[go: up one dir, main page]

JPH07255498A - エンドテリンレセプターに作用する物質の同定のためのテスト法 - Google Patents

エンドテリンレセプターに作用する物質の同定のためのテスト法

Info

Publication number
JPH07255498A
JPH07255498A JP7056274A JP5627495A JPH07255498A JP H07255498 A JPH07255498 A JP H07255498A JP 7056274 A JP7056274 A JP 7056274A JP 5627495 A JP5627495 A JP 5627495A JP H07255498 A JPH07255498 A JP H07255498A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cell
substance
reporter gene
vector
etr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP7056274A
Other languages
English (en)
Inventor
Burkhard Dr Kroeger
クレーガー ブルクハルト
Siegfried Bialojan
ビアローヤン ジークフリート
Claus Dr Bollschweiler
ボルシュヴァイラー クラウス
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF SE
Original Assignee
BASF SE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BASF SE filed Critical BASF SE
Publication of JPH07255498A publication Critical patent/JPH07255498A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【目的】 エンドテリンレセプターに作用する物質の同
定のためのテスト法 【構成】 ａ）エンドテルミンレセプター（ＥＴＲ）を
内在性に表現するセルラインを選択するか又はＥＴＲ組
換え体を安定に表現するセルラインを製造し、 ｂ）工程ａ）の後の宿主細胞を、 ｂ１）細胞内メッセンジャー物質の上昇により活性化さ
れるプロモーターを含有し、 ｂ２）機能的にｂ１）に記載のプロモーターと結合する
リポーター遺伝子を有する組換えベクターを用いてトラ
ンスフェクトさせ、 ｃ）工程ｂ）の後の ｃ１）工程ｂ）に記載のベクターを一時的に含有するか
又は ｃ２）工程ｂ）に記載のベクターを安定に集積して含有
する細胞を確立させ、 ｄ）工程ｃ）からの細胞をテストすべき物質と接触さ
せ、 ｅ）工程ｄ）の後の細胞中のリポーター遺伝子の表現を
測定する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、エンドテリンレセプタ
ーに作用する物質を同定するための機能的テスト法に関
する。
【０００２】
【従来の技術】エンドテリン（ＥＴ）は、内皮細胞中及
び多くの他の組織中に先駆蛋白質（Prepro-ＥＴ、big-
ＥＴ）として表現され、相応するエンドテリン変換系
（ＥＣＥｓ）により生物学的に活性な形に変換されうる
２１個のアミノ酸から成る（Inoue,A.等のProc.Natl.Ac
ad.Sci.USA,86,2863-2867,1989;Yanagisawwa,M.等のTIP
S10,374-378,1989）。
【０００３】２個又は５個のアミノ酸中で相互に異なっ
ており、異なる遺伝子をコードしているエンドテリンの
３種のイソ形、ＥＴ−１、ＥＴ−２、ＥＴ−３が知られ
ている（Yanagisawa,M.等のNature 332,411-415,198
8）。
【０００４】この作用の基本は、エンドテリンと平滑筋
細胞（ＥＴＲａ）及び内皮細胞（ＥＴＲｂ）上の特異的
レセプター（ＥＴＲ）（それらの一次構造は解明されて
いる）との相互作用である （Arai,H.等のNature 348,7
30-732,1990;Sakurai,T.等のNature 348,732-735,199
0）。
【０００５】ＥＴ−レセプターは、７−トランスメンブ
ランドメイン−レセプターの分類に属し、これは、細胞
内でＧ−蛋白質とカップリングしており、それにより、
特異的に、”第２メッセンジャー”−カスケードを作動
させる（カルシウム、ｃＡＭＰ、ＰＩＰ、ｃＧＭＰ）。
【０００６】血圧の薬物学的影響に関して、そのレセプ
ターへのエンドテリンの作用に影響する物質は重要であ
る。殊に、ＥＴＲａ−アンタゴニストは、血圧低下剤と
して重要であり；ＥＴＲｂ−アゴニストは、血管拡張剤
として使用可能である。
【０００７】レセプターへの作用を有する物質を求める
