JPH07502898A - 酵素ｒｎａ分子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 酵素ＲＮＡ分子 発明の背景 本発明は、ある時はりボザイムと呼ばれ、他のＲＮＡ分子を切断し得る酵素ＲＮ Ａ分子に関する。合衆国政府はＮ、１．Ｈ，（ＧＭ−４０６８９）からの支援で 幾分なされた本発明に権利を有しつる。

セフ等、Ｕ、Ｓ特許４．９８７．０７１は、１又はそれ以上の酵素活性、例えば 他のＲＮＡ分子を切断する作用をなすエンドリボヌクレアーゼを有する種々のＲ ＮＡ分子を記載する。そのような活性は分子内切断活性と呼ばれる。これらの酵 素ＲＮＡ分子は、それ自体切断及びスプライソングとなる活性を有するＲＮＡ分 子から誘導される。そのような自己切断は分子内切断活性の例である。

ベロツタ及びビーン、１８　ヌクレイツク・アンラド・リサーチ　６８２１．１ ９９゜は、Ｄ型肝炎ウィルス（ＨＤＶ）のゲノムＲＮＡがらの自己切断ドメイン を記載する。彼等は、ＨＤＶゲノム鎖の自己切断部位での切断に必要な最小配列 を記載し、又、このドメインの外側を落とす配列が切断反応を阻害する証拠を示 す。彼等は、 他の自己切断及び自己スプライ／レグＲＮＡと共に「リボザイム」を酵素及び基 質部分に物理的に分離することがしばしば可能である。ＨＤ　Ｖ自己切断ＲＮＡ については、同様にうま（行く分離が可能でありうる。切断部位に対し５′を要 求する単一ヌクレオチドが基質の部分として観察されると、基質の残り及び全触 媒部分は切断部位の３′側で配列に存在しなければならない。我々の結果は、Ｈ ＤＶゲノムＲＮＡの自己切断について、切断の部位に対し、５′側で「基質」配 列との有意な相互作用が切断部位でウリノンに限られうろことを示す。より長い 配列を要求することが予想されるが、ｖＬＴＳＶ　ＲＮＡが切断部位に対し３ｎ ｔ５′側のみを要求し、他のＲＮＡ触媒反応で切断の部位に隣接するより短い配 列にも先例がある。例えばテトラヒメナ族Ｉイントロンから誘導されたりボザイ ムはジヌクレオと同じくらい小さな基質を触媒する。同じリボザイムは末端リン 酸エステルを含む反応、ホスホトランスフェラーゼ及び酸性ホスファーゼとして 作用することも可能である（例示省略）。

と述べる。

以下の検討は、本発明の請求の範囲に対する先行技術として認められない技術に 関する。

ベロツタ及びビーン、３５０　ネイチャー６３１７．１９９１は、ＨＤＶゲノム 及び抗ゲノムＲＮＡの構造を記載し、又、ＨＤ　Ｖゲノム鎖ＲＮＡからの自己切 断要素が、切断部位に対し、５′側でただ一つのヌクレオチド及び８３ヌクレオ チド又は、変性剤の存在で、自己切断活性のための切断部位に対し３′側で、８ ４ヌクレオチドのいずれかを要求することを述べる。

ローゼンノユタイン及びビーン、１９　ヌクレイツク・アンツズ・リサーチ５４ ０９．１９９１は、ＨＤＶのゲノム及び抗ゲノム自己切断要素についての塩基対 構造を提案する。

ブランチ及びロバートソン、８８　プロノーディンゲス・オン・ナンジナル・ア カデミイ・オン・サイエンシズ　ＵＳＡ　１０１６３．１９９１は、ＲＮＡを酵 素及び基質成分であると信じられるものに分割するよう修飾されたＨＤＶによる トランス切断を記載する。これら２つの成分は後で結合し、効率的なＲＮＡプロ セシング反応と正しいＲＮＡ末端を与えると記載された。彼等は、ペロツタ及び ビーン、ヌクレイツク・アンッズ・リサーチ、土掘が、初めの５又は６残基が［ ブランチ及びロバートソンのコ基質に存在し、転写物は、／ス切断を要求せず、 結果は切断部位の５′部位に３塩基のみを含んでいる抗ゲノム転写物の［ブラン チ及びロバートソンの］予備的研究と一致する。

さらに速度論的研究は、トランス切断の効率が基質の５′末端と酵素の３′末端 の間を対合する潜在的塩基にどう影響されるか測定することが必要であろう。

そのような塩基対合相互反応の可能性は、酵素転写物の３′末端にδＲＮＡに存 在しない残基を加えることにより［ブランチ及びロバートソンの］　トランス反 応中で増加した。

と述べている。

発明の要約 本発明は、例えばＤ型肝炎ウィルス（ＨＤＶ）から誘導されたもので、それらは 基質ＲＮＡでそれらのＲＮＡ切断活性を示すのに基質ＲＮＡ分子の切断部位がら ３′側に基質ＲＮＡ分子との塩基対合のみを必要とする、基質ＲＮＡ切断酵素Ｒ ＮＡ分子、の構築及び用途に関する。本発明は、又、隣接する２′水酸基の使用 によりその部位を切断するために基質ＲＮＡの切断部位の３′又は５′側のみで 結合する必要がある第一酵素ＲＮＡ分子を提供する。これは、基！ＲＮＡの切断 部位から５′側で結合し、切断にグアノシン化合物を必要とするテトラヒメナか ら誘導された酵素ＲＮＡ分子と対照的である。それは又、基質ＲＮＡの切断部位 に対し３′及び５′側の両方で結合し、隣接する２′水酸基を用い切断を生ずる いわゆるヘアピン及びハンマーへッドリボザイムと対照的である。

従って、出願人は第一に、分離（基質）ＲＮＡ分子の切断が切断部位から３′側 のみで結合する酵素ＲＮＡ分子により達成できる手段を提供する。これらの酵素 ＲＮＡ分子は、ハンマーヘッド及びヘアピン酵素ＲＮＡ分子を一般に必要とする １２−１５ヌクレオチドに比べ、所望の活性を発揮するために７基質ヌクレオチ ドと同様に少ない塩基対のみを必要とす。これはテトラヒメナイントロン誘導酵 素ＲＮＡ分子に対する４−６ヌクレオチド標的よりもわずかに長い。即ち、これ らの酵素ＲＮＡ分子は、それらが比較的短いＲＮＡ分子で、しがも特異的標的、 比較的短い標的配列として提供できるので、これまでに記載された酵素ＲＮＡ分 子よりも優れている。それらは、それらが他の標的にほとんど又は全く作用する ことなく特別のＲＮＡ標的に高度の作用特異性を依然示すので、４−６ヌクレオ チドのみを認識するものよりも優れている。

本発明の酵素ＲＮＡ分子は、切断部位に対する即時３′側でのグアノシン塩基の 採択、切断部位に対する即時５′側でのＵ、Ｃ又はＡの採択、及び生じる切断に ついての２′水酸基の有用性のみを有するほとんど全ての７又は８ヌクレオチド 部位で切断するよう設計できる。従って、これらの酵素ＲＮＡ分子は、診断及び 治療方法に用いることができる有意なインビトロ及びインビボ活性を提供する。

明らかにするために、本発明の酵素ＲＮＡ分子は、リホザイムよりはむしろ酵素 と呼ばれ、それらの分子内切断酵素的性質を示す。即ち、これらの分子は他のＲ ＮＡ分子を切断し、それら自体から分離するよう作用する。

従って、第一の局面では、本発明は、切断部位で分離ＲＮＡ基質を切断するＲＮ Ａ基質切断酵素活性を有する核酸分子を特徴とする。核酸分子は、塩基が切断部 位の３′側のみでＲＮＡ基質と塩基対合するＲＮＡ基質結合部分、及び（ＲＮＡ 基質結合部分の一部又は全てを含みうる）酵素活性を有する酵素部分を含む。

