JPH07291859A

JPH07291859A - 転写因子活性阻害剤

Info

Publication number: JPH07291859A
Application number: JP11168694A
Authority: JP
Inventors: Masaki Goto; 正樹後藤; Isao Tanaka; 勲田中; Koji Yamada; 浩司山田; Koichi Katayama; 幸一片山
Original assignee: Eisai Co Ltd
Current assignee: Eisai Co Ltd
Priority date: 1994-04-28
Filing date: 1994-04-28
Publication date: 1995-11-07

Abstract

(57)【要約】【目的】本発明は、転写因子ＮＦκＢの活性を阻害す
ることにより、ＮＦκＢ結合配列を有するＤＮＡ遺伝子
のＲＮＡへの転写及びタンパク質への翻訳を阻害し、そ
の遺伝子がコードするタンパク質などの産生を抑制する
ＮＦκＢの活性阻害剤を提供することを目的とする。【構成】式【化１】又は【化２】で表される化合物又はその薬理学的に許容できる塩を有
効成分とする組成物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、NFκB の活性阻害剤又
はNFκB 活性阻害作用に基づく、抗炎症，抗自己免疫疾
患及び抗ウイルス剤等に関する。

【０００２】

【従来の技術】

〈発明の背景〉遺伝子の本体であるDNA は、様々な因子
により調節を受けており、遺伝情報の発現が制御されて
いる。例えばDNA からmRNAへの転写は、その遺伝子上の
数個から数十個の塩基配列を認識し結合する複数個のDN
A 結合タンパク質により制御を受けている。このような
DNA 結合タンパク質の一つとして知られるNFκB は、抗
体産生細胞であるB 細胞の核抽出液中に存在し、免疫グ
ロブリンκ軽鎖(Ig κ) 遺伝子のエンハンサーに結合す
る因子として同定された。その後研究が進むと、刺激誘
導される多くの遺伝子の発現誘導などに関与する転写因
子であり、広く生命現象の制御に関わることが明らかに
なってきた。

【０００３】このNFκB は、通常細胞質内に分子量50kD
のタンパク質のホモダイマーまたは分子量50kDのタンパ
ク質と分子量65kDのタンパク質のヘテロダイマーが、I
κBという活性を抑制するタンパク質と結合して存在し
ている。そして細胞に一定の刺激が与えられるとI κB
が修飾を受けて複合体からはずれてNFκB が活性化さ
れ、そのダイマーが核内へ移行することによりDNA 結合
活性が検出されるようになる。この活性はセカンドメッ
センジャーなど別の遺伝子の発現を介さない直接的な活
性化の結果生じることがわかっている。

【０００４】また、DNA 上のNFκB 結合配列は様々な遺
伝子に見出されており、実際に遺伝子の機能発現に重要
であることが示されている。その結合配列（κB モチー
フ）は、約10塩基より構成され、共通するのはG(ク゛アニン)
のクラスターで始まりC(シトシン) のクラスターで終ること
である。ところで、炎症タンパク質として知られている
インターロイキン-1(IL-1)や腫瘍壊死因子(TNF) の遺伝
子上にも多くのDNA 結合タンパク質が結合する配列が存
在するが、その中にNFκB の結合配列も存在することが
わかっており(Clark,B.D.et al.,Nucl.Acids Res.,14,
7898,1984;Nedospasov,S.A.et al.,Cold SpringHarb. S
ymp. Quant. Biol.,51,611,1986) 、実際にNFκB の結
合がmRNAへの転写を制御していることが報告されている
(Hiscott,J.et al.,Mol. Cell. Biol.,13,6231,1993;Co
llart,M.A.et al.,Mol. Cell. Biol.,10,1498,1990) 。

【０００５】〈従来技術〉従来NFκB の転写活性を阻害
する物質としては、NFκB 結合性タンパク質がヨーロッ
パ特許公開公報第５８４２３８号に開示されている。

【０００６】また、以下の式で表される化合物（１），
（２）はIL-1とTNF 産生をそれぞれのmRNAの産生レベル
で抑制することが報告されている(Goto,M.et al.,Agent
s Actions.,32,225,1991;Miyamoto,K.et al,Agents Act
ions.,37,297,1992)。