典型的なスクリーニングは、レセプター結合検定に基づ
く。この先行文献によれば、確かに、同定された作用物
質の機能（アンタゴニスムス、アゴニスムス）に関して
は何も言及できない。この情報は、複雑なインビトロ−
モデルでの（例えば放射能ＣＡＭＰ−測定）、もしくは
経費のかかる動物実験で初めて取得されるはずである。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】従って、エンドテリン
レセプターに対してアゴニスト特性又はアンタゴニスト
特性を有する適当な物質を同定することを可能とするテ
スト系を提供する課題が存在した。
【０００９】
【課題を解決するための手段】この課題は、エンドテリ
ンレセプター（ＥＴＲ）に作用する物質の同定のための
本発明によるテスト法により解決され、これは次の工程
を包含する： ａ）エンドテリンレセプター（ＥＴＲ）を内在性に表現
するセルラインを選択するか、又はＥＴＲ組換え体を安
定に表現するセルラインを製造し、 ｂ）工程ａ）の後の宿主細胞を、 ｂ１）細胞内メッセンジャー物質の上昇により活性化さ
れるプロモーターを含有し、 ｂ２）機能的にｂ１）に記載のプロモーターと結合する
リポーター遺伝子（Ｒｅｐｏｒｔｅｒｇｅｎ）を有する
組換えベクターを用いてトランスフェクトさせ、 ｃ）工程ｂ）の後の ｃ１）工程ｂ）に記載のベクターを一時的に含有するか
又は ｃ２）工程ｂ）に記載のベクターを安定に集積して含有
する細胞を確立させ、 ｄ）工程ｃ）からの細胞をテストすべき物質と接触さ
せ、 ｅ）工程ｄ）の後の細胞中のリポーター遺伝子の表現を
測定する。
【００１０】本発明の基本原理は、リガンド結合により
誘導されたレセプター活性及びこれに結び付いた、信号
形質導入連鎖の誘発（例えばｃＡＭＰ−発生）の高活性
リポーター系へのカップリングに基づく。
【００１１】このリポーター系は、細胞内メッセンジャ
ー物質（第２メッセンジャー）の濃度の変化により活性
化可能な１個のプロモーターを含有する構成から成る。
ここで、カルシウム、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ又はホスホイ
ノシトールホスフェート（ＰＩＰ）に応答するプロモー
ターを使用するのが有利である。
【００１２】これらプロモーターは、その遺伝子生成物
が容易に測定可能である遺伝子を調節する。この場合、
リポーター遺伝子、例えば、ルシフェラーゼ、クロラム
フェニコールアセチルトランスフェラーゼ、アルカリ性
ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼに関する遺伝子
を使用するのが有利である。
【００１３】本発明のテスト法の最初の工程ａ）で、エ
ンドテリン−レセプターを内在性に表現するセルライン
を選択する。この場合、これは、ＥＴＲａ（例えば，Ｓ
ＫＮＭＣ、Ｒａｔｌ、Ａ１０、Ａ７Ｒ５）又はＥＴＲｂ
（エンドテル細胞）でありうる。
【００１４】二者択一的に、宿主細胞は、例３に記載の
方法により、相応するエンドテリン−レセプター（ＥＴ
Ｒａ又はＥＴＲｂ）をコードする組換えべクターで安定
に形質転換させられる（例１参照）。
【００１５】有利には、この組換えべクターは、他の遺
伝子断片例えば、調節信号又は選択マーカーを有してい
てよい。選択マーカー例えば、ネオマイシン−レジステ
ンツ（neoR）の使用が特に有利である。
【００１６】ＥＴＲの表現のための宿主細胞としては、
特に、ＣＨＯ−Ｋ１−セルライン（ＡＴＣＣ Ｎｒ．Ｃ
ＣＬ ６１）が好適である。
【００１７】もう一つの工程で、細胞内メッセンジャー
物質の濃度に依存して調節されるプロモーターを有する
組換えべクターが製造される。細胞内メッセンジャー物
質又は”第２メッセンジャー”とは、殊に、カルシウ
ム、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ及びホスホイノシトールホスフ
ェートと理解すべきである。
【００１８】このようなプロモーターとは、”第２メッ
センジャー”−制御転写のために必要な全てのエレメン
トを包含する配列範囲と理解すべきである。基礎転写コ
ントロールのエレメント、例えば、”ＴＡＴＡ−ボック
ス”及び”ＣＣＡＡＴ−ボックス”も、誘導可能な転写
コントロールのエレメント、例えば”第２メッセンジャ
ー”−依存性転写ファクター、いわゆる”応答エレメン
ト（ＲＥｓ）”のための結合配列もこれに該当する。
【００１９】ここで、これは、カルシウム−ＲＥｓ、ｃ
ＡＭＰ−ＲＥｓ、ｃＧＭＰ−ＲＥｓ又はホスホイノシト
ールホスフェート−ＲＥｓでありうる。これらＲＥｓの
配列及びこれらに結合するファクター、例えば、ｃＡＭ
Ｐ応答性エレメント結合プロテイン（ＣＲＥＢ）は公知
である（Montminy,M.R.等のProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.