核酸分子は切断部位の３′側でのみＲＮＡ基質と塩基対合し、その切断部位てＲ ＮＡ基質の切断を起こすことができる。

関連局面では、本発明は、切断部位の３′側でのみＲＮＡ基質と核酸分子との塩 基対合を生じさせることによる、切断部位でのＲＮＡ基質の切断方法を特徴とす る。そのような方法は、ＲＮＡ基質を切断部位で分離ＲＮＡＩ賞を切断するＲＮ Ａ基質切断酵素活性を有する核酸分子と接触させることを含む。本核酸分子は、 切断部位の３′側のみてＲＮＡ基質と塩基対合するＲＮＡ基質結合部分、及び（ ＲＮＡ基質結合部分の一部又は全てを含みうる）酵素活性を有する酵素部分を含 む。

核酸分子は切断部位の３′側でのみＲＮＡ基質を塩基対合することが可能であり 、切断部位てＲＮＡ基質の切断を生ずる。接触は、核酸分子が切断部位てＲＮＡ 基質の切断を生じる条件下に実施する。

別の関連局面では、本発明は切断部位で分離ＲＮＡ基質を切断するＲＮＡ基質切 断酵素活性を有する核酸分子を特徴とする。分子は、切断部位の３′又は５′側 のみてＲＮＡ基ｉｔと塩基対合し、切断部位の３′側及び５′側の両者ではしな いＲＮＡ基質結合部分及び（ＲＮＡ基質結合部分の一部又は全てを含みうる）酵 素活性を有する酵素部分を含む。核酸分子は、切断部位の３′又は５′側でのみ ＲＮＡ基質と塩基対合することが可能であり、隣接する２′水酸基により切断部 位でＲＮＡ基質の切断を生ずる。この２′水酸基は、一般に基質ＲＮＡ分子によ り提供される。

上記局面の好ましい実施態様では、核酸分子はＤ型肝炎ウィルスから誘導され、 核酸分子は、ＧＮＮＮＮＮＮ又はＮＮＮＮＮＮＮ　（式中、各Ｎは独立していず れかの特定ヌクレオチド塩基であることができる）のＲＮＡ基質配列に対し５′ 側で切断する活性を有し、核酸分子は、切断部位と隣接して塩基対合する少なく とも１つのりボヌクレオチドを含み、核酸分子はＲＮＡであり、核酸はＲＮＡと ＤＮＡの混合物であり、核酸分子は７ヌクレオチドがら成るが実質的に成る標的 ＲＮＡ配列と塩基対合し、核酸分子は環状であり、そして核酸分子は単−ＧＵ塩 基対、続いて６ワトソンークリツク塩基対（例えば、ＡＵＳＧＣ及びＡＴから選 ばれるもの）を有するＲＮＡ二本鎖を切る活性を有する。

他の局面では、本発明は二本鎖ＲＮＡ基質を切断部位で切断するＲＮＡ基質切断 酵素活性を有する核酸分子を特徴とする。核酸分子はＲＮＡ二本鎖を認識し、Ｇ Ｕ塩基対のＧの５′側てＲＮＡ二本鎖、例えば構造：ＧＮＮＮＮＮＮ ＵＮＮＮＮＮＮ を有するＲＮＡ二本鎖を切断することができる酵素部分を含む。

別法として、核酸分子は、グアノンノー独立方法でＲＮＡ　（即ちワトソンーク リック塩基対で結合した構造）二本鎖を切断する活性を有する。

関連局面では、本発明はグアノノン−独立方法でＲＮＡ二本鎖又は構造・ＧＮＮ ＮＮＮＮ ＵＮＮＮＮＮＮ を有するＲＮＡ二本鎖を切断する方法を特徴とする。

方法は、ＲＮＡ二本鎖を、二本鎖ＲＮＡ基質を切断部位で切断するＲＮＡ基質切 断酵素活性を有する核酸分子と接触させる段階を含む。本核酸分子は酵素活性、 例えばＧＵ塩基対のＧの５′側で基質を切断することができるものを有する酵素 部分を含む。

さらに別の局面では、本発明は、分離ＲＮＡ基質を切断部位で切断する酵素活性 を有する環状核酸分子、及びそのような分子の製造方法を特徴とする。一般に、 環状化すべきＲＮＡを含む自己連結及び自己切断ＲＮＡ分子は、以下に記載する ようなＲＮＡを環状化するのに適当な条件下にイキュベートする。このよう自己 連結自己切断ＲＮＡは、自己切断でないがインビボで細胞因子により連結するで あろうグループ■又は■イントロンであるか或はブレーａＲＮＡイントロンから 誘導されうる。

本発明の他の特徴及び利点は、その好ましい実施態様の以下の記載から及び請求 の範囲から明らかであろう。

好ましい実施態様の説明 −図面をまず簡単に説明する。

図面 図ＩＡは、ペロツタ及びビーン上掲１９９１、並びにローゼンンユタイン及びビ ーン２９　バイオケミストリイ８０１１．１９９１により提案されたように示し た、自己切断配列５ＡＩ−２のヌクレオチド塩基配列及び潜在的二次構造の線図 描写である。切断の部位は矢印により示す。

図ＩＢ及びＩＣは、基質ＤＨ８Ｌ及びＤＨ５３とそれぞれ塩基対合したＲＮＡ分 子ＡＤＣ１（図ＩＢ）及びＡＤＣ２Ｃ図ＩＣ）のヌクレオチド塩基配列及び潜在 的二次構造の線図描写である。図ＩＢ及びＩＣの箱領域は、配列が変化する領域 を示す。図１Ｂ及びＩＣにおいて、図ＩＡのものと同じヌクレオチド配列は（水 平線により示された塩基対を有する）肉太線で示され、小文字はプロモーター又 はベクターにより提供された転写物に存在する配列を示すのに用いられ、ＲＮＡ 分子の酵素部分の一部であるとは考えられない。

図ＩＤ及びＩＥは、図ＩＡからの配列の変形を示すＨＤ　Ｖのゲノム及び抗ゲノ ムＲＮＡの同様の線図描写である。

図ＩＦ〜ＩＨは、関連活性を示す修飾ＲＮＡ酵素の例の線図描写である。

図２は、「照合」基質のトランス切断を示すオートラジオグラムの複製である。

基質オリゴヌクレオチド、ＤＨ３１及びＤＨ５３（放射活性５゛−末端標識化） は、表示したようにＡＤＣｌ又はＡＤＣ２と３７℃、４５℃又は５５℃でインキ ュベートしｔ二。４０ｍＭ　トリスＨＣＩ（２５℃でｐＨ８，０）　、１！ＩＭ 　ＥＤＴＡ、１１ｍＭ　ＭｇＣ１５及び１．５＋＋Ｍ基質を含む反応は酵素ＲＮ Ａの領３μＭまでの添加により開始し、次いで表示温度でインキュベートした。

完全反応のｐＨは、３７℃で７７から５５℃で７．４まで変化した。反応は、２ ５ｍＭＥＤＴＡを含む１０ｐｌホルムアミドの添加により３０分後停止し、２０ ％のポリアクリルアミドゲル上の電気泳動により分画した。コントロール反応は 酵素（φ）又はＭｇＣ１，（−Ｍｇ）のいずれかの不存在で５５℃で３０分間イ ンキュベートした。マーカーレーン（Ｔ１）は基質オリゴヌクレオチドのＴ１一 部分消化物を含有した。末端標識切断生成物の位置（ｐＵＵＣ＞ｐ）を示す。

図３Ａ及び３Ｂは、５５℃での酵素ＲＮＡ転換を示すグラフ描写である。図３八 において、基質ＲＮＡ　（［５’−３２Ｐ］　ＤＨ３Ｉ）及び酵素ＲＮＡ　（Ａ ＤＣＩ）は、４ＱｍＭ）リスＨＣＩ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１１ｅ＋Ｍ　ＭｇＣ＋ ２（３７℃でｐＨ７７，５５℃でｐＨ７，４）中、反応温度で３分間、別々にブ レインキュベートし、次いで混合して反応を開始した。混合後、ＤＨ８Ｉの濃度 は２μＭでＡＤＣＩの濃度は０．２μＭであった。試料（５μｌ）を表示時間で 取り、同量の２５＋ＭＥＤＴＡを含むホルムアミドで反応を停止し、２０％ポリ アクリルアミドゲル上の電気泳動により分画した。標識基質及び生成物バンドを 測定し、結果を生成物に存在する各レーンに全放射活性のフラクションとして、 及び酵素ＲＮＡのモル当りに生成した生成物のモル（Ｐ／Ｅ）として表した。５ ５℃で基質の９０−９２％は切断し、データはこのエンドポイントを訂正しなか った。黒ぬり三角、反応５５℃。白丸、反応３７℃。黒ぬり丸、反応は３７℃で インキュベートし、次いで３０分後５５℃にシフトした。図３Ｂにおいて、実験 は、酵素ＲＮＡ濃度を０゜３μＭに増加し、基質濃度を１．５μＭに減じた以外 、図３Ａにおけると同様に行った。

