JPH07115997A - Ｇｐｔ測定用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 保存安定性を有する液状のＧＰＴ測定用試薬
を提供する。 【構成】 Ｌ−アラニンとα−ケトグルタル酸からＧＰ
Ｔにより生成されるピルビン酸をＬＤＨにより乳酸に変
え、共存ＮＡＤＨの減少量を測定するＧＰＴ測定法試薬
において、ＮＡＤＨ、ＬＤＨ及びアミノ酸を含有する第
一試薬と、Ｌ−アラニン及びα−ケトグルタル酸を含有
する第二試薬とからなり、第一試薬ｐＨが８．５〜１０
で、第二試薬ｐＨが５〜８で、それぞれ液状である。 【効果】 液状で長期間安定に保存しておき、使用に際
して溶解操作の必要なく、そのまま自動分析機などに適
用できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、グルタミン酸ピルビン
酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）測定用試薬に関する。
より詳細には、長期間安定なＧＰＴ測定用の改良された
液状試薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナ
ーゼ（以下、ＧＰＴと略称する）は、心臓や肝に多く分
布する酵素であり、各種疾患時に血中に遊出されるの
で、尿や血液等の生体液中のＧＰＴの測定は心疾患、肝
疾患の診断や治療の経過観察の指標として重要な項目の
一つである。

【０００３】ＧＰＴの測定法としては、Ｌ−アラニンと
α−ケトグルタル酸を基質として、ＧＰＴによって生成
されるピルビン酸を乳酸脱水素酵素（以下、ＬＤＨと略
称する）によって乳酸に変え、共存させておいた還元型
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ
Ｈと略称する）量の減少量を、波長３４０ｎｍ付近で測
定することによりＧＰＴを測定する方法が汎用されてい
る。

【０００４】この反応式を示せば、以下のとおりであ
る。 前記の式中で、ＮＡＤは酸化型ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドである。

【０００５】一般的に酵素を含む試薬は、その保存安定
性の面を考慮して、反応に必要な組成物を含む凍結乾燥
品として提供され、使用時に緩衝液等で溶解して用いら
れていた。しかし、作業性やコスト面から、溶解後の試
薬の安定性も要求されるようになり、例えば特開昭５７
−３９８００号公報のようにＧＰＴ試薬の安定性に関す
る技術が開示されている。

【０００６】前記の特開昭５７−３９８００号公報記載
の技術は、特にＬＤＨの安定化のために、従来からの殺
菌剤の添加のみならず、スルフヒドリル化合物（例えば
還元型グルタチオン、Ｎ−アセチルシステイン等）とキ
レート剤（例えばＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ）を併用・添加し
てＬＤＨの安定化を図ったものである。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】近年、特に試薬形態を
供給時から液状とし、ユーザーの作業性を向上させるこ
とが求められている。また、これらの試薬は多くの場
合、自動分析機にて使用されるので、試薬構成を２試薬
系とし、しかも試薬組成物の安定性を長期間（例えば半
年から１年）維持する必要がある。これに対して、前記
の特開昭５７−３９８００号公報記載の技術は３試薬系
であり、ＬＤＨの室温での安定性はせいぜい１０日程度
である。更に、ＬＤＨの安定性に主眼をおいており、Ｇ
ＰＴ測定に必要なその他の配合成分、特にＮＡＤＨの安
定性については、単にｐＨ９〜１１のアルカリ性条件下
におけば、その寿命に問題はなく、更に基質のα−ケト
グルタル酸についても殺菌剤を使用すればその安定性に
問題はないと記載しているに過ぎない。しかしながら、
この系で使用する酵素や基質を２試薬系の溶液状態で、
長期間安定させるには、いまだ不十分であった。本発明
者等はこうした従来の問題点を解消すべく種々鋭意検討
した結果、液状試薬としての充分な保存安定性を有する
ＧＰＴ測定試薬組成を見出した。本発明は、こうした知
見に基づくものである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、Ｌ−アラニン
とα−ケトグルタル酸を基質としてグルタミン酸ピルビ
ン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）によって生成される
ピルビン酸を乳酸脱水素酵素によって乳酸に変え、共存
させておいた還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チド量の減少量を測定することからなる前記グルタミン
酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）の測定法の
試薬において、少なくとも還元型ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド、乳酸脱水素酵素及びアミノ酸を含有
する第一試薬と、少なくともＬ−アラニン及びα−ケト
グルタル酸を含有する第二試薬とからなり、第一試薬の
ｐＨが８．５〜１０であり、第二試薬のｐＨが５〜８．
５であり、そしてそれぞれ液状試薬であることを特徴と
する、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（Ｇ
ＰＴ）測定用試薬に関する。

