JPH07274960A

JPH07274960A - β−マンナナーゼ生産菌及びβ−マンナナーゼの製法

Info

Publication number: JPH07274960A
Application number: JP8753294A
Authority: JP
Inventors: Isao Kusakabe; 功日下部; Shigeki Yoshida; 滋樹吉田
Original assignee: SHIROGANE BIO KIKAKU KK
Current assignee: SHIROGANE BIO KIKAKU KK
Priority date: 1994-04-01
Filing date: 1994-04-01
Publication date: 1995-10-24

Abstract

(57)【要約】【目的】発酵法によってβ−マンナナーゼを製造する
際、得られた酵素の煩雑な精製処理の必要性を解消す
る。【構成】細胞外酵素としてβ−マンナナーゼのみを生
産するバチルス・ズブチリスＭ−１を使用する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、β−マンナナーゼを生
産する能力を有する新規な微生物及び該微生物を使用す
るβ−マンナナーゼの製法に係る。

【０００２】

【従来の技術】β−マンナナーゼは、Ｄ−マンナン及び
Ｄ−ガラクト−Ｄ−マンナンの１,４−β−Ｄ−マンノ
ピラノシル結合を任意に加水分解し得る加水分解酵素で
ある。バチルス・ズブチリス及びアスペルギルス・ニー
ガーからの高度に精製した酵素調製物は、コンニャクの
Ｄ−グルコ−Ｄ−マンナンを減成して、Ｄ−グルコー
ス、Ｄ−マンノース、及び一連のマンノ−及びグルコマ
ンノ−オリゴ糖を生成することが知られている。

【０００３】このようなβ−マンナナーゼは、細菌、真
菌、植物等、各種の起源から単離されている。たとえ
ば、ペニシリウム属菌（特開昭51−151388号)、バチル
ス属菌（微工研菌寄第5732号及び第5733号：特公昭57−
59754号)、(微工研菌寄第7648号：特公昭63−18474
号)、(FERM P−8857：特公平３−65754号)(FERM P−885
8：特開平３−47076号)、ストレプトマイセス属菌、エ
アロモナス属菌、アスペルギルス属菌に由来するものが
ある。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】上述の如く、β−マン
ナナーゼは各種の起源から得られているが、これらのβ
−マンナナーゼはいずれも他の酵素（特にα−マンナナ
ーゼ、β−マンノシダーゼ等）と混合した状態で得られ
るため、各々の酵素を単離、精製して単独で使用する場
合、その精製工程が極めて煩雑であり、コストの上昇を
招いている。

【０００５】

【課題を解決するための手段】発明者らは、このような
従来技術の欠点を解消するため、細胞外酵素としてβ−
マンナナーゼのみを生産する微生物の検討を行い、かか
る目的に適する新たな微生物を土壌の中から見い出し、
本発明に至った。

【０００６】これによれば、本発明の第１の目的は、細
胞外酵素としてβ−マンナナーゼのみを生産するバチル
ス・ズブチリスに属する新規な微生物を提供することに
ある。

【０００７】さらに、本発明の第２の目的は、前記β−
マンナナーゼ生産能を有する微生物を培養し、β−マン
ナナーゼを培養液中に生成、蓄積せしめ、これを採取す
ることを特徴とするβ−マンナナーゼの製法を提供する
ことにある。

【０００８】本発明の新規なβ−マンナナーゼ生産菌は
土壌中から単離されたもので、その菌学的性質は次のと
おりである。１形態学的性質形態桿菌サイズ 0.5〜1.0×２〜2.5μｍグラム染色性陽性運動性あり芽胞胞子のう非膨出形楕円形位置亜端立２生理的性質最適生育条件 pH 5.5〜7.0 温度 25〜35℃ カタラーゼ＋嫌気下での生育 − Ｖ−Ｐ反応＋Ｖ−ＰブロスのpH 5.5 グルコースからの酸の産生＋グルコースからのガスの産生 − ゼラチン液化＋デンプン分解＋クエン酸塩の利用＋プロピオン酸塩の利用 − 卵黄反応 − 硝酸塩還元＋ pH6.8での生育(ニュートリエントフ゛ロス) ＋ pH5.7での生育＋５％NaCl存在下での生育＋７％NaCl存在下での生育 − 10℃での生育 − 30℃での生育＋ 50℃での生育＋ 55℃での生育 − これらのデータをBergey's Mannual of Determinatives
Bacteriology第８版と比較することにより、該微生物
はバチルス・ズブチリス（Bacillus subtillis）の一亜
種であると同定された。

