JPH0686385B2 - 活性プロトロンビン複合体組成物およびその製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明の背景 本発明は血液凝固病変の治療用組成物に関する。本発明
は一般に血液凝固因子の阻害因子を有する患者の出血性
症状の管理に有用な新規組成物の新規な製造方法に関す
る。特に、本発明は抗血友病因子または血漿トロンボプ
ラスチン成分阻害因子の治療に関する。

本出願において「阻害因子」なる述語は、血友病Ａ患者
中の抗血友病因子に対し、または血友病Ｂ患者中の血漿
トロンボプラスチン成分に対し特異的な抗体を意味す
る。

血液凝固は非常に複雑なプロセスである。最終的にフィ
ブリン凝塊を生じさせる種々の血液成分間の相互作用
は、連続して発生するいくつもの過程（カスケード）を
経由し、各過程は前後の過程に依存しかつそれによって
規制される。一般にこの凝固過程に関与する血液成分
は、酵素原か、または酵素変調因子である。該酵素原は
酵素的に不活性なタンパクで、凝固過程の初期の段階で
生成された一般に他のタンパク分解酵素である活性因子
の作用によってタンパク分解酵素へ変換される。このよ
うな変換を受けた凝固因子を以後「活性因子」と定義
し、そして下位クラス記号“a"によって表わされ、他方
酵素原は「凝固因子前駆体」という。

酵素変調因子はカルシウムイオンまたは非酵素タンパク
のような助因子が主であり、そして多くは酵素が少しで
も触媒活性を発揮しようとするならば必須である。この
ような変調因子は酵素基質と区別されるべきである。基
質は酵素によって共有結合的に変化されるが、変調因子
は構造上の変化を受けることなしに酵素へ結合する。

血液凝固過程は、大部分一つ一つの酵素原によって区切
られた、生成した血液成分と可溶性血液成分との間の反
応の連続流である。ハーゲマン因子（第XII因子）の接
触活性化のような最初の出来事が連続流の一本の枝とし
て開始される。基本的にはこの最初の出来事の生成物が
連続流中の次の酵素原を活性化し、そしてフイブリン凝
塊が生成するまで順次このような反応が続く。この連続
流の全速度は、助因子および変調因子に依存する。

今や種々の多数の血液凝固因子と、それらが相互に反応
し環境の影響を受ける態様が知られているが、しかし疑
問が残っている多くの分野が残っている。このような一
分野は、血液凝固因子阻害因子の作用、病因学および治
療法である。

血液凝固因子の阻害因子は、通常の出血治療においてか
なりの難問である。凝固不足による無制限の出血は通常
プールした血漿原から不足している成分の供給によって
停止される。しかしながら阻害因子は不足している凝固
因子の存在に応答して患者によってしばしば明らかにさ
れるので、凝固因子の投与量を増すことは単に阻害因子
のより多量の産性を生じるだけとなるから、この慣用の
アプローチはしばしば非生産的である。

この凝固因子阻害因子による問題はそれだけの問題では
ない。例えば血友病Ａ患者人口の推定21％までは第VIII
因子阻害因子、すなわち抗血友病因子（AHF）阻害因子
を発生する。本発明の背景を完全に理解するためには、
血液凝固の機構およびそれに対する阻害因子の影響を論
ずることが必要である。

このような凝固因子阻害因子の病因学はよく解明されて
いないが、しかし二つの主要ルートをたどるものと考え
られる。第一に、上で論じたように治療的凝固因子濃縮
物、例えばAHFの頻繁な投与は患者に増加した阻害因子
力価で証明される免疫反応をしばしば生成する。AHFに
よる患者の免疫系への多数回の挑戦は、増加し続けるAH
F抗体レベルを促進するものと信じられる。このような
抗体は次にAHFと複合体をつくり、その活性をブロック
するので、抗体力価の上昇は満足な臨床応答を達成する
ため一層多くの投与量を記録する。

対照的に、阻害因子の出現の第二のルートは、治療的血
液タンパク分画の投与の作用とは信じられていない。む
しろ阻害因子はしばしば薬剤反応またはコラーゲン異変
の後で、自然発生的または自己免疫病の態様で発生する
ようである。

医学社会では、凝固因子阻害因子を、（ａ）免疫抑制し
またはすることなく、凝固因子の極端に低投与量または
極端に高投与量を投与するか、（ｂ）ヒト以外の起源の
凝固因子を使用するか、または（ｃ）活性プロトロンビ
ン複合体濃縮物（PCC），すなわち少なくとも凝固因子
の少割合が活性酵素へ変換されたPCCを投与することに
よって処置している。最初の二つの手法は広く使用され
ていない。患者の系に存在している阻害因子を圧倒する
充分に多量の凝固因子の注入は、阻害因子力価が凝固因
子の投与毎に応答して上昇するから、各治療毎に段々有
効でなくなる。他方非人間凝固因子の使用は治療した患
者に重大な免疫反応の危険を発生させる。

凝固因子阻害因子で悩まされる患者の治療のため活性PC
Cの使用は、Feket et alらによる1972年第14回国際血
液学会議における発表以後、広く受入れられている。例
えばKurzynski et alはNew England Journal Of
Medicine 291（４）:164（1974）において因子II15単
位/ml（以下因子をＦと略記することがある）,F−VII20
0単位/ml,F−IX42単位/ml,F−X58単位/ml,F−IX a3−10
単位/ml,およびトロンビン0.001−0.003単位/mlを含有
する活性PCCをＦ−VIII阻害因子で悩まされている患者
を処置するために治療的に使用した。作用する活性因子
の正体は議論の的であるけれども、このような濃縮物の
臨床的成功は種々の活性凝固因子VII a,IX aまたはX a
の存在に帰せられている。最近は、成功は「第VIII因子
阻害因子バイパス活性」（FEIBA）を有する成分の存在
にも帰せられている。この成分は活性因子II,VII,IXま
たはＸの一つであるとは信じられておらず、そうではな
くてその活性の本態はよく解明されていない。

活性PCCは第VIII因子阻害因子の処置に使用するとき、
ヒトに免疫反応が観察されないように第VIII因子抗原を
充分に含まぬように複合体を調製できるという利点を有
する。以前凝固因子阻害因子の処置に使用されたプロト
ロンビン複合体濃縮物の大部分は、コーン分画Ｉ上清か
らプロトロンビン複合体を強化した血漿分画操作の人工
物であり、該活性因子は特別の工程が誘発したものはな
く、その結果濃度が低過ぎるかまたは変動するため満足
なものではないとしばしば考えられていた。

PCCの活性化方法はこの分野で一般的に言われて来た
が、このような製品の製造のためのわれわれが知ってい
る詳細な唯一の記載は、Eibl et alの米国特許第4,16
0,025号だけである。彼らはその中で、彼らの方法が開
発される以前は、「活性プロトロンビン複合体濃縮物は
それらの有効成分に関し試験することができず、そして
標準化することができなかった・・・・・従って結果は
安全でなく、そして再現することができなかった」と主
張している。さらに彼らは彼らの方法は、「再現できそ
して慎重な態様で所望の第VIII因子阻害因子バイパス活
性の産生を保護するのが目的である」と述べている。

Eibl et alの方法は、血漿、寒性沈殿プア血漿または
コーン分画Ｉ上清から選ばれた出発原料を接触活性化剤
の使用によって活性化し、FEIBA成分および第II,VII,IX
およびＸ因子を塩基性イオン交換体へ吸着することより
なる。接触活性化剤は、ハーゲマン因子の活性化によっ
て本来の凝固機構を開始するシリカまたはカリオンのよ
うなよく知られた物質である。