83,6682-6686,1986）．本発明に好適なプロモーター
は、天然に由来してよく、例えば、ソマトスタチン−遺
伝子、ｆｏｓ−遺伝子、ＨＩＶ−１ ＬＴＲｓ又は血管
作用性小腸ペプチド（ＶＩＰ）−遺伝子のプロモーター
であってよいか、又は多くの種々の遺伝子プロモーター
から人工的に構成されていてよい。
【００２０】例えば、これは、合成オリゴヌクレオチド
の融合及びリゲーシヨンにより行うことができる。複数
のｃＡＭＰ応答エレメントと基本サイトメガロウイルス
ＩＥ−遺伝子プロモーターとの融合を実施するのが有利
である。
【００２１】この構成されたプロモーターに、リポータ
ー遺伝子を機能的に結合させる。リポーター遺伝子は、
その表現される遺伝子生成物が容易に測定−又は定量可
能な信号を生じるような遺伝子である。
【００２２】一般に、好適なリポーター遺伝子は、慣用
の方法で立証可能であるような蛋白質に関する遺伝子で
ある。リポーター遺伝子として、容易に立証可能な反応
を触媒作用する酵素に関する遺伝子を使用するのが有利
である。
【００２３】特に好適なリポーター遺伝子は、クロラム
フェニコール−アセチル−トランスフェラーゼ（ＣＡ
Ｔ）又はルシフェラーゼに関する遺伝子である。
【００２４】構成されたプロモーターとリポーター遺伝
子の機能的結合は、リポーター遺伝子の転写を”第２メ
ッセンジャー”−依存性のプロモーターのコントロール
下に行うことを意味する。
【００２５】工程ａ）の後の宿主細胞の組換えべクター
による形質変換（工程ｂ）は、全ての慣用の形質変換
法、例えば、電気泳動、燐酸カルシウム又はリポソーム
介在トランスフェクシヨンにより行うことができる。特
に、この形質変換のためには、例３で使用したリポソー
ム介在トランスフェクシヨンが有利である。
【００２６】宿主細胞が組換えべクターで形質変換され
た後に、もう一つの工程ｃ）で、べクターを一時的に又
は安定に集積して表現するような細胞を更に使用する。
【００２７】一時的な表現とは、限られた期間（約２４
−４８時間）のみの表現と理解すべきである。安定な表
現のために、べクターは宿主細胞のゲノム中に集積す
る。
【００２８】もう一つの工程ｄ）で、工程ｃ）で単離さ
れた細胞は、テストすべき物質に特異的なＥＴＲ−リガ
ンド（例えばＥＴ−１）と接触される。
【００２９】このことは、テストすべき物質を、通常１
０~3Ｍ〜１０~6Ｍの濃度で、かつエンドテリン（ＥＴ−
１）を、通常１０~8Ｍの濃度で血清不含の細胞培養培地
に添加することにより行う。
【００３０】テストすべき物質は、ＥＴ−刺激された宿
主細胞と一般に２〜２４時間接触する。引き続き、この
細胞をリゼートし、リポーター遺伝子−表現の評価のた
めに、例４に記載のように準備する。
【００３１】テスト物質で処理されたテスト細胞中のリ
ポーター遺伝子の表現を測定し、同じセルラインをＥＴ
のみで刺激した対照と比較する。双方の測定値の比較に
より、ただちに、テストされた物質がリポーター遺伝子
表現に、かつＥＴ−ＥＴＲ−相互反応に影響するか否か
を示すことができる。
【００３２】本発明の決定的な利点は、直接、高い感度
で、かつ高い処理率で、物質のＥＴ−レセプターへの機
能的データもしくは作用（アンタゴニスムス、アゴニス
ムス）を提供するテスト法である。これにより、ＥＴ−
レセプターに作用する物質への有効な物質スクリーニン
グを行うことが可能になる。
【００３３】
【実施例】次の実施例で本発明を更に説明する。
【００３４】例１ ＥＴＲａもしくはＥＴＲｂをコードするべクターの構成 ヒトＥＴａ−レセプターのｃＤＮＡを、公開データ（Ad
achi,M.等のBiochem.Biophys.Res.Communic.180,1265-7
2,1991）に基づき、ヒト胎盤ｃ−ＤＮＡ−Ｂａｎｋから
単離し、プラスミド ｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ）の複数ク
ローニング部位（Ｈｉｎｄ ＩＩＩ／Ｘｈｏ Ｉ）にク
ローニングした。ＥＴＲａに関してコードする配列は、
１２８４ｂｐを有する。
【００３５】ヒトＥＴｂ−レセプターのｃＤＮＡを、公
開データ（Nakamura,M.等のBiochem.Boiophys.Res.Comm
unic.177,34-39,1991）に基づき、ヒト肝臓ｃＤＮＡ−
Ｂａｎｋから単離し、ｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ
（ＢａｍＨ Ｉ／ＨｉｎｄＩＩＩ）にクローニングし
た。ＥＴＲｂに関してコードする配列は、１３２９ｂｐ
を有する。
【００３６】組換え表現のために、双方のレセプター
を、真核べクターｐｃＤＮＡ Ｉ ＮＥＯ（Invitroge
n,San Diego）に再クローニングした（Umkloniert）。
このために、双方のレセプターＤＮＡフラグメントを、
それぞれ制限酵素ＢａｍＨ Ｉ／Ｘｈｏ Ｉを用いてｐ
Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔから単離し、ｐｃＤＮＡ Ｉ
ＮＥＯの複数クローニング部位の相応する切断位置ｎｉ
リゲートした。
【００３７】この操作を実施するために使用した技術
は、例えば、”Molecular Cloning",Sambrook et al，C
