JPH07138183A - 胃・十二指腸疾患治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【構成】 ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）を有効成分として
含有する胃・十二指腸疾患治療剤。 【効果】 本発明の治療剤において、有効成分であるＨ
ＧＦは胃及び十二指腸の上皮細胞の増殖を促進し、傷害
を受けた胃及び十二指腸の再生を図ることができる。従
って、本発明の治療剤は、慢性及び急性の胃・十二指腸
疾患（例えば、胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍など）の予
防・治療に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は胃・十二指腸疾患治療剤
に関する。より詳細にはＨＧＦ(HepatocyteGrowth Fact
or、肝細胞増殖因子）を有効成分とする胃・十二指腸疾
患治療剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＨＧＦは本発明者らが再生肝ラット血清
中から成熟肝実質細胞を in vitro で増殖させる因子と
して見いだしたタンパク質である（Biochem Biophys Re
s Commun, 122, 1450, 1984）。本発明者らはさらに、
ＨＧＦをラット血小板より単離することに成功し（Pro
c. Natl. Acad. Sci, 83, 6489,1986, FFBS Letter, 2
2,311, 1987）、そのアミノ酸配列を一部決定した。さ
らに、本発明者らは解明されたＨＧＦアミノ酸配列をも
とにヒト及びラット由来のＨＧＦｃＤＮＡクローニング
を行い、このｃＤＮＡを動物組織に組換えて肝実質細胞
増殖因子をタンパク質として得ることに成功した（ヒト
ＨＧＦ：Nature, 342, 440, 1989；ラットＨＧＦ：Pro
c. Natl. Acad. Sci, 87, 3200, 1990）。

【０００３】ＨＧＦの分子量はＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動で８２〜８５ｋＤである。ラットＨＧ
Ｆ分子は４６３アミノ酸残基からなるα鎖と２３３アミ
ノ酸残基からなるβ鎖が１個のジスルフィド結合により
架橋したヘテロダイマー構造を持ち、α、β両鎖とも２
個のグルコサミン型糖鎖結合部位が存在する。ヒトＨＧ
Ｆもまたほぼ同じ生理活性を有し、４６３アミノ酸残基
からなるα鎖と２３４アミノ酸残基からなるβ鎖とから
なる。α鎖中には線溶酵素プラスミンと同様のクリング
ル構造が４個存在し、β鎖のアミノ酸配列においてもセ
リンプロテアーゼ活性を有するプラスミンのＢ鎖と約３
７％のホモロジーを有する。ラットＨＧＦとヒトＨＧＦ
のアミノ酸配列のホモロジーはα鎖において91.6％、β
鎖において88.9％と非常に高い相同性を持ち、その活性
は全く互換性がある。

【０００４】肝実質細胞を特異的に増殖させる因子とし
て発見されたＨＧＦは、本発明者をはじめとする研究者
による最近の研究成果によって、生体内で種々の活性を
示している事が明らかとなり、研究対象としてのみなら
ずヒトや動物の治療薬などへの応用に期待が集まってい
る。本発明者らは、ＨＧＦが増殖因子として肝細胞のみ
ならず広く上皮系細胞に働く事を明らかにし、いくつか
の発明を成就した。特願平２−１５８８４１号において
は、ＨＧＦが腎の近位尿細管細胞の増殖を促進すること
より、腎疾患治療剤としての応用開発を、また特願平２
−４１９１５８号においては、ＨＧＦがメラノサイト、
ケラチノサイトなど正常上皮細胞の増殖を促進すること
より、上皮細胞促進剤として創傷治療や皮膚潰瘍治療、
毛根細胞の増殖剤などへの応用開発を成就し、その詳細
を開示した。特に、ＨＧＦはＥＧＦ等他の多くの増殖因
子に見られるガン化作用やガン細胞増殖活性を有さない
ことから、より実用に適している。さらに本発明者ら
は、特願平３−１４０８１２号においてＨＧＦのヒト肝
ガン由来ＨｅｐＧ２細胞株、リンパ芽球ガン由来ＩＭ９
細胞株などのガン細胞増殖抑制活性を利用し、制ガン剤
としても利用可能であることを開示した。