Eibl et alは彼らの最終製品の標準化には高度に配慮
したが、彼らは活性化操作には少ししか注意を払ってい
ない。pH,温度、出発原料および活性化剤は一般的に記
載されているが、実施例１および２に開示されている１
時間または３時間以外活性化時間は述べられていない。

酵素の連続反応流である活性化反応は、活性化されたサ
ンプル中の物質によりそして関与する酵素の反応速度に
よってさまざまのかつ予期できない速度で急激に加速さ
れる傾向にあるので、プロトロンビン複合体濃縮物の過
剰活性化を避けるのは極めて困難である。もっとも可能
性ある過剰活性化の有害な結果は、製品中にトロンビ
ン、または活性第II因子の出現である。例えばEibl et
alはトロンビンレベル0.05および0.07NIH単位/mlを報
告している。トロンビンは血液成分に対し直接フィブリ
ン凝塊を生成するように作用することができるが、他の
活性凝固因子は凝固反応流の初期にその効果を発揮し、
そのため生体内で血液成分によって変調を受けるので、
トロンビンは望ましいとは考えられない。

Eibl et alによって報告された上昇したトロンビンレ
ベルは、われわれは彼らが活性操作を適切に制御しなか
った結果であると信ずる。Eibl et alは活性化のため
の出発原料をスクリーンせず、そのため使用した血漿ま
たは血漿分画の各ロットのすでに存在している活性化状
態を考慮に入れることに失敗し、そして活性化に対する
そのロットの操作中の対応を決定していない。しかしな
がらEibl et alは実施例１において、最終製品の種々
のロットにおける凝固因子およびFEIBAレベルの変動
は、凝固因子対FEIBAの所望の比が得られるまでバルク
バッチを混合することによって補償することを提案して
いる。これはコスト、収率損失、およびこのような操作
につきものの汚染の危険のために不満足である。

White et al“Blood"49（２）:159−170（1977）によ
れば、アメリカ赤十字PCCはヘパリンの存在および抗ト
ロンビンIIIの慎重な強化のため非血栓形成性である。
これらの二つの添加物はPCC中のプロテアーゼの不可逆
的不活性化を生ずるといわれている。このような凝縮物
は、不注意に存在するかも知れない活性因子およびその
発生機構がヘパリンおよび抗トロンビンIIIによって抑
制されるこのような目的に有用であるかどうかは問題で
ある。

従って本発明の目的は、最終製品を混合または取り扱う
ことなしに活性PCC製剤を標準化することである。

他の目的は操作中トロンビンの生成を減らし、そして生
成したトロンビンを中和するように、活性PCCの製造を
制御することである。

本発明は、濃縮された形で血液凝固因子II（プロトロン
ビン）,VII,IXおよびＸを少なくとも含んでいるプロト
ロンビン複合体含有血液タンパク分画を原料とし、酵素
的に活性なこれら血液凝固因子が成功する条件下におい
てかつ該条件を調節することによって該分画を所望の活
性化の程度へ活性化処理することよりなる、血液凝固因
子の阻害因子を有する患者の止血処置に使用するための
活性プロトロンビン複合体濃縮物を製造する方法であっ
て、 （ａ）前記分画の活性化の程度を制御するため調節すべ
き処理条件の一つを選定し、 （ｂ）活性化終了前に、該分画をあらかじめ定めた活性
化の程度へ活性化するのに要する選定した処理条件の大
きさを決定し、 （ｃ）選定した処理条件を前記大きさに設定し、そして （ｄ）設定した処理条件に従って前記あらかじめ定めた
活性化の程度まで前記分画の活性化処理を実施する工程
を含み、 前記活性プロトロンビン複合体濃縮物は、前記患者へ直
接投与できる水性組成物の形において、単位/mlで表わ
し、血液凝固因子を下記濃度： プロトロンビン １〜10 第VII因子 37〜190 第VII a因子 ８〜80 総第IX因子（IX＋IX a） 15〜112 第IX a因子前駆体 ０〜30 第Ｘ因子 １〜30 第X a因子 １〜20 トロンビン ＜0.003 を含むことを特徴とする活性プロトロンビン複合体濃縮
物の製造法に関する。

別の目的は凝固因子阻害因子を持っている、または欠乏
症患者を第II,VII,全IX,X,VII X,IX a前駆体、およびX
a因子の選ばれた活性を含有する活性PCCで処置すること
である。

本発明のこれらおよびその他の目的は、本明細書を全体
として考慮することにより当業者には明白であろう。

本発明の主目的は、活性化の終了前に、実質上あらかじ
め決定した組成の活性PCCを得るのに必要とする条件を
決定することによって達成される。これは発表された先
行技術の特徴である標準化および血栓形成性の未解決問
題に対する消極的アプローチと対照的である。先行技術
では活性化時間および温度のような条件は任意に設定さ
れ、そして得られる製品の困難性は、もし可能であれば
混合されたとき所望の製品が得られるようなロットを選
ぶことによって救済される。

一般に活性化の一条件だけが変化することを許され、そ
してこれは活性化が進行を許される反応時間であるのが
通常である。

選んだ条件の大きさは二つの方法のうち一方の方法によ
って決定される。二方法のうち最低に好ましい方法にお
いては、該条件は活性化が開始された後分画の部分標本
を分取し、各部分標本の活性化を中止し、各部分標本の
活性化程度を決定し、そして分画のあらかじめ定めた活
性化程度を得るのに必要な条件の大きさを計算すること
によって決定される。

その代りに、条件の大きさは、活性化前に分画の部分標
本を分取し、部分標本間で条件を変え、各部分標本につ
いて設定した条件に従って活性化し、活性化を中止し、
そして分画のあらかじめ定めた活性化の程度が得られる
のに必要な条件の大きさを計算することによって決定す
ることができる。この具体例は、同時に活性化が進行し
ているバルクから分取した部分標本の定量中に起り得る
ような、あらかじめ定めた活性化レベルをオーバーラン
することがあり得ないという利益を有する。

活性化操作の制御は、出発原料として自然活性化の低い
程度を示す分画だけを選ぶことによって容易化される。

活性化程度は、トロンビン測定も有用であるが、活性化
されない部分的トロンボプラスチン（NAPT）または第VI
II因子補正時間を追跡することによって一般的に監視さ
れる。これらの測定法は後で詳細に記載される。個々の
凝固因子のレベルも活性化の測定として決定されること
ができる。これら因子の測定方法もこの中で記載され
る。

本発明の追加の目的は、米国特許第3,560,475号の方法
の間に生成される中間PCCを活性化することによって達
成される。PCCを活性化するための該特許方法中の特定
の活性化点選定は、活性化遅延剤がPCC中に存在するか
ら活性化操作の制御を大きく容易化する。

別の目的は、一般に製品の容器に充填され、凍結乾燥さ
れる直前に、活性化遅延剤が中和または除去された後、
活性化された製品へヘパリンを添加することによって達
成される。

さらに別の目的は、最終的に活性化されたPCC中へ安定
化剤ヘパリン、そして場合により抗トロンビンIIIを含
めることによって達成される。これら物質はトロンビン
を不活化し、そして血栓症に罹患し易い患者、例えば肝
機能異常患者に対する付加的安全性を提供するものと信
じられる。

