JPH07502490A

JPH07502490A - 殺菌性／透過性増大タンパク質および脂質担体を含有する組成物、その製造方法、およびそれらの使用

Info

Publication number: JPH07502490A
Application number: JP5506407A
Authority: JP
Inventors: マラ、マリアン・エヌ; スコット、ランダル・ダブリュ; スネイブル、ジェイムズ・エル; ワイルド、クレイグ・ジー
Original assignee: インサイト・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド
Priority date: 1991-09-27
Filing date: 1992-09-28
Publication date: 1995-03-16
Also published as: EP0610445A4; WO1993005797A1; CA2119262A1; US5234912A; AU664206B2; CA2119262C; EP0610445B1; AU2699792A; DE69327516D1; DE69327516T2; EP0610445A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】殺菌性／透過性増大タンパク質および脂質担体を含有する組成物、その製造方法、およびそれらの使用発明の背景グラム陰性感染は、特に入院患者および免疫無防備状態の患者における罹患率および死亡率の主要な原因である［Ｄｕｍａ、　Ｒ，１，、Ａｍ、Ｊ、　ｏｆ　Ｍｅｄ、、　７８　（Ｓｕｐｐｌ、　６Ａ）：　１５４−１６４　（１９８５）、およびＫｒｅｇｅｒ　Ｂ、　Ｅｌ、　Ｄ、Ｅ、　ＣｒａｖｅｎおよびＷ、ＲｌＭｃＣａｂｅ。

Ａｍ、Ｊ、Ｍｅｄ、、　６８：　３４４−３５５　（１９８０）　］　。利用可能な抗生物質が一般に感染の封じ込めにａ効であるとしても、それらはリポ多糖（ＬＰＳ）に関連する病理生理学的作用を中和するために何かをなすことはない。

ＬＰＳ、すなわち内毒素は、グラム陰性菌の外膜の主要成分であり、この微生物が溶菌したときに放出される［Ａｈｅｎｃｐ、　Ｊ、　Ｌ、およびに、Ａ、Ｍｏｒｇａｎ、　Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、、　１５０　Ｄ）：　３８０−３８８　（１９８４）　］。

抗生物質療法の最中に放出されるＬＰＳは、炎症応答の潜在的な刺激要因である。イン・ビボにおけるＬＰＳの多くの有害作用は、炎症細胞によって放出される可溶性伝達物質に起因する［Ｍｏｒｒｉｓｏｎ　Ｄ、　Ｃ，およびＲｌＪ、　Ｕｌｅｖｉｃｈ、　Ａｍ、　Ｊ。

Ｐａ１ｈｏ１．、９３　（２）：　５２７−６１７　（１９７８）　］　、　ＬＰＳは、最終的には播種性器管内凝固（Ｄ　Ｉ　Ｃ）　、成人呼吸窮迫症候Ｒ（ＡＲＤＳ）、心臓機能障害、臓器不全（ｏｒｇａｎ　ｆａｉｌｕｒｅ　）　、肝不全（ヘパトビリアリ（ｈｅｐａｌｏｂｉｌｉａｒｙ　）機能障害）、脳不全（ｂｒａｉｎ　１ａｉｌｕｒｅ　）　（ＣＮＳ機能障害）、腎不全、多臓器不全（ｍｕｌｔｉ−ｏｒｇａｎ　ｆｘｉｌｕｒｅ）およびシ３　ツクを招き得る、宿主炎症細胞による伝達物質の放出を誘発する。

可溶性ＬＰＳは、好中球の走化性の減少、粘着性の増加、カル生成の上昇、補体に対する表面受容体の調節向上（ｕｐｒｒｇｕｌａｊｉｏｎ）　、および周囲の媒体への顆粒タンパク質の放出を引き起こす［Ｍｏ＋ｒｉｓｏｎおよび旧ｅｖｉｃｈ　（１９７８）　］。

特定の、およびアズール親和性の両区画はＬＰＳに応答して脱顆粒する［Ｂａｎｎａｔｙｎｔ、　Ｒ，Ｍ、、　Ｎ、Ｍ、　Ｈａｒｎｅｔｔ、　Ｋ、Ｙ、ＬｅｅおよびＷ、Ｄ、Ｒｉｇｇｅｒ、　１．　ＩｎｆｒｃＬ　Ｄｉｓ、、　１５６　（４）：　４６９−４７４（１９７７）］。ＬＰＳに応じて放出されたアズール親和性タンパク質は、宿主にとって信書でもあり、有益でもあり得る。好中球エラスターゼは、凝固カスケード抑制の要因であるプロテアーゼ阻害剤の脱顆粒を引き起こす。これは、内毒素血症の潜在的に致命的な結末である播種性血管向凝固のような凝固障害を招く。アズール親和性顆粒はまた、ミエロペルオキシダーゼのような殺菌性分子および天然ＢＰＩタンパク質を何している。

内毒素血症は、血中における内毒素、すなわち熱安定細菌性毒素の存在に関与する状態である。内毒素は、感染に立ち向かう上で有益な炎症応答を誘発するが、無制御の場合には宿主にダメージを与える。内毒素血症は、肝臓の内毒素結合タンパク質の産生を誘発し、白血球からの殺菌性タンパク質の放出を引き起こす。

種々の研究が、従来イン・ビトロにおけるそれらの殺菌活性のみが知られているこれらの白血球タンパク質の１つ、すなわちＢＰＩタンパク質が、イン・ビトロにおいて好中球および単球を刺激する内毒素の能力を阻害し、イン・ビボで与えられた場合に、内毒素もしくは細菌性抗原投与による死を減少させることを示している。

単球および好中性顆粒球は、細菌感染に対する宿主防御において鍵となる役割を果たすと同時に内毒素血症の病理にも関与している。これらの細胞は、細胞内的に微生物を摂食しかつ殺すと同時に、殺菌、タンパク分解、オプソニン、発熱、補体活性および組織損傷作用を有する可溶性タンパク質を放出することによって、イン・ビボおよびイン・ビトロにおいて内毒素に応答もする。

内毒素に刺激された単球によって放出されるサイトカインである腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は、インφビボにおいて、内毒素の毒性作用のいくつかを模倣する。動物へのＴＮＦの注入は、発熱、ショックおよびグルコース代謝の改変を引き起こす。ＴＮＦはまた、好中球の潜在的な刺激因子である。

ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＩＬ−８のような他のサイトカインもまた、ＬＰＳの病態生理学的作用の幾つかに介在する。

抗生物質療法の改善にもかかわらず、内毒素血症に関わる罹患率および死亡率は高いままである。抗生物質それ自体はＬＰＳの毒性作用の中和には有効ではない。したがって、直接的な内毒素中和活性を有する治療の必要性が生じている。

内毒素血症の現在の治療方法では、抗生物質と支援ケアとが用いられている。利用可能な補助療法のほとんどが、低血圧または発熱のような内毒基のショック症状を治療するが、内毒素を不活性にはしない。他の療法は、ＬＰＳに対する炎症宿主応答を阻害する。以下に示すように、現在の療法は、毒性、免疫原性、または動物モデルどヒトでの試験との間の効能の非再現性により大きな制限がある。

ポリミキシンＢ　（ＰＭＢ）は、最も毒性が高く、生物学的に活性な成分であるリピッドＡに結合し、構造的に破壊することが示されている塩基性ポリペプチド抗生物質である。

ＰＭＢは、イン・ビトロにおける内毒素の好中性顆粒球放出活性化を阻害することか示されており、ヒトにおけるグラム陰性感染に対する潜在的な治療である。

しかしながら、その全身毒性のために、この薬剤は局所製剤としてを除いてその使用に制限かある。

抗生物質および高−回投与量のメチルプレドニゾロンコハク酸ナトリウム（ＭＰＳＳ）を用いるコンビネーション療法は、イヌを用いたグラム陰性敗血症の実験モデルにおいて死を妨げることが示されている。全身性敗血症の臨床的な徴候を示す２２３名の患者の多中心（ｍｕｌｌｉｃｅｎｌｅ＋　）　、二重盲検、プラセポ対照の臨床研究における、ＭＰＳＳを抗生物質と共に用いる他の研究は、治療群とブラセボ群とでは死亡率に大差はないと結論付けた。さらに、この研究音速は、１４日以内の二次感染の消散は、プラセボ群が有意に高いことを見出した。