【０００７】

【化１３】

【０００８】

【化１４】

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】生体膜を構成するリン
脂質は、種々の刺激により誘導されるホスホリパーゼに
よってアラキドン酸を遊離する。このアラキドン酸がリ
ポキシゲナーゼやシクロオキシゲナーゼ等の酵素系で代
謝されることによりロイコトリエン，トロンボキサン，
プロスタグランジン等が産生される。これらの物質は複
雑な生理活性を示し、生体の維持・調節に重要な働きを
有している。例えば、ロイコトリエンB₄は白血球の遊
走、リソゾーム酵素分泌や活性酸素産生などに関与する
一方、免疫系に対して促進的に作用し、インターロイキ
ン1 ，2 の産生を促進したり、リンパ球の活性化を増強
することが知られている。トロンボキサンB₂はトロン
ボキサンA₂の安定代謝物で、トロンボキサンA₂は細動脈
収縮作用や血小板凝集作用により局所微小循環に関与す
る。またプロスタグランジンE₂は血管拡張作用や血管透
過性抗進作用を有し、炎症作用に寄与する。また、免疫
系に対しては抑制的に作用しさらに、サイトプロテクシ
ョンにより細胞を種々の刺激から保護することも報告さ
れている。

【００１０】生体は外からの様々な刺激を受けることに
より、種々のサイトカインが遊離され炎症反応を生じ
る。従来の薬物は、ヒスタミン等のメディエーターレセ
プターへの拮抗作用やいわゆるアラキドン酸カスケード
中のリポキシゲナーゼまたはサイクロオキシゲナーゼ等
の代謝酵素を阻害することによりヒスタミンやロイコト
リエンB₄若しくはプロスタグランジンE₂等の炎症タンパ
クの発現を抑制するものである。しかし、非ステロイド
系の薬物ではその効果は対症療法を期待するものであり
根本治療としては十分なものとはいえず、ステロイド系
の薬物は有効ではあるが副作用が強く、長期投与ができ
ないという問題があった。特に自己免疫疾患等の炎症性
の疾患は、慢性化することが多く、長期療養が必要とな
り副作用のある薬物の使用には向いていない。また、ヨ
ーロッパ特許公開公報第５８４２３８号に開示されてい
る物質は蛋白質であり、その安定性から薬物として投与
するときにさまざまな障害がある。本発明者等は、炎症
性疾患に対する原因療法を確立すべく、各種炎症性のサ
イトカインを根本的に抑制する方法や物質について永年
にわたり鋭意検討を重ね、転写因子NFκB の活性阻害作
用に基づき、各種サイトカイン等を遺伝子レベルで抑制
する化合物を見いだし本発明を完成した。

【００１１】

【課題を解決するための手段】すなわち本発明は、式

【００１２】

【化１５】

【００１３】または

【００１４】

【化１６】

【００１５】で表される化合物又はその薬理学的に許容
できる塩を有効成分とするNFκB の活性阻害剤、及び、
式

【００１６】

【化１７】

【００１７】または

【００１８】

【化１８】

【００１９】で表される化合物又はその薬理学的に許容
できる塩を有効成分とするNFκB の活性阻害作用が有効
な疾患の治療・予防剤、並びに、NFκB 活性阻害作用に
基づく、抗炎症，抗自己免疫疾患及び抗ウイルス剤、及
び、炎症性疾患，自己免疫性疾患及びウイルス性疾患治
療予防剤である。

