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JPH07184664A - アルファ−チューブリンのキメラ遺伝子のプロモーターエレメント - Google Patents

アルファ−チューブリンのキメラ遺伝子のプロモーターエレメント

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Publication number
JPH07184664A
JPH07184664A JP6276846A JP27684694A JPH07184664A JP H07184664 A JPH07184664 A JP H07184664A JP 6276846 A JP6276846 A JP 6276846A JP 27684694 A JP27684694 A JP 27684694A JP H07184664 A JPH07184664 A JP H07184664A
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JP
Japan
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gene
plant
nucleic acid
maize
regulatory element
Prior art date
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Pending
Application number
JP6276846A
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English (en)
Inventor
Montserrat Capellades
モンセラ・カペリヤーデス
Rose Richard De
リシヤール・ドウ・ローズ
Lluis Montoliu
ルイ・モントリユ
Pedro Puigdomenech
ペドロ・ピユイグドムネシユ
Juan Rigau
フアン・リゴー
Miguel Angel Torres
ミゲル・アンヘル・トレス
Javier Uribe
ハビエル・ウリベ
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Bayer CropScience SA
Original Assignee
Rhone Poulenc Agrochimie SA
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Filing date
Publication date
Application filed by Rhone Poulenc Agrochimie SA filed Critical Rhone Poulenc Agrochimie SA
Publication of JPH07184664A publication Critical patent/JPH07184664A/ja
Pending legal-status Critical Current

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Abstract

(57)【要約】 【構成】 少なくとも花粉、根、分裂組織ゾーン及び未
成熟胚における特異的発現を制御する調節エレメントを
少なくとも一つ含むトウモロコシα−チューブリン遺伝
子に由来する単離核酸。 【効果】 植物の遺伝子形質転換に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、α−チューブリンのキ
メラ遺伝子のプロモーターエレメントに関する。
【０００２】
【従来の技術】微小管は、あらゆる種類の細胞における
多くの機能にとって必須のエレメントである。特に植物
では、幾つかの重要な現象、特に形態形成に関する現象
で主要な役割を果たす。総ての真核生物において、微小
管は多数の高度に保存された（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）タ
ンパク質で構成されている。その中で最も多いのはチュ
ーブリンである。これまでに二つの主要なタンパク質サ
ブユニットが開示されており、それぞれα−チューブリ
ン及びβ−チューブリンと称されている。微小管の本質
的機能及び偏在的分布はしばしば、チューブリンをコー
ドする遺伝子が、強く且つ構造的に発現された遺伝子の
好例であるという見解を示唆してきた。実際、チューブ
リンサブユニットは、真核生物では、ある遺伝子ファミ
リーによってコードされる。植物の分野では、α−及び
β−チューブリンは、例えばトウモロコシ、Ａｒａｂｉ
ｄｏｐｓｉｓ、ダイズ、エンドウ及びニンジンのような
数種類について研究されてきた。これらのいずれでも、
それぞれのゲノムが、植物の生長中に様々に発現される
多数のα−及びβ−チューブリン遺伝子をコードする。
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓでは、チューブリン遺伝子ファ
ミリーの注意深い分析の結果、これらのタンパク質をコ
ードする１５個の遺伝子（α−チューブリン６個及びβ
−チューブリン９個）が明らかにされた（Ｋｏｐｃｚａ
ｋら，１９９２；Ｓｎｕｓｔａｄら，１９９２）。トウ
モロコシでは、３個のα−チューブリン遺伝子がクロー
ニングされ、配列決定された（Ｍｏｎｔｏｌｉｕら，１
９８９；Ｍｏｎｔｏｌｉｕら，１９９０）。更に、ゲノ
ムＤＮＡのＰＣＲ分析により別の６個を検出し得る（Ｍ
ｏｎｔｏｌｉｕら，１９９２）。最近の研究によれば、
トウモロコシ組織から別個のα−チューブリンＤＮＡ配
列が少なくとも６個クローニングされ、特徴が解明され
た（Ｖｉｌｌｅｍｕｒら，１９９２）。
【０００３】トウモロコシに由来するα−Ｔｕｂ １及
びα−Ｔｕｂ ２遺伝子は、２キロベース（ｋｂ）対以
上のＤＮＡにより分離されて縦一列に配置されている。
これらの遺伝子は総てのトウモロコシ分裂組織内で発現
され、幼根系では発現レベルが高い（Ｍｏｎｔｏｌｉｕ
ら，１９８９）。α−Ｔｕｂ １遺伝子は、分析した総
ての組織内でα−Ｔｕｂ ２遺伝子より高いレベルで発
現され、また、花粉内で強く発現される（Ｍｏｎｔｏｌ
ｉｕら，１９９０）。ｉｎ ｖｉｔｒｏハイブリダイゼ
ーション実験の結果、分裂組織内では、休止状態の主要
活性化（ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ ｃｅｎｔｒａｌ ａｃｔ
ｉｖａｔｉｏｎ）の間にα−Ｔｕｂ １が発現されるこ
とが明らかにされた（Ｒｉｇａｕら，Ｐｒｅｓｓ）。Ａ
ｒａｂｉｄｏｐｓｉｓでは、ある遺伝子が花粉中で特異
的に発現されることが判明したが、トウモロコシ遺伝子
α−Ｔｕｂ １又はα−Ｔｕｂ ２と同じ発現パターン
を示したものはなかった（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒら，１９
９０）。トウモロコシ遺伝子α−Ｔｕｂ ３は、分裂中
の細胞を多く含む総ての植物器官、とくに未成熟胚で発
現される（Ｍｏｎｔｏｌｉｕら，１９９０）。
【０００４】ここに至って、トウモロコシα−チューブ
リン遺伝子に由来する領域のプロモーター調節エレメン
トは、単子葉植物及び双子葉植物の両方を含む植物種の
花粉、幼根系、分裂組織ゾーン及び未成熟胚内での特定
組織発現を制御し得ることが判明した。本発明は、トラ
ンスジェニック植物における遺伝子発現の制御、特に除
草剤耐性遺伝子の制御を向上させる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題及び課題を解決するため
の手段】本発明は、トウモロコシα−チューブリン遺伝
子の５’調節領域に関する。該領域は、本発明では、異
種遺伝子をコードする遺伝子の発現を制御するのに有用
な、上流調節アセンブリ（ｕｐｓｔｒｅａｍ ｒｅｇｕ
ｌａｔｏｒｙ ｅｎｓｅｍｂｌｅ＝ＵＲＥ）と定義され
る。ＵＲＥは、トランスジェニック植物内で発現された
異種遺伝子のコーディング領域に結合した時にそれぞれ
異なる調節発現パターンを形成する複数の調節エレメン
トを含む。特に、本発明は、根、花粉及び分裂組織にお
ける遺伝子の発現を特異的に制御する、トウモロコシ遺
伝子α−Ｔｕｂ １由来のＤＮＡから単離した領域に関
する情報を提供する。
【０００６】本発明は、前記調節エレメントを含む植物
キメラ遺伝子にも関する。調節エレメントは、異種遺伝
子によってコードされた産物の発現を制御することがで
きるように、異種遺伝子のコーディング配列に機能的に
結合される。必要であれば、別のプロモーターエレメン
トが全体的又は部分的にキメラ遺伝子構築体中に含まれ
る。これらの補足的エレメントは、非限定的具体例とし
て例えば、単子葉植物組織における異種遺伝子の発現を
大幅に増強する、コメのアクチン遺伝子のイントロン
１のような単子葉植物のイントロン配列を含む。本発明