図４Ａ及び４Ｂは、基質標的サイズの評価を示すオーラジオグラムの複製である 。詳しくは、図４Ａは、切断の部位に対し３′側の必要物を示す。５′末端標識 基質オリゴヌクレオチドのアルカリ加水分解産生部分消化物、ＤＨ３Ｉ　（レー ン４）は、ＯｍＭ（レーン６）、２ｍＭ　（レーン７及び８）又は１０ｍＭ　Ｍ ｇ”　（レーン９−１２）中、５０℃で０．３μｌＭ　ＡＤＣｌと５分（レーン ７．９及び１１）又は３０分（レーン８．１０及び１２）間、インキュベートし た。切断を開始するのに用いたＭｇ　２　’に加えて、レーン５−１２に示す反 応は３ＱｍＭ　トリス／ＨＣ１，７ｍＭ重炭酸ナトリウム（ｐＨ７、５）及び領 ５ｍＭ　ＥＤＴＡを含み、レーン１１及び１２に示す反応はさらに２Ｍ尿素を含 有した。各反応中の全基質の量は２５ｍＭよりも少なく見積もった。試料は、５ μｍの反応物を同量の、２５＋１１ＭＥＤＴＡを含むホルムアミドと混合するこ とにより電気泳動用に調製した。生成物を２０％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素 ゲル上で分画した。マーカー及びコントロール　レーン１、標識ＤＨ８Ｌ未処理 未処理アレーンＨ５Ｉは１０ｍＭ　Ｍｇ２゛中５０℃で１０分間ＡＤＣ１により 切った；レーン３、ＤＨ５１のＴ１部分消化物、レーン５、酵素ＲＮＡを含まな いｌＱｍＭ　Ｍｇ”中５０℃で３０分間インキュベートしたアルカリ消化物。

図４Ｂは、切断の部位に対する５′側の要求物を示す。３′−末端標識ＤＨ３２ のアルカリ産生部分消化物（ＵＵＣＡＧＧＧＵＣＧＧｐ＊ＣｐＸレーン４）をＯ （レーン６）、２（レーン７）、１０（レーン８）又は２０ｍＭ　Ｍｇ”　（レ ーン９）中、領３μＭＡＤＣＩと５０℃でインキュベートした。反応は、５分後 、同量の、２５ｍＭ　ＥＤＴＡを含むホルムアミドの添加により停止した。反応 条件：ま、図４Ａに記載したもの（マーカー及びコントロールレーン１−３及び ５は、上記したものと同等のものであった）と異なった。３′標識化及びアルカ リ又はＴ１による部分消化物に用いた条件は、ベロツタ及びビーン上掲、１９９ ０及び＋９９１に記載される。

図５Ａは切断部位に対し５′側の位置で基質に存在するヌクレオチドでの変化の 影響を示ずＰＥ］薄層クロマトグラフィプレートのオートラジオグラムの複製で ある。詳しくは痕跡量の配列［５’　３２Ｐ］　ｐＮＡＧＧＧＵｃＧＧ　（式中 Ｎ（ま図に示したヌクレオチドである）のオリゴヌクレオチドを４ＱｍＭｈリス ＭＣＩ（ｐＨ７４）　、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１ｂＭ、ＡＤＣｌ中、掲示したよう に１１ｍＭ　ＭｇＣｌ２を存在させ又はさせることなく５５℃で１０μｍ反応で インキュベートした。酵素ＲＮＡをｉＩｋ後に加えた。５分後、２．５ｕｌの０ ．１ＭＥＤＴＡを加えて反応を停止し、各反応から２ａｌをＰＥＩプレート上に 分画した。アデノシン２゜３′サイクリツクリン酸５′リン酸マーカーの位置は 、破線の卵形により示す。

図５Ｂは、基質ＲＮＡ超過時間の切断のグラフ描写である。反応は、ＡＤＣ１の 濃度をＤＨ３８（５’Ｇ）により反応中に変えた以外、図５Ａに記載した通りで あった。ＰＥＩプレートはオリジンで２．５μｌの０．１Ｍ　ＥＤＴＡと共にプ レスポットし、示された時間に２８１の反応物を取り、直接ＰＥＩプレート上に スポットし、反応を停止した。白丸、１μＭＡＤＣＩによるＤＨ３４（５’Ｃ） 　白四角、ＩＩＩＭＡＤＣｌによるＤＨ３５（５’Ｕ）：白三角、１μＭによる ＤＨ５６（５’Ａ）。

増加するサイズの黒ぬり丸、１．２又は４ＭＭＡＤＣＩによるＤＨ３７（５’Ｇ ）。

値は反応の最終限度を調整しなかった。

図６−１０はそれぞれ以下の酵素ＲＮＡ分子（ＡＤＣＩ、ＡＤＣ３、ＣＤＣ２Ｑ ＱＳＰＤＣ７）及び関連基質並びに二本鎖切断酵素の線図描写である。

図１１は環状（Ｃ）酵素ＲＮＡ分子の形成に適用したＲＮＡ分子を示す線図描写 である。野生型イントロン二次構造は、上方左に図式的に示し、変更（ｐｅｒｍ ｕｔｅｄ）イントロン配列の二次構造は、図の残部に示す。太い線はエキリン配 列（？ＪＩ数もあり）を示し、細い線はイントロン配列を示し、黒ぬり点線は変 更形に加えられたベクター配列を示す。矢印は５′スプライス部位を指す。数は イントロン中の特異対合を指す。

図１２は環状ＲＮＡ分子の一例の形成の段階を図式的に示す。最初にグアノシン が環状化すべきＲＮＡ配列（黒線）を含む変更ＲＮＡの５′スプライス部位を攻 撃する。次いで攻撃は３′スプライス部位の新しい３′水酸基により生じ「内部 エキリン」配列の共有結合閉鎖となり、環状ＲＮＡを形成する。

酵素ＲＮＡ分子 本発明の酵素ＲＮＡ分子は一般に上記される。以下にそのような分子の実施例を 提供する。これらの実施例は本発明に限定されず、本発明を読者に明確に示すた めにのみ提供される。当業者はこれらの実施例及び関連記述が以下に示される請 求の範囲の実施を可能にすることを理解するであろう。

上で検討したように、これらの分子による基質ＲＮＡの特異切断は、切断の部位 に対し３′側で塩基対合のみを必要とする。酵素ＲＮＡ分子の切断の機構も、切 断部位リンへの攻撃が外因性グアノシンの３′−水酸基よりもむしろ隣接する内 因性２′−水酸基によるものであるので、テトラヒメナ指定（例えばＬ−１９） ＲＮＡ分子について記載されたものと異なる。即ち、これは切断部位の一つの側 のみに要求される塩基対合を伴う隣接する２′水酸基により、部位に切断を起こ す酵素ＲＮＡの最初の記載である。以下にＨＤ　Ｖ酵素について、２′−水酸基 がそのような特異切断に要求される酵素ＲＮＡの最初の記載を提供する。

図ＩＡを引用して、酵素トランス反応を示すために以下の実施例で用いられるＲ ＮＡ配列は、ＨＤＶの抗ゲノム（マイナス）鎖がらの自己切断配列から誘導され たが、全く同一ではない。図ＩＤ及びＩＥを引用してゲノム及びゲノムＨＤＶか らの自己切断配列は、同様の方法で用いることができ、同様の性質を有する酵素 ＲＮＡ分子を発達させる。実際、２つの配列の複合体である合成バージョン、Ｃ ＤＣ２００（図８及び以下参照）も活性である。図ＩＦ−ＩＨに示すように、Ｒ ＮＡ配列での有意な違いが本発明の種々の酵素ＲＮＡの間に存在する。この事実 は、以下の広範囲の請求範囲を支持する。