【０００５】ＨＧＦの医薬品としての実用性を考える上
でさらに重要な点は、ＨＧＦがＧ１期、すなわち増殖期
に入った細胞のみを増殖促進し、Ｇ０期、すなわち静止
期にある細胞には作用しないことである。このことは、
傷害のある組織の増殖再生は促進するが、傷害を受けて
いない組織に対しては全く作用を及ぼさないことを意味
する。従って、過剰にＨＧＦを投与しても、あるいは血
液などを介して非患部にＨＧＦが到達しても、正常組織
にガン化を誘導したり過剰な増殖を起こすことがないと
考えられる。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】前記のようにＨＧＦが
肝細胞だけでなく広く上皮細胞の増殖を促進し、またガ
ン細胞の増殖抑制活性を有することから、生体内ではＨ
ＧＦが組織傷害治癒に働いていることが予想される。Ｈ
ＧＦ産生細胞は上皮細胞自身ではなく、肝臓ではＫｕｐ
ｆｆｅｒ細胞や類洞壁血管内皮細胞、腎臓では毛細血管
内皮細胞、肺では肺胞マクロファージや血管内皮細胞な
ど主に間葉系の細胞により産生されていることが解明さ
れており、近隣細胞から必要に応じてＨＧＦが供給され
る、いわゆるパラクリン機構が成立していることが明ら
かにされている。しかしながら、肝臓や腎臓に傷害を受
けたとき、傷害を受けていない臓器、例えば肺などにお
いてもＨＧＦの産生が高まることから、いわゆるエンド
クリン機構によってもＨＧＦが供給されていると考えら
れる。

【０００７】このように、ＨＧＦは種々の臓器・組織で
傷害治癒に働いている増殖因子であるが、胃及び十二指
腸に傷害が加わった時にＨＧＦが胃及び十二指腸の修復
に寄与するか否かは明らかにされていない。本発明者ら
は、ＨＧＦの標的細胞の多くは上皮細胞系であることか
ら、胃・十二指腸に傷害が加わった時にＨＧＦが胃・十
二指腸の再生に寄与し、疾患の予防・治療に有効であろ
うと思考し、胃・十二指腸におけるＨＧＦの作用を検討
した。その結果、ＨＧＦにより胃粘膜細胞の増殖が著し
く促進されることを見出した。本発明はかかる知見に基
づいてなされたもので、本発明は、胃・十二指腸傷害の
予防・治療に有用な胃・十二指腸疾患治療剤を提供する
こと目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
めになされた本発明の胃・十二指腸疾患治療剤は、ＨＧ
Ｆを有効成分として含有することからなる。上記の構成
からなる本発明の有効成分であるＨＧＦは、医薬として
使用できる程度に精製されたものであれば、種々の方法
で調製されたものを用いることができる。ＨＧＦの調製
方法としては、各種の方法が知られており、例えば、ラ
ット、ウシ、ウマ、ヒツジなどの哺乳動物の肝臓、脾
臓、肺臓、骨髄、脳、腎臓、胎盤等の臓器、血小板、白
血球等の血液細胞や血漿、血清などから抽出、精製して
得ることができる。また、ＨＧＦを産生する初代培養細
胞や株化細胞を培養し、培養物（培養上清、培養細胞な
ど）から分離精製してＨＧＦを得ることもできる。ある
いは遺伝子工学的手法によりＨＧＦをコードする遺伝子
を適切なベクターに組込み、これを適当な宿主に挿入し
て形質転換し、この形質転換体の培養物から目的とする
組換えＨＧＦを得ることができる(例えば、Nature, 34
2, 440, 1989、特開平５−１１１３８３号公報、Bioche
m. Biophys. Res. Commun., 163, 967, 1989など参
照)。上記の宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝
子工学的手法で用いられている各種の宿主細胞、例えば
大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌、植物又は動物細胞など
を用いることができる。

