JPH07121873B2 - 鳥感染性気管支炎ワクチン - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規な鳥感染性気管支炎ワクチン、生もしく
は失活した鳥感染性気管支炎ワクチンの製造方法、およ
び感染性気管支炎に対する鳥の免疫化方法に関する。

鳥類の冠ウイルス（corona virus）は、気管支雑音、
咳、くしやみおよび鼻汁排出を特徴とする若い雛および
成長雛における急性の高度感染性呼吸病に対する作用因
子となることが知られている。感染性気管支炎（IB）と
呼ばれるこの病気は、特に若い雛において高い死亡率を
もたらし、さらに腎臓および繁殖管に影響を与え、後者
の損傷はそれぞれ飼育種の鶏における卵の産卵低下をも
たらしうる。多くの場合、この産卵低下症は下痢性腸炎
を伴う。

雛は唯一のIBウイルス（IBV）の天然宿主であると考え
られていたが、最近七面鳥からもこのウイルスが単離さ
れた。鳥類のIBVの他に、七面鳥の冠ウイルス腸炎を引
起こす因子（CET,幼鶏病）は他の鳥類の冠ウイルス種類
として記載されている。

鳥類におけるIBを抑制するため、ワクチンが大規模に使
用されている。たとえば、ブロイラーの雛、および産卵
種および育成種の若鳥や雛の免疫化のために、主として
生の減成ワクチンの投与が行われている。生ワクチンウ
イルスの種類は、それらの免疫学的性質の他に、その抗
原スペクトルおよび低病原性をも考慮して選択されてい
る。たとえば、コネクチカツト（たとえばコネクチカツ
ト・アイソレートA5968）またはマサチユーセツツ（た
とえばバウデツト型IBV42）のような特定の血清型（ser
otype）を含有するワクチンが文献に記載されている
が、これらは同族型に対してのみ保護を与えるものであ
る。また、たとえばＨ株として知られる比較的巾広い抗
原スペクトルを有することが示された特定のウイルス株
から得られるワクチンも使用される。

生ワクチンでは、互いに異なる複数のIB血清型の組合せ
も試みられているが、大抵の場合相互の反応の結果各血
清型に対して与えられる保護は最適ではなかつた。

したがつて、これらのしばしば使用されるIBウイルス株
もしくはその組合せに基づく従来のIBワクチンは、IBの
発生に対し完全な免疫を与えないと思われる。

しかしながら、本発明による新規なIBワクチンは、驚く
ことに感染性気管支炎に対し一層効果的である。

これらの新規なワクチンは、雛の赤血球を自然に血球凝
集させる（hemagglutinate）感染性気管支炎ウイルスか
ら得られることを特徴とする。

雛の赤血球を自然に血球凝集する性質を有するIBウイル
スは、たとえばマサチユーセツツ型およびコネクチカツ
ト型の各種のIBV血清型の中から生ずることが判かつた
が、さらに新しい血清型に属するウイルスも確認され
た。

雛の赤血球の自然血球凝集を示すウイルス株の免疫能力
は、同じそれぞれの血清型に属するが赤血球を自然に凝
集させないウイルスの免疫能力よりもはるかに大きい。

さらに、雛の赤血球を自然に凝集させるIBウイルスの組
合せから得られるIBワクチンは、雛の赤血球の凝集をも
たらさない異なる血清型からのIBV株の組合せに基づく
ワクチンよりも、良好な保護を示すことが判つた。

さらに、本発明によるIBワクチンは、１種もしくはそれ
以上の非血球凝集性IBウイルスから得られるワクチンと
組合せた場合、ならびにマレツクス病，ニユーキヤツス
ル病または産卵低下病に対するワクチンのような他のウ
イルス単離物から得られるワクチンと組合せた場合、優
秀な免疫化特性を示した。