は、植物形質転換ベクター、これらのベクターによって
形質転換した植物細胞、並びにキメラ遺伝子を有する植
物及び種子も包含する。
【０００７】本発明では別の目的によれば、異種ペプチ
ドの細胞レベル以下での位置決定（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌ
ａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）を植物細胞に特異的
な細胞レベル以下の細胞小器官に向けることができる、
アミノ末端トランジットペプチドを含む融合ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ配列を有するキメラ遺伝子を形成
して、トランスジェニック植物における遺伝子発現のよ
り高度な制御及びより確実なターゲッティングを得る。
【０００８】本発明は、新しい特性を有し、特に除草剤
に対して耐性である形質転換単子葉又は双子葉植物の製
造方法も提供する。該構築体で形質転換した植物細胞
は、再生及び／又は培養により、耐性植物を生み出すこ
とができる。
【０００９】本発明は、トウモロコシα−チューブリン
遺伝子の上流調節アセンブリ（ＵＲＥ）のシス調節エレ
メントを包含する。該シス調節エレメントはＵＲＥのそ
れぞれ別個の領域であり、自己の制御下にある遺伝子に
ついて発現の調節を付与する。本発明は、特定的には、
根、花粉、分裂組織及び未成熟胚における特異的発現を
可能にする遺伝子エレメントを少なくとも一つ含む単離
核酸を包含する。いずれのチューブリン遺伝子も、調節
エレメント、特に３つの類似のα−チューブリン遺伝子
を表すトウモロコシ遺伝子α−Ｔｕｂ １、α−Ｔｕｂ
２及びα−Ｔｕｂ ３を単独で又は組合わせて形成す
ることができる。好ましくは、トウモロコシα−チュー
ブリン遺伝子α−Ｔｕｂ １を調節エレメント源として
使用する。
【００１０】本発明の調節エレメントの一つは、根にお
ける特異的遺伝子発現を制御する。根に特異的なある調
節エレメントは、根内で自己の制御下にある遺伝子の発
現を開始させることができる特定のヌクレオチド配列、
即ち、根で検出される前記遺伝子の発現産物に関するヌ
クレオチド配列を含む。根に特異的な発現は、根のあら
ゆる部分、非限定的具体例として例えば、根の分裂組織
ゾーン、根の側芽、側根及び根の維管束ゾーンに見いだ
し得る。新芽の先端、茎又は葉には遺伝子発現は検出さ
れない。
【００１１】根に特異的な遺伝子発現を制御する調節エ
レメントを同定するためには、トウモロコシα−チュー
ブリン遺伝子からのＵＲＥ全体の欠失による分析を実施
しなければならない。欠失分析では、ＵＲＥ全体のヌク
レオチドを順次除去し、得られたフラグメントをリポー
ター遺伝子のコーディング配列か又は別の異種コーディ
ング配列に連結する。次いで該構築体を、他の組織以外
の所望の特定組織のみにおける異種遺伝子の産物の存在
を検出することにより、前記組織に特異的な遺伝子発現
を制御する能力について分析する。同定した組織特異的
エレメントは、例えば部位特異的突然変異誘発によって
修飾することもできる。修飾した調節エレメントは次い
で、組織内の特異的遺伝子発現を制御する能力について
検査し得、それによって組織特異性を付与する別の配列
を同定し得る。調節エレメントを同定するためのこれら
の技術は、総てのトウモロコシα−チューブリン遺伝子
に適用できる。例えば、好ましい具体例として、トウモ
ロコシα−チューブリン遺伝子α−Ｔｕｂ １のＵＲＥ
を分析すると、根に特異的な遺伝子発現を制御する調節
エレメントは配列ＩＤ Ｎｏ．：１のヌクレオチド９６
３〜１１１５及び１〜１１１５からなることがわかる。
【００１２】本発明の別の調節エレメントは、花粉に特
異的な遺伝子発現を制御する。花粉に特異的な遺伝子発
現は特に有用であり重要である。トウモロコシα−チュ
ーブリン遺伝子α−Ｔｕｂ １は通常は根及び花粉の両
方で発現される。本発明に従ってＵＲＥ全体からトウモ
ロコシα−チューブリン遺伝子α−Ｔｕｂ １の特定領
域を単離すると、発現は花粉のみに検出される。花粉に
特異的なある調節エレメントは、花粉内で自己の制御下
にある遺伝子の発現を開始させることができる特定のヌ
クレオチド配列、即ち、他の組織では検出されず花粉内
で検出される前記遺伝子の産物に関するヌクレオチド配
列を含む。花粉に特異的な発現を制御する調節エレメン
トは、発現が花粉内で検出されるという点を除いて、前
述の根に特異的な調節エレメントの同定と同様に、トウ
モロコシα−チューブリン遺伝子のフラグメントを、花
粉に特異的な遺伝子発現を制御する能力について分析す
ることにより同定される。花粉に特異的な発現を可能に
するヌクレオチド配列の修飾は前述のように同定され
る。あらゆるトウモロコシα−チューブリン遺伝子に由
来する花粉に特異的な調節エレメントは、これらの方法
で同定できる。例えば、好ましい具体例として、トウモ
ロコシα−チューブリン遺伝子α−Ｔｕｂ １のＵＲＥ
を分析すると、花粉に特異的な遺伝子発現を制御する調
節エレメントは配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．：１のヌクレ
オチド１〜１３４８及び１２９５〜１３４８からなるこ
とがわかる。
【００１３】トウモロコシα−チューブリン遺伝子のＵ
ＲＥ領域に存在する本発明の別の調節エレメントは、分
裂組織に特異的な遺伝子発現を制御する。分裂組織に特
異的な遺伝子発現を付与する調節エレメントは、他の調
節エレメントの同定に関して説明したように同定され
る。例えば、欠失分析を使用して、分裂組織内で自己の
制御下にある遺伝子の発現を制御するあらゆるトウモロ
コシα−チューブリン遺伝子のヌクレオチド配列を同定
することができる。このような配列は、分裂組織に特異
的な遺伝子発現を付与する別の配列を同定するために、
前述のように修飾し、検査し得る。例えば、好ましい具
体例として、トウモロコシα−チューブリン遺伝子α−
Ｔｕｂ ３のＵＲＥを分析すると、花粉に特異的な遺伝
子発現を制御する調節エレメントは配列ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．：３のヌクレオチド１〜６９５及び５４２〜６９
５からなることがわかる。
【００１４】トウモロコシα−チューブリン遺伝子のＵ
ＲＥ領域に存在する本発明の別の調節エレメントは、未
成熟胚に特異的な遺伝子発現を制御する。未成熟胚に特
異的な遺伝子発現を与える調節エレメントは、他の調節
エレメントに関して説明したように同定される。例え
ば、欠失分析を使用して、未成熟胚内で自己の制御下に
ある遺伝子の発現を制御するあらゆるトウモロコシα−
チューブリン遺伝子のヌクレオチド配列を同定すること
ができる。このような配列は、未成熟胚に特異的な遺伝
子発現を与える別の配列を同定するために、前述のよう
に修飾し、検査し得る。例えば、好ましい具体例とし
て、トウモロコシα−チューブリン遺伝子α−Ｔｕｂ
３のＵＲＥを分析すると、未成熟胚に特異的な遺伝子発
現を制御する調節エレメントは配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ．：３のヌクレオチド１〜１０７６からなることがわ
かる。
【００１５】トウモロコシα−チューブリン遺伝子の上
流調節アセンブリをコードする単離核酸は次の方法で得
ることができる。α−チューブリンｃＤＮＡでのトウモ
ロコシゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニングによ
り、α−チューブリン組換えゲノムクローンを単離する
（Ｍｏｎｔｏｌｉｕら，１９８９）。α−チューブリン
組換えＤＮＡを得るための有用な方法は、例えばＡｕｓ
ｕｂｅｌら，１９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃ
ｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，
Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹに記述され
ており、又は一般的に入手可能な組換えＤＮＡ技術に関
する極めて多数のマニュアルのいずれかに記述されてい
る。ヌクレオチド配列の決定については多くの方法が使
用可能であり且つ当業者に知られている。例えば、α−
チューブリン遺伝子のＵＲＥを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のような配列決定ベクター
のポリリンカー部位にサブクローニングし得る。次い
で、これらのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔサブクローンを
「二本鎖ジデオキシ（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｄ
ｉｄｅｏｘｙ）」法により配列決定し得る（Ｃｈｅｎ及
びＳｅｅｂｕｒｇ，１９８５，ＤＮＡ ４，１６５）。
