JPH07501443A

JPH07501443A - 高分子量のコラーゲン様タンパク質ポリマー

Info

Publication number: JPH07501443A
Application number: JP5509309A
Authority: JP
Inventors: カッペロ，ジョセフ; ファーラリ，フランコ　エー．
Original assignee: Protein Polymer Technologies Inc
Current assignee: Protein Polymer Technologies Inc
Priority date: 1991-11-12
Filing date: 1992-11-04
Publication date: 1995-02-16
Also published as: DE69233300D1; CA2123316A1; EP0670848B1; ATE258981T1; EP0670848A4; EP0670848A1; AU675056B2; DE69233300T2; AU3064692A; KR100238715B1; WO1993010154A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】高分子量のコラーゲン様タンパク質ポリマー序論技術分野本発明の分野は、組換え技術を使用するコラーゲン様ポリマーの生産である。

背景コラーゲン、すなわち、天然に見いだされるタンパク質は、工業において広い用途を見いだす。化学的に加水分解した天然のコラーゲンは加熱および冷却により変性および復元してゼラチンを製造することかでき、これは他の応用のなかでも写真および医学の用途において使用される。この現象の原因となるコラーゲンの鎖の性質は、三重らせんと表示されるコンフォメーションを有する鏡開凝集物を自発的に成形するその能力である。らせんは鏡開の弱い相互作用により安定化され、これらの相互作用はグリシンにより占有される第３残基毎の位置におけるペプチドの主鎖の密接な近位およびグリシン間の２位置におけるプロリンおよびヒドロキシプロリンにより提供されるキンクから生ずる。３つのキンクした鎖の形状寸法は、三重らせん内の水素結合を可能とする。この構造はゆるく、そして水、小さい有機および無機の分子、他のタンパク質、および細胞との相互作用に容易にアクセス可能である。コラーゲンは多数の異なるアミノ酸配列から成るか、より構造的に安定なセグメントの１つは処理したコラーゲン１型鎖のアミノ末端およびカルボキシル末端に存在する。これらの末端は大きい程度に反復するトリペプチドの配列ＧＰＰ（第２のＰは］７ばしばヒドロキシル化されている）から成る。

コラーゲンの天然の形態と対照的に、組換え的に生産されたコラーゲン様ポリマーはもっばら広範な種類のＧＸＹ配列から選択される単一の反復トリペプチド配列から成ることができ、ここでＸおよびＹは既知の天然の配列から誘導されるか、あるいは誘導されない、任意のアミノ酸である。コラーゲン様ポリマーは、また、最終のポリマーの中でブロックとして反復する、異なるトリペプチドの配列から成ることかできる。非類似のブロックは、また、反復する方法で使用してブロックポリマーをつくって、追加の化学的または生物学的の官能性を提供することができる。

組換え技術の出現で、コラーゲン様ポリマーを生産する機会が発生し、ここてコラーゲンの有利な性質を選択的に保持することができると同時に、新規な能力および特性を導入することができる。コラーゲン、反復トリペプチドの独自性は、配列の高い反復性および組成物中のアミノ酸グリシンおよびプロリンの頻繁な利用に照らして、組換え技術のための課題である。高いレベルのグリシンおよびプロリンをもつタンパク質をエンコードする遺伝子は、必要により、自己相補性配列の中の高いレベルのヌクレオチドのグアニジンおよびシチジンから構成される。こうして、遺伝子を合成するとき、鎖かループアウトし、一本鎖ＤＮＡが切除され、遺伝子のセグメントの損失、および非効率的な転写および／または翻訳を生じうる組換え事象か起こる実質的な機会が存在する。こうして、コラーゲンの有利な性質を提供すると同時に、高分子量のコラーゲン様ポリマーの安定な発現を可能とする技術および組成物を開発することにおいて実質的な関心が存在する。

関係する文献ＷＯ３８１０５０８２号およびＧｏｌｄｂｅｒｇら、Ｇｅｎｅ　（Ａｍｓｔ、）８０　：　３０５−３１４（＋９８９）は、比較的低分子量のコラーゲン類似体のタンパク質の製造を記載している。また、構造タンパク質のポリマーを記載しているＰＣＴ／ＵＳ８７１０３３６０号およびＰＣＴ／　ＵＳ８９／　０５０１６号を参照のこと。

発明の要約第３位置毎にグリシンを有する遺伝子を合成することによって、高分子量のコラーゲン様ポリマーが提供され、そしてグリシンの間に存在するアミノ酸の約６０％以下はプロリンである。複数のトリペプチド単位を有する配列を合成し、配列を一緒に結合してマルチマーを生成し、マルチマーをクローニングし、そして最後にマルチマーを接合して、大部分について、単細胞の微生物の中で高分子量のコラーゲン様ポリマーを発現する遺伝子を提供することによって、遺伝子を製造する。

特定の態様の説明高分子量のコラーゲン様ポリマーを製造する方法および組成物か提供され、ここでグリシンはトリアド反復単位の第１アミノ酸として保持され、そして他の２つのアミノ酸は変化して、グリシンの間のポリマーのプロリン含量をコラーゲン様ポリマーの中のアミノ酸に基ついて６０９６より少なく、通常的４０％より少なく、より通常３０９６より少なく減少する。ポリマーは種々の方法で変化し、単一の反復単位を有し、交互する反復単位を有するか、あるいは異なる反復単位のブロックを有する。通常、ポリマーは、ポリマーの約２０９６より少ない、より通常的１０９６より少ないのアミノ酸配列を構成する配列をそれらの５′末端および３′末端に有するであろう。コラーゲン様ポリマーをエンコードする遺伝子を合成し、適当な発現ベクターの中に挿入し、次いてこのベクターを発現宿主の中に導入する。次いて、生ずるコラーゲン様ポリマーを分離し、精製し、そして種々の方法で使用することができる。

本発明のポリマーは、少なくとも約３０ｋＤ　（キロダルトン）、より通常少なくとも約４０ｋＤ、好ましくは少なくとも約５０ｋＤであり、かつ通常的＋５０ｋＤを越えない、より通常的１２５ｋＤを越えない、しばしば約１００ｋＤを越えない分子量を有することによって特徴づけられる。

ポリマーは、さらに、コラーゲンに似ており、らせんを提供し、変性および復元し、ゲルを成形することができるなどにおいて特徴づけられる。ポリマーは好ましくは天然のコラーゲン、とくに哺乳動物のコラーゲンの中に見いだされるトリペプチドのトリアドの配列を主要比率で有するであろう。本発明のポリマーは、種々の方法において、種々の機能的単位を導入することによって修飾することがてき、ここて機能的単位に依存して、ポリマーはデザインの一部分であることかてき、第３位置に均一な交互するグリシンを提供するか、あるいは均一性を妨害するか、あるいは反復単位のブロックの末端に存在することができる。２０アミノ酸のいずれも存在することかてきるか、帯電したアミノ酸は通常反復する配列の中の総数により３０％より少なく、しばしば１５％より少ない比率で存在するであろう。

本発明のコラーゲン様ポリマーは、それらの反復単位、反復単位のパターン、中断する配列の挿入などに関して広く変化させることかできる。少なくとも７５重量％、通常少なくとも８０重量％、より通常少なくとも８５重量％はトリアド（ｔｒｉａｄｓ）（第１アミノ酸としてグリシンをもつトリペプチド）から構成されているであろう。通常少なくとも５０９６、より通常少なくとも８０％のトリアドは天然のコラーゲン、と（に哺乳動物のコラーゲンの中に見いだされるであろう。

トリアドの数は、通常少なくとも約１００、より通常少なくとも約１５０、そして約５００以下、通常約４００以下であろう。

本発明の組成物は式により記載され、ここで各大文字はアミノ酸を示し、あるアミノ酸についての１文字の記載はその特定のアミノ酸を示し、そしてその１つの文字の記載内でない文字は任意のアミノ酸またはアミノ酸の表示したグループを記号で表すために使用される。上付き文字は複数のトリアドが存在することを示し、アミノ酸の文字記号はトリアドの各々において同一であるか、あるいは異なるアミノ酸を記号で表すことができる。下付き文字は常にそれが関係する記号または式の反復の数を意味する。

大部分について、ポリマーはコラーゲン様ポリマーの中に少なくとも２回存在するモチーフとして、隣接してまたは隣接しないで、次の式を育する配列を有することによって特徴づけられる：（（ＧＸＯ）、Ｚ）。

式中、 ′　Ｇはグリシンであり：Ｘおよび０は任意のアミノ酸であり、ただしＸおよび０は約４５総数％より少ない、通常約４０総数％より少ない、３０総数％より少なくあることができ、そして約ＩＯ総数％より大きい、通常約１５総数％より大きい、ポリマー、通常全体のポリマーの反復配列のプロリン含量を有するように選択され；Ｚは０〜５０アミノ酸、より通常θ〜３０アミノ酸、しばしば０〜１５アミノ酸を有し、そして通常機能的能力を有する配列であり、そして反復ＧＸＯ以外であり；ｎは少なくとも４でありかつ１００以下、通常約７５以下、しばしば約５０以下であり；そしてｍは少なくとも１つてあり、２であることができ、通常少なくとも約３かつ約２０以下、通常約１２以下であり、とくにｎが大きくなる程、ｍよりは小さくなる。

トリアドの反復配列は、ポリマーの少なくとも６０重量％、通常少なくとも８０重量％である。

通常、モチーフの中の異なるトリアドの合計数は少なくとも２、より通常少なくとも３であり、かつ約２４以下、より通常約１６以下、は、通常約１５以下、より通常約１２以下である。プロリンを含むトリアドの数は、少なくとも４０総数％、より通常少なくとも６０総数％でありかつ約９８総数％以下である。すべてのトリアドは１つのプロリンを含むことができるか、好ましくは８５総数％より少ない、通常７５総数％より少ないトリアドはプロリンを含む。

コラーゲン様ポリマーの１つの型は、大部分について、反復するモチーフとして、下記のモチーフを有するであろう。

（ＧＸ”Ｏ”）、’Ｚ’）、’ 式中、ＧＸＯは前に定義したとおりであり；ＸおよびＯは同一の数であり、そして２〜１０、通常３〜８、しばしば４〜６の範囲内、とくに２゜３．５またはｌＯてあり、これは配列の中に存在する多数の異なるトリアドまでおよびそれらを包含し；Ｚは前に定義したとおりであり：Ｚは１〜ｍ１であり、通常３以下、しばしば１〜２、好ましくはｌであり、ここでＺは異なるＺ基を意味し、Ｘの定義に類似し、モしてｍｌは少なくともｌてあり、２、通常少なくとも約３であることができ、かつ約２０以下、通常約１２以下、とくにｎｌが大きくなるとき、上の通りであり；そしてｎｌは少なくとも約２でありかつ約１００以下、通常約７５以下、より通常約５０以下、一般に約３０以下である。

例えば、Ｘが３であり、ＺはＯアミノ酸であり、がっｍｌが１である場合、次の式が得られる：（（ＧＸ’Ｏ’）（ＧＸ”Ｏ”ＸＧＸ３０’））、’式中、ＸＩは特定のアミノ酸であり、Ｘ！は同一であるか、あるいは異なるアミノ酸などであり、かっＯに類似することがてき：そしてｎｌは一般に少なくとも約２、より通常的４であり、かつ約３３以下、通常約２５以下である。

本発明の化合物を合成する１つの技術は、それ自体法の式の特定のモチーフに導く。

（（α）、（β）ｅ（α）、’ｌ　。

式中、 αは１〜９トリアド、通常２〜６トリアド、好ましくは２〜４トリアド、通常プロリンを有する少なくとも１つのトリアド、より通常プロリンを有する少な（とも２つのトリアドを有し。

βは１〜２４トリアド、通常２〜１８トリアド、より通常３〜９トリアドを有し：ｅは少なくとも３、通常少なくとも６てあり、かつ約５０以下、通常約３６以下であり：ｇは少なくともｌてあり、かつ約２０以下、通常約１２以下、より通常約８以下であり；ａおよびａｌは同一であるか、あるいは異なることができる；ａは少なくとも１てあり、かつ約６以下、通常約３以下であり、ただしａまたはａｌは０であることができる。

理解されるように、存在するトリアドの数が大きくなるほど、所望の分子量を提供するために要求される反復の数は小さくなる。

好ましい態様において、これらの拡張されたモチーフは、大部分について、次の式を有する：（ＧＵ”Ｂ’）、（ＧＸ”０”）、’（ＧＵ”Ｂ’）、Ｚ”）、’Ｇ＋　Ｘ”＋　Ｏ’＋　Ｚ’＋　ｍ’およびｎｌのすべては前に定義したとおりであり；ＵおよびＢは任意のアミノ酸であり、しばしばトリアドの少なくとも１つのトリアドの中に存在するプロリンが存在しくまた、ＸおよびＯの定義を参照のこと、これらはここにおいて含まれる）；ＵおよびｂはＸおよび０に類似する意味を有し、異なるトリアド（トリペプチド）単位の中の同一であるか、あるいは異なるアミノ酸を示し；そしてｐおよびｐｌは１〜６、より通常２〜４であり、そして２つのｐは同一であるか、あるいは異なることができ、通常同一であるが、ただしｐは０であることもできる。

グリシン以外のとくに興味あるアミノ酸は、次のものを包含する：アラニン（Ａ）、イソロイシン（■）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、ヒスチジン（Ｈ）、およびプロリン（Ｐ）、好ましくは中性の極性アミノ酸、例えば、ＳまたはＴ、あるいは中性の脂肪族アミノ酸、例えば、Ａ、Ｔ、Ｌ、またはＶの少なくとも１つである。通常、芳香族疎水性アミノ酸、例えば、Ｆ。

ＹおよびＷは回避され、そして脂肪族疎水性アミノ酸（Ｌ、　Ｖ、Ｉ）は、いやしくも、プロリンが存在するとき、通常使用されるであろう。構造的考慮について、プロリン、アラニン、バリン、セリン、スレオニン、グルタミンまたはアスパラギンをＸまたは０位置に含有するトリアド配列はいっそう安定な三重らせんを成形する。安定性の増加は、また、０位置にヒドロキシプロリンを含有するドリアトにより与えられる。トリプトファンおよび千ロジンを含有するトリアドは通常利用されない。三重らせんの高次のアセンブリーについて、ＸまたはＯ位置に、しかしことにＸ位置にグルタミン酸またはアスパラギン酸を含有するトリアド、およびＸまたは０位置に、しかしことに０位置にリジンまたはアルギニンを含有するトリアドは好ましい。

少なくとも１つのトリアドが第２位置にプロリンを有する場合、より好ましくは２つのトリアドが第２位置にプロリンを存するが、あるいは少なくとも１つのトリアドが第３位置にプロリンを有することはとくに重要であり、時には第３位置にプロリンを有する２つのトリアドが得られると、第１および第２の位置にプロリンを有する少なくとも２つのトリアドかしばしば存在する。大部分について、モチーフにおけるトリアドの少なくとも３０％、より通常少なくとも５０９６は第２または第３の位置にプロリンを有し、そして両者の位置にプロリンをもつ多少の、通常３５総数％以下のトリアドが存在することかある。