本発明による新規なIBワクチンは、たとえば雛の赤血球
を自然に血球凝集させる性質を有する新規なIBウイルス
株から得ることができ、これらは英国ウエイブリツジ
州、ニユーハウ所在のセントラル・ベテリナリイ・ラボ
ラトリーに寄託され、寄託番号VLO10110/AVI/3;VLO1011
0/AVI/4;VLO10110/AVI/5;VLO10110/AVI/6およびVLO1011
0/AVI/7として登録されており、そしてこれらは、D274,
D1466,D580,246Gおよび249Gの部内名称でそれぞれ示さ
れた種類に対応するものである。

新規なIBV株は種々の血清型に属することが示された。2
46GおよびD580株はそれぞれマスチユーセツツ型および
コネクチカツト型である。D274,249GおよびD1466株は新
規の従来未報告の血清型に属する。第Ｉ表には一定の血
清希釈されたウイルス法を用いる卵におけるウイルス中
和試験（VN）の結果を要約し、これらは新規な単離物D2
74およびD1466のいずれもマシチユーセツツ血清型に属
せず（オランダワクチン株H₅₂によつて、これら実験に
おいて示される）またＨ株ワクチンによる包含されない
ような北アメリカIB血清型にも属さないことを示してい
る。血球凝集株D274は、新たな血清型D207に分類するこ
とができ、血球凝集性ウイルスD1466はD212型に属す
る。249G株はD274株と同じ血清型である。これは、新規
な単離物と、特定の病源菌を含有しない（SPF）雛で調
製された特定抗血清との間の交差中和実験〔雛の胚繊維
芽（CEF）細胞におけるプラツク減少試験を使用する〕
で示される。

新規な血清型IBV株D274,249GおよびD1466に対する適切
なワクチン化が可能なことは、雛の単離物におけるこれ
ら血清型の高度の出現によつて示される。第３表には、
新規な血清型IBウイルス（3A）に対する抗体を有する群
の相対数および群（3b）から各血清型のIBウイルスが単
離される頻度を示す。

これら新規なウイルスは、鳥類の冠ウイルスとして同定
しうる次の性質によつて特徴づけられる： 1.） これらはRNA型の核酸を有し、雛の胚腎臓細胞（C
EK）培養物におけるウイルス再生は、培地に対する５−
フロオロデスオキシ−ウリジンの添加によつてたいして
影響を受けなかつた。

2.） これらウイルスはリピド溶剤に対し鋭敏である。
SPE胚子含有卵内でウイルスを増殖させて得られた感染
性羊水−尿膜液（AAF）をクロロホルムで処理したとき
には、その結果として、感染性タイターが著しく減少し
た。これは、必須リピドを含有するエンベロプウイルス
が有する典型的な性質であり、また、鳥類の冠ウイルス
の特性でもある。

3.） 感染AAFを超遠心分離により濃縮して作成したウ
イルス標本を電子顕微鏡で検査すると、冠ウイルスに特
徴的な寸法および形状を有しかつ表面に典型的な突起部
（長さ15〜20nm）を有するウイルス粒子が認められた。
突起部を除く該粒子の直径は75〜120nmであつた。

4.） ゲル拡散試験を用いることにより、これらウイル
スは公知の鳥類冠ウイルス、たとえばIBV比較株ダイデ
ツドと共通の抗原を含有することが示された。しかしな
がら、他の鳥類ウイルスと共通の抗原は、検出すること
ができなかつた。SPF雛における新規株に対し調製され
た特定の抗血清は、鳥類冠ウイルス以外の鳥類ウイルス
から生成された抗原と反応しなかつた。

5.） 新規なウイルス株は、感染細胞の細胞質中で増殖
する。試験管内の系で適するものは、次のものである： ☆胚子含有のSPF卵（好ましくは尿膜経路によつて感染
される）； ☆気管支器官培養物； ☆雛の細胞および ☆雛の胚細胞（好ましくはCEK細胞）。