以下の実施例から明らかなように、はとんど無限の変化をＨＤＶの項目Ｉで行う ことができる（図１参照）。幹■対合に含まれる各位置での変化はなされなかっ たけれども、基質の＋１の塩基（切断部位に対し３′側の最初の位置）だけが容 易に変化できないことは明らかで、即ち、その位置でＧは、切断反応が最大効率 で生ずるのに重要であるように見える。結合部位での変化は、＋２ないし＋７の 塩基がワトソンークリック対合を経て認識されることを示す。従って、所望の酵 素を基質配列ＧＮＮＮＮＮＮ　（式中、Ｎは特異的ヌクレオチド塩基であること ができる）に対し５′側で切断するよう設計することが可能である。

幹Ｉを延長（又は短縮）することにより標的配列のサイズを変えることが可能で あることも明らかで、これは活性をある程度まで影響しうる。幹■又は■のサイ ズ及び配列を変えることにより行うことができる本酵素に対する幾つかの変化が ある。図７は、幹■が短縮されて（ＡＤＣ３）試験がなされたものの一つを示す 。この小さなパージョンは、少なくともＡＤＣｌと同じように活性であるように 見える（図６参照）が、しかしながら、ｃｉｓでは、自己切断はより長い幹■を 伴うバージョンよりも速く、即ち、小さな酵素はより活性であろう。自己切断形 のＲＮＡ分子では、配列てＡＤＣ３の幹■に変化し、ＡＤＣＩの幹■は元のバー ジョン以上に切断の程度を増す。酵素活性が要求されない多くの配列が除去でき る。例えば図８　（ＣＤＣ２００）は、造られて活性であることが示されたＲＮ Ａ分子を示す。そのような小さな酵素ＲＮＡは、簡単に合成され、より高い特異 的活性の可能性は小ＲＮＡが酵素的に活性な構造に折りたたまれる高い確率を有 する。

標的配列も切断反応の間にループを巻くが依然として切断を起こさせる一連の塩 基を含みつる。従って酵素ＲＮＡ分子は異なる構造のＲＮＡ基質を標的とじつる 。

本発明において可能であるＲＮＡ構造での幾っがの変化は、幹Ｈの開いた末端が ループで閉じ、そして幹■が開くバージョンにより示される（図９、ＰＤＣ７） 。

この「変更」バージョンも酵素的に活性である。酵素設計の見地がらすると、活 性酵素を造る能力は、一度それが合成されると正しく折りたたむＲＮＡを得るこ とに大きく依存しうる。ポリヌクレオチド鎖が開始し、終了する位置を変える能 力はその点について、幾らが役立ちつる。酵素の環状に変更したバージョンを造 ることができるという事実は、酵素の環状形を造ることが可能であることを示唆 する。そのような環状ＲＮＡ分子は、それらが末端を有しないので、ＲＮＡを崩 壊させるエキソヌクレアーゼに対し耐性である。そのような酵素は治療用途に非 常に重要である。

一本鎖ＲＮＡを切るよりも単−ＧＵ塩基対、続いて６ワトソンークリツク塩基対 を含むＲＮＡ二本鏑を切るＲＮＡ酵素のバージョンを造ることも可能である。

図１０を引用して、幹Ｉは基質として提供され、酵素の残りはＨＤＶ又はその同 等物のＲＮＡ配列の残余として提供される。

実施例１．　修飾ＨＤＶ　ＲＮＡ Ｄ型肝炎ウィルスからの自己切断ＲＮＡ配列を修飾し、分子内（トランス）反応 でＲＮＡの切断を触媒する能力を有する酵素を生成した。デルタ誘導酵素は基質 ＲＮＡを特異的部位で切断し、配列特異性は、基質との塩基対に提案された酵素 の部分で変更により変えることができた。長さが約８ヌクレオチドの基質標的サ イズが確認された。切断部位に対し、じかに５′側に単一リポヌクレオチドを含 んでいるオクタヌクレオチドは、切断のための基質であり、切断活性はグアニン 塩基でのみその位置で有意に減少した。これらのデータは、二本鎖が切断部位に 対し、３′側で配列と形成するＤ型肝炎ウィルス酵素の自己切断形に提案された 二次構造と一致し、それらは切断が隣接２′水酸基による切断部位でのリンの攻 撃を含む提案された機構を支持する。

Ｄ型肝炎ウィルス（ＨＤＶ）は、Ｂ型肝炎にもかかっているある患者で見出され た小さな一本鎖ＲＮＡウィルスである。ゲノムＲＮＡ及び相補的抗ゲノムＲＮＡ の両者に存在する自己切断配列は、ウィルスＲＮＡの環複製をローリングする間 ＲＮＡを処理するよう作用しうる。従って、ＨＤＶ　ＲＮＡは、その天然形でヒ ト細胞内で機能する自己触媒的ＲＮＡの例である。他の自己切断ＲＮＡと同様、 ＨＤＶＲＮＡの自己切断活性は二価カチオンを必要とし、切断により５′水酸基 及び２’、３′−サイクリックリン酸を含有する生成物を産生ずる。

図ＩＡに示されるＨＤＶ自己切断構造についての提案モデルは、トランス作用酵 素が切断部位（四角で囲んだ部分、図ＩＡ）に隣接する二本鎖により特定される 基質を結合すべきことを示す。本実施例では、幹■の５′部位を削除することに より産生された、触媒形のＤ型肝炎ＲＮＡが特定配列でオリゴリボヌクレオチド を切断することが可能であることを示す。種々のサイズと配列の基質を用い、幹 ■相互反応の分子間型、切断部位二本鎖がトランス反応に必要であるという証拠 が示される。トランス反応は、切断の部位に対し直接５′のヌクレオチドに対す る塩基及び塘必要物を試験するのに用いた。

以下の材料及び方法を本実施例で使用した。

プラスミドｐｓＡ１−２及びｐｓＩ５’３’（ペロツタ及びビーン、止揚１９９ １）は、Ｔ７プロモーターの下流に挿入された抗ゲノムの自己切断要素の合成バ ージョンを含んだ。ｐＡＤｃｌ及びｐＡＤＣ２は、鋳型としてプラスミドのウラ ンル含有一本鏑を用いるオリゴヌクレオチド指定削除突然変異導入法により、ｐ ｓＡｌ−２及びｐＳ　Ｉ　５’３’からそれぞれ産生じた（クンケル等、１５４ 、メス　エンザイム体４ｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｌｌ、　）　３６７．１９８７　ビ ーイレ及びメソンング、１５３、メスエンザイム、３．１９８７）。オリゴヌク レオチド（５′ＡＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＧＣＣ−ＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣ ＧＴ）は、抗ゲノム配列の部分に及びＴ７プロモーターの部分に相補であった。

自己切断要素の配列のＴ７プロモーターに対応する＋２から切断部位に対応する ＋１０まで部分を削除するよう設計し、か（して提案した構造の幹Ｉの５′側を 削除した。適当な削除を伴うプラスミドは、修＃Ｔ７　ＤＮＡポリメラーゼ及び ジデオキシヌクレオチド鎖ターミネータ−を有するプライマー伸長によりミニブ レツブＤＮＡを配列決定することにより確認した。形質転換及び配列決定の二次 ラウンドに続き、プラスミドＤＮＡを煮沸溶解により一夜培養物より調製し、エ チジウムプロミドの存在でＣｓＣ１平衡密度遠心により精製した。

転写に用いた条件は、４０Ｉｌ１ＭトリスーＨＣｌ　（ｐＨ７，５）　、１５＋ ｉＭ　ＭｇＣ１ｚ、５ｍＭジチオトレイトール、２ｍＭスペルミジン、リポヌク レオすド三リン酸各１ｍＭ、０．１ｍｇ／ｍｌ線状プラスミドＤＮＡ、及び５０ 単位のＴ７　ＲＮＡポリメラーゼ／ｍＨのＤＮＡであった。３７℃で６０分後、 ＥＤＴＡを５０ｍＭ、ホルムアミドを５０％（Ｖ／Ｖ）加え、ＲＮＡを７Ｍ尿素 含有８％（ｗ／リポリアクリルアミドゲル上で電気泳動することにより分画した 。ＲＮＡはＵＶシャドーイングにより置き、切削し、−晩４℃（１０ｍＭ　ＥＤ ＴＡ　０．１％（Ｗ／Ｖ）　ドデシル硫酸ナトリウム中）で溶出し、エタノール 沈澱により回収した。濃度を塩基組成及び２６Ｏｒ＋ａでの吸光係数により評価 した。