組換えコラーゲン様ポリマーにおいて利用されるトリアドの選択は、性質、例えば、らせんの安定性、水和、溶解度、ゲル化点、生物分解性、および免疫原性に影響を与えるためになされる。例えば、免疫原性を最小するために、簡単な側鎖をもつアミノ酸、例えば、グリノン、アラニン、セリン、バリン、およびプロリンから成るトリアドを利用する。より複雑なアミノ酸を必要とするとき、それらのアミノ酸はへキサペプチド、ノナペプチド、またはこれらのアミノ酸を含有する天然のコラーゲンの鎖からのより長いトリアド配列を利用することによって組み込むことかできる。

大きい程度に、本発明のポリマーの多数は、次の式により描写することかできる。

Ｊ’、（（ＧＵ”Ｂｂ）、”（ＧＸ”０’）、’（ＧＯ″Ｂ’）、”）Ｚ、）、 ’）Ｊ”。

式中、記号のすへては前述したが、ただしＪｌおよびＪ２は同一であるか、あるいは異なり、そして約１〜４０アミノ酸、より通常約１〜３ｏアミノ酸のアミノ酸配列であり、そして便利な任意の配列であることができ；２つのｒは同一であるか、あるいは異なり、そして０またはｌであり。

２つのｐ２は同一であるか、あるいは異なり、そして０またはｐ】である。

モチーフを定める種々の反復配列は、下記の配列により例示することができる：ＧＡＰＧＰＡＧＰＫ；　ＧＡＰＧＰＡＧＰＰＧＡＨ；　ＧＳＰＧＡＰＧＰＡ；　ＧＡＰＧＰＡＧＳＲＧＤＰＧＰＡ；ＧＡＮＧＡＰＧＰＡＧＰＡＧＡＰＧＰＰ；　ＧＡＱＧＰＡＧＰＧＧＡＰＧＰＡＧＰＧ；　ＧＡＰＧＰＡＧＡＳ；ＧＰＡＧＡＰＧＳＲＧＤＰＧＡＰＧＰＰ；　ＧＶＳＧＰＲＧＰＡＧＡＰＧＰＰ；　ａｎｄ　ＧＡＱＧＰＡＧＰＧとくに重要なトリアドは、次のものを包含する：　ＧＡＰ、　ＧＰＡ、　ＧＰＰ。

ＧＡＳ、　ＧＰＧ、　ＧＰＳ、　ＧＡＱ、　ＧＳＰ、　ＧＳＱ、　ＧＬＱ、　ＧＰＲ，ＧＰＫ、　ＧＡＫ、　ＧＡＲ，ＧＥＲ，ＧＤＲ，ＧＥo、　ＧＤＡ。

ＧＡＨおよびＧＥＡここでそれらのトリアドと他のトリアドとの組み合わせはとくに重要であり、トリアドの少なくとも約３０総数％、通常少なくとも約５０総数％、示したトリアドの範囲内に入る、より通常少なくとも約６０総数％、しばしば少なくとも８０総数％が存在する。さらに、任意の１つの単位の中のトリアドの数は広く変化することができ、望ましくは数は３，５またはその多数倍である。

ＧＵＢ配列を定める配列は、次のものを包含する：ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ：　ＧＡＨＧＰＡＧＰＲ；　ＧＡＶＧＡＰＧＰＫ；　ＧＰＡＧＡＰＧＥＰ；　オヨヒＧＶＳＧＰＲＧＡＰ遺伝子はＰＣＴ／　ＵＳ８７／　０２８２２号に記載されている方法により合成できる。とくに、遺伝子は下記のプロトコールに従い合成される。

一般に、少なくとも１２のアミノ酸、かつ通常約６０以下のアミノ酸をコードする、比較的短いオリゴヌクレオチドの鎖が合成される。相補的鎖をアニーリングし、クローニングし、そして配列決定して、正しい配列か得られたことを確立する。末端は平滑末端であるか、あるいは互い違いであることができ、通常互い違いである。次いて、配列をマルチマー化し、結合し、そしてクローニングベクターの中に挿入する。適当な宿主の中に形質転換した後、クローンを単位のオリゴマー化について分析し、そして適当なサイズの単位を選択し、そして発現のために使用する。異なる配列のフランキング反復単位を望むとき、このモチーフをエンコードする配列をフランキング反復単位の間の適当な制限部位に挿入し、こうして引き続いて遺伝子を適当なフランキング単位で切除することができる。次いで、フランキング単位をもつモチーフをエンコードする生ずる配列を切除し、オリゴマー化し、そして、前述したように、クローニングし、そして所望の配列およびサイズを有することに関して同定することができる。

本発明のタンパク質は、適当な単細胞の宿主、例えば、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ）、酵母菌、Ｓ、ボンベ（ｐｏｍｂｅ）　、サツカロミセス・セレビシアエ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）など、真菌、ニュウーロスボラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉ　ｌ　Ｉｕｓ）などを形質転換することによって生産される。広範な種類の発現ベクターは文献に記載されてきており、そしてここで例示する必要はない。発現ベクターは誘発可能なあるいは構成的プロモーターを提供することができ、ここで本発明のタンパク質は連続的に発現するか、あるいは誘発後のみ発現することができる。多数の発現ベクターは適当なプロモーター、終結配列、および開始配列と終結配列との間のポリリンカーを有するので、所望の遺伝子を便利にポリリンカーの中に挿入してプロモーターの転写のコントロール下にすることができる。

さらに、ベクターは１または２以上のマーカーを有することができ、前記マーカーは形質転換された宿主における選択を可能とする。ベクターは、また、染色体外の維持またはゲノムの中への組込みを可能とする。マーカーは毒素、例えば、抗生物質に対する耐性、あるいは両栄養性宿主のプロトトロピーに対する相補性を提供することかできる。発現ベクターの選択は、ある数の因子、例えば、宿主、経済性、操作の容易性などに依存する。

いったん発現ベクターがクローニングされると、通常それを分析して、遺伝子が存在しそしていかなる修飾もなされてないことを確実にする。次いで、発現宿主を発現培地の中で成長させ、十分な時間か経過した後、細胞を溶解し、そしてタンパク質を分離する。ある場合において、タンパク質は比較的不溶性であり、したがって、種々の手段、例えば、遠心により細胞破片から分離することができる。純度に依存して、タンパク質はそのまま使用することができるか、あるいは不純物を抽出する種々の溶媒を使用する抽出によりさらに精製して、所望の生産物を不溶性の形態で残すことができる。

必要に応じて、希酸性溶液を使用してタンパク質を可溶化し、次いて透析によりタンパク質を沈澱させることができる。使用する条件は、生産する特定のタンパク質、その溶解度、汚染物質の性質、究極的用途などとともに変化する。

コラーゲン様ポリマーの小さいセグメント、例えば、１５〜３６アミノ酸を含む小さいペプチドを製造することができる。これらのセグメントは、適当な免疫原に接合させることによってハブテンとして使用することができ、そして生ずる免疫原をその配列に対して特異的な抗血清またはモノクローナル抗体の生産のために使用することができる。こうして、本発明のコラーゲン様ポリマーに特異的に結合する抗体を生産することができる。本発明のポリマーの溶解度に依存して、抗体を親和精製、ウェスタンプロット上のポリマーの同定、または新規な構造を生成するためのポリマーの非共有結合の架橋なとのために使用することができる。

本発明の組成物は、種々の用途、構造単位、薬物などの使用を見いだすことができる。本発明のコラーゲン様ポリマーは、材料、例えば、繊維、膜、フィルム、コーティング、ヒドロゲル、コロイド懸濁液および成形品の成形において、これらの材料に、および天然に見いだされる源または合成源からの種々の表面に、独特の特性を付与するときに育用であり、特性は通常水の吸収、生物適合性、または有機または無機の性質の非タンパク質化合物、例えば、ハロゲン化銀、色素などとの相互作用に関連する。１−１００ミルのコーティングは、天然に見いだされる源および合成源からの種々の表面への付着性をもって、使用を見いだすことができる。これらのポリマーの顕著な性質は、特定の温度における熱可逆的ゲル化、それらの固有の生物適合性およびそれらの生物吸収である。したがって、本発明のポリマーは写真フィルムにおいて、創傷の包帯として用途を見いだし、新生血管の形成、眼の応用、骨のセメント、人工器官のためにマトリックス、成長する培養物のためのコーティング、移植または注射可能なデリバリ−系などを可能とする。

さらに、天然のコラーゲンは架橋するので、消化および分子量の減少なしで、紡糸、造形などのために再溶解することができない。

こうして、コラーゲン様ポリマーは所望のコラーゲンの特性を保持し、そして処理することができる。

下記の実施例によって、本発明をさらに説明する。これらの実施例は本発明を限定しない。

実験高分子量のコラーゲン様タンパク質のポリマーの製造方法Ａ、小規模。プラスミドＤＮＡを１．５ｍｌの培養物から沸騰手順またはアルカリ性溶解法により調製した（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎ−ｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、コールド・スプリング・ハーバ−（１９８２）。

Ｂ、大規模。１リツトルの適当な抗生物質を含むルリア（Ｌｕｒｉａ）ブロス中で、プラスミドを有する菌株を一夜成長させた。細胞を１０、０ＯＯＸ　ｇ　テ５分間遠心し、そしてｌ０ｍ１の氷冷ＴＥ　（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ８，１ｍＭ　ＥＤＴＡ）の中に再懸濁させた。細胞を再び遠心し、４ｍｌのＴＢＳ（ＴＥおよび２５％Ｗ／Ｖ）の中に懸濁させ、そして渦形成によりホモジナイゼイションした。試料を次の工程のために氷上に保持した。リゾチーム（１０ｍｇ／ｍｌのＩ　ｍｌ）を細胞懸濁液に添加し、そして５分間インキュベー’ｉ　ａ　ンした後、２ｍｌノ０．５Ｍ　ＥＤＴＡ　ｐｌ（ｌ１１．ｏを添加した。

１０分間インキュベーションした後、５０ｍ１のブロティナーゼＫ　（４０ｍｇ／　ｍｌ　）を添加し、次いで１０分後１５ｍ１の溶解緩衝液（０，１％トリトンＸ−１００、ＩｍＭ　ＥＤＴＡ、　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　、　ｐｉ（８）を添加した。１５〜２０分後、細胞のリゼイトを３５．０ＯＯＸ　ｇ　ｌ：おいて９０−１２０分間遠心した。上澄み液（１９，８ｍ１）をプラスチック管に２０ｍｇのＣｓＣ１および４００μｍの臭化エチジウム（１０ｍｇ／　ｍｌ）とともに移した。溶解後、この混合物を２本のポリアロマ−超遠心機の管の中に分割して入れ、加熱密閉し、そしてベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）Ｔｉ６５モーターで６０、０００ｒｐｍにおいて２４時間遠心した。下のプラスミドＤＮＡのバンドを管から皮下注射針で取り出した。臭化エチジウムを等しい体積のＮａＣ１飽和イソプロパツールで３回抽出した。２体積の８２０をＤＮＡ溶液に添加し、次いでＤＮＡをエタノールで沈澱させた。

２　膜タンパク質化フェノール抽出を、便利な体積、典型的には１００μｍ〜１０ｍ１のＤＮＡ試料について実施した。ＤＮＡ試料を０．ＯＩＭ　ＴｒｉＳ−ｆ（ＣＩ　、　ｐＨ７，５，１ｍＭ　ＥＤＴＡの中に希釈し、そして等しい体積の水飽和フェノールを添加した。試料を短時間渦形成し、そして氷上に３分間配置した。マイクロフージ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）の中で３分間遠心した後、水性層を新しい管に取り出し、そして等しい体積のクロロホルム、イソアミルアルコール（２４：Ｉ）で１回抽出した。

３、　フェノール沈澱水性緩衝液中のＤＮＡをエタノール沈澱により濃縮した。　のＤＮＡ試料に、１／１０体積の３Ｍの酢酸ナトリウムｐＨ７，５および２〜３体積の冷いエタノールを添加した。このＤＮＡを３０分間−７０°Ｃにおいて、あるいは−夜−２０ °Ｃにおいて沈澱させ、次いでマイクロフージ中で４°Ｃにおいて１５分間遠心した。ペレットを２００μｍの冷い８０％エタノールで１回洗浄し、そして再び４℃において１０分間遠心した。空気乾燥または凍結乾燥後、ベレットを適当な緩衝液の中に再懸濁させた。

４、ＤＮＡのホスファターゼ処理Ａ、Ｉμｍ　（２５単位）の仔つシ腸ホスファターゼ（ベーリンガー・マンヘイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ））を制限酵素の消化反応に直接添加し、そして３７°Ｃにおいて３０分間インキユベーソヨンすることによって、ＤＮＡのホスファターゼ処理を実施した。ホスファターゼを６５°Ｃにおいて６０分間不活性化した後、フェノール抽出により膜タンパク質化した。

Ｂ、ＤＮＡのホスファターゼ処理を、また、制限酵素の消化からエタノール沈澱させたＤＮＡを２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　、　ｐＨ８，０、１０ｍＭ　ＭｇＣ１＊の中に２ｏｎｇ／ｍｌの最終ＤＮＡ濃度に再懸濁させることによって実施した。シュリンプのアルカリ性ホスフ了ターゼを２Ｕ／μｇのＤＮＡに添加し、そしてこの混合物を３７°Ｃにおいて１時間インキュベーションし、６５°Ｃにおいて２０分間不活性化し、次いで１２．　ＯＯＯＲＰＭにおいて３０分間遠心することによってプロバインド（Ｐｒｏｂｉｎｄ）フィルター（ミリボア（Ｍｉ　ｌ１ｉｐｏｒｅ））に通過させた。次いで、　ＤＮＡをエタノール沈澱させ、そして適当な緩衝液の中に再懸濁させた。

５、ＤＮＡのリン酸化アニーリング前のリン酸化を、ポリヌクレオチドキナーゼ３′−ホスファターゼ不含（ベーリンガー・マンヘイム）の使用により実施した。この反応は３７℃において３０分間次の成分を含有する５０μｍの反応体積の中で実施した：Ｉ２．５μｇのＤＮＡ、　５μｍの１０×キナーゼ緩衝液（０，５Ｍ　Ｔｒｉｓ　ｐ）１７．５、ｌ０ｍＭ　スペルミジン、０．１ｍＭ　ＭｇＣ１＊、１５０ｍＭ　ＤＴＴ、ＩｍＭ　ＥＤＴＡ）　、および２ｕｌのポリヌクレオチドキナーゼ（ＩＯｕ／μｍ）。リン酸化後、ＴＥＡＢ中で平衡化したバイオ−スピン（Ｂｉｏ−３ｐｉｎ）　６カラム（バイオラド（ＢｉｏＲａｄ））を使用して、ＤＮＡ鎖から塩類およびグリセロールを除去した。

６、ＤＮＡポリメラーゼ１とのフィルイン反応５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ＳｐＨ７，４，５０ｍＭ　ＫＣＩ　１５ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、および４００ｍＭの４つのデオキシヌクレオチドトリホスファターゼを含有する緩衝液の中に、ＤＮＡを再懸濁させた。ＩＯ単位のクレノーＤＮＡポリメラーゼ（ＢＲＬ）を添加し、そしてこの反応を室温において１５分間進行させた。次いて、　ＤＮＡをフェノール抽出しそしてエタノール沈澱させた。