内毒素血症の治療に対する比較的新しい試みは、内毒素中和抗体を用いる受動免疫である。Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｊ５に対する高度免疫ヒト免疫グロブリンは、グラム陰性菌血症およびショックを有する患者の死亡率を５０％減少させることが見出されている。他のグループは、マウス、キメラ、およびヒトモノクローナル抗体を用いた動物モデルにおいて有望な結果を見出している。モノクローナル抗体は超免疫血清に対する利点、例えばより一貫した薬剤効力およびヒト病原体の伝播減少を有するものの、ＬＰＳを中和するための免疫グロブリンの投与に関連する依然として多くの問題を抱えている。免疫グロブリンそれ自身に対する宿主の応答は、過敏症を招く可能性がある。補体活性化および免疫複合体の沈着に続く組織の損傷は、敗血症患者において坑内毒素抗体を含む治療を用いる上での他の関心事である。

ＢＰＩタンパク質は、１９７５年に最初に発見された好中性顆粒球タンパク質である［Ｗｅｉｓｓ、Ｊ、、　Ｒ，Ｃ，Ｆｒａｎｓｏｎ、　Ｓ、Ｂｃｃｈｅｒｄ山、　ＬＳｃｈｍｅｉｄｌ＊ｒ、およびＰ、　Ｅｌｓｂａｃｈ、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖ！ｓ１．、　５５：３３　（１９７５）　］　。５７ｋＤタンパクであるＢＰＩタンパク質は、１９７８年にヒト好中球から高度に精製された形で得られ、イン・ビトロにおけるリン酸緩衝生理食塩水中でアッセイした際に、膜透過性を増大させ、グラム陰性細菌に対する殺菌活性を有することが示された［Ｗｅｉｓｓ、Ｊ、ら、Ｊ、Ｒｉｏｔ。

Ｃｌｕｍ、、２５３　（８）：　２６６４−２６７２　（１９７８）　３゜Ｗｓｉｓｓう［Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５４　（２１）：　１１０１０−１１０１４　（１９７９）　］は、さらにＢＰＩタンパク質がホスホリパーゼＡ２活性を増大させることを見出しており、これはＢＰＩタンパク質に、そのイン・ビトロにおける殺菌活性に加えて前炎症活性を示唆するものである。

ウサギＢＰＩタンパク質が１９７９年に精製され（ＥＩＢｂａｃｈら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５４　（２］）：　１１０００−１１００９］　、その上、ヒト由来のＢＰＩタンパク質と同様の殺菌および透過性増大能を有することが見出され、さらなる研究材料の源を提供している。ウサギおよびヒト由来の両ＢＰＩタンパク質は、イン・ビトロにおいて、Ｋｌ−莢膜内包（Ｋｌ−ｅｎｃｉｐｓｕｌａｊｅｄ　）　Ｅ、　ｃｏｌｉを含む種々のグラム陰性菌に対して有効であることが見出された［Ｗｅｉｓｓ　ら、１ｎｌｅｃｌｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎ目ｙ　３８　（３）：　１１４９−１１５３．　（＋９８２）　］。

イン・ビトロでのＢＰＩタンパク質の殺菌作用におけるリポ多糖の役割が、１９８４年にＷｅｉｓｓらによって提唱された［１゜Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３２　（６）＋　３１０９−３１１５．　（１９８４）］　。これらの研究者たちは、ＢＰＩタンパク質がグラム陰性菌の外膜に結合し、ＬＰＳの細胞外放出を引き起こし、かつＬＰＳ生合成を選択的に刺激することを示した。

１９８４年に、ヒト好中球からＢＰＩタンパク質と類似の特性を有するタンパク質が単離され、カチオン性抗菌タンパク質５７　（ＣＡＰ５７）と命名された［５ｈａｆｅｒ、Ｗ、Ｍ、、Ｃ，Ｅ、ＭａｒｊｉｎおよびＪ、ＬＳｐｉｔｚｎａｇｅｌ、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、、　４５：２９　（１９８４）　］。

このタンパク質は、Ｎ−末端アミノ酸配列、アミノ酸組成、分子量および源による決定ではＢＰＩタンパク質と同一であった［Ｓｐｍｎａｇｅｆら、Ｂｌｏｏｄ　７６：８２５−８３４．　１９９０１　。を也のグループ、ＢｏｖｄｅおよびＧｒａｙは、１９８６年に、ＢＰＩタンパク質と仮想的に同一の特性を有する殺菌性糖タンパク質を報告した［ＢｏｖｄｅおよびＧｒａｙ、Ｉｎ１ｅｃｌｉｏｎ　ａｎｄ　１ｍｍｕｎ目ｙ５４（１）：１４２−１４８　（１９８６）］。

１９８５年に、Ｏｏｌ　らは、好中球プロテアーゼで開裂した後であっても、ＢＰＩタンパク質はそのイン・ビトロ殺菌活性を保持することを報告した［Ｏｏ　ｉおよびＥｌｓｂａｃｈ、　Ｃ１１ｎｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　３３　（２）：　５６７Ａ　（１９８５）］　、これは、分子の断片が活性を保持することを示唆している。ＢＰＩタンパク質の全てのイン・ビトロ殺菌活性および透過性増大活性は、このタンパク質（７）Ｎ−末端２５ｋＤ断片に存在すル［Ｏｏｉ、　Ｃ，Ｅ、、ら、１゜８ｉｏ１．　Ｃｔｕｍ、　２６２：　１４８９１　（１９８７）］。

ＢＰＩタンパク質が、細菌外膜上の内毒素に関連する構造に結合する証拠は以下の通りである。（１）ＢＰＩタンパク質の透過性増大活性に対する感受性が、平滑法と比較して粗面株のＥ、ｃｏｌｉの方が増大する［Ｗｅｉｓｓ、Ｊ、ら、１山ｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、５１：　５９４　（１９８６）］　；　（２）結果として内毒素構造を改変することになるＰｒｍ　Ａ変異か、ポリミキシンＢ　（ＰＭＢ）およびＢＰＩタンパク質の両者の結合を減少させる［Ｆａｒｌｅｙ、　Ｍ、　Ｍ。

ら、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、５６：　１５３６−１５３９　（１９８７）およびＦａｒｌｚＹする［Ｆｘｒｌｅｙ　１９８８コ　；並びに（４）　Ｂ　Ｐ　Ｉタンパク質は、アミノ酸配列相同性および免疫交叉反応性をリポ多糖結合タンパク質（Ｌ　Ｂ　Ｐ）と呼ばれる他の内毒素結合タンパク質と共有する［Ｔｏｂｉａｓら、１．　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋ｎ、２６３　（２７）：　１３４７９−１３４８１（１９８８）　］。

ＬＢＰ−ＬＰＳ複合体は単球上の細胞表面需要体（ＣＤＩ４）に結合し、これは炎症性サイトカインＴＮＦの合成および放出の増大を招（［Ｓ（ｈｕｍａｎｎら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４９　：　１４２９−１４３１　］。

このため、ＬＢＰはＬＰＳの免疫刺激活性を促進する。ＢＰＩタンパク質はＬＰＳと結合し、好中球および中球の活性化を阻害する［Ｍａｒｒａ　ら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ。１４４　：　６６２−６６６　（１９９０）　；Ｍａｒｒａおよび５ｃｏｆｆ、　ｗｏ　９０１０９１８３．　１９９０年８月２３日刊行；Ｃ，１，Ｆｉｓｈｅｒ　ら、Ｃ１ｒｃｕｌａｔｏｒｙ　５ｂｏｃｋ　３４：　１２０　（１９９１）］。

Ｇｒａｙらによって、ＢＰＩタンパク質をコードするｃ　ＤＮＡ９５０５−９５０６　（１９８９）　］。彼等は、ＢＰＩタンパク質は、開裂可であると報告した。

グラム陰性菌に結合するＢＰＩタンパク質は、本来的に、ＬＰＳ構造を破壊し、小さな疎水性分子に対する微生物透過性を変え、かつ細胞の死を引き起こすものと報告された［Ｗｅ　ｉ　ｓ　ｓら、１．９７８］。さらに最近、これらの同一著者らは、そのような作用か血清アルブミンの非存在下でのみ起こることを示している。ＢＰＩタンパク質は、血清アルブミンの存在下で培養された最近に添加された場合には殺菌活性を持たず、したがって、アルブミンが遍在するインφビボではＢＰＩタンパク質は最近を殺さないことが示唆されるＪＭａｎｎｉｏｎら、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、８５：　８５３−８６０　（１９９０）およびＭａｎｎｉｏｎら、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、　８６：　６３１６４１］　。このため、従来、当該分野においては、ＢＰＩタンパク質の有益な作用はイン・ビトロ殺菌作用に限定されると理解されてい乙。