【００２０】前記式で表される化合物（３），（４）は
転写因子NFκB の活性を阻害することにより、NFκB 認
識配列を有するDNA の転写を阻害する。従ってNFκB 認
識配列を有する遺伝子であれば、その遺伝子に対応する
タンパク質の発現を有効に阻害することが可能である。
従ってIL-1，TNF を始めインターロイキン-2(IL-2)，イ
ンターロイキン-6(IL-6)，インターロイキン-8(IL-８)
，顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF)，インターフェロ
ンβ(INF- β) 等のサイトカインを始め、インターロイ
キン-1レセプターアンタゴニスト(IL-1RA)等の炎症性サ
イトカインのレセプターアンタゴニストおよび、その他
の主要組織適合抗原系(MHC) クラスI ，MHC クラスII，
β2 マイクログロブリン，免疫グロブリン軽鎖，血清ア
ミロイドA，アンジオテンシノーゲン，補体B ，補体C4
タンパクの遺伝子や、オンコジーンの一つであるC-myc
遺伝子、ヒューマンイミュノデフィシェンシィーウイル
ス(HIV) ，シミアンウイルス40(SV40)，サイトメガロウ
イルス(CMV) ，アデノウイルス等ウイルスの遺伝子等の
発現を抑制することにより、これらが関連する疾患を予
防・治療することができる。以下にその疾患を例示す
る。慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、全身
性強皮症、ベーチェット病、結節性動脈周囲炎、潰瘍性
大腸炎、活動性慢性肝炎、糸球体腎炎などを初めとする
各種自己免疫疾患；変形性関節症、痛風、アテローム硬
化症、乾癬、アトピー性皮膚炎、肉芽腫を伴う肺疾患、
各種脳炎など炎症症状が病態の基本になっている難治性
各種疾患、エンドトキシンショック、敗血症、炎症性大
腸炎、糖尿病、急性骨髄芽球性白血病、肺炎、心臓移
植、脳脊髄炎、食欲不振、急性肝炎、慢性肝炎、薬物中
毒性肝障害、アルコール性肝炎、ウイルス肝炎、黄疸、
肝硬変、肝不全、心房粘液腫、キャッスルマン症候群、
多発性骨髄腫、レンネルトＴリンパ腫、メサンギウム増
殖性腎炎、腎細胞癌、サイトメガロウイルス性肺炎、サ
イトメガロウイルス性網膜症、アデノウイルス性感冒、
アデノウイルス性プール熱、アデノウイルス性眼炎、エ
イズなどの疾患の治療及び予防に効果を示す。

【００２１】本発明における式

【００２２】

【化１９】

【００２３】または

【００２４】

【化２０】

【００２５】で表される化合物の製造方法は特に限定さ
れないが、例えば、それぞれ特開平2-256645号公報、特
開平3-188042号公報に示される方法により合成すること
ができる。また、本発明にかかる化合物は、その構造式
から明らかなように二重結合を有するので、シス，トラ
ンスの幾何異性体が存在しうるが、いかなる異性体も本
発明の範囲に包含される。

【００２６】本発明化合物をこれらの疾患の治療・予防
剤として投与する場合は、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセ
ル剤、シロップ剤などとして経口的に投与してもよい
し、また坐剤、注射剤、外用剤、点滴剤などとして非経
口的に投与してもよいが、本発明の場合は、経口剤とし
て投与することが望ましい。投与量は、疾患の種類、症
状の程度、年齢などにより著しく異なるが、例えば経口
剤としてヒトに投与する場合は、0.001 〜20mg/kg 、好
ましくは0.01〜15mg/kg であり、更に好ましくは0.1 〜
10mg/kg を１日１〜数回に分けて投与する。経口・非経
口投与のための製剤化は、通常の製薬的に許容できる担
体を用い、常法により製造する。

【００２７】すなわち経口用固形製剤を調製する場合
は、主薬に賦形剤、さらに必要に応じて結合剤、崩壊
剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤などを加えた後、常法
により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤など
とする。賦形剤としては、例えば乳糖、コーンスター
チ、白糖、ブドウ糖、ソルビット、結晶セルロース、二
酸化ケイ素などが、結合剤としては、例えばポリビニル
アルコール、ポリビニルエーテル、エチルセルロース、
メチルセルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチ
ン、シェラック、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒド
ロキシプロピルメチルセルロース、クエン酸カルシウ
ム、デキストリン、ペクチン等が、滑沢剤としては、例
えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレン
グリコール、シリカ、硬化植物油等が、着色剤としては
医薬品に添加することが許可されているものが、矯味矯
臭剤としては、ココア末、ハッカ脳、芳香酸、ハッカ
油、龍脳、桂皮末等が用いられる。これらの錠剤、顆粒
剤には糖衣、ゼラチン衣、その他必要により適宜コーテ
ィングすることはもちろん差し支えない。また必要に応
じて防腐剤、抗酸化剤等を添加することができる。

