JPH069696A - システイン残基で修飾することによる成長ホルモン及び他のタンパク質の安定化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】タンパク質中に本来存在する、又は部位特異的
変異誘発などによりタンパク質中に挿入した存在量の少
ないシステイン残基を修飾する選択的方法を提供する。 【構成】新規な誘導体化組み替え、又は天然タンパク質
において、タンパク質中に本来存在する又は挿入された
少なくとも１個のシステイン残基を（ＣＨ_２ＣＯ
_２Ｒ_１），（ＣＨ_２ＣＯＮＨＲ_１），［ＣＨ（ＣＯ
Ｒ_２）（ＣＨ_２）_ｘ（ＣＯＲ_３）］，［ＣＨ_２−ＣＯＮ
ＨＣＨ（ＣＯＲ_２）（ＣＨ_２）_ｘ（ＣＯＲ_３）］、又は
［ＣＨ_２ＣＯＮＨ（ＣＨ_２）_ｘＣＯＲ_４］から選んだ置
換基を用いて誘導体化する；ここでＲ_１はＣＨ_２ＣＨ_２
−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｙＯＭｅであり；Ｒ_２及びＲ_３は
Ｈ又はＲ_４であり；Ｒ_４はＮＨＣＨ_２ＣＨ_２（ＯＣＨ_２
ＣＨ_２）_ｙＯＭｅ、又はＯＣＨ_２ＣＨ_２（ＯＣＨ_２−Ｃ
Ｈ_２）_ｙＯＭｅであり；Ｘは１から３の整数であり、Ｙ
は１０から３００の整数であり；Ｒ_２及びＲ_３は同時に
Ｈであることはできない。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の背景】本発明は、新規な誘導組み替え又は天然
タンパク質、及び／又はポリペプチドにおいて、該タン
パク質及び／又はポリペプチドが１個以上のシステイン
残基を含み、該残基が本文中で定義する置換基を用いて
誘導体化されていることを特徴とするタンパク質及び／
又はポリペプチドに関する。さらに、その本来の形態で
システインを含まないタンパク質は、例えば部位特異的
変異誘発により改変し、有利な部位にシステインを導入
し、その後該システインを誘導体化することができる。

【０００２】分子生物学的方法により多くのタンパク質
及び／又はポリペプチド（今後タンパク質と言う）の利
用性は劇的に増加したが、多くの場合該タンパク質の治
療上の利用は他の因子、例えば凝集、加水分解による分
解、低い生物利用性及び有効な調剤の調製を妨げる物理
的性質などにより阻害される。本発明においては、組み
替え起源、及び天然起源のタンパク質中のシステイン残
基上の高活性のスルフヒドリル基を誘導体化し、タンパ
ク質表面上の有効電荷を改変し、それにより等電点を改
変する、あるいはタンパク質に表面修飾ポリマ−を結合
する。

【０００３】電荷等電点の改変の利点は、タンパク質調
剤のｐＨが等電点と大きく異なる場合タンパク質の凝集
を最少にするという理由で周知である。従って等電点の
操作は凝集を最少にする方法を与える。

【０００４】又、タンパク質調剤の改良のための別の機
構として、それに限定されるわけではないが、例えばポ
リエチレングリコ−ル、及びポリプロピレングリコ−ル
を包含する誘導体化化合物とタンパク質との複合による
方法がある。これらの方法の利点として認められている
いくつかの点には：免疫原性及び抗原性が低くなるこ
と、作用時間が長くなること及び薬物動態学的性質の改
変が含まれる。［Ｆ．Ｍ．Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ｃｈｉｍ
ｉｃａｏｇｇｉ（１９８９）５３］。

【０００５】これまで、ポリマ−分子のタンパク質への
結合は、主にリシン又は他の塩基性アミノ酸を経てい
た。これはアルキル化剤、例えばトリアジン誘導体、ジ
アゾニウム塩、又はコハク酸誘導体などの活性アシル化
剤を用いて行われた。これらの反応は制御が困難で、タ
ンパク質中の必須アミノ酸との反応により生物活性の重
大な損失が起こることが多かった［Ｆ．Ｆ．Ｄａｖｉｓ
等，Ｐｏｌｙｍｅｒ（１９７９）２０ ３５７参照］。

【０００６】それに対し本発明は、タンパク質中に本来
存在する、又は部位特異的変異誘発などによりタンパク
質中に挿入した存在量の少ないシステイン残基を修飾す
る選択的方法を提供する。

【０００７】誘導タンパク質の配合物を提供するのが本
発明の目的であり、そのタンパク質には生物学的に有効
でありさらに安定に投与できる（哺乳類、鳥類及び魚類
の）成長ホルモン、哺乳類 ＩＧＦ−１、及びＩＧＦ−
２、インタ−リュ−キン、インタ−フェロン、プロウロ
キナ−ゼ、腫瘍壊死因子、アンチトロンビン ＩＩＩが
含まれるが、これらに限定されるわけではない。さらに
前記で示した通り、部位特異的変異誘発を用いて該タン
パク質の有利な部位にシステインを導入することができ
るので、該タンパク質は、自然の形でシステイン残基を
含むタンパク質に限定されない。非経口的投与に適した
生物活性の組み替え、及び／又は天然のタンパク質の配
合物の提供が本発明のもうひとつの目的であり、該配合
物は、生物活性量の誘導体化成長ホルモン（動物又はひ
と型の）、あるいは他のタンパク質、又はそれらの製薬
上あるいは薬理学上許容できる塩を、製薬上又は薬理学
上許容できる固体あるいは液体キャリヤ−中に含む。

【０００８】どのようなシステイン−含有タンパク質の
修飾もできる新規配合物の提供は本発明のさらに別の目
的である。イオン化性官能基の性質及び数、及び／又は
表面修飾ポリマ−の大きさ及び数を適切に選ぶことによ
り、物理的性質が明確に異なるある範囲の誘導体化タン
パク質が製造される。

【０００９】本発明のこれらの目的及び他の目的は下記
に示す発明に関するより詳細な説明によりさらに明らか
となるであろう。

【００１０】

【発明の要約】本発明は、成長ホルモン、ＩＧＦ−１、
及びＩＧＦ−２、インタ−リュ−キン、インタ−フェロ
ン、プロウロキナ−ゼ、腫瘍壊死因子、アンチトロンビ
ン ＩＩＩを含むがそれに限定されるわけではない新規
な誘導体化組み替え、又は天然タンパク質において、タ
ンパク質中に本来存在する又は挿入された少なくとも１
個のシステイン残基を（ＣＨ₂ＣＯ₂Ｒ₁），（ＣＨ₂ＣＯ
ＮＨＲ₁），［ＣＨ（ＣＯＲ₂）（ＣＨ₂）_x（ＣＯ
Ｒ₃）］，［ＣＨ₂−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＲ₂）（ＣＨ₂）
_x（ＣＯＲ₃）］，又は［ＣＨ₂ＣＯＮＨ（ＣＨ₂）_xＣＯ
Ｒ₄］から選んだ置換基を用いて誘導体化し；ここでＲ₁
はＣＨ₂ＣＨ₂−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_yＯＭｅであり；Ｒ₂及
びＲ₃はＨ又はＲ₄であり；Ｒ₄はＮＨＣＨ₂ＣＨ₂（ＯＣ
Ｈ₂ＣＨ₂）_yＯＭｅ、又はＯＣＨ₂ＣＨ₂（ＯＣＨ₂−ＣＨ
₂）_yＯＭｅであり；Ｘは１から３の整数であり、Ｙは１
０から３００の整数であり；Ｒ₂及びＲ₃は同時にＨであ
ることはできず；該タンパク質又はポリペプチドの誘導
体化システイン残基が誘導体化の前にジスルフィド結合
を形成している場合、両システインは誘導体化の完結後
同一のスルフヒドリル誘導体を有することを特徴とする
タンパク質に関する。さらに１個以上のシスルフィド結
合を有するいくつかのタンパク質の場合、該スルフィド
結合の１個あるいはそれ以上を選択的に分裂させ、選択
的に分裂したジスルフィド結合を残りのシステイン残基
に影響を及ぼすことなく誘導することができる。ジスル
フィドを連続的に分裂させる場合、１種類以上の配合物
を用いて異なるシステインを誘導することができる。さ
らに該タンパク質が非対システインを有する場合、残基
は還元段階を経ずに誘導する。

【００１１】本発明は又、新規誘導体化化合物におい
て、該化合物が以下から成り：ＺＣＨ₂ＣＯ₂Ｒ₁，ＺＣ
Ｈ₂ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＲ₂）［（ＣＨ₂）_x（ＣＯ
Ｒ₃）］，ＺＣＨ（ＣＯＲ₂）［（ＣＨ₂）_x（ＣＯ
Ｒ₃）］、又はＺＣＨ₂ＣＯＮＨ（ＣＨ₂）_xＣＯＲ₂、こ
こでＲ₁はＣＨ₂ＣＨ₂（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_yＯＭｅであり；
Ｒ₂及びＲ₃はＨ又はＲ₄であり；Ｒ₄はＮＨＣＨ₂ＣＨ
₂（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_yＯＭｅ、又はＯＣＨ₂ＣＨ₂（ＯＣＨ
₂ＣＨ₂）ｙＯＭｅであり；ＺはＢｒ又はＩであり；Ｘは
１から３の整数であり、Ｙは１０から３００の整数であ
り；Ｒ₂及びＲ₃は同時にＨでであることはできないこと
を特徴とする化合物を提供する。

