JPH07121868B2

JPH07121868B2 - 腹膜透析用浸透剤

Info

Publication number: JPH07121868B2
Application number: JP61214979A
Authority: JP
Inventors: エリアス・クレイン
Original assignee: リサーチ・コーポレイション・テクノロジーズ・インコーポレイテッド
Priority date: 1985-09-10
Filing date: 1986-09-10
Publication date: 1995-12-25
Anticipated expiration: 2010-12-25
Also published as: EP0218900A3; US5039609A; DK433086D0; CA1341151C; JPH08131780A; DK168692B1; EP0218900A2; US5869444A; JPS6260563A; EP0218900B1; DE3683583D1; DK168080C; DK2993A; DK168080B1; DK2993D0; DK433086A

Description

【発明の詳細な説明】［発明の分野］この発明は、新規腹膜透析法に関するものである。さら
に具体的には、腹膜透析物（透析液）中における浸透剤
としての比較的低分子量のペプチドの使用に関するもの
である。

［先行技術および発明の経緯］哺乳動物の腎臓の正常な機能としては、一定の酸−塩基
および電解質均衡を維持し、過剰の体液を除去し、血液
から望ましくない体の代謝産物を除去する作用が挙げら
れる。末期腎臓病を患う個体においてこの腎機能は正常
レベルの５％以下まで低下し得る。腎機能がこの点まで
減少した場合、生命を維持するためにし腎臓機能に代わ
る人工的手段を用いなければならない。これは臨床的に
は透析の使用により達成される。このための最も一般的
な方法の１つは血液透析であり、この方法の場合患者の
血液を人工腎臓透析機に通すことになる。この機械にお
いて合成非透過性膜は人工腎臓として作用し、患者の血
液をその片側に接触させ、膜の反対側に透析流体または
透析物（剤）を接触させる。従って、これは患者の血液
中の望ましくない産物が自然に拡散により膜から流体中
へ通過するような組成となっている。こうして血液は、
本来腎臓が機能する場合と実質的に同じ方法で浄化さ
れ、そして血液は患者の体内へ戻される。この透析方法
を用いた場合、患者は物理的には週に何回も数時間機械
に「つながれ（hooked up）」なければならない。明ら
かな理由により、この方法は有効ではあるが多くの不都
合さを示す。

血液の体外処置を必要とする血液透析にともなう幾つか
の不都合さは、患者自身の腹膜を必要とされる半透膜と
して使用する技術を用いることにより克服される。腹膜
は多数の血管および毛細血管を有する体腔の膜質内層で
あるため、天然半透膜として作用することができる。腹
壁のカテーテルにより透析溶液を腹腔へ導入する。透析
物を適当な期間滞留させることにより透析物および血液
管の溶質交換が行なわれる。血液から透析物への適当な
浸透圧勾配を与えることにより流体が除去され、血液か
ら水を流出させることができる。すなわち、適切な酸−
塩基および電解質および流体の均衡を血液に戻し、また
透析溶液を体腔からカテーテルにより簡単に排出させ
る。複数のタイプの腹膜透析が存在するが、連続通院腹
膜透析（CAPD）として知られている技術が特に好まし
い。これは溶質および流体交換が行なわれている間患者
を機械につないでおく必要がないからである。必要とさ
れる定坐期間は、透析溶液の注入および排出中のみであ
る。

腹膜透析の最も難しい面の１つであり、また最も重要な
面の１つは、必要な浸透圧勾配を達成するために透析物
中に含有させる適当な浸透剤を見つけることである。こ
こで用いられる浸透活性剤とは、水および毒性物質が腹
膜を通り透析溶液中へ移動するために必要な浸透勾配を
維持できる、透析溶液に存在する物質を意味する。適当
な剤は少なくとも２つの重大な基準を満たすべきであ
る。第１に、ある程度生物学的に不活性、すなわち非毒
性および代謝可能なものでなければならず、また第２
に、好ましくは腹膜から血液中へ急速に通過するべきで
はない。これは最大限外濾過勾配を維持させ、また血液
中において毒性または望ましくない物質の蓄積を防ぐこ
とになる。腹膜に置かれたほとんどすべての物質は、緩
慢なリンパ排出または腹膜透析により結局は循環系へ出
で行くため、毒性が存在しないということは特に重要で
ある。現在まで多くの様々な物質を用いて様々な成功も
おさめられてきたが、これらの要求を完全に満たす物質
はまだ知られていない。一般的に最も広く認められてき
た剤はグルコースである。グルコースは非毒性であると
いう利点を有し、また血液中に入った場合容易に代謝が
できる。しかしながら、これを使用した場合の主たる問
題点は、透析物から血液へ容易に取り込まれてしまうこ
とである。前述のように、物質はすべて結局は循環系へ
進むが、グルコースの場合、あまりにも急速に腹膜を通
るため、注入２〜３時間以内に浸透圧勾配はくずれるこ
とになる。これは限外濾過の方向に反転をもたらすこと
さえあり得、水が交換に許された時間の終わり近くに透
析物から再吸収されるという望ましくない結果をもたら
す。さらに、取り入れられるグルコースの量は、患者の
エネルギー摂取の大部分に相当し得、12〜35％の高さで
あり得る。これは非糖尿病患者の場合大した影響はない
が、グルコース耐性がすでに損なわれている患者の場合
重大な代謝負担であり得る。このように負担が加えられ
た結果、多くのCAPD患者で見られるように高血糖症およ
び肥満を併発し得る。糖尿病患者の場合、加えられたグ
ルコース負担に起因する低血糖症の危険を減ずるため
に、腹膜透析物にインシュリンを加えなければならない
という別の不都合さおよび危険にかかわることになる。

グルコースの使用はまた、透析物製造においても問題を
もたらす。一般に透析物の殺菌は、生理学的pH値でグル
コースのカラメル化をひき起こす加熱により行なわれ
る。これを償うために、透析物のpHを通常5.0〜5.5のpH
範囲に調節する。この低pH値は、体内での正常値よりか
なり低いため、流入時に苦痛を経験する患者もあり得、
また溶質浄化の低下をもたらす腹膜硬化の原因ともなり
得る［シュミット等、「アーカイブス・オブ・インター
ナル・メドウシン」（Arch.Int.Med.）、141巻、1265〜
1266頁（1980年）］。

