JPH07502642A - 新規な形態のリポ糖結合性タンパク質（ｌｂｐ） - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 なう態のりボ　Δ　ンパク　ＬＢＰ 皮直立互 本発明は、免疫系を刺激するのに有用な医薬品に関する。

より特定すれば、本発明は、新規な形態のリボＭ　（Ｉ　１ｐｏｓａｃｃｈａｒ ｉｄｅ）結合性タンパク質（ＬＢＰ）に関する。

１１技亘 リボ多糖（ＬＰＳ）は、グラム陰性細菌細胞壁の糖タンパク質成分であり、これ らの細菌による感染の病因の活性部分である。

ＬＰＳは、明らかに細菌に対する免疫応答のために不可欠であり、またこのよう な感染の急性作用（例えば、敗血症性ショック）に関連する。しかし、その作用 を及ぼすために、ＬＰＳは、明らかに多数の体内に存在する（ｉｎｃＨｇｅｎｏ ｕｓ）タンパク質に結合する。

哺乳動物において、散在しているリボ多糖のような極性脂質に結合し、その作用 を仲介する多数のタンパク質が記載されている。これらの分子の多（は、単離さ れて詳細に研究されており、機能および構造において類似していることが知られ る。これらのタンパク質は、考えられる共通の進化起源を有する１つの遺伝子フ ァミリーによりコードされていると考えられ得ることか、示唆されている。この ようなタンパク質の１つであるコレステロールエステル移動タンパクｆｆ１（Ｃ ＥＴＰ）は、コレステロールエステル、およびリポタンパク質に関連した他の複 合脂質に結合し、それらのＨＤＬとＶＬＤＬとの間の移動（ｔｒａｎｓｆｅｒ） を仲介する。別のタンパク質、殺菌性の透過性増強タンパク質（ＢＰＩ）は、元 来、天然に存在する宿主の抗菌因子として単離されていた。後に、ＢＰＩは、細 菌細胞壁から遊離したＬＰＳに結合すること、およびその生物学的作用の多くを 中和するようであることが示された（Ｍａｒｒａ、　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　（１ ９９０）出：６６２−６６６）。

３番目のタンパク質、リボ多糖結合性タンパク質（ＬＢＰ）もまたＬＰＳに結合 するが、これは、分子複合体と、特異的な単球細胞表面レセフリーとの直接的な （目互作用によりサイトカイン放出を引き起こし、その生物学的作用を仲介し得 る。従って、ＬＢＰとＬＰＳとの複合体は、マクロファージおよび好中球の活性 化、および以下に示すようなサイトカインの放出を仲介すると言われている。こ のサイトカインは、例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦン、インターロイキン−１（ ＩＬ−１＞、およびインターロイキン−５（ＩＬ−６＞である。例えば、Ｓｃｈ ｕｍａｎｎら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９９０）　１４９：１４２９−１４３１； 　Ｗｒｉｇｈｔ、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９９０＞　２４９：１４３１−１４３３ を参照のこと。

ＣＥＴＰ、　ＢＰＩ、およびＬＢＰは全て、８著な相同性を示しており、そして ＢＰＩとｌｌ３Ｐとの間の相同性は、特に顕著であった。ＢＰＩおよびＬＢＰは 両方とも、脂質結合に対して反応性であると思われる約２５ｋｄの正に荷電した アミン末端ドメインと、膜および／またはレセフリーとの相互作用を仲介し得る 約３０ｋｄの疎水性カルボキン末端ドメインとを含む。

既知の形態のＬＢＰ　（ＬＢＰ−α）は、肝臓で合成され、正常なヒト血清中に ０．５μｇ／ｎ＋１未満の濃度で存在する。このレベルは、免疫応答の銹起から ２４時間後に５０μｇ／ｍｌにまで増加する。既知のＬＢＰ形態は約６０ｋｄの 分子量を有しており、このうち約１０ｋｄは付加されたグリコジル残基を表す。

ＬＢＰは、ＬＰＳのリピドＡ部分に結合することが示されており、この結合は、 おそらくＬＢＰのアミン末端部分が関連している。ＬＰＳのリピドＡ部分は、シ ョックを誘発するのに不可欠であると考えられる。ＬＯＰはまた、無傷グラム陰 性細菌のようなＬＰＳ生産粒子をオプソニン化し、その被覆された粒子がマクロ ファージへ付着することを仲介する。この結合は、特異的な細胞性レセプター、 ＣＤ１４によって生じると思われる。ＣＤ１４は、遊離の状態で細胞膜平面内を 移動し得る（Ｗｒｉｇｈｔら　（上記））。従って、ＬＢＰが、感染に対する炎 症反応において重要な役割をなすことが明らかである。