基質ＲＮＡ５　（ＤＨ３１、ＵＵＣ”ＧＧＧＵＣＧＧＣＡＵ：ＤＨ３２、Ｕｔ７ Ｃ”ＧＧＧＵＣＧＧ　；ＤＨ８３、ＵＵＣＡＧＧＣＡＣＧＧＣＡＵ：ＤＨ８４、 ＣＡＧＧＧＵＣＧＧ：　ＤＨ８５、ＵＡＧＧＧＵＣＧＧ；ＤＨ８６；　ＡＡＧＧ ＧＵＣＧＧＳＤＨ３７；ＧＡＧＧＧＵＣＧＧ）及び混合オリゴヌクレオチド（Ｄ Ｈ８８、ｄＣＡｒＧＣ；ＧＵＣＧＧ）はＵＳバイオケミカル（オハイオ）より提 供されたが、これらは化学的に合成され、脱保護され、塩基はＨＰＬＣにより脱 保護を確かめた。各々をゲル精製し、配列は５’３２ｐ−標識材料の酵素的配列 決定により確認した。

ＤＨ５８のアルカリ加水分解は、その位置で塩基は確認されなかったけれども、 ５′デオキシリボースの存在と一致した５′標識モノヌクレオチドを遊離しなか った。基質オリゴヌクレオチドは、２５ｐモルのオリゴヌクレオチド、２５ｐモ ル［ガンマー３２Ｐ］　ＡＴＰ　（７０００Ｃｉ／■モル）、５０ｍＭ）リスＨ ＣＩ（２４℃でｐＨ８゜９Ｌ１０菖Ｍ　Ｍ　ｇ　Ｃ１！、５■Ｍジチオトレイオ ール及び１０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを含む１０１１１反応中で標 識化し、３７℃で３０分間のインキュベーションに続き、ＥＤＴＡを加えて標識 オリゴヌクレオチドをゲル精製した。

幾つかの実験について、痕跡量の標識基質を既知量の未標識オリゴヌクレオチド と混合した。未ｍ識基質は５’ＯＨ基を含有した。

生成物を７Ｍ尿素０．１Ｍ１−リス−ホウ酸塩ｐＨ８，３及び１＋Ｍ　ＥＤＴＡ を含む２０％ポリアクリルアミド（ビスアクリルアミド　アクリルアミド：１： ２９）ゲル（０，７關厚さ×１９０閣巾×２２ｃｍ高さ）上の電気泳動により分 画した。電気泳動に続いて、ゲルをアセテートンートに移し、プラスチックラッ プで覆い、オートラジオグラムを一７０℃で調製した。ゲルからの結果を測定す るため、バンドをオートラジオグラム用いて置き、切削し１、セレンコブンンチ レーションを測定することにより定量した。

ＥＭサイエンス（ｖＷＲより販売）からのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）プレー トは、予めＨ，Ｏで洗浄し、使用直前に乾燥した。試料（２ｐｉ）をプレートの 底端（ｂｏｔｔｏｍ　ｅｄｇｅ）から２Ｃ鵬にスポットした。溶媒はＬＭ　Ｌｉ Ｃ１であった。定量はバイオスキャン単波検出器を用い行った。

以下の結果を得た。

抗ゲノム自己切断配列（ｐｓＡｌ−２）のクローン化合成バージョンを含むプラ スミドを用い、成分の５′末端形成配列の部分を切削し、ｐＡＤｃｌを産生じた 。

Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼによるインビトロ合成は幹Ｉの５′側欠損ＨｉｎｄＩ Ｉ［ランオフＲＮＡを産生じた（部分１０に対し５′側のヌクレオチドは本転写 で単−Ｇにより置換した）（図ＩＢ参照）。先を切り取った配列の二次バージョ ン、ｐＡＤＣ２は幹Ｉの３′側に変更を取り込んだ（Ａ３６Ｕ、Ｃ３７Ｇ、図Ｉ Ｃ参照）。

ｐＡＤｃｌ及びｐＡＤＣ２から転写されたＲＮＡ　（ＡＤＣＩ及びＡＤＣ２）は 精製し、２つのオリゴリボヌクレオチド基質により切断活性を試験した。基質Ｄ Ｈ８１は１３−ｍｅｒで、それは切断部位に対応するｎｔ位置−３ないし＋１０ の野生型配列を含み、ＡＤＣＩ　ＲＮＡと予想れさる切断部位二本鎖を形成する 可能性を有した（図ＩＢ）。ＤＨ５Ｉは、ＡＤＣ２との同様の相互作用で２つの 不適当な組合わせを含有した。ＤＨ３Ｉに対応する基質ＤＨ３３は、２つの塩基 変化、位置３におけるＧ対Ｃ及び位置４におけるＵ対人を含み、そのために基質 はＡＤＣｌとの２つの不適当な組合わせを含んだがＡＤＣ２による切断部位二本 鎖を形成することができた（図ＩＣ）。

各基質は３！Ｐにより５′末端標識化し、ＡＤＣＩ又はＡＤＣ２とインキュベー トした。正しい部位での各基質の切断は、５′末端標識トリヌクレオチド［３２ ｐ］ＵＵＣを放出した。１０ＩＩＩＭＭｇ２゛中、３７℃、４５℃及び５５℃に おいて、ＤＨ３ＬはＡＤＣＩにより切断されたがＡＤＣ２によっては切断されず 、一方ＤＨ８３はＡＤＣ２によって切断されたがＡＤＣｌによっては切断されな かった（図２参照）。従って、これらの条件下で各形の酵素は、それがワトソン ークリック塩基対を形成できる「適合した」基質のみを切断した。切断反応の正 確度をＴ１に隣接する配列決定ゲル上の切断生成物及び末端標識基質のアルカリ 加水分解はしごを分析することにより確認した。合成鋳型からの転写により作ら れた内部標識基質によって、５′及び３′生成物を観察した。

酵素（ＡＤＣＩ）に対し１０倍過剰の基質（ＤＨ３Ｉ）により、約６０％の基質 を５５℃で６０分間に切断しく図３Ａ、黒ぬり三角参照）、６モルの基質が酵素 のモル当り切断されたことを示す。しかしながら３７℃では、切断された基質の 部分は約１０％で停滞期に入った（白丸）。３７℃で反応の程度はＡＤＣｌの分 子当り単一切断事件を示すことができた。その解釈と一致して、３７℃でのＡＤ ＣＩ対ＤＨ５Ｉ比を増加することは基質の大きなフラクションが切断される結果 となったが、酵素のモル当り約１モルの生成物でやはり停滞期に入った（図３Ｂ １白丸参照）。３７℃で３０分のインキュベーションに続き、反応を５５℃にソ フトすると、切断活性は再開しく図３Ａ及び３Ｂ、黒ぬり丸参照）、酵素が３７ ℃でのインキュベーションの間に不活性化されなかったことを示す。３７℃３０ 分後、自由（ｆｒｅｅ）酵素の添加は付加切断となり、これは基質が依然利用可 能な形であることを示す。５５℃での酵素のプレインキュベーション又はＭｇ２ ４の添加に先だつ、加熱による酵素の変性は、３７℃で活性増加とはならなかっ た。

好ましい基質標的サイズは、提案された切断部位二本鎖と一致した。提案された 切断部位二本鎖（幹工）が基質結合に寄与しうる程度を評価するため、基質サイ ズを変えることの効果を試験した。ＤＨ５Ｉを３２ｐで５′末端標識化し、ゲル 精製し、次いで部分加水分解に付し、末端標識断片のはしご（ｌａｄｄｅｒ）を 産生じ、配列決定ゲル上に示した。ｌＱｍＭ　Ｍｇ”中、末端標識断片と過剰の ＡＤＣＩとの混合物のインキュベーションの結果、１Ｑｎｔ又はそれより長い断 片の切断となり（図４Ａ、レーン９及び１０参照）、切断部位に対し３′側で少 なくとも７がこのような条件下に必要であることを示した。Ｍｇ２”濃度を５０ ｍＭに上げてもサイズ必要物を減少しなかったが、Ｍ　ｇ　２　’濃度を２ｍＭ に下げる（レーン７及び８）か、又は尿素を２Ｍ添加する（レーン１１及び１２ ）と、活性を減少させた。本実験は、速やかに切断されたこれらの基質断片を示 した。それは低レベルの小さな断片の切断を明らかにしなかった。しかしながら 、実験は酵素過剰でなされたので、短い断片がより長い断片により結合部位から 単に競合したことはありそうもなく、従ってそれは切断部位に対し３′側に要求 物のかなり正確な図を示すべきである。

