JPH07134101A

JPH07134101A - Ｄｎａ塩基配列決定装置

Info

Publication number: JPH07134101A
Application number: JP5305815A
Authority: JP
Inventors: Ryoji Nemoto; 亮二根本; Yoshinori Mishina; 喜典三品
Original assignee: Hitachi Electronics Engineering Co Ltd
Current assignee: Hitachi High Tech Corp
Priority date: 1993-11-11
Filing date: 1993-11-11
Publication date: 1995-05-23

Abstract

(57)【要約】【目的】波長の接近した励起光と蛍光から、蛍光波長
成分だけを効果的に、かつ、確実に取り出すことができ
るＤＮＡ塩基配列決定装置を提供する。【構成】ＤＮＡ断片用の多数の泳動路を有する、垂直
に保持される平板型ゲル電気泳動手段、該電気泳動装置
の泳動路に、該電気泳動装置の横方向から該泳動路と直
交するように、レーザ光を照射する光励起用のレーザ光
照射手段、レーザ光によって照射されたＤＮＡ断片から
発生された蛍光を検出し電気信号に変換する蛍光検出手
段とからなるＤＮＡ塩基配列決定装置において、前記蛍
光検出手段は偏光板（特に、Ｓ偏光成分を遮断する偏光
板）を有することを特徴とするＤＮＡ塩基配列決定装
置。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はＤＮＡ塩基配列決定装置
に関する。更に詳細には、本発明は蛍光標識を用いてＤ
ＮＡの塩基配列を効率的に迅速に決定することのできる
装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＤＮＡ等の塩基配列を決定する方法とし
て、ゲル電気泳動法が広く実施されている。

【０００３】電気泳動する際に、従来は試料をラジオア
イソトープでラベルし、分析していたが、この方法では
手間と時間がかかる難点があった。更に、放射能管理の
点から常に最大限の安全性と管理が求められ、特別な施
設内でなければ分析を行うことができない。このため、
最近では、試料を蛍光体でラベルする方式が検討されて
いる。

【０００４】光を用いる方法では、蛍光ラベルしたＤＮ
Ａ断片をゲル中を泳動させるが、泳動開始部から、１５
〜２０cm下方に各泳動路毎に光励起部と光検出器を設け
ておき、ここを通過するＤＮＡ断片を順に計測する。例
えば、配列を決定しようとするＤＮＡ鎖を鋳型として酵
素反応（ダイデオキシ法）による操作で末端塩基種が０
かった種々の長さのＤＮＡを複製し、これらに蛍光体を
標識する。つまり、蛍光体で標識されたアデニン（Ａ）
断片群，シトシン（Ｃ）断片群，グアニン（Ｇ）断片群
およびチミン（Ｔ）断片群を得る。これらの断片群を混
合して電気泳動用ゲルの別々の泳動レーン溝に注入し、
電圧を印加する。ＤＮＡは負の電荷を持つ鎖状の重合体
高分子のため、ゲル中を分子量に反比例した速度で移動
する。短い（分子量の小さい）ＤＮＡ鎖ほど早く、長い
（分子量の大きい）ＤＮＡ鎖ほどゆっくりと移動するの
で、分子量によりＤＮＡを分画できる。

【０００５】特開昭６３−２１５５６号公報には、レー
ザで照射される電気泳動装置のゲル上のラインと光ダイ
オードアレイの配列方向が電気泳動装置内のＤＮＡ断片
の泳動方向と直角となるように構成されたＤＮＡ塩基配
列決定装置が開示されている。

【０００６】図４は該装置の構成を説明する模式図であ
る。泳動板７４は２枚のガラス板の間に電気泳動用ゲル
（例えば、ポリアクリルアミド）を挟み込んでいる。泳
動板全体の厚さは約１０ｍｍ程度であるが、ゲル電解質
層自体の厚さは約１ｍｍ未満である。泳動板７４の上端
より若干下の位置に櫛歯状のゲル電解質層上端が存在す
る。この櫛歯状の溝７５内に蛍光物質で標識されたＤＮ
Ａ断片を注入する。