【０００９】より具体的には、ＨＧＦを生体組織から抽
出精製する方法としては、例えば、ラットに四塩化炭素
を腹腔内投与し、肝炎状態にしたラットの肝臓を摘出し
て粉砕し、Ｓ−セファロース、ヘパリンセファロースな
どのゲルカラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ等の通常
の蛋白質精製法にて精製することができる。また、遺伝
子組換え法を用い、ヒトＨＧＦのアミノ酸配列をコード
する遺伝子を、ウシパピローマウィルスＤＮＡなどのベ
クターに組み込んだ発現ベクターによって動物細胞、例
えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、マ
ウスＣ１２７細胞、サルＣＯＳ細胞などを形質転換し、
その培養上清より得ることができる。

【００１０】かくして得られたＨＧＦは、そのアミノ酸
配列の一部が欠失又は他のアミノ酸により置換されてい
たり、他のアミノ酸配列が一部挿入されていたり、Ｎ末
端及び／又はＣ末端に１又は２以上のアミノ酸が結合し
ていたり、あるいは糖鎖が同様に欠失又は置換されてい
てもよい。

【００１１】上記のＨＧＦは、後記実施例に示されるよ
うに、胃粘膜細胞の増殖を促進する作用を有し、また胃
・十二指腸傷害を受けた生体では胃及び十二指腸（並び
に肝臓及び肺）におけるＨＧＦ産生が促進されることが
明らかとなった。より詳細には、兎の胃粘膜細胞（上皮
細胞）の１次培養で細胞成長に対するＨＧＦのもたらす
効果を調べたところ、ＨＧＦの添加により、細胞のＤＮ
Ａ合成及び増殖は、用量依存的な明瞭な応答を示すこと
が確認された。ＨＧＦが生理学的な投与量で細胞成長を
促進することから、ＨＧＦが胃上皮細胞の増殖の調節手
段となることが明らかになった。上述の細胞増殖はＥＧ
Ｆとインシュリンに対して相加的あるいは相乗的であ
り、またチロシンキナーゼ特異阻害剤であるゲニステイ
ンによりブロックされた。従って、各種の成長因子の作
用が仲介されるチロシンキナーゼの通路は、ＨＧＦによ
り誘発された胃上皮細胞の増殖促進応答に含まれること
が考えられる。

【００１２】また、実験結果は、細胞内遊離Ｃａ²⁺がＨ
ＧＦによっては増えなかったことを示し、Ｃａ²⁺は兎の
胃上皮細胞に対するＨＧＦの作用には重要な役割を果た
している様には見受けられなかった。

【００１３】さらに、筋原線維芽細胞との間の識別性に
やや問題はあるが、胃の間葉に由来する線維芽細胞様の
細胞の培養上清(conditioned medium)にはＨＧＦと類似
の増殖促進効果を持つ因子が存在することが示され、更
に線維芽細胞様の細胞の培養上清の増殖促進効果は、Ｅ
ＧＦ又はインスリンと共力的であり、又ゲニステインに
よりブロックされた。肝臓、腎臓及び肺のような他の臓
器においては、線維芽細胞がＨＧＦを分泌し、これらが
上皮細胞の増殖を促進し、かつ傷害からの治癒プロセス
に寄与することが報告されている。上記の結果及び知見
並びに重大な胃組織欠陥が先ず顆粒化組織により取り代
わられ、次に上皮の再形成がこれに続くこと(J. Clin.
Gastroenterol. 13, Suppl 2, S21-34, 1991)の事実か
ら見て、胃粘膜の修復及び傷害治癒は、ＨＧＦが寄与す
る、胃上皮細胞とその下の結合組織との間の相互作用に
より調節されることが推察される。

【００１４】以上のように、ＨＧＦは胃粘膜細胞の増殖
を促進させる作用を有するので、本発明の治療剤は慢性
又は急性の胃・十二指腸疾患（例えば、胃炎、胃潰瘍、
十二指腸潰瘍など）の予防・治療に利用することができ
る。