上記のデータにより、鳥類の冠ウイルスに属しそして他
の鳥類ウイルス（たとえば鳥類インフルエンザウイル
ス、ニユーキヤツスル病ウイルス（NDV）REVウイルス、
アデノウイルス、ロイコレスウイルス、細網内皮症ウイ
ルス、鳥類脳脊髄炎ウイルス、感染性喉頭気管支ウイル
スを含むヘルペスウイルス、マレク病ウイルス、鳩およ
び七面鳥のヘルペスウイルスおよび感染性滑液のう病ウ
イルスから区別される前記の新規ウイルスが充分に同定
できた。

さらに、本発明は、上記した自然血球凝集を示す鳥類の
冠ウイルスのワクチンの製造に関するものである。

このウイルスは、胚子含有のSPF雛卵または、好ましく
は鳥の組織からの細胞培養物で増殖させることができ
る。

弱毒化生ワクチンを生産すべき場合、減成は、ウイルス
単離物を胚子含有卵または細胞培養物（好ましくはCEK
細胞）に適合させかつウイルスをこれら培養物中に、た
とえば10〜200倍で通すことにより行なうことができ
る。安全な生ワクチンを製造するためのその他の方法
は、鳥類の冠ウイルスの適当なクローンを選択しかつ培
養することであり、ただしこれらはまだ自然凝集の性質
を有するものとする。

新規なウイルスから失活ワクチンを製造するには、AAF
もしくは細胞培養液をたとえばホルムアルデヒドまたは
β−プロピオラクトーンによつて失活させることができ
る。

失活させかつ必要に応じpHを調整し失活剤を中和した
後、失活抗原をアジユバント（助剤）と混合することが
できる。アジユバントは、たとえば水酸化アルミニウム
または鉱油〔たとえばマルコール（登録商標）82〕もし
くは植物油と１種もしくはそれ以上のツイーン（登録商
標）80およびスパン（登録商標）80とよりなる組成物で
あり得る。

生ワクチンは点眼薬，点鼻薬，飲料水または噴霧法によ
つて１日令〜産卵令（約18週）にわたる年令の鳥に投与
することができる。

通常、失活ワクチンは、10〜20週令において皮下注射ま
たは筋肉内注射によつて投与することができる。

生ワクチンについては、鳥１羽当りlog3〜log7EID₅₀の
範囲、好ましくはlog4〜log5EID₅₀の範囲の投与量を使
用することができる。

失活ワクチンは、鳥１羽当りlog5〜log8EID₅₀、好まし
くはlog6〜log8EID₅₀の抗原当量を含有することができ
る。

ワクチン（生または失活）が１種より多い冠ウイルス株
を含む場合、それぞれの株は上記した投与量レベルで存
在させるべきである。

新規な鳥類冠ウイルスの１種もしくはそれ以上とたとえ
ばNDV感染性滑液のう病ウイルス、EDS76ウイルス、アデ
ノもしくはレオウイルスのような特に失活ワクチンにお
ける１種もしくはそれ以上の無関係の鳥類ウイルスとの
組合せも、本発明の一部を構成する。

以下、本発明を実施例により説明する。

実施例Ｉ 感染性気管支炎ウイルスの単離 次の手順を用いて、盲種鶏および産卵鶏の群において単
離を行なつた： 気管支採集物および／または盲腸領域からの腸掻取り物
を、抗生物質を含有するトリプトースホスフエートプロ
ス中に懸濁させた。少なくとも10個の９〜11日令の胚子
含有SPF雛卵に、各ウイルス試料の懸濁物を尿膜経路に
よつて接種した。接種の48〜72時間後、尿膜液とCAMと
を10個の卵のうち４個から収穫し、さらにSPF卵に対し
接種した。少なくとも３連の盲実験を各試料につき行な
つた。各実験における残余の卵（通常10個のうち６個）
を７日間培養し、そしてまだ生存している胚を発育阻害
およびIBに典型的な病巣につき検査した。

