JPH0720883B2 - 免疫毒素及びその製造方法 - Google Patents
免疫毒素及びその製造方法Info
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Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
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- A61K47/6817—Toxins
- A61K47/6819—Plant toxins
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、毒性分子を特にたとえば寄生虫のような或る
種の真核細胞及び好ましくはヒト細胞のような哺乳動物
に供給して、これら細胞の特異的破滅をもたらす薬剤に
関するものである。この薬剤は免疫毒素と呼ぶことがで
き、次の３種の成分を有する：(a)或る種の真核細胞、
たとえばヒト、猿などの細胞のような哺乳動物細胞或い
はこれに関連する或る種の抗原に高度に特異的に結合す
るモノクローナル抗体、たとえばネズミ若しくはその他
の哺乳動物のモノクローナル抗体、(b)リボソーム‐失
活蛋白質若しくは毒素、及び(c)抗体が毒素を特定の標
的細胞へこの毒素を分離し又は活性化することなく供給
して、動物体としうる環境中の標的細胞へ達せしめる抗
体に対する毒素の結合である。
種の真核細胞及び好ましくはヒト細胞のような哺乳動物
に供給して、これら細胞の特異的破滅をもたらす薬剤に
関するものである。この薬剤は免疫毒素と呼ぶことがで
き、次の３種の成分を有する：(a)或る種の真核細胞、
たとえばヒト、猿などの細胞のような哺乳動物細胞或い
はこれに関連する或る種の抗原に高度に特異的に結合す
るモノクローナル抗体、たとえばネズミ若しくはその他
の哺乳動物のモノクローナル抗体、(b)リボソーム‐失
活蛋白質若しくは毒素、及び(c)抗体が毒素を特定の標
的細胞へこの毒素を分離し又は活性化することなく供給
して、動物体としうる環境中の標的細胞へ達せしめる抗
体に対する毒素の結合である。
たとえば毒素のような薬理剤の特異的キヤリヤとして抗
体を使用する可能性が、ハイブリドーマ技術を使用して
高度に特異的な純粋モノクローナル抗体を生産しうる能
力のため急速に発展しつつある研究の主題となつてい
る。最近、腫瘍関連抗原を識別するモノクローナル抗体
が開発されている〔たとえば、リツツ（Ritz）等、ネイ
チヤー、第283巻、第583〜585頁（1980）；ウツドベリ
ー（Woodbury）等、PNAS（USA）、第77巻、第2183-2186
頁（1980）；ヘルリン（Herlyn）等、PNAS（USA）、第7
6巻、第1438〜1442頁（1979）；並びにセエオン（Seo
n）等、PNAS（USA）、第80巻、第845-849頁（1983）に
記載されている〕。この種の抗体を利用して毒性剤を特
定の腫瘍細胞に供給して、これらを選択的に死滅させう
ると思われる。リボソーム‐失活用蛋白質〔たとえばバ
ルビエリ（Barbieri）等、カンサー・サーベー、第１
巻、第489-520頁（1982）；及びオルソン（Olsnes）
等、毒素及びウイルスの分子作用（コーヘン（Cohen）
等編）、第51〜105頁、エリセビール出版（1982）〕
が、この目的に対する理想的な毒性剤であると思われ
る。大抵の努力は、ジスルフイド結合により結合された
２種の同一でないサブユニツト（Ａ及びＢ連鎖）よりな
るリチン（ヒマの種子（Ricinus communis）から抽出さ
れる）を使用することに向けられている。A-鎖が細胞の
細胞質中に入ると、そのリボソームの触媒失活によつて
細胞の死滅をもたらす。Ｂ−鎖は細胞表面の炭水化物成
分に結合する性質を有し、かつ細胞中へのＡ鎖の吸収を
促進すると思われる。
体を使用する可能性が、ハイブリドーマ技術を使用して
高度に特異的な純粋モノクローナル抗体を生産しうる能
力のため急速に発展しつつある研究の主題となつてい
る。最近、腫瘍関連抗原を識別するモノクローナル抗体
が開発されている〔たとえば、リツツ（Ritz）等、ネイ
チヤー、第283巻、第583〜585頁（1980）；ウツドベリ
ー（Woodbury）等、PNAS（USA）、第77巻、第2183-2186
頁（1980）；ヘルリン（Herlyn）等、PNAS（USA）、第7
6巻、第1438〜1442頁（1979）；並びにセエオン（Seo
n）等、PNAS（USA）、第80巻、第845-849頁（1983）に
記載されている〕。この種の抗体を利用して毒性剤を特
定の腫瘍細胞に供給して、これらを選択的に死滅させう
ると思われる。リボソーム‐失活用蛋白質〔たとえばバ
ルビエリ（Barbieri）等、カンサー・サーベー、第１
巻、第489-520頁（1982）；及びオルソン（Olsnes）
等、毒素及びウイルスの分子作用（コーヘン（Cohen）
等編）、第51〜105頁、エリセビール出版（1982）〕
が、この目的に対する理想的な毒性剤であると思われ
る。大抵の努力は、ジスルフイド結合により結合された
２種の同一でないサブユニツト（Ａ及びＢ連鎖）よりな
るリチン（ヒマの種子（Ricinus communis）から抽出さ
れる）を使用することに向けられている。A-鎖が細胞の
細胞質中に入ると、そのリボソームの触媒失活によつて
細胞の死滅をもたらす。Ｂ−鎖は細胞表面の炭水化物成
分に結合する性質を有し、かつ細胞中へのＡ鎖の吸収を
促進すると思われる。
従来、免疫毒素は完全リチンを抗体へ結合させて作成さ
れていた〔ヨウル（Youle）等、PNAS（USA）、第77巻、
第5483−5486頁（1980）；トルベ等、ネイチヤー、第29
7巻、第594−596頁及びバレラ（Vallera）等、サイエン
ス、第222巻、第512-515頁（1983）〕。この種の免疫毒
素は、リチンのＢ−鎖結合部位に対し高濃度にて細胞表
面と競合する乳糖の存在下においてのみ特異的毒性を示
す。生体内において、これらの免疫毒素はリチン自身と
同様に非特異的毒素であると予想され、したがつて移植
用の骨髄のインビトロ処理において限られた用途を有す
るが治療価値が低いと思われる。遊離リチンのA-鎖は、
B-鎖から完全分離されると、遊離A-鎖が細胞表面に付着
する能力がないため、完全リチンよりもインビトロにて
104〜106倍低い毒性を示す。A-鎖が抗体に結合すると、
得られる免疫毒素は一般に適当な表面抗原を有するこれ
ら細胞に対し特異的細胞毒性を示す。しかしながら、毒
性作用の発現はリチンと比較して遅いため、長い培養時
間を用いる必要がある。高度の毒性は、化学結合がジス
ルフイド結合を含む時のみ示された。免疫毒素が化学的
に安定な非開裂性結合を有する場合には、殆んど又は全
く毒性がなかつた〔マスホ等、ジヤーナル・バイオケミ
ストリー、第91巻、第1583-1591頁（1982）〕。
れていた〔ヨウル（Youle）等、PNAS（USA）、第77巻、
第5483−5486頁（1980）；トルベ等、ネイチヤー、第29
7巻、第594−596頁及びバレラ（Vallera）等、サイエン
ス、第222巻、第512-515頁（1983）〕。この種の免疫毒
素は、リチンのＢ−鎖結合部位に対し高濃度にて細胞表
面と競合する乳糖の存在下においてのみ特異的毒性を示
す。生体内において、これらの免疫毒素はリチン自身と
同様に非特異的毒素であると予想され、したがつて移植
用の骨髄のインビトロ処理において限られた用途を有す
るが治療価値が低いと思われる。遊離リチンのA-鎖は、
B-鎖から完全分離されると、遊離A-鎖が細胞表面に付着
する能力がないため、完全リチンよりもインビトロにて
104〜106倍低い毒性を示す。A-鎖が抗体に結合すると、
得られる免疫毒素は一般に適当な表面抗原を有するこれ
ら細胞に対し特異的細胞毒性を示す。しかしながら、毒
性作用の発現はリチンと比較して遅いため、長い培養時
間を用いる必要がある。高度の毒性は、化学結合がジス
ルフイド結合を含む時のみ示された。免疫毒素が化学的
に安定な非開裂性結合を有する場合には、殆んど又は全
く毒性がなかつた〔マスホ等、ジヤーナル・バイオケミ
ストリー、第91巻、第1583-1591頁（1982）〕。