【００１５】本発明の治療剤は種々の製剤形態（例え
ば、液剤、固形剤、カプセル剤など）をとりうるが、一
般的には有効成分であるＨＧＦのみ又はそれと慣用の担
体と共に注射剤とされるか、又は慣用の担体と共に経口
剤とされる。当該注射剤は常法により調製することがで
き、例えば、ＨＧＦを適切な溶剤（例えば、滅菌水、緩
衝液、生理食塩水等）に溶解した後、フィルター等で濾
過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することによ
り調製することができる。注射剤中のＨＧＦ含量として
は、通常0.0002〜0.2(W/V%)程度、好ましくは0.001〜0.
1(W/V%)程度に調整される。また、経口薬としては、例
えば、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、軟又は硬カプセル
剤、液剤、乳剤、懸濁剤、シロップ剤などの剤形に製剤
化され、これらの製剤は製剤化の常法に準じて調製する
ことができる。製剤中のＨＧＦ含量は、剤形、適用疾患
などに応じて適宜調整することができる。

【００１６】製剤化に際して、好ましくは安定化剤が添
加され、安定化剤としては、例えば、アルブミン、グロ
ブリン、ゼラチン、マンニトール、グルコース、デキス
トラン、エチレングリコールなどが挙げられる。さら
に、本発明の製剤は製剤化に必要な添加物、例えば、賦
形剤、溶解補助剤、酸化防止剤、無痛化剤、等張化剤等
を含んでいてもよい。液状製剤とした場合は凍結保存、
又は凍結乾燥等により水分を除去して保存するのが望ま
しい。凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水などを加
え、再溶解して使用される。

【００１７】本発明の製剤は、該製剤の形態に応じた適
当な投与経路により投与され得る。例えば、注射剤の形
態にして静脈、動脈、皮下、筋肉内等に投与することが
できる。その投与量は、患者の症状、年齢、体重などに
より適宜調整されるが、通常ＨＧＦとして0.01mg〜100m
gであり、これを１日１回ないし数回に分けて投与する
のが適当である。

【００１８】

【発明の効果】本発明の治療剤において、有効成分であ
るＨＧＦは胃・十二指腸細胞の増殖を促進し、傷害を受
けた胃・十二指腸の粘膜を再生し修復を図ることができ
る。従って、本発明の治療剤は、慢性及び急性の胃・十
二指腸疾患（例えば、胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍な
ど）の予防・治療に有用である。

【００１９】

【実施例】以下、実施例及び製剤例に基づいて本発明を
より詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定され
るものではない。なお、以下の実施例１〜３で使用した
試薬類は下記の通りである。 ヒトＥＧＦ（ワクナガ社製）、ヒトインスリン（シオ
ノギ社製）及びゲニステイン(genistein、Sigma社製）
は購入品を使用した。 ＨＧＦは、Nakamuraらの方法(Nature 342, 440-443,
1989)に準じ、ヒトＨＧＦ全長ｃＤＮＡを含む発現ベク
ターでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の培養上清か
ら精製されたヒト組換体ＨＧＦを使用した。 胃上皮細胞分離及び培養用の試薬は下記の通りであっ
た。：Coonの改変Ham's F-12培地 (KC biological 社
製)、ＢＭＥ(Basal medium Eagle)、ＭＥＭ(minimal es
sential medium、Sigma社製)、アミノ酸、Ｎ−２−ヒド
ロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸
(N-2-hydroxyethylpiperadine-N-2-ethanesulonic aci
d、HEPES) 緩衝液(Sigma社製)、ウシ血清アルブミン (B
SA)（フラクションＶ、Sigma社製）、ハンクス液（HBS
S、Gibco社製)、クルードタイプＩコラゲナーゼ（Sigma
社製）、エチレンジアミン四酢酸（EDTA、Sigma社
製）。トリチウムラベル化チミジン（［³Ｈ］−チミジ
ン、New England Nuclear社製）、クリスタルバイオレ
ット(Crystal violet、Sigma社製）及びIndo-1AM（螢光
Ｃａ²⁺プローブ、ワコー社製）は購入品を使用した。