【００１６】トウモロコシα−チューブリン遺伝子のＵ
ＲＥのα−Ｔｕｂ １クローンをコードするＤＮＡのヌ
クレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．：１で表す。
【００１７】トウモロコシα−チューブリン遺伝子のＵ
ＲＥのα−Ｔｕｂ ２クローンをコードするＤＮＡのヌ
クレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．：２で表す。
【００１８】トウモロコシα−チューブリン遺伝子のＵ
ＲＥのα−Ｔｕｂ ３クローンをコードするＤＮＡのヌ
クレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．：３で表す。
【００１９】最適化トランジットペプチドのヌクレオチ
ド配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．：４で表す。
【００２０】他のα−チューブリン遺伝子のＵＲＥも同
じ手法で得ることができる。また、トウモロコシゲノム
ＤＮＡライブラリーをスクリーニングし別のα−チュー
ブリン遺伝子を同定するために、α−Ｔｕｂ １、α−
Ｔｕｂ ２及びα−Ｔｕｂ３のＵＲＥの転写配列をハイ
ブリダイゼーションプローブとして使用することによ
り、トウモロコシα−チューブリン遺伝子ファミリーの
別のメンバーを表すクローンを得ることもできる。
【００２１】組織内の特異的遺伝子発現を制御するシス
調節配列の同定は、特定配列を異種遺伝子のコーディン
グ配列と転写融合し、該キメラ遺伝子を適当な宿主内に
転移し、異種遺伝子の発現を検出することによって実施
し得る。発現の検出に使用する検査は、異種配列の種類
に応じて決定する。例えば、リポーター遺伝子、例えば
β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）のリポーター遺伝子
は、キメラ構築体の転写及び翻訳受容能を確立するため
に一般的に使用されている。トランスジェニック生体内
のリポーター酵素を敏感に検出するためには標準的な検
査が使用可能である。ＧＵＳ遺伝子は、トランスジェニ
ック植物におけるプロモーター活性のリポーターとして
有用である。なぜなら、該酵素は植物細胞内で大きな安
定性を示し、蛍光定量検査及び組織化学的位置検出技術
（ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉ
ｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）が使用可能だからである。
Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら，１９８７ ＥＭＢＯ Ｊ ６，
３９０１は、植物組織におけるＧＵＳ活性の生化学的及
び組織化学的検出のための標準的手順を開発した。生化
学的検査は、植物組織溶解物を、ＧＵＳ用の蛍光定量法
基質である４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グル
クロニドと混合し、次いで３７℃で１時間インキュベー
トし、その後４−メチルウンベリフェロンの蛍光を測定
することによって実施する。ＧＵＳ活性の組織化学的位
置検出は、植物組織試料を５−ブロモ−４−クロロ−３
−インドリル−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）中で３７
℃で１８時間インキュベートし、Ｘ−Ｇｌｕｃスポット
のパターンを観察することにより実施する。このような
キメラ遺伝子の構築は、発現の調節に必要な特定調節配
列の決定を可能にし、且つ分析によって、これらの配列
が異種遺伝子の発現を制御し得ることを明らかにする。
【００２２】本発明は、根における特異的遺伝子発現、
花粉内での特異的遺伝子発現、分裂組織内での特異的遺
伝子発現又は未成熟胚内での特異的遺伝子発現を制御
し、異種遺伝子を制御することができるように異種遺伝
子のコーディング配列に結合されているトウモロコシα
−チューブリン遺伝子由来の調節エレメントを含む植物
キメラ遺伝子も包含する。異種遺伝子は、トウモロコシ
α−チューブリン遺伝子以外の任意の遺伝子であってよ
い。必要であれば、該キメラ構築体に、別のプロモータ
ーエレメント、例えば単子葉植物のイントロンを、その
発現が、異種遺伝子でコードされ、任意の有用な作物特
性、例えば昆虫、線虫、真菌及び好ましくは除草剤に対
する耐性を付与するポリペプチドを有効量産生するのに
十分なだけ、全面的又は部分的に含ませ得る。
【００２３】従って本発明は、除草剤耐性酵素をコード
する配列に結合されている、本発明の根に特異的な発現
を付与する、トウモロコシα−チューブリンのＵＲＥの
領域を含むキメラ遺伝子を包含する。前記ＵＲＥ領域
は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．：１に示されているようなα
−Ｔｕｂ １のヌクレオチド１〜１１１５、９６３〜１
１１５又は１〜１５２９を含むのが好ましい。根に特異
的な発現を与えるヌクレオチドの修飾はいずれも本発明
の一部分を構成する。根はある種の除草剤類を蓄積し、
これらの除草剤はその少量施用に対して根を極めて敏感
にする。トウモロコシα−チューブリンのＵＲＥのエレ
メントは根における高度の調節された発現を制御するこ
とができるため、耐性表現型を与える上で有用である。
これらのエレメントは、除草剤耐性酵素をコードする遺
伝子、例えばＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ由来のａｒｏ
Ａ、及び除草剤を解毒する酵素をコードする遺伝子、例
えばブロモキシニルに耐性のＫ．ｏｚａｅｎａｅ由来の
ｂｒｘ遺伝子の発現を調節するのに有用である。これら
のエレメントを含有するキメラ遺伝子は、耕種学の量の
除草剤に対して耐性を示すトランスジェニック植物系の
製造に使用し得る。
【００２４】本発明は、花粉に特異的な発現を与えるト
ウモロコシα−チューブリンのＵＲＥの領域を有し、異
種遺伝子と融合されたキメラ遺伝子も包含する。該構築
体は、異種遺伝子が植物花粉内で直接発現されるという
点で、トウモロコシα−チューブリンの「正規の（ｎｏ
ｒｍａｌ）」発現とは空間的に異なる発現を与える。換
言すれば、ＵＲＥの内容から特定の配列を除去すると、
組織の特異的調節が修飾される。α−Ｔｕｂ １のＵＲ
Ｅ領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．：１に示されているよ
うなヌクレオチド１〜１３４８又は２９５〜１３４８を
含むのが好ましい。該調節エレメントは、好ましくは、
不稔性（ｓｔｅｒｉｌｅ）オス植物を作るために細胞毒
性タンパク質と融合させ得る。花粉に特異的な発現を与
えるヌクレオチドの修飾はいずれも本発明の一部分を構
成する。
【００２５】本発明は、分裂組織に特異的な発現を与え
るトウモロコシα−チューブリンのＵＲＥの領域を有
し、異種遺伝子と融合されたキメラ遺伝子も包含する。
α−Ｔｕｂ ３のＵＲＥ領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ．：３に示されているようなヌクレオチド１〜６９５
又は５４２〜６９５を含む。分裂組織に特異的な発現を
与えるヌクレオチドの修飾はいずれも本発明の一部分を
構成する。
【００２６】本発明は、未成熟胚に特異的な発現を与え
るトウモロコシα−チューブリンのＵＲＥの領域を有
し、異種遺伝子と融合されたキメラ遺伝子も包含する。
α−Ｔｕｂ ３のＵＲＥ領域は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ．：３に示されているようなヌクレオチド１〜１０７
６を含むのが好ましい。未成熟胚に特異的な発現を与え
るヌクレオチドの修飾はいずれも本発明の一部分を構成
する。
【００２７】前述のキメラ構築体の使用は、除草剤耐性
を与える上で特に重要である。大部分の除草剤は雑草と
作物とを判別しないため、除草剤に対して耐性の作物の
遺伝子工学は、広範囲の除草剤の使用を可能にするとい
う点で、農業的にかなりの重要性を有する。従って本発
明は、植物内で機能し且つａｒｏＡ遺伝子の少なくとも
一部分か又は除草剤耐性を与えるポリペプチドをコード
する配列と融合したプロモーターの少なくとも一部分に
根に特異的な発現を与えるトウモロコシα−チューブリ
ンのＵＲＥのエレメントを含むキメラ遺伝子を包含す
る。具体例としては、グリホセートと、５−エノールピ
ルビルシキミ酸−３−ホスファートシンターゼ（ＥＰＳ
ＰＳ）に近い阻害剤、スルホニルウレア、イミダゾリノ
ンと、アセトキシヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＳ）阻
害剤及び４−ヒドロキシフェニルピルベートジオキシゲ
ナーゼ（ＨＰＰＯ）阻害剤とに対する耐性を与えるポリ
ペプチドが挙げられる。好ましくは、α−Ｔｕｂ １の