本発明はまた、単位/mlとして、凝固因子活性Ｆ−II
（プロトロンビン）１−10;トロンビン約0.003以下,F−
VII約37ないし190,F VII a約８ないし80,総Ｆ−IX（IX
＋IX a）約15ないし112,F−IX a前駆体０ないし約30,F
−Ｘ約１ないし30,およびＦ−X a約１ないし20を有する
水溶液よりなる改良された活性PCC組成物を含む。さら
に詳しくは、改良された活性PCCは、一定の輪郭された
総Ｆ−IXおよびＦ−IX a前駆体、Ｆ−VIIおよびＦ−VII
a,F−ＸおよびＦ−X aレベル、Ｆ−VIII補正活性およ
びNAPT時間を含有し、そして活性PCCが投与される患者
に免疫反応を生じないように第VIII因子抗原を充分に含
まないであろう。

ここで使用するのに適当な出発原料は、少なくとも凝固
因子II,VII,IX,X,XIおよびXIIを含有しなければならな
い。出発組成物は一般にコーン血漿分画Ｉ＋II＋III,I
およびIII,IIおよびIII,III,III−0,IV−1,またはIV−
１およびIV−４の溶液であり、IV−１が好ましい。該組
成物は約20℃において約10w/v％に緩衝液または食塩水
に溶解し、そしてすでに存在する自然活性化の程度を決
定するため、以下の記載するように凝固因子活性につい
てスクリーニングされなければならない。凝固因子は次
に適当な公知のプロトロンビン複合体吸着剤、例えば米
国特許第3,360,475号に記載されているように三塩基性
リン酸カルシウム、またはジエチルアミノエチル基置換
樹脂へ吸着し、次に溶解したコーン分画の体積の約４％
に等しい溶離溶媒の体積中に吸着剤から溶離することに
よって部分的に精製される。これら体積および温度は臨
界的ではない。

出発物質は次に好ましくは無意識に自然に高程度に活性
化されているかどうかを検知するために検定される。出
発物質が適当であるかどうかは、該分画NAPT時間およ
び、好ましくは第VIII因子補正時間を測定することによ
って決定される。前者は例えばPepper et al,“Briti
sh Journal Of Haematology"36:573（1977）またはK
ington et alのアメリカ血液学会1974年アトランタ大
会の抄録第86号に開示されている慣用の測定である。出
発原料はトリス緩衝食塩水に、1:10ないし1:1000,最適
には1:100に測定前希釈されることが好ましい。サンプ
ルを最大強度で使用すると、凝塊時間はしばしば過剰に
速い。NAPT時間は血漿凝塊の生成をその読み取り信号と
して有するので、試験結果は1:100希釈が使用されたと
きの秒で通常報告される。ここではNAPT時間といえば、
すべて食塩水中0.06MトリスpH8.3（以後トリス緩衝食塩
水という）中サンプルまたは標準の1:100希釈液につい
ての測定である。

第VIII因子補正時間測定は、すべて37℃で実施する以下
の工程よりなる。試験すべき組成物の部分標本をバルビ
タール緩衝液中に1:20,1:40および1:80の希釈度を与え
るように希釈する。このバルビタール緩衝液はProctor
et al,Am.J.Clin.Path.36（３）:214（1961）記載の
希釈液の修正であり、それは希釈液１部を水１部と混合
することによってつくられる。

Ｆ−VIII補正活性１単位/mlを有する参照活性PCCの1:2
0,1:40,および1:80を未知サンプルと同様に希釈液中に
つくる。ここでの目的のため、第VIII因子補正活性１単
位とは、正常なヒト血漿の第VIII因子活性の５％以下を
有する第VIII因子欠乏または阻害血漿へ加えるとき、上
記測定条件においてその血漿の凝塊時間を35秒へ補正す
る活性PCCが前記希釈液中に1:20希釈度で含まれている
量として定義される。試薬ブランクは標準液と同じ態様
で調製される。

測定の実施に当り、可溶性エラグ酸混合物（Actinの商
標名でDadeから販売されている）0.1mlをあらかじめ温
められたフイブロメーター反応カップのセットへ添加さ
れる。正常なプールしたヒト血漿の５％以下の第VIII因
子活性を有する第VIII因子欠乏血漿0.1mlを次に各カッ
プへ加える。ブランクまたは標準希釈液の各部分標本0.
1mlを直ちにエラグ酸混合物および第VIII因子欠乏血漿
を収容したカップへ加える。３分後0.02M CaCl₂0.1ml
を凝固を開始するため加える。凝固時間を記録し、そし
て必要ならば試薬ブランク凝固について補正する。

第VIII因子補正活性の単位は反復実験を平均し、そして
希釈度によって確立された参照濃度をそれぞれ凝固時間
に対しプロックすることにより計算される。各希釈サン
プルの濃度は該プロックから位置決めし、その希釈度に
ついて補正し、そして平均濃度が単位/mlとして報告さ
れる。第VIII因子補正測定の結果は、出発原料をスクリ
ーニングし、そして活性化条件を決定する場合は単に秒
で報告することが好ましい。しかしながら最終製品の力
価は一般に単位/mlで報告される。出発分画をスクリー
ニングする場合、希釈は修正しない希釈液でなされる。

NAPT時間約200秒以上および第VIII因子補正時間約89秒
以上を有する出発原料が本発明の方法に使用するために
許容できる。例えばそれぞれが異なる血漿プールから調
製されたコーン分画IV−１ペーストの30の群において、
NAPT時間は144から294秒、そして第VIII因子補正時間は
82.7から98秒の範囲であった。出発原料をトロンビンに
ついてもスクリーニングすることが好ましく、そのよう
な場合、出発原料は後で記載の測定法において２時間以
内に凝塊を生ずるのに充分なトロンビン、すなわちトロ
ンビン約0.001単位/ml以上を含むならば使用してはなら
ない。また出発原料はプロトロンビン約0.4ないし1.0単
位/ml,F−VIII0.5ないし3.0単位/ml,F−IX0.5ないし1.5
単位/ml,およびＦ−X0.5ないし3.0単位/mlを含まなけれ
ばならない。

活性化の程度を決定するためのフィードバック測定の有
効性は、測定を実施するのにたっぷりした時間が与えら
れるように活性化の速度をおそくすることによって改良
することができる。これは測定実施中あらかじめ定めた
活性化状態を越える機会を減らす。活性化速度をおそく
する便利な一手法は、凝固因子を以後活性化遅延剤と呼
ぶ血漿成分の存在下で活性化することである。活性化遅
延剤は活性化速度をおそくし、そしてコーン分画IV−１
ペーストの10％溶液をpH7.2において三塩基性リン酸カ
ルシウムの0.5重量％に吸着し、三塩基性リン酸カルシ
ウムから0.1Mクエン酸ナトリウムで溶離し、リン酸カル
シウム溶離液からポリエチレングリコール（PEG）濃度
５％において沈殿する操作中に除去または中和される物
質と定義される。遅延剤の本態は未知であるが、活性化
速度をおそくする抗トロンビンIIIまたは同定されない
希釈タンパクであると推定される。リン酸カルシウム溶
離液中に残っている抗トロンビンIIIの量は約１国際単
位/mlで、一方PEG沈殿後の製品は約0.1単位/mlを含有す
る。

