ４ｆと命名した。サブ タイプ４ａからの識別は配列番号５１および７を用いたプローブの手段によって 行うことができる。
プローブ２９はＢＥ９０の配列がら得たもので、プローブ５１および５２はＧＢ ７２４の配列から得たものであるが、特定のＩＩＣＶタイプまたはサブタイプの 遺伝子型決定を向上させるために有用でありうる。
実施例９：ヌクレオチドディスタンスの計算系統発生分析 すでに公表された配列はＥＭＢＬデータベース、公開３５がら得た。他の配列は 本発明者により分析され、およびＤＤＢＪデータベースに寄託した。配列は系統 学推論パッケージ、３．５０バージヨン（Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ　Ｉｎｆｅｒｅｎ ｃｅ　Ｐａｃｋａｇｅ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　３．５ｃ）フェルセンスティン、１９ ９３年３月（Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ、　Ｍａｒｅｈ　１９９３）に対する連続 的様式中に与えられた。同一長の配列のみが同じ計算ニ含マレタ。使用シタフｏ 　’；ｆ　ラムハＤＮＡＤＩＳＴ、　ＰＲＯＴＤＩＳＴ、　ＤＮＡＰＡＲＳ、　 ＰＲＯＴＰＡＲ３，ＮＥＩＧＨＢＯＲ，５ＥＱＢＯＯＴ、　Ｃ０Ｎ５ＥＮＳＥオ ヨヒＤＲＡＷＴＲＥＥテアツタ。最大ＤＮ＾ティスタンスの見込マトリックスは 、Ｋｉｍｕｒａ−２パラメーター設定を使用してＤＮＡＤＩＳＴにより作成され た。ブートストラップ分析は５ＥＱＢＯＯＴを使用して、２０００反復で行った 。これらすべてのマトリックスをさらにＮｅｉｇｈｂｏｒ−Ｊｏｉｎｉｎｇ設定 を使用しＮＥＩＧＨＢＯＲで分析し、ならびにＣ０Ｎ５ＥＮＳＥで分析してコン センサス樹系を計算した。５ＥＱＢＯＯＴデータ設定もＤＮＡＰＡＲＳプログラ ムで１１３０回の反復で分析された。推定のタンパク質配列は、ＰＲＯＴＤＩＳ Ｔで分析され、続いてＮＥＩＧＨＢＯＲで分析された。最終的にプログラムＤＲ ＡＹＴＲＥＥは系統発生樹系図の図形的出力を創造するために使用された。すべ ての分析はＳＵＮ　５ＰＡＲＣＩＰＸコンピューターステーションで行われた。
ＮＳ５領域 Ｅｎｏｍｏｔｏらにより記載されたプライマーの組（１９９０）を使用して、１ ３の種々の単離物由来の３４０ｂｐ長のＮ５５ｂ　ＰＣＲ断片を増幅、クローン 化および配列決定した。このヌクレオチド配列を、ＰＨＹＬＩＰ　３．５ｃパツ ケージのＤＮ＾ＤＩＳＴプログラム（Ｆｅｌｅｓｅｎｔｓｔｅｉｎ、　１９９３ ）を使用して系統発生樹系図を作るために使用した。６つの主な群または゛タイ プの多様性はこの根無し木の証明である。各群はさらにふたつ以上の亜群または ′サブタイプ′に細分することができた。以下の集団（緊密に関連した単離物か ら成る群）が作られた：１ａ、１ｂ、２ｂ、　３ａ、３ｂ、４ａおよび５ａ０こ の集団化は反復２０００の５ＥＱＢ００Ｔ／ＤＮＡＤＩＳＴ／ＮＥＩＧＨＢＯＲ ／Ｃ０Ｎ５ＥＮＳＥプログラムを使用する１００％のブートストラップ様式の再 サンプルデータに現れた。ブートストラップ様式のＤＮＡＰＡＲ３分析も同様な 集団化を生じた。ＤＮＡＤＩＳＴマトリックスから、単離物間、タイプ間および サブタイプ間の分子の進化的ディスタンスを計算できた。上記に示した分割され た集団のみをこれらの計算に含めた。
ひとつのサブタイプの単離物間でこの範囲は０．０１４８から０．１０６４（平 均０゜０６２３　；標準偏差０．０１８１）であった。サブタイプ間のディスタ ンスは０．１６５４から０．２６７５（平均０．２３１２：標準偏差０．０１８ ２）であり、タイプ間では０．３５８１から０．６５４９（平均０．４９４２． 標準偏差０．０４８５）の範囲であった。しかし例外も現れた。
！１ｃｍＪ６と単離物ＢＥ９２との間のディスタンスは０．１５３９であり、デ ィスタンス間としては低いディスタンス値であるが、しかし同一サブタイプ間に 属する単離物間で得られたどのような値よりもはるかに高かった。ＨＣ−Ｊ６と ＢＥ９２との間のＮＳ５ヌクレオチド配列の相同性は８６．２％だった。ブート ストラップ様式のＤＮＡデータベースは両方の配列をこの場合９８．８％にまと め、これはサブタイプ２ａ分類に関しては異議のあるところであるが、しかし分 子進化的ディスタンスおよびＢＥ９２の５°ＬＩＲの配列から暫定的にこの単離 物をサブタイプ２ｃに分類した。
ＧＢ８０９はタイプ４ａ集団から、０．１５０９（最小／最大＝　０．１３８４ １０．１５９７）（７）平均ディスタンスに位置した。８７．４％の最大相同性 がＧＢ８０９とＧＢ３５８（タイプ４ａ）の間に存在する。しかし、これらのデ ータがら、観察された５’　ＵＲ中の変異性と共に新たなタイプ４サブタイプ４ ｃを作ることが可能になる。ＧＢ５４９は新たなサブタイプ４ｅを表し、ヌクレ オチド水準で４ａ集団から０．２４２６のディスタンスを：サブタイプ４ｃから ０．２４０３のディスタンスを；およびＧＢ４３８から０．１７３８のディスタ ンスを有する。単離物ＧＢ４３８はおそらく別のタイプ４サブタイプを表すかも しれないが、暫定的に４ｆと命名する。
コア／Ｅｌ領域 ＤＮＡ５ＤＩＳＴプログラムを使用するヌクレオチド３７８と９５７との間にあ るコア／Ｅｌ領域に関する系統発生樹系図は６つの主要支脈を生じ、６つの異な る遺伝子型を表す。２０００回の反復でブートストラップ様式のりサンプリング 分析から、１００％の確実性で、以下の集団を明らかにできた；サブタイプ１ａ 、ｌｂ、　２ａ、２ｂ、３ａおよび４ａ０サブタイプ４Ｃ％　４ｅ、　４ｆおよ び５ａはひとつの単離物により表されるだけなので、この集団化はこれらには不 適当である。ＤＮＡＤＩＳＴマトリックスに基づき、同一サブタイプに属する単 離物に関する分子の進化的ディスダンスは、０．０４０２がら０．１１１（平均 ０．０７７２、標準偏差０．０１９７）、サブタイプ間は０．１８６４から０． ３５３５（平均０．２８３３、標準偏差０．０３５０）、およびタイプ間は０． ３８２４から０．６２３０（平均０．４８９４、標準偏差０．０５５４）の範囲 にあった。
ＤＮＡＤＩＳＴマトリックスからのディスタンスはさらに、タイプ４中に少なく とも４つの異なるサブタイプが存在する証明を提供した。タイプ４ａは０゜００ ８３の平均相互ディスタンスを有する；一方タイブ４ｃ、４ｅおよび４ｆでの平 均は０．２６０２であった。サブタイプ４ｃおよび４ｆは４ｅから、それぞれ０ ．２０４７および０．１８６４離れており、一方４ｃと４ｆとの間のディスタン スは０．２３１６であった。
ＮＳ３／４領域 すでに記載したタイプ３ａエピトープ領域（Ｓｔｕｙｖｅｒら１９９３ａ）およ びＥＭＢＬデータバンクの他の配列を含むＤＮＡ配列は、ＤＮＡＤＩＳＴおよび ＮＥＩＧＨＢＯＲを使用してヌクレオチドディスタンスを計算するために使用さ れた。ＤＮＡＤＩＳＴマトリックスから単離物間の分子的進化のディスタンスは ０．０４０７から０゜１１８１（平均０．０８５５、標準偏差０．０１９０）、 サブタイプ間は０．２２８１がらｏ、２６０３（平均０．２４１６、標準偏差０ ．００９８）およびタイプ間は０．４０５２から０．６２４７（平均０．４８８ ９、標準偏差０．０５３１）の範囲であった。
実施例１０ 実施例の導入部、および前述の実施例中に記載したように、５’　ＵＲの可変領 域は遺伝子型に特異的な配列を、実施例８に記載したように新たに発見された遺 伝子型中にも含むと期待され、従ってそのような新たな遺伝子型−特異的モティ ーフは、実施例８に記載したような遺伝子型−特異的プローブの手段によって再 度検出されるべきである。それゆえに、プローブ３２および実施例８に記載した プローブ３１．３３．３４．３７．３８．４４．４５および４６を合成し、ニト ロセルロース膜に適用し、実施例３および４に記載したようなビオチン−標識Ｐ ＣＲ断片を用いたラインプローブアッセイを行った。ただしＰＣＲ断片の合成中 に、ｂｉｏ−１１−ｄＵＴＰから取り込まれたものではな（、配列番号３および ４を用いた５゛−ビオチン化プライマー、または配列番号１および２を用いた５ °−ビオチン化プライマーから取り込まれたビオチンを用いたＰＣＲ生成物の標 識は除外した。
第６図は、ＨＣＶのタイプ１ではないＨＣＶタイプ２の５’　ＯＲ断片の、配列 番号３２を用いたプローブへのタイブー特異的ハイブリダイゼーションを表す。
サブタイプ２ａおよび２ｂ単離物の両方が特異的にプローブ３２とハイブリダイ ズした。
第７図において、配列番号３３および３４のプローブは、血清ＢＥ９２由来の遺 伝子型２ｃ　ＰＣＲ生成物と特異的にハイブリダイズすることを表すことができ た。一方遺伝子型２ａおよび２ｂ血清は、それぞれ２ａおよび２ｂ遺伝子型−特 異的プローブとの特異的ハイブリダイゼーションを観察することができたが、こ れらのプローブ（配列番号３３および３４）に対しては反応しなかった。新しい 遺伝子型２ｃは、最近発見された他の遺伝子型２ｃとは異なるかもしれないと思 われたので、このサブタイプの種類のための別の名前が提案できる。
第８図は、タイプ４血清を用いて行ったラインプローブアッセイを表し、最も共 通なタイプ４血消のプローブ３７および３８への特異的ハイブリダイゼーション を表す。
第９図は、タイプ５ａ血清のプローブ４４．４５．４６およびプローブ７に対す る特異的ハイブリダイゼーションを図解し、一方タイブ４血清の反応性は通常プ ローブ３１に限られ、プローブ４４がら４６に対しては存在しない。
それゆえに、配列番号１８のプローブのタイプ４およびタイプ５単離物の両方に 対する混乱は、今では配列番号１９のプローブに加えて配列番号３７．３８．４ ４．４５．４６．７．３０、おび３１のプローブを遺伝子型４および５を識別す るために採用することにより、便利に克服できる。
実施例１１ 実施例３および４で概説したような他のハイブリダイゼーション条件（温度およ び緩衝液）を使用することが好ましいかもしれない。それゆえに、配列番号９３ ．９４．９５および９６のプローブをニトロセルロース膜に適用した。第１０図 は実施例４に記載されたようなタイプ４血清ＧＢ１１６およびタイプ５ａ血消Ｂ Ｅ９５を用いたラインプローブアッセイを表すが、以下が異なる：ＰＣＲ断片を ＮａＯＨ／ＳＤＳ中で変性させた後、３ＸＳＳＣ（Ｍａｎｉａｔｉｓら、（１９ ８２））および１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）から成る１、０ｍｌのハ イブリダイゼーション溶液（５０°Ｃに予め暖めた）を変性ＰＣＲ生成物に加え 、ハイブリダイゼーションを振盪湯浴中で５０℃、２時間行った。片を同じハイ ブリダイゼーション緩衝液で５０°Ｃで３０分間洗浄し、その後実施例４に記載 されたように洗浄および発色を行った。第１Ｏ図では、明らかなタイブー特異的 反応を観察できる。それゆえに、タイプ−特異的ハイブリダイゼーションは、ハ イブリダイゼーションブローブにわずかに変更を加えた後に実施例４および１０ 中に記載されたような他のハイブリダイゼーション条件でも得られた。例えば特 定のハイブリダイゼーション条件で、より特異的なハイブリダイゼーションを行 うために、プローブの位置を変更することができ、例えばタイブー特異的ヌクレ オチドがプローブの中央部に位置するようにプローブを配置することができる。
