JPH0749364B2 - イネ科作物の病害防除微生物および病害防除方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、イネ科作物の病害、特
にイネ幼苗腐敗症及びイネもみ枯細菌病の防除に有効な
新規微生物及びこの微生物を用いてイネ科作物の病害を
防除する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】イネもみ枯細菌病菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ ｇｌｕｍａｅ）によって引き起こされる病気で
あるイネもみ枯細菌病は、日本、韓国、中国などの他、
東南アジアのイネ栽培地域に広く分布し、イネの収量に
重大な被害を与えている。当初、本病原細菌は、イネの
穂のみに病気を起こす細菌であると考えられていたが、
その後の研究により本細菌はイネの幼苗に対しても病原
性を示すことが明らかにされた。幼苗に対する被害は、
水稲栽培の特殊性に基づく育苗箱の普及に伴ってわが国
の重大な問題となっている。従って、イネもみ枯細菌病
菌についてこれまで発生生態の解明、栽培法と発病との
関係及び防除法の開発など広範囲な研究が実施されてい
る。しかしながら、今なお伝染経路や侵入感染機構に不
明な部分もあって、まだ的確な防除法は確立されていな
い。現在、防除対策としては塩水選による罹病もみの除
去、各種薬剤による種子消毒、及びカスガマイシン・キ
ャプタン水和剤、ポリカーバメイト水和剤などの育苗箱
施用等が挙げられている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしこれらの薬剤
は、効果の不安定なこと、病菌菌株によって効果の異な
ること、及び生育抑制の薬害が現れるなどのことから、
実用化にあたっては、さらに検討しなければならないの
が現状である。また抵抗性品種の利用も考えられている
が、本細菌病に対する抵抗性遺伝子がイネに存在するか
否かも明確ではない。このように現在までに行われてい
る防除法は、充分な効果を挙げていないのが現状であ
り、新しい防除法の開発が望まれている。

【０００４】近年、土壌伝染性の植物病害を防除する手
段の一つとして、より自然に立脚した生物的防除方法の
開発が重要視されている。中でも各種抗菌物質産生性の
根圏微生物の利用に関する研究は世界各国で進められて
おり、幾つかの成功例が報告されている。また病原性細
菌から病原性を喪失あるいは除去した非病原性変異菌株
を利用した研究も多い。これら非病原性菌株の中には病
原性菌株と同様に宿主内で増殖し、生態学的に病原性菌
株とほぼ同様な挙動を示すものも存在する。このような
非病原性菌株で予め宿主植物体を前処理することによ
り、その後接種した病原性細菌の侵入を防ぎ、或いは増
殖を抑制することにより、発病を抑制する可能性が考え
られる。本発明者らは、このような考えに基づいて、非
病原性イネもみ枯細菌病菌を利用することによってイネ
もみ枯細菌病を生物的に防除する方法について検討を重
ね、本発明をなすに至った。

【０００５】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、イ
ネ科作物の病害防除に有効で病原性のない新規シュード
モナス グルメ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｌｕｍａ
ｅ）に関する。また、さらに本発明は、この新規シュー
ドモナスグルメをイネ種子に接種するかあるいは土壌に
散布することによってイネ科作物の病害を防除する方法
に関する。本発明におけるイネ科作物の病害とは、イネ
幼苗腐敗症及び／またはイネもみ枯細菌病をいう。本発
明における新規シュードモナス グルメは、微工研に、
微工研菌寄第１２１０５号として寄託されている。ま
た、本発明では、この菌株を放射線、化学薬品等で変異
させた菌株も、イネ科作物の病害が防除でき、病原性の
ない限り、本発明の菌株のなかに包含される。

【０００６】この新規シュードモナス グルメをイネ種
子に接種する場合は、菌株濃度が１０⁸ 〜10¹²ｃｆｕ／
ｍｌの懸濁液に、イネ種子を浸漬することにより行うこ
とが好ましい。また、新規シュードモナス グルメを土
壌に散布して防除する場合は、１０⁷ 〜１０¹⁰ｃｆｕ／
ｇ−土壌の菌体濃度になるように散布することが好まし
い。

【０００７】本発明者らは、福岡地方の田で生育させた
イネからイネもみ枯細菌病に侵されたもみを選別し、こ
れを７０％のエタノール水溶液に数秒浸漬した後、有効
塩素濃度３％の次亜塩素酸ナトリウム水溶液に５分間浸
し、滅菌蒸留水で水洗した後、すりつぶし、これをＰＳ
Ａ平板培地に展開して、これからイネもみ枯細菌を４７
菌株分離した。

【０００８】これらのイネもみ枯細菌は、次の菌学的性
質を有する。桿菌状で、極毛を有する。好気性で、生育
適温は３０〜３５℃、４０℃でも生育可能。コロニーは
灰白色を呈する。キング培地で生育可能。ゼラチン液
化、硝酸塩還元、リトマスミルク還元、アンモニア産
生、硫化水素産生、カタラーゼ、レシチナーゼは、いず
れもプラス。インドール産生、ＭＲ反応、オキシターゼ
は、いずれもマイナス。

【０００９】次に、このなかからイネばかりでなく他の
植物体にも病原性を持たない点でのみ菌学的性質が相違
し、その他の点ではイネもみ枯細菌病と同様の性質を示
す非病原性イネもみ枯細菌の選択を行なった。