【０００９】以下本発明を詳細に説明する。本発明のＧ
ＰＴ測定用試薬は、（１）ＮＡＤＨと、ＬＤＨと、アミ
ノ酸とを含み、ｐＨが８．５〜１０の液状第一試薬と、
（２）Ｌ−アラニンと、α−ケトグルタル酸とを含み、
ｐＨが５〜８．５の液状第二試薬とから構成される。

【００１０】本発明者が見出したところによれば、ＧＰ
Ｔ測定で使用する酵素や基質を安定な条件で維持し、な
おかつ、反応時のｐＨをＧＰＴの至適ｐＨであるｐＨ
７．３付近に設定するためには、補酵素ＮＡＤＨを含む
試薬を単にアルカリ性に維持するのみでは、充分な安定
化が得られない。更に、特に２試薬系で構成する場合
に、一定濃度のアミノ酸を第一試薬に添加することによ
り、ＮＡＤＨの安定性が飛躍的に向上するばかりか、Ｌ
ＤＨの安定化も可能となった。

【００１１】第一試薬に添加するアミノ酸としては、こ
の測定系に存在するＬＤＨの基質とならない任意のアミ
ノ酸を用いることができる。具体的には、グリシン、ア
ラニン、ロイシン等の中性アミノ酸、グルタミン酸、ア
スパラギン酸等の酸性アミノ酸、リシン、アルギニン等
の塩基性アミノ酸を適宜選択して用いることができる。

【００１２】前記アミノ酸の添加濃度は、使用するアミ
ノ酸の種類により変化するので特に限定されるものでは
ないが、一般的には前記アミノ酸を１０〜２００ｍＭの
範囲内で適宜添加濃度を調整して用いることができる。
具体的には、例えばアミノ酸としてＬ−アラニンを用い
る場合、１０〜２００ｍＭ、好ましくは１０〜１５０ｍ
Ｍ、より好ましくは１０〜１００ｍＭの量で添加すれば
期待される効果が得られる。また、アミノ酸としてグリ
シンを用いる場合、１０〜４００ｍＭ、好ましくは１０
〜２００ｍＭ、より好ましくは１０〜１５０ｍＭの量で
添加すれば同様の効果が得られる。

【００１３】アミノ酸を添加した第一試薬のｐＨを８．
５〜１０とし、第二試薬のｐＨを５〜８．５に維持する
ことにより、ＧＰＴ反応時のｐＨをｐＨ７〜８（特にｐ
Ｈ７．３付近）に設定することができると共に、各構成
成分を長期間安定に保存することができる。第一試薬に
添加するアミノ酸の量が前記範囲以外になると、第一試
薬の組成成分の安定性が著しく低下する。

【００１４】第一試薬の緩衝液はＧＰＴ反応時のｐＨを
前記の範囲内にすることができれば、従来公知の緩衝液
を適宜選択して使用することができる。具体的には、ト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、Ｎ，Ｎ
−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン緩衝液等を使
用することができる。この際、第一試薬に添加するアミ
ノ酸としてグリシンを選択する場合には、緩衝液として
グリシン緩衝液を用いることにより、グリシンを前記の
アミノ酸としてだけではなく、緩衝剤としても利用する
ことができるので、第一試薬の構成が簡略化される。ま
た、そのｐＨは８．５〜１０、特に９以上が好ましい。