特定のプローブについて、他のハイブリダイゼーション条件中でも特異性を保持 するために、連続的！１ＣＶ配列を長くし、または短くし、かつ／またはプロー ブのセンスを逆にして、特定の好ましい温度または塩濃度条件で遺伝子型−特異 的ハイブリダイゼーションを可能にすることも好ましいかもしれない。しかし場 合によっては、イノノン類または誤対合ヌクレオチドを含めて、遺伝子型−特異 的ハイブリダイゼーションが特定の温度または塩濃度条件で起こるようにするこ とが好ましいかもしれない。例えば配列番号３７のプローブは、タイプ４と５単 離物間を実施例１０に記載したようなテトラメチルアンモニウムクロライド緩衝 液中で識別できたが、いまでは連続的ＨＣｖ配列の３゛末端を２ヌクレオチド延 長することにより配列番号９３（５°−ＧＡＧＴＧＴＴＧＴＡＣＡＧＣＣＴＣＣ −３’　）に変更され、プローブ９３はＳＳＣ／ＳＤＳハイブリダイゼーション 緩衝液中で特異活性を表した（第１０図）。配列番号４４のプローブはタイプ４ と５単離物間を実施例１０に記載したようなテトラメチルアンモニウムクロライ ド緩衝液中で識別できたが、いまでは連続的１１ｃＶ配列の３′末端を１ヌクレ オチド延長することにより配列番号９６（５−ＧＡＧＴＧＴＣＧＡＡＣＡＧＣＣ ＴＣ−３”Ｉに変更され、プローブ９６はＳＳＣ／ＳＯＳハイブリダイゼーショ ンＶ！衝液中で特異滑液中表した（第１０図）。配列番号４６のアンチセンスプ ローブは、−１３２から−１１７の位置を標的とし、タイプ４と５の単離物間を 実施例１０に記載したようなテトラメチルアンモニウムクロライド緩衝液中で識 別できたが、今では配列ＩＳ番号９５（５’　−ＴＧＣＣＣＧＧＡＧＡＴＴＴＧ ＧＧ−３”）に変更され、これは−１２６から−１１１の位置を標的とするセン スプローブであり、プローブ９５はＳＳＣ／ＳＤＳハイブリダイゼ−ノヨン緩衝 液中で特異活性を表した（第１０図）。
実施例では当業者に対して、実施例４に与えたような遺伝子型−特異的変異、ま たは他の新たな、または今後発見される遺伝子型中に存在する遺伝子型−特異的 変異を標的とするためのプローブを開発する多（の可能性を説明した。
表　３　ＨＣＶ　ＬｉｐａタイピングおよびＨｃｖ抗体アッセイの最終結果引用 文献 Ｂａｒａｎｙ　Ｆ（１９９１）、クローン化耐熱性リガーゼを使用する遺伝子疾 患の検出およびＤＮＡ増幅（Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｄｅｔｅｃｔｉ ｏｎ　ａｎｄ　ＤＮＡ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉ。
ｎ　ｕｓｉｎｇ　ｃｌｏｎｅｄ　ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ　ｌｉｇａｓｅ、　 ）　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ＾ｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｉｔｓ＾８８：P ８９−１９３゜ Ｂｅｊ＾、　Ｍａｈｂｕｂａｎｉ　Ｍ、　Ｍｉｌｌｅｒ　Ｒ，Ｄｉ　Ｃｅ５ａｒ ｅ　Ｊ、　Ｈａｆｆ　Ｌ、＾ｔｌａｓ　Ｒ（１９９０）水中の病原細菌および指 標を検出するための多重ＰＣＲ増幅および固定化捕獲プローブ（Ｍｕｌｔｉｐｌ ｅｘ　ＰＣＲａＩＩＩｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅ ｄ　ｃａｐｔｕｒｅ　ｐｒｏｂｅｓ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂａ ｃｔｅｒｉａｌ　ｐａｔｈｏｇｅｎｓ　ａｎｄ　１ｎｄｉｃａｔｏｒｓ　ｉ■ ｗａｔｅｒ、）　Ｍｏｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｐｒｏｂｅｓ　４：３５３−３６５゜Ｂｕ ｋｈ　Ｊ、　Ｐｕｒｃｅｌｌ　Ｒ，Ｍｉｌｌｅｒ　Ｒ（１９９２）　Ｃ型肝炎ウ ィルスの５゛非コード領域の配列分析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　 ｏｆ　ｔｈｅ　５°ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｉｔ ｉｓ　Ｃｖｉｒｕｓ、　）　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　 ８９：４９４２−４９４６゜Ｂｕｋｈ　Ｊ、　Ｐｕｒｃｅｌｌ　Ｒ，Ｍｉｌｌｅ ｒ　Ｒ（１９９３）世界中から集められた単離物の推定上のＥ１遺伝子の配列分 析により予想されたＣ型肝炎ウィルスの少な（とも１２遺伝子型（＾ｔ　１ｅａ ｓｔ　１２　ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｃｖｉｒｕｓ　 ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｂｙ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈ ｅ　ｐｕｔａｔｉｖｅ　Ｅｌ　ｇｅｎｅ　ｏｆ　１ｓｏｌａｔｅｓｃｏｌｌｅｃ ｔｅｄ　ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ、）　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ ＳＡ　９０：８２３４−８２３８Ｃｈａ　Ｔ、　Ｂｅａｌ　Ｅ、　Ｉｒｖｉｎｅ 　Ｂ、　Ｋｏｌｂｅｒｇ　Ｊ、　Ｃｈｉｅｎ　Ｄ、　Ｋｕｇｏ　Ｇ、　Ｕｒｄｅ ａ　Ｍ（１９９２）、少なくとも５つの関連した、しかし別個のＣ型肝炎ウィル ス遺伝子型が存在する（＾ｔ　１ｅａｓｔ　ｆｉｖｅ　ｒｅｌａｔｅｄ、　ｂｕ ｔ　ｄｉｓｔｉｎｃｔ、　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｃｖｉｒａｌ　ｇｅｎｏｔｙｐ ｅｓ　ｅｘｉｓｔ、　）　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８ ９ニア１４４−７１４８Ｃｈａｎ　Ｓ、Ｓｉｍｍｏｎｄｓ　Ｐ、ＭｃＯｍｉｓｈ 　Ｆ、Ｙａｐ　Ｐ、Ｍｉｔｃｈｅｌｌ　Ｒ，Ｄｏｗ　Ｂ、Ｆｏｌｌｅｔｔ　Ｅ、 　（１９９１）異なる３種のＣ型肝炎ウィルスによる感染に対する血清学的応答 （Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ　ｔｏ　１ｎｆｅｃｔｉｏｎ　 ｗｉｔｈ　ｔｈｒｅｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｔｙｐｅｓ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｉ ｔｉｓ　Ｃｖｉｒｕｓ、　）Ｌａｎｃｅｔ　３３８：１９９１゜Ｃｈａｎ　Ｓ、 　ｌｉｃｏｍｉｓｈ　Ｆ、　Ｈｏｌｍｅｓ　Ｅ、　Ｄａｙ　Ｂ、　Ｐｅｕｔｈｅ ｒｅｒ　Ｊ、　Ｆｏｌｌｅｔｔ　Ｅ、　Ｙａｐ　Ｐ、Ｓｉｍｍｏｎｄｓ　Ｐ（１ ９９２ａ）新規Ｃ型肝炎ウィルスタイプの分析、およびその現存する変異体に対 する系統発生的関係（＾ｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａ　ｎｅｗ　ｈｅｐａｔｉｔｉ ｓＣｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｒｅ ｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｔｏ　ｅｘｉｓｔｉｎｇ　ｖａｒｉａｎｔｓ、）　Ｊ　 Ｇｅｎ　Ｖｉｒｏｌ　７３：１１３１−１１４１゜Ｃｈａｎ　Ｓ、　）ｌｏｌｍ ｅｓ　Ｅ、　ＭｃＯｍｉｓｈ　Ｆ、　Ｆｏｌｌｅｔｔ　Ｅ、　Ｙａｐ　Ｐ、　Ｓ ｉａ＋ａ＋ｏｎｄｓ　Ｐ（１９X２ ｂ）新規で高度に異なるＨＣＶタイプ（タイプ３）の系統発生的分析：感染に関 する配列変異性の血清学的応答に対する効果。Ｃ型肝炎ウィルスおよび関連ウィ ルスを対象としたウィルス分子学および病原論（Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎ ａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａ　ｎｅｗ　ｈｉｇｈｌｙ　ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ　ＨＣＶ 　ｔｙｐｅ（ｔｙｐｅ３）：ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　５ｅ■ ｕｅｎｃｅ　ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ　ｏｎ　ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ　ｒｅｓ ｐｏｎｃｅｓ　ｔｏ　１ｎｆｅｃｔｉｏｎ、　Ｉｎ：Ｈｅｐ≠■ ｉｔｉｓ　Ｃｖｉｒｕｓ　ａｎｄ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｖｉｒｕｓｅｓ、　Ｍｏ１ ｅｃｕｌａｒ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｐａｔｈｏｇｅ■ ｅｓｉｓ、　）イタリアペニスでの第一回定例総会、抄録Ｄ５．７３゜Ｃｈｏｍ ｃｚｙｎｓｋｉ　Ｐ、　５ａｃｃｈｉ　Ｎ　（１９８７）グアニジニウム酸チオ シアネートーフェノールークｏロホルム抽出にょる単回ＲＮＡ単離法（Ｓｉｎｇ ｌｅ　５ｔｅｐ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ＲＮＡ１ｓｏｌａｔｉｏｎ　ｂｙ　ａｃ ｉｄ　ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ　ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ−ｐｈｅｎｏｌ−ｃｈ ｌｏｒｏｆｏｒｍ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ、　）＾ｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　１ ６２：１５６−１５９゜Ｃｈｏｏ　Ｑ、　Ｒｉｃｈｍａｎ　Ｋ、　Ｈａｎ　Ｊ、 　Ｂｅｒｇｅｒ　Ｋ、　Ｌｅｅ　Ｃ，Ｄｏｎｇ　Ｃ，Ｇａｌｌｅｇｏｓ　Ｃ。