【００１２】本発明はさらに、組み替えた動物成長ホル
モンの凝集を、該成長ホルモンの５５及び１６６位、又
は１８３及び１９１位にあるシステイン アミノ酸残基
間の２個のジスルフィド架橋の少なくとも１個を還元
し、その後５５及び１６６位、及び／又は１８３及び１
９１位にある還元架橋の各システインを、同一の誘導体
を用いて誘導体化することにより妨げる方法であつて、
５５及び１６６位のシステイン上の誘導体は１８３及び
１９１位のシステイン上の置換基と同一であるか又は異
なった置換基であることを特徴とする方法に関してい
る。本発明の新規誘導体化組み替え動物成長ホルモンの
製造に使用する置換基には以下のものが含まれる：（Ｃ
Ｈ₂ＣＯ₂Ｒ₁），（ＣＨ₂ＣＯＮＨＲ₁）［ＣＨ（ＣＯ
Ｒ₂）（ＣＨ₂）_x（ＣＯＲ₃）］，［ＣＨ₂ＣＯＮＨＣＨ
（ＣＯＲ₂）（ＣＨ₂）_x（ＣＯＲ₃）］，又は［ＣＨ₂Ｃ
ＯＮＨ−（ＣＨ₂）_xＣＯＲ₄］；ここにＲ₁はＣＨ₂ＣＨ₂
（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_yＯＭｅであり；Ｒ₂及びＲ₃はＨ又は
Ｒ₄であり；Ｒ₄はＮＨＣＨ₂ＣＨ₂（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_yＯ
Ｍｅ、又はＯＣＨ₂ＣＨ₂（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_yＯＭｅであ
り；Ｘは１から３の整数であり、Ｙは１０から３００の
整数であり；Ｒ₂及びＲ₃は同時にＨであることはできな
い。

【００１３】本発明はさらに、前述の誘導体を用いて１
２７位の遊離のシステインを誘導体化することによりイ
ンタ−リュ−キン−２の半減期を増す方法に関する。

【００１４】本発明に従えば、好ましい新規動物成長ホ
ルモンは、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヒト、鳥類、及び魚類
の組み替え成長ホルモンで、その場合成長ホルモンの小
ル−プ中のジスルフィド架橋が還元され、１８３及び１
９１位のシステインが（ＣＨ₂ＣＯ₂Ｒ₁），［ＣＨ₂（Ｃ
Ｏ₂Ｒ₂）（ＣＨ₂）_x（ＣＯＲ₃）］，［ＣＨ₂ＣＯＮＨＣ
Ｈ（ＣＯＲ₂）（ＣＨ₂）_x（ＣＯＲ₃）］，又は［ＣＨ₂
ＣＯＮＨ（ＣＨ₂）_xＣＯＲ₄］；ここでＲ₁，Ｒ₂，Ｒ₃及
びＸは上記と同義である、から選んだ置換基により誘導
体化されている。

【００１５】さらに本発明のもうひとつの新規タンパク
質は、動物の成長ホルモン誘導体で、その場合それぞれ
１０２及び１１２位のＳｅｒ及びＴｙｒがシステイン残
基で置換され、通常１８３及び１９１位にあるシステイ
ン残基がグルタミン酸で置換されている。このタンパク
質は、当業者に周知の部位特異的変異誘発により製造す
る。さらにこれらの方法は、他のタンパク質に対して、
ホルモンの結合部位と相互作用する又は生物効果を引き
出す能力を変えることなくポリマーを結合するための部
位を導入するために利用される。本特許出願に関連して
生まれたすべてのプラスミド、ＤＮＡ配列及び微生物
は、逆に特定した場合を除いて、Ｐｒｉｎｓｔｏｎ，Ｎ
ｅｗ ＪｅｒｓｅｙのＡｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍ
ｉｄ Ｃｏｍｐａｎｙのカルチャーコレクションに寄託
され、かつ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ
２０９５２，Ｕ．Ｓ．ＡのＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）
に寄託されている。

【００１６】本発明の好ましい修飾組み替え動物タンパ
ク質には、以下に示すように動物及び人の成長ホルモ
ン、インタ−リュ−キン及びインタ−フェロンが含まれ
るがそれに限定されるわけではない。別のＡｓｐ−Ｇｌ
ｎ付加置換を伴わない、又は他の置換を伴う組み替え起
源の成長ホルモンは同様に本発明に従って製造される。
さらにアミノ酸鎖の一部が欠失した、アミノ酸鎖の付加
した、アミノ酸の置換された、（誘導体化のための付加
システインを含む）、活性部分を含むフラグメントを持
つ動物タンパク質はすべて本発明の範囲に含まれる。

【００１７】 組み替えブタ成長ホルモン Ｈ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｌｅ ｕ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅ ｕ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌ ａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｒ ｇ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｔｙ ｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈ ５５ ｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒ ｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ａｒ ｇ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｓｅ ｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌ ｙ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｐｈ ｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅ ｒ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓ ｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｍｅ ｔ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒ ｇ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｔｙ ｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｓｅ ｒ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｇｌ １６６ ｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅ ｕ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｖａ １８３ ｌ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｓｅ ｒ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ＯＨ 組み替えウシ成長ホルモン Ｈ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｌｅ ｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅ ｕ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌ ａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｒ ｇ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｔｙ ｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｈ ５５ ｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒ ｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｌｙ ｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｓｅ ｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌ ｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｐｈ ｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅ ｒ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓ ｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｍｅ ｔ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｒ ｇ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｔｙ ｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｓｅ ｒ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｇｌ １６６ ｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅ ｕ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｖａ １８３ ｌ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｌ ａ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ＯＨ 組み替えＣｙｓ¹¹²，¹²²，Ｇｌｕ¹⁸³，¹⁹¹ブタ成長ホルモン Ｈ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｌｅ ｕ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅ ｕ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌ ａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｒ ｇ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｔｙ ｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈ ｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒ ｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ａｒ ｇ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｓｅ ｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌ ｙ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｐｈ １１２ ｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅ １２２ ｒ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓ ｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｍｅ ｔ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒ ｇ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｔｙ ｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｓｅ ｒ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｇｌ ｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅ ｕ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｖａ １８３ ｌ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｓｅ １９１ ｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ＯＨ 組み替えヒト成長ホルモン Ｈ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅ ｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｌｅ ｕ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌ ａ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌ ｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙ ｒ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｓｅ ５６ ｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｔｈ ｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌ ｎ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｉｌ ｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｌｅ ｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｖａ ｌ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｌ ａ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅ ｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｔｈ ｒ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅ ｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌ ｎ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｓｅ ｒ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓ １６７ ｎ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｌｙ ｓ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅ １８４ ｕ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｇｌ １９１ ｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−ＯＨ 組み替えＩＬ−２ Ｈ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｓ ｎ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅ ｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙ ｓ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅ ｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｔｙ ｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅ ｕ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｃｕｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌ ｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｓ ｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｐｒ ｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｓ ｎ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌ ｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌ ｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｖａ ｌ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｐｈ ｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ｔｈ ｒ誘導体化タンパク質 誘導体化タンパク質は、水酸化ナトリウム又はアンモニ
ウムなどの塩基水溶液を用いてｐＨ８．４に調節した
水、又はグアニジンヒドロクロリド、重炭酸ナトリウム
などの水溶液中にタンパク質を溶解又は分散して製造す
る。ジスルフィド結合の還元が必要な場合には、（ＤＬ
−トレオ−１，４−ジメルカプト−２，３−ブタンジオ
−ル ＤＴＴ）をこの溶液にゆっくり加える。添加は一
般に室温にて窒素雰囲気下で行う。得られた溶液に誘導
体化剤を加える。混合液を約１−４時間撹拌する。反応
の進行を非修飾チオ−ル基のＥｌｌｍａｎ滴定、又はゲ
ル電気泳動により追跡する。反応が完結した後、限外濾
過により脱塩する。溶液を濃縮し、水又はグアニジンヒ
ドロクロリド水溶液を用いた再希釈及び限外濾過を数回
行う。最終の濾過の残留物を凍結乾燥し、誘導体化タン
パク質を得る。

【００１８】２種類の誘導体化剤をＮ−Ｆｍｏｃ−Ａｓ
ｐ（^tｂｕ）ＯＨから製造し、そのフロ−チャ−ト１及
びフロ−チャ−ト２に示す。ポリエチレングリコ−ルモ
ノメチルエ−テル（ＰＥＧ−ＯＭｅ）から誘導されるア
ミンは、標準的方法により容易に得られる。このアミン
をジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）又は他の
関連脱水剤を用いてＮ−Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（^tｂｕ）Ｏ
Ｈと縮合させる。標準的方法を用いてＦｍｏｃ保護基を
除去し、（Ｉ）を得る。ＤＣＣを用いて（Ｉ）とヨ−ド
酢酸の縮合を行い、ｔｅｒｔ−ブチルエステルを除去す
るとアルキル化剤が得られる。ポリマ−がｂ−カルボキ
シル基のみに結合した、及びａ及びｂカルボキシル基の
両方に結合した同様の誘導体が、使用する出発材料に依
存して製造されることは明らかであろう。