これらの不利益があるため、浸透剤としてグルコースに
代わる適当なものを発見することが強く望まれる。多く
の物質が、生物学的に不活性であり、容易に腹膜を通過
せず、非毒性であり、適当な浸透圧を発揮するという基
準を満たすものとして提案されてきた。現在まで、これ
らの中でグルコースに代わる適当な代用物であることが
判明した物質はない。例えば、デキストラン［ジェシン
グ、「アクタ・メディカ・スカンジナビカ」（Acta Me
d.Scan.）、185巻、237〜239頁（1960年）］またはポリ
アニオン（米国特許4339433号）の使用が提案されてき
たが、それはこれらが高分子量であるため腹膜から血液
中への拡散が最少限になるからである。しかしながら、
溶質移動過程におけるリンパ系の役割が明らかに高分子
量自体の利点を制限する［アレン等、「アメリカン・ジ
ャーナル・オブ・フィジオロジー」（Amer.J.Physio
l.）、119巻776〜782頁（1937年）］。また、ポリアニ
オンについては、ほとんどが代謝可能であるため、これ
らの毒性作用が何であるかに関しては未知である。代謝
に関する同様の問題がソルビトール、キシリトールおよ
びグルコースポリマー類のような化合物にも認められ
る。非常にゆっくりと代謝されるソルビトールは、高浸
透圧性昏睡および致死の症例と関連性があるため［ラジ
ャ等、「アナルス・オブ・インターナル・メドゥシン」
（Ann.Int.Med.）、73巻、993〜994頁（1970年）］、も
はや使用されていない。またはキシリトールおよびグル
コースポリマーは共に血液中に蓄積する傾向があり不快
な副作用をともない得る［バジャト等、「トランザクシ
ョンズ・オブ・ジ・アメリカン・ソサエティー・オブ・
アーティフィシャル・インターメディエント・オーガン
ズ」（Trans Amer.Soc.Artif.Interm.Organs）、28巻、
280〜286頁（1982年）］。フルクトースは浸透能力の点
ではグルコースに匹敵するが、これもまた多くの同様な
不利益を示す。コストが高いため、普及するには至らな
かった。

グルコースと置き換えれれるものとして提案されたアミ
ノ酸の使用の方が前記のものより有望である。アミノ酸
は耐性良好であり、既知の有害な副作用を伴わない［オ
ーレン等、「ペリトネアル・ダイアリシス・ブレタン」
（Perit.Dial.Bull.）、３巻、66〜72頁］。アミノ酸は
低分子量であるため、質量ベースでグルコースよりも高
い浸透作用を発揮する。しかしながらこのことはまた、
結果として浸透勾配の急速な喪失の原因となる血液中へ
のかなり急速な摂取をもたらし得る。グルコースとは異
なってアミノ酸摂取は多くのCAPD患者に認められる蛋白
質喪失を補い得るという点で有益であり得るが、グルコ
ースと比べた場合にアミノ酸溶液のコストが非常に高い
という重大な不利益が存在する。さらに、アミノ酸を急
速に摂取するとかなりの窒素負担が生じるため、血中の
尿素窒素レベルが著しく増加する。すなわち、アミノ酸
ですら適当な代用物を提供するとは考えられない。

しかしながら、この発明は、グルコースに代わり安全で
有益なだけでなく経済的にも実行可能な浸透剤を用いて
腹膜透析方法に改善をもたらすものである。意外なこと
に、乳漿（ホエー、whey）蛋白質のような高品質蛋白質
を酵素加水分解することから得られる比較的低分子量の
オリゴペプチド類（300〜2000ダルトン）の混合物が、
腹膜透析溶液における有効な浸透剤として用いられ得る
ことが発見された。アミ酸溶液と比べて幾分高いペプチ
ド分子量が、血液中への急速な摂取が抑えるため、浸透
勾配をさらに効果的に維持し、また血液中の窒素の望ま
しくない増加を防ぐことができる。ペプチド混合物は最
終的には非常にゆっくりではあるが血清中に吸収される
ため、さらに高品質蛋白質由来の貴重な食餌補足物をも
たらす。結局、このペプチド混合物は浸透剤の安価で容
易に得られる原料を提供する。医薬目的に用いられる他
のペプチド混合物については既に記載がなされた。例え
ば米国特許第4427658号は乳漿蛋白質の酵素加水分解か
ら得られた蛋白質加水分解物について記載している。そ
の場合、小さなペプチドから大きなペプチドの分離を行
わずにほとんど全部の酵素加水分解を遂行することが要
求された。したがって、生成物は明らかに最終混合物中
に5000ダルトンまたはそれ以上のかなり大きなサイズの
ペプチドを含んでいる。腹膜から血液への飲作用摂取が
知られているため、これらは抗原性および／またはアレ
ルギー性の危険を呈し得る。この点が、この発明による
注意深く分離され、比較的低分子量の混合物とはかなり
違っている。

［発明の記載］この発明は、ペプチド混合物、すなわち実質的に300〜2
000ダルトンの分子量および150〜1500の当量重量を有す
るペプチドからなる混合物の浸透有効量および電解質浸
透均衡腹膜透析溶液を含む腹膜透析に有用な組成物に関
するものである。

またこの発明は、透析を必要とする患者に前記の低分子
量ペプチドの浸透有効量を含む腹膜透析物の治療有効量
を投与することからなる腹膜透析方法に関するものであ
る。

さらにこの発明は、浸透活性剤として小さなペプチドか
らなる前記混合物を含む腹膜透析物に関するものであ
る。

またこの発明は、溶質を移動させ得る透析膜の片側と水
溶液を接触させ、同時に膜の反対側を逆浸透ユニットか
ら得られレザーバーから供給された実質的純水と接触さ
せ（ただしこの水の溶質濃度は溶質を膜から水中へ移動
させるのに充分なものである）、水および移動した溶質
をレザーバーに送り、そしてレザーバーに送られた溶質
を逆浸透膜の溶質保持性により蓄積させることからなる
低分子量溶質の単離方法を提供する。