Ｓｃｈｕｍａｎｎら　（上記）は、ヒトおよびウサギのＬＢＰのアミノ酸配列お よびコード化ｃＤＮＡを開示している。本発明は、まだ記載されていない新規な 形態のＬＢＰ　（ＬＢＰ−β）を提供する。

ｌ咀旦皿丞 本発明は、免疫系を活性化するのに有用な新規な形態のＬＢＰを提供する。本発 明の新規なＬＢＰ　（本明細書中では、ＬＢＰ−βと称する）は、免疫系を刺激 することで知られるリボ糖結合性タンパク質のレパートリ−に加えられる。この 別の形態のＬＢＰを用いることにより、免疫機能を高めるために設計された治療 プロトコルの微細な調整が可能になる。

従って、１つの局面では、本発明は、精製され単離された形態の免疫刺激タンパ ク質ＬＢＰ−βに関する。他の局面では、本発明は、このタンパク質を提供する のに有用な組換え材料および方法に関する。さらに別の局面では、本発明は、本 発明のＬＢＰ−βを用いる免疫系を刺激する方法、この方法に有用な薬学的組成 物、およびＬＢＦ−βに反応する抗体に関する。

図１は、ＬＢＰ−αおよびＬＢＰ−βのアミノ酸配列およびそれらをフードする 核酸の比較を示す。

図２は、ＬＢＰ−βのアミノ酸配列およびそれをコードするｃＤＮＡを示す。

図３は、ＬＢＰ−βのクローニングにおけるＰＣＨに用いられた２つのアンブリ マー（ａｍｐｌｉａｅｒ）の構造を示す。

図４は、ウサギＬＢＰ、ヒ）ＢＰＩ、既に開示されている形態のヒ）　ＬＢＰ　 （ＬＢＰ−ａ　）、およびヒトＬＢＰ−β１７）　２４０〜２５０位のアミノ酸 配列の比較を示す。示されている番号付けは、Ｓｃｈｕｍａｎｉら（上記）の図 １を参照する。

ｌを　る≦ 本発明のＬＢＰ−βは、既に開示されているヒ）ＬＢＰ−αと比較して、ヒトＢ ＰＩとウサギＬＢＰとの両方に対して相同性が高いことが示される。ＬＢＰ−β は、ＬＢＰ−αに対して７個のアミノ酸が置換されている（図１を参照のこと） 。さらに、より重大なことには、本発明のＬＢＰ−βは、カルボキン末端領域に 、ヒトＢＰＩおよびウサギＬＢＰにおいて同様の残基に相当する付加的な４個の アミノ酸を含む。この配列は、５ｃｈｕａ＋ａｎｎのＬＢＰ−αでは開示されて いない。４個の付加アミノ酸は、分子の３次構造において深遠な効果を有し得る 。

このアミノ酸の付加４分子、すなわち配列Ｍｅｔ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−ＰｒＯは、 ウサギＬＢＰのＭｅｔ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ相同配列、およびヒトＢＰＩの Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ配列に相当する。従って、ＬＢＰ−βにみられ る４分子は、このタンパク質に独特である。ヒトＢＰ　Ｉ、既に開示されている ヒ）　ＬＢＰ、ウサギＬＢＰ、および本発明のＬＢＰ−βの２４０〜２５０位の 残基の比較を、図４に示す。

本発明の新規なＬＢＰ−βは、組換え技術により、最も好都合に生産され得る。

完全アミノ酸配列およびこの配列をコードするｃＤＮＡは、本明細書中に開示さ れており、これらを図２に示す。

図２に示したアミノ酸配列は、開裂して成熟型を得ることのできる前駆体タンパ ク質を示している。最初の２５個のアミノ酸（１〜２５位）により、成熟型のＬ ＢＰが分泌される。この成熟型は、２６位に示されているＡｌａ残基をＮ末端に 有する。このため、図２の番号付はシステムは、前駆体タンパク質に適切である 。成熟タンパク質の対応する位置は、示された番号から２５を引くことにより得 られる。よって、例えば、図２の２６６位に示されたバリンは、成熟型では２４ １位である。