【００１９】フロ−チャ−ト１

【００２０】

【化１】

【００２１】コハク酸誘導体（フロ−チャ−トＩＩ）も
Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（^tｂｕ）ＯＨから製造する。遊
離の酸をＤＣＣを用いてｐ−ニトロ安息香酸（ＰＮＢ）
エステルに転化し、ピペリジンを用いてアミノ基の脱保
護を行う。

【００２２】フロ−チャ−ト２

【００２３】

【化２】

【００２４】アミノ基をジアゾニウム塩に転化する（硝
酸ｉ−アミル／ＨＯＡｃ）。活性ＰＮＢエステルをＨ₂
Ｎ−ＰＥＧ−ＯＭｅを用いて置換し、ポリマ−側鎖を導
入する。ＨＩで処理すると、ヨウ化物によるジアゾ結合
の置換及びｔｅｒｔ−ブチルエステル保護基の加水分解
が同時に起こり、最終生成物を与える。

【００２５】Ｆｍｏｃ−Ｎ−Ａｓｐ（⁺ｂｕ）ＯＡの代
わりにＮ−保護 ３−アミノ酪酸（フロ−チャ−ト３）
を用いると、対応する一官能基化ヨウドアセトアミド誘
導体が製造される。同様にＰＥＧ−ヨ−ドアセテ−トが
ＤＣＣ媒介カップリングにより直接製造される。

【００２６】ポリマ−の結合は、アミド結合、あるいは
エステル結合であることができることは明らかであろ
う。この２種類の官能基の加水分解され易さは異なり、
好ましい結合のしかたは特定の適用法に伴って変わるで
あろう。さらにＰＥＧポリマ−は、広い分子量の範囲で
得ることができ、それはすべて非常に有用である。又、
ポリマ−は、ポリエチレングリコ−ル又はポリプロピレ
ングリコ−ルに限定されない。他の非常に有用なポリマ
−には、ポリビニルアルコ−ル、デキストラン及び炭水
化物類、ポリピロリドンが含まれるがこれらに限定され
ない。

【００２７】フロ−チャ−ト３

【００２８】

【化３】 部位特定的突然変異生成 本発明の修飾（置換）組み替え動物（又は人）成長ホル
モン、又は他のタンパク質の製造は、部位特定的突然変
異生成により行うことができる。ＤＮＡのクロ−ン区分
の特定の決められた部位のＤＮＡ配列の変更に現在使用
されている方法は、そのＤＮＡの１重鎖の形態のものを
形成することを必要とする。１重鎖ＤＮＡを、オリゴヌ
クレオチドがその中に誤対合区域を含む以外、その部分
と相補的である合成オリゴヌクレオチドとアニ−リング
する。誤対合区域は通常オリゴヌクレオチドの中心部分
に位置する。アニ−リング混合物を、Ｔ４ ＤＮＡリガ
−ゼ及びアデノシン ５’トリホスフェ−トの存在下に
Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラ−ゼＩ、大切片及びデオキ
シヌクレオチドトリホスフェ−トを添加して２重鎖とし
そして共有結合により閉じる。その後２重鎖ＤＮＡを適
したＥ．ｃｏｌｉ株に形質転換し、そこでＤＮＡの誤対
合区域が修復され、複製される。２群のクロ−ンが得ら
れる。修復合成の鋳型としてどちらの鎖を選ぶかによ
り、クロ−ンは野生型、あるいは変異（突然変異）型配
列のどちらかを含む。突然変異型配列を含む、すなわち
オリゴヌクレオチドの配列に対応する配列を含むクロ−
ンを、放射活性標識をしたオリゴヌクレオチドと交雑す
ることにより選ぶ。オリゴヌクレオチド及び野生型配列
の間の誤対合により、放射活性標識をしたオリゴヌクレ
オチドは突然変異型配列を含むクロ−ンとより安定に結
合する。従って適切な温度におけるインキュベ−トによ
り野生型と突然変異型クロ−ンとを分けることができ
る。同定したクロ−ンの変化を適切な領域のＤＮＡ配列
決定により確認する。突然変異生成のひとつの目的は、
小ル−プジスルフィド結合を形成することができない、
好ましく組み替え誘導したタンパク質成長ホルモン（ｒ
ｐＳＴ）分子を生成させることである。小ル−プジスル
フィドは、１８３及び１９１位のシステイン間に位置す
る。別の目的は、加水分解部位と同定された１０２−１
１２残基に位置するオメガル−プに２個のシステイン残
基を導入することである。これらの新しく導入されたシ
ステインは、本文中に記載する方法によりさらに修飾す
る。必要な突然変異体を得るために使用される基本的方
法を以下に記載する。

【００２９】Ｓｅｒ１０２及びＴｙｒ１１２残基の置換
は２個のオリゴヌクレオチドを用いて行う。２個のオリ
ゴヌクレオチドは以下の配列を有する： ５’ＴＴＣ ＡＣＣ ＡＡＣ ＴＧＴ ＣＴＧ ＧＴＧ
ＴＴＴ ３’Ｓｅｒ１０２ ５’ＧＡＣ ＣＧＣ ＧＴＣ ＴＧＴ ＧＡＧ ＡＡＧ
ＣＴＧ ３’Ｔｙｒ１１２ 鋳型となる一重鎖ＤＮＡは、ｐＧＥＭ３ｚ−（ｆ＋）ｐ
ＳＴ−ＳＸ ＤＮＡである。この一重鎖ＤＮＡは、すで
に通常１８３及び１９１位に存在するシステインを２個
のＧｌｕ残基で置換して修飾してある（このＤＮＡは下
記に示すように発現ベクタ−ＰＲ０２１１として寄託さ
れている）。２０００ｎｇの一重鎖ＰＧＥＭ３ｚ（ｆ
＋）ｐＳＴ−ＳＸ ＤＮＡを、前以てアデノシン ５’
トリホスフェ−ト及びポリヌクレオチドキナ−ゼを用い
て５’ホスホリル化してあるＡＡ１オリゴヌクレオチド
５０ｎｇと混合する。混合物を６５℃に７分間加熱し、
その後室温に１０分間保つ。この方法によりオリゴヌク
レオチドと一重鎖ＤＮＡをアニ−リングする。その後ア
ニ−リングしたＤＮＡをＡＴＰ，ｄＮＴＰ’ｓ（４個の
デオキシリボヌクレオチド５’トリホスフェ−トの混合
物）、Ｔ４ ＤＮＡリガ−ゼ及びＤＮＡポリメラ−ゼＩ
大切片を添加して共有結合により閉じた二重鎖の形態に
転化させる。この混合物を室温にて１時間インキュベ−
トする。この混合物を標準的方法によりＨＢ１０１コン
ピ−テント細胞に形質転換する。３７℃にて終夜インキ
ュベ−トした後、コロニ−をニトロセルロ−ズのフィル
タ−上に移し、標準的方法により交雑を行わせる。形質
転換コロニ−は、放射標識オリゴヌクレオチドプロ−ブ
を用いて同定した。これらのコロニ−からプラズマＤＮ
Ａを製造し、前記したとおりにＨＢ１０１コンピ−テン
ト細胞に導入し、放射活性オリゴヌクレオチドプロ−ブ
を用いて再びスクリ−ニングする。プラスミドＤＮＡ
を、プロ−ブと交雑したコロニ−から再度製造する。ｐ
ＧＥＭ−３ｚ（ｆ＋）ｐＳＴ−ＳＸＥ−Ｓ１０２Ｃで示
すＳ１０２Ｃ突然変異を含むひとつのクロ−ンからのプ
ラスミドＤＮＡを形質転換によりＪＭ１０１コンピ−テ
ント細胞に導入し、１個の形質転換細胞から導いた精製
ファ−ジから一重鎖ＤＮＡを製造した。チロシンを１１
２位で突然変異させるために、以下の配列を有する第２
のオリゴヌクレオチドを使用する： ５’ ＧＡＣ ＣＧＣ ＧＴＣ ＴＧＴ ＧＡＧ ＡＡ
Ｇ ＣＴＧ ３’ 変異生成の過程は鋳型ＤＮＡがｐＧＥＭ−３ｚ（ｆ＋）
ｐＳＴ−ＳＸＥ−Ｓ１０２Ｃ（これは変異生成から単離
したクロ−ンであり、１０２位のセリンがシステインに
変換されている）であり、１８３及び１９１位のシステ
インがグルタミン酸置換基であることを除いて上記と同
様である。最終の洗浄温度は５６℃である。ＤＮＡ配列
決定により同定したクロ−ンが所望の配列を有すること
が明らかになる。この突然変異クロ−ンをｐＧＥＭ−３
ｚ（ｆ＋）ｐＳＴ−ＳＸＥ−Ｓ１０２Ｃ，Ｙ１１２Ｃと
表す。

【００３０】その後変異（突然変異体）クロ−ンを、Ｅ
ＰＯ公開１７３，２８０の図５に記載の通りに、バクテ
リアの発現プラスミドｐＲ０２１１（ＡＴＣＣ Ａｃｃ
ｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ４０４８３，１９８８年
８月２３日に寄託）に再構成する。ｐＧＥＭクロ−ンを
ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いて切断し、ｐＳＴ
遺伝子フラグメントを単離する。ｐＲＯ２１１を子牛の
腸のアルカリホスファタ−ゼを用いて処理した同一の酵
素で消化し、大切片を単離する。２片をＴ４ＤＮＡリガ
−ゼで結合させ、適したバクテリア株、例えば保管され
ているＥ．ｃｏｌｉＮ９９ｃＩに形質転換する。