Ｃｏ１ｔ　Ｄ、　Ｍｅｄｉｎａ−３ｅｌｂｙ　Ａ、　Ｂａｒｒ　Ｐ、　１ｌｅｉ ｎｅｒ　Ａ、　Ｂｒａｄｌｅｙ　Ｄ、　Ｋｕｏ　Ｇ、　Ｈｏ■ ｇｈｔｏｎ　Ｍ　（１９９１）Ｃ型肝炎ウィルスの遺伝的組織および多様性（Ｇ ｅｎｅｔｉｃ　ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ 　ｔｈｅ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｃｖｉｒｕｓ、　）　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａ ■ ａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８８：２４５１−２４５５゜Ｃｏｍｐｔｏｎ　Ｊ（１９ ９１）、核酸配列を基本とした増幅（Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　５ｅｑｕｅｎ ｃｅ−ｂａｓｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、　）　Ｎａｔｕｒｅ、　３５ ０：９１−９２゜Ｄｕｃｋ　Ｐ（１，９９０）キメラ環化オリゴヌクレオチドに 基づくプローブ増幅系（Ｐｒｏｂｅ　ａｍｐｌｉｆｉｅｒ　ｓｙｓｔｅｍ　ｂａ ｓｅｄ　ｏｎ　ｃｈｉｍｅｒｉｃ　ｃｙｃｌｉｎｇ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔ ｉ■ ｅｓ、　）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　９．１４２−１４７゜Ｅｎｏｍｏｔｏ 　Ｎ、　Ｔａｋａｄａ　Ａ、　Ｎａｋａｏ　丁、　Ｄａｔｅ　Ｔ（１９９０）日 本にはふたつのタイプのＣ型肝炎ウィルスが存在する（Ｔｈｅｒｅ　ａｒｅ　ｔ ｗｏ　ｔｙｐｅｓ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｃｖｉｒｕｓ　ｉｎ　Ｊａｐａ ｎ、）Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍ　１７０：１０２１ −１０２５゜Ｇｕａｔｅｌｌｉ　Ｊ、　Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ　Ｋ、　Ｋｗｏｈ　 Ｄ、　Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ　Ｋ、　Ｒｉｃｈｍａｎ　Ｄ、Ｇｅｎｇｅｒａ　Ｔ（ １９９０）レトロウィルスによる複製後に模擬実験された多重酵素反応による核 酸の等温のインビトロ増幅（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ、　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ａｍ ｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ　ｂｙ　ａ　ｍｕ ｌｔｉｅｎｚｙｍｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｍｏｄｅｌｅｄ　ａｆｔｅｒ　ｒｅ■ ｒｏｖｉｒａｌ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、　）　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａ ｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８７１８７４−１８７８、Ｉｎｃｈａｕｐｓｅ　Ｇ、＾ｂ ｅ　Ｋ、　Ｚｅｂｅｄｅｅ　Ｓ、　Ｎａ５ｏｆｆ　Ｍ、　Ｐｒ１ｎｃｅ＾（１９ ９１）ポリメラーゼ連鎖反応による感染血清中のウィルスＲＮＡの検出のための Ｃ型肝炎ウィルス由来保存領域の使用（υｓｅ　ｏｆ　ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　５ ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｆｒｏｍ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｃｖｉｒｕｓ　ｆｏｒ　ｄ ｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｖｉｒａｌ　ＲＮＡｉｎ　１ｎｆｅｃｔｅｄ　５ｅｒ ａ　ｂｙ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ、　）　ｌｌ ｅｐａｔｏｌｏｇｙ、　１４：５９５−６００゜Ｊａｃｏｂｓ　Ｋ、　Ｒｕｄｅ ｒｄｏｒｆ　Ｒ，Ｎｅ１ｌｌ　Ｓ、　Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ　Ｊ、　Ｂｒｏｗｎ　 Ｅ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈＥ（１９８８）テトラアルキルアンモニウム塩溶液中では オリゴヌクレオチド二重鎖の熱安定性は配列非依存的である組み替えＤＮＡクロ ーンの同定への応用（丁ｈｅ　ｔｈｅｒｍａｌ　５ｔａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｏ ｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｄｕｐｌｅｘｅｓ　ｉｓ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　 １ｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｉｎ　ｔｅｄｒａａｌｋｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　５ａ ｌｔ　５ｏｌｕｔｉｏｎ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏ■ ｔｏ　ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ　ｃｌｏｎｅ ｓ）、Ｎｕｃｌ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ　１６：４６３７−４６５０゜ Ｋａｎａｉ　Ｋ、　Ｋａｋｏ　Ｍ、　Ｏｋａｍｏｔｏ　Ｈ（１９９２）慢性Ｃ型 肝炎のＩＩｃＶ遺伝子型およびインターフェロンへの応答（ＨＣＶ　ｇｅｎｏｔ ｙｐｅｓ　ｉｎ　ｃｈｒｏｎｉｃ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　’Ｃａｎｄ　ｒｅｓｐ ｏｎｓｅ　ｔｏ　１ｎｔｅｒｆｅｒｏｎ、　）　Ｌａｎｃｅｔ　３３９：１５４ ３゜Ｋａｔｏ　Ｋ、　Ｈｉｊｉｋａｔａ　Ｍ、　Ｏｏｔｓｕｙａｍａ　Ｙ、　Ｎ ａｋａｇａｗａ　Ｍ、　０ｈｋｏｓｈｉ　Ｓ、　Ｓｕｇｉｍｕｒａ　Ｔ、　Ｓｈ ｉｍｏｔｏｈｎｏ　Ｋ（１９９０）非Ａ非Ｂ肝炎の日本人患者由来ヒトＣ型肝炎 ウィルスゲノムの分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏ ｆ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｃｖｉｒｕｓ　ｇｅｎｏｍｅｆ ｒｏｍ　Ｊａｐａｎｅｓｅ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｎｏｎ−＾、ｎｏｎ −Ｂ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ、　）　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ ＳＡ　８７：９５２４−９５２８゜Ｋｕｂｏ　Ｙ、　Ｔａｋｅｕｃ’ｈｉ　Ｋ、 　Ｂｏｏｎｍａｒ　Ｓ、　Ｋａｔａｙａｍａ　Ｔ、　Ｃｈｏｏ　Ｑ、　Ｋｕｏ　 Ｇ、　Ｖｅｉｎｅｒ　Ａ、Ｂｒａｄｌｙ　Ｄ、　ｌｌｏｕｇｈｔｏｎ　Ｍ、　５ ａｉｔｏ　Ｉ、　Ｍｉｙａｍｕｒａ　Ｔ（１９８９）日本にて輸血後の非Ａ非Ｂ 肝炎に関わる供与者から単離したＣ型肝炎ウィルスのｃＤＮ＾ＤＮＡＡ　ｃＤＮ Ａ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｊｔｉｓ　Ｃｖｉｒｕｓ　１ｓｏｌａ ｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ａｎ　１ｒｎｐｌｉｃａｔｅｄ　ｄｏｎｏｒ　ｏｆ　ｐｏｓ ｔ−ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ　ｎｏｎ−＾、ｎｏｎ−Ｂ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　 ｉｎ　Ｊａｐａｎ、）　m ｕｃｌ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　１７：ｌ０３６ｇ−１０３７２，Ｋｗｏｈ　Ｄ、 　Ｄａｖｉｓ　Ｇ、　Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ　Ｋ、　Ｃｈａｐｐｅｌｌｅ　Ｈ，Ｄ ｉｍｉｃｈｅｌｅ　Ｌ、　Ｇｉｎｇｅｒａｓ　Ｔ（１９８９）転写に基づく増幅 系、およびビーズ−を基本としたサンドイッチハイブリダイゼーション様式を用 いた増幅ヒト免疫不全ウィルスタイプ１の検出（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ− ｂａｓｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ａｎｄ　ｄｅｔｅｃ ｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｈｕｍａｎ　ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃ■ ｅｎｃｙ　ｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅｌ　ｗｉｔｈ　ａ　ｂｅａｄ−ｂａｓｅｄ　ｓ ａｎｄｗｉｃｈ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｆｏｒｍａ煤B ）　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ＾ｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ８６　：１１７３−１１７７ ゜Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ　Ｕ、　Ｋａｉｓｅｒ　Ｒ，５ａｎｄｅｒｓ　Ｊ、　ｆｌ ｏｏｄ　Ｌ（１９８８）リガーゼを仲介した遺伝子検出法（Ｌｉｇａｓｅ−ｍｅ ｄｉａｔｅｄ　ｇｅｎｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、　）　５ ｃｉｅｎｃｅ　２４１：１０７７−１０８０．　Ｌｅｅ　Ｃ，Ｃｈｅｎｇ　Ｃ， ｆａｎｇ　Ｊ、　Ｌｕｍｅｎｇ　Ｌ（１９９２）５’非翻訳領域の非保存配列を 用いたＣ型肝炎ウィルスの同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆｈｅｐａ ｔｉｔｉｓ　Ｃｖｉｒｕｓｅｓ　ｗｉｔｈ　ａ　ｎｏｎｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　５ ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　５°ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ　ｒｅｇｉｏｎ 、　）　Ｊ　Ｃ１１ｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　３０：１６０２−１６０４Ｌｉｚ ａｒｄｉ　Ｐ、　Ｇｕｅｒｒａ　Ｃ，Ｌｏｍｅｌｉ　Ｈ，Ｔｕｓｓｉｅ−Ｌｕｎ ａ　Ｉ、　Ｋｒａｍｅｒ　Ｆ（１９３３）組ミ替えＲＮ＾ハイブリダイゼーショ ンプローブの指数関数的増幅（Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉ ｏｎ　ｏｆ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＲＮＡ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　 ｐｒｏｂｅｓ、）Ｂｉｏ／s ｅｃｈｎｏｌｏｇＶ　６：１１９７−１２０２、Ｌｏｍｅｌｉ　Ｈ，Ｔｙａｇｉ 　Ｓ、　Ｐｒ１ｎｔｃｈａｒｄ　Ｃ，Ｌｉ５ａｒｄｉ　Ｐ、　Ｋｒａｍｅｒ　Ｆ （１９３９）複製しうるハイブリダイゼーシヨンプローブの使用に基づ（定量的 アッセイ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ａｓｓｅｙｓ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈ ｅ　ｕｓｅ　ｏｆ　ｒｅｐｌｉｃａｔａｂｌｅ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａ■ ｉｏｎ　ｐｒｏｂｅｓ、　）　Ｃ１１ｎ　Ｃｈｅｍ　３５：１８２６−１８３１ ゜Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ　Ｅ、　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ（１ ９８２）モレキュラークローニンク：実験マニュアル。