【００２８】注射剤、点滴剤などを調製する場合は、主
薬に必要によりpH調製剤、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤
などを添加し、必要ならば凍結乾燥などを行って、常法
により皮下・筋肉・静脈内用注射剤、点滴注射剤とす
る。以下に、本発明の具体的な代表的実施例を挙げる
が、本発明はこれらのみに限定されるものではない。

【００２９】

【実施例】

実験例実験例１ゲルシフトアッセイ TNF-αとHIV-1 のNFκB プローブを用いてゲルシフトア
ッセイを行った。TNF-αのNFκB プローブとしては、転
写開始位置からそれぞれ634 番目のNFκB 様サイト［下
線部］( κB-1,5'-GGGTCTGTGAATTCCCGGGGGTGA-3') を用
いた。HIV-1 NFκB プローブとしては、転写開始位置か
らそれぞれ103 番目と90番目(5'-GGCTACAAGGGACTTTCCGC
TGGGGACTTTCCAGG-3') のNFκB 様サイトを用いた。DNA
は二本鎖で用い、[ α-³²P]dCTP とクレノウフラグメン
ト(Klenow Fragment) を用いて常法により標識し、NAP-
5 カラム（ゲルろ過カラム) で精製した。核抽出物2 μ
g と³²P-標識したTNF-α又はHIV-1 のNFκB プローブ(1
0,000-20,000cpm)を結合緩衝液（10mMTris-HCl，40mMNa
Cl，10%glycerol ，1mMEDTA ，1mMDTT，1%NP-40 ，1%デ
オキシコレイト，3 μg/mlpoly[dI-dC] ）中、室温で30
分間結合反応させた。DNA-NFκB 複合体と遊離のオリゴ
ヌクレオチドを分離するために5%非変性ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を行った。ゲルを減圧乾燥後、富士BA
S2000 イメージアナライザーにて核抽出物中のNFκB と
これに結合したオリゴヌクレオチド複合体のバンド（黒
化度）を定量した。同様に試験化合物の効果を試すため
に核抽出物はヒト単球を10ng/ml のLPS で2 時間刺激し
て得たものを用いた。そして、2 μg の抽出物又はヒト
組換えp50タンパクとTNF-α又はHIV-1 のNFκB プロー
ブを前記化合物（１）の存在、非存在下で室温で反応さ
せ、比較した。ヒト単球のLPS 刺激によるNFκB 結合活
性化に対する化合物（１）の作用( 抑制率%)を表１に示
した。

【００３０】

【表１】

【００３１】実験例２トランスフェクション実験 HIV-1 のロングターミナルリピート(LTR) 上に存在する
NFκB 配列を4 個組み込み、分泌型のヒト胎盤型アルカ
リフォスファターゼ(PLAP)を連結させたプラスミド(HIV
-1- κB-PLAP) 、HIV-1 LTR にPLAPを連結させたプラス
ミド(HIV-1 LTR-PLAP ：NIH より入手) 、ヒトTNF-α遺
伝子の転写開始部位から1.4kb 上流領域配列にPLAPを連
結させたプラスミド(TNF- α-PLAP)、SV40のpromoterを
PLAPに連結したプラスミド(pSV2-PLAP) を作成した。前
者3 つのプラスミドはNFκB 配列を有している。これら
のプラスミドを、それぞれマウスのマクロファージ細胞
株のRaw264.7にDEAE- デキストラン法を用いてトランス
フェクトした。これらの細胞を前記化合物（１）の存在
下、非存在下にLPS(1 μg/ml) で48時間刺激後、培養上
清中に放出されたアルカリフォスファターゼを蛍光検出
試薬ルミステイン(商標：住友金属社製) を用いてMicro
Lumat LB96P (EG&G,BERTHOLD)にて蛍光を測定した。化
合物（１）非存在下で得られた蛍光に対する抑制率を、
図２に示した。