【００１０】この選択についてさらに詳細に説明する。 １．非病原性イネもみ枯細菌病菌の選択 イネもみ枯細菌病菌はイネの幼苗及び穂を侵す病原細菌
であるため、たとえ発病抑制効果が認められても、これ
をそのまま生物的防除に利用することは危険である。し
かし、この菌はｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて病原性を喪失
し易い性質をもっており、保存中あるいは継代培養中に
病原性を喪失することもある。一方、本発明者らは、こ
の菌がイネに対する病原性の他、ジャガイモ、ニンジン
等の組織切片を腐敗させる性質を有する事を見出した。
そこで全ての作物に対して非病原性の菌株を選抜する目
的で本菌の各種作物に対する病原性を検討した。

【００１１】植物材料としては、ジャガイモ（メークイ
ン）、ニンジン（品種不明）及びトマト苗（東光）、イ
ネ種子（あそみのり）を実験に供試した。各種野菜組織
に対する腐敗能の検定は次の方法で行った。各種野菜組
織を３％次亜塩素酸ナトリウム（アンチホルミン）に１
５分間浸漬することによって表面殺菌を行い、その後滅
菌水で充分に水洗して滅菌メスで厚さ約５ｍｌに切断
し、これをろ紙を敷いた直径９ｃｍの滅菌シャーレに置
き、滅菌水を５ｍｌ入れ、ＰＳＡ斜面培地に３０℃で４
８時間培養したイネもみ枯細菌病菌を切断面の中央部に
１白金耳量接種した後、３０℃に４８時間静置し、腐敗
能の有無を検討した。トマト苗に対する病原性の検討
は、ＰＳＡ斜面培地に３０℃で４８時間培養したイネも
み枯細菌病菌の各菌株を滅菌した白金耳で斜面からかき
とり、これを予め７０％エタノールで表面殺菌したトマ
ト苗（播種後３週間）の茎に多針接種することにより行
った。イネに対する病原性の検討は次のように行った。
すなわち、供試品種あそみのりの種子を３％次亜塩素酸
ナトリウム（アンチホルミン）で３０分間消毒後、充分
水洗し、２５℃で２日間浸種した。この種子６０粒を直
径９ｃｍの滅菌シャーレにとり、これに濃度約１０⁹ ｃ
ｆｕ／ｍｌの細菌懸濁液１５ｍｌを注入し、３０℃で２
４時間浸漬接種した。その後、オートクレーブで滅菌し
たくみあい培土（三井東圧製）８０ｇを入れ、滅菌蒸留
水３０ｍｌを灌水した、６０×６０×４５ｍｍのプラス
チック製容器に播種し、種子がかくれる程度に同くみあ
い培土で覆土し、３２℃の接種箱中（湿度１００％）で
２日間育苗した。さらに、２５℃の空調温室で緑化した
後接種１５日目に発病の有無と程度を調査した。

【００１２】

【表１】

【００１３】結果は表１に示した通りである。イネに対
して病原性を示さない菌株が１５菌株存在した。トマト
に対する病原性は供試した全ての菌株で認められなかっ
た。各種野菜組織に対して腐敗能を示さずかつトマト、
イネに対しても病原性を示さない菌株８菌株、即ち、Ｎ
７５０４，Ｎ７５０３，ＹＮ７８１０，ＹＮ７８０５，
ＹＮ７８２５，７５０，７５２，８０５が選抜できた。
また、ジャガイモに対する腐敗能とイネに対する病原性
との間には供試した４７菌株において高い関連性が認め
られた。これらの１５菌種は継代培養あるいは保存中に
イネに対する病原性が喪失したものと考えられる。そし
てこれらの非病原菌は、ジャガイモ等その他の植物に対
しても病原性を示すことはない。

【００１４】次に、これら非病原性細菌がイネもみ枯細
菌病菌で起こるイネ幼苗腐敗症の発病を抑制することが
できるか否かについて検討した。 ２．非病原性イネもみ枯細菌病菌によるイネ幼苗腐敗症
の発病抑制効果 病原性菌株４菌株（Ｋｕ８１１１、２、Ｓｏ−１、Ｋｙ
ｕ８２−３４−２）及び非病原性菌株５菌株（Ｎ７５０
３、Ｎ７５０、ＹＮ７８１０、ＹＮ７８２５、８０５）
を実験に供試した。イネ品種はあそみのりを用いた。非
病原性イネもみ枯細菌病菌によるイネ幼苗腐敗症の発病
抑制効果の検定を次の方法で行った。すなわち、水保存
菌をＹＰＤＡ斜面培地に移植し、３０℃で４８時間培養
後、滅菌蒸留水１０ｍｌに懸濁（濃度：約１０^９ｃｆｕ
／ｍｌ）、これをＹＰＤ液体培地２００ｍｌに加え、３
０℃で４８時間振とう培養した。その後、３，６００×
ｇで２０分間遠心を行い、得られた菌体を滅菌蒸留水に
約１０^１０ｃｆｕ／ｍｌになるように懸濁し、これにメ
チルセルロースを１．５％になるように加えた。イネ種
子は３％次亜塩素酸ナトリウム（アンチホルミン）で３
０分表面殺菌した後、滅菌水で充分に洗浄し、メチルセ
ルロースを含む細菌懸濁液に３０℃で２４時間浸漬処理
した。対照として細菌を含まない１．５％メチルセルロ
ース液に浸漬した種子を用いた。病原性菌株は、非病原
性菌株と同様に培養後、約１０^８ｃｆｕ／ｍｌの濃度に
なるように滅菌水で調節し、これを接種源とした。非病
原性菌株及び病原性菌株の菌濃度は実験の度にＹＰＤＡ
平板培地を用い、希釈平板法に従って求めた。非病原性
菌株液に浸漬したイネ種子は、滅菌したくみあい培土
（三井東圧製）約８０ｇの入った６０×６０×４５ｍｍ
のプラスチック製容器に６０粒ずつ播種し、覆土（２０
ｇ）した後、接種源である病原性菌株の細菌懸濁液を１
０ｍｌずつ灌注接種した。処理した容器は、３２℃で４
８時間接種箱（湿度：１００％）に入れて催芽させた
後、２５〜３０℃の空調温室なるいは２８℃の植物育成
チャンバー内に置き、緑化させた。灌水は１日１回行っ
た。発病度の判定は接種後１５日目に行った。全ての実
験は２回以上反復した。発病度の検定は、図１に示すよ
うに病徴の激しさの度合いによって、０〜５の６段階
（発病度０は健全苗、１は健全苗と背丈は変らないが葉
身にクロロシスが現れたもの、２は健全苗より背丈が低
く、葉鞘基部のネクロシスが見られるもの、３は葉身の
クロロシス、葉鞘基部にネクロシスに加えて、全身が異
常形態を呈しているもの、４は本葉第１葉しか展開して
おらず全体的に退緑したもの、５は腐敗枯死したもの）
に分けて調査し、発病度は各区６０粒の平均値をもって
示した。