【００２０】実施例１胃基底粘膜細胞の分離及び細胞培養方法 胃基底粘膜細胞（以下、胃粘膜細胞という）は、成体兎
（体重２.５−３.０ｋｇの日本白兎を雌雄の別なく使用
した）から分離し、Otaらの方法(Gastroenterologia Ja
ponica 25, 1-7, 1990)に準じて培養した。概略的に
は、基底粘膜を兎の胃から迅速に分離し、付着物を粗く
こすり取った後、２〜３ｍｍ²の小片に切断した。切断
した組織は、クルードタイプＩコラゲナーゼ（０.３５
ｍｇ／ｍｌ）を含むＢＭＥの中でインキュベートした。
次に１ミリモルのＥＤＴＡを含むＢＭＥの中でのインキ
ュベーションをし、更に上記のクルードタイプＩコラゲ
ナーゼを含むＢＭＥ溶液の中でのインキュベーションを
行ったが、このインキュベーションは５％ＣＯ₂及び９
５％Ｏ₂の環境下３７℃，ｐＨ７.４の条件で続けて２回
実施した。最後のインキュベーションから取り出した細
胞は、ＨＢＳＳにより洗浄し、かつ５％ＣＯ₂を含む３
７℃の湿潤環境下で培養した。培養培地はＦ−１２培地
であり、これに１０％の非動化（５６℃、３０分間）し
たウシ胎児血清（FBS, Gibco社製）、１５ミリモルＨＥ
ＰＥＳバッファー、１００単位／ｍｌペニシリン、１０
０単位／ｍｌストレプトマイシン及び５μg／ｍｌ Fung
izoneを添加した。

【００２１】培養した細胞は、Teranoらの方法(Gastroe
nterology 83, 1280-1291, 1982)に準じ、過ヨウ素酸シ
ッフ（ＰＡＳ）染色により、４８時間後に調べた。培養
された細胞は、接種後４８時間で準飽和細胞密度(Sub-c
onfluent)の単一層を形成した。これらの単一層の９０
％以上が細胞質中にＰＡＳ-陽性の物質を持っており、
培養細胞が主として粘膜形成細胞からなっていることを
示した。これらの細胞は１ヶ月後に死滅し、線維芽細胞
様の細胞（細胞形態から判別）が主体を占めた。

【００２２】また、胃基底線維芽細胞様の細胞（以下、
線維芽細胞様細胞という）は、上述のように培養が１ヶ
月以上に及んだ際、胃粘膜細胞が死滅し、線維芽細胞が
主体を占めた時に得られた。この期間中、１０％ＦＢＳ
を添加したＦ−１２培地は毎週交換した。線維芽細胞の
培養上清は、線維芽細胞が主体を占めた後に培養系から
得た。

【００２３】実施例２各種増殖因子の細胞増殖効果 各種増殖因子の胃粘膜細胞に対する増殖効果は、ＤＮＡ
合成促進及びクリスタルバイオレット法により測定し
た。その詳細は下記の通りである。 Ａ．細胞増殖方法及び増殖の測定方法 ＤＮＡ合成に対する各種増殖（成長）因子の及ぼす
影響は、［³Ｈ］−チミジン取り込み法により測定し
た。分離した胃粘膜細胞は、２４-ウエル培養プレート
（Primaria社製）上に１.４×１０⁵細胞／ｃｍ²の密度
で接種し、１０％ＦＢＳを添加したＦ−１２培地中で２
４時間培養した。次に血清を含まないＦ−１２培地を用
いて２４時間培養した後、培地を試験物質（ＥＧＦ、イ
ンシュリン、ＨＧＦ、線維芽細胞の培養上清又はゲニス
テイン）及び０.１％ＢＳＡを添加した無血清Ｆ−１２
培地に変えた。同時に［³Ｈ］−チミジン（最終濃度：
１.０mCi／ｍｌ）を添加した。試験物質を添加してから
２４時間後に細胞を洗浄し、５％のトリクロロ酢酸を添
加した。細胞は１時間、４℃下で放置し、次に１ＮのＮ
ａＯＨの中で可溶化し、ＨＣｌで中和した。溶液は、固
体シンチレーターを塗布してあるReadycap(Beckman ins
trument社製)に移し、一夜にわたって風乾した。次いで
放射活性を液体シンチレーションカウンターを用いてカ
ウントした。