７、　制限エンドヌクレアーゼを使用する消化（ｘ　ｒＡＡ１緩衝液（ＩＯＸＡＡ緩衝液は３３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−アセテート、ｐ）１７．９．６６０ｍＭ　リン酸カリウム、　１００ｍＭ　酢酸マグネシウム、５０ｍＭ　ジチオスレイトール（ＤＴＴ）およびＩｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ヌクレアーゼ不含）〕中で、ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥＮ）で消化した。可能なときはいっでも、ＤＮＡの濃度をｌμｇ／２５μｍ以下に保持した。インキュベーションは３７°Ｃにおいて大部分の制限エンドヌクレアーゼについて１〜４時間の間実施したが、ただしＢａ１ｌ、　Ｂａｎ＋およびＮａｅｌの消化物は一夜インキユベーションした。

８、ＤＮＡの分析用アガロースゲルの電気泳動ゲル分析のためのＤＮＡ試料に、０．２体積の負荷緩衝液（５×電気泳動緩衝液、Ｏ，０Ｉ９６プロモフ工ノール色素、５０ｍＭ　ＥＤＴＡ、および５０％グリセロール）を添加した。次いて、試料を１．０％　（ｗ／ｖ）アガロースゲルを含有する水平の浸漬電気泳動単位のレーンの中に負荷した。電気泳動緩衝液はＩＸＴＡｃまたは１／２ＸＴＢＥであった。

ＩＸＴＡＣは、酢酸でｐＨ７，８に調節した、４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ＝塩基、ＩＯｍＭＥＤＴＡてあった。Ｉ／２ＸＴＢＥは、０．０４５Ｍ　Ｔｒｉｓ＝塩基、０．０４５Ｍホウ酸であった。ゲルを４０〜５０Ｖにおいて１８時間の間展開し、次いて取り出し、そして０．５ｇ／ｍｌの臭化エチジウムで３０分間染色した。

ＤＮＡのバンドを長波長の紫外線トランスイルミネーター上で可視化した。

９、　調製用アガロースゲルの電気泳動手順および材料は、分析用アガロースゲルの電気泳動についてと同一であった。唯一の差は、精製すべきＤＮＡ断片のサイズに依存して０．５〜２．５９６　（ｗ／　ｖ　）の濃度範囲の低融点（［、ＭＰ）のアガロースの使用することである。臭化エチジウムで可視化した後、ＬＭＰアガロースゲルからＤＮＡ制限断片を切除した。アガロースのライゲーションのために、使用した緩衝液はｌ　ｘＴＡＥ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓアセテート）ＤＮＡを含有するゲル断片を７０°Ｃにおいて５分間溶融し、そしてＴＥＩ（ＩＯｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ’、　ｐＨ７，５，０，２Ｍ　ＮａＣ１）てほぼ５倍に希釈した。ゲル溶液をＮＡＣＳカラム（ＢＲＬ）に適用した。このカラムを５ｍｌの同一緩衝液で洗浄した。結合したＤＮＡを＋０００ｂｐより小さいＤＮＡ断片について３００μＩのＴｅ３（ｌｏｍＭ　Ｔｒｉｓ−１１ｃＩ　、　ｐＨ７，５，１，ＯＭ　ＮａＣ１）て溶離するか、あるいはより大きい断片についてＴｅ３（ＩＯｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌ　、ｐｏ　７．５．２　Ｍ　ＮａＣ１）で溶離した。溶離したＤＮＡをエタノール沈澱により濃縮した。

Ｉｌ、ＤＮＡのライゲーノヨン粘着末端を結合するための反応混合物は次の成分を含有した：２０μｍの最終反応体積で１８ｇのＤＮＡ、ＩＸＡＡ緩衝液（上の工程６を参照）　ＩｍＭ　ＡＴＰおよび２０単位のＴ４　ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ）　、ライゲーションを１５ °Ｃにおいて１６〜１８時間または室温において１〜２時間進行させた。平滑末端のライゲーションのために、反応混合物は２０μｍの反応体積てｌｕｇＤＮＡ、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　、　ｐｉ（７，５，５ｍＭＭｇＣ１２，５ｍＭ　ＤＴＴ　、０．２５ｍＭ　スペルミジン、　２００ｎｇ　ＢＳＡ、ｌ　ｍＭ塩化へキサミンコバルト（ＨＣＣ）、０．５Ｍ　ＡＴＰおよび４００単位のＴ４　ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を含有した。ライゲーションは室温において３０分〜１時間の間進行させた。

１２、アガロースＤＮＡライゲーションアガロースを６５℃において溶融し、次いて室温を３７°Ｃに低下させ、そしてライゲーション緩衝液（５Ｘ＝　ｌ００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　、　ｐ）ｌ　７．５．５０ｍＭ　ＭｇＣＬ、５０ｍＭ　ＤＴＴ、１　ｍＭ　ＡＴＰ）を添加した１次いで管を室温に配置し、そしてリガーゼを添加しく１００単位の７４　ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）、反応体積は通常５０μｌてあった。反応を１５°Ｃにおいて１６〜１８時間イされている変更された手順を使用して、ｍＲＮＡを調製した。カナマイラン（５０ｇｇ／ｍｌ）を補充したＬＢ培地中で、細胞を３０°Ｃまたは４２°Ｃにおいて成長させた。

ＯＤ＠。。１．０において１０ｍ１の細胞を回転し、そして細胞のペレットを１０ｍ１のプロトプラスト化緩衝液（１５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　、　ｐＨ８，０，０，４５Ｍ　スクロース、８　ｍＭ　ＥＤＴＡ）の中に再懸濁させた。８０ μｍのリゾチームを５０ｍｇ／ｍｌにおいて添加し、次いてこの混合物を氷上で１５分間インキユベーソヨンした。細胞懸濁液をＲＣ−５Ｂ遠心機を使用してＳＳ　−３４０−ターの中で７．　ＯＯＯＲＰＭで回転した。

ペレットを０．５ｍｌの溶解緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ｔｌｃＩ　、　ｐｔｌ　８．０、Ｉ　Ｏｍ！ＪＮａＣ１、ＩｍＭ　クエン酸ナトリウム、　１．５％ｗ／ｖ　５ＤＳ）および１５μｍのＤＥＰＣの中に再懸濁させた。この懸濁液をおだやかに混合し、次いて１．５ｍｌのエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）管に移し、３７℃において５分間インキュベーションし、次いて氷上に冷却した。２５０μｍ飽和ＮａＣ１（４０％ｗ　／　ｖ　）を添加し、おだやかに混合し、そして氷上のインキュベーションをさらに１０分延長した。このスラリーを４ °Ｃにおいて１５分間回転した。上澄み液を２本の１．５ｍｌの管に入れ、そして１ｍｌの１００９６エタノールを各々に添加した。ＲＮＡを冷時沈澱させ、次いて４°Ｃにおいて２００分間回転せた。ペレットを７０％エタノール中で洗浄し、そして乾燥させた。次いてＲＮＡを０．１ｍｌの８．０の中に再懸濁させ、そして０Ｄ２６゜および０Ｄ２１０を採取してＲＮＡの回収および純度を測定した。１０ｍ１の成長する細胞からの合計のＲＮＡ（５％ｍＲＮＡ、　９５９４　ｔＲＮＡ＋　ｒＲＮＡ）の平均の回収は０．５〜１．ｏｍｇであった。

２、　ノザンプロット分析前述したように精製したＲＮＡをアガロースゲル上で展開させ、そしてＭａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、コールド・スプリング＋ハーバ−（＋９８２）、１）ｌ）　２０２−２０３に記載されている手順に従い、転移緩衝液として１０×ＳＳＣを使用して、ニトロセルロースに移した。ＥＣＬ遺伝子検出キット（アマーンヤム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））を、プローブの標識化、ハイブリダイゼーション条件および検出のために使用した。これらの手順は次の文献に記載するように実施した：　ＥＣＬ遺伝子検出システムＲＰＮ２１０１、バージョン２、アマ−ジャム・インターナショナル（ＡｍｅｒｓｈａｍＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）ｐｃｌ　。

２００ｍ１の無菌のしブロスの培養物を、小１白金耳の大腸菌（ε、ｃｏｌｉ）細胞とインキユベーシヨンした。これを農場しなから３７°Ｃにおいて、ＯＤ、。。かほぼ０．５なるまて、インキュベーションした。培養物を氷上に１０分間配置し、そして６．ＱＯＯＸｇを１０分間遠心した。細胞ペレットを１００ｍ１の氷冷０．１Ｍ　ＭｇＣＩｔの中に再懸濁させ、氷上に３０〜４０分間保持し、そして再び遠心した。ペレットを氷冷１００ｍＭ　ＣａＣＬの中に再懸濁させ、無菌の試験管に移し、そして氷上で２４時間インキユヘーションした。次いて、能力細胞のアリコートを取り、そして−７０°Ｃにおいて貯蔵した。

Ｚ　大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）の形質転換凍結した能力細胞ｎｏアリコートを氷上で融解した。５０μｍの細胞に、０．１〜１μｇのＤＮＡを添加し、そしてこの混合物を氷上で３０分間インキユペーンヨンした。管を氷から取り出し、そして４２°Ｃの浴に２分間入れた。Ｌブロス（Ｉ　ｍｌ）を添加し、そして形質転換混合物を農場しながら所望の温度（通常３０″Ｃまたは３７°Ｃ）において２時間インキュベーションした。次いで、形質転換体の１／１０を適当な抗生物質をＬブロス上にプレートしそして、必要なときに、ＸＧＡＬおよびＩＰＴＧを添加した。

配列の合成ペプチドを、免疫原として使用するためにキーホールリンペットヘモシアニンにカップリングした。この物質をウサギの中で抗体を調製するために、アンチボディーズ・インコーホレーテッド（Ａｎｔ　１ｂｏｄｉｅｓ、　Ｉｎｃ、　）に送った。完全フロインドアジュバント中のｉｎ＋ｇ／ｍｌの濃度でペプチド接合体を第０日に使用して、ウサギを免疫化した。動物にフロインド不完全アジュバントを第３０日に再注射し、そして第６０日に力価決定した。抗原として合成ペプチドを使用するマイクロタイターＲＩＡにより、陽性の血清を検出した。

Ｋａｇｅ口およびＧ１１ｃｋ（１９７９）　、ラジオイムノアッセイの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｒａｄｉｏ−ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ＪａｆｆｅおよびＢｅｒｍａｎ　（福）　、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、ｐ、３２８゜ＤＣＰ　ＩおよびＤＣＰ２配列の合成ペプチドと反応する抗血清が得られた。

前述の手順に従い、配列（ＧＡＰＧＰＡＧＰＰＧＳＲＧＤＰＧＰＰ）　２　（ＤＣＰ−（ＡＢ）　ｔ”）を有する追加のペプチドを合成し、これをまた免疫原として使用するためにキーホールリンペットヘモシアニンｎｉカップリングした。

次いて、ポリクローナル抗血清を前述したように調製し、これはＤＣＰ３配列の合成ペプチドに結合した。

前述の手順に従い、配列（ＧＡＰＧＡＰＧＳＱＧＡＰＧＬＱ）　２ＹＭＫを有する追加のペプチドを合成し、これをまた免疫原として使用するためにキーホールリンベットヘモシアニンにカップリングした。次いで、ポリクローナル抗血清を前述したように調製し、これはＣＬＰ３．１配列の合成ペプチドに結合した。

Ｚ　タンパク質のポリアクリルアミドゲルの電気泳動成長する培養物からのほぼ１０’の大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）細胞を、１０．０００×ｇで５分間の遠心により沈降させた。細胞ペレットを１００−１５０μｍの２×試料緩衝液（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１（ＣＩ　、　ｐＨ６，８，４％ＳＤＳ、　１０９６β−メルカプトエタノール、６０％グリセロールまたはスクロース）の中に再懸濁させ、そしてチクマー（Ｔｅｋｍａｒ）超音波崩壊器を使用して３０秒間超音波処理した。試料をほぼ５分間沸騰させ、そして２０〜１００μｌのリゼイトを５ＯＳ−ポリアクリルアミドゲル（７，５〜１６％Ｗ／　ｖ　）上に負荷した。ゲルをＬａｅｍｍｌｉ（Ｎａｔｕｒｅ、　２７　：　８Ｏ−６８５（１９７０））の手順に従い調製した。ゲルの中のタンパク質を１０％メタノール、７．５％酢酸中で２％クーマツシー・ブリリアント・ブルーで１時間染色し、そして１０％メタノール、７．５％酢酸中で一夜脱染した。

３、　タンパク質の発現の分析３０°Ｃにおいて成長させた一夜の培養物を使用して、２５０ｍ１のフラスコ中に含有された５０ｍ１のＬＢ培地を接種した。カナマイシンを５０ｐｇ／ｍｌの最終濃度で添加し、そして培養物を３０°Ｃにおいて撹拌（２００ｒｐｍ）　Ｌ、なからインキュベーションした。培養物がＯＤ・ｏｏに到達したとき、４０ｍ１を４２°Ｃに前項て加温した新しいフラスコに移し、そして同一温度においてほぼ２時間インキュベーションした。培養物（３０°Ｃおよび４２°Ｃ）を氷上で冷却し、そして００．。。を取った。細胞を遠心により集め、次いで１．０の００．。。のアリコートに分割し、そして適当な抗体を使用するウェスタン分析を実施するために使用した。

４、　ゲル中のタンパク質のイムノブロッティングタンパク質の電気泳動後、フランキングガラス板をポリアクリルアミドゲルから取り出した。ゲル表面を転移緩衝液（２ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ、１９２ｍＭ　グリシン、２０％メタノール）で湿らした。１片のニトロセルロース紙（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、５Ｍ１１３０７）を転移緩衝液で飽和させ、そしてゲルの上に横たえた。フィルターとゲルとの間の気泡を除去した。ゲルおよびニトロセルロースのフィルターを、製造業者（バイオ−ラド）により特定する転移ユニットの中に入れた。転移を２００ｍＡにおいて３〜４時間進行させた。次いで、ニトロセルロースのフィルターを取り出し、そしてアミド−シュワルツ（Ａｍｉｄｏ　−Ｓｃｈ−ｗａｒｔｚ）で３分間染色しく０．０５％アミド（Ａｍｉｄｏ）ブラック、４５％脱イオンＨ，０１４５９６メタノール、１０％酢酸）そしてＨ，０中で脱染した。