好ましくは活性化遅延剤を含有する適当な出発原料が選
ばれれば、以後活性化操作という操作が開始され、少な
くとも不活性酵素原が対応する血液凝固因子へ変換され
る。これは血漿または血漿分画を接触活性化することに
より慣例的に実施される。これはカオリン、シリカまた
はケイ酸塩のような接触活性化剤を出発原料と混合し、
そして所望の活性化状態が得られるまで混合を継続する
ことにより達成される。接触活性化剤は公知であり、そ
して任意の一種の選択は臨界的でない。しかしながら所
望の活性化程度が得られたとき除去を容易にするよう
に、不溶性活性化剤を使用するのが好ましい。接触活性
化剤は約0.05ないし5w/v％，好ましくは0.06％の濃度で
使用される。活性化の平均温度は０℃ないし約30℃の範
囲とすることができ、そして好ましくは約15℃である。
pHは約5.5ないし8.5の範囲にあり、そして好ましくは約
7.2である。タンパク濃度は約0.3ないし0.9g1％の範囲
である。

活性化の程度は通常一つのそしてあらかじめ定めた活性
化の程度が得られるように変化する条件を除いて、すべ
ての条件を一定に保つことによって制御される。pH,温
度およびその他の条件を一定に保ち、反応時間を変える
ことによって活性化期間を制御することが好ましい。こ
れは反応混合物を遠心またはロ過することにより、好ま
しくは1.2ミクロン孔径を有するカートリッジフィルタ
ーでロ過することにより、反応が容易に停止されるので
便利である。しかしながら反応時間を一定に保ち、他の
条件の一つを変化させることも本発明の範囲内である。
例えばあるバルクロットが少ししか活性化を必要としな
い場合、反応はもっと激しい処理を必要とするロットよ
りも低い温度で実施することができる。温度による活性
化制御は、低温、すなわち０℃ないし約10℃において
は、トロンビンおよびIX aおよびX a因子に比較して第V
II a因子の産生が有利になるという追加の利益を提供す
る。最後に二以上の条件を変えることができるが、しか
しこれは一般に好ましくない。

活性化期間は、スクリーニングによって決定された出発
血漿中にすでに自然に発生した活性化の程度と、所望の
活性化程度とに依存する。NAPT時間で表わした好ましい
活性化程度は、約70ないし100秒、好ましくは75ないし9
5秒である。好ましい活性化の程度は約70ないし90秒、
好ましくは約70ないし80秒の第VIII因子補正時間として
も表わすことができる。第VIII因子補正時間は、活性化
中の凝固時間の変化がNAPT時間の変化ほど著しくないの
で、活性化状態のモニターのためには好ましくない。第
VIII因子補正時間測定そしてまたトロンビン生成時間ま
たは前に引用したPepper et alによって開示されたFE
IBA試験に代えて、NAPT時間を使用することは本発明の
範囲内である。ここで報告された凝固時間は、ことわり
のない限り活性化直後のサンプルについてのものであ
る。活性PCCのそれ以上の濃縮はNAPTおよび第VIII因子
補正時間を短縮し、例えば凝固因子濃度の２倍化はNAPT
時間を約半分にするであろう。さらに異なるあらかじめ
定めたNAPTおよび第VIII因子補正時間によって表わされ
る異なる活性化程度も最終製品を使用されるべき臨床的
応用に応じて選択されることができる。また活性化の程
度は他の測定法、例えば以下に記載する一つまたはそれ
以上の活性凝固因子試験法によっても決定することがで
きる。実際の経過時間そのものは一般に本質的でない
が、しかし約５ないし45分、概略15分の範囲であること
が判明した。

出発物質の個々のバルクロットの各自の活性化に必要と
する時間の大きさを知得するための好ましい方法は、バ
ルクロットから活性化前に採取した部分標本を使用して
活性化期間を最初に決定し、そして次に該ロットを活性
化中にも同様にモニターすることを含む。この好ましい
方法の第一の部分は、活性化以前にバルクロットから複
数のサンプルを採取し、各サンプルを活性化し、そして
活性化を異なる時間で停止することを含む。各部分標本
は次にそのNAPT時間および第VIII因子補正時間について
測定され、そして結果のプロットが作成され、所望のNA
PT時間および場合により第VIII因子補正時間を得るため
経過しなければならない期間が決定される。またトロン
ビンも測定されることが好ましい。次にバルクロットが
部品標本サンプルについて使用したのと同じ条件でこの
期間を念頭において活性化される。

さらに詳しくは、好ましい具体例の最初の部分は、サン
プルの110ml部分標本２本を採取し、約60mgのシリカを
各部分標本と15℃ないし20℃の温度で混合し、活性化が
５分間進行するのを許容し、それを60分に達するまで反
復し、シリカを除去するため部分標本をロ過し、各部分
標本について活性化時間を記録し、そして各部品標本に
ついて平均NAPTおよび第VIII因子補正時間を決定するこ
とよりなる。NAPTおよび第VIII因子補正時間それぞれ約
70ないし100秒および約70ないし90秒を得るのに必要な
活性時間がその後間挿法によって決定される。この全操
作は普通1.5時間以下を必要とする。この時間の間サン
プルがそれから採取されたバルクロットは活性因子のレ
ベルに有意な変化なしに単に15ないし20℃に保たれるこ
とができる。

適当な活性化時間を決定するための好ましい方法の第二
の部分は、バルクロットそれ自体に対する活性化操作の
影響がモニターされるから、代表となることを意図した
部分標本の活性化を追跡するよりも一層直接的な結果が
得られる利益を有する。この方法の第二の部分は、スク
リーニングされた出発原料の活性化を開始し、反応混合
物から５分間隔で10mlサンプルを採取し、それぞれにつ
いて第VIII因子補正およびNAPT時間、そして場合により
トロンビンを測定することよりなる。あらかじめ定めた
第VIII因子補正またはNAPT時間が次の５分間間隔内に達
成されることが見込まれるとき、シリカをロ過除去する
ことにより活性化操作を停止する。これら測定はサンプ
ルを採取した時の活性化の状態の測定であって、結果を
読み取る時のそれではないので、活性化操作を停止すべ
き時点は測定結果から外挿法によって予測することが望
ましい。予測は、普通のように活性化操作の間前に観察
された第VIII因子補正時間およびNAPT時間のプロットを
基礎にして行う。

制御された活性化の終了の後、その必要はないけれども
凝固因子をさらに任意の所望程度に精製することができ
る。活性PCCを米国特許第3,560,475号に開示され、そし
て上で論じたようなPEG沈殿によって精製し、濃縮する
ことが好ましい。他のタンパク単離技術、例えばイオン
交換樹脂への吸着、ゲルクロマトグラフィー、またはア
ルカノールまたはプルロニックポリマーのような良く知
られた試薬による沈殿も使用することができる。

精製した製品は分画IV−１ペーストの約２％溶液に等し
い水溶液の体積に溶解される。好ましくはこの水溶液は
0.1Mクエン酸ナトリウム１容、0.9％NaCl ４容および
ヘパリン１ないし２単位/mlを含有する。pHは生理的に
耐え得るレベル例えば7.0へ調節され、清澄化され、そ
して慣用技術で無菌ロ過され、バイアルへ小分され、そ
して凍結乾燥される。製品は一般に無菌水中に凍結乾燥
前と同じ濃度に復元される。復元された製品はヘパリン
を0.5ないし1.5単位/ml,好ましくは約1.1単位/ml以上含
有するであろう。