ＵＲＥ領域は、ＳＥＱ ＩＤＮｏ．：１に示されている
ようなヌクレオチド１〜１１１５、９６３〜１１１５又
は１〜１５２９を含み、リポーター遺伝子に融合されて
いる。未成熟胚に特異的な発現を与えるヌクレオチドの
修飾はいずれも本発明の一部分を構成する。
【００２８】本発明のキメラ遺伝子は、トウモロコシα
−チューブリンのプロモーター配列を部分的又は全体的
に、異種遺伝子のコーディング配列と融合させることに
より構築する。これらの配列の並置は多くの方法で実施
し得る。５’から３’までの配列の順序は次のようにす
るのが好ましい：トウモロコシα−チューブリンのＵＲ
Ｅ、単子葉植物又は双子葉植物、例えばタバコのイント
ロン配列、コーディング配列及びポリアデニル化部位。
【００２９】このようなキメラ遺伝子の一般的な構築方
法は当業者には良く知られており、Ａｕｓｕｂｅｌら
（１９８９）等の文献に記述されている。ＤＮＡフラグ
メントを連結するためには様々な方法を使用し得、その
選択は、ＤＮＡフラグメントの末端の性質に依存する。
当業者には公知のように、異種遺伝子が発現できるため
には、該構築体は転写体の効果的なポリアデニル化のた
めのプロモーターエレメント及びシグナルを必要とす
る。その結果、ＣＡＡＴ及びＴＡＴＡボックスとして知
られているプロモーター配列を含むトウモロコシα−チ
ューブリンのＵＲＥ領域は、プロモーターを用いずにコ
ーディング配列と直接融合できる。また、ＣＡＡＴ及び
ＴＡＴＡボックスを含まないトウモロコシα−チューブ
リンのＵＲＥ領域は、植物内で機能するプロモーターを
コードするＤＮＡフラグメントに結合できる。植物プロ
モーターは市販のものを入手するか、又は公開された配
列を参考にして化学的に合成し得る。この種のフラグメ
ントの具体例としては、ＣＡＡＴ及びＴＡＴＡボックス
を保持しているカリフラワーモザイクウイルスの部分欠
失（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）３５Ｓプロモーターが挙げら
れる。別のプロモーター、例えばノパリンシンターゼ及
びリブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼのプ
ロモーターを使用することも可能である。次いでプロモ
ーターフラグメントを異種コーディング配列に結合す
る。コーディング配列の３’末端は、ポリアデニル化部
位、非限定的具体例として例えばノパリンシンターゼの
ポリアデニル化部位と融合する。また、植物の形質転換
に必要な配列で包囲された一つ以上のポリアデニル化部
位を含む植物形質転換ベクターを使用することも可能で
ある。
【００３０】本発明のトウモロコシα−チューブリンＵ
ＲＥエレメント及び異種コーディング配列は、キメラ遺
伝子を得るために、植物形質転換ベクターのポリリンカ
ー部位中にサブクローンし得る。
【００３１】本発明の５’エレメントは、制限及びエン
ドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼでのトウモロコ
シα−チューブリンゲノムクローンの消化によって誘導
し得る。ＣＡＡＴ及びＴＡＴＡボックスを含む制限フラ
グメントは、ＧＵＳ又はａｒｏＡのコーディング配列の
ようなプロモーターを用いずに異種遺伝子に連結する。
当業者には公知のように、トウモロコシα−チューブリ
ンの５’調節エレメントは、別の方法、例えば化学的又
は酵素的（ＰＣＲ）合成によって得ることができる。異
種産物は、この種の構築体内で発現され得る任意の遺伝
子のコーディング配列であり得る。これらの具体例はい
ずれも本発明の一部分を構成する。コーディング配列の
３’末端は任意に、ポリアデニル化部位、非限定的具体
例として例えば、ノパリンシンターゼのポリアデニル化
部位、オクトピンＴ−ＤＮＡの遺伝子７のポリアデニル
化部位、又はＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓヒストン遺伝子の
遺伝子Ｈ４Ａ７４８のポリアデニル化部位と融合する。
また、ポリアデニル化部位は異種遺伝子自体によって与
えられることもある。
【００３２】ＴＡＴＡボックスを含まないトウモロコシ
α−チューブリンの５’調節エレメントは、植物プロモ
ーター配列の少なくとも一部分、即ち少なくともＣＡＡ
Ｔ及びＴＡＴＡ配列を含む部分に結合し得る。該プロモ
ーターは、好ましくは、カリフラワーモザイクウイルス
の部分欠失３５Ｓプロモーターである。得られたキメラ
複合体は、異種コーディング配列及びポリアデニル化配
列に連結し得る。
【００３３】異種遺伝子の調節された発現を得るために
は、植物を本発明のキメラ遺伝子で形質転換する。遺伝
子の移入（ｔｒａｎｓｆｅｒ）は、当業界では、トラン
スジェニック植物内で異種遺伝子を発現させるための方
法として良く知られている。タバコは最も頻繁に使用さ
れる植物である。なぜなら、再生が容易であり、植物当
たりの種子の収率が高く、且つ腫瘍菌（Ａｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ）Ｔｉプラスミド由来のベクターで高頻度
で形質転換できるからである（Ｋｌｅｅら，（１９８
７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．
３８，４６７）。非限定的具体例として例えばワタ、セ
イヨウアブラナ及びダイズといったような双子葉植物は
好ましいトランスジェニック宿主である。しかしなが
ら、当業者は本発明に従って任意の植物を効果的に形質
転換し、トランスジェニック宿主として再生し得る。
【００３４】形質転換の方法は多数知られている。キメ
ラ遺伝子は、Ｈｏｒｓｃｈら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２７ ７，１２２９に記載のような葉盤（ｆｏｌｉａ
ｒｄｉｓｃ）上での形質転換及び再生プロセスによって
導入し得る。別の形質転換方法、例えば原形質体培養
（Ｈｏｒｓｃｈら（１９８４）Ｓｃ ｉｅｎｃｅ ２２
３，４９６、ＤｅＢｌｏｃｋら（１９８４）Ｅ ＭＢＯ
Ｊ ２，２１４３、Ｂａｒｔｏｎら（１９８３）Ｃｅｌ
ｌ ３２，１０３３）、又は茎もしくは根の外植体のｉ
ｎ ｖｉｔｒｏ形質転換（Ｚａｍｂｒｉｓｋｙら（１９
８３）ＥＭＢＯＪ ２，２１４３、Ｂａｒｔｏｎら（１
９８３）Ｃｅｌｌ ３２，１０３３）も本発明の範囲内
で使用できる。好ましくは、腫瘍菌由来のベクターで植
物を形質転換する。しかしながら、本発明のキメラ遺伝
子を植物細胞内に挿入するためには別の方法も使用し得
る。これらの方法としては例えば、バイオリスティック
（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）よる方法（Ｋｌｅｉｎら（１９
８３）Ｎａ ｔｕｒｅ ３２７ ７０）、電気穿孔法、化
学的誘導によるＤＮＡの吸収、及びウイルスもしくは花
粉をベクターとして使用する方法が挙げられる。
【００３５】形質転換方法に必要であれば、本発明のキ
メラ遺伝子は、植物形質転換ベクター、例えばＢｅｖａ
ｎ（１９８４）又は欧州特許出願第３３７ ８９９号に
記載の別の方法によって記述されている二成分（ｂｉｎ
ａｒｙ）ベクター内に導入することもできる。植物形質
転換ベクターは、天然のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔ
ｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ遺伝子移入系の修飾によって誘導
し得る。該天然の系は、Ｔ−ＤＮＡと称する大セグメン
トを含む大きなＴｉ（Ｔｕｍｏｕｒ ｉｎｄｕｃｉｎ
ｇ、腫瘍誘発）プラスミドを含む。該プラスミドは形質
転換植物に移入される。Ｔｉプラスミドの別のセグメン
トであるｖｉｒ領域は、Ｔ−ＤＮＡの移入に関与する。
Ｔ−ＤＮＡは末端反復体（ｔｅｒｍｉａｌ ｒｅｐｅａ
ｔ）に包囲されている。修飾二成分ベクターでは、腫瘍
を誘発する遺伝子が欠失しており、ｖｉｒ領域の機能
が、Ｔ−ＤＮＡ境界配列で境界が定められた外来ＤＮＡ
の移入に使用される。Ｔ領域はまた、抗生物質に対する
耐性のための選択可能マーカーと、移入すべき配列の挿
入のための複数のクローニング部位とを含む。これらの
遺伝子工学株は「無害化（ｄｉｓａｒｍｅｄ）」Ａｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓとして知
られており、植物核ゲノム内のＴ領域によって境界を定
められた配列の効果的な形質転換を可能にする。
【００３６】表面不稔化（ｓｕｒｆａｃｅ−ｓｔｅｒｉ
ｌｉｚｅｄ）葉盤を、外来ＤＮＡを含むＡｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓと共にインキュ
ベートし、２日間培養し、次いで抗生物質含有培地中に
移入する。適当な抗生物質を含有する培地中で根付かせ
た後、形質転換新芽を選択し、土に移す。該トランスジ