さらに、ＢＰＩタンパク質は、Ｇｒａｙらにより、可溶形態で好中性顆粒球膜から放出される、２５ｋＤａ断片に開裂されるべき膜タンパク質として記述されている［Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

２６４　（１６）：　９５０５−９５０９　（１９８９）　］。

実際、ＢＰＩタンパク質は、ＬＰＳに結合し、イン・ビトロおよびインゆビボにおいてＬＰＳの免疫刺激活性および毒性活性を阻害するタンパク質である。したがって、ＢＰＩタンパク質を包含する殺菌性／透過性増大タンパク質は、内毒素関連障害の治療および予防処置に重要な用途を有している。

さらに、殺菌性／透過性増大タンパク質は、とりわけ、試料中のＬＰＳの検出および定墓測定のための診断手順に、および装置の生物学的試料が接触する表面の殺菌性／透過性増大タンパク質でのコーティングに重要な用途を有している。

しかしながら、従来の技術は、殺菌性／透過性増大タンパク質を可溶性、活性形態に安定に保つ十分な方法を提供していない。

この発明は、殺菌性／透過性増大タンパク質および脂質担体を含有する医薬および非医薬両組成物、並びにそれを製造する方法を提供することにより、この問題を処理する。この発明の組成物は、高濃度で安定に保存することが可能である。

この発明は、さらに、この発明の組成物の使用を提供する。

発明の要約この発明は、殺菌性／透過性増大タンパク質および脂質担体を含有し、殺菌性／透過性増大タンパク質が脂質担体に溶解している組成物を提供する。脂質担体は、リポソームまたは非イオン性界面活性剤を含んでい又もよい。

この発明はまた、この発明の組成物の製造方法であって、殺菌性／透過性増大タンパク質と脂質担体とを、殺菌性／透過性増大タンパク質が溶解するような条件下で接触させることを包含する方法を提供する。

この発明は、さらに、治療上有効な量の殺菌性／透過性増大タンパク質および薬剤学的に許容し得る脂質担体を含有し、殺菌性／透過性増大タンパク質が脂質担体中に溶解している医薬組成物を提供する。薬剤学的に許容し得る脂質担体は、リポソームまたは非イオン性界面活性剤を含んでいてもよい。

この発明は、さらに、この発明の医薬組成物の製造方法であって、治療上有効な量の殺菌性／透過性増大タンパク質と薬剤学的に許容しｉ）る脂質担体とを、殺菌性／透過性増大タンパク質が溶解するような条件下で接触させることを包含する方法を提供する。

この発明は、さらに、試事゛１中のリポ多糖の検出方法であって、試料とこの発明の組成物とを、リポ多糖−殺菌性／′透過性増人タンパク質１夏合体が形成されるよ・）な条件下で接触させ、かつリポ多糖−殺菌性／透過性増大タンパク質複合体を検出し、それにより試料中のリポ多糖を検出することを包含する方法を提供する。

この発明は、さらに、試料中のリポ多糖の世を定量的に測定する方法であって、試料とこの発明の組成物とを、リポ多糖−殺菌性／透過性増人タンパク質複合体が形成されるような条件下で接触させ、かっリポ多糖−殺菌性／透過性増大タンパク質複合体の量を定量的に測定し、それにより試料中のリポ多糖の量を定量的に測定する方法を提供する。

この発明は、さらに、殺菌性／透過性増大タンパク質が非結合リボ多糖と複合体を形成し得るように手術用具を殺菌性／透過性増大タンパク質で被覆する方法であって、この発明の医薬組成物と生物学的試料に接触することが想定された用具表面とを、含有される殺菌性／透過性増大タンパク質が用具表面に付着するような条件下で接触させることを包含する方法を提供する。

この発明は、さらに、殺菌性／透過性増大タンパク質が非結合リポ多糖と複合体を形成し得るように移植可能な侵入性装置を殺菌性／透過性増大タンパク質で被覆する方法であって、この発明の医薬組成物と生物学的試料と接触することが想定された装置表面とを、含有される殺菌性／透過性増大タンパク質が装置表面に付着するような条件下で接触させることを包含する方法を提供する。

この発明は、さらに、リポ多糖を含有する流体を、この流体を患者に投与する前に浄化する方法であって、流体とこの発明の医薬組成物とを、リポ多糖と含有される殺菌性／透過性増大タンパク質とか複合体を形成するような条件下で接触させ、かつ形成された１夏合体を流体から分離し、それにより流体を浄化することを包含する方法を提供する。

この発明は、さらに、内毒素関連ショック、内毒素関連播種住血管内凝固、内毒素関連Ｈ血、内毒素関連血小板減少症、内毒素関連成人呼吸窮迫症候群および内毒素関連腎不全からなる群より選ばれる疾患に罹患Ｉ−た患名を治療する方法であって、患者にこの発明の医薬組成物を、含有される殺菌性／透過性増大タンパク質が患者の有するリポ多糖と結合し得るにｈ゛効な量投与し、それにより患者を治療することを包含する方法を提供する。

最後に、この発明は、患者における内毒素血症を予防する方法であって、患者にこの発明の医薬組成物を、含有される殺菌性／透過性増大タンパク質が患者の何するリポ多糖と結合し得るに有効な量投与し、それにより患者における内毒素血症を予防することを包含する方法を提供する。

色素産生ＬＡＬアッセイにおけるｒＢＰ！タンパク質によるＬＰＳ活性の阻害。

Ｅ、　ｃｏｌｉ　０１１１：Ｂ４　（０−Ｉ　ＥＵ／ｍ　１）を０−１００μｇ／ｍ　Ｉ　Ｂ　Ｐ　Ｉタンパク質と一緒に３７℃で１時間ブレインキュベートした後、色素産生カブトガニアメーノく様細胞溶解質（ＬＡＬ）アッセイにおいて内毒素活性をアッセイした。データは、ｍ１当りの内毒素単位（ＥＵ）表示の内毒素に対するアッセイ値±ＳＤ（縦軸）、対ＥＵ／ｍ１表示のインキュベーション混合物に添加された内毒素量（横軸）ｐＴ７８ＰＩタンパク質プラスミド構築体の模式図。

ＢＰＩタンパク質のＣ−末端トランケーション（ｌｒｕｎｃａｌｉｏｎ）であるＢＰＩタンパク質突然変異誘発性プライマー２５ｋＤＰｒｏ　２１２　ＴＧＡのヌクレオチドおよびアミノ酸配列。

図４ＢＰＩタンパク質のＣ−末端トランケーションであるＢＰＩタンパク質突然変異誘発性プライマー３８ｋＤ　Ｐ　ｒ　ｏ　３３７ＴＧＡのヌクレオチドおよびアミノ酸配列。

図５ＢＰＩタンパク質突然変異誘発性プライマーのヌクレオチドおよびアミノ酸配列：ＢＰＩタンパク質のＣ〜末端トランケーションである好ましいＡＴＧ５’　旧ｎｄｌｌｌ。

開立ｐ３３７のタンパク配列。

図７ｐ２１２のタンパク配列。

図８ｐ　Ａ　ｃ　３７３の模式図。

発明の詳細な説明この発明は、特には、殺菌性／透過性増大タンパク質および脂質担体を含有する組成物であって、殺菌性／透過性増大タンパク質か脂質担体中に溶解している組成物を提供する。

ここで用いられる場合には、殺菌性／透過性増大タンノ々り質とは、ｌ）ヒトＢＰＩタンパク質およびＢＰＩタンパク質；２）ＢＰＩタンパク質と実質的に同じアミノ酸配列およびＢＰＩタンパク質の生物学的活性を有する生物学的に活性なあらゆるポリペプチド；３）ＢＰＩタンパク質の生物学的に活性な断片またはＢＰＩタンパク質のポリペプチド類似体；および４）生物学的に活性なりＰＩタンパク質の変種を意味し、かつ包含する。この関連において、生物学的に活性とは、ＬＰＳに対する発熱性応答を阻害し得ることを意味する。この生物学的活性は、ウサギＵＳＰパイロジエンアッセイにおいて測定することができる。