本発明は、添付の図２の２６〜４８２位で示されたアミノ酸配列に対応するＬＢ Ｐ−βに関連しており、配列に対してゎずかに改変を行ったとしても活性を保持 し得ることが理解される。詳細には、１つまたはいくっがのアミノ酸がＮ末端お よび／またはＣ末端から除去されても、活性に影響を与え得ず、そして１つまた はいくつかのアミノ酸が置換されることは、置換が行われるアミノ酸残基に関し て保存的であると考えられている残基について行われても、顕著な様式で活性に 影響を与え得ない。このようなわずかなそして理解された改変により生じた分子 もまた、本発明の範囲内に含まれ、ｒ　ＬＢＰ−β」の名称の中に含まれる。さ らに、グリコジル化、リン酸化、または側鎖の化学的改変（例えば、プロリンを ヒドロキシプロリンに転換することによる）による標準的な誘導体化もまた、Ｌ ＢＰ−βと称されるタンパク質に含まれ得る。そして、これらの誘導体化は、こ れらの改変が、タンパク質の活性を刺激する免疫系を破壊しない限り、本発明の 範囲内に含まれ得る。

図２に示されたｃＤＮＡは、アミノ酸番号の２２２〜２２３位に故意に作製され たＣｌａｌ部位を除いて、以下の説明中に記載のように回収されたｃＤＮＡと同 一である。このＣｌａｌ部位を加えて、カセット型で他の構築物中にスプライシ ングされるＬＢＰ−β部分を形成した。しかし、もちろん、ＬＢＰ−βのアミノ 酸配列をコードする任意のＤＮＡが、このタンパク質の生産のための適切な発現 系中に含まれ得る。コード化ＤＮＡは、天然ｃＤＮＡを回収することにより、必 要に応じてその同義性の（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）改変物を提供することにより 調製され得るか、または従来の固相オリゴヌクレオチド合成法により部分的ある いは完全に合成され得る。４８２個のアミノ酸のＬＢＰ−β前駆体タンパク質ま たは４５７個のアミノ酸の成熟タンパク質をコードするのに十分な長さのＤＮＡ の構築は、容易に利用可能であって、当該分野において知られる方法によって行 われ得る。

本発明のＬＢＰ−βをコードするＤＮＡは、制御配列が適合する宿主細胞におい て、コーディングＤＮＡの発現を行う制御系に連結される。従って、制御配列の 選択は、生産宿主細胞の性質による。発現系の構築、宿主細胞の形質転換、およ び形質転換細胞の培養のための方法は、現在十分に確立された手法である。種々 の発現系７組換え宿主が用いられ得る。原核生物発現では、通常、Ｅ、　ｃｏｌ ｉ宿主が有用であり、ｔｒｐプロモーターまたはＰＬプロモーターのような調節 可能なプロモーターを含む種々の制御配列が十分に確立されている。組換えタン パク質の生産に有用な真核系は、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、そ してより最近では、無傷植物および多細胞生物を含む。成熟タンパク質として本 発明のＬＢＰ−βを提供するように、発現系を構築し得る。あるいは、組換え宿 主細胞（天然配列を含む）からＬＢＰ−βを分泌する、または融合タンパク質と してＬＢＰ−βを提供するペプチド配列をコードする上流ＤＮＡに、コード化Ｄ ＮＡを連結し得る。このような発現系の設計における変型もまた、当該分野では 周知である。

本発明のＬＢＰ−βはまた、ＬＢＰ−βまたは関連のタンパク質を検出するため に、イムノアッセイシステムにおいて有用な抗体を提供するのに用いられ得る。

特に、既に開示されているヒトＬＢＰからＬＢＰ−βを区別する、このＬＢＰ− βの新規部分に関連したエピトープを認識する抗体が、このために有用である。

このエピトープに関して特異的に、ＬＢＰ−βの成熟型のアミノ酸２４１〜２４ ５位（図２の前駆体ペプチドの２６６〜２７０位として示される）を含む部分を 含むペプチドフラグメントで免疫感作することにより、抗体が調製され得る。こ のようなフラグメントは、示された５個のアミノ酸からなる配列と同程度の長さ であり得るか、またはＬＢＰ−βに由来する付加的なアミノ酸残基を含み得る。

ペプチドが短い場合、免疫原性を高めるために、担体との結合が必要とされ得る 。

本発明の抗体は、適切な哺乳動物被験体に繰り返し投与し、血清中の抗体力価を モニターすることによる、標準的な免疫感作プロトコルにより調製される。ポリ クローナル抗血清を回収し、それ自体を用い得るか、またはモノクローナル抗体 を、感作動物の末梢血リンパ球または肺臓がら、標準的な細胞不死化およびスク リーニング法を用いて調製し得る。周知のように、この抗体の免疫反応性フラグ メントは、多くの７７セイ、およびこの抗体が有用とされる他の適用において有 益に用いられ得る。