フィルターをｒＢＩ、０ＴＴＯＪ　（５％ｗ／ｖ脱脂ドライミルク、Ｔｒｉｓ　 −ＨＣＩ、ｐＨ７，４，０，９％ｗ／　ｖ　ＮａＣｌ、０．２％ｗ／ｖアジ化ナトリウム）中で室温において少なくとも１０分間インキュベーションした。フィルターを０．５×プロツト（Ｂｌｏｔｔｏ）（２，５％脱脂ドライミルク、Ｔｒｉｓ−ＭＣＩ、ｐＨ７，４，０，９％ｗ／ｖ　ＮａＣｌ、０．２％ｗ／ｖアジ化ナトリウム）中で適当に希釈した（１：５０〜Ｉ：５００）血清の中に入れ、そして室温においてほぼ１６時間おだやかに撹拌した。フィルターを１時間５回交換のＴＳＡ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　、　ｐＨ７，４，０，９％　ＮａＣ１，０，２％アジ化ナトリウム）で洗浄した。プロットをＩ　Ｘ　ＩＯ７ｃｐｍの１２１１−プロティン八を含有する１５ｍ１のＢＬＯＴＴＯ溶液の中に入れ、そして室温にお（Ｘで２時間おだやかに撹拌した。フィルターを最小量の７回交換のＴＳＡで２時間洗浄し、脱イオンＨ２０で１回すすぎ、そして空気乾燥した。プロットをサランラップで覆い、そしてオートラジオグラフアミノ酸組成をＨｅｎｔｉＣｋＳＯｎおよびＭｅｒｅｄｉｔｈ（＋９８４）のＰＴＣ誘導手順により決定した。タンパク質試料を、５．７Ｎの一定に沸騰するＨＣＩて１０８°Ｃにおいて２４時間の間真空中で加水分解した。ＰＩＴＣとの反応後、移動塩基としてＯ，ＩＭ　ＮＨ，ＯＡｃ　ｐＨ６，７８中の０〜５０％（７）７セトニトリルの直線の勾配でウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）＋００Ｅ系およびスペルコ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）ＣＩ８カラムの１（ＰＬＣ逆相クロマトグラフィーにより、アミノ酸誘導体を２５４μｍにおいて検出した。）ｌｅｎｔｉｃｋｓｏｎ、　Ｒ，Ｌ、およびＭｅｒｅｄｉｔｈ、　Ｓ、　Ｃ，（１９８４）逆相高性能液体クロマトグラフィーによりア製造業者により提供される標準の対称無水物化学を使用するアプライド・バイオシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）４３０Ａ型ペプチド合成装置上の固相合成により、合成ペプチドを製造した。各段階におけるカップリング収量を、５ａｒｉｎら（１９８１）の定量的ニンヒドリン法により決定した。合成ペプチドを固体の支持体から切断し、そしてアミノ酸ブロッキング基を無水ＨＰにより除去した（ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ、（１９８４））　、粗製のペプチドをセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−５０のクロマトグラフィーにより脱塩した。　５ａｒｉｎ、Ｖ、に、、Ｋｅｎｔ。

ラド合成（Ｓｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ）　、Ｐｉｅｒｃｅ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ　６イリノイ州ａ−）クツオード、１３ｐ、　８５−８９゜Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト、調節した孔のガラスカラムおよびすべての合成試薬は、アプライド・バイオシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、カリフォルニア州フォスターシティ−から入手した。アプライド・バイオシステニス３８１Ａ型ＤＮＡ合成装置により１０倍過剰の保護されたホスホルアミダイトおよび合成支持体力ラムに結合した１μＭのヌクレオチドを使用するホスファイトトリエステル法により、合成オリゴヌクレオチドを製造した。合成に使用した化学は、合成装置とともに使用するために推奨された標準プロトコールであり、そして記載されている（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら、Ｊ、　Ａｍｅｒ。

Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、１０３：３１８５−３３１９（１９８１））。脱保護および固体の支持２４・　２４５−２４８（＋９８３）に記載されている標準の手順に従い実施した。

アプライド・バイオシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（１９８４）により推奨されるように除去された保護基の光学密度により測定した反復収率は、９７．５％より大きかった。粗製のオリゴヌクレオチドの混合物を、１９８４年１１月９日のアプライド・バイオシステムスのプロトコール（Ｕｓｅｒ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　Ｎｏ、　１３）に記載されている調製用ゲル電気泳動により精製した。アクリルアミドゲルの濃度は、オリゴマーの長さに依存して１０〜２０％の間で変化した。精製したオリゴマーを紫外線シャドウィングにより同定し、ゲルから切除し、そして粉砕およびソーク手順により抽出した（Ｓｍｉｔｈ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、６５３７１−３７９（＋９８０））。

２、ＤＮＡの配列決定ＤＮＡ配列は次の文献に記載されている方法により決定した・ＭａｎＬａｔｉｓら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｃｌ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　ｔ、ａｂｏｒａｔｏｒｙ　、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク；　Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ　ら、Ｇｅｎｅ（１９８３）２６：　＋０１−１０６　；Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７４：５４６３−５４６７：Ｂｉｇｇｉｎら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８０：３９６３−３９６５；およびＳａｎｇｅｒら、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ。

８７：　１０７−１１０゜問題の範囲を含有する断片をＭ１３ｍｐ＋８またはＭＩ３ｍｐ１９の多重クローニング部位の中にクローニングした（Ｍａｎｉａｔｉｓら、（１９８２）およびＮｏｒｒａｎｄｅｒら、（１９８３））　、−木組ＤＮＡを調製し、そしてプライマー伸長法（Ｓａｎｇｅｒら、（＋９７７）およびＢｉｇｇｉｎら、（１９８３））により標識として″６Ｓ−デオキシアデノンン５′−（アルファーチオ） −トリホスフェートにニュー・イングランド・ニュークリアー（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａ、ｒ））を使用して配列決定した。ある場合において、逆転写酵素（モレキュラー・ジェネティクス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ））を使用して、Ｚａｇｕｒｓｋｙら（Ｇｅｎｅ　Ａｎａｌ、　Ｔｅｃｈ、　（１９８５）　２　：　８９−９４）により利用されたジデオキシ・デオキシヌクレオシドトリホスフェート比においてプライマーを伸長した。′！Ｐまたは ”Ｓｄｅ標識化したデオキシアデノランをこれらの反応において使用した。いくつかのＧ−Ｃに富んだ配列の中に出現する圧縮人工物は、デオキシグアノシントリホスフェートをＧ反応から排除し、そしてデオキシイノシントリホスフェート（Ｐ−Ｌバイオケミカルス）を代わりに３７．５μＭの濃度で使用することによって克服された。他の混合物において、Ｇ反応におけるジデオキシＧＴＰの濃度は０．５ｍＭであった。すべての配列は８Ｍの尿素を含有する６または８％のポリアクリルアミドゲル上で展開された（　Ｓａｎｇｅｒら、（＋９７８））。配列のために使用したプライマーはＰ−Ｌバイオケミカルスから購入した。

３、二本鎖プラスミドＤＮＡのジデオキシＤＮＡ配列の決定プラスミドＤＮＡを前に記載されたように調製した（大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）からのプラスミドＤＮＡの調製、小規模、Ｍａｎｉａｔｉｓら）。プライマーを前述したようにＤＮＡ合成装置を使用して合成し、そしてＭ＋３の配列について前述した手順に従いプラスミドＤＮＡにアニーリングした。

配列決定の手順はセクエナーゼ（ＳｅｑｕｅｎａｓｅＸユナイテッド・スティン・バイオケミカルス（ＩＪｎｉｔｅｓ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））を使用して実施し、そして条件は供給業者により推奨されるものであった。すべての配列を前述したようにポリアクリルアミドゲル上で展開した。

実施例２ＤＣＰｌ、２および３の構造ＤＣＰＩ　（ＣｚＡｔ４Ｃ２）４ＤＣＰ２　（Ｃ，Ａ、、Ｃ，）。

ＤＣＰ３　（Ｃ２（ＡＢ）＋ｚＣｔ）４ここでＡ　＝　ＧＡＰＧＰＡＧＰＰＢ　＝ＧＳＲＧＤＰＧＰＰＣ＝　ＧＡＨＧＰＡＧＰＫＤＮＡのデザインＤＣＰポリマーの構造か複雑であるために、遺伝子モノマーのデザインは次の通りであったコ１、Ｃｔ単位のデザインおよび合成（５′および３′）２、Ａ単位のデザインおよび合成３、ＡＢ単位のデザインおよび合成プラスミドｐＰＴＯ１３４の構成アクセプターベクターＰＰＴＯＩ３４をデザインし、そしてＤＣＰポリマーの遺伝子の構成要件を入れるように特別に構成した。このベクターはそのＭＣ５（多重クローニング部位）の中に−Ｆｏｋｌ　ＲＥＮのための２つの認識部位を含有する。

これらの部位を含有する２つのポリヌクレオチド鎖を、実施例１に記載するように合成しそして精製した。

０−ＡＩ　Ｓ’　−ＧＴＣＣＴＧＣＣＧＡτＧＣＴＣにＡＧＡＴＧＧＴＧＣＡＴＧＣＡＴにＴＡＣＡＴＣＣＧＡＧＴＡＣＴＴＣＧＡＴＯ＋Ｂｌ　３’　−ＡＣＧＣＣＴＡＣＣＡＧＣ丁ＣＴＡＣＣ八ＣＧＴＡＣＧＴＡＣＡへＧτＡＧＧＣＴＣＡＴＧＡＡＣＣ丁Ａアニーリング後、ＢＥＬｎｌ　ＲＥＮおよびＥｃｏＲＶ　ＲＥＮで消化したｐＳＹ９３７（特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ８７１０２８２２号を参照のこと）と、２つのオリゴヌクレオチド鎖を結合した。ライゲーション混合物の生成物を大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）の中にクローニングし、そして抗生物質のクロランフェニコールを含有する細菌のプレート上で選択した。個々のコロニーからのプラスミドＤＮＡを、５ｃａｌ　ＲＥＮおよび５ｔｕｌ　ＲＥＮで消化した後、アガロースゲルの電気泳動上で分析した。１つのプラスミドｐＰＴＯ］２４は　待したＤＮＡ断片を含有した。

次いて、新しいＭＣ３はｐｓＹ１３６７に動いた。このプラスミドはｐｓＹ１２９９の誘導体である（特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ８７１０２８２２号を参照のこと）。

プラスミドＩ）ＳＹＩ２９９をＮｃｉｌ　ＲＥＮで消化し、そして大きいＤＮＡ断片をアガロースゲルの電気泳動およびＮＡＣＳ精製により精製した。精製したＤＮＡ断片をＤＮＡポリメラーゼで処理しく実施例１参照）、結合し、次いでＦｏｋｌで消化した後、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）株ＨＢＩＯＩの中で形質転換した。単一のコロニーからのプラスミドＤＮＡを精製し、そして制限消化により分析した。１つのプラスミドｐｓＹ１３６６は正しく、２つのポリヌクレオチド鎖を、実施例１に記載するように合成しそして精製した。

１Ｂａｎｉｌｌ　Ｆｏｋ１１＋＾ｌ　５’　−ＣＴＡＣＡＴＧＴＧＴ丁ＡＣＡＣＡＴＣＣＣＧＴＧＣ１、！ｊｌ　３’　−ＣＣＣＡＧＡＴにＴＡＣＡＣＡＡＴｃＴＧＴＡＧＣにＣＡＣＣオリゴヌクレオチドｊ１１．Ａおよび１．　Ｂをアニーリングし、モしてＢａｎ１ｌ　ＲＥＮおよびコＩ　ＲＥＮで消化したプラスミドｐｓＹ１３６６と結合した。このライゲーション反応の生成物を大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）株ＨＢＩＯＩの中に形質転換した。形質転換されたクローンからのプラスミドＤＮＡを精製し、そしてＦｏｋｌで消化した。Ｐｏｋｌで線状化されたクローンを配列決定した。プラスミドｐｓＹ１３６７は所望のＭＣＳ配列を含有し、そして引き続く構成のために選択した。

プラスミドｐＰＴＯ１２４およびｐｓＹ１３６７をＮｒｕｌおよびＮｃｏｌで消化し、そしてＤＮＡ断片をアガロースゲルの電気泳動およびＮＡＣＳ精製により精製した。ｐＰＴ０１２４からの小さい断片（はぼ５００ｂｐ）をｐｓＹ１３６７からの大きい断片と結合した。ライゲーション混合物の生成物を大腸菌（Ｂ、ｃｏｌｉ）の中に形質転換した。単一のコロニーからのプラスミドＤＮＡを精製し、そして制限消化およびＤＮＡ配列決定により分析した。１つのプラスミドｐＰＴＯ１３４は所望の配列を含有し、そしてＤＣＰ構成のためにアクセプターベクターとして使用した。

Ｃ単位の合成およびアセンブリー４つのオリゴヌクレオチド鎖を実施例１におけるように合成しそして精製した。

オリゴヌクレオチド鎖の各対は、Ｃ２単位、５′または３′Ｃ２単位をエンコードする。

２−Ａｔ　５′　−ａｒｃｃｒｃｈｃｃｃｃｃｃｘａｃＡｃｃｘｃｃｃＡ）ｃ、ｃｃｃｃｃａｃＡＴａａｃｃｃｘｃｃｈｃｃｃｃｃｃ入ＡＡオリゴヌクレオチド１１１２．Ａおよび２．　Ｂをアニーリングし、モしてＰｏｋ　ｌで消化したプラスミドｐＰＴＯ１３４のＤＮＡと結合した。このライゲーション生成物を大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）株ＨＢＩＯＩの中に形質転換した。形質転換されたコロニーからのプラスミドＤＮＡを精製し、そして５ｆｉｌで消化した。５ｆｉｌで線状化したコロニーを配列決定した。

プラスミドｐＰＴＯ１３５は所望のＣ１配列を含有し、そして引き続く構成のために選択した。

鎖２．Ｃおよび２．　Ｄを、４１２．　Ａおよび２．　Ｂにおけるように、アニーリングし、結合し、そして形質転換した。形質転換されたコロニーからのプラスミドＤＮＡを精製し、そしてＢａｎ１ｌ　ＲＥＮで消化した。Ｂａｎ　ｌ　ｌで線状化したクローンを配列決定した。プラスミドｐｐ’ｒ。

１３７およびｐＰＴＯ１３８は正しいＣ，ＤＮＡ配列を含有した。

プラスミドｐＰＴＯ１３５およびｐＰＴＯ１３７を」肪Ｉ　ＲＥＮおよび」座Ｉ　ＲＢＮで消化した。Ｃ１（鎖Ａ＋Ｂ）を含有するｐＰＴＯ１３５からの大きい断片を、Ｃ６断片（鎖Ｃ＋Ｄ）を含有するｐＰＴＯ１３７の小さい断片と結合した。ライゲーション生成物を大腸菌（Ｅ、　ＣＯＩ　ｉ）株ＨＢＩＯＩの中に形質転換した。形質転換体からのプラスミドＤＮＡを精製し、そして２つの消化、それぞれ、−シリ−Ｉ　５ｔｕｌ　ＲＥＮおよび一謀頭１−　Ｓ剋Ｉ　ＲＥＮを実施した。両者の消化においてほぼ５ｏｏｂｐのＤＮＡ断片を解放するクローンを配列決定した。プラスミドｐＰＴＯ１４０は、表２に示すように、正しいＣ＝Ｃｔ配列を含有し、そしてＤＣＰ遺伝子モノマーの構成のために使用した。