リチンA-鎖の性質にのみ類似した性質及び特性を有する
種類のリボソーム失活用蛋白質が存在する。ゲロニン及
び３種の公知のヤマゴボウ抗ウイルス蛋白（PAP）がこ
の種の蛋白質の例である。これらはMr約30,000の基本的
蛋白質であつて、極めて安定であることが知られてお
り、細胞には結合せず、したがつて完全細胞に対し極め
て高濃度でない限り非毒性であり、リチンにつき操作す
る際必要な高度の注意なしに精製及び操作するのに安全
である。ゲロニン及びPAPを使用して免疫毒素が作成さ
れておりかつ一般にこれらはリチンA-鎖で作成された免
疫毒素に対し同程度の特異的細胞毒性を示したが〔トル
ペ（Thorpe）等、ヨーロピアン・ジヤーナル・バイオケ
ミストリー、第116巻、第447-454頁（1981）；コランバ
ツチ（Columbatti）等、ジヤーナル・イミユノロジー、
第131巻、第3091-3095頁（1983）；ウイールス（Wiel
s）等、カンサー・リサーチ、第44巻、第129-133頁（19
84）及びラマクリシナン（Ramakrishnan）等、カンサー
・リサーチ、第44巻、第201-208頁（1984）〕、いずれ
も非結合抗体からは完全には精製されない。非結合抗体
の存在は、たとえば抗原を封鎖し或いは内部通路を飽和
することにより細胞毒性試験の結果に影響を及ぼし、こ
のことはこれら免疫毒素につき記載された能力の大きな
変動の原因となりうる。
種類のリボソーム失活用蛋白質が存在する。ゲロニン及
び３種の公知のヤマゴボウ抗ウイルス蛋白（PAP）がこ
の種の蛋白質の例である。これらはMr約30,000の基本的
蛋白質であつて、極めて安定であることが知られてお
り、細胞には結合せず、したがつて完全細胞に対し極め
て高濃度でない限り非毒性であり、リチンにつき操作す
る際必要な高度の注意なしに精製及び操作するのに安全
である。ゲロニン及びPAPを使用して免疫毒素が作成さ
れておりかつ一般にこれらはリチンA-鎖で作成された免
疫毒素に対し同程度の特異的細胞毒性を示したが〔トル
ペ（Thorpe）等、ヨーロピアン・ジヤーナル・バイオケ
ミストリー、第116巻、第447-454頁（1981）；コランバ
ツチ（Columbatti）等、ジヤーナル・イミユノロジー、
第131巻、第3091-3095頁（1983）；ウイールス（Wiel
s）等、カンサー・リサーチ、第44巻、第129-133頁（19
84）及びラマクリシナン（Ramakrishnan）等、カンサー
・リサーチ、第44巻、第201-208頁（1984）〕、いずれ
も非結合抗体からは完全には精製されない。非結合抗体
の存在は、たとえば抗原を封鎖し或いは内部通路を飽和
することにより細胞毒性試験の結果に影響を及ぼし、こ
のことはこれら免疫毒素につき記載された能力の大きな
変動の原因となりうる。
リチンA-鎖と異なりゲロニン及びPAP毒素は利用可能な
スルフヒドリル基を持たないので、先ず最初にこれらは
たとえば構造： 〔式中、ｍは１〜５の整数である〕 を有する一般的な架橋剤、たとえばN-スクシンイミジル
3-（2-ピリジルチオ）プロピオネート（SPDP）と反応さ
せて、ジチオピリジル基のジスフイド結合を還元した後
に、スルフヒドリル含有毒素結合体を生成させ、次いで
これを同様なジチオピリジル含有の抗体結合物に共有結
合させてジスルフイド含有結合を抗体と毒素との間に形
成させる必要がある。SPDPなどとこの種の毒素との反応
は毒素の顕著な非可逆的失活をもたらして、最終的架橋
毒素‐抗体複合体又は免疫毒素が顕著に低下した毒性活
性を示すことを突き止めた。
スルフヒドリル基を持たないので、先ず最初にこれらは
たとえば構造： 〔式中、ｍは１〜５の整数である〕 を有する一般的な架橋剤、たとえばN-スクシンイミジル
3-（2-ピリジルチオ）プロピオネート（SPDP）と反応さ
せて、ジチオピリジル基のジスフイド結合を還元した後
に、スルフヒドリル含有毒素結合体を生成させ、次いで
これを同様なジチオピリジル含有の抗体結合物に共有結
合させてジスルフイド含有結合を抗体と毒素との間に形
成させる必要がある。SPDPなどとこの種の毒素との反応
は毒素の顕著な非可逆的失活をもたらして、最終的架橋
毒素‐抗体複合体又は免疫毒素が顕著に低下した毒性活
性を示すことを突き止めた。
本発明は、高活性の免疫毒素と呼ばれる毒素と抗体との
間の共有架橋結合した複合体を提供し、その際利用しう
るスルフヒドリル基を持たないリボソーム失活用蛋白質
をイミノチオールエステル塩と反応させてスルフヒドリ
ル含有の結合体を生成させ、モノクローナル抗体をSPDP
と反応させて第２のジチオピリジル含有の結合体を生成
させ、かつ両結合体を共有結合させて、抗体がジスルフ
イド結合を介しリボソーム失活性蛋白質もしくは毒素に
結合している複合体若しくは免疫毒素を生成させる。
間の共有架橋結合した複合体を提供し、その際利用しう
るスルフヒドリル基を持たないリボソーム失活用蛋白質
をイミノチオールエステル塩と反応させてスルフヒドリ
ル含有の結合体を生成させ、モノクローナル抗体をSPDP
と反応させて第２のジチオピリジル含有の結合体を生成
させ、かつ両結合体を共有結合させて、抗体がジスルフ
イド結合を介しリボソーム失活性蛋白質もしくは毒素に
結合している複合体若しくは免疫毒素を生成させる。
利用しうるスルフヒドリル基を持たない任意のリボソー
ム失活性蛋白質を本発明における毒素として使用するこ
とができ、この種のものとしてはゲロニウム・ムルチフ
ロルム（Gelonium multiflorum）の種子からのゲロニ
ン、フイトラツカ・アメリカーナ（Phytolacca america
na）の種子（PAP-S）又はその葉（PAP若しくはPAPII）
からのヤマゴボウ抗ウイルス蛋白質、モモルジカ・チヤ
ランチア（Momordica charantia）からのMCI及びサポナ
リア・オフイシナリスＬ（Saponaria officinalis L.）
からのリボソーム失活性蛋白質が挙げられる。ゲロニン
はスチルペ（Stirpe）等によりジヤーナル・バイオロジ
カル・ケミストリー、第255巻、第6947-6953頁（1980）
に記載されたように精製することができ、PAP−Ｓはバ
ルビエリ等によりバイオケミカル・シヤーナル、第203
巻、第55-59頁（1982）に記載されたように精製するこ
とができ、またPAP及びPAPIIはアービン（Irvin）等に
よりArch.Biochem.Biophys.、第200巻、第418-425頁（1
980）に記載されたように精製されたように精製するこ
とができ、MCIはバルビエリ等によりバイオケミカル・
ジヤーナル、第186巻、第443-452頁（1980）に記載され
たように精製することができ、さらにサポナリア・オフ
イシナリスＬからのリボソーム失活性蛋白質はスチルペ
等によりバイオケミカル・ジヤーナル、第216巻、第617
-625頁に記載されたように精製することができる。
ム失活性蛋白質を本発明における毒素として使用するこ
とができ、この種のものとしてはゲロニウム・ムルチフ
ロルム（Gelonium multiflorum）の種子からのゲロニ
ン、フイトラツカ・アメリカーナ（Phytolacca america
na）の種子（PAP-S）又はその葉（PAP若しくはPAPII）
からのヤマゴボウ抗ウイルス蛋白質、モモルジカ・チヤ
ランチア（Momordica charantia）からのMCI及びサポナ
リア・オフイシナリスＬ（Saponaria officinalis L.）
からのリボソーム失活性蛋白質が挙げられる。ゲロニン
はスチルペ（Stirpe）等によりジヤーナル・バイオロジ
カル・ケミストリー、第255巻、第6947-6953頁（1980）
に記載されたように精製することができ、PAP−Ｓはバ
ルビエリ等によりバイオケミカル・シヤーナル、第203
巻、第55-59頁（1982）に記載されたように精製するこ
とができ、またPAP及びPAPIIはアービン（Irvin）等に
よりArch.Biochem.Biophys.、第200巻、第418-425頁（1
980）に記載されたように精製されたように精製するこ
とができ、MCIはバルビエリ等によりバイオケミカル・
ジヤーナル、第186巻、第443-452頁（1980）に記載され