old Spring Harbor Laboratory,1989に記載の慣用の分
子生物学的技術である。
【００３８】例２ 構成されたプロモーターの構成及びリポーター遺伝子と
の融合 ａ）市販のリポーター構成ｐＭＡＮｎｅｏ−ｌｕｃ（Ｆ
Ａ．Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｋａｔ．Ｎｏ．６１７１−１）
から出発し、エンハンサー／プロモーター不含のリポー
タープラスミドを構成させた。このために、ｐＭＡＭｎ
ｅｏ−ｌｕｃ中のＲＳＶ−ＬＴＲｓ及びＭＮＴＶ−ＬＴ
Ｒｓの調節配列を有する範囲を、ＮｄｅＩ及びＮｈｅＩ
を用いる制限切断により欠失させ、制限酵素ＮｄｅＩ、
ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩ、ＳＰｅＩ及びＮｈｅＩに関する認
識配列を有するポリリンカーで置換した。こうして生じ
たリポータープラスミドｐｎｅｏＬｕｃは、調節性配列
をポリリンカー領域内に吸収する働きをする。
【００３９】合成されたプロモーターを４個の合成オリ
ゴヌクレオチドから製造した： ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１は、位置−６７〜＋１のヒ
ト サイトメガロウイルス イメデイエート アーリー
ゲンス（humanen Cytomegalovirus ImmediateEarly G
ens）のプロモーター領域に相当する（Henninghausen
L.G.,Fleckenstein B,;EMBO J.5,1367-1371,1986）． 付加的に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１は、制限エンドヌク
レアーゼに関する２個の認識配列を有する：ＮｏｔＩに
関する５'末端、ＳｐｅＩに関する３'末端。
【００４０】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２は、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１に対する対向ストランドに相当する。
【００４１】ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３は、血管作用
小腸ペプチド（ＶＩＰ）遺伝子のｃＡＭＰ応答エレメン
トの４倍繰返しに相当する（Tsukada,T.等のJ.Biol.Che
m.262,8743-8747,1987）。
【００４２】付加的に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３は、制
限エンドヌクレアーゼに関する２個の認識配列を有す
る：ＮｅｄＩに関する５'末端、ＮｏｔＩに関する３'末
端。
【００４３】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４は、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：３に対する対向ストランドに相当する。
【００４４】ｄ） 組換えべクターの製造のために、Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２をハ
イブリドさせ、ＮｏｔＩ／ＳｐｅＩ切断し、かつ、ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４をハイ
ブリドさせ、ＮｄｅＩ／ＮｏｔＩ切断した。次いで、双
方の生成物を、例２ａ）からのＮｄｅＩ及びＳｐｅＩで
線状化されたべクターｐｎｅｏＬｕｃにクローニングさ
せた。このクローニング法は、各々の成分の正当な、即
ち機能的な配向を結果として有する。
【００４５】ｐｎｅｏＬｕｃからのＢｇｌIII／Ｈｉｎ
ｄIII制限フラグメントの欠失により、ＮｅｏＲ−遺伝
子は、それがもはや機能的でない程度に短縮された。ト
ランスフェクトすべき宿主細胞は、既に、ＥＴＲａもし
くはＥＴＲｂ−べクターを介して（例１参照）ネオマイ
シンに対して耐性であり、従って相応する選択はもはや
不可能であるので、このことは必要であった。安定な形
質変換体への選択は、ハイグロマイシン−含有媒体中で
の培養によるハイグロマイシン耐性遺伝子（Stratagen
e）を有するべクターを用いる同時トランスフェクシヨ
ンにより行った（例３）。
【００４６】例３ 安定なテストセルラインの形質変換及び選択 ＣＨＯ−Ｋ１−細胞を、ＦＣＳ１０％を有するＤＭＥＭ
／ＨａｍＦ１２−（１：１）−培地中で、１０ｃｍ−ペ
トリシャーレ中に細胞１×１０６の細胞密度で接種し、
一晩培養した。
【００４７】血清不含の培地２ｍｌ中に入れられたトラ
ンスフェクタム（ＰｒｏｍｅｇａＮｒ．Ｅ １２３１）
１０μｌ中のべクターＤＮＡ２μｌを用いて、トラン
スフェクシヨンを６時間に渡って行った。その後、血清
含有培地中に移行させた。更に４２時間の後に、細胞を
選択培地中に移行させた。
【００４８】工程ａ）の後のＥＴＲ−表現性宿主細胞の
場合に、ゲネチシン（Ｇ４１８−スルフェート）６００
μｇ／ｍｌを含有する培地中で選択を行った。
【００４９】ハイグロマイシン５０μｇ／ｍｌが添加さ