実施例II 生ワクチン A. ウイルスの増殖 胚子含有SPF雛卵（10〜11日培養）に、尿膜孔経路で、
種ウイルスの50％卵感染投与量（EID₅₀）のlog3〜log4
を接種した。卵を接種の18〜24時間後に検査し、非特異
性の死滅胚を捨てた。18〜72時間の培養時間（使用した
ウイルス株に応ずる）の後、AAFを収獲し、遠心分離お
よび／または過によつて清澄させ、最終的に適当濃度
の抗生物質（示した場合）と混合した。

B. ワクチンの製造 次いで、AAFをそれ自体公知の方法により医薬製剤まで
処理することができる。安定化は、たとえばソルビトー
ル、マニトールなどの炭水化物またはアルビミン、カゼ
インのような蛋白質または適当な混合物の如き適当な安
定剤の添加によつて行なうことができる。このAAFを−3
5℃以下の温度で凍結させ、次の処理まで貯蔵すること
ができる。或いは、このAAFを後の処理まで、＋４℃で
貯蔵することもできる。ウイルス含量を測定するため、
試料を採集する。安定化されたAAF（材料が凍結されて
いる場合は解凍した後）を１〜2mlの量で凍結乾燥瓶中
に満たす。ウイルス含量は、凍結乾燥後のタイターが少
なくとも鳥１羽当り4.0log EID₅₀の投与量となるように
調整する。この試験瓶を減圧下もしくは窒素下に凍結乾
燥後封止する。

実施例III 失活ワクチン A. ウイルスの製造 II Aの項で記載したと同様にウイルスを増殖させる。失
活させる前の物質の貯蔵およびその後の処理は、−35℃
未満の温度で行なうことができる。

B. ウイルスの失活 凍結AAFを解凍させ、試料を採集してウイルスタイター
（EID₅₀）を決定し、AAFを最終濃度0.4％までのホルマ
リンの添加により失活させる。室温にて24時間後、ホル
マリンをメタ亜硫酸ナトリウムによつて中和することが
できる。鋭敏なSPF雛の胚にもしくはCEF培養物に少なく
とも１回接種することにより、試料を失活につき試験す
る。失活のための他の方法は、β−プロピオラクトン、
エチレン−イミンまたはその誘導体の使用である。失活
したAAFを、タイターの要求に応じて希釈または濃縮す
る。濃縮は、失活に先立つて行なうことができる。適す
る方法は、限外過またはポリエチレングリコール沈澱
による濃縮である。失活AAFは＋４℃で貯蔵することが
できる。

C. ワクチンの製造 失活した油性エマルジヨンワクチンを製造するため、ツ
イーン（登録商標）80を3.5％の濃度で失活抗原懸濁物
へ加える。抗原含量を鳥１羽当り少なくとも7.0log EID
₅₀の投与量に調整する。抗原物質は、酵素免疫法によつ
て決定することができる。次いで、懸濁物をアジユバン
トの油相中へ、油対水の比70:30もしくは55:45にて乳化
させる。アジユバントの組成は次の通りである。

マルコール（登録商標）52 90 ％ ツイーン（登録商標）80 3.5％ スパン（登録商標）80 6.5％ 水相の平均粒子寸法は、1.0μｍ未満である。

実施例IV 混合ワクチン A. 混合生ワクチン 混合生ワクチンを製造するため、異なるウイルス株（実
施例IIにより調製）を含有するAAFを、各特定株に対す
る所要の最少ウイルス含量が最終生産物中に達成される
ように混合せねばならない。

B. 混合失活ワクチン 実施例II Aにしたがつてウイルス株を増殖させ、−35℃
にて貯蔵する。各ウイルス株の抗原を実施例II Bにした
がつて失活させ＋４℃にて貯蔵する。ツイーン（登録商
標）80を3.5％の濃度にて各抗原懸濁物へ加える。各特
定ウイルス懸濁物の抗原含有量は、各ウイルス株が１羽
当り少なくとも7.0log EID₅₀の抗原当量を有するワクチ
ンの投与量にて含有するように調整される。多価ワクチ
ンを実施例III Cに記載したように乳化させる。