たように精製することができ、さらにサポナリア・オフ
イシナリスＬからのリボソーム失活性蛋白質はスチルペ
等によりバイオケミカル・ジヤーナル、第216巻、第617
-625頁に記載されたように精製することができる。
本発明において毒素と反応させうるイミノチオールエス
テル塩としては、構造： 〔式中、ｎは１〜５の整数であり、Ｒは１〜５個の炭素
原子を有するアルキル基でありかつA-は、たとえば塩素
イオンのような水溶性陰イオンである〕 を有するものが挙げられる。好適なエステル塩はメチル
3-メルカプトプロピオンイミデート塩酸塩及び２−イミ
ノチオラン塩酸塩を包含し、後者は４−メルカプトブチ
ルイミデートの環化型である。
テル塩としては、構造： 〔式中、ｎは１〜５の整数であり、Ｒは１〜５個の炭素
原子を有するアルキル基でありかつA-は、たとえば塩素
イオンのような水溶性陰イオンである〕 を有するものが挙げられる。好適なエステル塩はメチル
3-メルカプトプロピオンイミデート塩酸塩及び２−イミ
ノチオラン塩酸塩を包含し、後者は４−メルカプトブチ
ルイミデートの環化型である。
本発明の免疫毒素における抗体としては、たとえば寄生
虫及び哺乳動物細胞などの真核細胞に対し特異的な任意
のモノクローナル抗体を使用することができる。特に興
味あるものは、ヒト腫瘍細胞に特異的な抗体である。適
するモノクローナル抗体としては、ヒトＴ細胞に対し特
異的なもの、たとえばハイブリドーマ細胞ラインATCCN
O.3513からのラインヘルツ（Reinherz）の米国特許第4,
443,427号における抗‐T12、ハイブリドーマ細胞ライン
ATCCNO.HB8213からの抗‐TiIB及びクールター・イミユ
ノロジーから入手しうる抗‐T3、‐T4、‐T11及び‐T12
モノクローナル抗体、並びに一般的な急性リンパ芽球白
血病抗原に特異的なモノクローナル抗体、たとえばリツ
ツ等によりネイチヤー、第283巻、第583-585頁（1980）
に記載されたようなJ5及びリツツ等によりバイオロジカ
ル・リスポンシス・イン・カンサー（ミヒツク編）、第
１巻、第1-21頁（1982）に記載されたようなJ13が挙げ
られ、これら両者はクールター・イミユノロジーから入
手することができる。
虫及び哺乳動物細胞などの真核細胞に対し特異的な任意
のモノクローナル抗体を使用することができる。特に興
味あるものは、ヒト腫瘍細胞に特異的な抗体である。適
するモノクローナル抗体としては、ヒトＴ細胞に対し特
異的なもの、たとえばハイブリドーマ細胞ラインATCCN
O.3513からのラインヘルツ（Reinherz）の米国特許第4,
443,427号における抗‐T12、ハイブリドーマ細胞ライン
ATCCNO.HB8213からの抗‐TiIB及びクールター・イミユ
ノロジーから入手しうる抗‐T3、‐T4、‐T11及び‐T12
モノクローナル抗体、並びに一般的な急性リンパ芽球白
血病抗原に特異的なモノクローナル抗体、たとえばリツ
ツ等によりネイチヤー、第283巻、第583-585頁（1980）
に記載されたようなJ5及びリツツ等によりバイオロジカ
ル・リスポンシス・イン・カンサー（ミヒツク編）、第
１巻、第1-21頁（1982）に記載されたようなJ13が挙げ
られ、これら両者はクールター・イミユノロジーから入
手することができる。
反応は次のように示すことができる： 〔ここでｎ及びｍは１〜５の整数であり、Ｒは１〜５個
の炭素原子を有するアルキル基でありかつA-は非毒性の
水素性陰イオンである〕。
の炭素原子を有するアルキル基でありかつA-は非毒性の
水素性陰イオンである〕。
毒素とイミノチオールエステル塩との間の反応は、たと
えば任意の適当な緩衝剤のような水性媒体中で約pH６〜
９にて約０〜50℃、好ましくは約０℃の温度で行なうこ
とができる。反応は好ましくは過剰のイミノチオールエ
ステル塩を用いて不活性雰囲気下に行ない、毒素中に導
入されたスルフヒドリル基の酸化を防止すると共に、好
ましくは90分間若しくはそれ以上かけて毒素分子１個当
り0.6〜0.7個のスルフヒドリル基を導入する。この反応
は、過剰のイミノチオールエステル塩を適当な緩衝剤で
のゲル過により除去して停止させることができる。
えば任意の適当な緩衝剤のような水性媒体中で約pH６〜
９にて約０〜50℃、好ましくは約０℃の温度で行なうこ
とができる。反応は好ましくは過剰のイミノチオールエ
ステル塩を用いて不活性雰囲気下に行ない、毒素中に導
入されたスルフヒドリル基の酸化を防止すると共に、好
ましくは90分間若しくはそれ以上かけて毒素分子１個当
り0.6〜0.7個のスルフヒドリル基を導入する。この反応
は、過剰のイミノチオールエステル塩を適当な緩衝剤で
のゲル過により除去して停止させることができる。
モノクローナル抗体とSDPDなどとの反応は、たとえば任
意適当な緩衝剤のような水性媒体中で約pH６〜９にて０
゜〜50℃、好ましくは25〜35℃の温度で過剰のSDPDを用
いることにより約30分間若しくはそれ以上にわたつて行
なわれる。この反応は、緩衝剤でのゲル過により或い
は緩衝剤に対する０〜40℃での透析によつて停止させる
ことができる。このように製造された結合体は、抗体分
子１個当り約２〜2.5個のジチオピリジル基を有する。
意適当な緩衝剤のような水性媒体中で約pH６〜９にて０
゜〜50℃、好ましくは25〜35℃の温度で過剰のSDPDを用
いることにより約30分間若しくはそれ以上にわたつて行
なわれる。この反応は、緩衝剤でのゲル過により或い
は緩衝剤に対する０〜40℃での透析によつて停止させる
ことができる。このように製造された結合体は、抗体分
子１個当り約２〜2.5個のジチオピリジル基を有する。
上記のように作成した２種の結合体を互いに反応させて
所望の架橋した免疫毒素を生成させることができ、その
際単にこれらを互いに水性媒体、たとえば任意適当な緩
衝剤中で約pH６〜９にて０〜50℃の温度で混合すれば良
い。好ましくは、毒素結合体は抗体結合体の2:1〜8:1の
モル比にて過剰に使用される。ジスルフイイド基を有す
る架橋の形成をもたらす反応は20時間以内で実質的に完
結する。次いで、全ての残存する遊離スルフヒドリル基
は、たとえばヨードアセタミドの添加により封鎖するこ
とができ、かつ反応混合物を25℃にてさらに１時間培養
し、この時点で全ての架橋されてない毒素若しくは毒素
結合体をゲル過により及び（又は）親和性クロマトグ
ラフイーにより除去することができる。
所望の架橋した免疫毒素を生成させることができ、その
際単にこれらを互いに水性媒体、たとえば任意適当な緩
衝剤中で約pH６〜９にて０〜50℃の温度で混合すれば良
い。好ましくは、毒素結合体は抗体結合体の2:1〜8:1の
モル比にて過剰に使用される。ジスルフイイド基を有す
る架橋の形成をもたらす反応は20時間以内で実質的に完
結する。次いで、全ての残存する遊離スルフヒドリル基
は、たとえばヨードアセタミドの添加により封鎖するこ
とができ、かつ反応混合物を25℃にてさらに１時間培養
し、この時点で全ての架橋されてない毒素若しくは毒素
結合体をゲル過により及び（又は）親和性クロマトグ
ラフイーにより除去することができる。
得られた精製免疫毒素は、出発物質として用いた毒素と
ほぼ等しいリボソーム失活能力を示すと共に、モノクロ
ーナル抗体出発物質から殆んど変化していない特異性結
合能力及び親和力を示す。本発明における免疫毒素の高
レベルの細胞毒性は、これらを分析試薬として或いは骨
髄のインビトロ処理におけると同様にＴ細胞及び（又
は）或る種の白血病細胞を選択的に破滅させるための治
療剤として有用にする。
ほぼ等しいリボソーム失活能力を示すと共に、モノクロ
ーナル抗体出発物質から殆んど変化していない特異性結
合能力及び親和力を示す。本発明における免疫毒素の高
レベルの細胞毒性は、これらを分析試薬として或いは骨
髄のインビトロ処理におけると同様にＴ細胞及び（又
は）或る種の白血病細胞を選択的に破滅させるための治
療剤として有用にする。
臨床でのイン・ビボ使用には、免疫毒素を、無菌性及び
エンドキシンレベルについて試験される溶液として供給
する。結合体投与の適当なプロトコールは、当業者であ
れば容易に知ることが出来る。例えば、結合体を、毎日
静脈注射で５日間にわたって与え、巨丸剤を毎日５日間