【０００７】図４の装置では、光源７０から出たレーザ
光はミラー７２で反射され、泳動板７４のゲル中の一定
ポイントに横から水平にレーザ光を照射する。ゲル中を
泳動してきた蛍光ラベルされたＤＮＡ断片７６がこの照
射領域を通過する際、このＤＮＡ断片から蛍光が順次放
出される。このとき、蛍光放出の水平位置から末端塩基
の種類が、また、泳動スタートからの泳動時間の差から
断片の長さを、更に、発光波長で検体の識別ができる。
各泳動路からの蛍光はレンズ７８によりイメージインテ
ンシファイヤ８０の受光部８２で結像する。この信号は
増幅されて光ダイオードアレイ８４で電気信号に変換さ
れて計測される。計測結果をコンピュータ処理すること
によって各ＤＮＡ断片の配列を計算し、目的とするＤＮ
Ａの塩基配列を決定する。

【０００８】図４に示された装置は受光系としてイメー
ジインテンシファイヤカメラを使用しているが、イメー
ジインテンシファイヤカメラは非常に高価な光学装置で
あるばかりか、比較的大型の装置である。このため、図
５に示されるように、各泳動路８８の検出位置に蛍光検
出手段を個別的に配置した装置が開発された。各蛍光検
出手段はフィルタ１００と集光レンズ１１０と受光素子
１２０とから構成されている。フィルタ１００は励起光
やバックグランド光を除去し、蛍光だけを選択的に通過
させるためのものであり、集光レンズ１１０はフィルタ
で濾波された蛍光を受光素子１２０の受光面に合焦させ
るために使用されている。受光素子１２０はｐｎ接合さ
れたシリコンからなるホトダイオードなどである。符号
８６はゲル電解質層を示す。

【０００９】例えば、このようなＤＮＡ塩基配列決定装
置において、レーザ光源としてアルゴンイオンレーザを
使用する場合、レーザ光の波長は約４８８ｎｍである。
また、ＤＮＡ断片を標識するための蛍光体として、ＦＩ
ＴＣを使用する場合、この蛍光体に前記のレーザ光が照
射されると、ここから波長約５２０ｎｍの蛍光が発生さ
れる。従って、前記フィルタ１００はこの波長５２０ｎ
ｍの蛍光だけを通過させ、それ以外の波長の迷光あるい
はバックグランド光などを除去できるものが好ましい。
このようなフィルタは例えば、誘電体多層膜コーティン
グフィルタなどである。

【００１０】しかし、図６に示すように、励起光の波長
と蛍光体の波長が接近しているので、励起光の波長だけ
を確実に、しかも効果的にカットできるフィルタの製作
は実際には非常に困難である。誘電体多層膜コーティン
グフィルタの場合、低屈折率と高屈折率の薄膜を層状と
し、これを等価的に一枚の膜と見做したとき、入射角斜
面と射出面との間で、いわゆるファブリペロ干渉計と同
様に所望の透過は貯に対し光路長がｍ・λ／２（ｍは整
数）となるように膜厚と屈折率を設定することにより、
所望の波長の光だけを透過できるようにする。しかし、
この多層膜の製作上、所望の透過波長に対し、狭帯域
で、かつ、カット性を良くするためには、膜の層数を多
くする必要があることから、各膜厚と屈折率の精度を十
分に上げなければならず、更に、膜の境界面における散
乱による特性低下を防止する為、膜の面粗さ及び整合性
を向上させなければならない等の技術的難点の存在が知
られている。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、フィルタ以外の手段により励起光をカットすること
ができるＤＮＡ塩基配列決定装置を提供することであ
る。

【００１２】

【課題を解決するための手段】前記課題を解決するため
に、本発明では、ＤＮＡ断片用の多数の泳動路を有す
る、垂直に保持される平板型ゲル電気泳動手段、該電気
泳動装置の泳動路に、該電気泳動装置の横方向から該泳
動路と直交するように、レーザ光を照射する光励起用の
レーザ光照射手段、レーザ光によって照射されたＤＮＡ
断片から発生された蛍光を検出し電気信号に変換する蛍
光検出手段とからなるＤＮＡ塩基配列決定装置におい
て、前記蛍光検出手段と泳動板との間に偏光板が設けら
れていることを特徴とするＤＮＡ塩基配列決定装置を提
供する。前記偏光板はＳ偏光成分を遮断する偏光板であ
る。

【００１３】

【作用】散乱体であるゲルからの散乱光は励起光の偏光
特性を保存し（直線偏光）、蛍光体による蛍光は偏光特
性が解消する。本発明では、この特性に着目し、蛍光検
出手段の前にＰ偏光板を配置することにより、励起光を
カットし、蛍光だけを透過させることに成功した。