ヘパリンは活性化後任意の点で加えることもできるが、
凍結乾燥前の活性PCCの最後の溶解のときに添加すべき
である。ヘパリンを凍結乾燥直前に加えるのが好まし
い。製品は通常抗トロンビンを0.1国際単位/mlを含有す
るので、もっと多量の抗トロンビンIIIを加える必要は
ないが、この時点で抗トロンビンIIIも加えられる。も
し必要なら、復元された活性PCC中の余分のトロンビン
活性をトロンビン0.003単位/ml以下に減らすのに充分な
抗トロンビンIIIおよびヘパリンが加えられる。

凝固因子定量 第XI,XII,II,VII,IX,X,X a,IX a前駆体,VII a因子およ
びトロンビンの測定のための分析方法は一般に慣用のも
のである。これら定量のすべては、ことわりのない限り
いくつかの共通特徴を有している。第１に各定量法は試
験サンプルの２系列の系統的希釈液と、そして１単位/m
lの与えられた力価を有する標準液を調製することを含
む。試験サンプル中の単位/mlによる濃度は、２系列を
平均し、標準液について得られた結果をそれらの以前の
系統的希釈によって確立されたそれらのそれぞれの％濃
度に対してプロットし、該プロットから希釈した試験サ
ンプル中の％濃度を読み取り、調製した系統的希釈につ
いて試験サンプル濃度を補正し、試験サンプル％濃度を
平均し、そして平均値を100で割って定量した因子の単
位/mlに到達することによって計算することができる。

第２に、ことわりのない限りすべての定量は37℃で実施
され、そしてすべての試薬はその温度にあらかじめ加温
される。

第３に、総凝固因子の定量は標準として凍結乾燥したヒ
ト正常血漿または凍結正常ヒト血漿を使用する。凍結乾
燥した正常ヒト血漿は、新たに採血した正常ヒト血漿の
三つの別々のプールに対して標準化される。各プール
は、経口避妊薬、抗炎症剤または関節炎投薬を服用して
いない10人の絶食した正常供血者からの静脈血を採取す
ることによって調製される。供血者はまたプロトロンビ
ン時間11ないし15秒、APTT30ないし45秒、およびフィブ
リノーゲンレベル200ないし400mg/dlを有していなけれ
ばならない。血液は3.8％クエン酸ナトリウム中に血液
９容に対し抗凝固剤１容の割合で採取し、混合し、100R
CFで15分間遠心し、その後各血漿上清の等量をプールす
る。血漿は１時間以内に定量する。以下で定量した各総
因子についての３プールの平均力価を勝手に１単位/ml
と設定する。

凍結正常ヒト血漿は、プールを1mlづつプラスチックバ
イアルへ分配し、そして−70℃で凍結することを除き、
前記の新たに採血した３プールのうち任意の一つと同じ
方法で調製される。凍結したプールは60日以内に使用さ
れる。各凍結プールは各総因子を１単位/ml含むものと
考えられる。以後上記２方法のいずれかにより確立され
た標準単位を含有する血漿は、参照血漿または標準血漿
と呼ばれる。

第４に、いくつかの定量において使用される因子欠乏血
漿は、特定の因子が先天的に欠乏している供血者、すな
わち正常プール血漿中に存在するものの約５％より少な
い因子力価を有する供血者から得た血漿である。

第５に、Ｆ−IX定量は総および前駆体Ｆ−IXを検出す
る。総Ｆ−IXのための定量は活性および不活性Ｆ−IX活
性の合計値を測定し、他方Ｆ−IX a前駆体定量は実質上
活性物質を含まない。従ってＦ−IX aは総Ｆ−IXから前
駆体活性を差し引くことによって推算することができ
る。残りの分析方法、すなわち第II,VII,X,XIおよびXII
のための分析方法は、すべて活性および酵素原因子の合
計を測定することに注意すべきである。しかしながら簡
単にするためこれら定量について「総」または「全」は
使用しない。他方およびＦ−IX定量法と対照的に、以下
に記載のトロンビン、VII aおよびX a法は活性因子を直
接定量する。

トロンビンは以下の方法によって測定される。NIHトロ
ンビン標準ロットＢ−３に対して標準化されたウシトロ
ンビン標準を通常の食塩水中0.001,0.002,0.003,0.005
および0.010μ/mlに希釈する。この希釈した標準液2.0m
lをフィブリノーゲン基質0.5mlへ加える。混合物を28℃
でインキュベートする。反応試験管を２分毎にチェック
する。最初のフィブリンストランドの出現をもって終点
とする。試験サンプルは希釈なしで同じように定量す
る。このように復元した試験サンプルの2.0mlをフィブ
リノーゲン基質0.5mlへ加え、そして終点生成を２分毎
に観察する。試験サンプルの凝固時間をトロンビン標準
液の凝固時間と比較する。計算は一般に前に記載したよ
うに実施する。

第X a因子はYin et al.“J.Lab.Clin.Med."81:298（1
973）の方法の変法で測定する。参照標準を含むすべて
の試薬はシグマ、ケミカル、カンパニーから市販されて
いる。試験サンプルはYin et alが使用した緩衝液中
に1:8,1:16および1:32（サンプルの部対緩衝液の部）ま
たはその希釈度が濃度0.01単位/mlにおける第X a因子標
準液の凝固時間より長くなるまでの高希釈度へ系統的に
２本宛希釈する。

標準第X a因子は最初同じ緩衝液中へ1:4に希釈し、そし
て２本宛1:64へ系統的に希釈する。標準Ｆ−X aの1:4希
釈液をＦ−X a単位/mlと定める。標準Ｆ−X aはここに
記載する定量において1:2希釈度において平均凝固時間1
4秒を生ずるものと定義される。各最終希釈液0.1mlをフ
ィブロメーターカップ中へピペットし、次に凝固を開始
させるため0.025CaCl₂0.1mlおよびウシ血漿−ウサギセ
ファリン溶液0.2mlをピペットする。各試験管について
の凝固時間を測定し、そしてＦ−X a活性を前に記載し
たように計算する。

Ｆ−X aは前記の凝固法の代替法として色原体法によっ
ても測定することができる。定量結果を「色原体法」で
あると断わりがない限り、Ｆ−X aは凝固法によって測
定したものと思われたい。色原体法は殆んどKosow,“Th
rombosis Research"1:565−573（1976）に記載されて
いる。これは405nmにおけるその光吸収によって検出し
得る色原体を得るように、Ｆ−X aによって特異的に加
水分解された合成基質と使用する。この基質Ｓ−2222は
Ortho Diagnostics,Inc.より市販されている。標準Ｆ
−X aはSigma Chemical Co.から得られるが、使用前N
aCl 1.33重量％を含む0.05Mトリス緩衝液pH8.3中へ1:4
に希釈される。Ｆ−X a0.5単位/mlを含む1:4希釈標準液
は定量において405nmにおける平均光学密度0.260を示さ
なければならない。この定量の実施において、サンプル
および希釈した標準液はトリス緩衝液中に系統的に希釈
される。各希釈液の0.4mlをガラス試験管へピペット
し、0.5M CaCl₂および0.1M NaClを含む溶液0.075mlお
よび１分後NaCl 0.9重量％を含む0.05Mトリス緩衝液pH
8.3中のＳ−2222溶液0.5mlをピペットする。50％酢酸0.
1mlを３分後に加えて反応を停止し、そして吸収を緩衝
液ブランクに対し405nmにおいて読み取る。計算は一般
に前に記載したように実施する。