与え、又は５日間の連続した点滴で与える。巨丸剤の投
与量には、５〜10mLのヒト血清アルブミンを加えた50〜
100mLの通常塩溶液を加える。連続点滴には、25〜50mL
のヒト血清アルブミンを加えた通常塩溶液を24時間当り
250〜500mL与える。１回の投薬量は、静脈注射で１〜10
0μg/kg体重／日（1ng〜10mg／kg／日）である。２〜４
週間後には、患者に治療の第２週程を与えてよい。当業
者は、投与経路、賦形剤、稀釈剤、投薬量、時間等に関
して、臨床状況が保証するように特定の臨床プロトコー
ルを決定することが出来る。
エンドキシンレベルについて試験される溶液として供給
する。結合体投与の適当なプロトコールは、当業者であ
れば容易に知ることが出来る。例えば、結合体を、毎日
静脈注射で５日間にわたって与え、巨丸剤を毎日５日間
与え、又は５日間の連続した点滴で与える。巨丸剤の投
与量には、５〜10mLのヒト血清アルブミンを加えた50〜
100mLの通常塩溶液を加える。連続点滴には、25〜50mL
のヒト血清アルブミンを加えた通常塩溶液を24時間当り
250〜500mL与える。１回の投薬量は、静脈注射で１〜10
0μg/kg体重／日（1ng〜10mg／kg／日）である。２〜４
週間後には、患者に治療の第２週程を与えてよい。当業
者は、投与経路、賦形剤、稀釈剤、投薬量、時間等に関
して、臨床状況が保証するように特定の臨床プロトコー
ルを決定することが出来る。
図面の簡単な説明 図１は、J5-ゲロニン結合体のイン・ビボでの薬理効果
を示すグラフである。
を示すグラフである。
図２は、J5-ゲロニン及びJ5抗体の薬理効果を示すグラ
フである。
フである。
図３は、毒性試験結果を示すグラフである。
以下、本発明の範囲を限定することなく実施例により本
発明の特徴を一層明療に説明する。
発明の特徴を一層明療に説明する。
実施例１ モノクローナル抗体J5（抗‐CALLA）及びゲロニンから
免疫毒素を作成した。
免疫毒素を作成した。
J5抗体は、アイ等によりイミユノケミストリー、第15
巻、第429-436頁（1978）に記載されたように、蛋白A-
セフアロースCL-4B（シグマ・ケミカル社、セントルイ
ス、MO）における親和性クロマトグラフイーによりネズ
ミの腹水液から精製した。さらに、この抗体を、グリシ
ン（50mM）及びアジ化ナトリウム（0.01％w/v）を含有
するpH6.0の10mMのリン酸ナトリウム緩衝液中でCM-セル
ロース（CM-52、ワツトマン・ケミカル・セパレーシヨ
ンス社、クリフトン、NJ）のカラムにおけるイオン交換
クロマトグラフイーにより精製した。このカラムを同じ
緩衝液における０〜100mMの塩化ナトリウム濃度勾配に
て展開させた。精製した抗体をリン酸緩衝塩水で透析し
た。
巻、第429-436頁（1978）に記載されたように、蛋白A-
セフアロースCL-4B（シグマ・ケミカル社、セントルイ
ス、MO）における親和性クロマトグラフイーによりネズ
ミの腹水液から精製した。さらに、この抗体を、グリシ
ン（50mM）及びアジ化ナトリウム（0.01％w/v）を含有
するpH6.0の10mMのリン酸ナトリウム緩衝液中でCM-セル
ロース（CM-52、ワツトマン・ケミカル・セパレーシヨ
ンス社、クリフトン、NJ）のカラムにおけるイオン交換
クロマトグラフイーにより精製した。このカラムを同じ
緩衝液における０〜100mMの塩化ナトリウム濃度勾配に
て展開させた。精製した抗体をリン酸緩衝塩水で透析し
た。
ゲロニンは、スチルペ等によりジヤーナル・バイオロジ
カル・ケミストリー、第255巻、第6947-6953頁（1980）
に記載されたように精製したが、ただしリン酸緩衝塩水
における微細セフアデツクスＧ−100（フアルマシヤ・
フアイン・ケミカルス、ウプサラ、スエーデン）のカラ
ムにおけるゲル過によりさらに精製した。
カル・ケミストリー、第255巻、第6947-6953頁（1980）
に記載されたように精製したが、ただしリン酸緩衝塩水
における微細セフアデツクスＧ−100（フアルマシヤ・
フアイン・ケミカルス、ウプサラ、スエーデン）のカラ
ムにおけるゲル過によりさらに精製した。
ジチオピリジル含有のJ5結合体の生成： 精製した抗体を、EDTA（1mM）を含有するpH7.0の100mM
リン酸ナトリウム緩衝液に溶解させ（１mg/ml）、かつ
エタノール中10mMのSPDP（ピアス・ケミカル・カンパニ
ー社、ロツクフオード、IL）の新たに作成した溶液5.5
μｌを抗体溶液1ml当りに添加した。この反応混合物を3
0℃にて30分間培養し、次いで抗体をEDTA（1mM）を含有
するpH7.0の100mMリン酸ナトリウム緩衝液に対し透析し
て過剰の試薬を除去した。これらの条件下で抗体１分子
当り約２個の基を導入して、ジチオピリジル含有のJ5結
合体を生成させた。
リン酸ナトリウム緩衝液に溶解させ（１mg/ml）、かつ
エタノール中10mMのSPDP（ピアス・ケミカル・カンパニ
ー社、ロツクフオード、IL）の新たに作成した溶液5.5
μｌを抗体溶液1ml当りに添加した。この反応混合物を3
0℃にて30分間培養し、次いで抗体をEDTA（1mM）を含有
するpH7.0の100mMリン酸ナトリウム緩衝液に対し透析し
て過剰の試薬を除去した。これらの条件下で抗体１分子
当り約２個の基を導入して、ジチオピリジル含有のJ5結
合体を生成させた。
スルフヒドリル含有ゲロニン結合体の生成： リン酸緩衝塩水におけるゲロニン（４mg/ml）を蒸留水
と0.5Mトリエタノールアミン/HCl緩衝液（pH8.0）と0.1
MのEDTAとで２mg/mlまで希釈して、トリエタノールアミ
ン及びEDTAの最終濃度をそれぞれ60mM及び1mMにした。
この溶液を脱気しかつアルゴン下で０℃に保つた。2-イ
ミノチオラン塩酸塩（ピアス・ケミカル・カンパーニー
社）を、0.5Mトリエタノールアミン/HCl緩衝液（pH8.
0）と1.0MのNaOHとの氷冷混合物（1:1v/v）により0.5モ
ルに溶解させ、かつこの氷冷ゲロニン溶液へ1ml当り２
μｌを添加した。アルゴン下で０℃にて90分間培養した
後、この溶液をNaCl（50mM）及びEDTA（1mM）を含有す
るpH5.8の5mMビストリスアセテート緩衝液におけるセフ
アデツクスG-25（微細）カラムで脱塩して未反応試薬を
除去すると共に、ゲロニン誘導体を形成させた。この工
程及びその後の工程は全て４℃で行なつた。
と0.5Mトリエタノールアミン/HCl緩衝液（pH8.0）と0.1
MのEDTAとで２mg/mlまで希釈して、トリエタノールアミ
ン及びEDTAの最終濃度をそれぞれ60mM及び1mMにした。
この溶液を脱気しかつアルゴン下で０℃に保つた。2-イ
ミノチオラン塩酸塩（ピアス・ケミカル・カンパーニー
社）を、0.5Mトリエタノールアミン/HCl緩衝液（pH8.
0）と1.0MのNaOHとの氷冷混合物（1:1v/v）により0.5モ
ルに溶解させ、かつこの氷冷ゲロニン溶液へ1ml当り２
μｌを添加した。アルゴン下で０℃にて90分間培養した
後、この溶液をNaCl（50mM）及びEDTA（1mM）を含有す
るpH5.8の5mMビストリスアセテート緩衝液におけるセフ
アデツクスG-25（微細）カラムで脱塩して未反応試薬を
除去すると共に、ゲロニン誘導体を形成させた。この工
程及びその後の工程は全て４℃で行なつた。
免疫毒素の生成： EDTA（0.5mM）を含有するpH7.0の100mMのNaPi緩衝液に
おける上記のジチオピリジル含有J5結合体（0.5−1.0mg
/ml）を、NaCl（50mM）とEDTM（1mM）とを含有するpH5.
8の5mMビス‐トリス／アセテート緩衝液における上記ス
ルフヒドリル含有ゲロニン結合体（0.5-1.0mg/ml）の同
重量（約５倍モル過剰）と混合した。この混合物のpHを
0.5Mトリエタノールアミン/HCl緩衝液（pH8.0）の添加
により7.0まで上昇させ、次いでこの混合物をアルゴン
下で４℃にて20時間保つた。最後に、ヨードアセタミド
（2mM）を添加して、残存する遊離スルフヒドリル基を
封鎖すると共に、培養を25℃にてさらに１時間続けた。
おける上記のジチオピリジル含有J5結合体（0.5−1.0mg
/ml）を、NaCl（50mM）とEDTM（1mM）とを含有するpH5.