コールドスプリングハー バ−ラボラトリ−出版、コールドスプリングハーバ−１ＮＹ、　（Ｍｏｌｅｃｕ ｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　：　ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ １ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃ ｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏ秩B ＮＹ） Ｍｏｒｉ　Ｓ、　Ｋａｔｏ　Ｎ、　ＹａｇｙｕΔ、　Ｔａｎａｋａ　Ｔ、　Ｉｋ ｅｄａ　Ｙ、　Ｐｅｔｃｈｃｌａｉ　Ｂ、　Ｃｈｉｅｗｓｉｌｐ　Ｐ、　Ｋｕｒ ｉｍｕｒａ　Ｔ、　Ｓｈｉｍｏｔｏｈｎｏ　Ｋ（１９９２）タイ国における患者 のＣ型肝炎ウィルスの新タイプ（八ｎｅｗ　ｔｙｐｅ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｉｔｉ ｓ　Ｃｖｉｒｕｓ　ｉｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓｉｎ　Ｔｈａｉｌａｎｄ、　）　Ｂ ｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍ　１８３：３３４−３４２゜ Ｎａｋａｏ　Ｔ、　Ｅｎｏｍｏｔｏ　Ｎ、　Ｔａｋａｄａ　Ｎ、　Ｔａｋａｄａ 　Ａ、　Ｄａｔｅ　Ｔ（１９９１）制限長多形によるＣ型肝炎ウィルスゲノムの タイピング（Ｔｙｐｉｎｇ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｃｖｉｒｕｓ　ｇｅｎ ｏｍｅｓ　ｂｙ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｌｅｎｇｔｈ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈ ｉｓｍ、　）Ｊ　Ｇｅｎ　Ｖｉｒｏｌ　７Q： ２１０５−２１１２゜ Ｏｋａ＋ｎｏｔｏ　Ｈ，０ｋａｄａ　Ｓ、　Ｓｕｇｉｙａｍａ　Ｙ、Ｙｏｔｓｕ ｍｏｔｏ　Ｓ、　Ｔａｎａｋａ　Ｔ、Ｙｏｓｈｉｚａｖａ　Ｈ，Ｔｕｄａ　Ｆ、 　Ｍｉｙａｋａｗａ　Ｙ、　Ｍａｙｕｍｉ　Ｍ（１９９０）Ｃ型肝炎ウィルスゲ ノムの５゜末端配列（Ｔｈｅ　５’　ｔｅｒｍｉｎａｌ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏ ｆ　ｔｈｅ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｃｖｉｒｕｓ　ｇｅｎｏｍｅ。
）　Ｊａｐａｎ　Ｊ　Ｅｘｐ　Ｍｅｄ　６０：１６７−１７７゜０ｋａｒｎｏｔ ｏ　Ｉｌ、０ｋａｄａ　Ｓ、Ｓｕｇｉｙａｍａ　Ｙ、Ｋｕｒａｉ　Ｋ、ｌ１ｚｕ ｋａ　Ｈ，Ｍａｃｈｉｄａ　Ａ、Ｍｉｙａｋａｗａ　Ｙ、　Ｍａｙｕｍｉ　Ｍ（ １９９１）ヒトキャリアーから単離したＣ型肝炎ウィルスのゲノムＲＮ＾のヌク レオチド配列二報告された単離物の保存および異種領域の比較（Ｎｕｃｌｅｏｔ ｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＲＮＡ　ｏｆ　ｈ ｅｐａｔｉｔｉｓＣｖｉｒｕｓ　１ｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ａ　ｈｕｍａｎ 　ｃａｒｒｉｅｒ：ｃｏｎ＋ｐａｒｉｓｏｎ　ｗｉｔｈ　ｒｅｐｏｒｔｅｄｉｓ ｏｌａｔｅｓ　ｆｏｒ　ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　ａｎｄ　ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ　ｒ ｅｇｉｏｎｓ、）　Ｊ　Ｇｅｎ　Ｖｉｒｏｌ　７２：２０ｋａｍｏｔｏ　＋ｌ、 　Ｓｕｇｉｕａｍａ　Ｙ、　０ｋａｄａ　Ｓ、　Ｋｕｒａｉ　Ｋ、　Ａｋａｈａ ｎｅ　Ｙ、　Ｓｕｇａｉ　Ｙ、　Ｔａｎａｋａ　Ｔ、　５ａｔｏ　Ｋ、　Ｔｓｕ ｄａ　Ｆ、　Ｍｉｙａｋａｗａ　Ｙ、　Ｍａｙｕｍｉ　Ｍ（１９９２ａ）タイブ ー特異的プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によるＣ型肝炎ウィルスのタ イピング：臨床的調査および感染源の追跡（Ｔｙｐｉｎｇ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ 　Ｃｖｉｒｕｓｂｙ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　 ｗｉｔｈ　ｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｒｉｍｅｒｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉ ｏｎ　ｔｏ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　５ｕｒｖｅｙｓ　ａｎｄ　ｔｒａｃｉｎｇ　１ ｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　５ｏｕｒｃｅｓ、）　Ｊ　ＧｅｎＶｉｒｏｌ　７３：６７ ３−６７９゜ Ｏｋａｍｏｔｏ■、　Ｋｕｒａｉ　Ｋ、　０ｋａｄａ　Ｓ、　Ｙａｍａｍｏｔｏ 　Ｋ、　Ｌｉｚｕｋａ　ＩＩ、　Ｔａｎａｋａ　Ｔ、　Ｆｕｋｕｄａ　Ｓ、　Ｔ ｓｕｄａ　Ｆ、　Ｍｉｓｈｉｒｏ　５（１９９２ｂ）報告された単離物に対して 相同性が良くないＣ型肝炎ウィルスゲノムの完全長配列：４種の別個の遺伝子型 の比較研究（Ｆｕｌｌ−１ｅｎｇｔｈ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ａ　ｈｅｐ ａｔｉｔｉｓ　Ｃｖｉｒｕｓ　ｇｅｎｏｍｅ　ｈａｖｉｎｇ　ｐｏｏｒ　ｈｏｍ ｏｌｏｇｙ　ｔｏ　ｒｅｐｏｒｔｅｄ　１ｓｏｌａｔｅｓ：ｃｏｍｐａｒａｔｉ ｖｅ　５ｔｕｄｙ　ｏｆ　ｆB ｕｒ　ｄｉｓｔｉｎｃｔ　ｇｅｎｏｔｙｐｅ、　）　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１８８ ：３３１−３４１゜Ｐｏｚａｔｔｏ　Ｇ、Ｍｏｒｅｔｔｉ　Ｍ、　Ｆｒａｎｚｉ ｎ　Ｆ、　Ｃｒｏｃｅ　Ｌ、　Ｔｉｒｉｂｅ／ｌｌｉ　Ｃ，ＭａｓａｙｕＴ、　 Ｋａｎｅｋｏ　Ｓ、　Ｕｎｏｕｒａ　Ｍ、　Ｋｏｂａｙａｓｈｉ　Ｋ（１９９１ ）種々のＣ型肝炎つイルスクローンテノ肝臓疾患の重症度（Ｓｅｖｅｒｉｔｙ　 ｏｆ　１ｉｖｅｒ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｈｅ’ｐ ａｔｉｔｉｓ　ＣｖｉｒａＬ　ｃｌｏｎｅｓ、　）　Ｌａｎｃｅｔ　３３３：５ Ｑ９゜５ａｉｋｉ　ｒ、Ｇｅ１ｆａｎｄ　Ｄ、５ｔｏｆｆｅｌ　Ｓ、５ｃｈａｒ ｆ　Ｓ、Ｈｉｇｕｃｈｉ　Ｒ，Ｈｏｒｎ　Ｇ、Ｍｕｌｌｉｓ　Ｋ、Ｅｒ１ｉｃｈ 　Ｈ（１９８８）耐熱性ポリメラーゼを用いたＤＮＡのプライマー指令型酵素的 増幅（Ｐｒｉｍｅｒ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ａｍｐｌｉｆｉ ｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｗｉｔｈ　ａ　ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ　ＤＮ Ａ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、）　５ｃｉｅｎｃｅ　２３９：４８７−４９１゜５ ｔｒｅｚｏｓｋａ　Ｚ、　Ｐａｕｎｅｓｋａ　Ｔ、　Ｒａｄｏｓａｖｌｊｅｖｉ ｃ　Ｄ、　Ｌａｂａｔ　Ｉ、Ｄｒｍａｎａｃ　Ｒ，Ｃｒｋｖｅｎｊａｋｏｖ　Ｒ （１９９１）ハイブリダイゼーションによるＤＮＡ配列決定：非−ゲルーニ基づ （方法による１００塩基の解読（ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｂｙ　ｈｙｂ ｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ＋１００　ｂａｓｅｓ　ｒｅａｄ　ｂｙ　ａ　ｎｏｎ−ｇ ｅｌ−ｂａｓｅｄ　ｍｅｔｈｏｄ、　）　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　５モ ■ ＵＳＡ　８８：１００８９−１００９３゜Ｔａｋａｍｉｚａｗａ＾、　Ｍｏｒｉ 　Ｃ，Ｆｕｋｅ　１．　Ｍａｎａｂｅ　Ｓ、　Ｍｕｒａｋａｍｉ　Ｓ、　Ｆｕｊ ｉｔａ　Ｊ。
０ｎｉｓｈｉ　Ｅ、　Ａｎｄｏｈ　Ｔ、　Ｙｏｓｈｉｄａ　Ｉ、　Ｏｋａｙａｍ ａ　Ｉｔ　（１９９１）ヒトキャリアーから単離したＣ型肝炎ウィルスの構造お よび組織（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔ ｈｅ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｃｖｉｒｕｓ　１ｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｈｕ ｍａｎ　ｃａｒｒｉｅｒｓ、　）Ｊ　ＶｉｒB １６５・１１０５−１１１３゜ Ｗａｌｋｅｒ　Ｇ、　Ｌｉｔｔｌｅ　Ｍ、　Ｎａｄｅａｕ　Ｊ、　５ｈａｎｋ　 Ｄ（１９９２）制限酵素／ＤＮＡポリメラーゼ系によるＤＮＡの等温インビトロ 増幅（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ 　ｏｆ　ＤＮＡ　ｂｙ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｅｎｚｙｍｅ／ＤＮＡ　ｐｏ ｌｙｍｅｒａｓｅ　ｓｙｓｔｅｍ、）　Ｐ■ ｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳ＾８９：３９２−３９６゜ｆｕ　Ｄ、 　Ｗａｌｌａｃｅ　Ｂ、　（１９８９）ライゲーション増幅反応（ＬＡＲ）−鋳 型依存的ライゲーノヨンの連続的循環を使用する特別なりＮＡ配列の増幅（Ｔｈ ｅ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＬＡ Ｒ）−ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　ＤＮＡ　５ｅ■ ｕｅｎｃｅｓ　ｕｓｉｎｇ　５ｅｑｕｅｎｔｉａｌ　ｒｏｕｎｄｓ　ｏｆ　ｔｅ ｍｐｌａｔｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｌｉｇａｔｉｏｎ、　j Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　４：５６０−５６９゜Ｙｏｓｈｉｏｋａ　Ｋ、　Ｋａｋｕｍ ｕ　Ｓ、　Ｗａｋｉｔａ　Ｔ、　Ｉｓｈｉｋａｗａ　Ｔ、　Ｉｔｏｈ　Ｙ、　Ｔ ａｋａｙａｎａｇｉＭ、　Ｈｉｇｕｃｈｉ　Ｙ、　５ｈｉｂａｔａ　Ｍ、　Ｍｏ ｒｉｓｈｉｍａ　Ｔ（１９９２）ポリメラーゼ連鎖反応によるＣ型肝炎ウィルス の検出およびインターフェロン治療への対応、Ｃ型肝炎ウィルスの遺伝子型に対 する関連性（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｃｖｉｒｕｓ　 ｂｙ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｒｅｓ ｐｏｎｓｅ　ｔｏ　１ｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｔ■ ｅｒａｐｙ：ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｔｏ　ｇｅｎｏｔｙｐｅ　ｏｆ　ｈｅ ｐａｔｉｔｉｓ　Ｃｖｉｒｕｓ、　）　Ｈｅｐａｔｏｌｏｇ■ １６：２９３−２９９゜ Ｆｉｇｕｒｅ　３ Ｆｊｕｒｅ５、慢月 配列番号 Ｈｃｖ−Ｉ　５ＡＧＶＱＥＤＡＡＳＬＲＡＣＩ（Ｒ１８−Ｑ−ＴＨ−に−−−− −一一一〇 Ｆｉｇｕｒｅ　６ 、工、−〇 −−−−Ｄ Ｅ Ｆ Ｇ −日 、−１ Ｊ Ｋ Ｆｉｇｕｒｅ　７ 一一一　−Ｅ Ｆｉｇｕｒｅ　８ 一−Ｂ Ｆｉｇｕｒｅ　９ Ｆｉｇｕｒｅ　Ｎ。
フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。
ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧＣＡ、ＣＨ，ＣＺ、ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、 ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＫＺ、ＬＫ、ＬＵ、ＬＶ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、 ＮＬ、Ｎｏ、ＮＺ、ＰＬ、ＰＴ、ＲＯ。
ＲＵ、ＳＤ、ＳＥ、ＳＫ、ＵＡ、ＵＳ、ＵＺ、ＶＮ（７２）発明者　ロツソー、 ルデイ ベルギー国ビーー２１８０エケレン・ウイルゲンホーベ　ストラード４５ （７２）発明者　パン・ホイベルスウイン、フーゴベルギー国ビー−９２７０カ ルケン・コルマン

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. １．生物学的試料中に存在するＨＣＶ単離物の遺伝子型を決定するために、（ｉ ）ひとつのＨＣＶ単離物の被検体鎖中に存在する、５′非翻訳領域のヌクレオチ ド−２９１位から−６６位に伸長するドメイン中の遺伝子型に特異的な標的領域 にハイブリダイズすることができるプローブであり、または（ｉｉ）任意の上記 に定義したプローブに相補的なプローブである、少なくともひとつのプローブの 使用。
  2. ２．以下の工程： −生物学的試料中のリボヌクレオチド、またはデオキシリボヌクレオチドが接近 できるように作られた試料を、必要に応じて適当な変性条件下で少なくともひと つのプローブと接近させ、該プローブは（ｉ）ひとつのＨＣＶ単離物の５′非翻 訳領域のヌクレオチド−２９１位から−６６位に伸長するドメイン中の領域にハ イブリダイズすることができ、または該プローブは（ｉｉ）任意の上記に定義し たプローブに相補的であり、ならびに −該プローブと同定すべきＨＣＶ単離物のヌクレオチド配列との間にあるいは形 成された複合体を検出する、ことを含んで成る生物学的試料中に存在するＨＣＶ 単離物の遺伝子型決定法。
  3. ３．少なくともふたつのプローブを含んで成るプローブの組を使用する、請求の 範囲第２項記載の方法。
  4. ４．使用するプローブが以下のひとつのドメイン中の少なくとも５ヌクレオチド ： ａ）ヌクレオチド−２９３位からヌクレオチド−２７８位に伸長するもの（図２ および４） ｂ）ヌクレオチド−２７５位からヌクレオチド−２６０位に伸長するもの（図２ および４） ｃ）ヌクレオチド−２５３位からヌクレオチド−２３８位に伸長するもの（図２ および４） ｄ）ヌクレオチド−２４４位からヌクレオチド−２２９位に伸長するもの（図２ および４） ｅ）ヌクレオチド−２３８位からヌクレオチド−２２３位に伸長するもの（図２ および４） ｆ）ヌクレオチド−１７０位からヌクレオチド−１５５位に伸長するもの（図２ および４） ｇ）ヌクレオチド−１４１位からヌクレオチド−１１７位に伸長するもの（図２ および４） ｈ）ヌクレオチド−８３位からヌクレオチド−６８位に伸長するもの（図２およ び４） ｉ）ヌクレオチド−１０３位からヌクレオチド−８８位に伸長するもの（図２お よび４） ｊ）ヌクレオチド−１４６位からヌクレオチド−１３０位に伸長するもの、の領 域を標的とする、請求の範囲第２項または第３項記載の方法。
  5. ５．決定すべきＨＣＶの各タイプまたはサブタイプのために、ふたつの異なるプ ローブの組またはふたつのプローブの混合物が使用され、該組または混合物の各 プローブが、請求の範囲第４項のように、以下のドメインの対の一覧の中からそ れぞれ選択されたそれぞれ異なる領域を標的とする： ＊ヌクレオチド−１７０位からヌクレオチド−１５５位に伸長するもの（図２お よび図４中）、およびヌクレオチド−１４１位からヌクレオチド−１１７位に伸 長するもの（図２および図４中）、＊ヌクレオチド−１７０位からヌクレオチド −１５５位に伸長するもの（図２および図４中）、およびヌクレオチド−１０３ 位からヌクレオチド−８８位に伸長するもの（図２および図４中）、＊ヌクレオ チド−１４１位からヌクレオチド−１１７位に伸長するもの（図２および図４中 ）、およびヌクレオチド−１０３位からヌクレオチド−８８位に伸長するもの（ 図２および図４中）、＊ヌクレオチド−１７０位からヌクレオチド−１５５位に 伸長するもの（図２および図４中）、およびヌクレオチド−８３位からヌクレオ チド−６８位に伸長するもの（図２および図４中）、＊ヌクレオチド−１４１位 からヌクレオチド−１１７位に伸長するもの（図２および図４中）、およびヌク レオチド−８３位からヌクレオチド−６８位に伸長するもの、 ＊ヌクレオチド−１７０位からヌクレオチド−１５５位に伸長するもの（図２お よび図４中）、およびヌクレオチド−１４６位からヌクレオチド−１３０位に伸 長するもの（図２および図４中）、＊ヌクレオチド−１３２位からヌクレオチド −１１７位に伸長するもの（図２および図４中）、およびヌクレオチド−１４６ 位からヌクレオチド−１３０位に伸長するもの（図２および図４中）、＊ヌクレ オチド−１４６位からヌクレオチド−１３０位に伸長するもの（図２および図４ 中）、およびヌクレオチド−１０３位からヌクレオチド−８８位に伸長するもの （図２および図４中）、請求の範囲第４項記載の方法。
  6. ６．少なくともひとつの以下の配列： 【配列があります】（配列番号：５） 【配列があります】（配列番号：６） 【配列があります】（配列番号：７） 【配列があります】（配列番号：８） 【配列があります】（配列番号：９） 【配列があります】（配列番号：１０）【配列があります】（配列番号：１１） 【配列があります】（配列番号：１２）【配列があります】（配列番号：１３） 【配列があります】（配列番号：１４）【配列があります】（配列番号：１５） 【配列があります】（配列番号：１６）【配列があります】（配列番号：１７） 【配列があります】（配列番号：１８）【配列があります】（配列番号：１９） 【配列があります】（配列番号：２０）【配列があります】（配列番号：２１） 【配列があります】（配列番号：２２）【配列があります】（配列番号：２３） 【配列があります】（配列番号：２４）【配列があります】（配列番号：２５） 【配列があります】（配列番号：２６）【配列があります】（配列番号：２７） 【配列があります】（配列番号：２８）【配列があります】（配列番号：２９） 【配列があります】（配列番号：３０）【配列があります】（配列番号：３１） 【配列があります】（配列番号：３２）【配列があります】（配列番号：３３） 【配列があります】（配列番号：３４）【配列があります】（配列番号：３５） 【配列があります】（配列番号：３６）【配列があります】（配列番号：３７） 【配列があります】（配列番号：３８）【配列があります】（配列番号：３９） 【配列があります】（配列番号：４０）【配列があります】（配列番号：４１） 【配列があります】（配列番号：４２）【配列があります】（配列番号：４３） 【配列があります】（配列番号：４４）【配列があります】（配列番号：４５） 【配列があります】（配列番号：４６）【配列があります】（配列番号：４７） 【配列があります】（配列番号：４８）【配列があります】（配列番号：４９） 【配列があります】（配列番号：５０）【配列があります】（配列番号：５１） 【配列があります】（配列番号：５２）【配列があります】（配列番号：５３） 【配列があります】（配列番号：５４）【配列があります】（配列番号：９３） 【配列があります】（配列番号：９４）【配列があります】（配列番号：９５） 【配列があります】（配列番号：９６）配列中ＹはＴまたはＣを表し、 ＫはＧまたはＴを表し、 ならびにＲはＧまたはＡを表し、 −またはＴがＵに置換された対応する配列、−または上記に定義した配列に相補 的な配列、を標的とするような配列を有するプローブ。
  7. ７．ふたつの各プローブが、請求の範囲第４項のように、以下のドメインの対の 一覧の中からそれぞれ選択されたそれぞれ異なる領域を標的とする： ＊ヌクレオチド−１７０位からヌクレオチド−１５５位に伸長するもの（図２お よび図４中）、およびヌクレオチド−１４１位からヌクレオチド−１１７位に伸 長するもの（図２および図４中）、＊ヌクレオチド−１７０位からヌクレオチド −１５５位に伸長するもの（図２および図４中）、およびヌクレオチド−１０３ 位からヌクレオチド−８８位に伸長するもの（図２および図４中）、＊ヌクレオ チド−１４１位からヌクレオチド−１１７位に伸長するもの（図２および図４中 ）、およびヌクレオチド−１０３位からヌクレオチド−８８位に伸長するもの（ 図２および図４中）、＊ヌクレオチド−１７０位からヌクレオチド−１５５位に 伸長するもの（図２および図４中）、およびヌクレオチド−８３位からヌクレオ チド−６８位に伸長するもの（図２および図４中）、＊ヌクレオチド−１４１位 からヌクレオチド−１１７位に伸長するもの（図２および図４中）、およびヌク レオチド−８３位からヌクレオチド−６８位に伸長するもの、 ＊ヌクレオチド−１７０位からヌクレオチド−１５５位に伸長するもの（図２お よび図４中）、およびヌクレオチド−１４６位からヌクレオチド−１３０位に伸 長するもの（図２および図４中）、＊ヌクレオチド−１３２位からヌクレオチド −１１７位に伸長するもの（図２および図４中）、およびヌクレオチド−１４６ 位からヌクレオチド−１３０位に伸長するもの（図２および図４中）、＊ヌクレ オチド−１４６位からヌクレオチド−１３０位に伸長するもの（図２および図４ 中）、およびヌクレオチド−１０３位からヌクレオチド−８８位に伸長するもの （図２および図４中）、ふたつのプローブの組、またはふたつのプローブの混合 物。