ェニック植物を自己受粉させ、これらの植物の種子を回
収し、抗生物質含有培地で培養する。
【００３７】根、新芽、花粉、分裂組織及び未成熟胚に
おけるリポーター又は異種遺伝子の発現は、免疫学的も
しくは組織化学的検査、又は活性検査によってモニター
し得る。
【００３８】後述のように、キメラ遺伝子の発現の検査
は異種コーディング領域の性質に応じて選択する。例え
ば、適当なヌクレオチドプローブがあれば、ノーザン
（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ）分析を用いて転写をモニターする
ことができる。異種遺伝子でコードされたポリペプチド
の抗体があれば、ウエスタン分析及び免疫−組織化学的
検出を使用してポリペプチドの産生及び位置をモニター
し得る。異種遺伝子によっては、生化学的検査も使用で
きる。例えば、アセチルトランスフェラーゼは標準的基
質のアセチル化の測定によって検出する。除草剤耐性遺
伝子の発現は、形質転換植物の除草剤耐性の測定によっ
てモニターし得る。
【００３９】本発明は、本発明のキメラ遺伝子を含む単
子葉及び双子葉トランスジェニック植物並びにその子孫
も包含する。植物細胞は前述の任意の植物形質転換方法
によりキメラ遺伝子で形質転換する。通常はカルス又は
葉盤培養状態にある形質転換植物細胞は、当業者に良く
知られている方法（例えばＨｏｒｓｃｈら（１９８５）
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２７，１１２９）で完全なトランス
ジェニック植物に再生される。トランスジェニック植物
は、好ましくは、ワタ、セイヨウアブラナ、トウモロコ
シ、タバコ又はダイズである。形質転換植物の子孫はキ
メラ遺伝子を伝達するため、形質転換植物に由来する種
子又は外植体はトランスジェニック植物系の維持に使用
される。
【００４０】本発明は、改善された除草剤耐性を有する
植物の製造方法も包含する。該方法は、根又は分裂組織
に特異的であり且つ除草剤耐性酵素又は除草剤分解酵素
のコーディング配列に結合している調節エレメントを含
むキメラ遺伝子を有するベクターで植物細胞を形質転換
し、所望の特性を有する植物を選択することからなる。
前記エレメントは、好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ．：１に示されているようなヌクレオチド１〜１１１
５、９６３〜１１１５又は１〜１５２９からなるα−Ｔ
ｕｂ １のＵＲＥの領域である。形質転換植物は除草剤
の施用に対して耐性を示す植物に再生される。
【００４１】本発明は、不稔性オス植物の製造方法も包
含する。該方法は、花粉に特異的であり且つ細胞毒性タ
ンパク質のコーディング配列に結合している調節エレメ
ントを含むキメラ遺伝子を有するベクターで植物細胞を
形質転換し、所望の特性を有する植物を選択することか
らなる。前記エレメントは、好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．：１に示されているようなヌクレオチド１〜１
３４８又は１２９５〜１３４８からなるα−Ｔｕｂ １
のＵＲＥの領域である。形質転換植物は不稔性オス植物
に再生される。
【００４２】本発明は、除草剤に対して耐性を示す植物
の製造方法も包含する。該方法は、根に特異的であり且
つＮ−ホスホノメチルグリシンのような除草剤に対して
耐性の遺伝子のコーディング配列に結合している調節エ
レメントを含むキメラ遺伝子を有するベクターで植物細
胞を形質転換し、所望の除草剤耐性を有する植物を選択
することからなる。選択した植物は、同一種の非形質転
換植物を同一条件下で死滅させる除草剤処理後に生存し
ている植物である。前記エレメントは、好ましくは、Ｓ
ＥＱ ＩＤ Ｎｏ．：１に示されているようなヌクレオ
チド１〜１１１５、９６３〜１１１５又は１〜１５２９
からなるα−Ｔｕｂ １のＵＲＥ領域であり、異種配列
は、ＥＰＳＰＳシンターゼ、アセトラクターゼシンター
ゼ又は４−ヒドロキシフェニルピルベートジオキシゲナ
ーゼをコードするか、又は耐性を与える突然変異を有す
る遺伝子によって供給される。形質転換植物は除草剤に
対して耐性を示す植物に再生される。好ましくは、α−
Ｔｕｂ １のＵＲＥのヌクレオチド７０〜１５２９を含
む根に特異的な調節エレメントと、単子葉植物イントロ
ン（ｐＲＰＡ−ＲＤ−８８のみ）と、最適化トランジッ
トペプチドと、除草剤耐性遺伝子ａｒｏＡとを含むベク
ターｐＲＰＡ−ＲＤ−６５又はｐＲＰＡ−ＲＤ−８８で
植物を形質転換する。
【００４３】
【実施例】以下の実施例は本発明をより詳細に説明する
ためのものである。
【００４４】これらの実施例で言及されているヌクレオ
チド配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．：１〜４の番号で示
される。
【００４５】実施例１ ａ）ＧＵＳリポーター遺伝 子を含む構築体 該実施例で使用するＧＵＳリポーター遺伝子の一般的用
途のためのカセットは、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら，１９８
７ ＥＭＢＯ Ｊ ６，３９０１に記載されている。要
約すれば、ＧＵＳのコーディング配列を、Ａ．ｔｕｍｅ
ｆａｃｉｅｎｓ由来ベクターｐＢＩＮ１９のポリリンカ
ー部位でノパリンシンターゼのポリアデニル化部位の
５’部分に連結した（Ｂｅｖａｎ（１９８４）Ｎｕｃｌ
ｅｉｃｓＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２，８７１１）。ベク
ターｐＢＩＮ１９は植物の形質転換に必要なＴ−ＤＮＡ
の左方及び右方境界と、カナマイシン耐性遺伝子とを含
む。得られた構築体ｐＢＩ１０１．１を図１に示す。Ｇ
ＵＳの開始コドンＡＵＧの上流の制限部位のみがプロモ
ーターＤＮＡフラグメントの挿入を許す。
【００４６】表１は、親プラスミドと形成された構築体
とを示している。トウモロコシα−Ｔｕｂ １と、形成
された構築体に含まれているプロモーターエレメントの
位置とを図２に示す。
【００４７】構築体ｐα−Ｔｕｂ １−ＧＵＳは、調節
領域（図２の−１４１０〜４８）の全長にわたる大きな
重複フラグメントを表す。幾つかの構築体の５’末端
は、ｐ．ＢＩ１０１．１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）［−
４４９（ＳｐｃＩ−ＳａｃＩＩ）、表１］内のα−Ｔｕ
ｂ １の４９７ｂｐフラグメントをエキソヌクレアーゼ
ＩＩＩで消化することによって得た。各欠失の位置は図
２に示す。
【００４８】ｂ）植物の形質転換 ｐＢＩＮ１９をベースとするプラスミド構築体を用い
て、標準的手順で（Ｈｏｒｓｃｈら（１９８５））、但
し初期形質転換体を１００μｇ／ｍｌカナマイシンで選
択して、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉｎｉａ ｔａｂａｃｕｍ
ｃｖ ｐｅｔｉｔｅ Ｈａｖａｎａ ＳＲ１）を形質
転換した。
【００４９】植物を自己受粉させ、形質転換体を同定す
るためにＦ１葉鞘（ｓｈｅａｔｈ）を２００ｇ／ｍｌカ
ナマイシンで生長させた。ｐＢＩＮ１９をベースとする
構築体は、毒性カナマイシン抗生物質に対する耐性を与
えるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴＩ
Ｉ）の遺伝子を含んでいるからである。カナマイシン耐
性のセグリゲーション頻度（ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ
ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）を分析することにより、タバコゲ
ノムに組み込まれた各ＧＵＳ構築体のコピー数を各形質
転換体毎に調べた。大部分の形質転換体は構築体から分
離する遺伝子座を一つだけ含んでいた。トランスジェニ
ック植物は温室で生長させた。
【００５０】
【表１】 表 Ｉ構築体 説明 親プラスミド ｐＢＩ１０１．１ プロモーターのない、ＧＵＳリポーター遺伝子由来 の遺伝子のｐＢＩＮ−１９カセット（Ｊｅｆｆｅｒ ｓｏｎら，１９８７）（図１参照）。
【００５１】 ｐＲＰＡ−ＢＬ−５０４ クロラムフェニコルアセチルトランスフェラーゼ の遺伝子がＧＵＳ遺伝子にとってかわっている以外 はｐＢＩ１０１．１に類似している。
【００５２】 ｐαＴｕｂ １ ｐＵＣ−１８にクローニングしたＭＧ１９／６由来 の３０５８ｂｐのＸｈｏＩフラグメント（Ｍｏｎｔ ｏｌｉｕら，１９８９）。トウモロコシα−Ｔｕｂ １の上流調節アセンブリ全体を含む。
【００５３】 ｐαＴｕｂ １−１５８８ ｐＵＣ−１８にクローニングしたトウモロコシα− Ｔｕｂ １由来の１５８８ｂｐのＸｈｏＩ−Ａｌｕ Ｉフラグメント（Ｍｏｎｔｏｌｉｕら，１９８９） 。転写開始部位の上流の１４１０ｂｐと下流の１８ ０ｂｐとを含む。