8の5mMビス‐トリス／アセテート緩衝液における上記ス
ルフヒドリル含有ゲロニン結合体（0.5-1.0mg/ml）の同
重量（約５倍モル過剰）と混合した。この混合物のpHを
0.5Mトリエタノールアミン/HCl緩衝液（pH8.0）の添加
により7.0まで上昇させ、次いでこの混合物をアルゴン
下で４℃にて20時間保つた。最後に、ヨードアセタミド
（2mM）を添加して、残存する遊離スルフヒドリル基を
封鎖すると共に、培養を25℃にてさらに１時間続けた。
免疫毒素の精製： 未結合のゲロニン並びにスルフヒドリル含有ゲロニン結
合体を、上記したように蛋白A-セフアロースCL-4Bのカ
ラム（抗体100mgにつきカラム15ml）に溶液を通過させ
て混合物から除去した。結合した蛋白をNaCl（0.15M）
を含有する0.1M酢酸で溶出させ、かつ回収直後に各フラ
クシヨンへ0.1容量の1.0MKPi緩衝剤（pH7.5）を添加し
た。この蛋白質を、NaCl（35mM）とNaN3（0.4mM）とを
含有する5mMのNaPi緩衝液（pH6.5）に対して透析し、次
いで予め同じ緩衝液で平衡化させたCM-セルロースのカ
ラム（ワツトマン、CM-52;抗体100mgにつきカラム30m
l）に加えた。未結合のJ5及びそのジチオピリジル含有
結合体はこれらの正確なイオン強度及びpHの条件下でCM
-セルロースに結合せず、緩衝液での洗浄によつてカラ
ムから除去した。J5を含有しかつゲロニンを含有する免
疫毒素はカラムに結合し、NaCl（1.0M）を含有する100m
MのNaPi緩衝液（pH6.5）にて小容量で溶出させた。かく
して、それは今や未結合のJ5及びゲロニンの両者並びに
それらの結合体を含有せず、これをNaCl（145mM）を含
有する10mMKPi緩衝液（pH7.0）で平衡化させたセフアク
リルS-300カラム（99cm×2.6cm）でのゲル過にかけて
高分子量の凝集物を除去した。最後に、この免疫毒素
（J5−ゲロニン結合体）を0.22μｍの過膜（ミレツク
ス‐GV、ミリポア・コーポレーシヨン社、ベツドフオー
ド、MA）に溶液を通して滅菌した。
合体を、上記したように蛋白A-セフアロースCL-4Bのカ
ラム（抗体100mgにつきカラム15ml）に溶液を通過させ
て混合物から除去した。結合した蛋白をNaCl（0.15M）
を含有する0.1M酢酸で溶出させ、かつ回収直後に各フラ
クシヨンへ0.1容量の1.0MKPi緩衝剤（pH7.5）を添加し
た。この蛋白質を、NaCl（35mM）とNaN3（0.4mM）とを
含有する5mMのNaPi緩衝液（pH6.5）に対して透析し、次
いで予め同じ緩衝液で平衡化させたCM-セルロースのカ
ラム（ワツトマン、CM-52;抗体100mgにつきカラム30m
l）に加えた。未結合のJ5及びそのジチオピリジル含有
結合体はこれらの正確なイオン強度及びpHの条件下でCM
-セルロースに結合せず、緩衝液での洗浄によつてカラ
ムから除去した。J5を含有しかつゲロニンを含有する免
疫毒素はカラムに結合し、NaCl（1.0M）を含有する100m
MのNaPi緩衝液（pH6.5）にて小容量で溶出させた。かく
して、それは今や未結合のJ5及びゲロニンの両者並びに
それらの結合体を含有せず、これをNaCl（145mM）を含
有する10mMKPi緩衝液（pH7.0）で平衡化させたセフアク
リルS-300カラム（99cm×2.6cm）でのゲル過にかけて
高分子量の凝集物を除去した。最後に、この免疫毒素
（J5−ゲロニン結合体）を0.22μｍの過膜（ミレツク
ス‐GV、ミリポア・コーポレーシヨン社、ベツドフオー
ド、MA）に溶液を通して滅菌した。
J5-ゲロニン結合体の見かけ分子量は、ポリアクリルア
ミド／ドデシル硫酸ナトリウムゲル分析により評価した
ところ、約190,000であった。
ミド／ドデシル硫酸ナトリウムゲル分析により評価した
ところ、約190,000であった。
実施例２〜５ モノクローナル抗体Ｉ−２、J30、抗‐T111B及び抗‐T1
11Cを、ゴーデイング（Goding）によりジヤーナル・イ
ミユノロジー、メソツド、第13巻、第215-226頁（197
6）に記載されたように蛋白A-セフアロースCL-4Bにおけ
る親和性クロマトグラフイーによつて腹水液から精製し
た。抗体含有フラクシヨンを直ちに1/10容量の1.0M NaH
CO3の添加により中和し、次いでグリシン（50mM）とNaN
3（0.4mM）とを含有する10mMのNaPi緩衝液（pH6.0）で
透析し、さらに同じ緩衝液で平衡化したCM-セルロース
のカラム（ワツトマン、CM-52）でのイオン交換クロマ
トグラフイーによつて精製した。カラム（蛋白質120mg
につき床容積30ml）を同じ緩衝液におけるNaClの濃度勾
配、すなわちI-2、抗‐T111B及び抗−T111Cについては
０〜200mM、またJ30については０〜300mMを用いて展開
させた。精製した抗体を最後にNaCl（145mM）を含有す
る10mMのKPi緩衝液（pH7.2）で透析して、−70℃で貯蔵
した。
11Cを、ゴーデイング（Goding）によりジヤーナル・イ
ミユノロジー、メソツド、第13巻、第215-226頁（197
6）に記載されたように蛋白A-セフアロースCL-4Bにおけ
る親和性クロマトグラフイーによつて腹水液から精製し
た。抗体含有フラクシヨンを直ちに1/10容量の1.0M NaH
CO3の添加により中和し、次いでグリシン（50mM）とNaN
3（0.4mM）とを含有する10mMのNaPi緩衝液（pH6.0）で
透析し、さらに同じ緩衝液で平衡化したCM-セルロース
のカラム（ワツトマン、CM-52）でのイオン交換クロマ
トグラフイーによつて精製した。カラム（蛋白質120mg
につき床容積30ml）を同じ緩衝液におけるNaClの濃度勾
配、すなわちI-2、抗‐T111B及び抗−T111Cについては
０〜200mM、またJ30については０〜300mMを用いて展開
させた。精製した抗体を最後にNaCl（145mM）を含有す
る10mMのKPi緩衝液（pH7.2）で透析して、−70℃で貯蔵
した。
免疫毒素をI-2、J30、抗‐T111B及び抗‐T111C並びにゲ
ロニンから作成したが、手順は未結合の抗体をCM-セル
ロースにより免疫毒素から分離するために使用した溶液
においてのみ実施例１とは異なつている。分離用の４種
の緩衝液は全てNaPi（5mM）とNaN3（0.4mM）とを含有
し、これらをpH6.5に調整したが、ただしJ30に対する緩
衝液はpH7.0に調整した。NaClの濃度はI-2及びJ30につ
いては溶液中40mMとし、抗‐T111Cについては溶液中34m
Mとし、また抗‐T111Bについては溶液中25mMとした。
ロニンから作成したが、手順は未結合の抗体をCM-セル
ロースにより免疫毒素から分離するために使用した溶液
においてのみ実施例１とは異なつている。分離用の４種
の緩衝液は全てNaPi（5mM）とNaN3（0.4mM）とを含有
し、これらをpH6.5に調整したが、ただしJ30に対する緩
衝液はpH7.0に調整した。NaClの濃度はI-2及びJ30につ
いては溶液中40mMとし、抗‐T111Cについては溶液中34m
Mとし、また抗‐T111Bについては溶液中25mMとした。
実施例６ 免疫毒素を抗‐T111A及びゲロニンから実施例１におけ
ると同じ手順で作成したが、ただし抗‐T111Aは蛋白質
Ａに結合しないので、この抗体を含有する腹水液を蛋白
質A-セフアロースCL-4Bに通過させて蛋白質Ａに結合す
る微量のネズミ免疫グロブリンを除去することにより精
製した。次いで、（NH4）2SO4を50％飽和まで加えるこ
とにより溶出液を分画した。沈澱した蛋白質を、NaCl
（145mM）を含有する10mMのKPi緩衝液（pH7.2）に溶解
させ、次いでpH6.0の緩衝液に透析し、上記と同様にCM-
セルロースのカラムでクロマトグラフイーにかけた。カ
ラムは０〜300mMのNaClの濃度勾配で展開させた。抗−T
111Aを含有するフラクシヨンを集め、濃縮し、かつNaCl
（145mM）を含有する10mMのKPi（pH7.2）に平衡化させ
たセフアクリルS-300のカラム（99cm×2.6cm）にてゲル
過にかけた。
ると同じ手順で作成したが、ただし抗‐T111Aは蛋白質
Ａに結合しないので、この抗体を含有する腹水液を蛋白
質A-セフアロースCL-4Bに通過させて蛋白質Ａに結合す
る微量のネズミ免疫グロブリンを除去することにより精
製した。次いで、（NH4）2SO4を50％飽和まで加えるこ
とにより溶出液を分画した。沈澱した蛋白質を、NaCl
（145mM）を含有する10mMのKPi緩衝液（pH7.2）に溶解
させ、次いでpH6.0の緩衝液に透析し、上記と同様にCM-
セルロースのカラムでクロマトグラフイーにかけた。カ
ラムは０〜300mMのNaClの濃度勾配で展開させた。抗−T
111Aを含有するフラクシヨンを集め、濃縮し、かつNaCl
（145mM）を含有する10mMのKPi（pH7.2）に平衡化させ
たセフアクリルS-300のカラム（99cm×2.6cm）にてゲル
過にかけた。
実施例１に記載した手順により、この抗‐T111A抗体と
ゲロニンとを架橋させた後、反応混合物を限外過によ
つて濃縮し、かつ過剰の遊離ゲロニン並びに高分子量の
ゲロニン結合体及び凝集体を、NaCl（145mM）を含有す
る10mMのKPi緩衝液（pH7.2）で平衡化したセアアクリル
S-300のカラム（99cm×2.5cm、抗体100mgを含有する試
料12mlにつき）でのゲル過によつて分離した。遊離の
抗‐T111A及びそのジチオピリジル含有の結合体を実施
例１に記載したと同様なCM-セルロース分画によつて免
疫毒素から分離した。ただし、緩衝液はNaCl（21.5mM）
とNaN3（0.4mM）とを含有する5mMのNaPi緩衝液（pH6.