【００３１】この株には野生型 ｇリプレッサ−が存在
する。これはｐＲＯ２１１中のＰ_Lプロモ−タ−からの
発現を妨げる。１度適した構成物を単離したら、それを
温度感応性 ｇリプレッサ−を含むバクテリア株、例え
ば（ＡＴＣＣ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ６
７７６６、１９８８年８月２３日に寄託した）Ｅ．ｃｏ
ｌｉ４２００に転移させる。これらの株中ではｐＳＴの
発現は温度に依存する。４２℃でリプレッサ−は不活性
となり発現が起こる。この段階でｐＳＴがＥＰ１７３，
２８０に含まれる方法により製造され発現が起こる（こ
こに参照として挿入）。ｐＳＴの発現はこれらの特定の
Ｅ．ｃｏｌｉ株に限定されていない。適した性質を有す
る他の株に置換できる。プラスミド発現ベクタ−はＡＴ
ＣＣに寄託されている。バクテリア株は別に寄託されて
いる。

【００３２】他のアミノ酸での置換は、適したコドン及
びオリゴヌクレオチドを用いて上記の方法により行うこ
とができる。同様にこれらの方法は多種の動物又は人の
成長ホルモンの修飾に使用される。

【００３３】使用法 有利なことに、本発明の新規動物タンパク質は、動物に
おける病気の状態の軽減；動物、特に食肉動物の成長速
度の増進；及びそれによる食糧の利用価値の向上に有用
である。これらの配合物のいくつかは、動物の食肉とし
ての質の向上、すなわち動物の脂肪に対する赤身の肉の
比率の増加に有効である。さらに、本発明の配合物のい
くつかは、酪農動物における乳の生産の増加、及び羊な
らびにコ−トのために飼育する他の動物における毛の生
産の増加に有効である。

【００３４】本発明の誘導体化成長ホルモンは、上記の
生物的改良のための動物の処理に有効であるが、本発明
の誘導体化動物成長ホルモンの高い有効性及び有用性
は、一部には該成長ホルモンの誘導体化により製造した
成長ホルモンの凝集の阻止に起因する。そのような阻止
により、本発明に記載の誘導体化を行わない天然の成長
ホルモン、又は組み替え成長ホルモンでは容易に、ある
いは有効に達成できない非常に改良された持続性放出系
の形成が可能になる。

【００３５】本発明の誘導体化成長ホルモンは、非常に
安定で、特に２量体形成による凝集がないということも
わかる。さらに本発明の誘導体化成長ホルモンは、高度
に改良された持続性放出系の形成に使用するのに有用で
ある。

【００３６】天然の動物成長ホルモンが１日で凝集する
のがわかった場合でも、本発明の修飾又は誘導体化成長
ホルモンを含む非経口投与用配合物は、１０日かそれ以
上修飾又は誘導体化成長ホルモンを放出し続ける。

【００３７】配合物 実際に本発明の配合物は、一般に、生物活性非経口投与
配合物の形態で注射により動物に投与する。本発明の組
み替え動物タンパク質の投与に有用な非経口配合物に
は、ゲル、ペ−スト、微小球、微細カプセル、移植片な
どがある。それはそれとして、基質の放出を制御でき、
従って投与の回数を減らすことができる生物活性物質の
投与形態を提供することは非常に興味深い。生物活性大
分子の持続性放出配合物の開発には、その複雑な作用形
態及び大分子の複雑な構造のために特別な問題が起こ
る。従って生物活性成長ホルモンを含む有効な持続性放
出配合物の開発が必要である。

【００３８】この種の投与に有用な配合物は、修飾又は
誘導体化動物成長ホルモンを希水酸化アンモニウムに溶
解し、その後アルカリ金属ベンゾエ−ト、ラウレ−ト、
カ−ボネ−トなどをそれに加えることにより製造する。
その後非イオン性界面活性剤を溶液と混合し、得られた
混合物を噴霧乾燥する。そのようにして形成した固体を
溶融脂肪又はワックス、あるいはその混合物と混合し、
得られた溶融混合物を、流入空気及び溶融層を融点以上
の温度に保つための加熱ジャケットをつけた空気／液体
噴射ノズルから噴射する。溶融液滴が冷却されると微小
球が形成される。これらを約４５−１８０ミクロンの所
望の大きさの範囲の一系列のふるい上に集め、使用のた
めに保存する。所望の大きさの範囲でない微小球は再利
用する。他の方法としては、均一な混合物を遠心板上に
供給し、形成する微小球を上記のように集める、又は溶
融混合物を冷却し、所望の範囲の平均粒径に粉砕する方
法がある。

【００３９】その後生物活性微小球を製薬上及び薬理学
上許容できる、動物への注射用の液体媒体中に分散す
る。一般に微小球−液体配合物は、通常頭部、頸部又は
耳の付近における皮下注射により動物に投与する。

【００４０】本発明の誘導体化動物タンパク質は又、従
来のペレット移植ガンを用いて動物の皮下に噴射する生
物適合性移植として製造される。配合物は、粉末誘導体
化成長ホルモンを、ヒマシ油ワックスなどのワックス、
あるいはコポリ（グリコリド／ラクチド）、水酸化マグ
ネシウム、及びプロピレンオキシドとプロピレングリコ
−ルの縮合物、エチレンオキシドの縮合物などの混合に
より調製した疎水性基剤との混合により製造する。この
ようにして製造した配合物をペレット成型機に導入し、
直径が約１／８インチの円筒状ペレットに成型する。そ
のようにして成型したペレットを従来のペレット移植ガ
ンを用いて投与する。

【００４１】本発明を下記に示す実施例によりさらに説
明する。

【００４２】

【実施例１】Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（^tｂｕ）ＮＨ−Ｐ
ＥＧ−ＯＭｅの製造 １．２４ｇ（３ｍＭ）のＦｍｏｃ Ａｓｐ（^tｂｕ）Ｏ
Ｈ、及び４０ｍＬのＣＨ₂Ｃｌ₂の溶液に、０．３ｇ
（１．５ｍＭ）のジシクロヘキシルカルボジイミドを加
え、反応混合物を室温で１時間撹拌する。沈澱するジシ
クロヘキシルウレア ３ｇを加える。反応混合物を室温で終夜撹拌する。メチ
レンクロリドを蒸発させ、残留物を３００ｍＬのＨ₂Ｏ
に溶解する。この溶液を濾過し、ＹＭ−２ Ａｍｉｃｏ
ｎ膜を通して限外濾過し、凍結乾燥して３ｇの生成物を
得る。

【００４３】

【実施例２】Ｈ₂Ｎ−Ａｓｐ（^tｂｕ）ＮＨ−ＰＥＧ−Ｏ
Ｍｅの製造 ３ｇの実施例１からのＦｍｏｃ−ＮＨＡｓｐ（^tｂｕ）
ＮＨ−ＰＥＧ−ＯＭｅを３０ｍＬのピペリジン−メチレ
ンクロリド（１：１ ｖ／ｖ）に室温で加え、３０分撹
拌する。メチレンクロリドを蒸発させ、残留物を２００
ｍＬのＨ₂Ｏに溶解し、Ａｍｉｃｏｎ ＹＭ−２膜を通
して限外濾過する。残留水溶液を凍結乾燥して２．５ｇ
の生成物を得る。

【００４４】

【実施例３】ＩＣＨ₂ＣＯＮＨＡｓｐ（^tｂｕ）ＮＨ−Ｐ
ＥＧ−ＯＭｅの製造 ０．４２７ｇのヨ−ド酢酸、及び２０ｍＬのメチレンク
ロリドの溶液に０．２３７ｇのＤＣＣを加え、反応混合
物を室温で１時間撹拌する。沈澱するジシクロヘキシル
ウレアを濾過し、２．５ｇのＨ₂Ｎ−Ａｓｐ（^tｂｕ）Ｎ
Ｈ−ＰＥＧ−ＯＭｅを加え、混合物を室温で３時間（ニ
ンヒドリン試験に陰性となるまで）撹拌する。メチレン
クロリドを蒸発させ、残留物を水に溶解し、Ａｍｉｃｏ
ｎ ＹＭ−２膜を通して限外濾過する。溶液を凍結乾燥
して２．６ｇの生成物を得る。

【００４５】

【実施例４】ＩＣＨ₂ＣＯＮＨＡｓｐ（ＯＨ）ＮＨ−Ｐ
ＥＧ−ＯＭｅの製造 ２．６ｇのＩＣＨ₂ＣＯＮＨ−Ａｓｐ（^tｂｕ）ＮＨ−Ｐ
ＥＧ−ＯＭｅを４０ｍＬのトリフルオロ酢酸／メチレン
クロリド（１：１ ｖ／ｖ）に溶解し、混合物を室温で
１時間撹拌する。溶媒を蒸発させ、残留物を約２００ｍ
ＬのＨ₂Ｏに溶解する。溶液をＡｍｉｃｏｎ ＹＭ−２
膜を通して限外濾過し、０℃にて水酸化アンモニウムを
用いて中和する。凍結乾燥により２ｇのＩＣＨ₂ＣＯＮ
ＨＡｓｐ（ＯＨ）ＮＨ−ＰＥＧ−ＯＭｅを得る。