【００１５】実験の結果を表２に示す。この表から明ら
かなように、非病原性菌株でイネ種子を浸漬処理するこ
とによってイネ幼苗腐敗症の発病が抑制されることが明
らかとなった。しかし、その発病抑制効果の程度は非病
原性菌株−病原性菌株の組み合わせによって著しく異な
り、全く発病抑制効果の見られないものから高い発病抑
制効果を示すものまで存在した。すなわち、病原性菌株
Ｓｏ−１に対しては、非病原性菌株Ｎ７５０３、Ｎ７５
０、ＹＮ７８２５、８０５によって発病が抑制された。
他方、ＹＮ７８１０で処理しても抑制効果は得られなか
った。病原性菌株２に対しては、Ｎ７５０３、８０５で
発病抑制効果が認められたが、Ｎ７５０、ＹＮ７８１
０、ＹＮ７８２５では全く抑制されなかった。病原性菌
株Ｋｙｕ８２−３４−２に対しては、非病原性菌株Ｎ７
５０３で処理した場合だけに発病抑制効果が認められ、
非病原性菌株Ｎ７５０、ＹＮ７８１０、ＹＮ７８２５、
８０５で処理しても発病は抑制されなかった。さらに病
原性菌株Ｋｕ８１１１に対しては、Ｎ７５０３、ＹＮ７
８１０、８０５で発病抑制効果が認められ、Ｎ７５０で
は弱く、ＹＮ７８２５では効果は得られなかった。この
結果、非病原性菌株Ｎ７５０３でイネ種子を処理するこ
とによってイネ幼苗腐敗症の発病を抑制できることが確
認された。

【００１６】

【表２】

【００１７】３．浸漬処理用の菌濃度と発病抑制効果と
の関係 そこで、この非病原性菌株Ｎ７５０３の菌濃度と発病抑
制効果との関係について検討した。非病原性菌株として
Ｎ７５０３を、また病原性菌株としてＳｏ−１を供試し
た。発病抑制効果の検定は前記した方法に従って行っ
た。すなわち、水保存してある各菌株をＹＰＤＡ平板培
地に広げて単一コロニー分離を行い、これを２００ｍｌ
のＹＰＤ液体培地の入った坂口フラスコに接種し、３０
℃で４８時間振とう培養を行い、遠心（８，０００×
ｇ、２０分間）によって得られた菌体を滅菌蒸留水に約
１０¹⁰ｃｆｕ／ｍｌになるように懸濁し、これを１０倍
段階希釈することにより約１０¹⁰、１０⁸ 、１０⁶ ｃｆ
ｕ／ｍｌの細菌懸濁液を作成した。この各濃度の非病原
性菌株Ｎ７５０３の懸濁液にメチルセルロースを１．５
％になるように加え、これに３％次亜塩素酸ナトリウム
（アンチホルミン）で表面殺菌を行ったイネ種子を浸漬
し、３０℃で２４時間静置後、滅菌したくみあい培土８
０ｇの入った容器に６０粒ずつ播種し、２０ｇのくみあ
い培土で覆土した後、各濃度の病原性菌株Ｓｏ−１の細
菌懸濁液を１０ｍｌずつ灌注接種を行い、３０℃で４８
時間接種箱に置き、２８℃で１日１２時間照明に調節し
た植物育成チャンバー内に入れ、１５日目に発病度の検
定を行った。

【００１８】この結果を表３に示した。表３から明らか
なように、非病原性菌株の濃度が１０¹⁰ｃｆｕ／ｍｌの
細菌懸濁液でイネ種子を処理した場合、土壌中の病原性
菌株の菌濃度が１０¹⁰ｃｆｕ／ｇと高濃度であっても高
い発病抑制効果が示された。しかし、非病原性菌株の菌
濃度が１０⁸ ｃｆｕ／ｍｌ以下になり、さらに、病原性
菌株の菌濃度が１０⁶ ｃｆｕ／ｇと低くなると発病抑制
効果は得られず、効果を得るためには高濃度（１０¹⁰ｃ
ｆｕ／ｍｌ）の非病原性菌株の懸濁液で処理する必要が
あることが明らかとなった。