ここで用いられる場合には、“ヒトＢＰＩタンパク質”または“ＢＰＩタンパク質”とは、感受性グラム陰性菌の外膜に結合する生来の、もしくは天然の５７ｋＤタンパク質を意味する。

ここで用いられる場合には、“ＢＰＩタンノ々り質の生物学的に活性な断片”とは、ＢＰＩタンパク質の生物学的活性、および内在するアミノ酸配列を有する、分子ｆｆ１５７ｋＤ未満のポリペプチドを意味する。

ここで用いられる場合には、“ＢＰＩタンパク質の生物学的に活性なポリペプチド類似体”とは、ＢＰＩタンノ々り質と実質的に同じアミノ酸配列、およびＢＰＩタンノくり質の生物学的活性を有するポリペプチドを意味する。ＢＰＩタン／くり質の生物学的に活性なポリペプチド類似体には、その配列が、ＢＰＩタンパク質の配列内のアミノ酸の変化、例えば変異、により、またはＢＰＩタンパク質配列配列ミ八もしくはカルボキシ−末端、あるいはそれら両者における１以上のアミノ酸の付加により、ＢＰＩタンノくり質の配列から変化するポリペプチドが含まれる。

ここで用いられる場合には、“ＢＰＩタンパク質の生物学的に活性な変種”とは、（１１ＢＰＩタンパク質に内在するアミノ酸配列部分およびＢＰＩタンパク質に内在しないアミノ酸配列を含み、かつ（２１Ｂ　Ｐ　Ｉタンパク質と実質的に同じ生物学的活性、すなわち内毒素中和活性を有するポリペプチドを意味する。

ＢＰＩタンパク質の生物学的に活性な変種は、組換えＢＰＩタンパク質であり得る。

ここで用いられる場合には、“組換えＢＰＩタンパク質”とは、遺伝子工学手法によって産生されたポリペプチドを意味する。したがって、ＢＰＩタンパク質、ＢＰＩタンパク質の生物学的に活性なポリペプチド断片、ＢＰＩタンパク質の生物学的に活性なポリペプチド類似体、およびＢＰＩタンパク質の生物学的に活性な変種の各々は、組換え体であり得る。

しかしながら、この出願の文脈においては、ＢＰＩタンパク質は組換えＢＰＩタンパク質とは同じではなく、後者は、生来の、もしくは天然のポリペプチドとは幾つかの分子特性、例えばグリコシレージョン・パターンにおいて異なる。

加えて、殺菌性／透過性増大タンパク質は、（１）ＬＰ３のリピッドＡドメインに特異的に結合し、（２）リピッドＡ結合部位への結合においてＢＰＩタンパク質と競合し、（３）細胞のＬＰＳ介在刺激を阻害し、かつ（４）殺菌活性を示さないタンパク質変種を意味し、かつ包含する。殺菌性／透過性増大タンパク質変種の例は、図６に示されるタンパク質変種である。殺菌性／透過性増大タンパク質変種の他の例は、図７に示されるタンパク質変種である。

ここで用いられる場合には、“脂質１１体”は、疎水性タンパク質の沈殿を阻止することが可能なあらゆる脂肪ＩｊＪ溶物質物質有する液体またはゲルである。

脂質担体はまた、緩衝溶液、塩（例えば、ＮａＣΩ）およびタンパク質担体（例えば、血清アルブミン）を何し−Ｃいてもよい。さらに、脂質担体は、溶液またはゲルの形態であってもよい。このような脂質担体は、当業者に公知の方法により処方される。

ここで用いられる場合には、タンパク質は、タンパク質のモノマーもしくはマルチマー（ｍｕ　Ｉ　ｌ　ｉｍｅ　ｒ）の表面領域か脂質担体と接触している場合に、脂質担体中に“溶解”している。

溶液から析出するタンパク質は溶解していない。溶解度は２８０ｎｍでの吸光度によりＡＪす定することがてき、そこでは溶解したタンパク質が２８０ｎｍの光を吸収し、析出したタンパク質は吸収しない。

この発明の一態様においては、脂質担体はリポソームを含有する。ここで用いられる場合には、“リポソーム“は、殺菌性／透過性増大タンパク質のような所望の物質を有するあらゆる膜結合小胞である。リポソームはまた、成分としてコレステロールを有していてもよい。

この発明の他の態様においては、脂質担体は、非イオン性界面活性剤を含有する。ここで用いられる場合には、非イオン性界面活性剤は、脂質可溶性環境において池の方法では不溶の物質を懸濁することができるあらゆる非イオン性脂質可溶性化合物である。非イオン性界面活性剤の例には、これに限定されるものではないか、（トウイーン８（１（Ｔｗｅｅｎ　８０）もしくはポリオキシエチレンソルビタン・モノオレエートとしても知られる）ポリソルベート８Ｌ　Ｂｒ１ｊ、ポリソルベート８（１゜およびトリトン（Ｔ＋１ｌｏｎ）　（例えば、トリトンＷＲ−１３３９およびトリトンＡ−２０）か含まれる。

他の態様においては、脂質担体はリン脂質を含有する。リン脂質は、ホスファチジルイノシトールもしくはホスファチジルコリンのような天然鼎乳動物リン脂質であってもよい。

この発明はまた、この発明の組成物の製造方法であって、殺菌性／透過性増大タンパク質と脂質担体とを、殺菌性／透−過性増大タンパク質が溶解するような条件下で接触させることを包含する方法を提供する。脂質担体にタンパク質を溶解するための条件は、当業者には公知である。

この発明は、さらに、治療上有効な社の殺菌性／透過性増大タンパク質および薬剤学的に許容し得る脂質担体を含有する医薬組成物であって、殺菌性／透過性増大タンパク質が脂質担体に溶解している組成物を提供する。

ここで用いられる場合には、′治療上有効な量の殺菌性／透過性増大タンパク質 ”とは、患者に投与された場合に、所望の結果を生じ得る、すなわち内毒素血症もしくはそれに関連する疾患を治療もしくは予防し得る量を意味する。殺菌性／透過性増大タンパク質の治療上有効な足の測定方法は、当業者には公知である。

特には、殺菌性／透過性増大タンパク質の治療上有効な量は、患者において、Ｏ，１ｍｇ／ｋｇないし１００ｍｇ／ｋｇの濃度を達成するに十分な量である。この発明の好ましい態様においては、殺菌性／透過性増大タンパク質の治療上有効な量は、患者において、１ｍｇ／ｋｇないし１９ｍｇ／ｋｇの濃度を達成し得るに十分な墓である。

例えば、３５０ｍ　ｇの殺菌性／透過性増大タンパク質は、７０ｋｇの患者において５ｍｇ／ｋｇの濃度を達成するための殺菌性／透過性増大タンパク質の治療上有効な足である。

ここで用いられる場合には、“薬剤学的に許容し得る担体”とは、内用もしくは外用のいずれかの医薬品としての使用に適した脂質担体を意味する。このような担体は、当業者には公知である。

この発明の一態様においては、薬剤学的にＭ’Ｕ容し得る脂質担体はリポソームを含有する。この発明の他の態様においては、薬剤学的に許容しｉ）る脂質担体は非イオン性界面活性剤を含有する。

この発明は、さらに、この発明の医薬組成物の製造方法であって、治療上有効な量の殺菌性／透過性増大タンパク質と薬剤学的に許容し得る脂質担体とを、殺菌性／透過性増大タンパク質が溶解するような条件下で接触させることを包含する方法を提供する。タンパク質を脂質担体に溶解するための条件は、当業者に公知である。

この発明は、さらに、試料中のリポ多糖の検出方法であって、試料とこの発明の組成物とを、リポ多糖−殺菌性／透過性増大タンパク質複合体が形成されるような条件下で接触させ、かつリポ多糖−殺菌性／透過性増大タンパク質複合体を検出し、それにより試料中のリポ多糖を検出することを包含する方法を提供する。

タンパク複合体の検出方法は当業者には公知であり、例としては、ＥＬＩＳＡおよびラジオイムノアッセイ技法が含まれる。

この発明は、さらに、試料中のリポ多糖の量を定員的に測定する方法であって、試料とこの発明の組成物とを、リポ多糖−殺菌性／透過性増大タンパク質複合体が形成されるような条件下で接触させ、かっリポ多糖−殺菌性／透過性増大タンパク質複合体の量を定量的に測定し、それにより試料中のリポ多糖の量を定量的に測定する方法を提供する。