【００５４】 ｐαＴｕｂ ３−１０７２ ｐＵＣ−１８のＢａｍＨＩ部位にクローニングした トウモロコシα−Ｔｕｂ ３由来の１０７２ｂｐの ＢｇｌＩＩフラグメント（Ｍｏｎｔｏｌｉｕら，１ ９９０）。転写開始部位の上流の１０２０ｂｐと下 流の６２ｂｐとを含む。
【００５５】 ｐＲＰＡ−ＲＤ−３７Ｂ フレーム内で融合した最適化トランジットペプチド （欧州特許第５０８ ９０９号）と、ａｒｏＡ遺伝 子と、ｐＢＳ ＩＩ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇ ｅｎｅ）にクローニングしたＮＯＳポリアデニル化 シグナルとを含むａｒｏＡ発現カセット。
【００５６】 ｐＲＰＡ−ＲＤ−４９ ３５Ｓ ＣａＭＶプロモーターと、ｂａｒ遺伝子と 、ｐＵＣ−１８のＨｉｎｄＩＩＩ部位とＥｃｏＲＩ 位との間にクローニングしたＴＲ７ポリアデニル化 シグナルとを含む単子葉植物形質転換ベクター。二 つのＡｆｌＩＩＩ部位とＳｓＰＩ部位との間のブラ ントエンドにＮｏｔＩリンカーを連結して、遺伝子 構築体３５Ｓ ＣａＭＶ−ｂａｒを含む３．１ｋｂ のＮｏｔＩフラグメントを形成した。
【００５７】 ｐＲＰＡ−ＲＤ−２６ ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｃＩＩ消化したｐＵＣ−１９に クローニングしたｐα−Ｔｕｂ １由来の１８６５ ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＳｃａＩフラグメント。５’→ ３’Ｃ ＧＧＣ ＣＧＣ ＣＧＣ ＴＣＣ ＡＣＣ ＣＧＴ ＡＣＧ ＡＣＧ ＡＣＣ ＡＣＣ ＡＴ Ｇ ＧＧＧ ＧＡＧを用いて、翻訳開始ＡＴＧを包 囲する配列を、ＮｃｏＩ部位を含むようにＰＣＲで 突然変異にかけた。
【００５８】 ｐＲＰＡ−ＲＤ−３２ トウモロコシ遺伝子α−Ｔｕｂ １由来のヌクレオ チド−１３４０〜１１８（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１ のヌクレオチド７１〜１５２７）からなるｐＲＰＡ −ＲＤ−２６の１４５８ｂｐのＰｓｔＩ−ＮｃｏＩ フラグメントを、ｐＲＰＡ−ＲＤ−３７ＢのＰｓｔ Ｉ−ＮｃｏＩ部位に連結して、トウモロコシα−Ｔ ｕｂ １−ＯＴＰ−ａｒｏＡ遺伝子−ＮＯＳという 発現カセットを形成した。
【００５９】 ｐＲＰＡ−ＲＤ−８７ トウモロコシａｄｈＩイントロン １を含む６００ ｂｐのＮｃｏＩ−ＰｓｔＩフラグメントをｐＲＰＡ −ＲＤ−３７ＢのＮｃｏＩ−ＰｓｔＩ部位にクロー ニングして、次の発現カセットを形成した：トウモ ロコシａｄｈＩイントロン １−最適化トランジッ トペプチド（欧州特許第５０８ ９０９号）、ａｒ ｏＡ遺伝子及びＮＯＳポリアデニル化シグナル。
【００６０】 ｐＲＰＡ−ＲＤ−９０ ｐＢＳ ＩＩ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ）のＳｍａＩ部位にクローニングした大腸菌ＤＮＡ のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントに よりブラントエンドで切断したｐＲＰＡ−ＲＤ−３ ２由来の１４３０ｂｐのＥａｇＩフラグメント（ト ウロコシ遺伝子α−Ｔｕｂ １のヌクレオチド−１ ３４０〜９０、即ちＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１の配列 ７１〜１４９９を含む）。
【００６１】形成された構築体 −１４１０ ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｍａＩ消化ｐＢＩ１０１．１に クローニングしたｐαＴｕｂ １−１５８８由来の １４７４ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩＩフラグ メント。転写開始部位の上流の１４１０ｂｐと下流 の４８ｂｐとを含む。
【００６２】 α−Ｔｕｂ ３−１０２０ ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｍａＩ消化ｐＢＩ１０１．１に クローニングしたｐαＴｕｂ ３−１０７２由来の １１１５ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｍａＩフラグメ ント。転写開始部位の上流の１０２０ｂｐと下流の ６２ｂｐとを含む（図２参照）。
【００６３】 −９５６ ｂａｍＨＩ消化と再循環とによって形成した−１４ １０誘導体。転写開始部位の上流の９５６ｂｐと下 流の４８ｂｐとを含む。
【００６４】 −４４９ ＳｐｅＩ消化と再循環とによって形成した−１４１ ０誘導体。転写開始部位の上流の４４９ｂｐと下流 の４８ｂｐとを含む。
【００６５】 −３５２ エキソヌクレアーゼＩＩＩ消化と再循環とによって 形成した−４４９誘導体（ｐＢＩ１０１．１内）。 転写開始部位の上流の３５２ｂｐと下流の４８ｂｐ とを含む。
【００６６】 −２９７ エキソヌクレアーゼＩＩＩ消化と再循環とによって 形成した−４４９誘導体（ｐＢＩ１０１．１内）。 転写開始部位の上流の２９７ｂｐと下流の４８ｂｐ とを含む。
【００６７】 −２５２ エキソヌクレアーゼＩＩＩ消化と再循環とによって 形成した−４４９誘導体（ｐＢＩ１０１．１上）。 転写開始部位の上流の２５２ｂｐと下流の４８ｂｐ とを含む。
【００６８】 −１８４ エキソヌクレアーゼＩＩＩ消化と再循環とによって 形成した−４４９誘導体（ｐＢＩ１０１．１内）。 転写開始部位の上流の１８４ｂｐと下流の４８ｂｐ とを含む。
【００６９】 −１１７ エキソヌクレアーゼＩＩＩ消化と再循環とによって 形成した−４４９誘導体（ｐＢＩ１０１．１内）。 転写開始部位の上流の１１７ｂｐと下流の４８ｂｐ とを含む。
【００７０】 −６４ エキソヌクレアーゼＩＩＩ消化と再循環とによって 形成した−４４９誘導体（ｐＢＩ１０１．１内）。 転写開始部位の上流の６４ｂｐと下流の４８ｂｐと を含む。
【００７１】 ｐＲＰＡ−ＲＤ−５３ ｐＢＩＮ−１９のＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ部位にクロ ーニングしたｐＲＰＡ−ＲＤ−３２由来のトウモロ コシα−Ｔｕｂ １−ａｒｏＡという発現カセット を含む３．５ｋｂのＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩフラグメ ント。
【００７２】 ｐＲＰＡ−ＲＤ−６５ 大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメント によりブラントエンドで切断したｐＲＰＡ−ＲＤ− ４９のＮｄｅＩ部位にクローニングしたＴ４ ＤＮ ＡポリメラーゼによってブラントエンドにしたｐＲ ＰＡ−ＲＤ−３２由来のトウモロコシα−Ｔｕｂ １−ａｒｏＡという発現カセットを含む３．５ｋｂ のＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント。発現カセッ ト、ｐＲＰＡ−ＲＤ−３２由来トウモロコシα−Ｔ ｕｂ１−ａｒｏＡの方向は、ａｒｏＡ及びｂａｒ遺 伝子の転写単位に対してダイバージェントであるこ とが判明した。
【００７３】 ｐＲＰＡ−ＲＤ−８８ ｐＲＰＡ−ＲＤ−８７のＰｓｔＩ部位にクローニン グしたトウモロコシα−Ｔｕｂ １遺伝子のヌクレ オチド−１３４０〜９０（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１ の配列７１〜１４９９）を含むｐＲＰＡ−ＲＤ−９ ０由来の１．５ｋｂのＰｓｔＩフラグメント。次の 発現カセットが形成された：トウモロコシα−Ｔｕ ｂ １−トウモロコシａｄｈＩイントロン １−最 適化トランジットペプチド（欧州特許第５０８ ９ ０９号）、ａｒｏＡ遺伝子及びＮＯＳポリアデニル シグナル。
【００７４】 ｐＲＰＡ−ＲＤ−７ 次の合成オリゴヌクレオチドでＰＣＲにより突然変 異にかけた最適化トランジットペプチド（欧州特許 第５０８ ９０９号、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４）の 誘導体：（１）ＧＡＡ ＴＴＣ ＣＧＡ ＡＡＧ ＡＣＡ ＡＡＧ ＡＴＴ ＡＴＣ ＧＣＣ ＡＴＧ ＧＣＴ ＴＣＧ［ヌクレオチド１〜３６、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３］；（２）ＣＣＧ ＴＡＧ ＧＣ Ｃ ＧＧＣ ＣＡＣ ＡＣＣ ＴＧＣ ＡＴＡ Ｃ ＡＴ ＴＧＡ ＡＣＴ ＣＴＴ ＣＣ［ヌクレオチ ド２２８〜１８１、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３］；及 び（３）ＣＧＡ ＧＡＣ ＧＣＴ ＧＴＣ ＧＴＡ ＣＣＴ ＧＣＣ ＧＣＣ ＧＣＴ ＧＴＣ ＴＡ Ｔ ＧＧＣ Ｇ［ヌクレオチド２３１〜２６７、Ｓ ＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３］。この最適化トランジット ペプチドをｐＢＳＩＩ ＳＫ（−）［Ｓｔｒａｔａ ｇｅｎｅ］のＥｃｏＲＩ及びＥｃｏＲＶ部位にクロ ーニングして、最適化トランジットペプチドを含む クローニングカセットを形成した。