第１図は、単離を目的とする透析−逆浸透を組合わせた
機構の概略を表わしたものである。

第２図は、実施例1Bで製造されたペプチド混合物の溶離
パターンを示す。

第３図は、60分間にわたって腹膜に残存する、アミン末
端基として表わされたペプチドの平均量を示す。

第４図は、60分間にわたって腹膜に残存するグルコース
の平均量を示す。

この発明の医薬組成物は、活性浸透剤として各ペプチド
が上限2000ダルトンの分子量を有している、種々の分子
量分布を示すペプチドフラクションを含む。一般的に
は、ペプチドのアミノ酸組成は特に重要ではなく、勿論
混合物が由来する原料の蛋白質により異なる。最も重要
な点は、低分子量群の選択であり、既に説明したように
腹膜を急速に通過し得ない程度に充分大きく、かつ要求
される浸透勾配を維持し得る程度に充分小さくなければ
ならない。測定結果によると、含まれるペプチド類の最
も効果的なサイズ範囲は約300〜2000ダルトンである。
当量重量は約150〜1500であるべきで、好ましい平均当
量重量は約250〜750である。

ペプチド混合物は大きな蛋白質の加水分解により容易に
製造され得る。蛋白質加水分解は、多くの公知方法によ
り行なわれ得る。例えば、一般的な加水分解技術は、強
い鉱酸またはアルカリの存在下における蛋白質の煮沸で
ある。しかしながら、この方法は多くの遊離アミノ酸を
破壊する可能性があり、または少なくとも変性させると
いう望ましくない結果をもたらす。また製造される生成
物を制御するのも困難である。酸加水分解は必ずしもあ
らゆる場合に同じ状態で蛋白質を破壊するわけではない
ため、予測し得ない生成物を生ずることになる。またこ
の反応は非常に急激であり、注意深くモニターしなけれ
ば小さなペプチドからなる所望の混合物ではなく個々の
アミノ酸の集合体が生成してしまう。すなわち、酸加水
分解はこの目的には不適当であると思われる。加水分解
手段の第２の可能性としては例えばヒドロキシアミンま
たは２−ニトロ−５−チオシアノベンゾエートのような
様々な化学試薬が挙げられるが、どれも鎖の特異的部分
でしか蛋白質を開裂しない。所望のペプチド混合物を得
るためには酵素加水分解の使用を選ぶことが好ましい。
酵素加水分解は比較的制御しやすいという重要な利点を
有しているため、完全な加水分解が起こる訳ではなく、
生成物は所望の分子量組成を有する。

適当な加水分解剤は、広範な種類の酵素から選択され得
る。中でも可能な選択例を若干挙げるとトリプシン、キ
モトリプシン、パパイン、ペプシンまたはある種の微生
物プロテアーゼ類がある。蛋白質加水分解の混合物例え
ばパンクレアチン（キモトリプシンおよびトリプシン）
も用いられ得る。これらは各々一般に特異的部位で蛋白
質を開裂する。例えば、トリプシンは、リジンおよびア
ルギニン残基のカルボキシル側でのみ蛋白質を開裂す
る。キモトリプシンは、芳香族アミノ酸のカルボキシル
側を選択的に攻撃する。ペプシンは好んで疎水性アミノ
酸を開裂する。他の蛋白質加水分解酵素の様々な特異性
もよく知られており、経験を積んだ化学者なら容易に入
手できるものである。この特異性ゆえに、最終生成物の
ペプチド混合物は加水分解に使用された酵素により少な
くとも部分的に異なったものとなる。しかしながら、後
に示すように、ペプチド混合物の実際の組成は、適正な
重量オスモル濃度が得られれば、ペプチドは所望のサイ
ズ範囲内となり、ほとんどまたは全く重要ではなくな
る。等業界の熟練者にはどのタイプの酵素がこの目的に
有用であるか明らかであろう。

勿論、製造される生成物のタイプに影響を与える別の可
変要素は加水分解される蛋白質のタイプである。実質的
にはいかなるタイプの食餌蛋白質でも適当な基質である
が、用いられる蛋白質は高品質蛋白質であるのが好まし
い。特許請求の範囲を含むこの明細書中で用いられてい
る高品質蛋白質の語は、高比率、一般的には少なくとも
50％および好ましくは60％〜70％の範囲で必須アミノ
酸、すなわちリジン、ロイシン、イソロイシン、メチオ
ニン、フエニルアラニン、トレオニン、トリプトファ
ン、バリンおよびヒスチジンを含む蛋白質を意味する。
一般的には、この意味では動物性蛋白質の方が植物性蛋
白質より高品質であることが多い。高品質蛋白質の特に
優れた原料としてはコラーゲン、ある種の牛乳蛋白質、
例えば乳漿、および卵蛋白質、特に卵アルブミンが挙げ
られるが、適当な比率のアミノ酸を供給する蛋白質なら
いずれも有用である。しかしながら、ある種の蛋白質、
例えばカゼインは高いパーセンテージで燐を含んであ
り、尿毒症において燐摂取を制限する必要があるため、
適当な基質ではない。高品質蛋白質が好ましい理由は、
アミノ酸のようにペプチドは容易に腹膜を通って拡散す
ることはないが、ある程度の拡散は不可避であるからで
ある。混合物中の少なくとも若干のペプチドは事実血流
へ入ってくるため、入ってくるものが栄養価値のあるこ
とを確実にすることが望ましい。すなわち膜を通って拡
散が起こる場合、透析物はまたある程度非経口的食餌補
充物としても役立つ。

ペプチド生成に最も好ましい蛋白質基質は、乳漿蛋白質
である。乳漿蛋白質とは、乳汁の酸性化後、すなわち燐
蛋白質カゼイン沈澱後溶液に残存する物質である。乳漿
蛋白質は主としてβ−ラクトグロブリン、α−ラクトア
ルブミン、イムノグロブリンおよび牛血清アルブミンか
らなり、60％以上がβ−ラクトグロブリンおよびα−ラ
クトアルブミンフラクションにより構成されている。こ
れら２種の蛋白質のアミノ酸組成はよく知られている
（第１表に示す）。乳漿蛋白質は容易に得られ、比較的
安価に製造されるという２つの利点を有する。