【００２４】 クリスタルバイオレット法による増殖
の測定のために、胃粘膜細胞は９６−ウエル培養プレー
ト（Primaria社製）に接種し、かつ上記のように成長さ
せた。試験物質を添加してから２４時間後に、培養した
細胞は、０.１％のクリスタルバイオレットを含む２５
％メタノールの中に１０分間浸漬することにより、固定
すると共に染色した。次いで染色した細胞層を、洗浄
し、乾燥した。６００ｎｍでの吸光度をマルチウェルス
ペクトロフォトメーター（Immunoreader 2000、 InterM
ed社製）を用いて測定した。

【００２５】Ｂ．試験結果 上記の試験の結果は以下のとおりであった。 胃粘膜細胞に対するＨＧＦの増殖効果 試験物質としてＨＧＦを用いて、２４時間培養した細胞
のＤＮＡ合成量（［³Ｈ］−チミジン取り込み量に基づ
く。以下同様）を図１に、クリスタルバイオレット染色
法による成長反応を図２に示す［平均値＋標準誤差、
＊：対照（コントロール）との比較結果 ｐ＜０.０
１］。なお、試験結果は、対照に対する比率（％）で示
した（以下、同様）。図１に示されるように、ＨＧＦ
は、用量依存的にＤＮＡ合成を有意に促進し、また図２
に示されるように、この増殖はクリスタルバイオレット
染色法により確認された。

【００２６】胃粘膜細胞に対するＨＧＦ、ＥＧＦ及び
インスリンの増殖効果 試験物質としてＨＧＦのみ、ＥＧＦのみ及びＨＧＦ＋Ｅ
ＧＦを用い、２４時間培養した細胞のＤＮＡ合成量を図
３に示し、また試験物質としてＨＧＦのみ、インスリン
（ＩＮＳ）のみ及びＨＧＦ＋ＩＮＳを用い、２４時間培
養した細胞のＤＮＡ合成量を図４に示す［平均値＋標準
誤差、 ＊：対照との比較結果 ｐ＜０.０１、＊＊：Ｈ
ＧＦのみ、ＥＧＦのみ（又はＩＮＳのみ）との比較結果
ｐ＜０.０１］。図３及び図４に示されるように、ＥＧ
Ｆ及びＩＮＳもＤＮＡ合成を促進し、かつＨＧＦと相加
的あるいは相乗的に作用した。

【００２７】胃粘膜細胞に対する線維芽細胞様細胞の
培養上清の増殖効果 試験物質として、培養した線維芽細胞様細胞の培養上清
を濃度を変化させて用い、２４時間培養した細胞のＤＮ
Ａ合成量を図５に示す（平均値＋標準誤差、＊：対照と
の比較結果 ｐ＜０.０１）。また、培養した線維芽細胞
様細胞と１０分間又は１２０分間共存させた培養上清を
試験物質として用い、２４時間培養した細胞のＤＮＡ合
成量を図６に示す（平均値＋標準誤差、＊：対照との比
較結果ｐ＜０.０１）。図５及び図６に示されるよう
に、線維芽細胞様細胞の培養上清は、用量依存的及び共
存時間依存的にＤＮＡ合成を促進した。なお、別途の試
験から、線維芽細胞様細胞の培養上清は、ＥＧＦ及びイ
ンスリンと相加的あるいは相乗的に作用することが示さ
れた。