切断部位に刻し５′側の要求物を同様の方法で試験した。１Ｑｎｔ長の基質、Ｄ Ｉ−Ｉ　Ｓ　２を［５”２Ｐ］　ｐＣｐで末端標識化し、分析を繰り返した（図 ４Ｂ参照）。標識基質（５’ＵＵＣＡＧＧＧＵＣＧＧｐ＊Ｃｐ、式中、ｐ★は標 識リンである）は切断部位に対し３′側に８ｎｔを含み、Ｍ　ｇ　２　”の存在 で、９ｎｔであるか又はそれより長い基質が、へＤＣＩにより切断され、Ｓｎｔ 長の標識生成物を産生じた（レーン７−９）。これらのデータは、切断部位に対 し５′側の単一ヌクレオチドが基質結合及び切断に充分であることを示す。これ は、切断部位に対し５′側の一つのヌクレオチドが自己切断に充分であることを 示し、たゲノム自己切断配列の知見と一致する。

配列５′ＮＡＧＧＧＵＣＧＧ、式中、ＮはリボＣ，Ｕ、Ａ、Ｇ又はデオキシＣで ある、のオクタヌクレオチドは＄２ｐで５′末端標識し、ＡＤＣＩにより切断に ついて試験した。［５′３２ｐ］ヌクレオシド５−ン酸エステル２’、　３′環 状リン酸エステルの放出を薄層クロマトグラフィによりモニターした（図５Ａ参 照）。５′ｒＣ，ｒＵ及びｒＡを伴うオリゴヌクレオチドを、試験した条件下、 同様の速度で同様の程度に切断した（図５Ｂ参照）。ｒＧを伴うオリゴヌクレオ チドは効果的に切断されず、４倍高い酵素濃度を用いても約１０倍遅かった（図 ５Ｂ参照）。

デオキシリボーズにより一１位置で切断は検出されなかった（図５Ａ参照）。

本実施例で用いたＨＤＶ指定酵素及び基質について、データは試験した条件下で 、７−８ｎｔの標的サイズを示す。データは、特異性が基質と酵素の間のワトソ ンークリック塩基対合により大きく影響されることを示す。

切断部位二本鎖（位置３と３７、及び４と３６）内の２つの位置での塩基対合に ついての証拠が示された（図１及び２）。転写反応を伴う結果は、自己切断ＲＮ Ａの等しい位置の突然変異導入法により得られたものと一致する。二本鎖の塩基 でのＧＴＪ塩基対（ＩＧ：３９Ｕ）の可能性を示唆する。各位置で自己切断活性 を低下させた変異及びワトソンークリック塩基対を産生じ得たかも知れない置換 は、完全な自己切断活性を回復しない。位置−１にＵがある、抗ゲノム配列（図 ＩＡ）又はゲノム配列について、幹■を拡げて位置−１にｎｔをそして位置４０ にＧを含む塩基対（ＣＧ又はＵＧ、図ＩＧ参照）を含むことが可能である。転写 反応からの結果は、位置−１のＧだけが実質的に切断を減じたことを示す。これ らのデータは、−１位置でのＧもおそい切断となったＲＮＡの自己切断形の突然 変異導入法から得られた結果と一致した。

転写反応を用いて切断の機構についてモデルの予言を試験した。ＨＤＶ　ＲＮＡ の自己切断は２’、　３’−環状リン酸エステル及び５′ＯＨを産生じ、切断が 隣接２′ＯＨ又はＯ−による切断部位でのリンへの攻撃を含む、エステル変換機 構により起きることを示唆する。この機構が正しいならば、その２′位置から水 酸基の除去が切断を防止するであろうことを予言する。従って２′水酸基を欠い ている基質の切断不能は、エステル交換機構について付加的証拠を提供する。

実施例２．　環状ＲＮＡ酵素 はとんど全ての短い配列のＲＮＡをインビトロで又は潜在的にインビボで環状形 に変換できる方法を以下に記載する。本技術は、特異的配列に基質ＲＮＡを切断 するよう設計される小さな環状形の酵素ＲＮＡを生成するのに有用である。基質 ＲＮＡに対する酵素の特異性は、主として標的配列との塩基対合により決定され 、それゆえ、容易に多重化できる。（インビトロでＲＮＡを切断するだめの）分 子生物学での道具としての酵素の証明された用途に加えて、そのような酵素は、 治療剤として、又は遺伝子発現を調節する手段としてアンチセンスＲＮＡ／ＤＮ Ａのいずれかを提供する。アンチセンス技術以上の重要な利点は、酵素が触媒的 に作用することである。

設計された酵素によるＲＮＡの切断はインビトロで非常に効率的であることがで きる。細胞中、標的ＲＮＡのレベルに影響を及ぼす酵素の能力は、見込みがあり そうであるが、解決すべき幾つかの障害がある。これら障害の幾つかは、（ｉ） 細胞内での酵素の導入と発現、（ム）細胞内での変性方法に対する酵素の安定化 及び（ｔｉｉ）ＲＮＡが活性コンホーメーションに折りたたむ確率を増すことで ある。

これらの障害は当業者によりある程度な（すことができるが、環状酵素はこれら の障害に対し良き解決を与える。例えば環状酵素はインビトロで合成できるか又 は大きな転写物の部分としてインビボで発現できる。しかしながら、一度切削さ れるか環に変換されると、それは発現に要する配列により又はポリアデニル化に より負担がかからず、そのいずれもＲＮＡの酵素コンホーメーノヨンへの折りた たみを妨害できる。環状形のＲＮＡは又、核外（ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｉｔｃ ）崩壊に耐性であり、従ってインビボでより長い半減期を有する。構造的見地か ら、環状ＲＮＡは折りたたみ選択に関して拘束されるようであり、従って、線状 酵素よりも効果的に活性形に折りたたむよう設計することが可能である。

以下に検討される研究において、（二次触媒的ＲＮＡを用い）環状ＲＮＡを効果 的に産生ずる技術、環状酵素の設計及び合成の検討、及びこれらの酵素の触媒活 性及び構造の特徴づけを示す。検討はインビトロ研究に焦点を合わせるが、これ らはインビボ系にも容易に拡げることができる。

基本的には、自己スプライシングＲＮＡの分子内反応は環状（Ｃ）エキソンを生 成するのに用いることができる。ＣＲＮＡの産生は、イントロン及びエキツノ配 列を配列換えすることにより生じ（エキツノ配列は実質的に何でもよい）、そオ ］により、単一エキソンは変更されているイントロンドメインの間にサンドイッ チされる（図１１参照）。得られるＲＮＡ転写物は、正常３′スプライス部位の ３′側に正常５′スプライス部位を有する。スプライシングにより、（単一）エ キソンの末端が結合し、環として放出される。スプライス部位の位置が反対にな ったので環が産生ずる。

グループＩイントロンの折りたたみ可能性を試験するため、変更イントロンの幾 つかのバージョンが作られ図１１）、（図１２に一般的に示す方法により）全て はインビトロスプライシング活性についての環状エキソン診断薬を産生ずる。環 の生成は、スプライソング反応が生じたことを示した。図１１及び１２から明ら かなように、テトラヒメナグループ！イントロン配列は、はんの少しの修飾で変 更イントロンを提供するのに使用できる。酵素配列を含むであろうエキソン部分 は、慣用の制限エンドヌクレアーゼ部位を含むよう設計されて酵素配列の導入を 促進する。新しい構造物が作られると、環状生成物の効率をモニターし条件を至 適化する。インビトロでのスプライシング活性を増強することが知られている特 異的変化を組入れて試験する。