個々の乳漿蛋白質は、硫酸アンモニウム溶液中における
分別溶解度により容易に単離され得る。264g/の硫酸
アンモニウム中における溶解度により様々な物質から蛋
白質を分離することを目的とする様々な案が存在する
［例えば、アームストロング等、「ビオキミカ・エト・
ビオフィジカ・アクタ」（Biochim.Biophys.Acta）、14
7巻、60〜72頁（1967年）、アシャフェンベルク等、
「バイオケミカル・ジャーナル」（Biochem.J.）、65
巻、273〜277頁（1957年）、セルボン等、「ビオキミカ
・エト・ビオフィジカ・アクタ」（Biochim.Biophys.Ac
ta）、295巻、555〜563頁（1973年）参照］。また別法
として、個々の乳漿蛋白質を商業手に入手（シグマ社）
するかまたは混合蛋白質濃縮物（エクスプレス・フー
ズ）として得ることも可能である。

蛋白質の原料および加水分解に用いられる酵素により実
際のペプチド組成は異なるということは、前記の熟練し
た化学者には直ちに理解できるものである。前述したよ
うに各々の酵素は特異的アミノ酸（複数も可）について
蛋白質を攻撃するため、酵素は支配的なものである。す
なわち、例えばトリプシンを用いる場合、基質が同一で
あれば、用いる都度小ペプチドからなる同一の群が生成
される。したがって、制御された一連の反応条件を与え
た場合、同じ純粋酵素および同じ出発蛋白質を用いて予
測可能なペプチド混合物を製造することは常に可能であ
る。確かに、ほとんどの市販の酵素には少量の他のプロ
テアーゼが混入し得る。ペプチドを酵素と接触させたま
まにした場合、これらの混入物質は多量の遊離アミノ酸
生成の原因となり得る。ペプチド生成時に反応器から所
望のサイズのペプチドを除去することにより、大部分望
ましくないアミノ酸生成の問題は避けられる。事実、ペ
プチド混合物の実際の組成は、少なくとも何のペプチド
が存在するかに関し、大部分無関係であることは容易に
理解されよう。重要な要素は、確実に生成されたペプチ
ドのサイズが前述の300〜2000ダルトンの範囲内に維持
されていることである。

前述したように、加水分解が適当な分子量ペプチド組成
をもたらすことを確実にするために加水分解プロセスを
進行に応じてモニターすることが重要である。これは酵
素プロセスの進行が比較的緩慢であるため容易になされ
るが、かなりの量のアミノ酸が混合物の一部にならない
ことをさらに確実にするため、用いられる酵素に最適で
はない温度および／またpHで反応させることにより酵素
開裂速度を緩慢にすることができる。所望の混合物を生
成するために要求される条件は、用いる酵素により必然
的に異なる。蛋白質の酵素加水分解はいずれもよく知ら
れた方法であるため、かなり多数の様々な酵素を用いる
最適な蛋白質加水分解に要求される条件は文献から容易
に得られる（例えば、ごく少数の公知方法については米
国特許第4427658および4145445号参照）。それほど経験
のない平均的化学者でも入手可能な情報を与えれば用い
る基質および酵素に最適な方法を選択することができ
る。

前述から明らかなように、この発明は任意の蛋白質加水
分解酵素またはこれらの酵素の組み合わせを用い得る
が、特に好ましい酵素はパンクレアチン、またはその構
成酵素であるキモトリプシンおよびトリプシンである。
さらにプロテアーゼ混入の可能性があるため過剰量のア
ミノ酸生成の問題を緩和するためには、酵素対基質の比
率をかなり低く、すなわち0.5％〜最大約5.0％の範囲内
に保つべきである。加水分解工程が完了し、所望のペプ
チド配合が得られた後、様々な方法によりペプチドが反
応混合物から精製および分離され得る。主として最終分
子量範囲もまた後述するように用いられた分離方法によ
り異なる。

この発明の好ましい生成物は、高品質蛋白質の酵素加水
分解により生成されたペプチドの混合物を含む治療用組
成物であり、前記混合物は下記特徴、すなわち、ａ）混合物は実質的に300〜2000ダルトンの分子量を有
するペプチドからなること、ｂ）混合物は５モルパーセント以下の遊離アミノ酸を含
んでいること、ｃ）混合物は少なくとも50％の必須アミノ酸をペプチド
形態を含んでいること、ｄ）混合物は、腹膜透析溶液に充分量で加えられた場合
浸透的に有効であること、およびｅ）混合物は約150〜1500の重量の成分当量を有するこ
とを呈する。

特に好ましい組成物は、高品質蛋白質が乳漿蛋白質であ
り、これがトリプシンおよびキモトリプシンの組み合わ
せにより加水分解され、最終混合物が約60〜70％の必須
アミノ酸成分を含むものである。前述したように、これ
らの組成物は、腹膜透析溶液における浸透剤として治療
用に用いられ得るが、高いレベルで必須アミノ酸を含む
ため、非経口的食餌補充物の一部としても用いられ得
る。

前述したことから明らかなように、非常に重要な最終生
成物の特徴は、溶液中に含まれるペプチドが非常に特異
的な分子量範囲内、すなわち約300〜約2000ダルトンで
あるということである。ペプチド分子の当量重量とは、
分子の電荷に関する分子の分子量を表わしたものであ
り、好ましくは150〜1500の範囲である。分子の電荷は
混合物および溶液の全体的な浸透係数の一因となる。20
00ダルトンを越える分子量の分子の場合浸透により進め
られる限外濾過はほとんどなく、また非常に小さい分子
の場合あまりにも速く循環系へ漏出してしまう。すなわ
ち重要なのは、必要とされる分子量範囲を確実に得られ
る方法での加水分解反応および生成物の制御を可能にす
ることである。

溶液のペプチド成分を単離および／または精製する様々
な方法が当技術分野には存在する。例えば、トリクロロ
酢酸（TCA）を用いて反応溶液中に残存する蛋白質およ
び酵素をすべて沈澱させることができる。別法として、
水混和性蛋白質沈澱剤、例えばアセトニトリル（ACN）
蛋白質は、溶液に残存するペプチドと約35〜45％のACN
濃度で沈澱する。さらにポリエチレンオキシドを加えて
相分離を起こさせる容量排除法を用いることができる。
しかしながら、これらの方法はどれも望みどおりの生成
物、すなわち特異的分子量組成のペプチド混合物の生成
を確実にすることはできない。