【００２８】細胞増殖に対するゲニステインの抑制効
果 上記のように、ＨＧＦ及び線維芽細胞様細胞培養上清に
より促進されることが判明したＤＮＡ合成が、チロシン
キナーゼ特異阻害剤であるゲニステインにより抑制され
るか否かを検討した。図７にはＨＧＦにより促進された
ＤＮＡ合成のゲニステインによる抑制結果を示した。判
定は［³Ｈ］−チミジン取り込み量によった（平均値＋
標準誤差、＊：ＨＧＦ＋ＤＭＳＯとの比較結果 ｐ＜０.
０１）。また、図８には、線維芽細胞様細胞の培養上清
により促進されたＤＮＡ合成のゲニステインによる抑制
結果を示した。判定は［³Ｈ］−チミジン取り込み量に
よった（平均値＋標準誤差、＊：線維芽細胞様細胞の培
養上清＋ＤＭＳＯとの比較結果 ｐ＜０.０１）。なお、
図中、ＤＭＳＯはジメチルスルホキシド、ＧＳはゲニス
テイン、ＦＩＢは線維芽細胞様細胞の培養上清を示す。
図７に示されるように、ＨＧＦによるＤＮＡ合成の促進
は、チロシンキナーゼ特異阻害剤であるゲニステインに
より、用量依存的に抑制されることが明らかになった。
また、図８に示されるように、線維芽細胞様細胞の培養
上清によるＤＮＡ合成の促進もゲニステインにより抑制
された。

【００２９】実施例３細胞内遊離Ｃａ²⁺の測定 ＨＧＦ及び線維芽細胞様細胞の培養上清による細胞増殖
により、細胞内の遊離Ｃａ²⁺が増加するか否かを測定し
た。測定法は以下のとおりである。胃粘膜細胞は、カバ
ーガラス上でＦ−１２培地を用いて培養した。培養した
細胞は、５ミリモルのindo-1AM（蛍光Ｃａ²⁺プローブ）
を含む培地を用い、３７℃下で１５分間インキュベート
した。カバーガラスをindo-1AMを含まぬ溶液中で３０分
間洗浄し、次に貫流セルチャンバーに移した。上記のカ
バーガラスに、１３７ミリモルＮａＣｌ、３.７ミリモ
ルＫＣｌ、０.５ミリモルＭｇＣｌ₂、１.８ミリモルＣ
ａＣｌ₂、５.６ミリモル グルコース及び４.０ミリモル
ＨＥＰＥＳを含むＨＥＰＥＳ緩衝液を連続的に流した。
細胞内遊離カルシュウム濃度はPeetersらの方法(Am. J.
Physiol. 253, H1400-1408, 1987)に準じて測定した。
蛍光は対物レンズにより収光され、２つの個別の光電子
増倍管を用いて４１０ｎｍ及び４８０ｎｍの両波長での
測定を同時に実施できるように、ビームスプリッターに
より分割した。［Ｃａ²⁺］iは、両蛍光発光時の４１０
／４８０蛍光比から［Ｃａ²⁺］i＝２５０ｎｍ（Ｒ−Ｒm
in）／（Ｒmax−Ｒ）ｂの式を用いて算定した。Ｒmax及
びＲminは、それぞれindo-1AMにＣａ²⁺が結合している
場合とＣａ²⁺が存在していない時の値に該当する。Ｒmi
nを求めるには、培養した胃細胞にindo-1AMを負荷し、
洗浄後、３７℃下で２分間"０"Ｃａ²⁺（０.１ミリモル
のＥＧＴＡを添加）にて１４０ミリモルのＫＣｌ、４ミ
リモルＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０５）及び５０ミリモル
ジギトニン(digitonin)に浸漬した。Ｒmaxは［Ｃａ²⁺］
oを０.１ミリモル（"High Ｃａ²⁺"）に高めるのに十分
なＣａ²⁺を加えることにより求めた。その結果を図９に
示す。図９に示されるように、ＨＧＦ及びＥＧＦは細胞
内遊離Ｃａ²⁺を増加させることがなかった。

【００３０】製剤例１ 生理食塩水１００ｍｌ中にＨＧＦ１ｍｇ、マンニトール
１ｇ及びポリソルベート８０ １０ｍｇを含む溶液を無
菌的に調製し、１ｍｌずつバイアルに分注した後、凍結
乾燥して密封することにより凍結乾燥製剤を得た。