【００１５】第二試薬の緩衝液はＧＰＴ反応時のｐＨを
前記の範囲内にすることができる従来公知の緩衝液を適
宜選択して使用することができる。具体的には、トリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液又はＮ，Ｎ−
ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン緩衝液等を適宜
選択して使用することができる。また、そのｐＨは５〜
８．５、特に５．５〜８．０が好ましい。

【００１６】基質であるＬ−アラニンの添加量は、好ま
しくは１００〜３０００ｍＭ、より好ましくは２００〜
２０００ｍＭである。また、もう一つの基質であるα−
ケトグルタル酸の添加量は、好ましくは１〜３００ｍ
Ｍ、より好ましくは３〜２００ｍＭである。

【００１７】本発明の試薬に用いられるＬＤＨとして
は、豚心臓由来や、ロイコノストック・メセンテロイデ
ス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄ
ｅｓ）由来のＬＤＨが好ましいが、その由来は特には限
定されない。ＬＤＨの添加量としては、少なくとも３０
００Ｕ以上を適宜選択して用いればよい。また、ＮＡＤ
Ｈは、好ましくは０．１〜５ｍＭ、より好ましくは０．
１〜１．０ｍＭの範囲で使用することができる。これら
の構成成分の添加量は、第一試薬と第二試薬の混合比に
よって変動するため、上記範囲外であっても、本発明に
含まれる。即ち、本発明の必須要件は、ＮＡＤＨと、Ｌ
ＤＨと、アミノ酸とを含み、ｐＨが８．５〜１０の液状
第一試薬と、基質であるＬ−アラニンと、α−ケトグル
タル酸とを含み、ｐＨが５〜８．５の液状第二試薬の２
試薬系に構成する点にある。

【００１８】前記の第一試薬及び／又は第二試薬には、
前記の必須の配合成分の他に、必要により、一般的に添
加される成分、例えばＥＤＴＡ等のキレート剤、アジ化
物等の防腐剤、及び各種界面活性剤等を適宜添加するこ
とができる。

【００１９】このように構成されたＧＰＴ測定用試薬に
よって、被検検体にＧＰＴの基質であるＬ−アラニンと
α−ケトグルタル酸を作用させると、それらの基質がグ
ルタミン酸とピルビン酸に変換される。ピルビン酸は共
役酵素であるＬＤＨにより、ＮＡＤＨを酸化して乳酸と
ＮＡＤになる。この反応で酸化されるＮＡＤＨの減少速
度を測定し、ＧＰＴ活性を求めることができる。

【００２０】

【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。実施例１ 豚心臓由来ＬＤＨ８０００Ｕと０．３９ｍＭ−ＮＡＤＨ
とを０．０１Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン緩衝液（ｐＨ９．５）に溶解し、更にアミノ酸として
のＬ−アラニンを０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、１５
０ｍＭ、及び２００ｍＭとなるように添加した後、溶液
のｐＨを４Ｎ−ＫＯＨ液にてｐＨ９．５に調整し、全量
を１リットルとして酵素含有溶液とした。この酵素含有
溶液を１０℃にて保存し、保存当日、１ケ月後、２ケ月
後、及び３ケ月後のＬＤＨ及びＮＡＤＨの安定性を以下
の試験により確認した。

【００２１】（１）ＬＤＨの保存安定性：上記の条件で
保存した酵素含有溶液を０．０５Ｍリン酸緩衝液で２０
倍に希釈し、その希釈液１５μｌに、ピルビン酸リチウ
ム（２７ｍｇ／ｄｌ）を含む０．０５Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．５）３００μｌとＮＡＤＨ水溶液（１５ｍｇ
／１０ｍｌ）６０μｌとを加え、３７℃で５分間反応さ
せ、波長３４０ｎｍにおける１分間当たりの吸光度変化
を測定し、その吸光度変化量からＬＤＨ活性の残存率を
下記式より算出した。