  8. ８．次のＨＣＶタイプ：ＨＣＶタイプ１、ＨＣＶタイプ２、ＨＣＶタイプ３、Ｈ ＣＶタイプ４、ＨＣＶタイプ５、ＨＣＶタイプ６を含有すると思われる生物学的 試料から、少なくともひとつの上記ＨＣＶタイプに属するＨＣＶ単離物の遺伝子 型を決定する方法であって、 −生物学的試料中のリボヌクレオチド、またはデオキシリボヌクレオチドが接近 できるように作られた試料を、必要に応じて適当な変性条件下で少なくともひと つのプローブと接近させ、少なくともひとつプローブが（ｉ）ひとつのＨＣＶ単 離物の５′非翻訳領域のヌクレオチド−２９１位から−６６位に伸長するドメイ ン中の領域とハイブリダイズすることができ、または該プローブが（ｉｉ）任意 の上記に定義したプローブに相補的であり、ならびに −該プローブと標的領域の間にあるいは形成された複合体を検出し、ならびに −観察されたハイブリダイズパターンから存在するＨＣＶタイプを判断する、 工程を含んで成る、請求の範囲第２項ないし第７項のいずれか一項に記載の方法 。
  9. ９．次のＨＣＶタイプ：ＨＣＶタイプ１、ＨＣＶタイプ２、ＨＣＶタイプ３、Ｈ ＣＶタイプ４、ＨＣＶタイプ５、ＨＣＶタイプ６の少なくともひとつに属するよ うなＨＣＶ単離物の遺伝子型を決定する請求の範囲第８項記載の方法であって、 ここで使用する該プローブは少なくともひとつの以下の標的領域、またはＴがＵ に置換された該領域、または該領域に相補的である領域を標的することができ： ＨＣＶタイプ１および６について：【配列があります】（Ｎｏ．５）【配列があ ります】（Ｎｏ．６） 【配列があります】（Ｎｏ．２８） ＨＣＶタイプ１について：【配列があります】（Ｎｏ．２９）ＨＣＶタイプ２に ついて：【配列があります】（Ｎｏ．８）【配列があります】（Ｎｏ．９） 【配列があります】（Ｎｏ．１０） 【配列があります】（Ｎｏ．１１） 【配列があります】（Ｎｏ．１２） 【配列があります】（Ｎｏ．３２） 【配列があります】（Ｎｏ．２２） 【配列があります】（Ｎｏ．２３） 【配列があります】（Ｎｏ．２４） 【配列があります】（Ｎｏ．２５） 【配列があります】（Ｎｏ．２６） 【配列があります】（Ｎｏ．３３） 【配列があります】（Ｎｏ．３４） ＨＣＶタイプ３について：【配列があります】（Ｎｏ．１３）【配列があります 】（Ｎｏ．１４） 【配列があります】（Ｎｏ．２１） 【配列があります】（Ｎｏ．３６） 【配列があります】（Ｎｏ．５４） ＨＣＶタイプ４および５について：【配列があります】（Ｎｏ．１７）ＨＣＶタ イプ４について：【配列があります】（Ｎｏ．１８）ＨＣＶタイプ４、３ｃおよ び３ｂについて：【配列があります】（Ｎｏ．１９）ＨＣＶタイプ４および３ｂ について：【配列があります】（Ｎｏ．３８）ＨＣＶタイプ４について：【配列 があります】（Ｎｏ．３７）【配列があります】（Ｎｏ．３９） 【配列があります】（Ｎｏ．４０） 【配列があります】（Ｎｏ．４１） 【配列があります】（Ｎｏ．４２） 【配列があります】（Ｎｏ．４３） 【配列があります】（Ｎｏ．４９） 【配列があります】（Ｎｏ．５０） 【配列があります】（Ｎｏ．５３） ＨＣＶタイプ５について：【配列があります】（Ｎｏ．４５）【配列があります 】（Ｎｏ．４７） 【配列があります】（Ｎｏ．４６） 【配列があります】（Ｎｏ．４４） ＨＣＶタイプ６について：【配列があります】（Ｎｏ．４８）領域中、ＹはＣま たはＴを表し、およびＫはＧまたはＴを表し、あるいは使用するプローブは上記 に定義したプローブの中から選択されたふたつのプローブの組である、上記方法 。
  10. １０．ＨＣＶのサブタイプを識別および分類する請求の範囲第９項記載の方法で あって、ここで請求の範囲第９項記載に定義された特定のＨＣＶタイプとハイブ リダイズできる少なくともひとつのプローブに加えて、以下の標的領域、または ＴがＵに置換された該領域、または上記に定義した領域に相補的な該領域を標的 する少なくともひとつのプローブが使用され： ＨＣＶタイプ１、サブタイプ１ａについて：【配列があります】（Ｎｏ．３１） ＨＣＶタイプ１、サブタイプ１ｂについて：【配列があります】（Ｎｏ．７） 【配列があります】（Ｎｏ．３０） 領域中ＹはＣまたはＴを表し、 ＨＣＶタイプ２、サブタイプ２ａについて：【配列があります】（Ｎｏ．９） 【配列があります】（Ｎｏ．１０） 【配列があります】（Ｎｏ．２２） 【配列があります】（Ｎｏ．２４） 領域中ＲはＡまたはＧを表し、 ＨＣＶタイプ２、サブタイプ２ｂについて：【配列があります】（Ｎｏ．１１） 【配列があります】（Ｎｏ．１２） 【配列があります】（Ｎｏ．２３） 【配列があります】（Ｎｏ．２５） ＨＣＶタイプ２、サブタイプ２ｃについて：【配列があります】（Ｎｏ．３３） 【配列があります】（Ｎｏ．３４） ＨＣＶタイプ３、サブタイプ３ａについて：【配列があります】（Ｎｏ．１３） 【配列があります】（Ｎｏ．１４） 【配列があります】（Ｎｏ．３５） 領域中ＫはＧまたはＴを表し、 ＨＣＶタイプ３、サブタイプ３ｂについて：【配列があります】（Ｎｏ．１９） 【配列があります】（Ｎｏ．３８） 【配列があります】（Ｎｏ．２１） ＨＣＶタイプ３、サブタイプ３ｃについて：【配列があります】（Ｎｏ．５１） 【配列があります】（Ｎｏ．５４） 【配列があります】（Ｎｏ．１９） 【配列があります】（Ｎｏ．７） ＨＣＶタイプ４、サブタイプ４ａまたは４ｄについて：【配列があります】（Ｎ ｏ．３８） 【配列があります】（Ｎｏ．１９） タイプ４、サブタイプ４ｂについて： 【配列があります】（Ｎｏ．３８） 【配列があります】（Ｎｏ．４１） 【配列があります】（Ｎｏ．４０） タイプ４、サブタイプ４ｃについて： 【配列があります】（Ｎｏ．４２） 【配列があります】（Ｎｏ．４３） 【配列があります】（Ｎｏ．５０） 【配列があります】（Ｎｏ．５３） 【配列があります】（Ｎｏ．７） タイプ４、サブタイプ４ｅについて： 【配列があります】（Ｎｏ．４０） 【配列があります】（Ｎｏ．３９） 【配列があります】（Ｎｏ．４１） タイプ４、サブタイプ４ｆについて： 【配列があります】（Ｎｏ．１９） 【配列があります】（Ｎｏ．３８） 【配列があります】（Ｎｏ．５１） 【配列があります】（Ｎｏ．７） タイプ４、サブタイプ４ｇ（暫定的）について：【配列があります】（Ｎｏ．５ ０） 【配列があります】（Ｎｏ．５３） タイプ４、サブタイプ４ｈ（暫定的）について：【配列があります】（Ｎｏ．４ ９） 【配列があります】（Ｎｏ．５０） あるいは使用されるプローブは上記に定義したプローブの中から選択されたふた つのプローブの組であり、ならびに、ひとつのタイプについてふたつのサブタイ プのみがある時は、それらが上述の領域のひとつを標的としないという事実から 判断されるサブタイプを排除することによって、これら上述のプローブが決定さ れると思われる、上記方法。
  11. １１．識別すべきＨＣＶタイプまたはサブタイプが、以下のひとつの領域を標的 とするようなＨＣＶの万能プローブにより同定される：【配列があります】（Ｎ ｏ．２０） 【配列があります】（Ｎｏ．２７） 請求の範囲第２項ないし第１０項のいずれか一項に記載の方法。
  12. １２．ハイブリダイゼーションの工程が標的する領域を含有するデオキシリボヌ クレオチドまたはリボヌクレオチドの増幅工程によって進められ、有利に以下の −タイプまたはサブタイプを決定すべき単離物を含有すると思われる生物学的試 料を、標的する領域を含むプライマーの組と接触させる工程であって、該プライ マーがＨＣＶゲノムの保存領域と相補的であり、および好ましくはプライマーが ＨＣＶゲノムの５′非翻訳保存領域に相補的であり、該プライマー好ましくは少 なくとも１５個の連続的ヌクレオチドを有し、該連続的ヌクレオチドがそれぞれ ヌクレオチド−３４１からヌクレオチド−１７１に伸長する領域、およびヌクレ オチド−６７からヌクレオチド−１（図２および４の）に伸長する領域から選ば れた配列に相補的である工程、 −例えば上述のプライマーの組の手段によるポリメラーゼ連鎖反応を介し標的領 域を増幅させる工程、および場合によってジゴキシゲニンまたはビオチンのよう な標識を増幅された標的配列に取り込む工程（ここで該増幅工程が２０から８０ 回繰り返され、有利には３０から５０回繰り返される）、 を含んで成る請求の範囲第２項ないし第１１項のいずれか一項に記載の方法。
  13. １３．増幅が二重のＰＣＲ段階から成り、各段階に特別なプライマーの組が関与 し、該第一段階はヌクレオチド−３４１から−ヌクレオチド−１８６に伸長する 領域、およびヌクレオチド−５２からヌクレオチド−１に伸長する領域から選ば れた外側のプライマー、ならびに特に以下の組：【配列があります】（Ｎｏ．１ ） 【配列があります】（Ｎｏ．２） あるいはこれらの相補鎖が関与し、 配列中、ＷはＡまたはＴを表し、ならびに該第二段階はヌクレオチド−３２６か らヌクレオチド−１７１に伸長する領域、およびヌクレオチド−６８からヌクレ オチド−１に伸長する領域から選ばれた入れ子状に重複したプライマー、ならび に特に以下の組： 【配列があります】（Ｎｏ．３） 【配列があります】（Ｎｏ．４） 配列中ＲはＡまたはＧ、およびＹはＴまたはＣを表し、あるいはこれらの相補鎖 が関与する、請求の範囲第１２項記載の方法。
  14. １４．生物学的試料に含有されるすべてのＨＣＶ単離物を同時に遺伝子型を決定 するための請求の範囲第２項ないし第１３項のいずれか１項に記載された方法で あって、以下の要素のひとつ：−試料中の遺伝物質がハイブリダイゼーションで きるようにされている該生物学的試料、 −または該生物学的試料中に含有された精製された遺伝物質、−または精製され た遺伝物質に由来する単一のコピー、−または精製された遺伝物質に由来する増 幅されたコピーを、請求の範囲第２項ないし第１３項のいずれか１項に記載され たプローブがすでに固定化されている固体支持体と接触させる、工程を含んで成 る上記方法。
  15. １５．請求の範囲第２項ないし第１４項のいずれか１項に記載された任意のプロ ーブを以下の要素のひとつ： −試料中の遺伝物質がハイブリダイゼーションできるようにされている該生物学 的試料、 −または該生物学的試料中に含有された精製された遺伝物質、−または精製され た遺伝物質に由来する単一のコピー、−または精製された遺伝物質に由来する増 幅されたコピーここで該要素はすでに支持体に固定されている、と接触させる、 工程を含んで成る請求の範囲第２項ないし第１４項のいずれか１項に記載された 方法。
  16. １６．既知のタイプまたはサブタイプとは異なる新規ＨＣＶタイプまたはサブタ イプの検出法および同定法であって、以下の：−生物学的試料中に存在するＨＣ Ｖ単離物が既知のどのタイプまたはサブタイプに属するかを請求の範囲第２項に 定義した方法により決定する工程であって、場合により該生物学的試料はあるい はＨＣＶ抗原または抗体アッセイによるか、または請求の範囲第１１項に定義し たようなＨＣＶについての万能プライマーを使用することにより予め前記生物学 的試料がＨＣＶ含有であると決定されていてもよい工程、−請求の範囲第４項に 定義した任意のドメインから選ばれた領域を標的にすることができる少なくとも ひとつのプローブと陽性的にハイブリダイズしない試料が観察された場合には、 その試料中に存在するＨＣＶタイプの完全なゲノムを配列決定するか、あるいは 決定すべき新規タイプおよび／またはサブタイプに相当する試料の５′非翻訳領 域のその部分（または複数の部分）を配列決定する工程、を含んで成る上記方法 。