【００３１】製剤例２ ０．０２Ｍリン酸緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ及び
０．０１％ポリソルベート８０含有、ｐＨ７．４）１０
０ｍｌ中にＨＧＦ１ｍｇとヒト血清アルブミン１００ｍ
ｇを含む水溶液を無菌的に調製し、１ｍｌずつバイアル
に分注した後、凍結乾燥して密封することにより凍結乾
燥製剤を得た。

【００３２】製剤例３ 注射用蒸留水１００ｍｌ中にＨＧＦ１ｍｇ、ソルビトー
ル２ｇ、グリシン２ｇ及びポリソルベート８０ １０ｍ
ｇを含む溶液を無菌的に調製し、１ｍｌずつバイアルに
分注した後、凍結乾燥して密封することにより凍結乾燥
製剤を得た。

【図面の簡単な説明】

【図１】試験物質としてＨＧＦを用いて２４時間培養し
た細胞のＤＮＡ合成量を示す図である（平均値＋標準誤
差、＊：対照との比較結果 ｐ＜０.０１）。

【図２】試験物質としてＨＧＦを用いて２４時間培養し
た細胞の成長反応（クリスタルバイオレット染色法）を
示す図である（平均値＋標準誤差、＊：対照との比較結
果 ｐ＜０.０１）。

【図３】試験物質としてＨＧＦのみ、ＥＧＦのみ又はＨ
ＧＦ＋ＥＧＦを用いて２４時間培養した細胞のＤＮＡ合
成量を示す図である（平均値＋標準誤差、＊：対照との
比較結果 ｐ＜０.０１、＊＊：ＨＧＦのみ又はＥＧＦの
みとの比較結果 ｐ＜０.０１）。

【図４】試験物質としてＨＧＦのみ、インスリン（ＩＮ
Ｓ）のみ又はＨＧＦ＋ＩＮＳを用いて２４時間培養した
細胞のＤＮＡ合成量を示す図である（平均値＋標準誤
差、＊：対照との比較結果 ｐ＜０.０１、＊＊：ＨＧＦ
のみ又はＩＮＳのみとの比較結果 ｐ＜０.０１）。

【図５】試験物質として、培養した線維芽細胞様細胞の
培養上清を濃度を変化させて用い、２４時間培養した細
胞のＤＮＡ合成量を示す図である（平均値＋標準誤差、
＊：対照との比較結果 ｐ＜０.０１）。

【図６】試験物質として、培養した線維芽細胞様細胞と
１０分間又は１２０分間共存させた培養上清を用い、２
４時間培養した細胞のＤＮＡ合成量を示す図である（平
均値＋標準誤差、＊：対照との比較結果 ｐ＜０.０
１）。

【図７】ＨＧＦにより促進されたＤＮＡ合成のゲニステ
インによる抑制結果（判定は［³Ｈ］−チミジン取り込
み量による）を示す図である（平均値＋標準誤差、＊：
ＨＧＦ＋ＤＭＳＯとの比較結果 ｐ＜０.０１）。なお、
図中、ＤＭＳＯはジメチルスルホキシド、ＧＳはゲニス
テインを示す。

【図８】線維芽細胞様細胞の培養上清により促進された
ＤＮＡ合成のゲニステインによる抑制結果（判定は［³
Ｈ］−チミジン取り込み量による）を示す図である（平
均値＋標準誤差、＊：線維芽細胞様細胞の培養上清＋Ｄ
ＭＳＯとの比較結果 ｐ＜０.０１）。なお、図中、ＤＭ
ＳＯはジメチルスルホキシド、ＧＳはゲニステイン、Ｆ
ＩＢは線維芽細胞様細胞の培養上清を示す。

【図９】ＨＧＦ及びＥＧＦを用いて培養した細胞の細胞
内遊離Ｃａ²⁺濃度の変化を示す図である。なお、陽性対
照として、デオキシコール酸を用いた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＨＧＦを有効成分として含有するこ
   とを特徴とする胃・十二指腸疾患治療剤。