限外濾過は、特異的分子量の最終生成物を所望する場合
最も頻繁に用いられる技術である。しかしながら、限外
濾過もまた、分利されるべき成分の分子量に少なくとも
約10倍の差がなければ確実な分離は達成され得ないとい
う非常に不利な面を有する。事実、この発明の生成物の
分離に実験的に用いた場合、2000分子量でカットオフす
る限外濾過フィルターを選んだのにもかかわらず、最終
溶液中には2000ダルトンよりかなり高い分子量の分子が
みられることも珍しいことではなかった（実施例２参
照）。要するに成分の分子サイズが不均一な母体混合物
から低分子量生成物を直接的に単離する確実な方法は一
般的に得られないということである。

しかしながら、この発明の浸透剤製造と関連して、不均
一分散分子量混合物からの低分子量溶質の単離システム
は開発された。この方法は、透析および逆浸透という単
純ではあるが予想外の組み合わせに基づくものであり、
この発明の生成物に必要なペプチド分離に特に適してい
ることが判明した。しかしながら、この用途はペプチド
類に限定される訳ではない。事実、実質的にいかなるタ
イプの低分子量溶質の分離にも用いられる。特許請求の
範囲を含むこの明細書中で用いられている「低分子量」
の語は、分子サイズが約5000ダルトンまたはそれ以下で
あること意味する。

大体、第１図で概略を示したプロセスは次のように進行
する。単離されるべき溶質を含む水溶液が透析装置ユニ
ット１を通って灌流し、ソースレザーバー（第１図の
「反応器」２）に戻される。透析装置１の膜は水溶液と
反対側を逆浸透ユニット３により供給された真水の流れ
により洗浄する。逆浸透ユニット３は加圧されて実質的
純水の供給を行なうが、これにより膜から流れの中への
比較的濃縮された溶質の透析を可能とするのに充分な濃
度勾配がもたらされる。2000ダルトンを越える分子量を
有する種類のものは一般に透析膜を通過する率があまり
高くないため、これらの大きな種類のものは溶液中に残
り、ソースレザーバーへ戻されることになるが、低分子
量（2000ダルトン未満）生成物の場合、真水流を通り、
逆浸透レザーバーへ流入する。逆浸透レザーバーから出
た流体に圧力をかけると、逆浸透エレメントは純水のみ
を透過させ、この純水が次に透析膜と接触し、この透析
膜において再び透析可能な低分子量のものが蓄積され、
これらが濃縮させる逆浸透レザーバーに運ばれることに
なる。逆浸透レザーバーの逆浸透圧が純水の生成を著し
く妨げだすときまで、または原料物質を使いきるまでこ
のプロセスは続けられ得る。次にこうして生成された濃
縮生成物はさらに公知方法により単離されるか、または
必要に応じて使用され得る。

透析工程および逆浸透工程の背景の原理は共によく知ら
れているため、ここで詳しく述べる必要はない。逆浸透
は水の精製に常用されており（米国特許第3774763号参
照）、濃縮溶液に高圧をかけることにより半透膜を通過
して濃縮溶液からこれより希釈な流体（例、水または空
気）へと溶媒を移動させ得る方法として特性を表わすこ
とができる。同時にこの方法の場合溶媒を精製し、それ
に含まれた溶質を単離することになる。透析は、結果的
に２つの液体を分離する膜を通して溶質が移動すること
による、高い溶質濃度を有する液体から低い溶質濃度を
有する液体への溶質分子の移動ともいうべき受動的プロ
セスとして定義され得る。透析単独の使用は主として現
在血液透析の場合のように非常に大きな分子から非常に
小さな分子を分離する場合に限られている。

以前に様々な目的を達成するために様々な膜分離方法が
組み合わされた。例えば、米国特許第3472765号は、生
物学的反応系における微生物をそれらの担体液体または
それらの望ましい代謝産物から分離するために逆浸透お
よび限外濾過の組み合わせを適用している。この方法は
主として限外濾過膜の推定分子量のカットオフに基づく
ものである。同様に、米国特許第4000065号では10000未
満の分子量を有し得る有機汚染物質を低レベルで含む水
溶液を精製するために逆浸透および限外濾過を組み合わ
せている。この方法は含有された汚染物質の限られた溶
解度範囲にかなり依存しており、また所望の生成物を得
るために限外濾過の方を重視しているものである。これ
らの方法では各々水溶液から低分子量物質を分離できる
ことが主張されている。しかしながら、いずれも狭い範
囲の低分子量溶質を含む生成物を非常に近い分子量を有
する他の溶質から分離することができる分離方法を記載
してはいない。限外濾過膜のカットオフ点がさらに信用
できるものではないということが以前に検討された。す
なわち、これらの方法はいずれもこの発明の生成物の製
造に適しているとは思われない。米国特許第3774763号
は、逆浸透を用いた水の精製方法を記載しており、前記
の精製水を次に血液透析ユニットに用い得るものとして
いる。しかしながら、逆浸透方法は複雑で、様々な付加
的要素、例えば脱イオン体を必要とし、さらにまた、水
が一度精製されてしまうと、透析ユニットとの相互作用
は継続しない。

しかしながら、この明細書に記載された新規方法は、水
溶液における溶質の溶解度が低いことを必要とせず、限
外濾過方法と関連した不都合さえも伴わない。代わりに
この発明の方法は、透析方法の本来の限界を有利に用い
ることにより2000ダルトンまたはそれ未満の分子を非常
に近い分子量の化合物からなる不均一混合物から分離す
るもので、また逆浸透処理を用いて分離を促進すること
により透析処理に用いられる純水の継続的な供給源をも
たらし、かつ逆浸透レザーバーに透析可能な生成物を濃
縮形態で続けて蓄積させる。得られた最終生成物は特定
範囲の低分子量ペプチドを含む溶液の要求を満たすもの
である。このプロセスは単純で、実質的には逆浸透レザ
ーバー中の溶質濃度が逆浸透段階を続けるための充分な
圧力の生成を妨げる程度になるまで連続的に繰り返され
得る２段階工程のみを必要とする。この方法は完了時に
必ずしもそれ以上の分離または精製処理を必要とはしな
いという別の利点を有する。