【００１９】

【表３】

【００２０】さらに、本発明では、本発明のシュードモ
ナス グルメＮ７５０３がイネ科作物の病害防除に使用
できることを立証するため、次の試験を行った。

【試験１】 非病原性Ｎ７５０３菌株の各種病原性菌株
に対する発病抑制効果 非病原性菌株Ｎ７５０３の持つ発病抑制効果が、さらに
多くの他の病原性菌株に対しても同様に高い発病抑制効
果を示すか否かについて検討を行った。

【００２１】すなわち、九州大学植物病理学教室保存の
イネもみ枯細菌病菌の菌株の内、強い病原性を示すＫｕ
８１０６、Ｋｕ８１２１、III 、８００１、８０１７、
Ｉ、Ｋｕ８１０５の計５菌株を供試し、Ｎ７５０３菌株
の発病抑制効果を検討した。発病抑制試験は前記の方法
によって行った。この結果は表４に示したように非病原
性菌株Ｎ７５０３は供試した全ての病原性菌株に対して
強い発病抑制効果を持つ菌株である事が明らかとなっ
た。

【００２２】

【表４】

【００２３】

【試験例２】 カスガマイシン・キャプタン水和剤との
発病抑制効果の比較本発明のＮ７５０３菌株のイネ幼苗
腐敗症の防除効果と、従来イネ幼苗腐敗症の防除に有効
なイネ育苗箱施用剤として報告されているカスガマイシ
ン・キャプタン水和剤の防除効果とを比較した。

【００２４】すなわち、病原性菌株Ｓｏ−１と非病原性
菌株Ｎ７５０３との組み合わせで、イネ品種としてはあ
そみのりを用いて実験を行った。発病抑制試験は前記方
法によった。カスガマイシン・キャプタン水和剤は、１
容器当たり２００倍希釈液（原体換算でカスガマイシン
１．２ｇ＋キャプタン１．２ｍｇ）１０ｍｌを、播種後
覆土前に滅菌土壌に灌注することにより処理した。

【００２５】この結果を表５に示す。Ｎ７５０３でイネ
種子を前処理することにより得られる発病抑制効果は、
カスガマイシン・キャプタン水和剤を土壌１当たり０．
４ｍｇで施用した場合に得られる発病抑制効果とほぼ同
程度のものであった。しかし、カスガマイシン・キャプ
タン水和剤で処理した区では、Ｎ７５０３の前処理また
は１．５％メチルセルロースのみで処理した区と比べ
て、イネ幼苗の苗丈が低いなど、若干の成育抑制が見ら
れる場合があった。非病原性菌株で前処理したものは、
防除薬剤とほぼ同程度の効果が得られ、その生育は無処
理区との間に殆ど差は認められなかった。

【００２６】

【表５】

【００２７】

【試験３】 発病抑制効果の品種間差異 本発明の非病原注菌株が、イネ品種あそみのりがイネ幼
苗腐敗症の発病を顕著に抑制することが明らかとなった
ので、この効果が他のイネの品種においても認められる
かどうか検討した。

【００２８】すなわち、イネ品種として、あそみのり、
太刀風、黄玉、中国４５号、クジュウ、愛知旭、農林２
９号、ＩＲ６４、イナバワセの計９品種を供試した。細
菌は非病原性菌株としてＮ７５０３、ＹＮ７８１０及び
８０５を、また病原性菌株としてＳｏ−１、Ｋｙｕ８２
−３４−２及び２を用いた。非病原性菌株による種子処
理、病原性菌株の接種及び効果の検定は前記した発病抑
制試験に示した方法で行った。

【００２９】この結果を表６及び表７に示す。実験結果
から非病原性菌株による発病抑制効果には品種間差異が
存在することが明らかとなった。非病原性菌株８０５と
病原性菌株Ｋｙｕ８２−３４−２の組み合わせにおいて
は、太刀風、黄玉、中国４５号及びクジュウで発病抑制
効果が認められたが、他の品種（あそみのり、愛知旭、
農林２９号、ＩＲ６４、イナバワセ）においては全く発
病は抑制されなかった。非病原性菌株８０５と病原性菌
株２の組み合わせでは、愛知旭、中国４５号で発病抑制
効果は認められず、農林２９号において若干の発病抑制
が認められ、他の６品種（あそみのり、太刀風、黄玉、
クジュウ、ＩＲ６４、イナバワセ）においては高い発病
抑制効果を示した。また、非病原性菌株ＹＮ７８１０と
病原性菌株Ｓｏ−１の組み合わせでは、太刀風、クジュ
ウ、イナバワセにおいては全く発病抑制効果は得られ
ず、他の品種（あそみのり、黄玉、中国４５号、愛知
旭、農林２９号、ＩＲ６４）では高い発病抑制効果が得
られた。非病原性菌株Ｎ７５０３と病原性菌株Ｓｏ−１
の組み合わせでは、全ての品種において発病を抑制する
ことが明らかとなった。以上のことから発病抑制効果発
現には非病原性菌株、病原性菌株及びイネ品種の３者の
間の特異的な関係が関与することが判明した。