【００１４】

【実施例】以下、図面を参照しながら本発明を更に詳細
に説明する。

【００１５】図１は本発明のＤＮＡ塩基配列決定装置の
模式的構成を示す部分概要斜視図である。蛍光検出手段
自体は特に限定されない。従来から光学式のＤＮＡ塩基
配列決定装置において蛍光検出に使用されてきた蛍光検
出手段あるいは、それ以外の新規な構成を有する蛍光検
出手段でも全て使用できる。

【００１６】図１に示された蛍光検出手段は、図５に示
された蛍光検出手段と類似して、集光レンズ１０と受光
素子１２とから構成されている。この集光レンズ１０と
泳動板７４との間に偏光板１４が配置されている。言う
までもなく、蛍光検出手段はこの偏光板１４を構成部品
の一つとして包含することができる。従って、偏光板１
４の配設位置は図示されたものに限定されない。レンズ
１０と受光素子１２との間であってもよい。更に、従来
の波長カットフィルタと併用することもできる。

【００１７】前記のように、本発明のＤＮＡ塩基配列決
定装置で使用するレーザ光は波長４８８ｎｍの直線偏光
レーザである。このレーザ光がゲル電解質層を通過する
際、ゲルからの散乱光は励起光の偏光特性を保存してい
る。すなわち、散乱光は直線偏光である。これに対し
て、蛍光体からの蛍光は偏光方向が変化し、Ｐ偏光成分
を多く含んでいる。すなわち、蛍光体からの蛍光は偏光
特性が解消している。

【００１８】従って、図２に示されるように、Ｓ偏光成
分を遮断し、Ｐ偏光成分だけを透過させる偏光板を使用
すると、波長４８８ｎｍの励起用直線偏光レーザによる
波長４８８ｎｍのゲル散乱光は偏光板により遮断され、
波長５２０ｎｍの蛍光だけを透過させる。

【００１９】これに対し、図３に示されるように、Ｓ偏
光成分を透過させる偏光板を使用すると、ゲル散乱光お
よび蛍光の両方とも透過してしまい所期の目的を達する
ことができない。従って、本発明では必ずＳ偏光成分を
遮断する偏光板を使用しなければならない。

【００２０】偏光板自体は当業者に公知であり、特に説
明を要しないであろう。従って、本発明の装置では従来
から使用されている全ての偏光板を使用することができ
る。例えば、プラスチック偏光板などを好適に使用する
ことができる。

【００２１】

【発明の効果】以上説明したように、本発明によれば、
偏光板を使用することにより、励起光と蛍光の波長が接
近していても、蛍光だけを効果的に、しかも、確実に蛍
光検出手段へ透過させることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のＤＮＡ塩基配列決定装置の模式的構成
を示す部分概要斜視図である。

【図２】Ｐ偏光成分を検出する偏光板の模式図である。

【図３】Ｓ偏光成分を検出する偏光板の模式図である。

【図４】特開昭６３−２１５５６号公報に開示されたＤ
ＮＡ塩基配列決定装置の模式的構成図である。

【図５】各泳動路毎に、フィルタ，集光レンズおよび受
光素子からなる蛍光検出手段を配列したＤＮＡ塩基配列
決定装置の一例の模式的構成図である。

【図６】波長４８８ｎｍの励起光と波長５２０ｎｍの蛍
光の強度と波長の関係を示す特性図である。

【符号の説明】

１０集光レンズ１２受光素子１４偏光板

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＤＮＡ断片用の多数の泳動路を有する、
垂直に保持される平板型ゲル電気泳動手段、該電気泳動
装置の泳動路に、該電気泳動装置の横方向から該泳動路
と直交するように、レーザ光を照射する光励起用のレー
ザ光照射手段、レーザ光によって照射されたＤＮＡ断片
から発生された蛍光を検出し電気信号に変換する蛍光検
出手段とからなるＤＮＡ塩基配列決定装置において、前記蛍光検出手段は偏光板を有することを特徴とするＤ
ＮＡ塩基配列決定装置。
【請求項２】偏光板はＳ偏光成分を遮断する偏光板で
ある請求項１のＤＮＡ塩基配列決定装置。
【請求項３】レーザ光源は、波長４８８ｎｍの直線偏
光レーザ光を発生するアルゴンイオンレーザであり、Ｄ
ＮＡ断片を標識するための蛍光体としてＦＩＴＣを使用
し、この蛍光体に前記のレーザ光が照射されると、ここ
から波長約５２０ｎｍの蛍光が発生される請求項１のＤ
ＮＡ塩基配列決定装置。