タンパク複合体を定員的に測定する方法は当業者には公知であり、例としてはＥＬＩＳＡおよびラジオイムノアッセイ技法が含まれる。

この発明は、さらに、殺菌性／透過性増大タンパク質が非結合リポ多糖と複合体を形成し得るように手術用具を殺菌性／透過性増大タンパク質で被覆する方法であって、この発明の医薬組成物と生物学的試料に接触することが想定された用具表面とを、含有される殺菌性／透過性増大タンパク質が用具表面に付着するような条件下で接触させることを包含する方法を提供する。

手術用具には、例としては、切断器具、鉗子、吸引装置およびカテーテルが含まれる。タンパク質が用具表面に付着するであろう条件は、当業者には公知である。

移植可能な侵入性装置には、例としては、人工関節、保護板、およびネジが含まれる。タンパク質が移植可能な侵入性装置の表面に付着するであろう条件は、当業者には公知である。この発明の好ましい態様においては、生物学的試料はヒトの内部区画（ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）である。

この発明は、さらに、リポ多糖を含有する流体を、この流体を患者に投与する前に浄化する方法であって、流体とこの発明の医薬組成物とを、リポ多糖と含有される殺菌性／透過性増大タンパク質とが複合体を形成するような条件下で接触させ、かつ形成された複合体を流体から分離し、それにより流体を浄化することを包含する方法を提供する。

ここで用いられる場合には、リポ多糖を含有する流体を“浄化する”とは、そこからリポ多糖を除去することを意味する。

ここて用いられる場合には、投与は、静脈内、腹腔内、または当業者に公知の他のあらゆる投与方法により行なうことができる。

リポ多糖が殺菌性／透過性増大タンパク質と慢合体を形成する条件は、当業者には公知である。さらに、流体からのリポ多糖−殺菌性／透過性増大タンパク質複合体の分離は、当業者に公知の適切なあらゆる手段により達成することができる。

この発明は、さらに、内毒素関連ショック、内毒素関連播種住血管内凝固、内毒素関連貧血、内毒素関連血小板減少症、内毒素関連成人呼吸窮迫症候群および内毒素関連腎不全からなる群より選ばれる疾患に罹患した患者を治療する方法であって、患者にこの発明の医薬組成物を、含有される殺菌性／透過性増大タンパク質が患者の有するリポ多糖と結合し得るに有効な墓投与し、それにより患者を治療することを包含する方法を提供する。

ここで用いられ場合には、投与は、静脈内、腹腔内、または当業者に公知の他のあらゆる投与方法により行なうことができる。

この発明の医薬組成物の、内毒素関連疾患に罹患している患者を治療するに有効な量は、患者において０．１ｍｇ／ｋｇないし１００ｍｇ／ｋｇの最終濃度を達成するに十分な墓である。好ましい態様においては、この発明の医薬組成物の、内毒素関連疾患に罹患している患者を治療するに有効な墓は、患者においてＩｍｇ／ｋｇないし１０ｍｇ／ｋｇの最終濃度を達成するに十分な凰である。

最後に、この発明は、患者における内毒素血症を予防する方法であって、患者にこの発明の医薬組成物を、含有される殺菌性／透過性増大タンパク質が患者の有するリポ多糖と結合し得るに有効なｆｆｌ投与し、それにより患者における内毒素血症を予防することを包含する方法を提供する。

二の発明の医薬組成物の、患者における内毒素血症の予防に有効な侶゛は、患、！１においτ０．ｌｒｎｇ／ｋｇないしｌｏｏｍ　ｇ／ｋｇの最終濃度を達成するに１・分な足である。好ましい態様においては、この発明の医薬組成物の、患者における内毒素血症の予防に有効な伝は、患者において１ｍｇ／ｋｇないしｌ０ｍｇ／ｋｇの最終濃度を達成するに十分な量である。

この発明は、以下の実験の詳細を参考にすることによってより理解されるであろう。しかしながら、詳述した特定の実験はその後に続く請求の範囲においてより完全に記述されるこの発明を説明するためだけのものであることは当業者には容易に認識されるであろう。

た５０ｍＭトリス、ＩＭ　ＮａＣＵ　、ｐＨ７，４中のｒＢＰＩの試料は、ロッカーΦプラットホーム（ｒｏｃｋｅｔ　ｐｌａｌｌｏｔｍ　）（Ｌａｂｑｕａｋｅ　５ｈａｋｅｎ、　Ｃａｔ、Ｎｏ、４００−Ｊｉｏ　Ｌａｂ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、　ＣＡ）を用いて撹拌した場合、３０分以内に沈殿するであろう。同様の沈殿効率は、ｒＢＰＩ溶液を５分間高撹拌した際に観察される。典型的には、沈殿方法のいずれも収率は約９７％沈殿である。

ｒＢＰ！溶解度に対する異なる試薬の効果５０ｍＭ）リスＩＭＮａＣΩ　ｐＨ７，４中の組換えＢＰＩ（１，６ｍ　ｇ／ｍ　１　）を下記溶液中に１０倍に希釈し、ロッカー・プラットホームを用いて４℃で一晩撹拌した。次いで、各溶液を視認しｉ）る沈殿について観察した（表１）。

５０　ｍＭ　Ｉ”リスｐａｌ　？、４１００　ｍＭ　ＮａＣ１’　Ｘ５０　ｍＭ　トリスｐＨ７，４１Ｍ　ＮａＣ１Ｘ５０ｍＭ）リスｐｉ（７，４１０ｍＭ　ＤＴＴ　ｘ５０１］］ＭトリスｐＨ７，４１０ｍＭアスコルビン酸　Ｘ５０ｍＭ）リスｐＨ７，４（アルゴン下）　Ｘ４０　ｍＭクエン酸塩ｐＨ４Ｘ４０　ｍＭクエン酸塩ｐｎ　５　Ｘ４０　ｍＭクエン酸塩ｐＨ６Ｘ４０　ｍＭクエン酸塩ｐｎ　７　Ｘ４０　ｍＭグリシンｐＨ３− ０１１１、Ｂ４　ＬＰＳ　２００　ｕｇ／ｍｌ（予備インキュベート３０分、＠３８°　−ウシ血清アルブミン１００　ｕｇ／ｍｌ　ｘウシ血清アルブミンｌ　ｍｇ／ｍｌ　ｘｌｏｏ　ｍＭ　アルギニンｐＨ８ＸＬＭアルギニンｐ）ｌ　８　Ｘ０１０５％トリトンＸ−１１４− Ｘ−沈殿を認める一＝沈殿を認めずｍｌ）に添加し、その溶液をロッカー・プラットホームを用いて３０分間撹拌した。撹拌の前後に、２８０ｎｍでの吸光度により溶解度を測定した（表２）。

０．５ｍＭ）−リドンＸ−１１４９００，１ｍＭ）リドンＸ−１１４５９０，００３％　トウイーン８０＃３０、０００７九　トウイーン８０３５０　ｍ１１１オクチルゲルコンド　２２５　ｍＭオクチルゲルコンド　２９１２、５　ｍＭオクチルグルコシド　８１６、２５　ｍＭオクチルゲルコンド　８０３、］２ｍＭオクチルクルコシド　８３表　２　（続き）１、５６　ｍＭオクチルグルコシド　６４５％　ポリエチレングリコール６０００　１０１％　ポリエチレングリコール６０００　２０．２％　ポリエチレングリコール６０００　２２０％エチレングリコール　９１００　ｍＭ　硫酸アンモニウム　３２０％グリセロール　９０．２％Ｂｒ＋１３５　１０１０．００５％Ｂｒ１ｉ　３５　９７０．０５％混合アルキルトリメチルアンモニウム　１０５ブロマイド　０１Ｍグルコース　０＊トウイーン８０＝ポリオキシエチレンソルビタン・モノオシＢｒ１ｊ３５−ポリエチレングリコールアルキルニーテルトウイーン８０を用い、例２に記載される通りに、さらなる溶鮮度研究を行なった（表３）。定量は、固相酵素免疫測定法によった。