【００４６】

【実施例５】［（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＮＨＣＯＡｓｐ（Ｏ
Ｈ）ＮＨＣＯＣＨ₂）Ｃｙｓ¹⁸³，¹⁹¹］−ｒｐＳＴの製
造 ２００ｍＬの０．５Ｍ ＮＨ₄ＨＣＯ₃（ｐＨ＝８．４）
中の４００ｍｇのｒ−ｐＳＴの溶液に２８．０ｍｇのジ
チオトレイト−ルを加え、反応混合物を１時間撹拌す
る。この還元ｒ−ｐＳＴに１ｇのＭｅＯ−ＰＥＧ−ＮＨ
ＣＯ−Ａｓｐ（ＯＨ）ＮＨＣＯＣＨ₂Ｉを加え、混合物
を３時間撹拌する。Ｅｌｌｍａｎ試験により遊離のチオ
−ルが残っているのでさらに１ｇのヨ−ドアセトアミド
誘導体を加え、混合物を室温で１８時間撹拌した。反応
混合物を希釈し、Ａｍｉｃｏｎ ＹＭ−１０膜を通して
限外濾過し、凍結乾燥により４００ｍｇの生成物を得
る。

【００４７】

【実施例６】Ｆｍｏｃ ＮＨ Ａｓｐ（^tｂｕ）ＣＯＰ
ＮＢの製造 ８ｇのＦｍｏｃ−Ａｓｐ（^tｂｕ）ＯＨ及び２５０ｍＬ
のメチレンクロリドの溶液に２．０１ｍｇのＤＣＣを加
え、得られる溶液を室温で１．５時間撹拌する。沈澱す
るジシクロヘキシルウレアを濾過し、１．３５ｇの４−
ニトロフェノ−ルを加え、反応混合物を１８時間撹拌す
る。溶液を冷却し、５％冷Ｎａ₂ＣＯ₃及びブラインで洗
浄する。乾燥後、溶液を蒸発させ４．２７ｇの生成物を
得る。

【００４８】

【実施例７】Ｈ₂ＮＣＨ（ＣＯ₂ＰＮＢ）ＣＨ₂ＣＯ₂ ^tｂ
ｕの製造 ２ｇのＦｍｏｃ ＮＨＣＨ（ＣＯ₂ＰＮＢ）ＣＨ₂ＣＯ₂ ^t
ｂｕを３０ｍＬのピペリジンとメチレンクロリドの氷冷
混合物（１：１，ｖ／ｖ）に加え、０℃にて２時間撹拌
する。溶媒を蒸発させ、残留物をメチレンクロリドに再
溶解し、０．１Ｎの冷ＨＣｌで洗浄する。得られた溶液
を乾燥し、蒸発させ０．８３ｇの生成物を得る。

【００４９】

【実施例８】Ｎ₂ＣＨ（ＣＯＮＨ−ＰＥＧ−ＯＭｅ）Ｃ
Ｈ₂ＣＯ₂ ^tｂｕの製造 ２．０ｇのＨ₂ＮＣＨ（ＣＯ₂ＰＮＢ）ＣＨＣＯ₂ ^tｂｕ、
３滴のＨＯＡｃ及び１００ｍＬのＣＨ₂Ｃｌ₂の溶液を２
時間還流した。揮発性溶媒を蒸発させ、残留物を５０ｍ
ＬのＣＨ₂Ｃｌ₂に再溶解し、５ｇのＭｅＯ−ＰＥＧ−Ｎ
Ｈ₂を加えた。混合物を室温で終夜撹拌する。溶媒を蒸
発させ、残留物をＨ₂Ｏに溶解し、Ａｍｉｃｏｎ ＹＭ
−２膜を通して限外濾過した。凍結乾燥により１．４８
ｇの生成物を得た。

【００５０】

【実施例９】ＩＣＨ（ＣＯＮＨ−ＰＥＧ−ＯＭｅ）ＣＨ
₂ＣＯ₂Ｈ）の製造 ０．５ｇのＮ₂Ｃ（ＣＯＮＨ−ＰＥＧ−ＯＭｅ）ＣＨ₂Ｃ
Ｏ₂Ｈの溶液を５０ｍＬのＣＨＣｌ₃に溶解し、０℃に冷
却する。２ｍＬのＨＩを注意深く加え、反応混合物を０
℃にて３０分撹拌し、その後２８℃に２時間加温する。
溶液を蒸発させ、３０ｍＬのＨ₂Ｏに溶解し、Ａｍｉｃ
ｏｎ ＹＭ−２膜を通して限外濾過する。凍結乾燥後、
０．３ｇの生成物が残る。

【００５１】

【実施例１０】［（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＮＨＣＯＣＨ（Ｃ
Ｈ₂ＣＯ₂Ｈ）Ｃｙｓ¹⁸³，¹⁹¹）］の製造 ２５０ｍＬの０．５Ｎ ＮａＨＣＯ₃（ｐＨ＝８．４）
中の５００ｍｇのｒｐＳＴの溶液に３５ｍｇのジチオト
レイト−ルを加え、反応混合物を１時間撹拌する。還元
ｒｐＳＴに２．０ｇのＭｅＯ−ＰＥＧ−ＮＨＣＯＣＨＩ
（ＣＨ₂−ＣＯ₂Ｈ）を加え、反応混合物を室温にて終夜
撹拌する。反応混合物をＨ₂Ｏで希釈し、Ａｍｉｃｏｎ
ＹＭ−１０膜を通して限外濾過し、凍結乾燥して５１
０ｍｇの生成物を得る。

【００５２】

【実施例１１】ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＯＣＯＣＨ₂Ｉの製造 ２５０ｍＬのメチレン中の５ｇのヨ−ド酢酸の溶液に、
２．７６ｇのＤＣＣを加える。反応混合物を周囲温度で
２時間撹拌し、沈澱するジシクロヘキシルウレアを濾過
により除去する。残留溶液に２０ｇのＭｅＯ−ＰＥＧ−
ＯＨを加え、反応混合物を室温にて終夜撹拌する。その
後溶液を冷却し、分液ロ−トに移し、１５ｘ１０ｍＬの
冷飽和ＮａＨＣＯ₃で抽出する。残留メチレンクロリド
溶液を蒸発させ、残留物を３０ｍＬのＨ₂Ｏに溶解す
る。この溶液をＡｍｉｃｏｎ ＹＭ−２を通して限外濾
過し、最後に凍結乾燥して５．４ｇの生成物を得た。

【００５３】

【実施例１２】２個の合成オリゴヌクレオチドを用い
た、ブタ成長ホルモンのオメガル−プへのシステインの
導入 Ｓ１０２Ｃと名付けられた合成オリゴヌクレオチドは以
下の配列を有する： ５’ＴＴＣ ＡＣＣ ＡＡＣ ＴＧＴ ＣＴＧ ＧＴＧ
ＴＴＴ ３’ このオリゴヌクレオチドは１０２位におけるセリンをコ
−ドするＤＮＡがシステインをコ−ドするＤＮＡと置換
されている点でｒｐＳＴ遺伝子の類似ＤＮＡ配列と異な
っている。従って１０２位に存在するセリンがシステイ
ンに置換される。