【０００９】この菌株をバチルス・ズブチリスＭ−１と
命名し、1994年２月９日付けで工業技術院生命工学工業
技術研究所に寄託した（受託番号FERM P−14139）。

【００１０】次に本発明の新規なβ−マンナナーゼ生産
菌バチルス・ズブチリスＭ−１を使用するβ−マンナナ
ーゼの製法について詳述する。

【００１１】ペプトン 1.2％、酵母エキス 0.5％、KH₂P
O₄ １％、MgSO₄・７H₂O 0.05％を含有する基本培地に炭
素源を添加し、バチルス・ズブチリスＭ−１を接種し、
温度25〜35℃において好気的条件下で培養を行う。

【００１２】炭素源としては、グアーガム、ローカスト
ビーンガム、ブラウンコプラミール、コンニャクマンナ
ンを使用できる。中でもローカストビーンガムが好適で
ある。炭素源は基本培地に0.5〜５％の量、好ましくは
１〜３％の量で添加される。

【００１３】窒素源についても特に制限はなく、ペプト
ン、酵母エキス以外にも一般に使用されているもの（た
とえば、肉エキス、コーンスティープリカー等）を使用
でき、その濃度によっても酵素の生産量は左右されな
い。

【００１４】本発明のバチルス・ズブチリスＭ−１を使
用するβ−マンナナーゼの製法の特徴の１つは、培養開
始時から６時間あたりまでは酵素生産が増加するが、そ
の後はほぼ定常に達することである。

【００１５】基本培地に炭素源としてローカストビーン
ガム 2.5％を加えて35℃で培養した場合、酵素活性の最
大値は培養６時間目の15.2単位（Ｕ）／mlである。

【００１６】なお、酵素活性の測定に当たっては、基質
としてコプラマンナン 71.1mg（マンノースとして50.0m
g）をＬ字管に取り、これにMcllvaine Buffer pH6.8 4.
0ml、超純水5.0mlを加え、Monod振とう機で55℃、15分
間プレインキュベートした後、酵素液を1.0ml加えて30
分間反応させ、反応後、反応液1.0mlを採取し、生成し
た還元糖量をソモギー法で求めて酵素活性に換算した。

【００１７】本発明のβ−マンナナーゼ生産菌はβ−マ
ンナナーゼを細胞外に生産するため、生産されたβ−マ
ンナナーゼは培地中に蓄積する。その後、蓄積したβ−
マンナナーゼを採取する。

【００１８】培養はバッチ式又は連続式のいずれの方式
によっても実施される。

【００１９】生産されたβ−マンナナーゼの採取、精製
に当たっては、培地中の菌体を遠心分離によって除去し
て上清液を得る。この上清液を酵素調製物として使用で
きる。

【００２０】本発明の方法によって生産されたβ−マン
ナナーゼの性質は下記のとおりである。（イ）作用マンナン、グルコマンナン、ガラクトグルコマンナンの
β−１,４−マンノピラノミド結合を非特異的に加水分
解し、最終的にマンノオリゴ糖、グルコマンノオリゴ
糖、ガラクトマンノオリゴ糖を生成する。（ロ）基質特異性 β−マンナンに特異的に作用し、α−マンナンには作用
しない。（ハ）至適pH及び安定pH範囲至適pHは6.8であり、30℃、３時間、pH６〜９で安定で
ある。（ニ）温度に対する安定性 pH6.8、２時間の条件で50℃まで安定である。（ホ）作用適温の範囲 55℃近傍に至適作用を有する。（ヘ）失活条件 pH6.8、60℃、30分でほぼ失活する。（ト）等電点電気泳動法による等電点 6.5 （チ）SDS−ポリアクリルアミド電気泳動法 37,000