5）とした。精製した免疫毒素を上記と同様にカラムか
ら溶出させ、かつNaCl（145mM）を含有する10mMのKPi緩
衝液（pH7.0）で透析した。
ゲロニンとを架橋させた後、反応混合物を限外過によ
つて濃縮し、かつ過剰の遊離ゲロニン並びに高分子量の
ゲロニン結合体及び凝集体を、NaCl（145mM）を含有す
る10mMのKPi緩衝液（pH7.2）で平衡化したセアアクリル
S-300のカラム（99cm×2.5cm、抗体100mgを含有する試
料12mlにつき）でのゲル過によつて分離した。遊離の
抗‐T111A及びそのジチオピリジル含有の結合体を実施
例１に記載したと同様なCM-セルロース分画によつて免
疫毒素から分離した。ただし、緩衝液はNaCl（21.5mM）
とNaN3（0.4mM）とを含有する5mMのNaPi緩衝液（pH6.
5）とした。精製した免疫毒素を上記と同様にカラムか
ら溶出させ、かつNaCl（145mM）を含有する10mMのKPi緩
衝液（pH7.0）で透析した。
実施例7-11 免疫毒素をJ5並びに精製したPAJ、PAPII及びPAP-Sのそ
れぞれから実施例１におけると同じ手順にしたがつて作
成した。さらに、免疫毒素を抗‐T111B及びPAP-Sから実
施例４におけると同じ手順で作成し、かつ抗‐T111A及
びPAP-Sから実施例６におけると同手順で作成した。
れぞれから実施例１におけると同じ手順にしたがつて作
成した。さらに、免疫毒素を抗‐T111B及びPAP-Sから実
施例４におけると同じ手順で作成し、かつ抗‐T111A及
びPAP-Sから実施例６におけると同手順で作成した。
抗体及び免疫毒素の抗原結合活性 各種の抗体及び免疫毒素の結合活性を間接免疫蛍光によ
つて測定した。適切な抗原を有する各種細胞（１×106
個）の培養物を０℃にて30分間培養し、その際2.5％（v
/v）のAB-型の収集したヒト血清とNaCl（0.9％w/v）含
有の１％（v/v）の1MHEPES緩衝液（pH7.2）とを補充し
た懸濁培養物に対するイーグル最小必須培地（ギブコ・
ラボラトリース社）100μｌにて抗体若しくは免疫毒素
をシリーズで希釈した。次いで、これら細胞を氷冷した
培地で３回洗浄した後、フルオレセイン標識したヤギ抗
‐ネズミIgG抗体で０℃にて30分間染色し、その際保存
溶液（メロイ・ラボラトリース社）を培地で1:25に希釈
したもの100μｌを用いた。再び細胞を氷冷培地で３回
洗浄した。蛍光性の抗体被覆した細胞を最後にEPICS IV
細胞ソータ（クールター・エレクトロニツクス社、ハイ
アリー、FI）で分析した。その結果は、関連抗原陽性細
胞に対する免疫毒素の結合が各対応の抗体自身における
と同様であることを示した。さらに、免疫毒素は、抗原
陰性細胞に対し検出しうる結合を示さなかつた。各抗体
の特異性及び親和性が免疫毒素に完全に維持された。
つて測定した。適切な抗原を有する各種細胞（１×106
個）の培養物を０℃にて30分間培養し、その際2.5％（v
/v）のAB-型の収集したヒト血清とNaCl（0.9％w/v）含
有の１％（v/v）の1MHEPES緩衝液（pH7.2）とを補充し
た懸濁培養物に対するイーグル最小必須培地（ギブコ・
ラボラトリース社）100μｌにて抗体若しくは免疫毒素
をシリーズで希釈した。次いで、これら細胞を氷冷した
培地で３回洗浄した後、フルオレセイン標識したヤギ抗
‐ネズミIgG抗体で０℃にて30分間染色し、その際保存
溶液（メロイ・ラボラトリース社）を培地で1:25に希釈
したもの100μｌを用いた。再び細胞を氷冷培地で３回
洗浄した。蛍光性の抗体被覆した細胞を最後にEPICS IV
細胞ソータ（クールター・エレクトロニツクス社、ハイ
アリー、FI）で分析した。その結果は、関連抗原陽性細
胞に対する免疫毒素の結合が各対応の抗体自身における
と同様であることを示した。さらに、免疫毒素は、抗原
陰性細胞に対し検出しうる結合を示さなかつた。各抗体
の特異性及び親和性が免疫毒素に完全に維持された。
細胞フリーの系における蛋白合成の分析： 蛋白合成に対するゲロニン又はヤマゴボウ抗ウイルス蛋
白及び免疫毒素の阻止活性を、ウサギの網状赤血球溶解
物で測定した。NaCl（20mM）及び牛血清アルブミン（0.
2mg/ml）を含有する10mMのKPi緩衝液（pH7.4）にて0.02
μg/mlのゲロニンまで希釈したゲロニン若しくは免疫毒
素の試料１μｌを、0.5mlのエツペンドルフ管における
網状赤血球溶解物（10μｌ）へ０℃にて添加した。塩と
緩衝剤カクテル（ニユーイングランド・ヌクレア社）と
を含有する混合物、すなわち従来ペルハム（Pelham）等
によりヨーロピアン・ジヤーナル・バイオケミストリ
ー、第67巻、第247-256頁（1976）に記載されているよ
うな19種のアミノ酸とクレアチン燐酸塩（0.15μモル）
とクレアチンホスホキナーゼ（2.5μｇ）とmRNA（80μ
ｇ）と57mCi/μモルの比放射性まで希釈した〔H3〕‐ロ
イシン（16μCi）との混合物16μｌを添加して反応を開
始させた。急速混合した後、チユーブを30℃で培養し
た。試料（３μｌ）を種々異なる時点で採取し、蛋白質
中への〔H3〕‐ロイシンの組込みを、蒸留水（0.4ml）
中への希釈によつて停止させた。放射線標識した蛋白質
を、ペルハム等（上記）に記載されたように定量した。
白及び免疫毒素の阻止活性を、ウサギの網状赤血球溶解
物で測定した。NaCl（20mM）及び牛血清アルブミン（0.