第Ｘ因子は“Thromb.et Diath"２:24（1958）記載のBa
chma et al.法の変法で測定するが、ザイツロ過した
雄ウシ血漿の代りに第Ｘ因子欠乏血漿を使用し、フィブ
ロメーターを終点検出のために使用し、そして希釈液は
Proctor et al“Am.J.Clin.Path."36（３）:214（196
1）記載の塩化ナトリウムおよびクエン酸ナトリウム含
有ベロナール緩衝液である。ラッセルマムシ毒液および
セファリンは、それぞれバロース、ウエルカム、アン
ド、カンパニーおよびトラベノール、ラボラトリーズ社
のハイラインド、デイビジョンから得た。計算は一般に
前に記載したように実施した。

プロトロンビン（第II因子）は以下の手法で定量され
る。Tocantins,Ed.,Blood Coaguration,Hemorrhage a
nd Thrombosis,vol.1,pp−144−148（1964）中のPeche
t法によって調製した第II因子欠乏血漿0.1mlを８本の試
験管へそれぞれ分配する。100％参照血漿は参照血漿を
イミダゾール1.72w/v％緩衝液pH7.3中へ1:10に希釈する
ことによって調製される。この参照血漿は次に同じ緩衝
液中に1:5,1:10,1:20および1:40にさらに希釈される。
各希釈液の0.1ml部分標品２本宛第II因子欠乏基質を含
む試験中へピペットされる。試験管の各２本セット中へ
参照血漿をピペットした直後、CaCl₂で凍結乾燥したウ
サギ脳トロンボプラスチン0.2mlをプラスチック先端ピ
ペットを使用して各試験管へ加える。15秒混合した後、
各試験管に光源の上で２秒に１回前後に傾け、そして最
後のゲル生成までの経過時間を記録する。以上の操作
を、イミダゾール緩衝液中の1:100希釈液を1:5,1:10,1:
20および1:40希釈液をつくる前につくることを除いて、
試験サンプルについて繰り返す。データは前に記載した
のと同じ方法で処理される。

Ｆ−IXは前に引用したProctor et alの方法と実質的
に同じである以下の方法によって測定される。活性PCC
試験サンプルの最小の1:20前希釈は生理食塩水中に調製
される。参照血漿は前希釈されない。試験サンプルおよ
び参照血漿のバルビタール緩衝食塩水中への２本宛の1:
5,1:10,1:20および1:40希釈液は、Proctor et alに記
載の部分的トロンボプラスチン−カオリン0.1mlおよび
正常Ｆ−IX活性の５％以下を有するＦ−IX先天的欠乏血
漿0.1mlを既に収容している試験管へピペットする。３
分後、0.03M CaCl₂0.1mlを各試験管内容物と混合し、3
0秒間インキュベートし、そして次に各試験管を光源の
前で最終ゲル生成であるまで２秒に１回以下傾ける。Ca
Cl₂添付からゲル生成までの時間を記録し、そしてデー
タを一般に前に記載したように処理する。

Ｆ−IX a前駆体は、最初の試験サンプルの最小1:20希釈
を生理食塩水でなく、Ｆ−IX欠乏基質中につくることを
除いて、徴Ｆ−IXについての前記方法と同じ方法で定量
する。

第VII因子は、凝固点をClotek器具で測定し、そして希
釈液が前に引用したProctor et alが記載した希釈液
であることを除き、Bang et al.,Ed.,Thrombosis an
d Bleeding Disorders,Theory and Methods,pp−19
7−198（1971）記載のEsnouf et al法によって測定さ
れる。

第VII a因子はサンプルを最初ベンズアミジン−セファ
ローズアフィニティーマトリックスで吸着することによ
って定量される。ベンズアミジン−セファローズアフィ
ニティーマトリックスは、例えばSchmer,“Z.Physiol.C
hem."353:810−814（1972）に記載されている良く知ら
れたアフィニティーゲルである。吸着されない分画を0.
1M NaHCO₃pH7.8で洗うことによりマトリックスから除
去する。次に0.5M NaClおよび0.3MベンズアミジンHCl
を含む同じ緩衝液がＦ−VII aを含有する分画を除去す
るために使用される。VII aについて後者の分画の定量
は、Ｆ−VIIに使用した同じ定量法および参照により実
施される。

第XI因子の定量は、CaCl₂溶液が0.03Mであり、トラベノ
ール、ラボラトリーズ社のハイランド、デイビジョンか
ら販売されているセファリン−カオリンを使用し、そし
て凝固点をClotek装置を使用することを除いて、Rappap
ort et al.,J.Lab.Clin.Med.57:771（1961）に記載さ
れている。

第XII因子は実質上第XI因子と同じ方法で測定される。
しかしながらこの場合第XII因子欠乏血漿を使用し、そ
して定量はプラスチック物品との接触で実施される。

本発明の新規な活性化された製品は、個々の凝固因子の
量または活性、NAPTおよびＦ−VIII補正時間で代表され
る全体の凝固促進活性、トロンビン活性および処置した
患者にＦ−VIIIに対する免疫を誘発する物質を実質上含
まないこと、ヘパリン１単位/ml以上および最終製品中
に抗トロンビンIII約0.1ないし３単位/mlの存在によっ
て特徴付けられる。前記特徴のいずれかまたはすべての
組み合わせは本発明の製品をも特徴付ける。

本発明の活性PCC中の凝固因子活性の典型的、好ましい
およびもっと好ましい範囲は、以下の第１表に述べる限
界内にある。第１表に述べた成分に加えて、製品は場合
によりＦ−XI約３ないし65単位/mlおよびＦ−XII約１な
いし30単位/mlを含んでもよい。

勿論これら因子のそれぞれに対する単位/mlで表わした
範囲は、製品の意図する用途によって変わる活性PCCの
復元体積によるであろう。上に示した範囲は患者へ直接
投与するため希釈または復元された活性PCCについてで
ある。

本発明はまた、Ｆ−VIII補正活性約１ないし35単位/ml
およびNAPT時間約27ないし70秒/mlを有する製品を含
む。好ましい組成物はＦ−VIII補正活性約７ないし30単
位/mlを示す。

本発明の活性PCCはこれまでPCCが投与されて来たのと同
じ方法で患者に投与することができる。普通凍結乾燥し
た活性PCCを含むバイアルの内容物は無菌水で復元さ
れ、そして一般にＦ−VIII補正活性約８ないし160単位/
kg,好ましくはＦ−VIII補正活性約10ないし80単位/kgの
範囲である治療上有効な投与量において注入される。最
適な結果は、Ｆ−VIII補正活性約25単位/kg以上，好ま
しくは50単位/kgの投与量で得られる。もし必要なら
ば、まれには活性PCCの全投与量はＦ−VIII補正活性約2
000単位/kgにも達した。満足な治療法は通常Ｆ−VIII補
正活性約８ないし300単位/kg,好ましくはＦ−VIII補正
活性約10ないし100単位/kgの全投与量において見られ
る。全投与量は一回の出血現象の間投与されるＦ−VIII
補正活性の量に関し、一回の注入時の投与した量をいう
のではないので、一回の注入が臨床的に満足な結果を達
成するのに有効なことがしばしばあることが理解できよ
う。

治療処置の一具体例は、Ｆ−IX約20ないし112単位/mlお
よびＦ−IX a前駆体０ないし約30単位/mlを含む水性組
成物の治療的に有効投与量を凝固因子阻害因子を発揮す
る患者に投与することである。