れた培地中での選択により、工程ｂ）の後のべクターを
安定に表現する細胞を得た。
【００５０】例４ テストの実施 例３による細胞を、マイクロ適定プレート（Ｐａｃｋａ
ｒｄ ”Ｖｉｅｗｐｌａｔｅ”Ｎｒ ６００−５１８
２）中に接種し（細胞密度１×１０５個／ウエル；ＦＣ
Ｓ１０％を有するＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２−培地）、１
６時間の後に、血清不含培地中に移行させた。更に４時
間の後に、テストすべき物質の希釈のために、ＥＴ−１
１０~8Ｍを加えた。対照細胞はＥＴ−１のみで処理し
た。
【００５１】２〜１６時間のインキュベーシヨンの後
に、この細胞をリシス緩衝液（２５ｎＭ Ｔｒｉｓ−燐
酸塩、ｐＨ ７．８； ２ｍＭ ＤＴＴ； ２ｍＭ
１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’
−テトラ酢酸；１０％グリセロール；１％Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００）３０μｌ／ウエルの添加により溶解させ
た（１５分、室温）。
【００５２】この細胞エキスに、ルシフェラーゼ検定基
質（コエンチームＡ ２７０μＭ、ルシフェリン４７０
μＭ、ＡＴＰ５３０μＭ）５０μｌを添加した。ルシフ
ェラーゼ−活性の測定は、慣用のルミノメーターで行う
ことができ；Ｆｉｒｍａ Ｈａｍａｍａｔｓｕの２Ｄ−
ルミノメーター中で測定するのが有利である。
【００５３】例５ 大量スクリーニングでのこのテスト系の使用 例４による検定系を、エンドテリンとそのレセプターと
の相互作用に特異的に影響する物質の”ランダムスクリ
ーニング”のために使用する。
【００５４】このスクリーニングで使用すべき物質を、
μＭの濃度でＤＭＳＯ中に溶かし、適当に希釈して、例
４によるテストで使用する。
【００５５】配列プロトコル （１）一般的情報： （ｉ）出願人： （Ａ）名称：ＢＡＳＦ アクチエンゲゼルシャフト （Ｂ）通り：カール−ボッシュ−シュトラーセ ３８ （Ｃ）地名：ルードウイッヒスハーフェン （Ｅ）国：ドイツ連邦共和国 （Ｆ）郵便番号：Ｄ−６７０５６ （Ｇ）電話：０６２１／６０４８５２６ （Ｈ）テレファックス：０６２１／６０４３１２３ （Ｉ）テレックス：１７６２１７５１７０ （ii）発明の名称：エンドテリンレセプターに作用する
物質の同定のためのテスト法 （iii）配列の数：４ （iv）コンピューター読み取り可能形： （Ａ）媒体型：フロッピーデイスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ コンパチブル （Ｃ）オペレーテイングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ
−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウエア：パテント イン リリース ＃
１．０ バージヨン ＃１．２５（ＥＰＡ） （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：７５塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の型：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の種類：ＤＮＳ（ゲノム） （iii) ハイポセテイカル：Ｎｏ （iii) アンチセンス：Ｎｏ （vi） 起源： （Ａ）生物名：ヒト サイトメガロ ウイルス(Human C
ytomegalo Virus) （viii） ゲノム中の位置： （Ｂ）存在位置：イメデイエート アーリー ゲン プ
ロモーター （xi） 配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
【００５６】
【化１】
【００５７】（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に間する情
報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：７５塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の型：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の種類：ＤＮＳ（ゲノム） （iii) ハイポセテイカル：Ｎｏ （iii) アンチセンス：Ｙｅｓ （vi） 起源： （Ａ）生物名：ヒト サイトメガロ ウイルス(Human C
ytomegalo Virus) （viii） ゲノム中の位置： （Ｂ）存在位置：イメデイエート アーリー ゲン プ
ロモーター （xi） 配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２：
【００５８】
【化２】
【００５９】（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に関する情