【００３０】

【表６】

【表７】

【００３１】

【試験４】 イネ幼苗腐敗症発病抑制機作の検討 １．さらに、本発明では、非病原性イネもみ枯細菌病菌
によるイネ幼苗腐敗症発病抑制機作を知るために、ま
ず、非病原性菌株の病原性菌株に対する抗菌活性を検討
した。すなわち、非病原性菌株Ｎ７５０３、Ｎ７５０、
８０５、ＹＮ７８１０、ＹＮ７８２５及び病原性菌株Ｋ
ｕ８１１１、２、Ｓｏ−１、Ｋｙｕ８２−３４−２を供
試した。抗菌物質の産生性及び活性の検定にはＹＰＤＡ
平板培地を用い、プレートクロロホルム法及びＵＶ照射
の２通りの方法で行った。ＵＶ照射は、培養後コロニー
の形成が認められたシャーレの上蓋を外し、１５Ｗの殺
菌ランプ（東芝ＧＬ−１５）で高さ３０ｃｍから３時間
行った。その後、３０℃で２４時間静置し、指示菌であ
る病原性菌株を重層し、３０℃で培養後コロニーの周囲
に形成される阻止帯の有無により抗菌物質産生性を検討
した。

【００３２】この結果、供試した非病原性菌株Ｎ７５０
３及びＮ７５０において抗菌活性が認められた。これら
の菌株が形成した阻止帯の巾は数ｍｍ程度の小さなもの
であった。しかし、非病原性菌株が病原性菌株に対して
培地上で示す抗菌活性と発病抑制効果との間には直接的
な関連性は認められなかった。

【００３３】２．次にイネもみ枯細菌病菌以外の既知植
物病原細菌及び腐生菌についてイネ幼苗腐敗症の発病抑
制効果を検討した。九州大学植物病理学教室において保
存してある植物病原細菌Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｋｕ７４１１、Ｅｒｗｉｎｉ
ａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ ｓｕｂｓｐ．ｃａｒｏｔｏ
ｖｏｒａ Ｎ７１２９、Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｍｉ
ｃｈｉｇａｎｅｎｓｅ ｐｖ．ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓ
ｅＮ６６０１、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ
ＡＴＣＣ ６６３３、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒ
ｉｎｇａｅ ｐｖ．ｓｙｒｉｎｇａｅ Ｉ、及びＰｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓｅ ｐ−１
５を供試した。これらの細菌はそれぞれＰＳＡ斜面培地
上に３０℃で４８時間培養後、２００ｍｌのＹＰＤ液体
培地の入った坂口フラスコに移植し、３０℃で４８時間
培養し、遠心（８，０００×ｇ、２０分）によって菌体
を集め、これを約１０¹⁰ｃｆｕ／ｍｌになるように滅菌
水に懸濁し、前処理に用い、前記した発病抑制試験を行
った。

【００３４】この結果、イネ幼苗腐敗症の発病抑制効果
は、非病原性イネもみ枯細菌病菌のみによって示され
た。供試したその他全ての細菌では発病抑制効果が全く
認められないことが明らかとなった。

【００３５】３．また、非病原性菌株の培養濾液でイネ
種子を処理した場合の発病抑制効果について検討した。
すなわち、非病原性菌株Ｎ７５０３をＹＰＤ液体培地
（２００ｍｌ）に接種し、３０℃で４日間振とう培養
後、遠心（８，０００×ｇ、２０分）し、上清を孔径
０．２μｍのメンブランフィルターを通し完全に除菌す
ることにより非病原性菌株培養濾液を得た。この培養濾
液に表面殺菌したイネ種子を２４時間浸漬し、これを病
原性菌株Ｓｏ−１が土壌１ｇ当たり２．６×１０⁷ ｃｆ
ｕになるように接種した汚染土壌に播種し、１５日目に
発病度を調査した。

【００３６】その結果、培養濾液の原液を用いた場合
も、１／１００希釈した場合も殆ど差のない発病度を示
し、培養濾液による発病抑制効果は全く認められなかっ
た。

【００３７】４．さらに、非病原性イネもみ枯細菌病菌
によるイネ幼苗腐敗症の発病抑制効果が死菌によっても
認められるか否かについて検討した。供試菌株として非
病原性菌株Ｎ７５０３、及び病原性菌株Ｓｏ−１を用い
た。ＰＳＡ斜面培地上に３０℃で４８時間培養した非病
原性菌株Ｎ７５０３を約10¹⁰ｃｆｕ／ｍｌになるように
滅菌蒸留水に懸濁した後、次に示す３通りの方法によっ
て死菌の作成を行った。１００℃で１０分間の熱処
理、滅菌シャーレに細菌懸濁液を２〜３ｍｌずつ入
れ、１５Ｗの殺菌ランプ（東芝ＧＬ−１５）で３０ｃｍ
の高さから４時間照射、細菌懸濁液約１０ｍｌを５０
ｍｌのビーカーに取り、これをクロロホルム約２００ｍ
ｌの入った２，０００ｍｌのビーカーに入れアルミニウ
ム箔で密封し、スターラーで撹拌しながら４時間の蒸気
処理を行った。発病抑制試験は前記した方法によって行
なった。

