JPH0692438B2

JPH0692438B2 - ペプチド

Info

Publication number: JPH0692438B2
Application number: JP58186402A
Authority: JP
Inventors: 正作沼; 昇矢内原; 隆宮田
Original assignee: 三菱化成株式会社
Priority date: 1983-10-05
Filing date: 1983-10-05
Publication date: 1994-11-16
Anticipated expiration: 2009-11-16
Also published as: JPS6078996A

Description

【発明の詳細な説明】本発明はペプチド類に関する。

さらに詳しくは、本発明は生理活性ペプチドに関する研
究の一環としてなされたものであり、ヒト・アセチルコ
リンリセプター−αのアミノ酸配列より、活性を予測・
決定されたペプチド類に関する。

本発明者の一人は、最近、ヒト・アセチルコリンリセプ
ター−α（ヒト−ACR−α）が図/a,/bに示す塩基配列及
びアミノ酸配列を有することを見出した。すなわち、電
気シビレエイ（Torpedo calfornica）の発電器官より抽
出されたACR−αのmRNAより得られたcDNAを用いてウシc
DNAを得、これを用いてヒトACR−α遺伝子の配列を決定
した。

一方、蛋白の二次構造（α−ヘリツクス、β−シート、
折れ曲り構造等）、親水性部位等を考慮して、アミノ酸
配列中の抗原活性部位を予測、決定する方法が知られて
いる（たとえば、ホップHopp＆ウッドWoodの方法:Proc.
Natl.Acad.Sci.U.S.A.Vol.78,3824−3828（1981），チ
ョウchou＆ファスマンFasmanの方法:Adv.Enzym.47,45−
148（1978）。）。

本発明者らは、この方法を用いて、特定のペプチド類が
ACRと類似の免疫的活性を有することを見出し、本発明
に到達した。

すなわち、本発明の要旨は、下記式（Ｉ）Ｈ−Thr−Tyr−Asp−Gly−Ser−Val−Val−Ala−Ile−A
sn−Pro−Glu−Ser−Asp−Gln−Pro−Asp−Leu−Ser−A
sn−Phe−Met−Glu−Ser−Gly−OH…（Ｉ）で表されるペプチドに存する。

なお、アミノ酸残基の上方の数字はACR−αのアミノ酸
配列中のアミノ酸残基の位置を示す（図１）。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明に係るペプチド類は、上記式（Ｉ）で表わされる
アミノ酸配列を有する。

また、本発明に係るペプチドは、アフイニテイカラム用
に好適である。

本発明に係るペプチド類は、ペプチド化学において用い
られる方法を適宜選択して製造することができる。すな
わち、液相法、固相法のいずれによつても得ることがで
き、反応に関与しないアミノ基及びカルボキシル基、さ
らには側鎖反応性基を保護したアミノ酸が反応に供され
る。

反応に関与しないアミノ基の保護基としては、ｐ−トル
エンスルホニル基、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）
基、ｔ−ブトキシカルボニル（Boc基）、フタロイル基
等が挙げられる。

一方、反応に関与しないカルボキシル基の保護基として
は、通常、ブチルエステル、ベンジルエステル（OBzl）
等が挙げられる。

また、側鎖反応性基の保護基としては、トシル（Tos）
基（グアニジノの保護）、ベンジル（Bzl）基（イミダ
ゾールの保護）、等が挙げられる。

さらに、アミノ基と反応させるカルボキシル基は、塩化
物、ヒドラジド、アジド、有機酸との混合無水物、チオ
エステル等に変えて活性化しておくことが望ましい。

保護基を有するペプチドの保護基脱離も常法によること
ができる。たとえば、トリフルオロ酢酸等による加水分
解、金属ナトリウム等による還元、白金等の触媒を用い
る接触還元、等である。

また、得られるペプチドの分離・精製は、抽出、クロマ
トグラフイー等により行なうことができる。

このようにして得られたペプチド類は、通常用いられる
各種の無機酸又は有機酸の酸付加塩とすることができる
し、金属化合物等との錯化合物とすることができる。

本発明に係るペプチド類は、ヒトACR−αと類似の抗原
活性を有する。したがつて、たとえば、ACRに対する自
己免疫反応（抗ACR抗体の産生）による神経筋伝達障害
に起因するとされる重症筋無力症（MG）の診断、さらに
は治療に有用である。

以下、実施例によりさらに本発明を詳細に説明する。

実施例１式（IV）で示されるペプチドを含むペプチドの合成： Boc−Glyの樹脂へのエステル化は次のように行なわれ
る。

乾燥したMe₂SO（34ml）に溶解したBoc−Gly（6.82mmo
l、1193mg）にクロルメチル化ポリスチレン（ジビニル
ベンゼン２％、200−400メツシユ、Cl:0.62mequiv./g樹
脂）（5.00g）を加え、さらにKO−ｔ−Bu（6.51mmol）
を加える。混合物を強く振とうし、80℃で２時間保持す
る。

ついで樹脂をMe₂SO、エタノール及びOH₂Cl₂で洗浄す
る。

合成は、固相法の常法により行なわれる。

合成はBoc−Gly−OCH₂−樹脂5.580gをペプチド合成装置
（“ベックマンBeckman990B型”）の反応器に入れて開
始され、順次アミノ酸を合成される。保護基の脱離は、
CH₂Cl₂中の25％トリフルオロ酢酸（TFA）及び1,2−エタ
ンジチオールで30分間処理して行ない、引続きCH₂Cl₂中
の10％トリエタノールアミン（Et₃N）で中和される。