2mg/ml）を含有する10mMのKPi緩衝液（pH7.4）にて0.02
μg/mlのゲロニンまで希釈したゲロニン若しくは免疫毒
素の試料１μｌを、0.5mlのエツペンドルフ管における
網状赤血球溶解物（10μｌ）へ０℃にて添加した。塩と
緩衝剤カクテル（ニユーイングランド・ヌクレア社）と
を含有する混合物、すなわち従来ペルハム（Pelham）等
によりヨーロピアン・ジヤーナル・バイオケミストリ
ー、第67巻、第247-256頁（1976）に記載されているよ
うな19種のアミノ酸とクレアチン燐酸塩（0.15μモル）
とクレアチンホスホキナーゼ（2.5μｇ）とmRNA（80μ
ｇ）と57mCi/μモルの比放射性まで希釈した〔H3〕‐ロ
イシン（16μCi）との混合物16μｌを添加して反応を開
始させた。急速混合した後、チユーブを30℃で培養し
た。試料（３μｌ）を種々異なる時点で採取し、蛋白質
中への〔H3〕‐ロイシンの組込みを、蒸留水（0.4ml）
中への希釈によつて停止させた。放射線標識した蛋白質
を、ペルハム等（上記）に記載されたように定量した。
上記のウサギ網状赤血球溶解物系における蛋白質合成は
20pgのゲロニンにより完全に阻止された。ジチオエリト
リトールによる事前の還元（20mM、30℃にて30分間）の
後に2-イミノチオラン塩酸塩（1.4チオール基／モル）
との反応により作成したゲロニン結合体の分析は正確に
同じ阻止を示し、４個までのチオール基が2-イミノチオ
ラン塩酸塩との反応により各ゲロニン分子中に蛋白合成
を阻止するその能力を阻害することなく導入されうるこ
とが判明した。J5-ゲロニン免疫毒素は、事前の還元な
しに分析した場合、蛋白合成阻止剤として天然ゲロニン
よりも低い活性を有するが、ジチオエリトリトールと共
に予備培養すればこの分析における蛋白質合成を阻止す
るその能力において天然ゲロニンから区別しえないよう
な充分活性のゲロニンを放出することが判明した。同様
な結果が、上記したような他のゲロニン免疫毒素並びに
PAP、PAP-II及びPAP-Sを含むような免疫毒素についても
得られた。
20pgのゲロニンにより完全に阻止された。ジチオエリト
リトールによる事前の還元（20mM、30℃にて30分間）の
後に2-イミノチオラン塩酸塩（1.4チオール基／モル）
との反応により作成したゲロニン結合体の分析は正確に
同じ阻止を示し、４個までのチオール基が2-イミノチオ
ラン塩酸塩との反応により各ゲロニン分子中に蛋白合成
を阻止するその能力を阻害することなく導入されうるこ
とが判明した。J5-ゲロニン免疫毒素は、事前の還元な
しに分析した場合、蛋白合成阻止剤として天然ゲロニン
よりも低い活性を有するが、ジチオエリトリトールと共
に予備培養すればこの分析における蛋白質合成を阻止す
るその能力において天然ゲロニンから区別しえないよう
な充分活性のゲロニンを放出することが判明した。同様
な結果が、上記したような他のゲロニン免疫毒素並びに
PAP、PAP-II及びPAP-Sを含むような免疫毒素についても
得られた。
細胞毒性分析： 細胞（５×104個の細胞を含有する0.1mlの培地）を96穴
（平底）のポリスチレン製マイクロタイター板（マイク
ロテストIII、ベクトン・デキンソン社）に塗沫した。
細胞毒性につき試験する蛋白質のシリーズ希釈物を含有
する等容積（0.1ml）の培地を各穴に加え、次いでシエ
ル‐LAB培養器（シエルダン・マニユフアクチヤリング
・インコーポレーシヨン社、コーネリウス、OR）にて５
％のCO2を含有する湿潤雰囲気内で37℃にて細胞を培養
した。必要とする培養時間の後、細胞に〔H3〕‐チミジ
ン（0.8μCi/穴１個）にて２時間パルス処理し、次いで
収獲し、かつPHD細胞ハーベスタ（ケンブリツジ・テク
ノロジー・インコーポレーシヨン社、ケンブリツジ、M
A）を用いてガラス繊維盤上へ溶解させた。水とエタノ
ールとで洗浄した後にフイルタ上に保持された放射能
を、パツカード・トリーカルブ4530シンチレーシヨンカ
ウンタを用いて2mlのベータフラワ中で測定した。全て
の分析は３反復で行ない、各実験を少なくとも３回反復
した。ID50の値は、〔H3〕‐チミジン組込みの50％阻止
を引起こす免疫毒素の濃度として測定した。
（平底）のポリスチレン製マイクロタイター板（マイク
ロテストIII、ベクトン・デキンソン社）に塗沫した。
細胞毒性につき試験する蛋白質のシリーズ希釈物を含有
する等容積（0.1ml）の培地を各穴に加え、次いでシエ
ル‐LAB培養器（シエルダン・マニユフアクチヤリング
・インコーポレーシヨン社、コーネリウス、OR）にて５
％のCO2を含有する湿潤雰囲気内で37℃にて細胞を培養
した。必要とする培養時間の後、細胞に〔H3〕‐チミジ
ン（0.8μCi/穴１個）にて２時間パルス処理し、次いで
収獲し、かつPHD細胞ハーベスタ（ケンブリツジ・テク
ノロジー・インコーポレーシヨン社、ケンブリツジ、M
A）を用いてガラス繊維盤上へ溶解させた。水とエタノ
ールとで洗浄した後にフイルタ上に保持された放射能
を、パツカード・トリーカルブ4530シンチレーシヨンカ
ウンタを用いて2mlのベータフラワ中で測定した。全て
の分析は３反復で行ない、各実験を少なくとも３回反復
した。ID50の値は、〔H3〕‐チミジン組込みの50％阻止
を引起こす免疫毒素の濃度として測定した。
上記の分析を用いて免疫毒素の細胞毒性を試験し、全て
がCALLA-含有細胞ラインの増殖に対する有力な阻止剤と
なり、毒性の開始が細胞を露出してから２〜３日後に出
現することが判明した。
がCALLA-含有細胞ラインの増殖に対する有力な阻止剤と
なり、毒性の開始が細胞を露出してから２〜３日後に出
現することが判明した。
ヌードマウスにおける腫瘍異種移植モデルでのJ5-ゲロ
ニンの薬理効果 試験材料:J5を含む免疫結合体、ゲロニンに結合したマ
ウスモノクローナル抗CALLA抗体 動物：スイスヌード異系交配雌マウスをTaconic Farms
（ニューヨーク州、Germantown在）より購入した。動物
を、Dana-Farber Cancer Institureの動物の世話につい
ての委員会のガイドラインに従って維持した。
ニンの薬理効果 試験材料:J5を含む免疫結合体、ゲロニンに結合したマ
ウスモノクローナル抗CALLA抗体 動物：スイスヌード異系交配雌マウスをTaconic Farms
（ニューヨーク州、Germantown在）より購入した。動物
を、Dana-Farber Cancer Institureの動物の世話につい
ての委員会のガイドラインに従って維持した。
細胞系統:Namalwa細胞系統はヒトバーキットリンパ腫か
ら誘導される（ATCC CRL1432）。
ら誘導される（ATCC CRL1432）。
薬理効果試験:J5-ゲロニン結合体のイン・ビボでの薬理
効果をヌードマウスにおいて調べた。これらのマウス
に、５×107のNamalwa細胞を接種した（腹腔内）。接種
後１〜２時間にて、これらのマウスに、単一投与量のJ5
-ゲロニン、J5抗体又はリン酸緩衝塩容液（PBS）を尾静
脈から与えた（静脈注射）。このモデルにおける対照動
物の中央生存時間は約24時間である。薬理効果を、終点
としての死に至る時間によって測定した。
効果をヌードマウスにおいて調べた。これらのマウス
に、５×107のNamalwa細胞を接種した（腹腔内）。接種
後１〜２時間にて、これらのマウスに、単一投与量のJ5
-ゲロニン、J5抗体又はリン酸緩衝塩容液（PBS）を尾静
脈から与えた（静脈注射）。このモデルにおける対照動
物の中央生存時間は約24時間である。薬理効果を、終点
としての死に至る時間によって測定した。
図１は、５×107のNamalwa細胞を接種したヌードマウス
におけるJ5−ゲロニン結合体のイン・ビボでの薬理試験
の結果を示す。動物を、PBS（●）又は10μｇ（0.5mg/K
g体重）のJ5-ゲロニン（○）、１μｇ（0.05mg／kg体
重）のJ5−ゲロニン（▲）、又は0.1μｇ（0.005mg／kg
体重）のJ5-ゲロニン（△）で処理した。
におけるJ5−ゲロニン結合体のイン・ビボでの薬理試験
の結果を示す。動物を、PBS（●）又は10μｇ（0.5mg/K
g体重）のJ5-ゲロニン（○）、１μｇ（0.05mg／kg体
重）のJ5−ゲロニン（▲）、又は0.1μｇ（0.005mg／kg
体重）のJ5-ゲロニン（△）で処理した。
図２は、J5-ゲロニン及びJ5抗体の薬理効果を示す。動
物を、PBS（●）、10μｇのJ5抗体（■）及び10μｇのJ
5-ゲロニン（〇）で処理した。
物を、PBS（●）、10μｇのJ5抗体（■）及び10μｇのJ
5-ゲロニン（〇）で処理した。
結論:J5-ゲロニン免疫結合体は、腫瘍を有するマウスの
生存を投与量に依存して延長させる（図１）。J5抗体単
独でも、腫瘍を有するマウスの生存を延長させる効果が
幾らかあった（図２）。しかしながら、腫瘍接種後70日
までに、この処理の群のマウスはすべて死亡したのに対
し、J5-ゲロニンで処理したマウスの75％は90日におい
て依然として生存しており、この結合体が抗体単独より
も、このイン・ビボモデルにおける生存延長について優
れていることを示している。
生存を投与量に依存して延長させる（図１）。J5抗体単
独でも、腫瘍を有するマウスの生存を延長させる効果が
幾らかあった（図２）。しかしながら、腫瘍接種後70日
までに、この処理の群のマウスはすべて死亡したのに対
し、J5-ゲロニンで処理したマウスの75％は90日におい
て依然として生存しており、この結合体が抗体単独より
も、このイン・ビボモデルにおける生存延長について優
れていることを示している。
毒性試験 A/Jマウスに、ゲロニン、無関係の特異性を有するMCA
（モノクローナル抗体）又はMCA-ゲロニン結合体を毎日
継続して静脈注射により投与した。MCAの150mg／kgまで
の及びそれを超える累積投与量は、外観、体重減少若し
くは死亡により測定した限りでは毒性を示さなかった。
MCA-ゲロニンの50mg／kgを超える累積投与量は、常に最
後の注射の後２日以内に死亡を引き起こしたが、ゲロニ
ン単独では75mg／kgを超える投力量において時々死亡を
引き起こすだけであった。約25mg／kgのLD50より低レベ
ルにおいて、MCA-ゲロニン結合体は投与量依存性の可逆
的体重減少を引き起こし、ゲロニン単独でも同様のこと
が弱い程度で見られたが、MCA投与では全く見られなか
った（図３）。MCA-ゲロニン結合体の毒性は、MCAのイ
ソタイプ又は投与経路によっては変化しなかった。
（モノクローナル抗体）又はMCA-ゲロニン結合体を毎日
継続して静脈注射により投与した。MCAの150mg／kgまで
の及びそれを超える累積投与量は、外観、体重減少若し
くは死亡により測定した限りでは毒性を示さなかった。
MCA-ゲロニンの50mg／kgを超える累積投与量は、常に最
後の注射の後２日以内に死亡を引き起こしたが、ゲロニ
ン単独では75mg／kgを超える投力量において時々死亡を
引き起こすだけであった。約25mg／kgのLD50より低レベ
ルにおいて、MCA-ゲロニン結合体は投与量依存性の可逆
的体重減少を引き起こし、ゲロニン単独でも同様のこと
が弱い程度で見られたが、MCA投与では全く見られなか