【００３８】これらは、いずれの場合においても発病抑
制効果が全く認められなかった。このことから非病原性
菌株による発病抑制効果は生菌によってのみ示される事
が明らかとなった。

【００３９】５．さらに、種子処理法及び接種法の違い
が発病抑制効果に及ぼす影響について検討した。すなわ
ち、高い発病抑制効果の認められる非病原性菌株Ｎ７５
０３と病原性菌株Ｓｏ−１の組み合わせを用いて行っ
た。非病原性菌株と病原性菌株の混合液（濃度Ｎ７５０
３：６．３×１０⁹ ｃｆｕ／ｍｌ、Ｓｏ−１：２．３×
１０⁷ ｃｆｕ／ｍｌ）及び非病原性菌株、病原性菌株の
単独液にメチルセルロースを１．５％になるように加
え、これらの液に表面殺菌したイネ種子を浸漬し、３０
℃で２４時間保った。処理した種子を、１００℃のくみ
あい培土の入った容器に６０粒ずつ播種し、３２℃で湿
度１００％の接種箱に４８時間保った後、２８℃、１日
１２時間照射の植物育成チャンバー内に置き、播種後１
５日目に発病度の検定を行った。また、濃度６．３×１
０⁹ ｃｆｕ／ｍｌの非病原性菌株懸濁液及び濃度２．７
×１０⁷ ｃｆｕ／ｍｌの病原性菌株懸濁液を１容器（１
００ｇのくみあい培土）当り１０ｍｌずつ混合し、この
土壌に表面殺菌した種子を播種した後、上記と同様に播
種１５日目に発病度の調査を行った。さらに、病原性菌
株接種後に非病原性菌株で処理した場合の発病抑制効果
の検定を以下の方法で行った。表面殺菌を行ったイネ種
子を病原性菌株Ｓｏ−１の細菌懸濁液（濃度：２．３×
１０⁸ ｃｆｕ／ｍｌ）で種々の時間（１０分、２４、４
８、７２、９６、１０２時間）浸漬接種後、１００ｇの
くみあい培土の入った容器に６０粒ずつ播種し、非病原
性菌株Ｎ７５０３の細菌懸濁液（濃度：約１０^9-10ｃｆ
ｕ／ｍｌ）を１０ｍｌずつ灌注し、３２℃で湿度１００
％に保った接種箱に４８時間入れ、その後２８℃で１日
１２時間照明の植物育成チャンバー内に置き、育苗し
た。発病後の検定は播種後１５日目に行った。

【００４０】実験の結果を表８及び表９に示す。表８に
示したように、病原性菌株を単独でイネ種子にコーティ
ングした区では全ての固体が完全に腐敗・枯死したのに
対し、非病原性菌株と病原性菌株の混合液でイネ種子を
コーティングした場合、発病度０．７を示し、高い発病
抑制効果が認められた。また、濃度２．３×１０⁶ ｃｆ
ｕ／ｇの病原性菌株で汚染した土壌に播種した場合には
３．６の発病度を示したのに対して、この土壌に非病原
性菌株が６．３×１０⁸ ｃｆｕ／ｇの濃度で存在した場
合には発病度が０．６と顕著な抑制効果を示した。ま
た、表９から明らかなように、先に病原性菌株Ｓｏ−１
をイネ種子に浸漬接種し、非病原性菌株Ｎ７５０３が土
壌１ｇ当たり約１０⁹ｃｆｕの菌量で存在している土壌
に播種した場合にも発病は顕著に抑制された。さらに、
イネ種子を病原性菌株の細菌懸濁液に１２０時間浸漬接
種した場合でも非病原性菌株を添加した土壌に播種すれ
ば発病が抑制されることが明らかとなった。この結果か
ら発病を防止するには、イネ種子を本発明の非病原性菌
株で被覆するかあるいはイネ種子を播種する土壌に本発
明の非病原性菌株を添加するとその効果を充分に達成す
ることができる。

【００４１】

【表８】

【表９】

【００４２】６．またさらに、非病原性菌株によるイネ
幼苗腐敗症の発病抑制効果の機作を明らかにする目的
で、イネ発芽液中及び栄養分の極端に限られている滅菌
水中における非病原性菌株と病原性菌株との競合関係に
ついて検討を行った。非病原性菌株としてＮ７５０３、
病原性菌株としてストレプトマイシン耐性のＳｏ−１−
ＳＲを用いた。イネ発芽液は次のようにして調整した。
即ち、３％次亜塩素酸ナトリウム（アンチホルミン）で
９０分間表面殺菌した種子を滅菌水で充分に洗浄後、滅
菌水５０ｍｌの入った１００ｍｌの三角コルベンに１０
粒ずつ入れ、３０℃で１日１２時間照明の植物育成チャ
ンバー内に７日間置き、その後滅菌ピンセットでイネ植
物体を除去、メンブランフィルター（孔径０．２μｍ）
を通すことにより完全に除菌した液をイネ発芽液とし
た。この発芽液を１００ｍｌの三角コルベンに２８ｍｌ
ずつ入れ、これに供試菌を所定の濃度（Ｎ７５０３：１
×１０ｃｆｕ／ｍｌ、Ｓｏ−１−ＳＲ：３×１０ｃｆｕ
／ｍｌ）になるように接種した後、３０℃で静置培養
し、経時的にＹＰＤＡ及びストレプトマイシン５００ｐ
ｐｍ含有ＹＰＤＡ培地を使用する希釈平板法により細菌
の定量を行った。イネ発芽液の代わりに滅菌蒸留水を用
いたものを対照とした。