【００２２】ＬＤＨ活性値（Ｕ／ｌ）＝（△Ｅ／ε）×
（Ｖ／ｖ）×１０³ △Ｅ：１分間当たりの吸光度変化量 ε：分子吸光係数（６．２２） Ｖ：全反応液量 ｖ：試料液量 なお、保存当日の活性値を１００％として、それぞれの
ＬＤＨ活性の残存率を算出した。結果を図１に示す。図
１（及び後記図２）において、○はＬ−アラニン０ｍ
Ｍ、●はＬ−アラニン５０ｍＭ、□はＬ−アラニン１０
０ｍＭ、■はＬ−アラニン１５０ｍＭ、そして△はＬ−
アラニン２００ｍＭである。

【００２３】（２）ＮＡＤＨの保存安定性：上記の条件
で保存した酵素含有溶液３２０μｌに、ＬＤＨ（１ｍｇ
／１０ｍｌ）を含む０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
５）１５μｌとピルビン酸リチウム（１０ｍｇ／ｍｌ）
水溶液８０μｌとを加え、３７℃で５分間反応させ、波
長３４０ｎｍにおける吸光度変化を測定し、その吸光度
変化量からＮＡＤＨの残存率を下記式より算出した。結
果を図２に示す。

【００２４】ＮＡＤＨ濃度（ｍｍｏｌ／ｌ）＝（Ｅ／
ε）×（Ｖ／ｖ） Ｅ：吸光度変化量 ε：分子吸光係数（６．２２） Ｖ：全反応液量 ｖ：試料液量 なお、保存当日の濃度を１００％として、ＮＡＤＨ量の
残存率を算出した。

【００２５】実施例２ 豚心臓由来ＬＤＨ８０００Ｕと０．３９ｍＭ−ＮＡＤＨ
とを０．０１Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン緩衝液（ｐＨ９．５）に溶解し、Ｌ−アラニン５０ｍ
Ｍを添加した後、４Ｎ−ＫＯＨにてｐＨ９．５に調整し
て１リットルとしたものを酵素含有溶液（第一試薬）と
した。基質としてのＬ−アラニン１．０４Ｍとα−ケト
グルタル酸４６ｍＭとをトリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、４Ｎ−ＫＯ
ＨにてｐＨ７．３に調整して１リットルとしたものを基
質含有溶液（第二試薬）とした。検体として管理血清を
用い、その管理血清１５μｌに第一試薬２６０μｌを加
えて３７℃で５分間加温した後、第二試薬１３０μｌを
加え、その１分後から４分間波長３４０ｎｍにおける吸
光度の減少を測定し、単位時間当たりの吸光度変化を求
めた。別に、従来法の試薬〔第一試薬＝ＮＡＤＨ（０．
１５ｍＭ）とアラニン（８００ｍＭ）を含む５ｍＭ炭酸
緩衝液（ｐＨ１０．５）；第二試薬＝α−ケトグルタル
酸（３５ｍＭ）とＬＤＨ（１０００Ｕ）とを含む０．５
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）〕を用いて同様にＧＰＴ
活性を測定し、本発明方法との相関を確認した。結果を
図３に示す。

【００２６】実施例３ 実施例１で用いたＬ−アラニンに換え、添加アミノ酸と
してグリシンを用いて試験を行った。即ち、ＬＤＨ及び
ＮＡＤＨを実施例１と同量含む０．０１Ｍトリス（ヒド
ロキシメチル）アミノメタン緩衝液（グリシン０ｍ
Ｍ）、前記トリス緩衝液に換えて、同成分を含む２０ｍ
Ｍグリシン緩衝液、同様に５０ｍＭグリシン緩衝液、同
様に１００ｍＭグリシン緩衝液、同様に１５０ｍＭグリ
シン緩衝液、同様に２００ｍＭグリシン緩衝液、同様に
４００ｍＭグリシン緩衝液を調製し、溶液のｐＨを６Ｎ
−ＨＣｌ液にてｐＨ９．５に調整し、全量を１リットル
として酵素含有溶液とした。この酵素含有溶液を１０℃
にて保存し、保存当日、１ケ月後及び３ケ月後のＬＤＨ
及びＮＡＤＨの安定性を実施例１と同様の試験により確
認した。結果を以下の表１及び表２に示す。