乳化させる前に水相を混合するか、或いは個々の抗原を
混合前に別々に乳化させることもできる。

実施例Ｖ 雛赤血球の血球凝集 ２容量の感染AAF（実施例I Aにしたがつて調製）または
感染組織培養物の上澄液を、１容量の２％雛赤血球懸濁
物と室温において混合した。

凝集は約２分間かかり、場合によつて５分以内で起こ
る。血球凝集は、＋４℃で培養して促進させることがで
きる。

ブロメリアン（bromelian）処理によつて示されるよう
に、ヘムアグルチニンはウイルス粒子と結合する。

実施例VI 血球凝集の抑制（HI） A. 新規なIB株によつてもたらされる雛赤血球の血球凝
集が特異的であつてウイルス抗原によるものかどうか
は、赤血球を加える前に特定ウイルスに対し特定の抗血
清を添加することにより、血球凝集反応の抑制で示すこ
とができる。

SPF卵に接種の48時間後、血球凝集性の株D274を接種
し、培養し、そしてAAFを回収した。

未処理AAFをそのまま、或いは血清もしくは抗血清で1:1
に希釈して使用した。その後、雛の赤血球を加えた。そ
の結果を下記の表に示す。

B. 新規なIBウイルスはヘムアグルチニンを含有し（ブ
ロメリアン処理によつて示される）かつ各種の血清型に
属するため、これら新規ウイルス間の区別を行なうため
にHI試験を用いることもできる。

使用する方法はアレクサンダーにより〔Ｄ・Ｊ等（Avia
n Pathonogy第５巻、第125〜134頁（1976））〕に記載
されている。各抗原を処理するため、ホスホリパーゼＣ
が使用されている。

このように得られるタイターは、2logとして表わされ
る。データを下記の表に示す。

実施例VII ワクチン化実験SPF雛 A. ウイルスの増殖およびワクチンの製造 D207株（非血球凝集性（HA−））およびD274株（血球凝
集性（HA＋））のウイルスをSPF卵上で培養し、54〜52
個の卵の試験でそれぞれ減成させた。これら弱毒化ウイ
ルス株のワクチンを実施例IIIにしたがつて調製した。

B. ワクチン化 ６週令のそれぞれ10羽のSPF雛よりなる２つの群に、点
眼によつて上記各ワクチンの4.0log EID₅₀をワクチン接
種した。鶏を隔離容器に収容し、１週間間隔で出血させ
て血清試験を行なつた。これら血清のHIタイターは、実
施例VI Bに記載した方法にしたがいIBV D274から調製さ
れた抗原を用いて決定した。表に示した結果は、上記２
つの群のワクチン化鶏において12週間後、D274抗原に対
し免疫の発現を示した。非ワクチン化鶏を用いた比較も
この実験に含ませた。

同じ２群のワクチン化鶏の血清において、同族株D274
（52^e試験に対する中和反応（＞4.0log）を試験した。
反応を示す動物の数（ワクチン化された10匹のうち）を
下記の表に示す。

C. 免疫実験 ワクチン化の12週間後、ワクチン化された群およびワク
チン化されない群の鶏をD274株（52回の試験の後）の4.
0log EID₅₀で免疫感染にかけた。４日後、鳥の気管支部
分を標準技術による免疫螢光分析（IFT）によつて組織
学的に検査した。顕微鏡的病巣または陽性IFTを示す鳥
の数（ワクチン化された10羽のうち）を下表に示す。