１０％　トゥイーン８０　１８７０．５％　トウィーン８０　１３７０．２５％トウイーン８０８１０．１２５％　トゥイーン８０　３００．０６３％　トゥイーン８０８０、００３１％　トウイー２８０１例４脂質担体、すなオっちトウビーン８ｏ中のＢＰＩタンパク質は、内毒素の致死性からマウスを有効に保護する（表４）。

表４ＣＤ−１マウスにおけるＢＰＩタンパク質による内毒素の致死性からの保護（２５ｍｇ／ｋｇ　ＩＶ　（７）ＬＰＳ−０１１１：Ｂ４　）（２４時間での生存個体／総数）生理食塩水対照　０１５処方＃１：２０ｍＭクエン酸塩、１５０ｍＭ　ＮａＣｆ）、０．２％トウイーン８０、ｐＨ６，０例５色素産生ＬＡＬアッセイにおけるｒＢＰＩによるＬＰＳ活性□ の阻害。Ｅ、　ｃｏｌｉ　０１ｌｌ：Ｂ４　（０−Ｉ　ＥＵ／ｍ　ｌ）を０−１００μｇ／ｍｌ　ＢＰＩタンパク質と一緒に３７℃で１時間予備インキュベートした後、色素産生カブトガニアメーバ様細胞溶解質（ＬＡＬ）アッセイにおいで内毒素活性をアッセイした。データ（図１）は、ｍ１当りの内毒素中位（ＥＵ）表示の内毒素に対するアッセイ値±ＳＤ（縦軸）、対ＥＵ／ｍ１表示のインキュベーション混合物に添加された内毒素量（横軸）を示す。

ＢＰＩタンパク質によるＬＰＳ誘発性ＴＮＦ分泌の阻害フィコール・ハイパツク勾配を用いてヒト末梢血中球細胞を単離し、発熱源非含有ＨＢＳＳで２回洗浄し、血清を除いたＲ　Ｐ　Ｍ　Ｉ　１６４０中に５ＸＩ０６／ｍｌで再懸濁した。

この細胞懸濁液の２００ｍ　ｌを、平底９６−ウェル組織培養皿の各ウェルにおいて３７℃で２時間インキュベートした。温ＲＰＭＩＩ６４０で２回洗浄することにより、非粘着細胞を再除去した。ＲＰＭＩ１６４０＋ｌＯ％自己由来不活性化血清中で細胞を培養した。

粘ｊ３単球細胞を、緩衝液、ＢＰＩタンパク質もしくはポリミキシンＢ　（７９００Ｕ／ｍｌ）と共に３７°Ｃで３０分間予備インキュベートしたＥ、ｃｏｌｉ　０１ｌｌ：Ｂ４　ＬＳＰで刺激した。ＬＳＰ混合物添加の４時間後に上清を回収した。ＴＮＦαの分泌をＥＬＩＳＡにより定量した。結果を表５に示す。

ＴＮＦ　ｐｇ／ｍｌｒＢＰＩＬＰＳ　緩衝液　ｎ　ｇ　／　ｍ　ｌＢ／ｍｌ　＆＝Ｊ照　１０００　＋００　１０１０００　１７２８±４１６　５２６±４７　１６９４±１３４　２０５２±３２４１００　１３００±１９９　６６±７４０７±９９　１４７９±２３２１０　８２６±２１６０±１６　０± １６　０±５６例７ＬＰＳはＲＩＢＩ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ　Ｒｅ５ｅａ＋ｃｈ、　Ｉｎｃ、、　Ｈａｍｉｌｔｏｎ、　ＭＴから購入した；カルシウム、マグネシウムおよびフェノールレッドを伴わないハンクス均衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）は１’１ａｘｅｌｔｏｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ＰＩｏｄｕｃｔｓ、　Ｄｅｎｖｅｒ、　ＰＡがら購入した；フィコールφバク、パーコールおよびマクロデクス（Ｍａｒ＋ｏｄｅｘ）はＰｈａ＋ｍａｃｉａ　Ｉｎｃ、、　Ｐｉｓｃａｌａｗａｙ、　ＮＪから購入した。ＴＮＦおよび抗ＴＮＦはＥｎ＋ｌｏｇｅｎ、Ｂｏｓｔｏｎ　ＭＡ　、’ｒ１ら購入した。

Ｂ、アズール顆粒単離および抽出地方血液銀行より人手したバフィコートから顆粒球を単離した。バフィコートをＨＢＳＳに３−４×希釈し、６４％パーコールを介する遠心により単核細胞から顆粒球を分離した。このペレットにジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＰ）を作用させ、洗浄し、水冷溶解緩衝液（１０ｍＭ　Ｐ　Ｉ　Ｐ　Ｅ　Ｓ。

ｐＨ６，８、１００ｍＭ　ＫＣΩ　、　３ｍＭ　Ｎ　ａ　Ｃｆ）　、　３．　５ｍＭＭｇＣΩ２）に再￥濁して窒素空洞形成（Ｐａｒｒ　Ｉｎ山ｕｍｅｎｔ　Ｃｏ、、　Ｍｏ１ｉｎｅ、ＩＬ　）により破壊した。アズール顆粒を不連続パーコール勾配を用いて単離した。このような方法は、当業者には公知である。このアズール顆粒を集めて＋８０．０ＯＯＸＧて２時間遠心することによりパーコールを除去した。この顆粒を、凍結−解凍を４サイクル行なった後１分間超音波処理することにより溶解した。溶解した顆粒を、室温で１時間間欠的に高撹拌することにより、等容量のｌｏＯｍＭグリシンｆ中に抽出した。この酸抽出物を、３０．０００　Ｘ　Ｇで２０分間および２００．０００　Ｘ　Ｇで３０分間遠心することにより浄化した。

Ｃ１好中球単離健′ｊ：−ホランティア提供者から酸性クエン酸デキストロース抗凝固剤に静脈血を採り、直ちに氷上に載置した。血液５部を冷マクロデクス１部と混合し、４ °Ｃで１．５−２時間静置した。白血球に富む血漿を冷ＨＢ　Ｓ　Ｓで１×洗浄し、その後ＨＢＳＳに再懸濁してフィコール・バク上に積層した。無視できない赤血球汚染か存在する場合には、顆粒球ペレットは低張溶解を受けた。これらの細胞をＨＢＳＳで２×洗浄し、ＨＢＳＳ＋２％自己由来血漿に再懸濁して、インキュベーション混合物中ｌＸｌ０６／ｍｌの最終顆粒球濃度を１）だ。

Ｄ、ＢＰＩタンパク質精製約２ｍｇの粗アズール顆粒抽出物を、流速１ｍ１／分の定速条件（ｉｓｏＣｒａｆｉＣｃｏｎｄＨｉｏｎ　）下において、５０ｍＭグリシンおよび１００ｍＭ　ＮａＣΩ緩衝液、ｐＨ２，０を用い、Ｂｉｏｓｉｆ　（ＴＳＫ−２５０）　（７，８ｍｍＸ　６００ｍｍ）高速サイス排除カラムでザイスにより分離した。最も高いＬ　Ｆ’　Ｓ阻害活性を有するカラム画分は、５７ｋＤ種の大部分を有していた。これらのＴ　Ｓ　Ｋ両分をプールし、５０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ５，５を用いてアクアポア（Ａｑｕａｐｏ＋ｅ）弱陽イオン交換（ＷＣＸ）カラム（２，１ｍｍｘ３０ｍｍ）に流し、２５分間で５０ｍＭクエン酸塩およびＩＭ　ＮａＣ Ω　（緩衝液Ｂ）の０−７５％の勾配に、次いて５分間で７５−１００％緩衝液Ｂに、流速２００ｍ１／分で溶出し。

た。陽イオン交換から５７ｋＤの物質が回収され、ＳＤＳ　ＰＡＧＥで単一のバンドとして現われた。幾つかの実験においては、０．１％ＣＨ３ＣＮ＋　０．１％ＴＦＡ中に１２分間置かれたＶｙｄａｃ　ＣＪカラムを用い、２００ｍ　ｌ　／分の流速で３０分で行なう逆５ＨＰＬＣにより、ＢＰＩタンパク質をさらに精製した（Ｒａｉｎｉｎ　ＩｎｓｆｒｕｍｅｎＬ；、Ｅｍｅｒｙｙｉｌｌｅ、　ＣＡ）。