本発明のＬＢＰ−βは、免疫系を刺激するのに有用であり、従って、治療の用途 のための薬学的組成物に処方され得る。投与に適した標準的な製剤は、例えば、 ｋ１譚山ｒｎ’ｓＰ堰１ｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　ＳｃｉｅｎｃｅｓｌＭａｃｋ 　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、、　Ｅａｓｔｏｎ、　ＰＡ　（最新版）中に見 い出され得る。ＬＢＰ−βのようなタンパク質の投与には、注射による投与が、 一般的に好ましい。そして注射のための適切な製剤には、例えば、ハンクス液、 リンガ−液、生理的塩類溶液などが含まれる。ＬＢＰ−βはまた、経粘膜または 経皮製剤によっても投与され得る。一般的に、経粘膜製剤は、デタージェントま たは他の界面活性剤および胆汁酸塩またはフシジン酸を含み、膜の変化を高めて いる。必要とされる投与レベルは、既に開示されている形態のＬＢＰと同程度で あるか、特定の被験体および症状に対して適切な投与量の決定は、投与形態、被 験体の性質、症状の発病度、および診療する医師の判断による。

以下の実施例は、説明のために含まれており、本発明を制限するものではない。

支立史上 ＬＢＰ−をコード　るｃＤＮＡのロ ス１は、Ｓｃｈｕｍａｎｎら　（１９９０）　（上記）により記載のＬＢＰをコ ードするｃＤＮＡの、上流および下流の領域に相補性であるように設計された、 アンブリマーのオリゴヌクレオチド配列を示す。

図３に示されるように、このオリゴヌクレオチドはまた、ＬＢＰコーディング領 域の外部および内部の両方に、制限部位Ｎｈｅシ １、　Ｃ１ａＬ　およびＸｈｏｌを含んでいた。図３に示されたアンブリマーは 、ヒト肝ＲＮＡ由来の市販のｃＤＮＡ調製物から、ＬＢＰコード化ＤＮＡを増幅 するのに用いた。この増幅は、標準的な酵素媒介ＰＣＲ法を利用した。

増幅産物を、対応する制限酵素Ｎｈｅｌ、　Ｃ１ａｌ、およびＸｈｏｌで消化し 、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により単離した。

消化したｃＤＮＡフラグメントを、市販の哺乳動物発現ベクターであるｐＭａｍ Ｎｅｏに連結し、Ｅ、　ｃｏｌｉ中にクローニングした。得られたクローンから のＤＮＡをゲル電気泳動により分析し、配列決定した。

得られた配列を図２に示す。この配列は、Ｓｃｈｕｍａｎｎら　（上記）により 報告された配列に類似するが、Ｇｅｎｅｂａｎｋ配列３５５３３の塩基８２６の 後から始まるコーディング領域内に、１２個のヌクレオチドからなる付加的な配 列を含んでいた。この配列は、図２の８２４〜８３５位として示されている。

ＦＩＧＬＪＲＥ　４ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３５／７４ 　Ｚ　７４３１−４ＣＣＯ７Ｋ　１４／４７　８３１８−４ＨＣ１２Ｎ　１／２ １　７２３６−４８ １５１０９　ＺＮＡ ＧＯＩＮ　３３１５３　Ｖ　８３１０−２Ｊ／／Ａ６１Ｋ　３９／３９５　Ｄ　 ９２８４−４ＣＧＯＩＮ　３３１５６９　Ｆ　９０１５−２Ｊ（Ｃ１２Ｎ　１／ ２１ Ｃ１２Ｒ１：１９） Ｉ

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．精製され単離された形態のタンパク質であって、図２の２６〜４８２位に示 される成熟ＬＢＰ−βのアミノ酸配列を含むタンパク質。
2. ２．請求項１に記載のタンパク質をコードする、精製され単離された形態の組換 えＤＮＡ。
3. ３．請求項２に記載のＤＮＡを発現し得る組換え発現系であって、前記コード化 ＤＮＡとは異種の制御配列に作動可能に連結された、前記タンパク質をコードす るＤＭを含む発現系。
4. ４．プラスミドに含まれる、請求項３に記載の発現系。
5. ５．請求項３に記載の発現系で形質転換された組換え宿主細胞。
6. ６．請求項１に記載のタンパク質の生産方法であって、前記コード化ＤＮＡの発 現が行われ得る条件下で、請求項５に記載の細胞を培養すること；および該培養 物からＬＢＰ−βタンパク質を回収することを包含する方法。
7. ７．活性成分として、請求項１に記載のタンパク質を、薬学的に受容可能な賦形 剤と組み合わせて含有する、薬学的組成物。
8. ８．被験体の免疫系を刺激する方法であって、図２の２５〜８２位に示される成 熟ＬＢＰ−βのアミノ酸配列を含む、有効星のタンパク質またはその薬学的組成 物を、該刺激を必要とする被験体に投与することを包含する方法。
9. ９．ＬＢＰ−βと特異的に反応する抗体またはその免疫反応性フラグメント発明 の詳細な説明