【００５４】一重鎖ｐＧＥＭ−３ｚ（ｆ＋）ｐＳＴ−Ｓ
Ｘ ＤＮＡが突然変異生成の基質である。このＤＮＡは
商業的に入手可能なファ−ジミド、ｐＧＥＭ−３ｚ（ｆ
＋）に含まれる修飾ｒｐＳＴ遺伝子を含む。ｒｐＳＴ遺
伝子の修飾を行うと、ＤＮＡ配列が変化し、コ−ド領域
の２２５−２３０位にＳａｃ Ｉ 制限エンドヌクレア
−ゼ切断部位が導入され、２８５−２９０位にＸｂａ
Ｉ制限エンドヌクレア−ゼ切断部位が導入される。ＤＮ
Ａ配列におけるこれらの変化は、ｒｐＳＴタンパク質の
アミノ酸配列は変えない。ｒｐＳＴ遺伝子の他の２種類
の修飾は１８３及び１９１位のシステイン残基をそれぞ
れグルタミン酸に置換するＤＮＡ配列の変化を生じる。
この修飾ｒｐＳＴ−ＳＸＥ遺伝子を含むＥｃｏＲＩ／Ｈ
ｉｎｄＩＩＩフラグメントを、標準的方法でこれらの制
限エンドヌクレア−ゼを用いて切断したｐＧＥＭ−３ｚ
（ｆ＋） ＤＮＡにクロ−ニングし、ファ−ジミドｐＧ
ＥＭ−３ｚ（Ｆ＋）ｐＳＴ−ＳＸを得る。精製したファ
−ジから標準的方法で一重鎖ｐＧＥＭ−３ｚ（Ｆ＋）Ｄ
ＮＡを形成する。このＤＮＡ２０００ｎｇを、前以てア
デノシン５’トリホスフェ−ト及びポリヌクレオチドキ
ナ−ゼを用いてその５’末端をホスホリル化してあるＣ
１８３ｄｅｌオリゴヌクレオチド１００ｎｇと混合す
る。混合物は１Ｘアニ−リング緩衝液（１Ｘアニ−リン
グ緩衝液は７５ｍＭのＫＣｌ及び５ｍＭのトリス−Ｃｌ
であり、ｐＨ８．０である）中に含み全体量を１０ｍｌ
とする。混合物を６５℃にて７分間加熱し、１０分間室
温でインキュベ−トする。この方法によりオリゴヌクレ
オチドが一重鎖ＤＮＡにアニ−リングされる。アニ−ル
した分子を伸ばし、２２ｍｌのＨ₂Ｏ、１ｍｌの２０ｍ
ＭＡＴＰ、それぞれ２単位のＴ４ ＤＮＡリガ−ゼ、及
びＤＮＡポリメラ−ゼＩ大切片（単位の定義に関して
は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ｃａｔ
ａｌｏｇｕｅ，１９８６を参照）、２ｍｌの２０Ｘ ｄ
ＮＴＰ’ｓ（それぞれ濃度が２ｍＭの４種類のデオキシ
リボヌクレオチド５’トリホスフェ−トの混合物）、及
び４ｍｌの１０Ｘフィルインバッファ−（１Ｘフィルイ
ンバッファ−は２７．５ｍＭ トリス−Ｃｌ，ｐＨ７．
５，１５ｍＭ ＭｇＣｌ₂，２ｍＭＤＴＴ）を添加し
て、共有結合により閉じた二重鎖ＤＮＡに転化させる。
室温で１時間インキュベ−トした後、反応混合物の半分
を、標準的形質転換法によりＨＢ１０１コンピ−テント
細胞に導入する。３７℃で終夜インキュベ−トした後、
コロニ−をニトロセルロ−スフィルタ−上に移し、標準
的方法で交雑を行わせる。オリゴヌクレオチドＳ１０２
Ｃの５’末端をｑ−３２Ｐ−ＡＴＰ及びポリヌクレオチ
ドキナ−ゼを用いて放射標識し、それを用いて所望の突
然変異の検出を行う。５Ｘ ＳＳＣ、１Ｘ Ｄｅｎｈａ
ｒｄｔ’ｓ及び１５０ｍｇ／ｍｌの酵母ｔＲＮＡ中、３
７℃において３時間予備混成を行った後、放射標識オリ
ゴヌクレオチドを加え、フィルタ−上、３７℃にて終夜
ＤＮＡと混成を行わせる。フィルタ−を５Ｘ ＳＳＣ
中、３７℃にて３０分間洗浄し、その後ＴＡＣ中、５８
℃にて３０分間洗浄する。この後者の洗浄の間に、その
プラスミドＤＮＡが所望の突然変異を含むコロニ−のみ
につき放射標識オリゴヌクレオチドプロ−ブとの交雑を
続ける。これらのコロニ−は洗浄したフィルタ−をＸ−
線フィルムに暴露した後に検出される。最初のペトリ皿
から得たいくつかのこのようなコロニ−からプラスミド
ＤＮＡを形成し、前記のようにしてＨＢ１０１コンピ−
テント細胞に導入し、放射標識オリゴヌクレオチドプロ
−ブを用いて上記ようにして再スクリ−ニングする。プ
ロ−ブと交雑するＤＮＡを持つコロニ−からプラスミド
ＤＮＡを形成し、所望のＤＮＡ配列の分析を行う。Ｓ１
０２Ｃ突然変異を含むひとつのクロ−ンからのプラスミ
ドＤＮＡをｐＧＥＭ−３ｚ（ｆ＋）ｐＳＴ−ＳＸＥ−Ｓ
１０２Ｃと称し、形質転換によりＪＭ１０１コンピテン
ト細胞に導入し、１個の形質転換細胞から誘導した精製
ファ−ジから一重鎖ＤＮＡを形成する。

【００５５】１１２位のチロシン−コ−ドＤＮＡをシス
テイン−コ−ドＤＮＡに置換するために、Ｙ１１２Ｃと
称する以下のオリゴヌクレオチドを合成する： ５’ＧＡＣ ＣＧＣ ＧＴＣ ＴＧＴ ＧＡＧ ＡＡＧ
ＣＴＧ３’ このオリゴヌクレオチドは１１２位のチロシンコドンを
コ−ドするＤＮＡがシステインをコ−ドするＤＮＡによ
り置換されている点でｒｐＳＴ遺伝子中の類似ＤＮＡと
異なっている。

【００５６】ｐＧＥＮ−３ｚ（ｆ＋）ｐＳＴ−ＳＸＥ−
Ｓ１０２Ｃからの鋳型一重鎖ＤＮＡ、及びＹ１１２Ｃオ
リゴヌクレオチドをアニ−ルし、前と同様にして伸ば
し、くくる。混合物をＨＢ１０１コンピテント細胞中に
導入し、形質転換細胞を分析してＳ１０２Ｃについて記
載の突然変異が正確に存在することを確認する。Ｙ１１
２Ｃオリゴヌクレオチドを放射標識検出プロ−ブとして
使用する。交雑及び洗浄条件はＳ１０２Ｃについて記載
の条件と全く同条件である。Ｙ１１２Ｃ突然変異を含む
数個のクロ−ンをＤＮＡ配列決定により同定する。Ｓ１
０２Ｃ及びＹ１１２Ｃ突然変異を含むプラスミドＤＮＡ
をｐＧＥＭ−３ｚ（ｆ＋９ｐＳＴ−ＳＸＥ−Ｓ１０２
Ｃ，Ｙ１１２Ｃと称する。

【００５７】

【実施例１３】適したバクテリア発現プラスミド中への
再構成 変異（突然変異）クロ−ンをバクテリア発現プラスミド
ｐＲＯ２１１中に再構成する（ＥＰ １７３２８０に記
載、ここに参照として挿入）。Ｍ１３クロ−ンをＥＣｏ
ＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより切断し、ｐＳＴ遺伝子フ
ラグメントを単離する。ｐＲＯ２１１を、子牛腸アルカ
リホスファタ−ゼにより処理した同一の酵素を用いてク
ロ−ニングし、大切片を単離する。２片をＴ４ ＤＮＡ
リガ−ゼを用いてくくり、適したバクテリア株、例えば
Ｎ９９ｃＩ⁺中に形質転換する。この株には野生型のｇ
リプレッサ−が存在する。これがｐＲＯ２１１中のＰ₂
プロモ−タ−からの発現を妨げる。適した構成物が単離
されたら、それを温度感応性 ｇリプレッサ−を含むバ
クテリア株、例えば４２００に移す。この株におけるｒ
ｐＳＴの発現は温度に依存する。４２℃でリプレッサ−
は不活性となり発現が起こる。この段階でｒｐＳＴを、
参照としてここに挿入するＥＰ １７３２８０に記載の
方法により製造することができる。ｐＳＴ遺伝子生成物
の発現に使用するＥ．ｃｏｌｉ株はＥ．ｃｏｌｉ４２０
０に限られているわけではない。いずれの適したＥ．ｃ
ｏｌｉ株も使用することができる。

【００５８】１８３及び１９１位のシステインをアラニ
ン、セリン、グルタミン酸、アルギニン、トリプトファ
ン、又はアスパラギンを形成する適したコドンに置換す
る以外は上記実施例１，２及び３に従い、該位置におい
てシステインを形成するＴＧＴをセリンを形成するＴＣ
Ｔ，ＡＧＣ又はＡＧＴに、グルタミン酸を形成するＧＡ
Ｇ又はＧＡＡに、アルギニンを形成するＣＧＮ，ＡＧＡ
又はＡＧＧに、アスパラギンを形成するＡＡＴ又はＡＡ
Ｃに、アラニンを形成するＧＣＧに、又はトリプトファ
ンを形成するＴＧＧに転化する。

【００５９】

【実施例１４】［（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＯＣＯＣＨ₂）Ｃ
ｙｓ¹⁰²，¹¹²，Ｇｌｕ¹⁸³，¹⁹¹］−ｒｐＳＴの製造 １５０ｍＬの０．５Ｎ ＮａＨ₂Ｏ₃（ｐＨ＝８．４）中
の２００ｍｇのＣｙｓ¹⁰²，¹¹²，Ｇｌｕ¹⁸³，¹⁹¹ｒｐＳ
Ｔの溶液に２８ｍｇのジチオトレイト−ルを加え、溶液
を１時間撹拌する。溶液に５００ｍｇのＭｅＯ−ＰＥＧ
−Ｏ₂ＣＣＨ₂Ｉ ｍｉｃｏｎ ＹＭ−１０膜を通して限外濾過し、１３５
ｍｇの生成物を得る。

【００６０】

【実施例１５】［（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＮＨＣＯＣＨ₂）
Ｃｙｓ¹²⁷］インタ−リュ−キン−２の製造 ２５ｍＬの０．５Ｎ ＮａＨ₂Ｏ₃（ｐＨ＝８．４）中の
２５ｍｇのインタ−リ ０００）を加え、反応混合物を遊離のチオ−ルが検出さ
れなくなるまで４８時間撹拌する。反応混合物をＡｍｉ
ｃｏｎ ＹＭ−１０膜を通して限外濾過し、１６ｍｇの
生成物を得る。

【００６１】

【実施例１６】［（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＯＣＯＣＨ₂）Ｃ
ｙｓ¹⁸³，¹⁹¹］ｒ−ｐＳＴの製造 ２５０ｍＬの０．５Ｎ ＮａＨ₂Ｏ₃（ｐＨ＝８．４）中
の４００ｍｇのｒｐＳＴに２８ｍｇのジチオトレイト−
ルを加え、溶液を１時間撹拌する。溶液に１．０ｇのＭ
ｅＯ−ＰＥＧ−Ｏ₂ＣＣＨ₂Ｉ（Ｍｗ＝２０００）を加
え、反応混合物を室温で６時間撹拌する。反応混合物を
Ａｍｉｃｏｎ ＹＭ−１０膜を通して限外濾過し、最後
に凍結乾燥して４２０ｍｇの生成物を得る。