【００７５】実施例２：ＧＵＳ活性 の組織化学的検出；
根及び 花粉に特異的な発現 各構築体を含むトランスジェニックタバコの根、花粉及
び他の種々の組織内でＧＵＳ活性を測定し、表２に示し
た。Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら（１９８７）の一般的な手順
を使用した。
【００７６】ＧＵＳ活性は、トウモロコシα−Ｔｕｂ
１遺伝子由来のプロモーターフラグメントを用いて、キ
メラＧＵＳ遺伝子を有するトランスジェニック植物内で
組織化学的に検出した。試料を、５０ｍＭ ＮａＰ
Ｏ4、ｐＨ７と、０．２ｍＭ ５−ブロモ−４−クロロ
−３−インドリル−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）と、
０．１ｍＭフェリシアン化カリウムと、０．１ｍＭフェ
ロシアン化カリウムとの混合物中で洗浄した。該試料
を、８０％グリセロールで被覆した顕微鏡のスライド上
に配置した。
【００７７】表２は、トウモロコシα−Ｔｕｂ １遺伝
子の調節エレメントを含むタバコ植物の典型的な顕微鏡
写真の結果を要約して示している。表２は、α−Ｔｕｂ
１の調節エレメントが、分裂組織、特に根の分裂組織
及び花粉内で大きな発現レベルを与えることを立証して
いる。
【００７８】植物組織を抽出緩衝液（５０ｍＭ ＮａＰ
Ｏ4、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％サルコシル、０．
１％トリトン Ｘ−１００及び１０ｍＭ β−メルカプ
トエタノール）中で粉砕することにより、蛍光定量法で
ＧＵＳ活性を分析した。溶解物を遠心分離した後、上清
を除去して新しい管内に配置し、１００μｌのアリコー
トで加えた。抽出緩衝液中２ｍＭの４−メチルウンベリ
フェリル−γ−グルクロニドを等量加え、３７℃で１時
間インキュベートした。反応を０．８ｍｌのＮａ2ＣＯ3
（０．２Ｍ）で停止させた。４−メチルウンベリフェロ
ン（４−ＭＵ）の蛍光を、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら（１９
８７）によって記載されているようにＨｏｆｆｅｒの小
型蛍光計で測定した。ＧＵＳ活性は、４−ＭＵピコモル
／タンパク質総質量単位／分で表す。花粉に特異的な発
現に対比して、分裂組織の特異性に関与するプロモータ
ーエレメントを決定するために、プロモーターの種々の
欠失のＧＵＳ発現パターン（図２参照）をトランスジェ
ニックタバコで調べた。
【００７９】ＧＵＳの発現を指示するα−Ｔｕｂ １の
種々の配列エレメント（図２に示す）を含むトランスジ
ェニック植物に由来する根の先端、新芽の先端、葉、茎
及び花粉を活性について検査した。結果は表３に示す。
１４１０と−３５２との間（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１：
１〜１０５８）のトウモロコシα−チューブリンのα−
Ｔｕｂ遺伝子のＵＲＥの一部分を含む総ての構築体は、
トランスジェニックタバコの根内でＧＵＳ活性を与え
た。調節領域の全長及び該領域に由来するフラグメント
は総て、タバコ原形質体内で高度の活性を与えた。トラ
ンスジェニック根内でＧＵＳ活性が抑制されるのは、転
写開始部位（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１の１０５８）の上
流の３５２ｂｐより近いプロモーターエレメントの欠失
後だけである。これは、α−Ｔｕｂ １の根に特異的な
調節エレメントが−３５２ｂｐの上流（ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．１：１〜１０５８）にあることを示すものであ
る。
【００８０】−１４１０と−６４との間（ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．：１〜１０５８）のトウモロコシα−チューブ
リンのα−Ｔｕｂ遺伝子のＵＲＥの一部分を含む総ての
構築体は、トランスジェニックタバコの花粉内でＧＵＳ
活性を与えた。ＧＵＳ活性がトランスジェニック花粉内
で抑制されるのは、転写開始部位（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ．１の１３４８）の上流の６４ｂｐより近いプロモー
ターエレメントの欠失後だけである。これは、α−Ｔｕ
ｂ １の花粉に特異的な調節エレメントが、−６４ｂｐ
の上流（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１：１〜１０５８）にあ
ることを示すものである。
【００８１】
【表２】
【００８２】該表は、青い斑点を有する植物（＋）又は
有していない植物（−）の数を、分析植物全部に対比し
て、植物の種々の部分の各構築体毎に示している。
【００８３】
【表３】
【００８４】実施例３：ＧＵＳ活性 の組織化学的検出：
分裂組 織に特異的な発現 トウモロコシα−Ｔｕｂ ３遺伝子由来のプロモーター
フラグメント（ＳＥＱＩＤ Ｎｏ．３のヌクレオチド１
〜１０８２）を用いて、キメラＧＵＳ遺伝子を含むトラ
ンスジェニック植物内でＧＵＳ活性を組織化学的に検出
した。試料を、５０ｍＭ ＮａＰＯ4、ｐＨ７と０．２
ｍＭ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−グル
クロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）と０．１ｍＭ フェリシアン
化ナトリウムと０．１ｍＭ フェロシアン化カリウムと
の混合物中で洗浄した。該試料を、８０％グリセロール
で被覆した顕微鏡のスライド上に配置した。
【００８５】表４は、トウモロコシα−Ｔｕｂ ３遺伝
子の調節エレメントを含むタバコの典型的な顕微鏡写真
の結果を示している。表４は、α−Ｔｕｂ ３の調節エ
レメント（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３のヌクレオチド１〜
１０８２）が、特に分裂組織内で大きな発現レベルを与
えることを立証している。
【００８６】植物組織を抽出緩衝液（５０ｍＭ ＮａＰ
Ｏ4、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％サルコシル、０．
１％トリトン Ｘ−１００及び１０ｍＭ β−メルカプ
トエタノール）中で粉砕することにより、蛍光定量法で
ＧＵＳ活性を分析した。溶解物を遠心分離した後、上清
を除去して新しい管内に配置し、１００μｌのアリコー
トで加えた。抽出緩衝液中２ｍＭの４−メチルウンベリ
フェリル−γ−グルクロニドを等量加え、３７℃で１時
間インキュベートした。反応を０．８ｍｌのＮａ2ＣＯ3
（０．２Ｍ）で停止させた。４−メチルウンベリフェロ
ン（４−ＭＵ）の蛍光を、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら（１９
８７）によって記載されているようにＨｏｆｆｅｒの小
型蛍光計で測定した。ＧＵＳ活性は、４−ＭＵピコモル
／タンパク質総質量単位／分で表す。分裂組織に特異的
な発現に対比して分裂組織の特異性に関与するプロモー
ターエレメントを決定するために、プロモーターの種々
の欠失のＧＵＳの発現パターン（図３参照）をトランス
ジェニックタバコで調べた。
【００８７】
【表４】
【００８８】植物は、ＧＵＳリポーター遺伝子に融合し
たプロモーターフラグメント−１０２４で安定して形質
転換された。結果は、ｐｍｏｌ／ｈ×ｍｇタンパク質で
表され、独立して形質転換した４つのＦ１植物の各々の
子孫の６〜１５個の植物の平均値に対応する。
【００８９】実施例４：タバコへの 除草剤耐性の導入 親プラスミドｐＲＰＡ−ＲＤ−３２（表１参照）に由来
する３．５ｋｂのＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを
ｐＢＩＮ−１９のＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ部位にクローニ
ングした。得られた構築体はｐＲＰＡ−ＲＤ−５３と称
し、転写フレーム内に下記のエレメントを含む：トウモ
ロコシα−Ｔｕｂ １調節エレメント、最適化トランジ
ットペプチド（ＯＴＰ）、ａｒｏＡ遺伝子、ｎｏｓター
ミネーター。
【００９０】親プラスミドｐＲＰＡ−ＲＤ−５３を三親
交差（ｔｒｉｐａｒｅｎｔａｌ ｃｒｏｓｓｉｎｇ）に
より株ＥＨＡ １０５ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓにトランスファーし（Ｈｏｏｄ
ら，（１９８６）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ， １６８，１
２９１）、得られたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを用い