報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１０６塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の型：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の種類：ＤＮＳ（ゲノム） （iii) ハイポセテイカル：Ｎｏ （iii) アンチセンス：Ｎｏ （vi） 起源： （Ａ）生物名：ホモ サピエンス（Ｈｏｍｏ Ｓａｐｉ
ｅｎｓ） （xi） 配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３：
【００６０】
【化３】
【００６１】（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ４に関する情
報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１０８塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の型：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の種類：ＤＮＳ（ゲノム） （iii) ハイポセテイカル：Ｎｏ （iii) アンチセンス：Ｙｅｓ （vi） 起源： （Ａ）生物名：ホモ サピエンス（Ｈｏｍｏ Ｓａｐｉ
ｅｎｓ） （xi） 配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４：
【００６２】
【化４】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 クラウス ボルシュヴァイラー ドイツ連邦共和国 ハイデルベルク カー ル−クリスト−シュトラーセ 13

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 エンドテリンレセプター（ＥＴＲ）に作
    用する物質を同定するためのテスト法において、これ
    は、次の工程： ａ）エンドテリンレセプター（ＥＴＲ）を内在性に表現
    するセルラインを選択するか、又はＥＴＲ組換え体を安
    定に表現するセルラインを製造し、 ｂ）工程ａ）の後の宿主細胞を、 ｂ１）細胞内メッセンジャー物質の上昇により活性化さ
    れるプロモーターを含有し、 ｂ２）機能的にｂ１）に記載のプロモーターと結合する
    リポーター遺伝子を有する組換えベクターを用いてトラ
    ンスフェクトさせ、 ｃ）工程ｂ）の後の ｃ１）工程ｂ）に記載のベクターを一時的に含有するか
    又は ｃ２）工程ｂ）に記載のベクターを安定に集積して含有
    する細胞を確立させ、 ｄ）工程ｃ）からの細胞をテストすべき物質と接触さ
    せ、 ｅ）工程ｄ）の後の細胞中のリポーター遺伝子の表現を
    測定するを包含することを特徴とする、エンドテリンレ
    セプターに作用する物質を同定するためのテスト法。
  2. 【請求項２】 工程ｂ２）でのリポーター遺伝子とし
    て、ルシフェラーゼに関する遺伝子を使用する、請求項
    １に記載の方法。
  3. 【請求項３】 工程ａ）での細胞として、細胞ＣＨＯ−
    Ｋ１を使用する、請求項１又は２に記載の方法。
JP7056274A 1994-03-15 1995-03-15 エンドテリンレセプターに作用する物質の同定のためのテスト法 Pending JPH07255498A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE4408690.3 1994-03-15
DE4408690A DE4408690A1 (de) 1994-03-15 1994-03-15 Testverfahren zur Identifizierung von Substanzen, die auf Endothelinrezeptoren wirken

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPH07255498A true JPH07255498A (ja) 1995-10-09

Family

ID=6512797

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP7056274A Pending JPH07255498A (ja) 1994-03-15 1995-03-15 エンドテリンレセプターに作用する物質の同定のためのテスト法

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP0677588A2 (ja)
JP (1) JPH07255498A (ja)
DE (1) DE4408690A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19713530A1 (de) * 1997-04-01 1998-10-08 Volker Dr Stoldt Hämodynamisch-moduliertes Reportersystem

Also Published As

Publication number Publication date
DE4408690A1 (de) 1995-09-21