  17. １７．生物学的試料中に存在する新規ＨＣＶタイプおよび／またはサブタイプの 検出法および同定法であって、（新規ＨＣＶタイプおよびサブタイプとは、新規 タイプを同定する場合にはタイプ１、タイプ２、タイプ３、タイプ４、タイプ５ 、およびタイプ６とは異なるものであり；新規サブタイプを同定する場合にはタ イプ１ＨＣＶ単離物についてはサブタイプ１ａおよび１ｂ、タイプ２単離物につ いてはサブタイプ２ａ、および２ｂ、タイプ３単離物についてはサブタイプ３ａ 、３ｂおよび３ｃ、タイプ４単離物についてはサブタイプ４ａ、４ｂ、４ｃ、４ ｄ、４ｅ、４ｆ、４ｇ（暫定的）および４ｈ（暫定的）とは異なるものである） 、以下の： −分析すべき生物学的試料中のＨＣＶ単離物（複数のＨＣＶ単離物）が既知のど のタイプ（複数のタイプ）またはサブタイプ（複数のサブタイプ）に属するかを 請求の範囲第２項ないし第１４項のいずれか一項による方法により決定する工程 であって、場合により該生物学的試料はあるいはＨＣＶ抗原または抗体アッセイ によるか、または請求の範囲第１１項に定義したようなＨＣＶについての万能プ ライマーを使用することにより予め前記生物学的試料がＨＣＶ含有であると決定 されていてもよい工程、−請求の範囲第９項および第１０項に定義した任意のタ イプ特異的またはサブタイプ特異的ドメインから選ばれた領域を標的にすること ができる少なくともひとつのプローブとハイブリダイズしない試料が観察された 場合には、より具体的にはタイプ１について配列番号５、２８および６と、タイ プ２について配列番号８から１２または２２から２６および３２から３４と、タ イプ３について配列番号１３、１４、３６、２１、または５４と、ならびにタイ プ４について配列番号１７、１８、１９、３７から４３、４９、５０および５３ と；ならびにサブタイプ１ｂについて配列番号７および３０と、サブタイプ１ａ について配列番号３１と、サブタイプ２ａについて配列番号９１０２２または２ ４と、サブタイプ２ｂについて１１、１２、２３または２５と、サブタイプ２ｃ について配列番号３３または３４と、あるいはサブタイプ３ａについて配列番号 １３、１４または３５と、サブタイプ３ｂ、４ａまたは４ｄについて配列番号３ ８、２１、および１９と、サブタイプ４ｂについて配列番号３８または４１と、 サブタイプ４ｃについて配列番号４２または４３と；サブタイプ４ｅについて配 列番号３９、４０または４１と、サブタイプ４ｆについて；配列番号５１、３８ 、１９または７と；推定のサブタイプ４ｈについては配列番号４９または５０と ；推定のサブタイプ４ｇについては配列番号５０または５３とハイブリダイズし ない試料が観察された場合には、試料中に存在するＨＣＶタイプの完全なゲノム を配列決定するか、あるいは決定すべき新規ダイブおよび／またはサブタイプに 相当する試料の５′非翻訳領域のその部分（または複数の部分）を配列決定する 工程、 を含んで成る上記方法。
  18. １８．生物学的試料中に存在するＨＣＶ、および／またはＨＩＶ、および／また はＨＢＶ、および／またはＨＴＬＶのタイプ（複数のタイプ）ならびにサブタイ プ（複数のサブタイプ）の決定法であって、−以下のプローブを提供する工程、 ＊請求の範囲第１項ないし第８項のいずれかに定義した少なくともひとつのプロ ーブ、好ましくはプローブは請求の範囲第９項および第１０項に定義したもので あり、ＨＣＶの遺伝子型決定（タイピングおよび／またはサブタイピング）が可 能であり、ならびに以下の少なくともひとつのプローブ： ＊上記生物学的試料中に存在しうるＨＩＶタイプ１および／またはタイプ２のオ リゴヌクレオチドを検出できるプローブ、ならびに／または ＊上記生物学的試料中に存在しうるＨＢＶサブタイプ、および／または（ＳＡｇ ）突然変異体および／または（ＣＡｇ）突然変異体のオリゴヌクレオチドを検出 できるプローブ、ならびに／または＊生物学的試料中に存在すると疑われるＨＴ ＬＶ−Ｉおよび／またはＨＴＬＶ−ＩＩのオリゴヌクレオチドを検出できるプロ ーブ、−場合によって請求の範囲第１２項または第１３項に定義したプライマー の組に加えて、少なくともひとつの次のプライマー類であってＰＣＲ反応により 、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、および／またはＨＢＶ、および／または ヒトＴ細胞リンフォトロピック（ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）ウイルス（ＨＴＬ Ｖ）オリゴヌクレオチドのそれぞれを増幅させるためのプライマーの組を提供す る工程、ならびに生物学的試料中に存在しうるＨＣＶ、およびＨＢＶおよび／ま たはＨＩＶおよび／またはＨＴＬＶのいずれかを増幅させる工程、−上述の上記 定義のプローブと ＊試料中の遺伝物質がすでにハイブリダイゼーションできるようにされている生 物学的試料、 ＊または上記生物学的試料中に含有された精製された遺伝物質、 ＊または精製された遺伝物質由来の単一コピー＊または精製された遺伝物質由来 の増幅コピーを、上述した上記定義のプローブと、プローブとＨＣＶならびに少 なくともひとつの次のウイルス、ＨＢＶ、および／またはＨＩＶ、および／また はＨＴＬＶの単離物の標的配列とがハイブリダイゼーションできる条件下で接触 させる工程、 −使用したプローブと生物学的試料に存在しうる標的領域との間に形成した可能 性のある複合体を検出する工程、を含んで成る上記方法。
  19. １９．固体支持体、具体的には膜片であって、その表面の既知の位置には以下の プローブ、またはそれらの相補鎖、または上述したプローブであってＴがＵに置 き換えられたものから選択されたものを含み：−請求の範囲第９項および第１０ 項に記載の配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５ 、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７ 、２８から５４および９３から９６、ならびにこれらのプローブと、区別される べきＨＣＶ単離物が存在する生物学的試料中に含まれると思われるＨＣＶのリボ またはデオキシリボヌクレオチド鎖との間にハイブリダイゼーシヨンがあるかど うかを決定するための対照を含む固体支持体。
  20. ２０．任意のＨＣＶ単離物をインビトロで識別するためのキットであって、−Ｈ ＣＶ単離物の存在を同定するための手段、−請求の範囲第１項に定義した少なく ともひとつのプローブ、−これらプローブとＨＣＶ単離物のｃＤＮＡおよび／ま たはＲＮＡとの間で行われるべきハイブリダイゼーション反応を可能にする緩衝 液を作成するために必要な緩衝液または成分、−適当である時には、ハイブリダ イゼーションの進行から生成するハイブリッドを検出するための手段、を含む上 記キット。
  21. ２１．ＨＣＶ単離物を含有すると思われる生物学的試料から少なくともひとつの ＨＣＶ単離物をダイピングするための、ならびにＨＣＶタイプおよびサブタイプ に従いＨＣＶ単離物を分類するためのキットであって、−場合により請求の範囲 第１１項に定義したひとつのプローブ、 −請求の範囲第２項ないし第１０項に記載された任意の中から選択された少なく ともひとつのプローブ、−これらのプローブとＨＣＶ単離物のｃＤＨＡおよび／ またはＲＮＡとの間で行われるべきハイブリダイゼーション反応を可能にする緩 衝液を作成するために必要な緩衝液または成分、−適当である時には、ハイブリ ダイゼーションの進行から生成するハイブリッドを検出するための手段、を含む 上記キット。
  22. ２２．少なくとも次のひとつのＨＣＶタイプ（ＨＣＶタイプ１、ＨＣＶタイプ２ 、ＨＣＶタイプ３、ＨＣＶタイプ４、ＨＣＶタイプ５、ＨＣＶタイプ６）に属す るＨＣＶ単離物のタイピングのためのキットであって、少なくともひとつの請求 の範囲第９項に定義したプローブ、 −これらプローブと上記ＨＣＶ単離物のｃＤＮＡｓおよび／またはＲＮＡＳとの 間で行われるべきハイブリダイゼーション反応を可能にする緩衝液を作成するた めに必要な緩衝液または成分；−適当な場合にはハイブリダイゼーションの進行 から生成するハイブリッドを検出するための手段、を含む上記キット。
  23. ２３．ＨＣＶタイプおよびサブタイプを識別ならびに分類するためのキットであ って、 −請求の範囲第９項または第１０項による少なくともひとつのプローブ、 −これらプローブと上記ＨＣＶ単離物のｃＤＮＡｓおよび／またはＲＮＡＳとの 間で行われるべきハイブリダイゼーション反応を可能にする緩衝液を作成するた めに必要な緩衝液または成分：−適当な場合にはハイブリダイゼーションの進行 から生成するハイブリッドを検出するための手段、を含む上記キット。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007517525A (ja) * 2004-01-07 2007-07-05 サード・ウェーブ・テクノロジーズ・インク Ｃ型肝炎ウイルスの遺伝子型の決定方法
JP2019531747A (ja) * 2016-10-19 2019-11-07 ジェン−プローブ・インコーポレーテッド Ｃ型肝炎ウイルスを検出または定量するための組成物および方法

Families Citing this family (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7258977B1 (en) * 1992-11-27 2007-08-21 Innogenetics N.V. Process for typing of HCV isolates
JP4251407B2 (ja) 1992-11-27 2009-04-08 イノゲネテイクス・エヌ・ブイ Ｈｃｖ単離物のタイピング法
CA2157600A1 (en) * 1993-03-05 1994-09-15 Roy J. Mankovitz Apparatus and method using compressed codes for television program record scheduling
US7255997B1 (en) 1993-04-27 2007-08-14 N.V. Innogenetics S.A. Sequences of hepatitis C virus genotypes and their use as therapeutic and diagnostic agents
ATE551423T1 (de) * 1993-04-27 2012-04-15 Innogenetics Nv Sequenzen von hepatitis c virus-genotypen sowie ihre verwendungen als therapeutika und diagnostika
US5830635A (en) * 1995-03-31 1998-11-03 Agnello; Vincent Method of detecting hepatitis C virus in tissues
US20020081577A1 (en) * 1995-06-06 2002-06-27 Robert L. Kilkuskie Oligonucleotides speciific for hepatitis c virus
AU719691B2 (en) 1996-01-26 2000-05-18 Innogenetics N.V. Method for detection of drug-induced mutations in the reverse transcriptase gene
ZA973367B (en) 1996-04-19 1997-11-18 Innogenetics Nv Method for typing and detecting HBV.