【００６２】

【実施例１７】誘導体化組み替え動物成長ホルモンを摂
取した動物の成長増進を決定する、脳下垂体切除ラット
試験法 本発明の種々の誘導体化組み替え動物成長ホルモンの、
動物の成長速度の変更における効率を、標準の脳下垂体
切除（ｈｙｐｏｘ）ラット検定を用いて決定する。脳下
垂体切除ラットは自身の成長ホルモンを製造できず、注
射による牛成長ホルモンに敏感である。測定する反応は
一定期間、例えば１０日などの間の成長である。

【００６３】各脳下垂体切除白子ラット（Ｔａｃｏｎｉ
ｃ Ｆａｒｍｓ，ＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙ−起源）
に、本文中の実施例に従って製造した配合物を注射す
る。その量は挙げられている調剤０．２ｍｌ中に含まれ
た８００マイクログラムのｒＰＳＴを１０日間で投与す
る（８０マイクログラム／日）のに十分な量である。別
に、各脳下垂体切除白子ラットに毎日８０マイクログラ
ムのｒＰＳＴ誘導体を注射する。

【００６４】試験法 試験の前に動物の重量を測定し、試験に使用する動物を
体重に基づいて選択する。群の平均体重からある標準偏
差内の体重を有する動物のみを選択する。得られた動物
群をコンピュ−タ−発生ランダム化法により１群当たり
８個のラットから成る処理群に無作為に分ける。試験動
物を清浄なケ−ジに移し、１ケ−ジ当たり４個のラット
を入れた。研究の第１日目に試験動物の体重を測定し、
過剰の重量が超過又は不足している動物を置き換える。
その後動物を試験群に割り当て、処理する。

【００６５】１０日の試験期間の最後に各動物の合計体
重増加を記録し、各処理に関する１個のラット当たりの
平均体重増加を決定する。下表Ｉにまとめるこれらの実
験の結果はこれらの誘導体の生物活性を示している。

【００６６】

【表１】 表Ｉ 脳下垂体切除ラット試験 脳下垂体切除ラットデ−タ ｇｍｓ（成長）誘導体 ＰＥＧ ０− ２− ４− ７− 合計 Ｍｗ ２日 ４日 ７日 １０日 ［［ＭｅＯ−ＰＥＧ−Ｏ₂ＣＣＨ− 2000 8.6 6.3 9.0 7.5 31.4 （ＣＨ₂ＣＯ₂Ｎａ⁺）ＮＨＣＯ− ＣＨ₂］Ｃｙｓ１８３，１９１］− ｒ−ｐＳＴ ［（ＭｅＯ−ＰＥＧ−Ｏ₂Ｃ− 5000 8.8 5.0 10.3 7.3 31.3 ＣＨ₂）Ｃｙｓ１８３，１９１］− ｒ−ｐＳＴ ［（ＭｅＯ−ＰＥＧ−Ｏ₂Ｃ− 2000 9.8 4.8 8.9 5.9 29.3 ＣＨ₂）Ｃｙｓ１８３，１９１］− ｒ−ｐＳＴ ｒ−ｐＳＴ - 6.9 5.3 6.8 9.0 28.0 上記のデ−タから、評価した各誘導組み替え牛成長ホル
モンは生物活性であり、動物を非常に成長させることが
わかる。

【００６７】

【実施例１８】修飾又は誘導体化組み替え動物成長ホル
モンの安定性の側面 ｐＨ７のホスフェ−ト緩衝生理的食塩水（ＮａＨ₂ＰＯ₄
Ｈ₂Ｏ３．４５ｇｍ，Ｎａ₂ＨＰＯ₄３．５５ｇｍ，Ｎａ
Ｃｌ９．５０ｇｍを蒸留水に溶解し、１０００ｍｌにし
てある）中の組み替え動物成長ホルモン誘導体の濃厚溶
液（１００ｍｇ／ｍｌまで）を調製する。これを無菌の
Ｍｉｌｌｅｘ−０．２２ｕｍミリポアフィルタ−装置を
通して濾過し、０．１ｍｌアリコ−トを管に入れる。こ
れらを４５℃の炉に置き、必要な間隔で除去する。内容
物をホスフェ−ト緩衝生理的食塩水で希釈する。上澄み
をＨＰＬＣにより分析し、モノマ−及びダイマ−含有量
を調べる。物質収支を行い；沈澱物質を記録する。結果
を最初の濃度と比較し、安定性の側面を実証する。

【００６８】別に、ｐＨ７．４における溶解度の低い成
長ホルモン誘導体を、あまり好ましくないｐＨ（４−１
０）で溶解し、あるいは懸濁液で評価する（表ＩＩ参
照）。

【００６９】

【表２】 表ＩＩ 試料 ７日 １４日 ２１日 分別溶解 分別溶解 分別溶解 （ダイマ−） （ダイマ−） （ダイマ−） ［（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＯＣＯ₂ＣＨ₂）Ｃｙｓ¹⁸³，¹⁹¹］ｒ−ｐＳＴ Ｍｗ＝２０００ ５２ − − Ｍｗ＝５０００ − １９ − ［（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＮＨＣＯ）（ＣＯ₂ ^-Ｎａ⁺）ＣＨＮＨＣＯＣＨ₂］Ｃｙｓ^{18 3} ，¹⁹¹］ｒ−ｐＳＴ Ｍｗ＝２００ ８３ ｒ−ｐＳＴ 工業的 85.9(29.4) 65.4(45.5) 59.8(51.7) 89.5(31.0) 64.0(44.9) 57.9(49.2)

【００７０】

【実施例１９】［（ＭｅＯ−ＰＥＧ−Ｏ₂ＣＣＨ₂）Ｃｙ
ｓ¹⁸³，¹⁹¹）ｒｐＳＴを用いた移植片の製造、及び試験
管内溶解による該移植片の評価 ９６ｍｇの−２７０メッシュのヒマシ油ワックス、及び
６４ｍｇの粉末［（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＣＯ₂ＣＣＨ₂）Ｃ
ｙｓ¹⁸³，¹⁹¹］ｒｐＳＴ及びｒｐＳＴから、１組の移植
片を製造する。ＰＥＧの平均分子量は２，０００であ
る。混合物を撹拌し、大表面積ペトリ皿に注ぎ、ＣＨ₂
Ｃｌ₂を室温で蒸発させ、その後真空乾燥する。乾燥残
留物を集め、カ−バ−プレスを用いて約１０００ｐｓｉ
で直径１／８”の円筒状移植片を形成する。そのように
して形成した移植片の重量はそれぞれ６０及び７０ｍｇ
である。その後、そのようにして製造した移植片の試験
管内溶解につき評価する。各移植片を１０ｍｌのホスフ
ェ−ト緩衝液（０．０５％Ｎａアジドを用い、ｐＨ７．
４）を含む別々のプラスチック管に入れ、振盪水棚に置
き、装置の水温を３９℃に保って管を振る。管を１日振
り、その後溶液を各管から取り出し、ＨＰＬＣによりｒ
ｐＳＴを分析し、溶液を捨てる。各管に新しいホスフェ
−ト緩衝液を加え、さらに３日管を振る。各管からの溶
液を再度ＨＰＬＣによりｒｐＳＴ分析を行う（溶液は再
度捨てる）。各管に再度新しいホスフェ−ト緩衝液を加
え、再度３日振り、再びｒｐＳＴ分析を行う。

【００７１】ホスフェ−ト緩衝液は（ＮａＨ₂−ＰＯ₄・
Ｈ₂Ｏ ３．４５ｇ，Ｎａ₂ＨＰＯ₄３．５５ｇ，ＮａＣ
ｌ ９．５ｇを蒸留水に溶解して１０００ｍｌとする
（表ＩＩＩ参照）。

【００７２】

【表３】 表ＩＩＩ 移植片放出 ６０％ヒマシ油ワックス及び４０％ｒ−ｐＳＴの混合物からプレスし、シリコン 管材料を用いて被覆した移植片 ＰＥＧ 放出％化合物 Ｍｗ １日 ４日 ７日 ｒ−ｐＳＴ ８．１ １１．３ １２．９ ［（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＯＣＣＨ₂） Ｃｙｓ¹⁸³，¹⁹¹］ｐＳＴ ２０００ １２．４ １７．１ １７．６ 本発明の主たる特徴及び態様は以下のとうりである。

【００７３】１．誘導タンパク質又はポリペプチドにお
いて、該タンパク質又はポリペプチドの少なくとも１個
のシステイン残基を置換基を用いて誘導体化し、該置換
基が：（ＣＨ₂ＣＯ₂Ｒ₁），（ＣＨ₂ＣＯＮＨＲ₁），
［ＣＨ（ＣＯＲ₂）（ＣＨ₂）_x（ＣＯＲ₃）］，［ＣＨ₂
ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＲ₂）−（ＣＨ₂）_x（ＣＯＲ₃）］，
又は［ＣＨ₂ＣＯＮＨ−（ＣＨ₂）_xＣＯＲ₄］から成り；
Ｒ₁＝ＣＨ₂（ＯＣＨ₂（ＣＨ₂ＣＨ₂）_y−ＯＭｅであり；
Ｒ₂及びＲ₃はＨ又はＲ₄であり；Ｒ₄＝ＮＨＣＨ₂ＣＨ
₂（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_yＯＭｅ、又はＯＣＨ₂ＣＨ₂（ＯＣＨ
₂−ＣＨ₂）_yＯＭｅであり；Ｘは１から３の整数であ
り、Ｙは１０から３００の整数であり；Ｒ₂及びＲ₃は同
時にＨであることはできず；該タンパク質又はポリペプ
チドの誘導体化システイン残基が誘導の前にジスルフィ
ド結合を形成している場合、両システインは同一のスル
ホヒドリル誘導体を与え；タンパク質が成長ホルモンで
ある場合、システイン上の該置換基はＣＨ₂ＣＯＮＨＲ₁
ではないことを特徴とする化合物。