各アミノ酸（3.10mmol）の連続的カツプリングは、CH₂C
l₂中、２時間でジシクロヘキシルカルボジイミド（DC
C）（3.10mmol）によつてなされる。溶媒量はDCCが6.2m
l（0.5M）である以外は、36mlである。

合成の一サイクルは、次の操作よりなる。

（１）CH₂Cl₂で洗浄（1.5分間、３回）（２）25％TFA/CH₂Cl₂及び１％1,2−エタジチオールで
脱保護基（1.5分間予備洗浄、ついで30分間処理）（３）CH₂Cl₂で洗浄（1.5分間、６回）（４）10％Et₃N／CH₂Cl₂で中和（1.5分間、３回）（５）CH₂Cl₂で洗浄（1.5分間、６回）（６）Boc−アミノ酸（3.26mequiv.,CH₂Cl₂中、５分
間）処理（７）ろ過なしに、DCC（3.10mequiv.）を添加し、120
分間カツプリングさせる。

（８）CH₂Cl₂で洗浄（1.5分間、６回）（９）それぞれ3.10mequiv.のBoc−アミノ酸及びDCCで
上記（４）〜（８）の工程をくりかえす。

二番目のサイクル以降において、くりかえし工程におけ
る反応は、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）
（3.10mmol,419mg）の存在下に行なわれる。

一カツプリング反応後、ペプチド−樹脂は、DMF（36m
l、15分間、２回）、メタノール（36ml、15分間、２
回）及びCH₂Cl₂（36ml、15分間、２回）で洗浄される。

HOBt及びBoc−アミノ酸はDMF（10ml）及びCH₂Cl₂（20m
l）に溶解される。Boc−アミノ酸はCH₂Cl₂（30ml）に溶
解される。ただし、Boc−Leu.H₂OはDMF（10ml）及びCH₂
Cl₂（20ml）に溶解される。

Boc−Gln及びBoc−Asnは、DMF（10ml）及びCH₂Cl₂（20m
l）に溶解され、等モル量のHOBtの存在下にカツプリン
グされる。

反応容器は、空気による酸化を最小限にするために、合
成時に窒素雰囲気下に保持される。

各カツプリング反応後に洗浄工程を行ない、未反応の遊
離アミノ基の存在をニンヒドリンテストによりモニター
する。

アミノ酸としては、次のような保護アミノ酸が使用され
る。

Boc−Ala,Boc−Met,Boc−Ile・1/2H₂O,Boc−Val,Boc−T
hr（Bzl）,Boc−Asp（OBzl）,Boc−Phe,Boc−Leu・H₂O,
Boc−Gle（OBzl）,Boc−Gly,Boc−Ser（Bzl）,Boc−Tyr
（OBzl−Cl₂）,Boc−Asn,Boc−Pro,Boc−Gln. 全サイクルを終了し、11.640gの保護ペプチド−樹脂を
得る。

その一部（5.026g）をアニソール（5.0ml）及びメチル
エチルサルフアイド（1.0ml）の存在下にHF（60ml）で
０℃、60分間、常法により処理する。HFは真空ポンプに
より０℃で除去される。生じる黄色の樹脂は、酢酸エチ
ルで数回洗浄される。

ペプチドを3M酢酸（150ml）で抽出し、ついで凍結乾燥
する。得られた粗ペプチドは1.500gであつた。

つぎに、粗ペプチド（700mg）を3M酢酸（0.02％エタン
ジチオールを含む）（10ml）に溶解し、“セフアデツク
スＧ−25"カラム（3.0×142cm）にかけ、0.02％エタン
ジチオールを含む3M酢酸で溶出する。

溶出物を10gごとに集め、各フラクシヨンを分光光度計
（280nm）及びTLC（溶媒系:1−BuOH:AcOH:H₂O＝4:1:5）
によつてモニターする。

主要成分を含むフラクシヨン44〜66を集め、凍結乾燥し
て、451mgの部分精製物を得る。

さらに、液滴向流分配に付し、150カラム（3.0×400m
m）で精製される（溶媒系:1−BuOH:AcOH:H₂O＝4:1:
5）。溶出物は3gごとに集められ、分光光度計（280nm）
及びHPLC（“TSK GEL"ODS−120、カラム:0.46×25cm、
溶媒:0.01NHCl/CH₃CN＝80/20→60/40、直線濃度勾配、3
0分、流速:1ml/分）でモニターされる。

目的物はフラクシヨン100〜118に溶出され、凍結乾燥す
ると73.9mgの白い粉末が得られた。HPLCによると、19.5
分で溶出された。

得られたペプチドのアミノ酸組成は次のとおりであつ
た。なお分析はペプチド加水分解物（6NHCl,24時間、11
0℃）について行なつた。

Asp 5.20 （５）,Thr 0.91 （１）， Ser 3.78 （４）,Glu 3.04 （３）， Gly 2.17 （２）,Ala 1.06 （１）， Val 1.73 （２）,Met 0.96 （１）， Ile 1.02 （１）,Leu 1.07 （１）， Tyr 1.03 （１）,Phe 1.05 （１）

【図面の簡単な説明】

図１（a,b）はヒトACR−α遺伝子を含むDNAフラグメン
トの塩基配列及びそれより想定されたアミノ酸配列を示
す（下段は、ウシcDNAの配列を示す。）。（なお、図1a
における３′側末端が、図1bの５′側末端に続く。）。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/564 Ｚ 8310−2ＪＣ０７Ｋ 99:00

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記式（Ｉ）Ｈ−Thr−Tyr−Asp−Gly−Ser−Val−Val−Ala−Ile−A
sn−Pro−Glu−Ser−Asp−Gln−Pro−Asp−Leu−Ser−A
sn−Phe−Met−Glu−Ser−Gly−OH…（Ｉ）で表されるペプチド。