表２ＧＡＨＧＰＡＣ，ＰＫＧＡＨＣＰＡＧＰＫＧＧＴＧＣＣＣＡＴＧＧＣＣＣＡＧ　ＣＭ；Ｇ　ＡＣＣＧｋＭＧＣＡＣＣＴＣＡＣＣＣＴＣＣＣＧＣＡ（ｉＧＴＣＣＣ：ＡＡＡＣＣｋＣＧＧＧＴＡＣＣＧＣ；ＧＴＣＧＴＣＣＴＧＣ；ＣＴＴＴＣＣＴＣＧＡＧＴＧＣＣＡＧＧＣＣＧＴＣＣＡＣＧＣＴＴＴＯｋＨＧＰＡＧＰ１’、ＧＡＨＣ；ＰＡＧＰＫＤＣＰＩおよび２遺伝子モノマーの構成２つのポリヌクレオチド鎖を、実施例Ｉに記載するように合成しそして精製した。

Ａ、をエンコードする２つのオリゴヌクレオチド鎖（３Ａおよび３Ｂ）をアニーリングし、そしてＦｏｋｌ　ＲＥＮで前以て消化したプラスミドＤＮＡ　ｐＰＴＯ１３４と結合した。ライゲーション混合物の生成物を大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）株）ＩＢＩＯＩの中に形質転換した。形質転換体からのプラスミドＤＮＡをＰｓｔｌ　ＲＥＮで消化し、そして線状化されたクローンを配列決定した。プラスミドｐＰＴＯ１４２は正しいことが発見され、そしてＡ、単位のマルチマー化のために使用した。

ｐＰＴＯ１４２からのプラスミドＤＮＡをＦｏｋｌ　ＲＩＥＮで消化し、モしてＡ。

単位を含有する断片をアガロースゲルの電気泳動により分離し、そしてＮＡＣＳカラムを使用して精製した（実施例１参照）。ＤＮＡ断片を自己結合し、そしてライゲーション生成物をＦｏｋｌ　ＲＥＮで前以て消化したｐＰＴＯ１３４と結合した。ライゲーション混合物の生成物を大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）株ＨＢＩＯＩの中に形質転換した。形質転換体からのプラスミドＤＮＡを精製し、そしてＦｏｋｌ　ＲＥＮで消化した。Ａ、に相当する１６２ｂｐのＤＮＡインサートを含有するクローンを配列分析のために選択した。プラスミド吐ＴＯ１４４は期待するＤＮＡ配列を含有し、そして引き続く構成のために選択した。ｐＰＴＯ１４４からのプラスミドＤＮＡをＦｏｋｌ　ＲＥＮで消化し、そして消化により発生した２つのＤＮＡ断片をアガロースゲルの電気泳動により分割した。より小さいＤＮＡ断片をＮＡＣＳカラムにより精製した（実施例Ｉ参照）。Ａ、コーディング配列を有するＤＮＡ断片を、前以てＦｏｋｌで消化したプラスミドＤＮＡｐＰＴＯ１４０と結合した。ライゲーション生成物を大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）株ＨＢＩＯＩの中に形質転換した。個々のコロニーからのプラスミドＤＮＡを、Ｆｏｋｌで消化することによって、多重Ａ　、　ＤＮＡ断片を含有するインサートについて分析した。Ａ６〜Ａ□の範囲のいくつかのサイズのインサートが見いだされた。１つのクローンｐＰＴＯ１４７（表３に示す）は所望のＤＣＰ２遺伝子モノマー配列ＣｌＡｌＩＣ！を含有することが同定され、そしてこれをそれ以上の構成のために使用した。

ＤＣＰＩポリマー遺伝子を構成するために必要である、ＤＣＰ　ｌ遺伝子モノマー配列Ｃ２Ａ□Ｃ１を含有するクローン（表４参照）は、引き続く継代の間に高度に不安定であることが発見された。この不安定性は、アクセプタープラスミドの高いコピー数に帰属された。この理由で、このプラスミドからの遺伝子モノマーをｐＢＲ３２２の中に再クローニングした（Ｆ、　Ｂｏｌ　１ｖａｒら、（＋９７７）Ｇｅｎｅ、２　：９５−１１３）。Ｃ＊Ａｘ４Ｃｔ遺伝子断片を含有するプラスミドＤＮＡをプラスミドから−Ｎｒｕｌ　ＲＥＮおよびＥｃｏＲＶ　ＲＥＮを使用する消化、アガロースゲルの電気泳動により分離し、そしてＮＡＣＳカラムで精製した。このＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＶ　ＲＥＮおよびＮｒｕｌ　ＲＥＮて消化したプラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡと結合した〈実施例１におけるアガロースのライゲーションを参照のこと）。このライゲーション生成物を大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌ　ｉ）株ＨＢＩＯＩの中に形質転換し、そして１００μｇ／ｍｌの抗生物質アンピシリンを含有する細菌のプレート上で選択した。個々のコロニーからのプラスミドＤＮＡをアガロースゲルの電気泳動により分析した。インサートを含有するするクローンをいくつかのＲＥＮを使用する消化により分析し、そして１つのｐＰＴＯ１５３をＤＣＰ＋ポリマー遺伝子の構成のために選択した。このプラスミドは安定であった。

表３Ｇ　Ａ　ＨＧ　Ｐ　Ａ　Ｇ、Ｐ　Ｋ　Ｇ　八　ＨＧＰＡＧＰＫＣＣＡＣＧＧＧＴＡＣＣＧＧＧＴＣＧＴＣＣＴにＧＣＴＴＴＣＣＴＣＧＡＧＴＧＣＣＡＧＧＣＣＧＴＣＣＡＧＧＣＴＴＴＧＡ）ＩＧＰＡＧＰＫＧＡＨＧＰＡＧＰＫＧ［；ＴＧＣＴＣＡＣＧＧＣＣＣＡＧＣＡＧにＴＣＣＧＪＩＪＩＧＧＧＣＧＣＣ；ＣＡＴＧＧＣＣＣＡＧＣへＧＣ：ＣＣＣＧｋ入ＡＣＣＡＣＧＡＧＴＣＣＣＧＧＧＴＣＣＴＣＣＡにＣＣＴτＣＣＣＣ，ＣＧＣＣＴＡＣＣＧＧ（、ＴＣＧＴＣＣＧＣ，ＧＣＴＴ丁ＧＡＭＧＰＡＧＰＫＧＡ）ＩＧＰＡにＰＫＧＣ，ＴＣ，ＣＣＣＡＴＣ，ＣＣＣＣＡＧＣ八ＣＧＡＣＣへ八八ＡＣＧＡへへＴＣＡＣＧＧＴＣＣＧＧＣＡＣＣＴＣＣＣ入ＡＡＣＣＡＣ（：ＣＧＴＡＣＣＧＧＣＴＣＧＴＣＣτＧｆｌ：ＣＴＴＴＣＣＴＣ（１；ＡＧＴＧＣＣＭ：ＧＣＣＧＴＣＣＡＧＧＣＴＴＴＧＡＨＧＰＡＧＰＫＧＡＨＧＰＡＧＰＫＤＣＰ　ｌポリマー遺伝子の構成りＮＡ　ｐＰＴＯ１５３からのプラスミドをＡｃｙ　＋で消化し、引き続いてＦｏｋｌ　ＲＥＮで消化した。ＤＣＰＩ遺伝子モノマーを含有するＤＮＡ断片、７８３ｂｌ）　、をアガロースゲルの電気泳動により分離し、そしてＮＡＣＳカラムを使用して精製した（実施例１参照）。モノマー遺伝子の断片を、Ｂａｎ１　ＲＥＮで消化したｐｓＹ１２６２（特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ８７１０２８２２号参照）と結合した。ライゲーション生成物を大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）株）ＩＢＩＯ＋の中に形質転換し、そして抗生物質カナマイシンを含有する細菌プレート上の成長のために選択した。個々のコロニーからのプラスミドＤＮＡを、」肋旧ＲＥＮおよびＰｖｕｌｌ　ＲＥＮを使用する消化およびアガロースゲルの電気泳動により、多重ＤＣＰＩモノマー断片を含有するインサートについて分析した。１つのクローンｐＰＴＯ１６４は遺伝子モノマー（７８３ｂｐ）を含有した；他のクローンｐＰＴＯ１６５はわずかに大きい断片（はぼ１２００ｂｐ）を含有した；そして第３のクローンｐＰＴ０１６６は遺伝子の２量体（１５６６ｂｌ））を含有した。

ＤＣＰＩタンパク質の発現の分析プラスミドｐＰＴＯ１６４，ｐＰＴＯ１６５またはｐＰＴＯ１６６を含有する大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）株ＨＢ１０１を３０°Ｃにおいて０．７のＯＤ＊ｏ。に成長させ、次いで４２°Ｃに２．０時間シフトした。これらの細胞により生産されたタンパク質を、ＤＣＰ−Ｃ，Ａ！ペプチドの抗血清と反応する新規なタンパク質のバンドについて、ウェスタンプロット分析により分析した。はぼ４５ｋＤの見掛けの分子量をもつバンドが、プラスミドｐＰＴＯ１６４を含有する培養物において観察された。ｐＰＴＯ１６５をもつ６８ｋＤのバンドおよびｐＰＴＯ１６６をもつバンドの薄いじみが観察された。

ｐＰＴＯ１６６を含有する菌株における検出可能な発現の低いレベルのために、ＤＣＰＩクローンにより生産されたｍＲＮＡを分析した。ｍＲＮＡを実施例１において前述したように調製した。ノザンプロット分析（実施例１参照）により、プローブとしてＤＣＰ２モノマー配列を使用して、すへてのクローンからのＤＣＰ特異的ｍＲＮＡは、全長であることが示され、そしてＤＣＰ遺伝子サイズに無関係にほぼ同一レベルで合成された。

ＤＣＰＩ　ｐＰＴＯ！６６５６１アミノ酸配列　分子量；　４６．４０９ダルトン［（ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ１２　（ＧＡＦＧＰＡＧＰＰ１２４　（ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ１２１２ＤＣＰ２ポリマー遺伝子の構成化断片をアガロースゲルの電気泳動により分割した。４８３ｂｐのＤＣＰ２遺伝子断片を切除し、そしてＮＡＣＳカラムにより精製した（実施例１参照）。精製した断片を、Ｂａｎ１　ＲＥＮ消化したｐｓＹ１２６２と結合した。

このライゲーション生成物を大腸菌（Ｂ、ｃｏｌｉ）株ＨＢＩＯＩの中に形質転換し、そして形質転換体を抗生物質カナマイシンを含有する細菌プレート上の成長について選択した。個々のクローンからのプラスミドＤＮＡを精製し、モしてＤＣＰ２遺伝子モノマーの断片の多重挿入について分析した。５００〜３．０ＯＯｂｐのサイズのいくつかのクローンが得られた。結果について表５を参照のこと。

ＤＣＰ２タンパク質の発現の分析プラスミドｐＰＴ０１５５〜０１６３を含有する大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌ　ｉ）株１（ＢＩＯＩを３０°Ｃにおいて００ｇ。。に成長させ、次いで４２℃２時間シフトした。これらの細胞により生産されたタンパク質を、ＤＣＰ−ＣＩＡｔペプチド特異的抗血清と反応性のバンドについてウェスタンプロット分析により分析した。結果について表５を参照のこと。

１］ＰＴＯＩ５５　１　６０３　２０１　検出されずｐＰＴＯ１５６２１０３５３４５４０ｐＰＴＯ１５７３１４６７４８９６０ｐＰＴ０１５８　４　１８９９　６３３　８０ｐＰＴＯ１５９５２３３１７７７１００ｐＰＴＯ１６０６２７６３９２１ＬみｐＰＴＯ１６１７３１９５１０６５検出されずｐＰＴＯ１６２７＋　３２４０　１０８０　検出されずｐＰＴＯ１６３７＋　３４２０　１１４０　検出されずＤＣＰ２　ｐＰＴＯ１５９７７７アミノ酸　分子量：６４．０９４ダルトンＭＤＰＶＶＬＱＲＲＤｆｆＮＰＧＶＴＱｌ、ＮＲＬＡＡＨＰＰＦＡＳＤＰＭ［（ＧＡＨＧＰＡＧＰに１２　（ＧＡＰＧＰＡＧＰｐＨ２（ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ１２］５ＧＡＭＤＰにＲＹＱｎＳＡＧＲＹＨ１’ＱＬＷＣＱＫＤＣＰ３のモノマーの構成（ＡＢ）　ｔをエンコードする４つのオリゴヌクレオチド鎖を、記載したように、合成しそして精製した（実施例１参照）。

４、Ａｌ　５’　−ＧＴＩ；ＣＴＣＣＣに（：ＡＣＣＴＣＣＡＣＡＡ丁ＡＴＴＡＴＴＣ’ＴＡ（ｉＡＧＧＴＧＡｃｃｃＡにＧＡＣＣＣＣＣＴf　−３１４＋Ｂｌ　３’　−ＡＧＧＣＣＣＴＧＣ；ＡＣＧＴＣＴＴＡ丁Ａ）＋ＴｋＡＧＡＴＣＴＣＣＡＣＴＣＧＧＴＣＣ丁ＧＧＣＧＣｋＣｃＡＣ＠　r’ ４、Ｃ１５’　−ＧＧＣＣＣＡＣＣＧ（、ＣＴＡＧＣＣＧＴＧＧＣＧＡＴＣＣＧＧＧＡＣＣＡＣＣＧＧ−４、Ｄ）　コ’　−ＡＣＧＴＣＣＧＧＧＴＧＧＣＣＣＡＴＣにＣ；ＣＡＣＣＣｒＣＴＡＧＧＣＣＣＴＧＧＴＧＧＣＣ−ＧＴＧＣＡＣＣＴＣ；Ｃ，ＣＣ（ＪＧＣＧＣＴ：、ＴＣＣＣ，ＣＣＴＧＣ，ＡＴ　’　−３’ＣＡＣＣＴ（：にＡＣＣＣＧＣＴＣＣ；ＣＣＣＡＣ（：ＣＣＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣ− ５’オリゴヌクレオチドｊＪＩ４．Ａおよび４．Ｂをアニーリングし、そして− Ｆｏｋｌ　ＲＥＮて消化したＤＮＡプラスミドｐＰＴＯ１３４（実施例１参照）と結合した。このライゲーション生成物と大腸菌（Ｂ、　ｃｏｌｉ）株ＨＢＩＯＩの中に形質転換した。形質転換されたコロニーからのプラスミドＤＮＡを精製し、そして」旦１および一紀工１で消化した。はぼ８００ｂｐの断片を含有するコロニーを配列決定した。鎖４．Ａおよび４、Ｂの所望の配列を含有するプラスミドｐＰＴＯ１３９を引き続く構成のために選このライゲーション生成物を大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）株ＨＢＩＯＩの中に形質転りの組み合わせた挿入に相当するＤＮＡ断片を含有するクローンを配列決定した。表６に示すように正しい（ＡＢ）、ＤＮＡ配列を含有するプラスミドｐＰＴＯＩ４３を、それ以上の構成のために選択した。