【００７４】２．第１項に記載のタンパク質又はポリペ
プチドにおいて、該タンパク質又はポリペプチドがその
本来の形態で少なくとも１個のシステイン残基を含むこ
とを特徴とするタンパク質又はポリペプチド。

【００７５】３．第１項に記載のタンパク質又はポリペ
プチドにおいて、該タンパク質又はポリペプチドが、本
来の形態のタンパク質又はポリペプチドに添加あるいは
置換されたシテイン残基を有することを特徴とするタン
パク質又はポリペプチド。

【００７６】４．第２項に記載のタンパク質又はポリペ
プチドにおいて、該タンパク質又はポリペプチドが：成
長ホルモン、インタ−リュ−キン、インタ−フェロン、
プロウロキナ−ゼ ＩＧＦ−Ｉｓ、及びＩＧＦ−２ｓ、
繊維芽細胞成長因子などの成長因子、及びアンチトロン
ビン ＩＩＩを含むことを特徴とするタンパク質又はポ
リペプチド。

【００７７】５．第３項に記載のタンパク質又はポリペ
プチドにおいて、該タンパク質又はポリペプチドが：成
長ホルモン、インタ−リュ−キン、インタ−フェロン、
プロウロキナ−ゼ ＩＧＦ−Ｉｓ、及びＩＧＦ−２ｓ、
成長因子、及びアンチトロンビン ＩＩＩを含むことを
特徴とするタンパク質又はポリペプチド。

【００７８】６．第４項に記載のタンパク質において、
該タンパク質が成長ホルモンであることを特徴とするタ
ンパク質。

【００７９】７．第５項に記載のタンパク質において、
該タンパク質が成長ホルモンであることを特徴とするタ
ンパク質。

【００８０】８．第６項に記載のタンパク質において、
該タンパク質がＣｙｓ¹⁰²，¹¹²Ｇｌｕ¹⁸³，¹⁹¹ｐＳＴ又
はＧｌｕ¹⁸³，¹⁹¹ｐＳＴであることを特徴とするタンパ
ク質。

【００８１】９．第４項に記載のタンパク質において、
該タンパク質がインタ−リュ−キン−２であることを特
徴とするタンパク質。

【００８２】１０．第５項に記載のタンパク質におい
て、該タンパク質がインタ−リュ−キン−２であること
を特徴とするタンパク質。

【００８３】１１．ＺＣＨ₂ＣＯ₂Ｒ₁，ＺＣＨ₂ＣＯＮＨ
ＣＨ（ＣＯＲ₂）−［（ＣＨ₂）_x（ＣＯＲ₃）］，［（Ｃ
Ｈ₂）_x（ＣＯＲ₃）］、又はＺＣＨＣＯＮＨ−（ＣＨ₂）
_xＣＯＲ₂から成り；Ｒ₁＝ＣＨ₂ＣＨ₂（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_y
ＯＭｅであり；Ｒ₂及びＲ₃はＨ又はＲ₄であり；Ｒ₄＝Ｎ
ＨＣＨ₂ＣＨ₂（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_yＯＭｅ、又はＯＣＨ₂Ｃ
Ｈ₂（ＯＣＨ₂−ＣＨ₂）ＨｙＨＯＭｅであり；ＺはＢｒ
又はＩであり；Ｘは１から３の整数であり、Ｒ₂及びＲ₃
は同時にＨでであることはできない化合物。１２．第１
１項に記載の化合物ＫＨ₂ＣＯ₂Ｒ₁において、Ｙが約１
０−１００であることを特徴とする化合物。

【００８４】１３．第１１項に記載の化合物ＫＨＣＯＲ
₂において、Ｒ₂Ｙが１０−１００の整数であることを特
徴とする化合物。

【００８５】１４．第１１項に記載の化合物ＫＨ₂ＯＯ
ＮＨ（ＣＯＲ₂）［ＣＣＨ₂）_xＣＯＲ₃）］において、Ｙ
が約１−２の整数であり、Ｙが約１０−１００であるこ
とを特徴とする化合物。

【００８６】１５．第１１項に記載の化合物ＩＣＨ₂Ｃ
ＯＮＨ（ＣＨ₂）_xＣＯＲ₂において、Ｘが約１−３の整
数であり、Ｙが約１０−１００の整数であることを特徴
とする化合物。

【００８７】１６．薬剤配合物において：薬理学上有効
量の修飾又は誘導体化タンパク質あるいはポリペプチ
ド、又は製薬上許容できるその塩；及びそのための製薬
上許容できる固体又は液体キャリヤ−から成り、該配合
物が動物の成長速度を速めるのに長期間にわたって有効
であることを特徴とする配合物。

【００８８】１７．第１６項に記載の配合物において、
該配合物を該動物に非経口的に投薬することを特徴とす
る配合物。

【００８９】１８．第４項に記載のタンパク質におい
て、該タンパク質が繊維芽細胞成長因子であることを特
徴とするタンパク質。

【００９０】１９．第５項に記載のタンパク質におい
て、該タンパク質が繊維芽細胞成長因子であることを特
徴とするタンパク質。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 スーザン・マンシーニ・キヤデイ アメリカ合衆国ペンシルベニア州ヤードレ イ・リビアロード1501 (72)発明者 マイケル・ジヨセフ・ダレイ アメリカ合衆国ペンシルベニア州ヤードレ イ・ハミングバードコート1564 (72)発明者 ホン−ミン・シー アメリカ合衆国ペンシルベニア州ラングホ ーン・パイングレンロード35

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 誘導体化タンパク質又はポリペプチドに
   おいて、該タンパク質又はポリペプチドの少なくとも１
   個のシステイン残基を置換基を用いて誘導体化し、該置
   換基が：（ＣＨ₂ＣＯ₂Ｒ₁），（ＣＨ₂ＣＯＮＨＲ₁），
   ［ＣＨ（ＣＯＲ₂）（ＣＨ₂）_x（ＣＯＲ₃）］，［ＣＨ₂
   ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＲ₂）−（ＣＨ₂）_x（ＣＯＲ₃）］，
   又は［ＣＨ₂ＣＯＮＨ−（ＣＨ₂）_xＣＯＲ₄］から成り；
   ここにＲ₁＝ＣＨ₂（ＯＣＨ₂（ＣＨ₂ＣＨ₂）_y−ＯＭｅで
   あり；Ｒ₂及びＲ₃はＨ又はＲ₄であり；Ｒ₄＝ＮＨＣＨ₂
   ＣＨ₂（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_yＯＭｅ、又はＯＣＨ₂ＣＨ₂（Ｏ
   ＣＨ₂−ＣＨ₂）_yＯＭｅであり；Ｘは１から３の整数で
   あり、Ｙは１０から３００の整数であり；Ｒ₂及びＲ₃は
   同時にＨであることはできず；該タンパク質又はポリペ
   プチドの誘導体化システイン残基が誘導体化の前にジス
   ルフィド結合を形成している場合、両システインは同一
   のスルフヒドリル誘導体を与え；タンパク質が成長ホル
   モンである場合、システイン上の該置換基はＣＨ₂ＣＯ
   ＮＨＲ₁ではないことを特徴とする化合物。
2. 【請求項２】 ＺＣＨ₂ＣＯ₂Ｒ₁，ＺＣＨ₂ＣＯＮＨＣＨ
   （ＣＯＲ₂）−［（ＣＨ₂）_x（ＣＯＲ₃）］，［（Ｃ
   Ｈ₂）_x（ＣＯＲ₃）］、又はＺＣＨＣＯＮＨ−（ＣＨ₂）
   _xＣＯＲ₂から成り；ここにＲ₁＝ＣＨ₂ＣＨ₂（ＯＣＨ₂Ｃ
   Ｈ₂）_yＯＭｅであり；Ｒ₂及びＲ₃はＨ又はＲ₄であり；
   Ｒ₄＝ＮＨＣＨ₂ＣＨ₂（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_yＯＭｅ、又はＯ
   ＣＨ₂ＣＨ₂（ＯＣＨ₂−ＣＨ₂）ＨｙＨＯＭｅであり；Ｚ
   はＢｒ又はＩであり；Ｘは１から３の整数であり、Ｒ₂
   及びＲ₃は同時にＨでであることはできない化合物。
3. 【請求項３】 薬剤配合物において：薬理学上有効量の
   修飾又は誘導体化タンパク質あるいはポリペプチド、又
   は製薬上許容できるその塩；及びそのための製薬上許容
   できる固体又は液体キャリヤ−から成り、該配合物が動
   物の成長速度を速めるのに長期間にわたって有効である
   ことを特徴とする配合物。