本発明の治療法の他の具体例は、Ｆ−VII約37ないし110
単位/mlおよびＦ−VII a約８ないし80単位/mlを含む水
性組成物の治療的に有効投与量を凝固因子阻害因子を発
揮する患者に投与することである。

本発明の他の具体例は、Ｆ−Ｘ約１ないし50単位/mlお
よびＦ−X a約４ないし10単位/mlを含む水性組成物の治
療的に有効投与量を凝固因子阻害因子を発揮する患者へ
投与することである。

本発明は以下の実施例を参照することによりもっと完全
に理解されるであろう。

実施例１ 活性プロトロンビン複合体の製造 この実施例は活性PCCの制御された製剤の典型的な製造
操作を記載する。

コーン分画IV−１ペースト80kgを食塩水720Lに懸濁し、
pHを1N水酸化ナトリウムで7.2に調節する。発生した重
い沈殿を沈殿させ、その後で透明な上清を遠心で得る。
NAPTおよび第VIII因子補正時間はそれぞれ240秒および9
8秒と測定された。これら時間はそれぞれ200秒および98
秒以上の基準に入るので、このロットを活性化に使用し
た。リン酸カルシウム3.6kgを清澄化した上清へ加え
る。15分間混合後、懸濁液を遠心してリン酸カルシウム
へ吸着された凝固因子を回収する。該因子は溶解したIV
−１ペースト容の４％に等しい体積の0.1Mクエン酸ナト
リウムと５分間激しく混合することにより、リン酸カル
シウムから分離される。懸濁液は遠心され、上清が回収
される。

上清中の凝固因子は次に、上清へシリカ20.9gを加え、
連続的に混合することによって活性化される。サンプル
10mlを５分間隔で採取し、そして前記のNAPTおよび第VI
II因子補正時間と、そしてトロンビン定量によって活性
の程度を測定する。

NAPTおよび第VIII因子補正時間がそれぞれ90および70な
いし90秒以内に達したとき、シリカ誘発活性化は反応混
合物を1.2ミクロンカートリッジでロ過することによっ
て打ち切られる。この時点でのトロンビン活性は0.003
単位/ml以下であった。

次に活性PCCは米国特許第3,560,475号に記載のPEG（ポ
リエチレングリコール）沈殿工程によってさらに精製さ
れる。シリカ除去工程からのロ液は平均分子量4000を有
するPEG（PEG4000）1.4kgを加えることにより、PEG5w/v
％にされる。約15分間混合後懸濁液は遠心され、そのpH
は5.2へ調節され、そして上清はさらにPEG4.1kgの添加
によってPEG4000濃度20％にされる。約15分間混合後、
上清を遠心し、そして沈殿を採取する。沈殿はNaCl 0.
72％およびヘパリン1.5単位/mlを含み、pH7.0に調節さ
れた0.02Mクエン酸ナトリウム中に溶解され、清澄化さ
れ、無菌ロ過され、30mlバイアルに分注され、凍結乾燥
される。水で復元したこの製剤中の第VIII因子補正およ
びNAPT活性、および凝固因子レベルを第２表に記載す
る。

実施例２ 実施例１の操作をPCCのさらに10ロットについて実質上
繰り返した。結果を第３表に示す。

実施例３ 本発明の製品を治療効果の評価のため13人の研究者に分
配した。全部で患者13人が合計74出血回数について処理
された。１人を除いてすべての患者は第VIII因子抗体を
各種レベルで示し、第VIII因子抗体を持っていない患者
は実施例４においても追加報告する。

これら患者の出血は、主として関節（59.5％）で、軟組
織（14.8％）および関節と軟組織の併発出血は残りの大
部分を占めた。残る15人のうち10人（13.5％）は外傷か
ら誘発され、３人は血尿を示し、１人は吐血で、１人は
頭蓋骨内出血であった。

幾例かは多数回注入であるが、全投与量は第VIII因子補
正活性９ないし1861単位/kgの範囲であった。投与量の
分布は、患者トロンビン時間（PT）および活性部分トロ
ンボプラスチン時間（PTT）に関連して以下の第４表お
よび第５表でさらに論ずる。各投与量は注射用無菌水中
で注入することにより投与した。多くの場合中程度また
は優秀な臨床反応を達成するためには約30mlの一回投与
が充分であったが、多数の出血において２回以上の投与
量が投与された。

活性PCCの臨床的実行は各研究者により注入後８時間以
内に積極的に評価された。評価は全体の臨床反応につい
てなされたが、研究者は止血、痛みの軽減、および関節
運動の改善に重きを置いた。一般に「優秀」な全体の臨
床反応とは、通常１回注入後８時間以内の急激な痛みの
軽減、および関節または出血部位寸法の明白な減少を意
味する。「中程度」の全体臨床反応は、はっきりしたし
かしいくらかおそい痛みおよび出血部位軽減と定義さ
れ、この場合いくらかの例では２回以上の注入が必要で
あった。「良好」全体臨床反応とは、さらに注入を必要
とするはっきりしない。しかし多分有益な効果を意味す
る。「無効」と呼ぶ臨床反応は、痛み、関節運動の範
囲、または出血部位の膨潤程度に関し無効を意味する。

74回の出血における製品による治療から得られた全臨床
反応を第４表に要約する。便宜上第VIII因子補正活性投
与量は、50単位/kg以上と以下の２群に分けた。

全出血例のうち、43例または58.1％が研究者によって優
秀な臨床反応として類別された。優秀な臨床反応と中程
度の反応とを合すると、全出血例の65例（87.8％）が有
効な結果となる。９例の出血例は研究者によって良好ま
たは無効と類別され、後者は９例中３例を数えた。

第４表はさらに、第VIII因子補正活性50単位/kg以上の
投与量を受けた50出血例のうち、33例または66％が優秀
な臨床反応を示し、50単位以下を投与した24例のたった
10例（または41.6％）が優秀な臨床反応を示したことを
示している。このように第VIII因子補正活性50単位/kg
の投与量が出血例の最良の治療処置のために好ましいこ
とが結論される。

臨床反応が発生しなかった３例の出血例のうち、１人は
最初製品の比較的的投与量（10単位/kgおよび22時間後2
1単位/kg）で処置された。患者が42単位/kgの追加投与
２回を受け（それぞれ約22時間置き）、ギブス副木を当
てた後はいくらかの除去の改善が見られた。

２番目の患者は31.8単位/kgの３回の注入の最初の注入
後に僅かの改善を示した。しかしながらその後の投与は
効果のないことを示したので、患者は第VIII因子療法に
切り替えた。第VIII因子（3,500単位）の３回の投与
後、出血のゆっくりした改善が起った。

３番目の患者はほんの少量の１回の製品の注入（39.1単
位/kg）を受けた。

出血例の抑制においては症状の急速な軽快が極めて重要
であるから、これらのデータを本発明製品の１回投与の
効果を示すようにアレンジした。

第５表はこの結果を要約する。

50単位/kgまたはそれ以上で良い成積が得られることが
見られる。

活性PCC投与量、注入後PTTおよびPT定量、および臨床反
応間の相関関係が間隔が15分から２時間の間で変化する
注入前から注入後への最低および最高PTおよびPTTの減
少を測定することによって検討された。その結果が対照
時間との差、すなわち△差として第６表および第７表に
示される。単位は第VIII因子補正単位である。