【００３２】

【表２】

【００３３】実験例３ヒト末梢血単球のリポポリサッ
カライド(LPS) 刺激により活性化されるNFκB の核内移
行に対する作用健常成人男子静脈血よりフィコール／パック比重遠心法
により単核球画分を得た。このうち、プラスチックシャ
ーレに付着した細胞を単球として用いた。前記化合物
（１）又は（２）で細胞を30分処理した後、LPS10ng/ml
で細胞を2 時間刺激した。回収した細胞から核抽出物を
部分精製した。この核抽出物を[ α-³²P]dCTP （デオキ
シシチジン三リン酸）で標識したNFκB 認識配列を有す
るオリゴヌクレオチドと室温で30分、結合反応を行っ
た。なお、NFκB 認識配列を有するオリゴヌクレオチド
は、各遺伝子の5'- 上流域に存在する固有の配列で、IL
-1βは、5'-GGGAAAATCC-3'、TNF-αは、5'-GTGAATTCCC-
3'、IL-6は、5'-GGGATTTTCC-3'、IL-8は、5'-GGAATTTCC
T-3'、IL-1RAは、5'-GGGTATTTCC-3'という配列でありそ
れぞれのオリゴヌクレオチドを核酸合成機にて調製し
た。核抽出物中のNFκB とこれに結合したオリゴヌクレ
オチド複合体を、遊離のオリゴヌクレオチドを分離する
ために5%非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行っ
た。ゲルを減圧乾燥後、富士BAS2000 イメージアナライ
ザーにて核抽出物中のNFκB とこれに結合したオリゴヌ
クレオチド複合体のバンド（黒化度）を定量した。化合
物（１）及び（２）の核抽出物中のNFκB への移行の抑
制率を表３に示した。

【００３４】

【表３】

【００３５】実験例４ヒト末梢血単球のリポポリサッ
カライド(LPS) 刺激によるIL-1β、TNF-α、IL-6の産生
に対する作用ヒト末梢血単球を、前記化合物（１）または化合物
（２）で細胞を30分処理した後、LPS10ng/mlで細胞を18
時間刺激した。培養上清中のIL-1β、TNF-α、IL-6をEL
ISA キット(R&D社) にて測定した。化合物（１）及び
（２）のIL-1β、TNF-α、IL-6産生抑制率を、表４に示
した。

【００３６】

【表４】

【００３７】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ０７Ｃ 59/82 9450−4Ｈ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】式【化１】または【化２】で表される化合物又はその薬理学的に許容できる塩を有
効成分とするＮＦκＢの活性阻害剤。
【請求項２】式【化３】または【化４】で表される化合物又はその薬理学的に許容できる塩を有
効成分とするＮＦκＢの活性阻害作用が有効な疾患の治
療・予防剤。
【請求項３】式【化５】または【化６】で表される化合物又はその薬理学的に許容できる塩を有
効成分とするＮＦκＢ活性阻害作用に基づく、炎症性疾
患治療予防剤。
【請求項４】式【化７】または【化８】で表される化合物又はその薬理学的に許容できる塩を有
効成分とするＮＦκＢ活性阻害作用に基づく、自己免疫
性疾患治療予防剤。
【請求項５】式【化９】または【化１０】で表される化合物又はその薬理学的に許容できる塩を有
効成分とするＮＦκＢ活性阻害作用に基づく、ウイルス
性疾患治療予防剤。
【請求項６】式【化１１】または【化１２】で表される化合物又はその薬理学的に許容できる塩を有
効成分とするＮＦκＢ活性阻害作用に基づく、インター
ロイキン-1，腫瘍壊死因子，インターロイキン-2，イン
ターロイキン-6，インターロイキン-8，顆粒球コロニー
刺激因子，インターフェロンβ，インターロイキン-1レ
セプターアンタゴニスト，主要組織適合抗原系クラスI
，主要組織適合抗原系クラスII，β2 マイクログロブ
リン，免疫グロブリン軽鎖，血清アミロイドA ，アンジ
オテンシノーゲン，補体B ，補体C4，C-myc 、ヒューマ
ンイミュノデフィシェンシィーウイルス，シミアンウイ
ルス40，サイトメガロウイルス及びアデノウイルスから
なる群より選ばれる１又は２以上の物質の遺伝子の発現
抑制剤。