削孔動物細胞中でＢＰＩタンパク質および／またはＢＰＩタンパク質変種を産生ずるためには、ｃＤＮＡ配列を適切なプラスミドベクターに挿入しなければならない。そのような用途に適切なベクターは、ＳＶ４０の複製起点並びに初期および後期プロモーター、それに続く多重挿入クローニング部位、それに続くＢ型肝炎表面抗原遺伝子由来の終結配列を有するｐＳＶ−１である（図２）。このプラスミド中には、細菌ＤＮＡ復製起点、並びにアンピシリン耐性およびジヒドロフオレートレダクターゼをコードする遺伝子も含まれている。同様のベクターが、他の外来遺伝子の発現に用いられている（ＭｃＧｒｏｇａｎら、Ｂｉｏｌｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６．　１？２−１７７）　。ＨｉｎｄｌｌｌおよびＢａｍ旧て消化し、アルカリホスファターゼで脱リン酸基することによりＤＰＩタンパク質ｃＤＮＡ配列を受け入れるためのベクターＤＮＡを調製した。

ｐＳＶ−１に挿入するための幾つかの１３Ｐ、１タンパク質ｃＤＮＡ含何インサートを調製した。まず、親プラスミドをＥｃｏＲＩで消化することにより、完全長のＢＰＩタンパク質をコードするインサートを調製した。これによりＢＰＩタンパク質コード配列の一部を含む２つのＤＮＡ断片が得られる。

これら２−）の断ｊ１を調製した５Ｖ−１に共に連結し、得られた組換えクローンを正しい向きにある２つのインサートの存在について、制限酵素消化によってスクリーニングした。親ＢＰＩタンパク質インサートＤＮＡからＢＰＩタンパク質のトランケート体（ｌｙｕｎｃａｌｅｄ　ｆｏｒｒｎ）をコードする２種のｃＤＮＡか生成した。この増幅オリゴは、ＢａｍＨＩ　クローニング部位に加えて、コドン２１２（オリゴ４５９）　（図３）および３３７（オリゴ４６０）　（図４）を停止コドンに置換するように設計された。両構築物の５′−末端で、オリゴ４５８か増幅に際し翻訳開始コドンＡＴＧの直ぐ上流にＨｉｎｄｌ１１部位を創造するために用いられた（図５）。したがって、各々５５ｋＤ、３８ｋＤおよび２５ｋＤ形態の組換えＢＰＩタンパク質をコードする３種のＢＰＩエンコーディングインサートが創造され、その各々を調製したベクターＤＮＡに別々に連結した。

３種の構築物の各々を制限消化分析により確認した後、ＣＨＯ細胞系ＤＵＸＢ１１細胞に形質導入するに十分な量を調製した。形質導入はりポフエクチンを用いて行ない、１ツられた形質転換細胞を、増量したメトトレキセートの存在下において、標準プロ１へコルを用いて選択した。形質転換プールのいずれかからの上清もしくはこのプール由来のクローンを、ＥＬＩＳＡにより、内毒素結合活性についてアッセイした。

ンパク質および／またはＢＰＩタンパク質変柾を産生させるためには、まずｃＤＮＡ配列をｐＡＣ３７３（図８を参照）のような適切なプラスミド発現ベクターに挿入しなければならない。この挿入に適当な制限部位を、標準部位指向変異誘発法によって創造することができる。適切な発現ベクターに必須の特性には、ｐＡＣ３７３のポリへドロン遺伝子プロモーターのような転写プロモーター、バキュロウィルス・ゲノムへの組換えを指向するフランキング相同配列が含まれる。

このプラスミドベクター中に存在するポリへドロン遺伝子の一形態のようなポリアデニル化シグナルは、組換え遺伝子の発現には必要であることもないこともある。転写プロモータおよび恐らくはポリアデニル化シグナルを含む調節配列と並置される、Ｅ、ｃｏｌｉのβ−ガラクトシダーセ遺伝子のようなマーカー遺伝子は、このベクターに含まれてもよいが、運搬された遺伝子（ｃｏｎｖｅｃｆｅｄ　ｇｅｎｅ）の発現には必須ではない。そのような目的のための典型的なベクターであるｐＡＣ３７３を図８組換えバキュロウィルスの創造；キメラバキュロウィルスを、ＢＰＩタンパク質標的遺伝子（もしくはそれらのトランケーション）有する発現プラスミドと野生型バキュロウィルスＤＮＡとの間の相同組換えにより創造する。プラスミドおよび野生型バキュロウィルスＤＮＡをリン酸カルシウム法により共沈させ、未感染５ｐｏｄｏｐｔｐｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ　（Ｓ　ｆ　９　）昆虫細胞に添加する。形質導入に続く４ないし７日間で、細胞は細胞変性形態（ｃｙｔｏｐａｌｈｉｃ　ｍｏ「ｐｈｏｌｏｇｙ　）を示し、ウィルス感染によって典型的に生成する核閉塞体（ｎｕｃｌｅａｒ　ｏｃｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｉｅｓ）を有する。野生型および組換えウィルスの両者を含む細胞非含有培養培地を回収する。

キメラバキュロウィルスの同定および単離：アガロースで覆われたＳｆ９細胞中層に対するプラーク精製により、この共形性導入（ｃｏ−ｔ＋ａｎｓｌｅｃｌｉｏｎ　）ストックからウィルスのクローン中離対をｉすることかできる。閉塞対について陰性のプラーク形態から、分析のための候補プラークが同定される。発現プラスミドかβ−ガラクトシダーゼのようなマーカー遺伝子を存する場合には、組換えプラークは、アガロース平板培地中の５−ブロモ−４−クロウルー３− インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ゲル）のような色素産生基質より生成する青色によって示される。取り出したプラークをマルチウェルディツシュ中の細胞の接種に用いる。得られた細胞溶解物および感染細胞上清を、標準活性もしくは免疫アッセイを用いて、組換えＢＰＩタンパク質の発現について評価することができる。陽性ウェルは、野生型の汚染のない純粋組換えウィルスストックを得るために、さらなるプラーク精製ラウンドを要するかもしれない。

ＢＰＩタンパク質のバッチ生成：増殖のため、Ｓｆ９細胞を、ＥｘＣｗｌｌ　（Ｊ、　Ｒ，５ｃｉｅｎｌｉｆｉｃ）のような血清非含有低タンパク培地中で適合させる。細胞を、穏やかに遠心することにより懸濁培養物から集め、細胞当り１ウイルスプラ一ク形成単位の感染多重性を利用するｍ１当り１，０００万細胞の濃度の細菌接種物を有する新鮮な培地に再懸濁する。２時間後、この培養物を新鮮な培地で５倍に希釈し、２ないし３０間インキュベートする。この期間の最後に、遠心により細胞をベレット化し、ｙＪ８Ｊ整された培地を日収する。この細胞ノ１゛含有上清から、標準手段により、ＢＰＩタンパク質を精製する。

昆虫細胞由来ＰＮ−Ｉの特徴付け：バキュロウイルス発現系を用いて昆虫細胞中に産生じたＢＰＩタンパク質は、おおよその分子量が５５ｋＤのグリコジル化タンパク質である。そのＮ−末端アミノ酸配列は、熟成哺乳動物細胞ＢＰＩタンパク質と同じであり、これはシグナル配列の正しい処理を示している。特異的な内毒素結合活性は、生来のＢＰＩタンパク質と区別できない。

ｐ７７８ＰＩタンパク質プラスミドの構築＝　（図２を参照）ポリメラーゼ−チェイン・リアクション（ＰＣＲ）において用いるために、アプライド・バイオシステムズ（＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）　３８０Ｂ　ＤＮＡシンセサイザーを用いてオリゴヌクレオチドを調製した。これらのオリゴヌクレオチドは、ＢＰＩタンパク質り、ＮＡの５′および３′末端に、それぞれ、Ｎｄｅ　ＩおよびＢｘｍ旧制限部位を生成した。加えて、Ｂｉｍ旧制限部位を有する他のオリゴヌクレオチドが、ＢＰＩタンノくり質ＤＮＡのプロリン−２１２トランケ一ト体（１＋ｕｎｃａ＋ｅｄ　ｐｒｏｌｉｎｅ−２１２ｖｅｔｓｉｏｎ　）を生成するために用いられた。