ＨＤＶ　ＲＮＡ酵素「ハンマーヘッド」又は、自己切断ＲＮＡの「ヘアピン」モ チーフに基づく配列を合成して変更イントロンに挿入する。環状形をインビトロ で産生じ、適当な標的及びコントロール基質に対し試験できる。酵素及び標的配 列は、線状（Ｌ）形のりボザイムと作用することが既に示されているものがら適 応できる。環状に変更されたＨＤＶ酵素は活性である。一つの実施例を図９に示 す。結果は、環状ＲＮＡ酵素が活性であろうことを示す。

（正常イントロン配列に基づき）変更イントロン配列を作るために、テトラヒメ ナイントロン（４１３塩基対）及び隣接配列（〜６０塩基対）を含むＤＮＡ断片 を希釈条件下に連結して環状形の配列を産生じた。次いでこのＤＮＡを３つの制 限エンドヌクアーゼの一つで切り、イントロン配列の非必須部分に切断し、エキ ツノ配列がイントロン配列により隣接したＤＮＡの線状断片を産生じた。そのＤ ＮＡをＴ７プロモーターの下流でプラスミドにクローンし、大量のＲＮＡの生成 を促進した。この構造物の全ての３つのバージョンから生成されたＲＮＡはスプ ライシング条件下、Ｃエキソンを産生じた。

酵素配列を導入するのに適した変更イントロン配列を作るために、上記手段を少 し変える。オリゴヌクレオチドプライマーを合成し、イントロン含有断片の２つ の末端に相補の配列と共に幾つかのユニークな制限部位を含有させた。ポリメラ ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてイントロン配列及び必須エキツノ配列を増幅す る。次いで得られるＰＣＲ生成物を精製して環状化する。プラント末端ライゲー ションを用いることができるが、それは又、環状化の前に切断てきる両末端近く に共通制限部位を組み入れるのに有用である。円環は上記したように再び切断し 、Ｔ７プロモーターを含むベクターに連結し、断片の好ましい定位のための制限 エンドヌクレアーゼ消化によりミニブレツブＤＮＡスクリーンする。全イントロ ン−エキツノ配列はＰＣＲ反応により誤りが生じなかったことを保証するよう配 列決定できる。一般にエキラン／クローニング部位配列は長さ約４０塩基対であ る。

これらのプラスミドは、転写し円環に変換する断片含有配列用のクローニングベ クターとして用いる。

円環生成は、試験した各配列について至適化できる。一般に、自己スベインング は、法条様性の条件下　５〜５０ｍＭ　Ｍｇ”、３０〜５０℃、０〜２００ｍＭ −価の塩及びｐＨ７〜９で起きる。反応は低濃度の変性剤（尿素及びホルムアミ ド）を許容し、ある場合には特異性はそれらの存在により増強できる。これらの 条件を変えることの効果を試験し、至適条件を決定する。

ＲＮＡの円環は、変性条件下（７Ｍ尿素）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に より容易に測定される。一般にＣ形は、ゲルの条件（アクリルアミド濃度、架橋 の程度、イオン強度、尿素濃度、ことによると温度）を少し変え、異常な可動性 ノットを有するバンドを検出することによりＬ形の核酸と区別される。最初の方 法は、８％及び１２％ポリアクリルアミドを含む２つのゲルを泳動することであ る（円環のサイズは現実の至適濃度を測定するであろうが、これは約５０ｎｔの 環についてうまく働く）。別法として、試料を二次元に分析しく低１度ケル、続 いて高濃度での第二の次元）、ここで円環は対角線を泳動する。この技術は生成 物の混合物が複合物であり、円環が両セットの条件下、線状種と共移動するとい うことがなければ必要ではない。

分離された種のＲＮＡが円環であることを決定する最も簡単な方法は、それを部 分加水分解（又は酵素的ニラキング）に付し、次いでゲル系にもどし、そこでＣ 形をＬ形から分離することである。いつかニックされる環状ＲＮＡは生成物の可 動性において別個のノットを示し、これに対し線状種はより小さな断片のスミア を形成する。放射標識ＲＮＡを円環生成物のキネティクス及び程度を定量するの に用いる。ラジオメイジャーの存在しない場合、オートラジオグラフィにより示 されるバンドを、ノンチレー／ヨンカウンターで励起し、カウントする。

変更配列のイントロン部分から非必珈配列の除去は、安定な折りたたみ選択を限 定することにより適当な折りたたみを促進する。正しい折りたたみも、非必須ル ープ配列を必須幹の末端で「類ループ」と置換することにより促進される。その ようなループ配列は、幹の末端で通常の安定性よりも大きなものを与える。

最もよく特徴付けられた小さな酵素がハンマーヘッドモチーフの自己切断ＲＮＡ から誘導された。以下の記載はハンマーヘッドを基にした酵素についてであるが 、同様の作業をヘアピンを基にした酵素又はＨＤＶを基にした酵素及び関連酵素 について実施できる。基本的着想は切断される一つが基質で他方が酵素であるよ う二本鎖のＲＮＡから自己切断ＲＮＡ　（正常は、一本鎖のＲＮＡ）をまとめる ことである。

既に特徴付けられた酵素に対応する配列を含む合成二本鎖ＤＮＡ断片は、合成さ れて上記した変更イントロン構造物に挿入されて円環を産生ずる。別法として、 それらをＴ７プロモーターの下流に直接挿入してＬ−形の酵素を産生ずる。得ら れるプラスミドＤＮＡを適当な制限エンドヌクレアーゼで切断し、流出転写物を Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼによるインビトロ転写により作る。変更イントロン構 造物により、あるスプライシング、従っである円環生成は、転写反応の工程の間 に起きるであろう。しかしながら、転写に続き条件は残っているスプライスされ ない材料をスプライスするよう調整される。次いで酵素を変性条件下にポリアク リルアミドゲル電気泳動により精製する。

酵素についての基質もインビトロ転写により産生される。短いオリゴヌクレオチ ドはしばしばこれらのアッセーに用いられる。酵素のＣ及びＬ／＜−ジョンを通 常の基質ＲＮＡに対する切断活性について試験する。ＲＮＡ５の起こりうる集合 を調節するため、酵素及び基質ＲＮＡを別々にＭｇ　”　”の不存在でトリス緩 衝液（ｐＨ７５）中、９５℃で１分間加熱し、反応温度まで冷却し、ＭｇＣ１， を加え、次いで混合に先たち、その反応温度で１５分間ブレインキュベートする 。反応をＥＤＴＡ及び変性剤の添加により停止し、生成物を７Ｍ尿素を有するポ リアクリルアミドゲル上で分画する。Ｃ酵素の特異活性を、カッティングの量が Ｌ酵素を増加するに伴って増加する条件下にＬ酵素と比較する。

実施例３．　二本鎖ＲＮＡを切ること 図１０を引用して、自己切断構造での切断の部位は幹Ｉの塩基に示され、切断は Ｇ−Ｕ塩基対のＧに対し５′側で起きる。酵素の幹■の３′側を含み、又、一本 鎖ＲＮＡ基質との塩基対（幹工の５′側）にそれを要求するよりも、むしろ幹Ｉ を全く省く形の酵素が産生できる（図１０参照）。この形の酵素は三次接触によ り二本鎖と結合し、切断可能構造を形成する。

幹ｌ及び■を連結する配列のＧヌクレオチドの各での変異は完全活性のために重 要であり、従って酵素の５′末端が抗ゲノム配列の位置４０のＧ（又はゲノム配 列の相当Ｇ）で開始すべきであるか、又は少な（とも含む。幹ｍも完全活性のた めに重要であり、それゆえ酵素の３′末端は、全ての幹■及びループ■を含むべ きである。幹■は短縮され、幹■及び■は共にループにより閉じることができる 。幹■の末端のループ並びに幹■及び■を結ぶ配列は急激な変化を許容しないで あろう。それでこれらも無傷で残されるべきである。

これは、二本鎖ＲＮＡを切断するための（自己スプライシングリボザイムよりも むしろ）修飾自己切断リボザイム、例えばＨＤＶ、ノ１ンマーヘッド及びヘアピ ンの用途の最初の記載である。スゾスタム、３１１、ネイチャー８３．１９８６ は、幹Ｉを欠いている自己スベイシンダテトラヒメナイントロンのバージョンが Ｕ−Ｇ塩基対のＵに対し３′側の位置で、グアノンン依存反応で二本鎖を切断す るであろうことを記載する。これは、問題の酵素が異なる鎖を切断し、又、グア ノシンを要求しないから、本発明と異なる。又、ＨＤＶ指定酵素はずっと小さく 、従つてより有用である。