新規な血球凝集性株D274から調製されたワクチンは、ワ
クチン化の１週間後に早くも高レベルのHIおよび中和性
抗体タイターを発生し、これは少なくとも12週間にわた
り保護性であることが知られたレベルに維持されると結
論される。これは、免疫反応に対するD274グループの10
0％保護によつて確認することができた。

これに対し、同じ血清型の非血球凝集性D207株は、実験
期間中に極めて低いレベルのHI抗体しか発生しなかつ
た。さらに、中和抗体タイターは血球凝集性D274でワク
チン化されたグループと比較してワクチン化後12週間に
わたり著しく低いものであり、これはD207群における著
しく低い保護割合（僅か約50％）によつて確認される。

実施例VIII 混合生ワクチンによるワクチン化 A. ウイルスの繁殖およびワクチンの調製 血球凝集性D274株およびD1466株のウイルスを実施例I A
に記載した方法にしたがつて増殖させ、そしてこれらの
１価および多価ワクチンを実施例II BおよびIV Aにした
がつてそれぞれ4.0log EID₅₀の各株を用いて調製した。

B. ワクチン化 10週令のSPF雛の４群につき、それぞれを４個の別々の
隔離装置内に収容した。これら鶏に点眼によつてワクチ
ン化した。グループＡにはD274株ワクチンをワクチン接
種し、グループＢにはD1466ワクチンを接種し、グルー
プＣには混合ワクチンを接種し、そしてグループＤは非
ワクチン化比較群とした。

C. 免疫化の試験 ワクチン化の当日およびその後2,4,6および８週間目に
血液を集めた。血清を、異なる原型株（M41,D274および
D1466）により調製された抗原を用いて、同質および異
質のHI抗体反応につきここに試験した。これらの結果を
第９表に示す。

D274をワクチン接種した雛（グループＡ）は、実験の終
了まで２週間目から同質HI抗体の高レベルに反応した。
ワクチン化後２週間および４週間にて、異質抗原M41お
よびD1466に対し顕著な交差反応が観察され、これは６
〜８週間で消失した。グループＢの雛は比較的低いタイ
ターレベルにおいて同様な反応を示した。同質の反応
は、少なくとも実験の終了時（接種後８週間後）まで保
護レベルに止まつた。混合ワクチン（グループＣ）は両
ワクチン株に対し長期持続性の高レベルのHI抗体を誘発
した。M41抗原に対する顕著な異質反応も、接種後２週
間および４週間で見ることができる。早期の異質反応
は、抗原特異性のグループに対し反応する免疫グロブリ
ンの高割合によつて説明することができる。この実験か
ら判るように、２種の血球凝集性株D274およびD1466は
単一生ワクチンおよび混合生ワクチンの両者において免
疫能力を表わす。

実施例IX ワクチンのフイールド実験 A. ウイルス増殖およびワクチン製造 非血球凝集性H120,D207株および血球凝集性D274株ウイ
ルスの生ワクチンを実施例VII Aに記載したように調製
した。

B. ワクチン化 白色レグホーンおよび褐色種鶏の群に、１日令にてH120
ワクチンを接種した。10週令にて白色レグホーンおよび
褐色種の鶏にそれぞれD207およびD274のワクチンを接種
した。投与量は、鳥１羽当り4.5log EID₅₀とした。平均
グループサイズは15,000羽の鳥とし、ワクチンはスプレ
ーによつて投与した（ナツプザツク−スプレイヤー）。

C. 採血 D207およびD274ワクチンを接種した当日、血液サンプル
を各群につき採取し、血清学的検査を行ない、これをワ
クチン化の後４週間反復した。

D. 免疫化比較 中和係数（NI）を保護のパラメータとして使用した。各
血清型に対し4logより大きい平均NIを、有効ワクチン化
に関連すると考えた。

この表において、保護性であることが知られた中和反応
に反応する群の割合は、D207ワクチングループと比較し
てD274グループにおいて著しく高いものであることが示
される。