この発明の工程で用いられる要素は、当技術分野で公知
の透析および逆浸透装置であり得る。また各々のユニッ
トは、温度、圧力、供給速度当について公知手順にした
がい操作され得る。透析装置における作動圧力は一般に
わずか500mm、好ましくはそれ未満であるべきである。
逆浸透ユニットの高圧部分の作動圧力は、逆浸透レザー
バー中の溶液の浸透圧を越えていなくてはならず、また
真水の透過水流を生成し、これに対して反応器からの溶
質を含む流れが透析されるように充分高くなければなら
ない。この発明の生成物製造における逆浸透ユニットの
一般的な作動圧力は150〜300psi、好ましくは200〜250p
siである。しかしながら、小さなペプチド以外の場合、
単離されるべき生成物により圧力は異なり得るというこ
とは経験豊かな化学者には明らかであろう。２つのユニ
ットの適当な結合手段は、任意のタイプの不活性で非毒
性物質、例えばプラスチックまたは珪素からなる低圧管
系である。ただし高圧プラスチックラインを必要とする
逆浸透のポンプおよび循環ライン間の結合は例外であ
る。

透析および逆浸透プロセスで用いるのに適した広範な種
類の膜は当業界では公知である［例えば、キルク−オト
マー編、「エンサイクロペディア・オブ・ケミカル・テ
クノロジー］（Encyclopedia of Chemical Technolog
y）、第３版、７巻、「透析」（1979年）および20巻、
「逆浸透」（1982年）参照］。実質的に透析特性を有す
る公知の膜ならいずれも透析に用いられ得る。これらは
例えばセルロース、セルロースアセテート、エチレンビ
ニルアルコール、ポリアクリロニトリルまたはポリメチ
ルメタクリレートから製造され得る。ペプチド混合物の
製造において、セルロース膜が好んで用いられ、特に中
空ファイバー膜および関連した透析装置に用いられる。
これらの膜はほとんどがこの発明の方法に適したもので
ある透過性の範囲で得られる。使用される膜は必要とさ
れる所望の分子の平均サイズに基づいて選択される。例
えば、HF−140透析装置（コーブ・ラボラトリーズ）に
含まれるような「普通の」透過性を有する膜は、一般に
1500を越える分子量を有するものに対して不浸透性であ
る。しかしながら、少し大きい分子量サイズを望む場
合、ある主のファイバー、例えばD2−HDF（エンカ）な
ら3000〜4000ダルトンの分子量まで、透過可能である。
市販されている膜の透過性は公知であり、経験豊かな化
学者の技能によれば、単離すべき分子のサイズおよび種
類により目的に最もかなった膜を決定することは可能で
ある。逆浸透膜に関しては、高レベルの電解質保持性を
有する膜が適している。らせん状に巻いた配置（config
uration）をした薄いフイルム合成膜がこの方法に特に
有用であることが判明した。しかしながら、中空ファイ
バー膜もまたこの方法において効果的に用いられ得る。

膜の選択に加えて、溶質含有溶液の供給源が生物学的反
応体である場合、最終生成混合物の平均サイズは、酵素
開裂の速度または生成物を製造する微生物代謝プロセス
の速度を制限することにより制御され得る。例えば、酵
素開裂プロセスを伴なう場合、反応速度は基質に対して
酵素のレベルを低く維持することにより低く保たれ得
る。速度はまた、用いられた酵素または微生物に最適な
値より低い温度またはpHで反応を行なうことにより変え
られ得る。このような修正は当業界の熟練者には充分可
能なことである。また反応プロセスの修正を膜の選択と
組合わせることにより非常に効果的および正確に所望の
生成物を製造することができることも熟練した化学者に
は明らかであろう。言い換えれば、所望の生成物の分子
量がわかっていれば、この方法を通じて即座に機械的に
どの組み合わせが興味の対象の生成物に対して最も満足
すべき結果をもたらすかを決定することは比較的単純な
問題である。

前述したように、この発明の方法は特に低分子量ペプチ
ド混合物の製造に適しており、また他の種類の蛋白質、
例えば大豆、卵または乳汁蛋白質の加水分解と結びつけ
て商業的に用いられ得る。また低分子量のものを単離す
るとが必要または望ましい他の不均一な非ペプチド混合
物についても容易に適用され得る。例えば、多くの生物
学に基づいた方法において、目的とする低分子量生成物
は様々なホルモンおよび蛋白質混入物の存在下に製造さ
れることが多く、そこからの生成物の分離は重大な問題
を呈する。例えばこれはコーンスターチ加水分解物の処
理による低分子量マルトデキストリンの単離において達
成され得る。コーンスターチを酵素により加水分解する
と、高分子量の澱粉が無作為に開裂されて累進的に小さ
なデキストリンが生成する。プロセスの続行に応じてあ
る時点で酵素活性を止めることによりベーキング添加剤
または甘味料のように食物加工業界で用いられるポリグ
ルコース（マルトデキストリン）の多分散混合物を得る
ことができる。酵素活性を続行させた場合最終生成物は
グルコースである。この発明の方法を用いることにより
酵素反応器からの低分子量のマルトデキストリンの連続
単離は可能となるが、この方法は以前にはあり得なかっ
たものである。同様に、抗凝血剤であるヘパリンのある
種のフラクションは抗凝血活性をもたずに抗血栓症活性
を有する。非常に貴重ではあるが、このようなフラクシ
ョンはそのサイズ（約3000ダルトン）が原因でこれより
大きい分子からの単離は困難である。この発明の方法
は、所望のフラグメントを化合物の不均一混合物から容
易に分離し得る手段を提供するものである。

この発明の生成物に関していえば、精製されたペプチド
混合物を腹膜透析物として用いるのに適した浸漬均衡水
溶液と組み合わせることができる。有用な透析物は、前
記目的のために有効に浸透均衡した状態であるために
は、水および望ましくない代謝産物が腹膜を通って拡散
を起こすのに充分な電解質濃度を有していなければなら
ない。必要条件は個々の場合で異なり得るため「標準
的」透析溶液というものは存在しない。例えば普通の溶
液は特定量のナトリウム、塩化物、ラクテート、マグネ
シウムおよびカルシウムを含有する。一般的な透析溶液
の成分を第２表に示すが、ただし浸透剤の量は明記しな
い。グルコース溶液においてグルコース−水和物は一般
に1.5〜4.25％の量で加えられ得る。これは可能な溶液
の一例を示すものにすぎず、またパターンの変化は熟練
者には明白なものであることが理解されよう。透析物に
おけるペプチド混合物の比率は変化し得るが、通常透析
溶液の約１〜15重量％の範囲である。いずれにしても使
用されるペプチド量は補助的電解質と共に約300〜約500
ミリオスモル／リットルの重量オスモル濃度をもたらす
のに充分な量であるできである（280ミリオスモル／リ
ットルが通常の血清オスモル濃度であり、電解質自体は
普通約260ミリオスモル／リットルの重量オスモル濃度
をもたらす）。透析物の投与は普通腹膜透析に対して用
いられる方法で行なわれる。腹膜透析方法の例が「ペリ
トネアル・ダイアリシス」（Peritoneal Dialysis）
（ノルフ編、マルチヌス・ニグホフ・パブリッシャー
ズ、1981年）に記載されている。個々の患者に必要な特
定の処置方法は患者の主治医により容易に決定できるも
のである。