表６ｃｘｐｃｐ　Ａ　ｃｐｐｃｓ　ＲｃｏｐｃｐｐＧＡＰＧＰＡＧＰＰＧＳＲＧＤＰＧＰＰ（ＡＢ）！遺伝子断片を含有する断片をアガロースゲルの電気泳動により分離し、そしてＮＡＣＳカラム上で精製した。次いで、ＤＮＡ断片をＦｏｋｌ　ＲＥＮで消化したｐＰＴＯ１３４と結合した。ライゲーション生成物を大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）株ＨＢＩＯＩの中に形質転換し、そして抗生物質クロランフェニコールを含有する細菌プレート上の成長について選択した。個々のコロニーからのプラスミドＤＮＡを、Ｆｏｋｌ　ＲＢＮを使用する消化により、多重（ＡＢ）　ＪＮＡ断片を含有するインサートについて分析した。（ＡＢ）、のｌコピーから数コピーまでの範囲のいくつかのクローンが得られた。（ＡＢ）＠を含有する１つのクローンｐＰＴＯ１６９を、ＤＣＰ３遺伝子モノマーの構成のための中間体として使用した。

（ＡＢ）、遺伝子断片をｐＰＴＯＩ６９からＦｏｋｌ　ＲＥＮを使用する消化、アガロースゲルの電気泳動およびＮＡＣＳ精製により精製した。次いで、このＤＮＡ断片を前辺てＢａｎ１　ＲＥＮで消化したＤＮＡプラスミドｐＰＴＯ１４０と結合した。ライゲーション生成物を大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）株ＨＢＩＯＩの中に形質転換し、そして形質転換体を抗生物質クロランフェニコールを含有する細菌プレート上で選択した。個々のコロニーからのプラスミドＤＮＡを、Ｆｏｋｌ　ＲＥＮを使用する消化により、（ＡＢ）、遺伝子断片の多重コピーを含有するインサートについて分析した。ｃ、（ＡＢ）　＋　２Ｇ。

（表７に示す）を含有する１つのクローンｐＰＴＯ１７１を、引き続く構成のためのＤＣＰ３遺伝子モノマーとして選択した。

表７ＧＧＴＧＣＴＣＡＣＣＧＣＣＣＡにＣＡＧＧＴＣＣＧ鮎ＧＧＧＣＧＣＧＣＡＴＧＧＣＣＣＡＧＣＡＧＧＣＣＣＧＡＡＡＣＣＪＣＧＡＧｔＧＣＣＧＣ：ＧＴＣＧＴＣＣＡＧＧＣττＣＣＣＧＣＧＣＧＴＡＣＣＧＧＧＴＣＧＴＣＣＧにＧＣＴＴＴＯＡＩ’１ＧＰＡＧＰＫＧＡＨＧＰＡＧＰＫＧＡＩ（ＣＰＡＧＰＫＣＡＨＧＰＡＧＰＫＤＣＰ３ポリマー遺伝子の構成ｐＰＴＯＩ７１からのプラスミドＤＮＡをＦｏｋｌ　ＲＥＮで消化し、そしてＤＣＰ３遺伝子モノマーを含有する断片をアガロースゲルの電気泳動およびＮＡＣＳ精製により精製した。次いでＤＣＰ３モノマーを自己結合し、次いてＢａｎ１　ＲＥＮで消化したＤＮＡプラスミド１）ＳＹＩ２６２と結合した。

ライゲーション生成物を大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）株ＨＢＩＯＩの中に形質転換し、そして抗生物質カナマイシンを含有する細菌プレート上の成長について選択した。個々のコロニーからのプラスミドＤＮＡを精製し、そしてＸｃｍｌ　ＲＥＮおよびＰｖｕｌｌ　ＲＥＮで消化後、ＤＣＰ３遺伝子モノマーの断片の多重コピーを含有する挿入について分析した。それぞれ、ＤＣＰ３のモノマー、２量体、３量体および４量体の形態を含有するクロー　ンｐＰＴＯＩ７３．　ｐＰＴＯ＋７４．　Ｉ）ＰＴＯＩ７５およびｐＰＴｏ　１７６を発現の分析について選択した。

ＤＣＰ３タンパク質の発現の分析ＤＣＰ３プラスミドｐＰＴＯＩ７３．　ｐＰＴＯ１７４，ｐＰＴＯＩ７５またはｐＰＴＯＩ７６を含有する大腸菌（Ｅ、　ｃａｌ　ｉ）株ＨＢＩＯＩを３ｏ″ｃにおいて０．７ノＯＤ６゜。に成長させ、次いで４２°Ｃに２時間シフトした。

これらの細胞により生産されたタンパク質を、ウェスタンプロット分析により、ＤＣＰ−（ＡＢ）ｔペプチドに対して特異的な抗血清と反応性の新規なタンパク質バンドについて分析した（結果について表８を参照のこと）。しかしながら、全長のポリマーの発現は遺伝子のサイズの増加とともに減少した。プローブとしてＤＣＰ３モノマーを使用するノザン分析において、これらのクローンにおける全長のｍＲＮＡの合成が等しいレベルであることか示された。

ｐＰＴＯ１７３１９２７３０９２８ｐＰＴＯ１７４２１６８３５６１６４ｐＰＴＯＩ７５　３　２４３９　８１３　９８ｐＰＴＯ１７６４３１９５１０６５１３５ＤＣＰ３　ｐＰＴＯ１７６１０６５アミノ酸　分子量：　９１．９６６ダルトンＭＤＰＶＶＬＱＲＲＤＷＥＮＰＧＶＴＱＬＮＲＬＡＡ）ＩＰＰＦＡｓＤＰＭ（（ＧＡｊｉＣＰＡＣＰＫ１２　（（ＧＡＰＧＰＡＧＰＰＩ　（ＧＳＲＧＤＰＧＰＰＩ　１１２　（ＣＡＨＧＰＡＧＰＫ１２）４（：ｍＰＧＲＹＱＬＳＡＧＲＹＨＱＬ■ＣＱＫＤＣＰ４．　５、および６の構造ＤＣＰ４〔Ｃ２（ＤＢ）Ｉ２Ｃ２〕４ＤＣＰ５　（Ｃ，（ＤＢ）、Ｃ，）。

ＤＣＦ’６　（Ｃ２Ｄ２４Ｃｔ）　ｔここで・Ｂ　＝　ＧＳＲＧＤＰＧＰＰＣ＝　ＧＡＨＧＰＡＧＰＫＤ　＝　ＧＡＱＧＰＡＧＰＧＤＣＰ４および５の遺伝子モノマーの構成（ＤＢ）、をコードする、３つの二本鎖ＤＮＡ区画を、実施例１に記載されているように、合成し、精製しそしてアニーリングした。

５、Ｂｌ　３’　−τＧＴＣＣＣＴＧＧＣＣＣＣＣＣＴＧＧＴＣＣＡＣＣＧＡＧＡＧＣτＣＣＧＣＴＡＧＧｉＣＣＣＡＧＧＡＧＧＣＣＣＡＣf ５−１）ｌ　３’−、ＴＧＴＴＣＣＴＣＣ；ＣＣＧＴＣＣＧＧＧＡＣＣＡＣＣＧＴＣＧＧＣＧＣＣＡＣＴＡＧＧＣＣＣＧＧＧＴＧＧＣＣＣＡbＱ３つのＤＮＡ区画を別々にクローニングした。最初の２つの鎖区画（５，Ａおよび５．Ｂ）を、前身てＢａｎ１　ＲＥＮで消化したｐＰＴ０１３８に結合した。

ライゲーション生成物を大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）株ＨＢＩＯＩの中に形質転換し、そして抗生物質クロランフェニコールを含有する細菌プレート上の成長について選択した。個々のコロニーからのプラスミドＤＮＡをＥｃｏ１０９１　ＲＥＮおよびＳｔｕ　ＲＥＮで消化し、そしてアガロースゲルの電気泳動により分析した。適当なサイズのＤＮＡ断片を含有するプラスミドＤＮＡを配列決定し、そしてｐＰＴＯ２２１を引き続く構成において使用した。

オリゴヌクレオチド鎖の第２対（５，０および５．Ｄ）を、ＤＮＡを配列決定した。１つのクローンｐＰＴＯ２２２は期待した配列を有し、そして引き続く構成について使用した。

ｐＰＴＯ２２２からのプラスミドＤＮＡをＦｏｋｌ　ＲＥＮで消化し、そして第２対のオリゴヌクレオチド１（５Ｃおよび５Ｄ）を含有する断片（５４ｂｌ））をアガロースゲルの電気泳動および引き続いてＮＡＣ３精製により分離した。このＤＮＡ断片を−Ｂａｎｌ　ＲＥＮで前以て消化したｐＰＴＯ２２２と結合した。ライゲーション生成物を大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）の中に形質転換し、そして単一のコロニーからのプラスミドＤＮＡを、Ｄｒａｌｌｌ　ＲＥＮおよび５ｔｕｌ　ＲＥＮて消化後、アガロースゲルの電気泳動により分析した。１つのクローンｐＰＴＯ２２３を、ＤＮＡ配列決定後、第３の配列決定されたＤＣＰ遺伝子断片についてのアクセプターベクターのために選択した。

プラスミドｐＰＴＯ２２３を−Ｂａｎｌ　ＲＥＮで消化し、そして第３対のオリゴヌクレオチド（５，Ｅおよび５．Ｆ）と結合した。ライゲーション反応の生成物を大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌ　ｉ）株）ＩＢＩＯＩの中に形質転換し、そして抗生物質クロランフェニコールを含有する細菌プレート上の成長について選択した。

個々の形質転換体からのプラスミドＤＮＡを精製し、そしてＦｏｋｌ　ＲＥＮおよび±ｌ　ＲＥＮで消化した。正しい断片サイズを含有するクローンを配列決定した。所望の配列を含有する、表ＩＯニ示ス、１　つｃ７）　’）　ロー　ンｐＰＴＯ２２４を、ＤＣＰ４Ｃ上４オヨヒＤＣＰ／　マーの引き続く構成において使用した。

ＣＧｒに（ＪＣＡＧＧＧＡＣＣ：ＧＧＣＧＧＧＡＣＣＡＧＧＴＧにＣＴＣτＣＧＡＧＧＣＧＡＴＣＣＧＣ：ＧτＣＣＴＣＣＣＣＣＡＣＧＴｃＴＣＣｅＴＧＧＣＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＣｃｃＡＧＡＧＣＴＣＣＧ　ＣＴＡＧＣＣｅｃＡＧＧＡＧＧＣＧｋＱＧＰｋＧＰＧＧＳＲＯＤＰＧＰＰＧＧｒＧＣＡＣＡｋＧＧｋＣＣＧＧＣｋＧＧ　ＣＣＣＴＧＧＴＯＧＣＡＧ　ＣＣ０ＣＧＧＴＧＡＴＣＣＧＧＧＣＣＣＡＣｃＧｃｃｘｃｃτＧ’ＸＴＣＣＴＣ；ＧＣＣＧＴＣＣＧＧＧＡＣＣＡＣＣＧＴＣＧＧ　ＣＧＣＣＡＣＴＡＧＣＣＣＣＧＧＣＴＧＧＯＧＡＱＧＰＡＧＦ’ＧＧ５ＲＧＤＰＧＰＰＣＧＴＧＣＴＣＡＡＧＧＡＣＣにＧＣＴＧＧＣＣＣＡＧＧＣＧＧＴＴＣＣＣＧＴＧＧＡＧＡＣＣＣ（：ＧＧＴＣＣＡＣＣＧＣＣＡＣＧＡＧＴＴＣＣｌＧＣＣＣＯＡＣＣＣ，ＣＧＴＣＣＣ；　ＣＣＡＡＧＣ；　Ｃ；　ＣＡＣＣＴＣＴＩＩ；にＣＣＣＣｋＧＧＴＧＧＣＧＡＱＧＰＡＧＰＧＧ５ＲＧＤＰＧＰＰ消化し、そして（ＯＢ）、を有する消化断片をアガロースゲルの電気泳動により分離し、そしてＮＡＣＳカラムで精製した。精製した断片を自己結合させ、次いで−Ｂａｎｌ　ＲＥＮで消化したｐＰＴＯ１４０の中にクローニングした。ライゲーション生成物を大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）株１（ＢＩＯＩの中に形質転換した。個々のコロニーからのプラスミドＤＮＡを、Ｐｏｋｌを使用する消化により、（ＤＢ）ＩＤＮＡ断片を含有するインサートについて選択した。（ＤＢ）　ｚ〜（ＤＢ）　、　２の範囲のいくっがのサイズのインサートが見いだされた。１つのクローンｐＰＴＯ２２９は所望のＤＣＰ５モノマー配列Ｃｚ（ＤＢ）ｓｅｔを含有すると同定され、そして引き続く構成のために使用した。ＤＣＰ４遺伝子モノマー配列Ｃｔ（ＤＢ）＋ｔＣｔを含有するクローンは、ＤＣＰＩの構成の間に観察されたように、引き続く継代の間に高度に不安定であることが発見された。引き続いて、新しいプラスミドをＤＣＰ４遺伝子モノマー断片のためのアクセプターとして使用するために構成した。

プラスミドｐＡｃＹｃ１８４（ＣｈａｎｇおよびＣｏｈｅｎ、　Ｊ、Ｂａｃｊｅｒｉｏｌ、１３４．１１４１−１１５６　［１９７７］　）を±Ｉ　ＲＥＮで消化し、アガロースゲルの電気泳動により精製し、そしてほぼ２０００ｂｐに相当するＤＮＡ断片をさらにＮＡＣＳカラムで精製した。このＤＮＡ断片をＤＮＡポリメラーゼでフィルインしく実施例１参照）次いで自己結合させた。ライゲーション混合物の生成物を大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）株１（Ｂｌｏｔの中に形質転換し、そして３０μｇ／ｍｌでクロランフェニコールを含有する細菌プレート上で選択した。

個々のプラスミドからのプラスミドＤＮＡをＥｃｏ４７１１１を使用する消化により線状化した。１つのクローンｐＰＴＯ２３５をＤＣＰ４モノマーのためのアクセプターベクターとして使用した。

ＤＣＰ４遺伝子モノマー断片を含有するプラスミドＤＮＡを、Ｄｒａｌ　ＲＥＮおよび−ハラＩｔ　ＲＥＮを使用する消化および引き続くアガロースゲルの電気泳動によりプラスミドから分離した。ＤＣＰ４遺伝子モノマー断片を含有するアガロースのスプライスを、前以てＥｃｏ４７ｒｌ［ＲＥＮで消化したプラスミドｐＰＴＯ２３５と結合し、そしてアガロースゲルの電気泳動およびＮＡＣＳカラムにより精製した。このライゲーション生成物を大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）株ＨＢＩＯＩの中に形質転換し、そして３０μｇ／ｍ＋でクロランフェニコールを含有する細菌プレート上で選択した。個々のクローンからのプラスミドＤＮＡをＮｒｕｌ　ＲＥＮおよびＥｃｏＲＶ　ＲＥＮを使用する消化により分析した。ＤＣＰ５遺伝子モノマー断片を含有する１つのクローンｐＰＴＯ２３７を、ＤＣＰ４ポリマー遺伝子の構成のために選択した。