実施例Ｘ ワクチン化フイールド実験の際のHI抗体タイターの発現
および分布 血球凝集性ワクチン株D274を接種した後の産卵鶏および
盲種鶏グループの血清学的反応を監視した。

平均サイズ15,000羽の鳥を有する全部で137群に、10〜1
2週令においてナツプザツクスプレー投与によりD274生
ワクチン（血清型Ｄ−207）の単一投与を接種した。

マサチユーセツツ型のワクチン接種を同じ年令のグルー
プ（H120）と約15週令（H52）において行なつた。各グ
ループをそれぞれの血清型マサチユーセツツＤ−207お
よびＤ−212に対し18〜20週令においてHI抗体につき試
験した。

HIタイターの分布パターンを第１図に示す。すなわち第
１図は、Ｄ−274生ワクチンを接種した後の３種のIB血
清型に対するHI抗体タイターの分布を示すグラフであ
る。137グループのうち16グループを、38週令まで追跡
し、HIタイターを４週間間隔で測定した。その結果を第
２図に示す。すなわち第２図は、１日令にてH120をワク
チン接種し、16週令にてH52を接種し、（マサチユーセ
ツツ型）、および12週令にて、D274を接種した16の群に
おけるHIタイターの観察結果を示すグラフである。137
グループのうち86％は７より大きいHIタイターを示し、
63％は８より大きく、かつ25％は血清型Ｄ−207に対し
９より大であつた。非血球凝集性株を２回接種した後、
マサチユーセツツ血清型に対する反応は劣つていた。グ
ループの66％は７より小さいHIタイターを有した。Ｄ−
212血清型に対する反応（ワクチン化なし）は予想通り
低いものであり、グループの62％は７より小さいHIタイ
ターを有した。

第２図から判るように、Ｄ−274株を一回ワクチン接種
した後に達成されるHIタイターは慣用のマサチユーセツ
ツワクチンを２回接種して誘発されるものと比較してよ
り高いものであると結論することができる。

実施例XI 雛赤血球の血球凝集（▲RBC^′ _Ｓ▼） 実施例ＶおよびVIにおいて行なつた迅速プレートHA試験
で示されたと同様な新規IBV株の自然血球凝集活性を、
マイクロタイター板において、ゆつくりしたHA試験によ
り一層定量的に試験し、この場合自然血球凝集は必らず
しも示さない。

マイクロタイター板における定量的な緩徐のHA試験によ
る血球凝集性株と非血球凝集性株との間の差は望ましい
ものであるため、濃縮されかつ部分的に精製されたウイ
ルス懸濁物を使用してHA活性を示した。

A. ウイルス懸濁物の調製 10日令の胚子含有卵からの尿膜液収獲物を、接種の24〜
48時間後に回収した。AAFを1000×ｇにて10分間遠心分
離によつて清澄させた。SW−28ロータ（ベツクマン社）
を用い30,000×ｇにて60分間遠心分離して35ml AAFのウ
イルス含量をペレツト化させた。このように得られたペ
レツトを、1mlをPBS（燐酸緩衝塩水）中に再懸濁させ
た。

B. 血球凝集の試験 マイクロ測定板においてウイルス懸濁物の２倍の希釈系
列を作成した。25μのRBC（１％）をウイルス希釈物
の最終容量50μへ加えた。プレートを４℃にて２〜18
時間培養の後に計数した。タイターは、75％より多い凝
集を示す最高希釈の再現値として示す（ｎ＝実験の回
数）。結果を第11表に要約する。

ここで試験した３種の自然血球凝集性株Ｄ−274,246Gお
よびＤ−1466は全て35倍の濃縮工程の後２〜８のHAタイ
ターを示すのに対し、未感染のAAF（陰極比較）と非血
球凝集性比較株M41は同じ処理の後陰性のままであつ
た。