った（図３）。MCA-ゲロニン結合体の毒性は、MCAのイ
ソタイプ又は投与経路によっては変化しなかった。
フロントページの続き (72)発明者 センター，ピーター デイー アメリカ合衆国 02130 マサチユ−セツ ツ，ボストン，ワン リージエント サー クル（番地なし) (56)参考文献 特開 昭57−106625（ＪＰ，Ａ)
Claims (9)
- 【請求項１】組成： ［式中、ｎは１〜５の整数であり、ｍは１〜５の整数で
あり、NH−抗体は真核細胞に対し又はこれに関連する抗
原に対し特異性のモノクローナル抗体であり、かつA-は
非毒性の水溶性陰イオンである］ を有する免疫毒素。 - 【請求項２】抗体が哺乳動物細胞に対し特異性である請
求の範囲第１項記載の免疫毒素。 - 【請求項３】モノクローナル抗体が、ヒトＴ細胞に対し
又は一般的な急性リンパ芽球白血病抗原に対し特異性で
ある請求の範囲第１項記載の免疫毒素。 - 【請求項４】ｎが３でありかつｍが２である請求の範囲
第１項記載の免疫毒素。 - 【請求項５】モノクローナル抗体がヒトＴ細胞に対し又
は一般的な急性リンパ芽球白血病抗原に対し特異性であ
る請求の範囲第４項記載の免疫毒素。 - 【請求項６】ゲロニンを水性媒体中で組成： ［式中、ｎは１〜５の整数であり、Ｒは１〜５個の炭素
原子を有するアルキル基でありかつA-は水溶性陰イオン
である］ を有するイミノチオールエステル塩と反応させて組成： を有する第１結合体を生成させ、 抗体を水性媒体中で構造： ［式中、ｍは１〜５の整数である］ を有する試薬と反応させて組成： を有する第２結合体を生成させ、 さらに第１及び第２結合体を水性媒体中で互いに反応さ
せて免疫毒素を生成させる ことを特徴とする下記の組成： ［式中、ｎは１〜５の整数であり、ｍは１〜５の整数で
あり、NH−抗体は真核細胞に対し又はこれに関連する抗
原に対し特異性のモノクローナル抗体であり、かつA-は
非毒性の水溶性陰イオンである］ を有する免疫毒素の製造方法。 - 【請求項７】イミノチオールエステル塩が２−イミノチ
オラン塩酸塩であり、ｎが３でありかつｍが２である請
求の範囲第６項記載の方法。 - 【請求項８】モノクローナル抗体が、ヒトＴ細胞に対し
又は一般的な、急性リンパ芽球白血病抗原に対し特異性
である請求の範囲第６項記載の方法。 - 【請求項９】モノクローナル抗体がヒトＴ細胞に対し又
は一般的な急性リンパ芽球白血病抗原に対し特異性であ
る請求の範囲第７項記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US70765085A | 1985-03-04 | 1985-03-04 | |
| US707650 | 1985-03-04 | ||
| PCT/US1985/001299 WO1986005098A1 (en) | 1985-03-04 | 1985-07-08 | Immunotoxin and method of making |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62500518A JPS62500518A (ja) | 1987-03-05 |
| JPH0720883B2 true JPH0720883B2 (ja) | 1995-03-08 |
Family
ID=24842568
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60503331A Expired - Lifetime JPH0720883B2 (ja) | 1985-03-04 | 1985-07-08 | 免疫毒素及びその製造方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0214995B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0720883B2 (ja) |
| CA (1) | CA1259920A (ja) |
| DE (1) | DE3581210D1 (ja) |
| WO (1) | WO1986005098A1 (ja) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IE62463B1 (en) * | 1988-07-07 | 1995-02-08 | Res Dev Foundation | Immunoconjugates for cancer diagnosis and therapy |
| EP0454726A4 (en) * | 1988-12-22 | 1991-11-27 | Xoma Corporation | Hindered linking agents and methods |
| US5183904A (en) * | 1988-12-22 | 1993-02-02 | Xoma Corporation | Hindered linking agents and methods |
| US5194594A (en) * | 1990-09-07 | 1993-03-16 | Techniclone, Inc. | Modified antibodies |
| IT1249051B (it) * | 1991-02-26 | 1995-02-11 | Italfarmaco Spa | Immunotossina da anticorpi monoclonali anti-cd5 |
| US6146850A (en) | 1991-11-04 | 2000-11-14 | Xoma Corporation | Proteins encoding gelonin sequences |
| US5837491A (en) * | 1991-11-04 | 1998-11-17 | Xoma Corporation | Polynucleotides encoding gelonin sequences |
| US5621083A (en) | 1991-11-04 | 1997-04-15 | Xoma Corporation | Immunotoxins comprising ribosome-inactivating proteins |
| US5376546A (en) * | 1991-11-04 | 1994-12-27 | Xoma Corporation | Analogs of ribosome-inactivating proteins |
| SE9601158D0 (sv) * | 1996-03-26 | 1996-03-26 | Stefan Svenson | Method of producing immunogenic products and vaccines |
| ZA200305980B (en) | 2001-02-12 | 2007-01-31 | Res Dev Foundation | Modified proteins, designer toxins, and methods of making thereof |
| CA2454048C (en) | 2001-07-17 | 2011-05-03 | Research Development Foundation | Therapeutic agents comprising pro-apoptotic proteins |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57106625A (en) * | 1980-12-22 | 1982-07-02 | Teijin Ltd | Cytotoxic protein complex and its preparation |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE427505B (sv) * | 1977-03-04 | 1983-04-11 | Pharmacia Diagnostics Ab | Reagens till anvendning vid immunkemiska bestemningsmetoder |
| FR2437213A1 (fr) * | 1978-09-28 | 1980-04-25 | Cm Ind | Produits cytotoxiques formes par liaison covalente de la chaine a de la ricine avec un anticorps et leur procede de preparation |
| JPS5616418A (en) * | 1979-07-20 | 1981-02-17 | Teijin Ltd | Antitumor protein complex and its preparation |
| JPS5686121A (en) * | 1979-12-14 | 1981-07-13 | Teijin Ltd | Antitumor proten complex and its preparation |
-
1985
- 1985-07-08 EP EP85903739A patent/EP0214995B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-07-08 DE DE8585903739T patent/DE3581210D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1985-07-08 JP JP60503331A patent/JPH0720883B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-07-08 WO PCT/US1985/001299 patent/WO1986005098A1/en active IP Right Grant
- 1985-10-08 CA CA000492485A patent/CA1259920A/en not_active Expired
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57106625A (en) * | 1980-12-22 | 1982-07-02 | Teijin Ltd | Cytotoxic protein complex and its preparation |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3581210D1 (de) | 1991-02-07 |
| CA1259920A (en) | 1989-09-26 |
| EP0214995B1 (en) | 1990-12-27 |
| WO1986005098A1 (en) | 1986-09-12 |
| EP0214995A4 (en) | 1987-07-22 |
| EP0214995A1 (en) | 1987-03-25 |
| JPS62500518A (ja) | 1987-03-05 |
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