【００２７】

【表１】 ＬＤＨの保存安定性 グリシン濃度（ｍＭ） 保存当日 １ケ月後 ３ケ月後 グリシン無添加 100.0 80.0 66.5 ２０ｍＭ 100.0 95.0 92.1 ５０ｍＭ 100.0 96.3 95.9 １００ｍＭ 100.0 98.2 97.8 １５０ｍＭ 100.0 98.5 97.7 ２００ｍＭ 100.0 99.0 98.1 ４００ｍＭ 100.0 99.3 98.6

【００２８】

【表２】 ＮＡＤＨの保存安定性 グリシン濃度（ｍＭ） 保存当日 １ケ月後 ３ケ月後 グリシン無添加 100.0 97.1 91.8 ２０ｍＭ 100.0 97.5 95.0 ５０ｍＭ 100.0 98.3 96.6 １００ｍＭ 100.0 98.0 97.2 １５０ｍＭ 100.0 97.8 94.8 ２００ｍＭ 100.0 97.0 93.0 ４００ｍＭ 100.0 96.2 92.3

【００２９】実施例４ 豚心臓由来ＬＤＨ８０００Ｕと０．３９ｍＭ−ＮＡＤＨ
とを０．０２Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ９．２）に溶解
し、６Ｎ−ＨＣｌにてｐＨ９．２に調整して１リットル
とした酵素含有溶液を第一試薬とした。基質としてのＬ
−アラニン１．０４Ｍとα−ケトグルタル酸４６ｍＭと
をトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐ
Ｈ７．６）に溶解し、４Ｎ−ＫＯＨにてｐＨ７．６４に
調整して１リットルとした基質含有溶液を第二試薬とし
た。検体として血清を用い、その血清１５μｌに第一試
薬２６０μｌを加えて３７℃で５分間加温した後、第二
試薬１３０μｌを加え、その１分後から４分間波長３４
０ｎｍにおける吸光度の減少を測定し、単位時間当たり
の吸光度変化を求めた。別に、日本臨床化学会勧告法試
薬〔第一試薬＝ＮＡＤＨ（０．２ｍＭ）、ＬＤＨ（２５
００Ｕ）、アラニン（６２０ｍＭ）を含む１１１ｍＭト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ
７．５０、３０℃）；第二試薬＝α−ケトグルタル酸
（１５０ｍＭ）を含む１１１ｍＭトリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ７．５０、３０℃）〕
を用いて常用基準法にてＧＰＴ活性を測定し、本発明方
法との相関を確認した。結果を図４に示す。

【００３０】

【発明の効果】本発明のＧＰＴ測定用試薬は、液状のま
まで、暗所又は明所にて、常温ないし低温下で長期間
（少なくとも半年以上）にわたって安定に貯蔵すること
ができる。従って、臨床検査を実施する現場で長期に保
存しておき、使用に際しては、溶解操作の必要もなく、
そのまま自動分析機などに適用することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明試薬におけるＬＤＨの保存安定性を示す
グラフである。

【図２】本発明試薬におけるＮＡＤＨの保存安定性を示
すグラフである。

【図３】本発明試薬と従来法試薬による測定結果の相関
関係を示すグラフである。

【図４】本発明試薬と日本臨床化学会勧告法試薬による
測定結果の相関関係を示すグラフである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｌ−アラニンとα−ケトグルタル酸を基
   質としてグルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ
   （ＧＰＴ）によって生成されるピルビン酸を乳酸脱水素
   酵素によって乳酸に変え、共存させておいた還元型ニコ
   チンアミドアデニンジヌクレオチド量の減少量を測定す
   ることからなる前記グルタミン酸ピルビン酸トランスア
   ミナーゼ（ＧＰＴ）の測定法の試薬において、少なくと
   も還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、乳酸
   脱水素酵素及びアミノ酸を含有する第一試薬と、少なく
   ともＬ−アラニン及びα−ケトグルタル酸を含有する第
   二試薬とからなり、第一試薬のｐＨが８．５〜１０であ
   り、第二試薬のｐＨが５〜８．５であり、そしてそれぞ
   れ液状試薬であることを特徴とする、グルタミン酸ピル
   ビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）測定用試薬。