これらの実験は、ゆつくりしたプレートHA試験および迅
速なプレートHA試験の両者により新規なIBV株の血球凝
集が見られることを示している。濃縮工程を正規に使用
して、濃縮しかつIBV粒子を部分的に精製した。これ
は、上記の株のHA特性がウイルス粒子に関連することを
示している。

【図面の簡単な説明】

第１図はHIタイターの分布パターン図であり、 第２図は４週間間隔で測定したHIタイターのグラフであ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭48−5923（ＪＰ，Ａ) 特公 昭55−41208（ＪＰ，Ｂ２) 平戸勝七等著「獣医微生物学」（昭43− ７−10）株式会社養賢堂第654頁

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】雛鳥の赤血球を自然に血球凝集させる鳥感
   染性気管支炎ウイルスから得られることを特徴とする鳥
   感染性気管支炎ワクチン。
2. 【請求項２】雛鳥の赤血球を自然に血球凝集させる鳥感
   染性気管支炎ウイルスの組合せから得られることを特徴
   とする特許請求の範囲第１項に記載のワクチン。
3. 【請求項３】鳥感染性気管支炎ウイルスが、セントラル
   ・ベテリナリィ・ラボラトリー（英国ウエイブリッヂ・
   ニューハウ所在）に登録番号VLO10110/AVI/3;VLO10110/
   AVI/4;VLO10110/AVI/5;VLO10110/AVI/6及びVLO10110/AV
   I/7で寄託されたウイルス株から選択されることを特徴
   とする特許請求の範囲第１項または第２項に記載のワク
   チン。
4. 【請求項４】１種もしくはそれ以上の赤血球凝集性の鳥
   感染性気管支炎ウイルスから得られるワクチンをさらに
   含有することを特徴とする特許請求の範囲第１項〜第３
   項のいずれかに記載のワクチン。
5. 【請求項５】a.雛鳥の赤血球を自然に血球凝集させる１
   種もしくはそれ以上の鳥感染性気管支炎ウイルス株を、
   適当な培地における培養で増殖させ、 b.感染した培養物を培養培地から収得し、 c.収得した物質を、必要に応じウイルスを弱毒化または
   失活させた後、処理して鳥感染性気管支炎に対するワク
   チン製剤を製造することを特徴とする生のもしくは失活
   した鳥感染性気管支炎ワクチンの製造方法。
6. 【請求項６】鳥感染性気管支炎ウイルス株が、セントラ
   ル・ベテリナリィ・ラボラトリー（英国ウエイブリッヂ
   ・ニューハウ所在）に登録番号VLO10110/AVI/3;VLO1011
   0/AVI/4;VLO10110/AVI/5;VLO10110/AVI/6及びVLO10110/
   AVI/7で寄託されたウイルス株から選択されることを特
   徴とする特許請求の範囲第５項に記載の方法。
7. 【請求項７】雛鳥の赤血球を自然に血球凝集させる１種
   もしくはそれ以上の鳥感染性気管支炎ウイルスから得ら
   れらワクチンを投与することを特徴とする、産卵する鳥
   を感染性気管支炎に対し免疫化させる方法。
8. 【請求項８】鳥感染性気管支炎ウイルス株が、セントラ
   ル・ベテリナリィ・ラボラトリー（英国ウエイブリッヂ
   ・ニューハウ所在）に登録番号VLO10110/AVI/3;VLO1011
   0/AVI/4;VLO10110/AVI/5;VLO10110/AVI/6及びVLO10110/
   AVI/7で寄託されたウイルス株から選択されることを特
   徴とする特許請求の範囲第７項に記載の方法。
9. 【請求項９】鳥１羽当りlog3〜log7EID₅₀の範囲の投与
   量にて生ワクチンを投与することを特徴とする特許請求
   の範囲第７項または第８項に記載の方法。
10. 【請求項１０】鳥１羽当りlog5〜log8EID₅₀の範囲の投
    与量にて失活ワクチンを投与することを特徴とする特許
    請求の範囲第７項または第８項に記載の方法。