EP0677588A2 (de) 1995-10-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0548165B1 (en) Expression of g protein coupled receptors in yeast
Quong et al. E2A activity is induced during B‐cell activation to promote immunoglobulin class switch recombination
Superti-Furga et al. Hormone-dependent transcriptional regulation and cellular transformation by Fos-steroid receptor fusion proteins.
EP0371820B1 (en) Novel receptors: their identification, characterization, preparation and use
AU655850B2 (en) A method of identifying ligands and antagonists of ligands
Wasylyk et al. Transcription Elements and Factors of Rna Polymerase B Promoters of Higher Eukaryote
WO2004053452A2 (en) Assays relating to toll-like receptor activity
KR19990077015A (ko) 진핵 세포 발현 시스템을 위한 발현 증강 서열 요소 (ease)
Adams et al. ZNF265—a novel spliceosomal protein able to induce alternative splicing
JP2007529992A5 (ja)
Penkov et al. Cloning of a human gene closely related to the genes coding for the c-myc single-strand binding proteins
Senoo et al. An orthologue of the Myelin-gene Regulatory Transcription Factor regulates Dictyostelium prestalk differentiation
US6410233B2 (en) Isolation and identification of control sequences and genes modulated by transcription factors
US20120073003A1 (en) Apobec3 mediated dna editing
CA2194361A1 (en) Method for identifying nucleic acids encoding c-fos promoter activating proteins
EP2216340A1 (en) Isoforms of human somatostatin receptor type 5 produced by alternative processing and oligonucleotide pairs for detection thereof by pcr
JPH07255498A (ja) エンドテリンレセプターに作用する物質の同定のためのテスト法
Gollop et al. Control of cell-type specific gene expression in Dictyostelium by the general transcription factor GBF
EP1033374B1 (en) Signal sequence trapping method
KR100236470B1 (ko) 파네실 전이효소 저해제의 효능을 평가할 수 있는Ras 단백질을 생산하는 Rat 2 피브로블라스트 세포주 및 그의 제조방법
Mu et al. Sequence-specific protein interaction with a transcriptional enhancer involved in the autoregulated expression of cAMP receptor 1 in Dictyostelium
HEMPSTEAD et al. The nerve growth factor receptor: biochemical and structural analysis
US20040115742A1 (en) Method to identify specific interaction between ligand and receptor
KR100236471B1 (ko) 파네실 전이효소 저해제의 효능을 평가할 수 있는Ras 단백질을 생산하는 Rat 2 피브로블라스트 세포주 및 그의 제조방법
AU2002301561B2 (en) Signal Sequence Trapping Method