第２表一般的な腹膜洗浄溶液の組成（ミリ当量／リットルで） Na 132.0 Ca 3.5 Mg 0.5 Cl 96.0 乳酸アニオン 40.0 以下、この発明についてさらに明確に理解できるように
実施例を示すが、これは限定を意図するものではない。

［実施例］実施例１以下の実施例によりペプチド混合物の製造方法を示す。

A.150グラムのセイバー・プロ（SAVORPRO）（エクスプ
レス・フーズ、インコーポレイテッド・ルイスビル、ケ
ンタッキー）、75％乳漿蛋白質濃縮物を３リットルの蒸
留水に溶かし、透析して残留していた乳糖および塩を除
去した。この処理により溶液の伝導率は700から26マイ
クロモーに減少した。

溶液のpHを8.0に調節し、溶液の温度を40℃にした。次
いで溶液を酵素反応器へ移し、透析装置を通して循環さ
せた（第１図に概略を示す）。透析装置の透析物側に、
薄いフィルムコンポジットのらせん状に巻いたエレメン
ト［フィルム−テック（Film−Tec）を用いた逆浸透
（R.O.）ユニットのアウトプットから出た純水を送っ
た。透析物を、R.O.ユニットへの供給を行う生成物レザ
ーバー容器に戻した。生成物レザーバーからR.O.を通る
循環速度は、純水の生成速度を最大にするためにこの速
度の10倍とした。ユニットを約200〜250psiの圧力で作
動させた。両回路を作動させてシグマ（Sigma）トリプ
シンおよびキモトリプシンの各々1.5グラムを酵素反応
器に加えた。酵素開裂の進行に応じてNaOHを加えること
により反応のpH値を維持した。2000ダルトンより小さい
ペプチドが反応器中に生成され、これらを透析膜（HF−
140血液透析装置、コーブ・ラボラトリーズ、レイクウ
ッド、コロラド）から生成物レザーバーへ透析すると、
R.O.ユニットは例えばNaClのような小さな電解質に対し
てさえ保持性があるためこれらはそこに残存した。10分
ごとに試料を採りながら反応器を２時間作動させた。生
成物レザーバーはペプチド濃度および重量オスモル濃度
における増加を続けた。生成物レザーバーから得られた
最終生成物は46.5グラム（収率31％）で平均当量重量は
408であった。溶離剤として30％酢酸を用いたP₂ゲル排
除カラムで生成物を分析すると、実質的に樹脂の空隙中
にペプチドが存在しないことを示し、全部のペプチドが
1800ダルトン未満であることを示していた。

B.Aの反応を正確に繰り返すが、ただし一層透過性の高
い透析装置「フレゼニウス（Fresenius）Ｄ−６透析装
置、バド・ホンブルク、FGR、D2−HDFファイバー、エン
カ・アクチェンゲゼルシャフト］を用いた。これにより
Ａにおいて可能であったものより高いパーセンテージの
さらに大きなペプチドフラグメントの抽出が可能となっ
た。溶離をＡと同様に行なった。結果を第２図に表わ
す。生成物の当量重量は483であった。

実施例２以下の実施例は、ペプチド混合物を透析および逆透析で
はなく限外濾過により精製する方法を示すものである。

a.乳漿蛋白質濃縮物（85％蛋白質）の３％溶液をpH＝８
とした。溶液の温度を50℃にした後、シグマ・ケミカル
・カンパニー製トリプシン（＃T2395）を蛋白質に対し
て1:100の割合で加えた。出発蛋白質溶液の重量オスモ
ル濃度（凍結点低下による）は47ミリオスモル／リット
ルであった。30分の反応時間の終わりに溶液をセルロー
ス膜（制限カットオフ＝5000ダルトン）により限外濾過
した。pHを出発値に戻したとき、重量オスモル濃度は11
2ミリオスモル／リットルであった。限外濾過物のゲル
排除クロマトグラフィーは、製造者が目的とした低いカ
ットオフにもかかわらず広範な分子量のペプチド生成物
に加えて出発α−ラクトアルブミン（分子量＝14200）
の小部分が限外濾過器を透過したことを示した。

b.脱イオン水中５％乳漿蛋白質固溶体が18ミリオスモル
／リットルの重量オスモル濃度を有することが判明し
た。溶液を透析することにより電解質成分を減じると13
ミリオスモル／リットルの重量オスモル濃度を示した。
この溶液の（名目上の20000ダルトンカットオフ膜に通
した）限外濾過の重量オスモル濃度は３ミリオスモル／
リットルにすぎず、停留物（retentate）により19ミリ
オスモル／リットルに増加したが、このことは出発乳漿
溶液の重量オスモル濃度に影響を与える低分子量溶質
（すなわち、乳糖、塩等）は希少であることを示した。
限外濾過停留物をpH＝８でトリプシンと反応させると、
生成した加水分解物は59ミリオスモル／リットルの重量
オスモル濃度を示した。加水分解物を前記と同じタイプ
の膜により限外濾過した。濾液の重量オスモル濃度は21
ミリオスモル／リットルであることがわかった。限外濾
過実験は、蛋白質消化が完全ではないこと、および加水
分解物の限外濾過により得られた生成物はかなりの量の
大きなペプチドフラグメントを含むことを示した。ゲル
透過クロマトグラフィー（GPC）分析により、限外濾過
物は大きなペプチドだけでなく出発α−ラクトアルブミ
ンも若干含んでいることが確かめられた。