【００４３】病原性菌株Ｓｏ−１−ＳＲをイネ発芽液中
に３×１０ｃｆｕ／ｍｌになるように単独接種して培養
した場合、その菌数は培養２日目に１×１０⁷ ｃｆｕ／
ｍｌに達し、その後若干の減少が見られたが、培養１５
日目まで約１０⁶ ｃｆｕ／ｍｌのほぼ一定の菌量で生存
した。非病原性菌株Ｎ７５０３と混合培養した場合、病
原性菌株Ｓｏ−１−ＳＲの増殖は著しく抑制され、培養
２日目に単独培養の菌数に比べて約１／１００、培養５
日目には約１／１０となり、その後１５日目まで約１／
１０の濃度で推移した。非病原性菌株Ｎ７５０３の増殖
は病原性菌株Ｓｏ−１−ＳＲとの混合培養によっても減
少せず、単独培養の場合とほぼ同様の増殖パターンを示
した。また、滅菌蒸留水中においてもイネ発芽液中の増
殖パターンと同様の傾向が認められた。すなわち、混合
培養において病原性菌株Ｓｏ−１−ＳＲの増殖は抑制さ
れ、培養２日目から１５日目まで単独培養の場合と比べ
て約１／１０の菌量で推移した。

【００４４】７．またさらに非病原性菌株でイネ種子を
処理することにより病原性菌株によるイネ幼苗腐敗症の
感染及び発病が抑えられる。この場合、イネもみにおい
て病原性菌株及び非病原性菌株がどのように消長するか
について検討を行なった。菌株は発病抑制効果の認めら
れる組み合わせとして非病原性菌株Ｎ７５０３と病原性
菌株２−ＳＲ及び効果の認められない組み合わせとして
非病原性菌株ＹＮ７８１０と病原性菌株２−ＳＲを供試
した。イネ品種あそみのりの種子から外穎と内穎を取り
除き、３％次亜塩素酸ナトリウム（アンチホルミン）で
９０分間表面殺菌し、滅菌蒸留水で充分に洗浄した。こ
の種子を０．５％の素寒天２０ｍｌの入った１００ｍｌ
の三角コルベンに１０粒ずつ播種し、非病原性菌株（濃
度：約１０¹⁰ｃｆｕ／ｍｌ）及び病原性菌株（濃度：約
１０⁸ ｃｆｕ／ｍｌ）の混合液を２ｍｌ及び各細菌液を
２倍に希釈した単独液を２ｍｌがつ接種した。その後２
５℃で３４，０００〜４０，０００ｌｕｘ照明の条件下
で育苗し、２日間隔で各菌の定量をＹＰＤＡ平板培地及
びストレプトマイシン１００ｐｐｍ含有ＹＰＤＡ平板培
地を用いて行った。

【００４５】この結果、病原性菌株２−ＳＲを単独で接
種した区においては、時間の経過とともに増殖し、接種
後１０日目には１種子当たり約１０⁷ ｃｆｕの菌量に達
した。しかし、発病抑制効果を示す非病原性菌株Ｎ７５
０３との混合培養においては、病原性菌株２−ＳＲは接
種後１０日目においても１種子当たり１×１０⁵ ｃｆｕ
／ｍｌの値にとどまり、接種時の菌量とほぼ同じ値であ
った。また、発病抑制効果を示さない非病原性菌株ＹＮ
７８１０との混合培養では、病原性菌株２−ＳＲは単独
培養の場合と同様に増殖していき、接種後１０日目には
１種子当たり１×１０⁷ ｃｆｕの菌量に達した。両非病
原性菌株は単独、混合の両培養において１０日目まで１
種子当たり約１０⁷ ｃｆｕの菌量で一定していた。この
ように、発病抑制効果の認められる菌株の組み合わせで
は病原性菌株の増殖が非病原性菌株との混合培養によっ
て抑えられる傾向が認められた。

【００４６】８．さらに、イネもみ枯細菌病菌は培地中
で毒素を産生することが報告されている。しかし、培地
中では病原性の有無にかかわらず毒性物質を産生するこ
とが明らかとなった。一方、非病原性菌株は土壌中では
イネに対する生育抑制を示さないことから、このイネ及
び土壌が関与した条件下で病原性菌株が産生する毒素を
非病原性菌株が中和あるいは解毒することにより発病が
抑制される可能性も十分に考えられる。このことを明ら
かにする目的で以下の実験を行った。