用途 本発明の酵素ＲＮＡは、治療上及びこの分野でよく認識された診断方法に有効で ある。それらの小さなサイズ及び７−８ヌクレオチドの標的配列のために、それ らの分子はインビボで特異的標的分子を切断するのに有効である。ＲＮＡは、製 薬媒体内での治療量で唐音に直接投与することを含む全ての標準的方法によって 、又はインビボでＲＮＡの生成を起こすウィルスのトランスフエクンヨンによっ てさえ、導入しつる。診断において、特殊なＲＮＡ配列を存在させることは、上 に示した実施例におけるように、及びセフ等、止揚で検討されるように容易に実 施できる。

他の実施態様は以下の請求の範囲内にある。

Ｇ　−Ｇ　ＣＡ　Ｕ　Ｃ−Ｇ　ＩＩ Ｕ−Ａ −Ｇ Ｃ−Ｇ　７０ −Ｃ ＾　Ａ −Ｃ −Ｃ −Ｕ Ｇ Ｃ △　Ｕ前 −Ａ −Ｇ −Ｇ７０ −Ｃ ＾　＾ −Ｃ −Ｃ −ＬＩ Ｇ Ｃ ・−３゛ 時間（分） △ 二　；：’　３　４　５　０　７　８　９　１０１１１２−・−−一−・・６８ 　Ｇ す００．―−Ｏ・・・Ｇ −・・ＯＯ・・・・・　Ｇ −０−・−・・０・　Ｕ Ｆ７Ｇ、　４θ 鴫　、−−１一番　ψ　Ｇ 嘲診−・　４に＃＃ｌ−０Ｇ 鴫）・・　−・　◆　−一　−一　Ｕ ３．令奉肴　・　ＧＦ）（４）　３’ Ｆ／Ｇ、　４ｂ フロノー・ 圧５Ｕ 時間（分） ５’ｐｐｐＧＧＧＣＡＵ　ＣＡＡＧＣυ３′−Ｇ −Ｃ −Ｕ Ａ −Ｃ −Ｃ −Ｕ Ｇ 八６０ １　１１−Ａ　Ｉ 環状ＲＮ　Ａ 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成６年７月　１３場

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. １．切断部位の３′側でのみＲＮＡ基質と塩基対合するＲＮＡ基質結合部分、及 び、 該ＲＮＡ基質結合部分の一部又は全てを含みうる、該酵素活性を有する酵素部分 、 を含み、 該核酸分子は切断部位３′側でのみＲＮＡ基質と塩基対合し、且つ切断部位で該 ＲＮＡ基質の切断を生じうる、切断部位で分離ＲＮＡ基質を切断するＲＮＡ基質 切断酵素活性を有する核酸分子。
2. ２．ＲＮＡ基質を、核酸分子か切断部位で該ＲＮＡ基質の切断を生ずる条件下、 切断部位で分離ＲＮＡ基質を切断するＲＮＡ基質切断酵素活性を有する核酸分子 と接解させる段階を含み、該核酸分子は、切断部位の３′側でのみＲＮＡ基質と 塩基対合するＲＮＡ基質結合部分、及び該ＲＮＡ基質結合部分の一部又は全てを 含みうる、該核酸分子が切断部位の３′側でのみＲＮＡ基質と塩基対合し、切断 部位で該ＲＮＡ基質の切断を生じうる、酵素活性を有する酵素部分を含む、切断 部位の３′側でのみ核酸分子と塩基対合することによる切断部位でのＲＮＡ基質 の切断方法。
3. ３．切断部分の３′又は５′側でのみ塩基対合し、切断部分の３′及び５′側の 両方では塩基対合しないＲＮＡ基質結合部分、及び該ＲＮＡ基質結合部分の一部 又は全てを含みうる、酵素活性を有する酵素部分、 を含み、 核酸分子が切断部位の３′又は５′側でのみＲＮＡ基質と塩基対合し、且つ隣接 ２′水酸基により切断部位で該ＲＮＡ基質の切断を生じうる、切断部位で分離Ｒ ＮＡ基質を切断するＲＮＡ基質切断酵素活性を有する核酸分子。
4. ４．該核酸分子がＤ型肝炎ウイルスから誘導される、請求項１又は３の核酸分子 。
5. ５．該核酸分子が配列ＧＮＮＮＮＮＮ、式中、各Ｎは独立してヌクレオチド塩基 である、に対し５′側で切断する酵素的に活性である、請求項１又は３の核酸分 子。
6. ６．該核酸分子が、切断部位に隣接して塩基対合する少なくとも一つのリボヌク レオチドを含む、請求項１又は３の核酸分子。
7. ７．該核酸分子がＲＮＡである、請求項１又は３の核酸分子。
8. ８．該核酸分子が７又は８ヌクレオチドから成る標的ヌクレオチド配列と塩基対 合する、請求項１又は３の核酸分子。
9. ９．該核酸分子が環状である、請求項１又は３の核酸分子。
10. １０．該核酸分子が単一ＧＵ塩基対、続く６ワトソン−クリック塩基対を有する ＲＮＡ二本鎖を切る、請求項１又は３の核酸分子。
11. １１．該核酸分子がＤ型肝炎ウイルスから誘導される、請求項２の方法。
12. １２．該核酸分子が配列ＧＮＮＮＮＮＮ、式中、各Ｎは独立してヌクレオチド塩 基である、に対し５′側で切断する酵素的に活性である、請求項２の方法。
13. １３．該核酸分子が、切断部位に隣接して塩基対合する少なくとも一つのリボヌ クレオチドを含む、請求項２の方法。
14. １４．該核酸分子がＲＮＡである、請求項２の方法。
15. １５．該核酸分子が７又は８ヌクレオチドから成る標的ヌクレオチド配列と塩基 対合する、請求項２の方法。
16. １６．該核酸分子が環状である、請求項２の方法。
17. １７．該核酸分子が単一ＧＵ塩基対、続く６ワトソン−クリック塩基対を有する ＲＮＡ二本鎖を切る、請求項２の方法。
18. １８．ＲＮＡ二本鎖と反応し、且つＧＵ塩基対のＧの５′側で該ＲＮＡ二本鎖を 切断しうる酵素部分、 を含む切断部位で二本鎖ＲＮＡ基質を切断するＲＮＡ基質切断酵素活性を有する 核酸分子。
19. １９．該ＲＮＡ二本鎖が構造 ＧＮＮＮＮＮＮ ＵＮＮＮＮＮＮ （式中、各Ｎは独立してヌクレオチド塩基である）を有する、請求項１８の核酸 分子。
20. ２０．ＲＮＡ二本鎖を、切断部位で該二本鎖ＲＮＡ基質を切断するＲＮＡ切断酵 素活性を有する核酸分子と接触させる段階を含み、該核酸分子が該酵素活性を有 する酵素的部分を含み、該核酸分子がＧＵ塩基対のＧの５′側で側基質を切断し うる、 構造 ＧＮＮＮＮＮＮ ＵＮＮＮＮＮＮ （式中、各Ｎは独立してヌクレオチド塩基である）を有するＲＮＡ二本鎖を切断 する方法。
21. ２１．切断部位で分離ＲＮＡ基質を切断する酵素活性を有する、環状核酸分子。
22. ２２．自己切断及び自己結合に適した条件下、環状分子を形成するであろうＲＮ Ａを含む分子内自己切断及び自己結合ＲＮＡ分子をインキュベートし、該環状分 子を産生する段階を含む、 酵素活性を有する環状核酸分子形成方法。
23. ２３．該自己切断及び自己結合核酸がグループＩイントロンから誘導される、請 求項２２の方法。
24. ２４．該自己切断及び自己結合核酸がグループＩＩイントロンから誘導される、 請求項２２の方法。
25. ２５．該自己切断及び自己結合核酸が自己切断ではないがインビボで細胞因子に より切断し、結合するプレメッセンジャーＲＮＡイントロンから誘導される、請 求項２２の方法。