ＰＣＲ反応に続いて、断片を精製し、Ｎｄｅ　ｌおよびＢａｍＨｌで消化した。

プラスミドｐ　Ｇ　Ｅ　Ｍ　Ｅ　Ｘ−１（Ｐ「ｏｍｅｇａより入手）を構築のためのベクターとして選択した。ｐＧＥＭＥＸ−１は、適正宿主内に置かれた場合、下流の配列を発現させるために用いることができるＴ７プロモーターを有している。このベクターをＢａｍ旧で開裂させ、精製に続いてＮｄｅ　Ｉで部分的に消化して中−のＮｄｃ　Ｉ部位および単一のＢａｍ旧部位を有するベタクーを生成させる。この断片を連結し、７１ナノ＼ン（Ｈｘｎａｈａｎ　）形質転換プロトコルを用いてＥ、　ｃｏｌｉ　Ｊ　Ｍ２Ｏ３株を形質転換する。この形質転換菌を、カルバミシリン（ｃａｒｂａｍｉｃｉｌｌｉｎ　）を含有するＬＢプレートに塗布し、３７℃で一晩インキユベートした。耐性コロニーを選別し、これを、ミニ・プラスミド調製品を調製し、かつ適当な制限酵素で消化することにより分析した。消化物を、１％アガロースゲルおよび５％ＰＡＧＥの両者を用いて分析した。

発現宿主であるＥ、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９　（ＤＥ３　）株を、ミニ・プラスミド調製品１μｍおよび／’％す／％ン形質転換プロトコルを用いて形質転換した。ＪＭ１０９　（ＤＥ３）は、Ｉ　ＰＴＧで誘発することができるＴ７　ＲＮＡポリメラーゼの遺伝子の染色体コピーを何している。この形質転換菌を、カルノ＜ミシリンを含有するＬＰプレートに塗布し、３７℃で一晩インキュベートシた。

Ｆｉｇυｒｅ２Ｆｉｇｕｒ＝　３ＢＰＩのＣ末端トランケーション２５ＫＯＰｒｏ　２１２　ＴＧＡＡＡ、２０５　２１０　２１２１１ｅ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｔｅｒ、Ｂａｍ　ＨＩＴＡＧ　ＡＡＣＴＡＴ　ＧＧＴ　ＣＴＧ　ＧＴＧ　ＧＣＡ　ＣＣＴ　ＴＧＡ　ＧＧＡＴＣＣＧＣＧＣＯ’、ｌＰ　３・　ＡＴＡ　ＣＣＡ　ＧＡＣＣＡＣＣＧＴ　ＧＧＡ　ＡＣＴ　ＣＣＴＡＧＧＣＧＣ５“オリゴ４５９：５　’　ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡ　ＡＧＧ　ＴＧＣＣＡＣＣＡＧ　ＡＣＣＡＴＡ　３゜Ｆｉｇｕｒ＝　４ＡＡ、３３０　３３５　３３７Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｌｓｕ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｔｅｒ　Ｂａｍ　ＨＩＣＣＣＡＣＣＧＧＣＣＴＴＡＣＣＴＴＣＴＡＣＣＣＴＴＧＡ　ＧＧＡＴＣＣＧＣＧＣＯＭＰ・３°ＣＣＧ　ＧＡＡＴＧＧ　ＡＡＧＡＴＧ　ＧＧＡＡＣＴＣＣＴＡＧＧＣＧＣ５゜オリゴ４６０・５’　ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡ　ＡＧＧ　ＧＴＡ　ＧＡＡ　ＧＧＴ　ＡＡＧ　ＧＣＣ３゜Ｆｉｇｕｒｅ　５５°ＣＣＣＡＡＧＣＴＴ　ＧＣＣＡＣＣＡＴＧ　ＡＧＡ　ＧＡＧ　ＡＡＣＡＴＧ　ＧＣＣ３’＜、−２Ｃ！：、じ−クトーー〉００Ｅ＋１国−ｔＡｘｘ＞ｏヘーー〉＞　％　０１−Ｉ　Ａψ×〉山Ｑ−リ＜ｏ”ｒ、ｗ口＋　ｃｑ　ｚ気＜×− Ｅ−４，−＋（１）−ベニｕ＋ｚｈトエ０く＞ｚψ〉〉ＣｚｚトへＨ＜　Ｌ　（Ｈ：ｌ：　Ｃ１＜　：！：　ｍ　Ａ　Ｑ。

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Claims

【特許請求の範囲】

１．殺菌性／透過性増大タンパク質および脂質担体を含有する組成物であって、殺菌性／透過性増大タンパク質が脂質担体に溶解している組成物。
２．脂質担体がリボソームを含有する請求の範囲第１項記載の組成物。
３．脂質担体が非イオン性界面活性剤を含有する請求の範囲第１項記載の組成物。
４．請求の範囲第１項記載の組成物の製造方法であって、殺菌性／透過性増大タンパク質と脂質担体とを、殺菌性／透過性増大タンパク質が溶解するような条件下で接触させることを包含する方法。
５．治療上有効な量の殺菌性／透過性増大タンパク質および薬剤学的に許容し得る脂質担体を含有する医薬組成物であって、殺菌性／透過性増大タンパク質が脂質担体中に溶解している組成物。
６．薬剤学的に許容し得る脂質担体がリポソームを含有する請求の範囲第５項記載の組成物。
７．薬剤学的に許容し得る脂質担体が非イオン性界面活性剤を含有する請求の範囲第５項記載の組成物。
８．請求の範囲第５項記載の医薬組成物の製造方法であって、治療上有効な量の殺菌性／透過性増大タンパク質と薬剤学的に許容し得る脂質担体とを、殺菌性／透過性増大タンパク質が溶解するような条件下で接触させることを包含する方法を提供する。
９．試料中のリポ多糖の検出方法であって、試料と請求の範囲第１項記載の組成物とを、リポ多糖−殺菌性／透過性増大タンパク質複合体が形成されるような条件下で接触させ、かっリポ多糖−殺菌性／透過性増大タンパク質復合体を検出し、それにより試料中のリポ多糖を検山することを包含する方法。
１０．試料中のリポ多糖の量を定量的に測定する方法であって、試料と請求の範囲第１項記載の組成物とを、リポ多糖−殺菌性／透過性増大タンパク質複合体が形成されるような条件下で接触させ、かつリポ多糖−殺菌性／透過性増大タンパク質複合体の量を定量的に測定し、それにより試料中のリポ多糖の量を定量的に測定する方法。
１１．殺菌性／透過性増大タンパク質が非結合リポ多糖と複合体を形成し得るように手術用具を殺菌性／透過性増大タンパク質で被覆する方法であって、請求の範囲第５項記載の医薬組成物と生物学的試料に接触することが想定された用具表面とを、含有される殺菌性／透過性増大タンパク質が用具表面に付着するような条件下で接触させることを包含する方法。
１２．殺菌性／透過性増大タンパク質が非結合リポ多糖と複合体を形成し得るように移植可能な侵入性装置を殺菌性／透過性増大タンパク質で被覆する方法であって、請求の範囲第５項記載の医薬組成物と生物学的試料と接触することが想定された装置表面とを、含有される殺菌性／透過性増大タンパク質が装置表面に付着するような条件下で接触させることを包含する方法。
１３．リポ多糖を含有する流体を、該流体を患者に投与する前に浄化する方法であって、流体と請求の範囲第５項記載の医薬組成物とを、リポ多糖と含有される殺菌性／透過性増大タンパク質とが複合体を形成するような条件下で接触させ、かっ形成された複合体を流体から分離し、それにより流体を浄化することを包含する方法。
１４．内毒素関連ショック、内毒素関連播種性血管内凝固、内毒素関連貧血、内毒素関連血小板減少症、内毒素開運成人呼吸窮迫症候群および内毒素関連腎不全からなる群より選ばれる疾患に罹患した患者を治療する方法であって、患者に請求の範囲第５項記載の医薬組成物を、含有される殺菌性／透過性増大タンパク質が患者の有するリポ多糖と結合し得るに有効な量投与し、それにより患者を治療することを包含する方法。
１５．患者における内毒素血症を予防する方法であって、患者に請求の範囲第５項記載の医薬組成物を、含有される殺菌性／透過性増大タンパク質が患者の与するリポ多糖と結合し得るに有効な量投与し、それにより患者における内毒素血症を予防することを包含する方法。