FR2750505B1 (fr) * 1996-06-27 1998-10-16 Appligene Oncor Procede de preparation de supports d'analyse de substances chimiques ou biologiques presentant un ensemble ordonne de zones de reaction
US6083763A (en) 1996-12-31 2000-07-04 Genometrix Inc. Multiplexed molecular analysis apparatus and method
US7101672B2 (en) * 1998-05-05 2006-09-05 Third Wave Technologies, Inc. Target-dependent reactions using structure-bridging oligonucleotides
IL122299A (en) * 1997-11-25 2003-11-23 Broadcom Corp Video encoding device
US20030096232A1 (en) 1997-12-19 2003-05-22 Kris Richard M. High throughput assay system
WO1999060158A1 (fr) * 1998-05-19 1999-11-25 Laboratory Of Molecular Biophotonics Phase solide utilisee pour detecter de l'acide nucleique et procede de detection d'acide nucleique
AR020608A1 (es) 1998-07-17 2002-05-22 United Video Properties Inc Un metodo y una disposicion para suministrar a un usuario acceso remoto a una guia de programacion interactiva por un enlace de acceso remoto
DK1213919T3 (da) 1998-07-17 2010-05-17 United Video Properties Inc Interaktivt tv-programguidesystem med flere indretninger i en husholdning
AU2006203092B2 (en) * 1999-02-03 2009-11-12 Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. Oligonucleotide primers for efficient detection of hepatitis C virus (HCV) and methods of use thereof
US6623919B1 (en) * 1999-02-03 2003-09-23 Ortho-Clinical Diagnostics, Inc Oligonucleotide primers for efficient multiplex detection of hepatitis C virus (HCV) and human immunodeficiency virus (HIV) and methods of use thereof
US6638714B1 (en) * 1999-02-03 2003-10-28 Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. Oligonucleotide primers for efficient detection of hepatitis C virus (HCV) and methods of use thereof
GB0016836D0 (en) * 2000-07-07 2000-08-30 Lee Helen Improved dipstick assays (1)
US6586584B2 (en) 2001-01-29 2003-07-01 Becton, Dickinson And Company Sequences and methods for detection of Hepatitis C virus
US20040043379A1 (en) * 2001-03-27 2004-03-04 Koji Hashimoto Method of detectingnucleic acid relating to disease
US20030152942A1 (en) * 2001-05-09 2003-08-14 Lance Fors Nucleic acid detection in pooled samples
US7196183B2 (en) * 2001-08-31 2007-03-27 Innogenetics N.V. Hepatitis C virus genotype, and its use as prophylactic, therapeutic and diagnostic agent
US7877273B2 (en) * 2002-01-08 2011-01-25 Fredric David Abramson System and method for evaluating and providing nutrigenomic data, information and advice
GB0200526D0 (en) * 2002-01-11 2002-02-27 Science And Technology The Methods
FR2855832B1 (fr) 2003-06-03 2007-09-14 Biomerieux Sa Procede de diagnostic et/ou de pronostic d'un syndrome septique
FR2857375B1 (fr) 2003-07-10 2007-11-09 Biomerieux Sa Procede de detection et/ou d'identification de bacteries de genre staphylococcus
EP1536024B1 (en) * 2003-08-29 2016-08-17 Fujirebio Europe N.V. New hepatitis c virus clade and phototype sequences thereof
US8124747B2 (en) 2003-08-29 2012-02-28 Innogenetics HCV clade and prototype sequences thereof
US20090209432A1 (en) * 2004-04-06 2009-08-20 Flinders Technologies Pty. Ltd. Detecting targets using nucleic acids having both a variable region and a conserved region
US8806533B1 (en) 2004-10-08 2014-08-12 United Video Properties, Inc. System and method for using television information codes
FR2881437B1 (fr) 2005-01-31 2010-11-19 Biomerieux Sa Procede pour le diagnostic/pronostic d'un syndrome septique
EP1866445B1 (en) 2005-03-30 2013-10-16 Labo Bio-Medical Investments B.V. Identification of beta-papillomavirus dna by type-specific reverse hybridization
US7465561B2 (en) * 2005-06-30 2008-12-16 Roche Molecular Systems, Inc. Probes and methods for hepatitis C virus typing using single probe analysis
WO2007059348A2 (en) * 2005-11-17 2007-05-24 Third Wave Technologies, Inc. Compositions and methods for detecting an hcv-1 subtype
EP1987162A4 (en) * 2006-01-23 2009-11-25 Population Genetics Technologi NUCLEIC ACID ANALYSIS ABOUT SEQUENCE TOKENS
FR2906537A1 (fr) 2006-09-28 2008-04-04 Biomerieux Sa Procede de diagnostic in vitro du cancer broncho-pulmonaire par detection des transcrits majoritaires alternatifs du gene klk8 codant la kallicreine 8 et son utilisation pour le pronostic de survie
EP2463390A1 (en) 2006-10-20 2012-06-13 Innogenetics N.V. Methodology for analysis of sequence variations within the HCV NS5B genomic region
US20110136678A1 (en) 2006-10-20 2011-06-09 Erwin Sablon Methodology for analysis of sequence variations within the hcv ns3/4a genomic region
US8418206B2 (en) 2007-03-22 2013-04-09 United Video Properties, Inc. User defined rules for assigning destinations of content
EP2236624B1 (en) * 2007-08-09 2012-11-07 Federalnoe Gosudarstvennoe Byudzhetnoe Uchrezhdenie Nauki Institut Molekulyarnoi Biologi Im. V.A. Engelgardta Rossiiskoi Akademii Nauk Method for identifying the genotype and subtype of hepatitis c virus on a biological microchip
US8601526B2 (en) 2008-06-13 2013-12-03 United Video Properties, Inc. Systems and methods for displaying media content and media guidance information
US8258283B2 (en) * 2008-12-29 2012-09-04 Lg Life Sciences Ltd. Method for detection of HCV at the real time PCR with intercalating dye
US20100240049A1 (en) * 2009-01-16 2010-09-23 Cepheid Methods of Detecting Cervical Cancer
EP2379752B1 (fr) 2009-01-19 2015-09-30 Biomérieux S.A. Procedes pour determiner la susceptibilite a contracter une infection nosocomiale chez un patient et pour etablir un pronostic d'evolution d'un syndrome septique
US20100323344A1 (en) * 2009-06-18 2010-12-23 Ferguson Monique R Detection of hepatitis C virus RNA
US9204193B2 (en) 2010-05-14 2015-12-01 Rovi Guides, Inc. Systems and methods for media detection and filtering using a parental control logging application
WO2011150976A1 (en) 2010-06-04 2011-12-08 bioMérieux Method and kit for the prognosis of colorectal cancer
US9110079B2 (en) 2010-09-29 2015-08-18 Biomerieux Method and kit for establishing an in vitro prognosis on a patient exhibiting SIRS
FR2970975B1 (fr) 2011-01-27 2016-11-04 Biomerieux Sa Procede et kit pour determiner in vitro le statut immunitaire d'un individu
WO2012129758A1 (en) 2011-03-25 2012-10-04 Biomerieux Method and kit for determining in vitro probability for individual to suffer from colorectal cancer
ES2640570T3 (es) * 2012-10-18 2017-11-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Ensayo de doble sonda para la detección de VHC
FR3000966B1 (fr) 2013-01-11 2016-10-28 Biomerieux Sa Procede pour etablir in vitro un pronostic de severite chez un patient en choc septique
CN104178562B (zh) 2013-05-21 2018-11-09 生物梅里埃股份公司 一种大肠癌预后试剂盒
EP3643792B1 (en) 2018-10-24 2021-09-15 Fujirebio Europe N.V. Detection and analysis of sequence variations in a target nucleic acid

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8810400D0 (en) * 1988-05-03 1988-06-08 Southern E Analysing polynucleotide sequences
JPH02167081A (ja) * 1988-12-21 1990-06-27 Tetsuo Nakamura 非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびウイルス抗原蛋白質
US5176994A (en) * 1988-12-21 1993-01-05 Immuno Japan Inc. Non-A, Non-B hepatitis virus genome RNA, cDNA and virus antigen protein
US5629158A (en) 1989-03-22 1997-05-13 Cemu Bitecknik Ab Solid phase diagnosis of medical conditions
US5043272A (en) * 1989-04-27 1991-08-27 Life Technologies, Incorporated Amplification of nucleic acid sequences using oligonucleotides of random sequence as primers
JP2802125B2 (ja) * 1989-06-23 1998-09-24 キヤノン株式会社 核酸の検出方法
US5372928A (en) * 1989-09-15 1994-12-13 Chiron Corporation Hepatitis C virus isolates
GB8924989D0 (en) * 1989-11-06 1989-12-28 Scotgen Ltd Method and device for the detection of antibiotic resistance
US5252743A (en) * 1989-11-13 1993-10-12 Affymax Technologies N.V. Spatially-addressable immobilization of anti-ligands on surfaces
US5629153A (en) * 1990-01-10 1997-05-13 Chiron Corporation Use of DNA-dependent RNA polymerase transcripts as reporter molecules for signal amplification in nucleic acid hybridization assays
EP0461863A1 (en) * 1990-06-12 1991-12-18 Immuno Japan Inc. Oligonucleotide primers, and their application for high-fidelity detection of non-A, non-B hepatitis virus
DK0469348T3 (da) * 1990-07-11 1997-04-01 Shionogi & Co cDNA-sekvens og detektering af hepatitis C-virus
HUT69140A (en) * 1990-08-10 1995-08-28 Chiron Corp Nanbv diagnostics: polynucleotides useful for screening for hepatitis c virus
US5620852A (en) 1990-11-14 1997-04-15 Hri Research, Inc. Nucleic acid preparation methods
EP0562047A4 (en) * 1990-12-06 1995-11-02 Affymax Tech Nv Sequencing by hybridization of a target nucleic acid to a matrix of defined oligonucleotides
EP0511559A1 (en) * 1991-04-30 1992-11-04 F.Hoffmann-La Roche & Co. Aktiengesellschaft Oligonucleotide probe reagent
CZ288720B6 (cs) * 1991-05-08 2001-08-15 Chiron Corporation Nukleová kyselina, kompozice s jejím obsahem, způsob tvorby hybridizačního produktu a způsob detekce genotypů HCV
US6190864B1 (en) 1991-05-08 2001-02-20 Chiron Corporation HCV genomic sequences for diagnostics and therapeutics
US5428145A (en) * 1991-08-09 1995-06-27 Immuno Japan, Inc. Non-A, non-B, hepatitis virus genome, polynucleotides, polypeptides, antigen, antibody and detection systems
EP0529493B1 (en) * 1991-08-27 1997-12-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods and reagents for hepatitis C detection
EP0532258A2 (en) * 1991-09-09 1993-03-17 Immuno Japan Inc. Oligonucleotides and determination system of HCV genotypes
WO1993005181A1 (en) 1991-09-12 1993-03-18 Cedars-Sinai Medical Center Direct detection of hepatitis c virus rna
US5173994A (en) * 1992-01-14 1992-12-29 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Fiber cleaning apparatus with air flow deflector
CA2135646A1 (en) * 1992-05-11 1993-11-25 Kenneth G. Draper Method and reagent for inhibiting viral replication
JPH06153961A (ja) 1992-11-27 1994-06-03 Imuno Japan:Kk Ｃ型肝炎ウイルス部分遺伝子、ならびにｃ型肝炎ウイルス遺 伝子の高感度検出法
JP4251407B2 (ja) 1992-11-27 2009-04-08 イノゲネテイクス・エヌ・ブイ Ｈｃｖ単離物のタイピング法
US5820852A (en) * 1996-11-26 1998-10-13 The Proctor & Gamble Company Oral compositions containing fluoride, pyrophosphate, and peroxide

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007517525A (ja) * 2004-01-07 2007-07-05 サード・ウェーブ・テクノロジーズ・インク Ｃ型肝炎ウイルスの遺伝子型の決定方法
US8071750B2 (en) 2004-01-07 2011-12-06 Third Wave Technologies, Inc. Determination of hepatitis C virus genotype
JP2019531747A (ja) * 2016-10-19 2019-11-07 ジェン−プローブ・インコーポレーテッド Ｃ型肝炎ウイルスを検出または定量するための組成物および方法
JP2022022452A (ja) * 2016-10-19 2022-02-03 ジェン－プローブ・インコーポレーテッド Ｃ型肝炎ウイルスを検出または定量するための組成物および方法

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