ＤＣＰ４ポリマー遺伝子の構成ｐＰＴＯ２３７カラ０）マーｙスミＦＤＮＡ　ヲＦｏｋｌ　ＲＥＮ　テｍ化り、ｆ：。ＤＣＰ４遺伝子モノマーを含有するＤＮＡ断片をアガロースゲルの電気泳動により分離し、そしてＮＡＣＳカラムにより精製した（実施例１参照）。次いで、このモノマー遺伝子断片を、Ｂａｎ１　ＲＥＮで消化したｐｓＹ１２６２と結合し、ホスファターゼで処理し、そしてアガロースゲルの電気泳動およびＮＡＣＳカラムにより精製した。ライゲーション生成物大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）株ＨＢＩＯ＋の中に形質転換し、そして形質転換体を５０μｇ／ｍｌで抗生物質カナマイシンを含有する細菌プレート上で成長について選択した。個々のコロニーからのプラスミドＤＮＡを精製し、そしてＤＣＰ４遺伝子モノマー断片の多重挿入について分析した。ＤＣＰ４遺伝子モノマーの１．　２または４コピーを含有するいくつかのクローンが得られた。それぞれ遺伝子モノマーの１，２および４コピーを含有するプラスミド吐ＴＯ２４７，ｐＰＴＯ２４８、およびｐＰＴＯ２４９をタンパク質の発現の分析のために選択した。

ＤＣＰ４タンパク質の発現の分析プラスミドｐＰＴＯ２４７，ｐＰＴＯ２４８、およびｐＰＴＯ２４９を含有する大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）株ＨＢ１０１を３０°Ｃにおいて０．７の０Ｄ−ｏｏに成長させ、次いで４２°Ｃに２．０時間シフトした。これらの細胞により生産されたタンパク質を、ウェスタンプロット分析により、ＤＣＰ−Ｃｔ（Ｉｈ）ペプチド特異的抗血清と反応性の新規なタンパク質バンドについて分析した。全長の生産物に相当する反応性バンドが各クローンで観察された。

ＤＣＰ４　ｐＰＴＯ２４９１０６５アミノ酸　分子量：　９１．５３３ダルトン４（Ｇ朋ＣＰＡＣＰＫ１２　Ｈ（ｃｘＱＧｐｘｃｐｃ）（ｃｓＲｃｏｐｃｐｐ）１１２（ｃＡＪ４ｃｐＡｃｐに）２）４ＤＣＰ５ポリマー遺伝子の構成りＣＰ５遺伝子モノマーを含有するｐＰＴＯ２２９からのプラスミドＤＮＡを、Ｆｏｋ　ＲＥＮで消化した後、アガロースゲルの電気泳動および引き続くと結合した。ライゲーション生成物を大腸菌（）：、　ｃｏｔ　ｉ）株ＨＢＩＯＩの中に形質転換し、そして５０μｇ／ｍｌで抗生物質カナマイシンを含有する細菌プレート上で成長について選択した。個々のコロニーからのプラスミドＤＮＡを精製し、そしてＤＣＰ５遺伝子モノマー配列Ｃ，（ＤＢ）、Ｃ。

の多重コピーを含有するインサートについて分析した。それぞれ、プラスミドｐＰＴＯ２３１およびｐＰＴＯ２３２はＤＣＰ５遺伝子モノマーの３および４コピーを含有し、そして発現の分析のために使用した。

ひＣＰ５タンパク質の発現の分析プラスミドｐＰＴＯ２３１およびｐＰＴＯ２３２を含有する大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌ　ｉ）株ＨＢ１０１を３０°Ｃにおいて０．７のＯＤ、。。に成長させ、次いで４２°Ｃに２．０時間シフトした。これらの細胞により生産されたタンパク質を、ウェスタンプロット分析により、ＤＣＰ−Ｃ２Ａ２ペプチド特異的抗血清と反応性の新規なタンパク質について分析した。全長の生産物に相当する反応性バンドが各クローンで観察された。

ＤＣＰ５　ｐＰＴＯ２３２６３３アミノ酸　分子量：　５５．２８８ダルトンＭＤＰＷＬＱＩ’１ＲＤＷＥＮＰＧＶＴＱＬ＋ＪＲＩＪＡＪ（ＰＰｆ’ＡＳＤＰＭ（（ＧＡＦＩＧＰＡＧＰＫ１２　［（ＧＡＱＧＰＡＧＰＧＩ（ＧＳＲＧＤＰＧＰＰｌ］６　（ＧＡＩ（ＧＰＡＧＰＫ１２　）４ＧＡＫＤＰＧＲＭＱＬＳＡＧＲＹＨＹＱＬ四ＣＱＫＤＣＰ６遺伝子モノマーの構成り４をエンコードする４つのオリゴヌクレオチドを、実施例１に記載するように、合成し、精製し、そしてアニーリングした。

６、Ａｌ　５　’　−ＧＴＧＣ）ｋ（ＪＧＧＧＡＣＣＣ，ＧＣＧＧＧＴＣＣＡＧＧＣＧＧＴＧＣＴＣＡＡＧＧＡＣＣＣＧＣＡＧＧＣＣＣＴＴaττＡＡＧ（ＥｃｏＯ１０９１１６＋Ｃ）　５’　−ＧＣＣＣＴＧにＴＧにＣＧＣＴＣＡＡＧＧＴＣＣＣＧＣＴ１１．ＣＣＣＣＡにＧＡＧＧＣＧＣＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＧＣ`ＧＧＴ− ６＋Ｄ）　コ’−（：ＡＣＣＡＣＣＧＣにＡＣＴτＣＣＩＣＣＣＣＣ，ＡＣＣＧＣ：ＧＴＣＣＴＣＣＧＣＧＣＧＴＣＣＣＡＧＧＣＣＣ，ＴＣbｋ− 鎖６Ａおよび６Ｂから成る最初のオリゴヌクレオチドセグメントを、前以てＢａｎ　ＲＥＮで消化したｐＰＴＯＩ３８に結合した。ライゲーション生成物を大腸菌（Ｅ、ｃｏ目）株１（８１０１の中に形質転換し、そして抗生物質クロランフェニコールを含有する細菌プレート上で成長について選択した。個々のコロニーからのプラスミドＤＮＡをＥｃｏＯ１０９１ＲＥＮおよびＸｍｎ１　ＲＵＮで消化し、そしてアガロースゲルの電気泳動により分析した。正しいサイズの断片を含有するプラスミドＤＮＡを配列決定し、そして正しい配列を含有する１つのクローンｐＰＴＯ２１９を引き続く構成のために使用した。

プラスミドｐＰＴＯ２１９を皿Ｉ　ＲＥＮおよび」並０１０９１で消化し、そして第２対のオリゴヌクレオチド（６Ｃおよび６Ｄ）と結合した。

ライゲーション生成物を大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）株ＨＢＩＯＩの中に形質転換し、そして抗生物質クロランフェニコールを含有する細菌プレート上の成長について選択した。形質転換体からのプラスミドＤＮＡを精製し、そしてＦｏｋｌ　ＲＥＮおよびＢａｎ１　ＲＥＮで消化した。正しい断片を含有するクローンを配列決定した。表１１に示す配列を含有する１つのクローンｐＰＴＯ２２０をＤＣＰ６遺伝子モノマーの引き続く構成において使ＣＧＴＧＣＡＣＭ；ＧＧＡＣＣＧＧＣ（、ＣＣＴＣＣＡＧＣＣＣ（：ＴＧＣＴＣＡＡＣＧＡＣＣＧＣＣ八ＧＧＣＣＣＴＧＧＴＣＣＡＣへＴＧＴＣＣＣＴＧＧＣＣＣＣＣＣＡＧＣ；ＴＣＣＧＣＣＡＣＧＡＧ丁τｃｃ’ｒｃｃｃｃｃＴｃｃｃｃｃＡｃｃ八ＧＡＱＧＰＡＧＰＧへＡＱＧＰＡＧＰにＧＧＣにＣＴＣＡＡＧＧＴＣＣＧＧＣＴＧＣＣＣＣＡＧＧＡ（ｉにＣ０ＣＧＣＡＧにＧＴＣＣＧＣＣＡＧＣ；ＴＣＣにＧＧＡＣＣＧＩにＡＧττＣＣＡＧにＣＣＣＡＣＣＧＣＧＴＣＣＴＣＣＧＣＣＣＣＴＣＣＣＡ（：ＣＣＣＧＴＣＣＡＧＣＣＣＣτＧＡＱＧＰＡＧＰＧＧＡＱ（ｉＰＡＧＰＧＤ４配列を含有するプラスミドＤＮＡをＦｏｋｌ　ＲＥＮおよびＢａｎ１　ＲＥＮて消化し、そしてＤ４を含有する消化断片をアガロースゲルの電気泳動および引き続＜　ＮＡＣ３精製により分離した。精製した断片を自己結合し、引き続いてＢａｎ１　ＲＥＮで消化したＤＮＡプラスミドｐＰＴＯ１４０と結合した。ライゲーション生成物を大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）株ＨＢＩＯＩの中に形質転換し、そして抗生物質クロランフェニコールを含有する細菌プレート上の成長について選択した。ＤＣＰ６遺伝子モノマー（Ｃ２−Ｃ２によりフランキングされた（Ｄ　、）、）を含有する形質転換体ｐＰＴＯ２４２を引き続く構成のために使用した。

ＤＣＰ６ポリマー遺伝子の構成ｐＰＴＯ２４２からのプラスミドＤＮＡはＦｏｋｌ　ＲＥＮて消化した。ＤＣＰ６遺伝子モノマーを含有するＤＮＡ断片をアガロースゲルの電気泳動により分離し、そしてＮＡＣＳカラムにより精製した。次いでモノマー遺伝子断片を、前以てＢａｎ１　ＲＥＮで消化したｐｓＹＩ２６２と結合し、ホスファターゼで処理し、そしてゲル電気泳動およびＮＡＣＳカラムにより精製した。ライゲーション生成物を大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）株ＨＢＩＯＩの中に形質転換し、そして形質転換体を５０μｇ／ｍｌで抗生物質カナマイシンを含有する細菌プレート上で成長について選択した。個々のコロニーからのプラスミドＤＮＡを精製し、そしてＤＣＰ６遺伝子モノマー配列Ｃ２Ｄ２−Ｃ２の多重挿入について分析した。ＤＣＰ６遺伝子モノマーの１〜４反復の範囲のいくつかのクローンが得られた。それぞれ遺伝子モノマーの１．２．３および４反復を含有するプラスミドｐＰＴＯ２４３゜ｐＰＴＯ２４４，ｐＰＴＯ２４５およびｐＰＴＯ２４６をタンパク質の発現の分析について選択した。

ＤＣＰ６タンパク質の発現の分析プラスミドｐＰ７０２４３〜プラスミドｐＰＴＯ２４６を含有する大腸菌（Ｅ。

ｃｏｌｉ）株ＨＢ１０１を３０°Ｃにおいて０．７のＯＤｇｏａに成長させ、そして４２°Ｃに２．０時間シフトした。これらの細胞により生産されたタンパク質を、ウェスタンプロット分析により、ＤＣＰ−Ｃ，Ａ、ペプチド特異的抗血清と反応性の新規なタンパク質について分析した。

表１１ｐＰＴＯ２４３１９２７３０９検出されずｐＰＴＯ２４４２＋６８３　５６１　７２ｐＰＴＯ２４５３２４３９８１３１１０ｐＰＴＯ２４６４３１９５１０６５１４０ＫＤＰＶＶＬＱ限Φ疵ＮＰＧ買ＱＬＮＲＩツムＨＰＰＦＡＳ（ＩＰＭ＋＋Ｇ入ＨＧＰＡＧＰＫＩ２　（ＧＡＱＧＰＡＧＰＧＩ２４　（ＧＡＨＣ；ＰＡＣＰに）２１４精製されたＤＣＰ６の性質質であった。アミノ酸の組成の分析により、生産物は主としてアミノ酸のグリシン、アラニン、プロリンおよびグルタミンから成ることが示された。合計のアミノ酸のうちのグリシン十アラニン＋プロあった。ＤＣＰ６ポリマーのこれらのアミノ酸の理論比は１．９０：１．００：１、００　：　０．４３である。

精製した生産物を合成し、そして元素組成について分析した。化学分析は生産物が５０．５％の炭素、６．７８％の水素、１９．５％の窒素、１１．３％の水および０．１％より少ない非燃焼性灰を含をすることか学生産物はほぼ８５．７％のタンパク質から成り、そしてそのタンパク質のほぼ９８．６％はＤＣＰ６である。

乾燥した生産物は水中に極めて可溶性である。８重量％またはそれより大きい溶液を容易に生成することができる。室温またはそれプラスミドｐＰＴ０２８５の構成（５′［連続する１）　ＣＴＡＣＣＴＡ（３′［連続する］）、Ｖした。

このライゲーション反応の生成物を大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）株）（Ｂｌｏｔの中に形質転換した。形質転換体からのプラスミドＤＮＡを精製し、そしに選択した。

ＣｌＦ３．１遺伝子モノマーの構成 ■に、ＤＮＡの４つの二本鎖の区画を化学的に合成した。

断片１：断片２：断片３：断片４：断片３の２つの鎖をリン酸化した後、ポリヌクレオチドキナーゼでの断片を個々にアニーリングした。

次いで、断片を前身てＢａｎ１　ＲＵＮおよびＥｃｏＲＶ　ＲｔＥＮで消化したｐＰＴ０２８５の中に結合し、そしてさらにＮＡＣＳカラムにより精製した精製しそしてＰｖｕｌｌおよびＳａｃ　Ｉ　ｒで消化した；正しいサイズのインサートを含有するクローンをさらにＥｃｏＲｌといくつかの制限エンドヌクレアーゼとの組み合わせで分析して、配列決定前に、独特制限エンドヌクレアーゼの存在を決定した。１つのクローンは有望に見え、そして配列決定した。プラスミドｐＰＴＯ２９１は表１２に示す配列をこのプラスミドを使用してＣｌＦ３．１モノマーを構成した。１（ＣＣライゲーション法（実施例１参照）を使用して、断片３を断片４と結合した。ライゲーション混合物の生成物を２％低分子量アガロースゲル中で電気泳動させ、そしてライゲーション生成物に相当するバンドをゲルから切除し、そして前以てＢａｎ１ｌ　ＲＥＮおよび５ｎａＢＩ　ＲＥＮで消化したｐＰＴＯ２９１プラスミドＤＮＡと結合し、そしてアガロースゲルの電気泳動およびＮＡＣＳカラムにより精製した。

ライゲーション反応の生成物を大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）株ＨＢＩＯＩの中に形インサートを含有するこれらのクローンを配列決定した。プラスミドｐＰＴＯ２９２は所望のＣｌＦ３．１モノマー配列を含有した（表１３参照）。

ＣｌＦ３．１ポリマー遺伝子の構成プラスミドＤＮＡ　ｐｓＹ１２６２をＢａｎ１　ＲＥＮで消化した。消化混合物を２つのアリコートに分割した。実施例１に記載するように、一方を仔つシ腸ホスファターゼで処理し、そして他方をシュリンプアルカリ性ホスファターゼ（ＳＡＰ）で処理した。

ｐＰＴＯ２９２からのプラスミドＤＮＡをアガロースゲルの電気泳動により分割した。１８０ｂｐのＣｌＦ３．　ｌ断片を切除し、そしてＮＡＣＳカラムにより精製しく実施例１参照）次いで前述したように調製したプラスミドｐｓＹ１２６２と結合した。