てタバコ葉盤上で形質転換を行った。
【００９１】温室内で、高さ約２０ｃｍの再生タバコ
に、ラウンドアップ（Ｒｏｕｎｄ Ｕｐ）形態に配合し
たグリホセートを噴霧した。健全な状態で生存している
ｐＲＰＡ−ＲＤ−５３含有形質転換植物は、グリホセー
トに対して大きな耐性を示した。
【００９２】
【表５】
【００９３】
【表６】
【００９４】
【表７】
【００９５】
【表８】
【００９６】
【表９】
【００９７】
【表１０】
【００９８】
【表１１】
【図面の簡単な説明】
【図１】親プラスミドｐ．ＢＩ１０１．１の構造を示し
ている。
【図２】キメラ構築体α−Ｔｕｂ １／ＧＵＳプロモー
ターを簡単に示している。数字は転写開始部位を基準と
している。上方の図はα−Ｔｕｂ １とα−Ｔｕｂ ２
との間の遺伝子間領域に対応し、欠失は適当な部位での
制限によって行った。下方の図は、エキソヌクレアーゼ
ＩＩＩで何回か消化することにより欠失を作ったフラグ
メント−４４９に対応する。ＳａｃＩＩ部位（＋４８）
は、プロモーターとプラスミドｐ．ＢＩ１０１．１との
間の転写融合点に対応する。（＋）はチューブリン遺伝
子α−Ｔｕｂ １の転写開始部位に対応する。
【図３】キメラ構築体α−Ｔｕｂ ３／ＧＵＳプロモー
ターを簡単に示している。数字は転写開始部位を基準と
している。欠失はエキソヌクレアーゼＩＩＩで何回か消
化することにより形成した。ＢｇｌＩＩ部位は、プロモ
ーターとプラスミドｐ．ＢＩ１０１．１のＢａｍＨＩ部
位との間の転写融合点に対応する。（＋）はチューブリ
ン遺伝子α−Ｔｕｂ ３の転写開始部位に対応する。
フロントページの続き (72)発明者 ルイ・モントリユ ドイツ連邦共和国、デー−69120、ハイデ ルベルク、ベルリネル・シユトラーセ・ 40、６・オー・ゲー (72)発明者 ペドロ・ピユイグドムネシユ スペイン国、08017・バルセロナ、セー ／マール・ドウ・ドウー・ドウ・ニユリ ア・24、４°・ベー (72)発明者 フアン・リゴー スペイン国、08192・バルセロナ、サン・ キルズ・デル・バレ、セー／マレセルバ・ ６ (72)発明者 ミゲル・アンヘル・トレス スペイン国、08016・バルセロナ、パセ グ・バルドーラ・243、プリンシパル・ ２・アー (72)発明者 ハビエル・ウリベ スペイン国、08029・バルセロナ、セー ／アントンサ・162、プリンシパル・４・ アー

Claims (31)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 少なくとも花粉、根、分裂組織ゾーン及
    び未成熟胚における特異的発現を制御する調節エレメン
    トを少なくとも一つ含むトウモロコシα−チューブリン
    遺伝子に由来する単離核酸。
  2. 【請求項２】 遺伝子がトウモロコシα−Ｔｕｂ １遺
    伝子であることを特徴とする請求項１に記載の単離核
    酸。
  3. 【請求項３】 遺伝子がトウモロコシα−Ｔｕｂ ２遺
    伝子であることを特徴とする請求項１に記載の単離核
    酸。
  4. 【請求項４】 遺伝子がトウモロコシα−Ｔｕｂ ３遺
    伝子であることを特徴とする請求項１に記載の単離核
    酸。
  5. 【請求項５】 調節エレメントが、花粉内で検出可能な
    該エレメントの制御下にある遺伝子の発現を制御するこ
    とを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の
    単離核酸。
  6. 【請求項６】 調節エレメントが、根内で検出可能な該
    エレメントの制御下にある遺伝子の発現を制御すること
    を特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の単
    離核酸。
  7. 【請求項７】 調節エレメントが、分裂組織内で検出可
    能な該エレメントの制御下にある遺伝子の発現を制御す
    ることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記
    載の単離核酸。
  8. 【請求項８】 調節エレメントが、未成熟胚内で検出可
    能な該エレメントの制御下にある遺伝子の発現を制御す
    ることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記
    載の単離核酸。
  9. 【請求項９】 調節エレメントがＳＥＱ ＩＤ Ｎ
    ｏ．：１のヌクレオチド１〜１３４８を含むことを特徴
    とする請求項５に記載の核酸。
  10. 【請求項１０】 調節エレメントがＳＥＱ ＩＤ Ｎ
    ｏ．：１のヌクレオチド１２９５〜１３４８を含むこと
    を特徴とする請求項９に記載の核酸。
  11. 【請求項１１】 調節エレメントがＳＥＱ ＩＤ Ｎ
    ｏ．：１のヌクレオチド１〜１５２９を含むことを特徴
    とする請求項６に記載の核酸。
  12. 【請求項１２】 調節エレメントがＳＥＱ ＩＤ Ｎ
    ｏ．：１のヌクレオチド１〜１１１５を含むことを特徴
    とする請求項１１に記載の核酸。
  13. 【請求項１３】 調節エレメントがＳＥＱ ＩＤ Ｎ
    ｏ．：３のヌクレオチド１〜６９５を含むことを特徴と
    する請求項７又は８に記載の核酸。
  14. 【請求項１４】 調節エレメントがＳＥＱ ＩＤ Ｎ
    ｏ．：３のヌクレオチド５４２〜６９５を含むことを特
    徴とする請求項１３に記載の核酸。
  15. 【請求項１５】 調節エレメントがＳＥＱ ＩＤ Ｎ
    ｏ．：３のヌクレオチド１〜１０７６を含むことを特徴
    とする請求項７又は８に記載の核酸。
  16. 【請求項１６】 植物内で機能することができ且つコー
    ディング配列に機能的に結合している請求項１から１５
    のいずれか一項に記載のプロモーターＤＮＡの、異種遺
    伝子を発現させるのに十分な部分を含む植物キメラ遺伝
    子。
  17. 【請求項１７】 プロモーターとコーディング配列との
    間に、当該遺伝子の別の調節エレメントを含むことを特
    徴とする請求項１６に記載の植物キメラ遺伝子。
  18. 【請求項１８】 遺伝子の調節エレメントが、植物内で
    機能するプロモーターであることを特徴とする請求項１
    ７に記載の植物キメラ遺伝子。
  19. 【請求項１９】 前記別の調節エレメントがカリフラワ
    ーモザイクウイルスの３５Ｓ ＣａＭＶプロモーターで
    あることを特徴とする請求項１８に記載の植物キメラ遺
    伝子。
  20. 【請求項２０】 前記別の調節エレメントが植物ヒスト
    ンプロモーターであることを特徴とする請求項１８に記
    載の植物キメラ遺伝子。
  21. 【請求項２１】 前記別の調節エレメントがコメアクチ
    ン遺伝子プロモーターであることを特徴とする請求項１
    ８に記載の植物キメラ遺伝子。
  22. 【請求項２２】 脂質代謝酵素、デサチュラーゼをコー
    ドする遺伝子、除草剤耐性遺伝子、又は５−エノールピ
    ルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼ、アセ
    トラクターゼ及び４−ヒドロキシフェニルピルベートジ
    オキシゲナーゼ（ＨＰＰＯ）をコードする遺伝子からな
    る群の中に含まれる異種遺伝子を含んでいることを特徴
    とする請求項１６から２１のいずれか一項に記載の植物
    キメラ遺伝子。
  23. 【請求項２３】 異種遺伝子がグリホセート耐性ａｒｏ
    Ａ遺伝子であることを特徴とする請求項２２に記載の植
    物キメラ遺伝子。
  24. 【請求項２４】 請求項１６から２３のいずれか一項に
    記載の植物キメラ遺伝子を含んでいることを特徴とする
    植物形質転換ベクター。
  25. 【請求項２５】 請求項２４に記載のベクターを含んで
    いる植物細胞。
  26. 【請求項２６】 請求項２５に記載の細胞から再生され
    たものであることを特徴とする植物又は植物子孫。
  27. 【請求項２７】 単子葉植物であることを特徴とする請
    求項２６に記載の植物。
  28. 【請求項２８】 トウモロコシ又は穀類であることを特
    徴とする請求項２７に記載の植物。
  29. 【請求項２９】 双子葉植物であることを特徴とする請
    求項２６に記載の植物。
  30. 【請求項３０】 タバコ、ワタ又はダイズであることを
    特徴とする請求項２９に記載の植物。
  31. 【請求項３１】 改善された作物特性を有する植物の製
    造方法であって、 ａ）植物細胞を請求項２４に記載のベクターで形質転換
    し、次いで ｂ）植物を再生する操作を含むことを特徴とする前記方
    法。
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