実施例３下記のものはここで用いられる腹膜透析溶液の電解質成
分を表わす（グラム／リットル）。

NaCl 5.38 CaCl 0.257 MgCl₂ 0.0508 Na乳酸塩 4.48 上記の成分は約260ミリオスモル／リットルの重量オス
モル濃度をもたらす。上記混合物に水１リットル当たり
61.1グラムのペプチド混合物を加えると約126ミリオス
モル／リットルの重量オスモル濃度となり、溶液全体と
して2.5％グルコース溶液の場合とほぼ等しい重量オス
モル濃度をもたらす。

実施例４実施例３記載の溶液中実施例1Bのペプチド混合物を用い
て、浸透剤としての低分子量ペプチドの有効性およびグ
ルコースの有効性の比較実験を行なった。

この試験では４羽のウサギを用いてＡ−Ｂシーケンスで
試験した結果、各ウサギはそれ自体の対照としての役割
を演じた。各動物に対し、2.5％グルコースまたは2.5％
グルコース溶液の場合とほど等しい溶液の重量オスモル
濃度（385ミリオスモル／リットル）をもたらすのに充
分なペプチドを用いて透析を行なった。各動物の腹膜腔
に体重1Kg当たり約50mlの透析物を仕込んだ。60分間の
最後における注入容量および流体の増加（浸透的限外濾
過による）を下記表に列挙する。

グルコースと同じ重量オスモル濃度において、ペプチド
は60分で浸透ポンプ活性におけるほとんど100％の増加
を示すが、これは明らかに循環中におけるグルコースと
比べて低いペプチドの喪失速度に起因する。第３および
４図は、腹膜における平均アミン末端基濃度対時間およ
びグルコース対時間のプロットを示す。これらはグルコ
ースのほとんど35％が失われるのと比べてペプチドの場
合（末端基により測定）20％しか失われないことを証明
する。これらの結果はグルコースが60分ではまだ血漿レ
ベルと平衡に達しなかった事実を考慮すると、一層重要
性を帯びるものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、単離を目的とする透析−逆浸透を組合わせた
機構の概略を表わしたものである。第２図は、実施例1Bで製造されたペプチド混合物の溶離
パターンを示す。第３図は、60分間にわたって腹膜に残存する、アミン末
端基として表わされたペプチドの平均量を示す。第４図は、60分間にわたって腹膜に残存するグルコース
の平均量を示す。１……透析装置、２……酵素反応器、３……逆浸透ユニ
ット、４……生成物レザーバー

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ａ６１Ｍ 1/14 ５２３ 1/28

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】浸透活性剤としてペプチド混合物の浸透有
効量を含み、前記混合物が実質的に300〜2000ダルトン
の分子量および150〜1500の当量を有するペプチドを含
む腹膜透析液。
【請求項２】ペプチドが少なくとも１種の高品質蛋白質
の加水分解により製造される、特許請求の範囲第１項記
載の透析液。
【請求項３】加水分解が酵素加水分解である、特許請求
の範囲第２項記載の透析液。
【請求項４】蛋白質がホエー（乳漿）蛋白質である、特
許請求の範囲第２項記載の透析液。
【請求項５】酵素がトリプシン、キモトリプシン、ペプ
シン、パパイン、パンクレアチン、微生物プロテアーゼ
類およびこれらの混合物からなる群から選ばれたもので
ある、特許請求の範囲第３項記載の透析液。
【請求項６】酵素がトリプシンおよびキモトリプシンを
組み合わせたものである、特許請求の範囲第５項記載の
透析液。
【請求項７】さらに浸透圧均衡電解質水溶液をも含む、
特許請求の範囲第１〜６項のいずれか１項記載の透析
液。
【請求項８】ペプチドを電解質と組合わせたものが300
〜500ミリオスモル／リットルの重量オスモル濃度をも
たらすのに充分な量で存在する、特許請求の範囲第１〜
７項のいずれか１項記載の透析液。
【請求項９】混合物が５モルパーセント未満の遊離アミ
ノ酸を含有する、特許請求の範囲第１〜８項のいずれか
１項記載の透析液。
【請求項１０】混合物が少なくとも50％の必須アミノ酸
を含む、特許請求の範囲第１〜９項のいずれか１項記載
の透析液。
【請求項１１】混合物が50〜70％の必須アミノ酸を含
む、特許請求の範囲第10項記載の透析液。
【請求項１２】ペプチドが透析液の１〜15重量％を構成
する特許請求の範囲第１〜11項のいずれか１項記載の透
析液。
【請求項１３】浸透活性剤としてペプチド混合物の浸透
有効量を含み、前記混合物が実質的に300〜2000ダルト
ンの分子量および150〜1500の当量を有するペプチドを
含む腹膜透析液の製造方法であって、ａ）加水分解条件下高品質蛋白質の水溶液を少なくとも
１種の加水分解酵素で処理することにより、少なくとも
ペプチド類のあるものが300〜2000の低分子量を有して
いるペプチド含有溶液を製造し、ｂ）ペプチド含有溶液を、低分子量ペプチド類を移動さ
せることのできる透析膜の片側と接触させ、ｃ）同時に膜の反対側を、レザーバーから供給され逆浸
透ユニットから得られた実質的純水と接触させ（ただ
し、前記の水の溶質濃度はペプチドが膜を通って水中へ
移動するのを可能とするように充分低いものである）、
そして、ｄ）水および移動した溶質をレザーバーに向かわせ、そ
して、ｅ）レザーバーに送られたペプチドを逆浸透膜の溶質保
持性により蓄積させることを特徴とする方法。
【請求項１４】前記方法が水溶液および水のリサイクル
により（ａ）〜（ｅ）段階を繰り返すことからなる、特
許請求の範囲第13項記載の方法。
【請求項１５】レザーバー中の溶液の濃度が逆浸透ユニ
ットからの純水の生成を防ぐのに充分なものとなるまで
前記方法を繰り返す、特許請求の範囲第14項記載の方
法。
【請求項１６】高品質蛋白質が実質的に涸渇するまで前
記方法を繰り返す、特許請求の範囲第14項記載の方法。
【請求項１７】加水分解の酵素反応器中で行なわれる、
特許請求の範囲第13項記載の方法。
【請求項１８】逆浸透ユニット上の圧力が14〜21kg/cm²
である、特許請求の範囲第13項記載の方法。
【請求項１９】透析膜がセルロースからなるものであ
る、特許請求の範囲第13項記載の方法。
【請求項２０】膜が中空ファイバー膜である、特許請求
の範囲第19項記載の方法。