このライゲーション反応の生成物を大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）株ＨＢＩＯＩの中に形質転換した。形質転換体をカナマイシンに対する耐性について選択した。個々の形質転換体からのプラスミドＤＮＡを、ＣｌＦ３．１多重ＤＮＡ挿入のためのサイズの増加について分析した。はぼ１．０ｋｂｐ〜３、５ｋｂｌｌの範囲のサイズのいくつかのクローンが得られた。遺伝子モノマーのそれぞれ６．　９．１１．１３および１７反復を含有する５つのクローンＩ）ＰＴＯ２９３〜ｐＰＴＯ２９７をタンパク質の発現の分析のために選択した。

ＣｌＦ３．１タンパク質の発現の分析３０℃において成長させたプラスミドｐＰＴＯ２９３〜ｐＰＴＯ２９７を含有する大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）株）ＩＢＩＯＩの一夜の培養物を別々に使用して、２５０ｍ１のフラスコの中に含有される５０ｍ１の培地を接種した。カナマイシンを５０μｇ／ｍｌの最終濃度に添加し、そして培養物を３０°Ｃにおいて撹拌（２０Ｏｒｐｍ）　シながらインキュベーションした。培養物が０．８の００．。

。到達したとき、４０ｍ１の各培養物を４２°Ｃに前以て加温した新しいフラスコに移し、そして同一温度においてほぼ２時間インキュベーションした。培養物（３０°Ｃおよび４２°Ｃ）を氷上で冷却し、モしてＯＤ、。。

を取った。細胞を遠心により集め、そして１．０のＯＤ＠。。のアリコ−トに分割し、このこれらのアリコートを使用して、ＣｌＦ３．１ペプチド特異的抗血清を使用するドツトプロットおよびウェスタンプロット分析を実施した（実施例１参照）。結果について表１４を参照のこと。

精製およびアミノ酸分析のために、より大きい培養物を使用した。

表１４ｐＰＴＯ２９３６１２５１４１７４５ｐＰＴＯ２９４９１７９１５９７６５ｐＰＴＯ２９５１１２１５１７１７７５１）ＰＴＯ２９６１３２５１１８３７９０ｐＰＴＯ２９７１７３２３１１０７７１３０プラスミドｐＰＴ０２９３〜ｐＰＴＯ２９７を含有する大腸菌（Ｂ、　ｃｏｌｉ）株ＨＢＩＯＩを前述したように成長させた。これらの細胞により生産されたタンパク質を、５ＤＳ−ＰＡＧＥにより、ＣｌＦ３．１特異的抗血清に対して反応性の検出について分析した。各分析において、それぞれ４５ｋＤ〜１３０ｋＤの見掛けの分子量の強い反応性のバンドが観察された。

ｐＰＴＯ２９７１０７７アミノ酸　分子量：９１．２６６ダルトンＫＤＰｗＬＱＲＲＤＷＥＮ？にＶＴＱＬｔｌＲｆＪＪ’Ｊ（ＰＰＦＡＳＤＰＨ（ＧＡＰＧＡｉ ’ＧＳ凶ＡＰＧＬＱ１６ＢＧＡＭＤＰＧＲＭＱＬＳＡＧＲＹ）ｆＹＱＬＷＣＱＫ上の結果から明らかなように、高分子量のコラーゲン様ポリマーを生産することができる。これらのポリマーは、各トリアドの第１アミノ酸がグリシンである反復するトリアドにより特徴づけられる。

天然のコラーゲンに比較してプラスミドの百分率を低下させることによって、コラーゲンに類似するが、独特の特性を享受する、種々の有用なコラーゲン様ポリマーが生成される。それらの生成物はフィルム、繊維、成形品としての用途を見いだし、繊維、フィルム、実験器具または他の表面、例えば、補形物の装置などの上の他の天然または合成のポリマーまたはコーティングと混合された。

この明細書の中に述べたすべての刊行物および特許出願は、本発明が関係する分野における技術水準を示す。すべての刊行物および特許出願を、各個々の刊行物または特許出願が特定的にかつ個々に引用によって加えるべきことが示されるのと同じ程度に、ここに引用によって加える。

本発明を例示および実施例により理解を明瞭にする目的で多少詳細に説明したが、添付した請求の範囲の範囲内である種の変化および変更を実施できることが理解されるであろう。

フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　１５１０９／／Ａ６１Ｌ　２７１００　Ｄ　７２５２−４ＣＦ　７２５２−４ＣＰ　７２５２−４ＣＤ０６Ｍ　１６１００　Ｚ　７１９９−３８（Ｃ１２Ｐ　２１１０２Ｃ１２Ｒ１：１９）Ｉ

Claims

【特許請求の範囲】

１．ｉｎｖｉｔｒｏで製造された構成体からの単細胞生物の中で発現さされ、少なくとも８０重量％の第１アミノ酸としてグリシンを有するトリアドからなり、そして前記トリアドの少なくとも４０総数％は少なくとも１つのプロリンからなり、ここで前記トリアドの全体のプロリン含量は４５総数％より少なく、そして少なくとも２つの反復単位の（ＧＸｏ）ｍからなり、ここでＧ，Ｘおよびｏは個々のアミノ酸を記号で表し、そしてＧはグリシンであり、そしてＸおよび０は各トリアドの中の同一であるか、あるいは異なるアミノ酸であり、そしてｎは少なくとも４である、ことを特徴とする、少なくとも約３０ＫＤのコラーゲン様ポリマー。
２．前記ポリマーはアミノ酸の少なくとも１５総数％のプロリンからなり、そして約１５０ＫＤ以下である、請求の範囲１のコラーゲン様ポリマー。
３．プロリンからなるトリアドの数が少なくとも６０総数％である、請求の範囲２のコラーゲン様ポリマー。
４．トリアドの反復配列を有し、前記トリアドの各々は第１アミノ酸としてグリシンを有しそして次の式：▲数式、化学式、表等があります▼ 式中、Ｇはグリシンであり、Ｘおよび０は任意のアミノ酸であり、ただしＸおよびｏは少なくとも約１０総数％のかつ約４５総数％より少ない配列のプロリン含量を有するように選択され、Ｚは０〜５０アミノ酸を有しそして反復ＧＸｏ以外であり、ｎは４〜１００の範囲であり、そしてｍは少なくとも１つである、の配列の少なくとも１つの反復からなる、少なくとも約３０Ｋｄのコラーゲン様ポリマー。
５．少なくとも１つのＧＸｏはＧＡＰ、ＧＰＡ、ＧＰＰ、ＧＡＳ、ＧＰＳ、またはＧＤＰから成る、請求の範囲４のコラーゲン様ポリマー。
６．前記配列が約４０〜９５総数％のプロリンを含むトリアドからなる、請求の範囲５のコラーゲン樣ポリマー。
７．約４５総数％より少ないプロリンを有し、そして式：【配列があります】式中、Ｊ１およびＪ２は同一であるか、あるいは異なり、そして約１〜５０アミノ酸のアミノ酸配列であり、Ｇはグリシンであり、ＸおよびＯは任意のアミノ酸であり、ただしＸおよびＯは少なくとも約１５総数％のかつ約４５総数％より少ないポリマーのプロリン含量を有するように選択され、Ｚは０〜５０アミノ酸のアミノ酸配列であり、ｘおよびＯは各トリアドの中のＸおよびＯが同一であるか、あるいは異なることができることを示し、ｚは各Ｚの中のアミノ酸配列が同一であるか、あるいは異なることができることを示し、ＵおよびＢは任意のアミノ酸であり、ｕおよびｂは個々のトリアドの中の同一であるか、あるいは異なるアミノ酸を示し、ｎ１は約４〜７５の範囲であり、各ｒは同一であるか、あるいは異なり、そして０または１であり、ｐ２は０〜６の範囲であり、そしてｍ１は約１〜２０の範囲である、を有する、少なくとも約３０Ｋｄのコラーゲン様ポリマー。
８．請求の範囲１のコラーゲン様ポリマーをエンコードするＤＮＡ配列。
９．請求の範囲４のコラーゲン様ポリマーをエンコードするＤＮＡ配列。
１０．少なくとも約３０ＫＤおよび４５総数％より少ないプロリンのコラーゲン様ポリマーをエンコードするＤＮＡ配列からなる単細胞の微生物であって、前記コラーゲン様ポリマーは、ｉｎｖｉｔｒｏで製造された構成体からの前記単細胞生物の中で発現されることができ、少なくとも８０重量％の第１アミノ酸としてグリシンを有するトリアドからなり、そして前記トリアドの少なくとも４０総数％は少なくとも１つのプロリンからなり、ここで前記トリアドの全体のプロリン含量は４５総数％より少なく、そして少なくとも２つの反復単位の（ＧＸＯ）ｍからなり、ここでＧ，Ｘおよびｏは個々のアミノ酸を記号で表し、そしてＧはグリシンであり、そしてＸおよび０は各トリアドの中の同一であるか、あるいは異なるアミノ酸であり、そしてｎは少なくとも４である、ことを特徴とする、単細胞の微生物。
１１．少なくとも約３０ＫＤのコラーゲン様ポリマーをエンコードするＤＮＡ配列からなる単細胞の微生物であって、前記コラーゲン様ポリマーは、次の式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中、Ｇはグリシンであり、Ｘおよびｏは任意のアミノ酸であり、ただしＸおよびｏは少なくとも約１０総数％のかつ約４５総数％より少ない配列のプロリン含量を有するように選択され、Ｚは０〜５０アミノ酸を有しそして反復ＧＸｏ以外であり、ｎは４〜１００の範囲であり、そしてｍは少なくとも１つである、の配列の少なくとも１つの反復からなる、単細胞の微生物。
１２．少なくとも約３０ｋＤのコラーゲン様ポリマーをエンコードするＤＮＡ配列からなる単細胞の微生物であって、前記コラーゲン様ポリマーは、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中、Ｊ１およびＪ２は同一であるか、あるいは異なり、そして約１〜５０アミノ酸のアミノ酸配列であり、Ｇはグリシンであり、Ｘおよびｏは任意のアミノ酸であり、ただしＸおよびｏは少なくとも約１５総数％のかつ約４５総数％より少ないポリマーのプロリン含量を有するように選択され、Ｚは０〜５０アミノ酸のアミノ酸配列であり、ｘおよびｏは各トリアドの中のＸおよびｏが同一であるか、あるいは異なることができることを示し、ｚは各Ｚの中のアミノ酸配列が同一であるか、あるいは異なることができることを示し、ＵおよびＢは任意のアミノ酸であり、ｕおよびｂは個々のトリアドの中の同一であるか、あるいは異なるアミノ酸を示し、ｎ１は約４〜７５の範囲であり、各ｒは同一であるか、あるいは異なり、そして０または１であり、ｐ２は０〜６の範囲であり、そしてｍ１は約１〜２０の範囲である、を有する、単細胞の微生物。
１３．少なくとも約３０ｋＤのコラーゲン様ポリマーをエンコードする遺伝子からなるＤＮＡ配列であって、前記コラーゲン様ポリマーは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで製造された構成体からの単細胞生物の中で発現されることができること、少なくとも８０重量％の第１アミノ酸としてグリシンを有するトリアドからなること、そして少なくとも２つの反復単位の（ＧＸｏ）ｍからなり、ここでＧはグリシンであり、ＸおよびＯは各トリアドの中の同一であるか、あるいは異なり、そしてｎは少なくとも６であり、ここで前記ポリマーの中の１５〜４５総数％のプロリンを有するように選択されること、単細胞の微生物の中で前記遺伝子の５′末端において機能的な転写開始調節領域、単細胞の微生物の中で前記遺伝子の３′末端において機能的な転写終止調節領域、およびを特徴とし、ここで前記遺伝子は前記調節領域の転写調節下にある、ＤＮＡ配列。
１４．前記遺伝子が、次の式：（（ＧＸＯ）ｎＺ）ｍ式中、Ｇはダリシンであり、ＸおよびＯは任意のアミノ酸であり、ただしＸおよびＯは少なくとも約１０総数％のかつ約４５総数％より少ない配列のプロリン含量を有するように選択され、Ｚは０〜５０アミノ酸を有しそして反復ＧＸＯ以外であり、ｎは４〜１００の範囲であり、そしてｍは少なくとも１つである、の配列の少なくとも１つの反復からなるコラーゲン様ポリマーをエンコードする、請求の範囲１２のＤＮＡ配列。
１５．前記遺伝子が、式：Ｊ１ｒ（（ＧＵｘＢｂ）ｐ２（ＧＸｘＯｏ）ｎ１（ＧＵｕＢｂ）ｐ２Ｚｒ）ｍ１）Ｊ２式中、Ｊ１およびＪ２は同一であるか、あるいは異なり、そして約１〜５０アミノ酸のアミノ酸配列であり、Ｇはグリシンであり、ＸおよびＯは任意のアミノ酸であり、ただしＸおよびＯは少なくとも約１５総数％のつ約４５総数％より少ないポリマーのプロリン含量を有するように選択され、Ｚは０〜５０アミノ酸のアミノ酸配列であり、ｘおよびｏは各トリアドの中のＸおよびＯが同一であるか、あるいは異なることができることを示し、ｚは各Ｚの中のアミノ酸配列が同一であるか、あるいは異なることができることを示し、ＵおよびＢは任意のアミノ酸であり、ｕおよびｂは個々のトリアドの中の同一であるか、あるいは異なるアミノ酸を示し、ｎｌは約４〜７５の範囲であり、各ｒは同一であるか、あるいは異なり、そして０または１であり、ｐ２は０〜６の範囲であり、そしてｍ１は約１〜２０の範囲である、のコラーゲン様ポリマーをエンコードする、請求の範囲１２のＤＮＡ配列。
１６．ｉｎ　ｖｉｔｒｏで製造された構成体からの単細胞生物の中で発現され、少なくとも８０重量％の第１アミノ酸としてグリシンを有するトリアドからなり、そして少なくとも２つの反復単位の（ＧＸＯ）ｎからなり、ここでＧはグリシンであり、ＸおよびＯは各トリアドの中の同一であるか、あるいは異なり、そしてｎは少なくとも６であり、ここで前記ポリマーの中の１５〜４５総数％のプロリンを有するように選択される、ことを特徴とする、少なくとも約３０ｋＤのコラーゲン様ポリマーを生産する方法であって、前記方法は、請求の範囲１２のＤＮＡ配列からなる単細胞の微生物を前記遺伝子を発現するために十分な時間の間成長させ、そして前記コラーゲン様ポリマーを分離する、ことからなる方法。
１７．ｉｎ　ｖｉｔｒｏで製造された構成体からの単細胞生物の中で発現され、少なくとも８０重量％の第１アミノ酸としてグリシンを有するトリアドからなり、そして少なくとも２つの反復単位の（ＧＸＯ）ｍからなり、ここでＧはグリシンであり、Ｘおよび０は各トリアドの中の同一であるか、あるいは異なり、そしてｎは少なくとも６であり、ここで前記ポリマーの中の１５〜４５総数％のプロリンを有するように選択される、ことを特徴とする、少なくとも約３０ｋＤのコラーゲン様ポリマーからなる成形された物品。
１８．前記成形された物品がゲル、フィルムまたは繊維である、請求の範囲２６の成形された物品。
１９．請求の範囲１のコラーゲン様ポリマーまたは前記コラーゲン様ポリマーの断片に応答して製造された抗体組成物。