【００４７】非病原性菌株による毒素の解毒は次の方法
により検討した。すなわち、くみあい培土５００ｇに対
して蒸留水１，０００ｍｌを加え、時々撹拌しながら２
４時間静置し、吸引濾過によりくみあい培土の水抽出液
を得た。これを１００ｍｌの三角コルベンに１８ｍｌず
つ分注し加圧滅菌した。これに３％次亜塩素ナトリウム
（アンチホルミン）で表面殺菌した無菌のイネ種子を２
０粒ずつ加え、病原性菌株２（菌濃度：約１０^９ｃｆｕ
／ｍｌ）の細菌懸濁液を２ｍｌずつ接種し、２５℃で３
４，０００〜４０，０００ｌｕｘ照明下で１０日間育苗
した。その後イネ種子を取り除き、１０，０００×ｇ、
２０分間の遠心を行い、得られた上清を０．２μｍのメ
ンブランフィルターで処理し、完全に除菌した病原性菌
株２の培養濾液を得た。この培養濾液を２ｍｌずつ滅菌
試験管に入れ、これにＹＰＤＡ斜面培地で３０℃、４８
時間培養した非病原性菌株Ｎ７５０３を約１０^９ｃｆｕ
／ｍｌになるように接種し、２５℃で培養した。培養１
０日目に、１０，０００×ｇ、２０分間の遠心により培
養濾液からの菌体を除き、０．２μｍのメンブランフィ
ルターを通すことにより完全に除菌し、得られた濾液を
２ｍｌずつ滅菌試験管に分注、これに表面殺菌したイネ
種子を２粒ずつ入れ、２５℃、３４，０００〜４０，０
００ｌｕｘの条件下で育苗し、１０日目に幼苗長及び細
長を測定し、解毒の有無を調べた。

【００４８】この結果、病原性菌株２の培養濾液では幼
苗長６．８ｍｍ、根長１．０ｍｍと強い生育阻害が認め
られたのに対して、これに非病原性菌株Ｎ７５０３を接
種し１０日間培養した濾液では幼苗長９１．６ｍｍ、根
長８３．０ｍｍと、対照区とほぼ同様の生育を示し、毒
素の活性が著しく低下している事が明かとなった。

【００４９】次に本発明の実施例を示す。

【実施例１】シュードモナス グルメＮ７５０３菌株を
約１０¹⁰ｃｆｕ／ｍｌの菌体濃度になるように滅菌蒸留
水に懸濁し、これにメチルセルロースを１．５％になる
ように加えた。この懸濁液１００ｍｌに、イネ種子あそ
みのり６０粒を３０℃で２４時間浸漬した。この種子を
１２０℃で３０分間滅菌したくみあい培土（三井東圧社
製）約８０ｇの入った容器に播種し、２０ｇ覆土した
後、病原性菌株の懸濁液（約１０⁸ ｃｆｕ／ｍｌ）を１
０ｍｌ灌注した。１５日経過したが発病は観察されなか
った。一方、Ｎ７５０３菌株を接種しなかった種子につ
いて、同様の試験を行った結果、これらは全て発病し
た。

【００５０】

【実施例２】１２０℃で３０分間滅菌した土壌に、シュ
ードモナス グルメＮ７５０３菌株を６．３×１０⁸ ｃ
ｆｕ／ｇ−土壌及び病原性シュードモナス グルメを
２．３×１０⁶ ｃｆｕ／ｇ−土壌になるように散布、混
合した。この土壌にあそみのり種子を播種した。種子
は、その後、発芽し、生育したが発病は観察されなかっ
た。一方Ｎ７５０３を混合せず、病原性菌のみを混入し
た区では、全て発病した。

【００５１】

【実施例３】イネ品種あそみのりを播種し、その２６日
目に、ワグネルポットに５株づつ移植して生育させ、移
植後８５日目の開花期に、シュードモナス グルメＮ７
５０３菌株の懸濁液（菌体濃度２．５×１０¹⁰ｃｆｕ／
ｍｌ）及び病原性菌株の懸濁液（Ｓｏ−１菌体濃度：
２．５×１０⁸ ｃｆｕ／ｍｌ、Ｋｕ８１１１菌体濃度：
１．７×１０⁸ ｃｆｕ／ｍｌ）の混合液（１：１）、ま
たは前記Ｎ７５０３菌株の懸濁液２倍希釈液或いは前記
病原性菌株の懸濁液２倍希釈液を、それぞれ１ポット当
たり５０ｍｌづつ噴霧接種した。接種後、３日間ビニー
ルで被覆し、２０日目に穂の発病の有無を調査し、罹病
株率及び１穂平均罹病度を算出した。この結果を表１０
に示した。

【００５２】

【表１０】 接種菌株 罹病株率（％） １穂平均罹病度 N7503 の２倍希釈液 ０ ０ N7503:So-1混合液 ４０．０ ５ N7503:Ku8111混合液 ３５．０ １５ So-1の２倍希釈液 ９０．０ ２０ Ku8111の２倍希釈液 ９０．０ ３８ ブランク ０ ０

【図面の簡単な説明】

【図１】シュードモナス グルメで惹起されるコメ種子
疾病の指標０〜５Ｎは壊死（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）をＣは
褪緑（ｃｈｌｏｒｏｓｉｓ）を示す。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 イネ科作物の病害防除に有効な病原性の
   ない新規シュードモナス グルメ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
   ａｓ ｇｌｕｍａｅ）Ｎ７５０３（微工研菌寄第１２１
   ０５）。
2. 【請求項２】 病原性のない新規シュードモナス グル
   メ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｌｕｍａｅ）Ｎ７５０
   ３（微工研菌寄第１２１０５）をイネ種子に接種するこ
   とを特徴とするイネ科作物の病害防除方法。
3. 【請求項３】 病原性のない新規シュードモナス グル
   メ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｌｕｍａｅ）Ｎ７５０
   ３（微工研菌寄第１２１０５）を土壌に散布することを
   特徴とするイネ科作物の病害防除方法。
4. 【請求項４】 イネ科作物の病害防除がイネ幼苗腐敗症
   及びイネもみ枯細菌病の防除である請求項（２）〜
   （３）のいずれかに記載の方法