【００２１】

【実施例１】バチルス・ズブチリスＭ−１を、ローカス
トビーンガム 2.5％、ペプトン 1.2％、酵母エキス 0.5
％、KH₂PO₄ 1.0ｇ、MgSO₄・７H₂O 0.05％を含有する培
地（pH無調整）100mlに接種し、35℃、24時間、120rpm
で振とう培養した。培養後、培養液を遠心分離（8000rp
m）に供して上清液95mlを得た。この上清液はβ−マン
ナナーゼ 1.5Ｕ／mlを含有していた。

【００２２】

【実施例２】同じ基本培地に、ローカストビーンガムの
代わりにグアーガム２％を添加して、実施例１と同様に
バチルス・ズブチリスＭ−１の培養を行った。得られた
上清液はβ−マンナナーゼ 1.5Ｕ／mlを含有していた。

【００２３】

【実施例３】同じ基本培地に、ローカストビーンガムの
代わりにコプラ搾油残渣１％を添加して、実施例１と同
様に培養を行った。得られた上清液はβ−マンナナーゼ
0.3Ｕ／mlを含有していた。

【００２４】次に、上述の各実施例で得られた上清液を
使用して各種の糖の加水分解を行った。

【００２５】

【実験１】1.0重量％コンニャクマンナン溶液（pH6.8）
100mlに実施例１で得られた上清液の10倍希釈液1.0mlを
添加し、55℃で反応させた。反応系中に存在する還元糖
の量（−●−）及び反応系の粘度（−○−）の経時変化
を図１に示す。

【００２６】

【実験２】1.0重量％ローカストビーンガム溶液（pH6.
8）100mlに実施例１で得られた上清液の10倍希釈液1.0m
lを添加し、55℃で反応させた。反応系中に存在する還
元糖の量（−●−）及び反応系の粘度（−○−）の経時
変化を図２に示す。

【００２７】図１及び図２のグラフから本発明の方法に
よって得られた酵素がβ−マンナナーゼであることが明
らかである。

【００２８】

【実験３】実施例１で得られた上清液を使用して、グア
ーガム、コンニャクマンナン、ローカストビーンガムと
共に、PNP−β−Ｄ−マンノピラノシド、Avicel及びβ
−１,４−キシランの加水分解を行った。

【００２９】本発明の方法で得られた酵素調製物は、グ
アーガム、コンニャクマンナン、ローカストビーンガム
を加水分解してオリゴ糖を生成するが、PNP−β−Ｄ−
マンノピラノシド、Avicel及びβ−１,４−キシランに
は全く作用しなかった。後者の化合物はいずれもβ−
１,４−結合を有するものであり、この事実から本発明
によって得られた酵素がβ−マンノシダーゼを含有しな
いことが明らかである。

【００３０】

【発明の効果】以上の如く、本発明による方法ではβ−
マンナナーゼは他の酵素と混合することなく単独で得ら
れるため、精製処理が極めて簡単であり、β−マンナナ
ーゼの製造コストを低減できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明によって得られた酵素によるコンニャク
マンナンの加水分解における反応系中に存在する還元糖
の量及び反応系の粘度の経時変化を示すグラフである。

【図２】本発明によって得られた酵素によるローカスト
ビーンガムの加水分解における反応系中に存在する還元
糖の量及び反応系の粘度の経時変化を示すグラフであ
る。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】細胞外酵素としてβ−マンナナーゼのみを
生産するバチルス・ズブチリスに属する微生物。
【請求項２】請求項１記載のβ−マンナナーゼ生産能を
有する微生物を培養し、β−マンナナーゼを培養液中に
生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする、
β−マンナナーゼの製法。
【請求項３】請求項２記載の製法において、β−マンナ
ナーゼ生産能を有する微生物が、工業技術院生命工学工
業技術研究所に受託番号FERM P−14139として寄託され
た菌株（バチルス・ズブチリスＭ−１）である、β−マ
ンナナーゼの製法。