結論として、主として第VIII因子阻害因子による凝固因
子欠乏症を示した患者33人の74出血例が本発明製品によ
って処置された。74例中71例に有効臨床反応を得た。71
例中59例は有効な臨床反応を得るためにたった１回の注
入が必要であり、59例中55例は注入後８時間以内に反応
が現れた。有効な臨床反応を得るのに６例は２回投与
を、６人は３回またはそれ以上の注入を必要とした。

PTTおよびPT値の最大の低下は第VIII因子補正活性50単
位/kg以上の投与量で発生し、そして大きい有効な臨床
反応をともなった。

実施例４ 実施例３に報告した臨床実験患者１人は第IX因子欠乏の
既往歴を持っていた。さらに第XI因子阻害因子が観察さ
れた。この患者は左腿に自然出血を持ち、そのため彼は
最初入院第１日ないし第７日に１日当り1Lの新鮮な凍結
血漿を投与された。第10日ないし第13日に本発明製品が
投与された。合計第VIII因子補正活性177単位/kgの４回
注入後の全的臨床反応は、研究者によって中程度と類別
された。研究者は「この製品の供給がなければ患者の出
血のため彼の左足を使用できなくなっていたであろう」
と報告した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 バ−クバイル・エル・レイモンド アメリカ合衆国92704カリフオルニア・サ ンタアナ・サウスニユ−ポ−トストリ−ト 731 (72)発明者 ト−マス・ウイリアム・ア−ル アメリカ合衆国92677カリフオルニア・ラ グナニグエル・ブリガンチンドライブ 33571 (72)発明者 ツエ・ダフネ・シ− アメリカ合衆国92683カリフオルニア・ウ エストミンスタ−・ミントストリ−ト8941

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】単位/mlで表わし、血液凝固因子を下記濃
   度： プロトロンビン １〜10 第VII因子 37〜190 第VII a因子 ８〜80 総第IX因子（IX＋IX a） 15〜112 第IX a因子前駆体 ０〜30 第Ｘ因子 １〜30 第X a因子 １〜20 トロンビン ＜0.003 で含むことを特徴とする血液凝固因子の阻害因子を有す
   る患者の止血処置に使用するための水性組成物。
2. 【請求項２】単位/mlで表わし、血液凝固因子を下記濃
   度： プロトロンビン 3.6〜8.9 第VII因子 37〜122 第VII a因子 25〜78 総第IX因子（IX＋IX a） 20〜81 第IX a因子前駆体 ５〜20 第Ｘ因子 １〜25 第X a因子 １〜10 トロンビン ＜0.002 で含んでいる請求の範囲第１項の水性組成物。
3. 【請求項３】単位/mlで表わし、血液凝固因子を下記濃
   度： プロトロンビン 3.6〜5.9 第VII因子 39〜88 第VII a因子 25〜60 総第IX因子（IX＋IX a） 50〜80 第IX a因子前駆体 ５〜12 第Ｘ因子 １〜13 第X a因子 ４〜10 トロンビン ＜0.001 で含んでいる請求の範囲第１項の水性組成物。
4. 【請求項４】ヒトに第VIII因子に対する免疫反応を引き
   起こさせないように充分に第VIII因子抗原を含まない請
   求の範囲第１項ないし第３項のいずれかの水性組成物。
5. 【請求項５】濃縮された形で血液凝固因子II（プロトロ
   ンビン）,VII,IXおよびＸを少なくとも含んでいるプロ
   トロンビン複合体含有血液タンパク分画を原料とし、酵
   素的に活性なこれら血液凝固因子が生成する条件下にお
   いてかつ該条件を調節することによって該分画を所望の
   活性化の程度へ活性化処理することよりなる、血液凝固
   因子の阻害因子を有する患者の止血処置に使用するため
   の活性プロトロンビン複合体濃縮物を製造する方法であ
   って、 （ａ）前記分画の活性化の程度を制御するため調節すべ
   き処理条件の一つを選定し、 （ｂ）活性化終了前に、該分画をあらかじめ定めた活性
   化の程度へ活性化するのに要する選定した処理条件の大
   きさを決定し、 （ｃ）選定した処理条件を前記大きさに設定し、そして （ｄ）設定した処理条件に従って前記あらかじめ定めた
   活性化の程度まで前記分画の活性化処理を実施する工程
   を含み、 前記活性プロトロンビン複合体濃縮物は、前記患者へ直
   接投与できる水性組成物の形において、単位/mlで表わ
   し、血液凝固因子を下記濃度： プロトロンビン １〜10 第VII因子 37〜190 第VII a因子 ８〜80 総第IX因子（IX＋IX a） 15〜112 第IX a因子前駆体 ０〜30 第Ｘ因子 １〜30 第X a因子 １〜20 トロンビン ＜0.003 で含むことを特徴とする活性プロトロンビン複合体濃縮
   物の製造法。
6. 【請求項６】前記調節すべき処理条件は活性化時間、ま
   たは活性化中のpHもしくは温度である請求の範囲第５項
   の方法。
7. 【請求項７】前記調節すべき処理条件は活性化時間であ
   り、そしてpHおよび温度は活性化中実質上一定に保たれ
   る請求の範囲第６項の方法。
8. 【請求項８】前記処理条件の大きさは、活性化前に前記
   分画の部分標本を採取し、部分標本間で前記処理条件を
   変え、各部分標本について設定した処理条件に従って部
   分標本を活性化し、活性化を停止し、各部分標本の活性
   化の程度を測定し、そして前記分画のあらかじめ定めた
   活性化の程度を得るのに要する前記処理条件の大きさを
   計算することによって決定される請求の範囲第５項の方
   法。
9. 【請求項９】活性化の程度は部分標本の非活性化部分ト
   ロンボプラスチン時間（NAPT時間）を測定することによ
   って測定される請求の範囲第８項の方法。
10. 【請求項１０】前記処理条件の大きさは、活性化が開始
    された後前記分画の部分標本を採取し、各部分標本の活
    性化を停止し、各部分標本の活性化の程度を測定し、そ
    して前記分画のあらかじめ定めた活性化の程度を得るの
    に要する前記処理条件の大きさを計算することによって
    決定される請求の範囲第５項の方法。
11. 【請求項１１】前記分画の活性化の程度はそのNAPT時間
    の測定によって測定される請求の範囲第10項の方法。
12. 【請求項１２】活性化の程度は前記分画の第VIII因子補
    正時間を測定することによっても測定される請求の範囲
    第11項の方法。
13. 【請求項１３】前記分画の活性化の程度はそのNAPT時間
    およびその第VIII因子補正時間を測定することによって
    測定される請求の範囲第８項または第10項の方法。
14. 【請求項１４】活性化開始前に前記分画の自発活性化の
    程度を測定することをさらに含む請求の範囲第５項の方
    法。
15. 【請求項１５】自発活性化の程度は、前記分画の第VIII
    因子補正時間を測定することによって測定される請求の
    範囲第14項の方法。
16. 【請求項１６】自発活性化の程度は、前記分画のNAPT時
    間を測定することによって測定される請求の範囲第14項
    の方法。
17. 【請求項１７】第VIII因子補正時間約89秒以上を示す分
    画だけを活性化することをさらに含む請求の範囲第15項
    の方法。
18. 【請求項１８】NAPT時間約200秒以上を示す分画だけを
    活性化することをさらに含む請求の範囲第16項の方法。
19. 【請求項１９】前記分画のNAPTおよび第VIII因子補正時
    間が測定され、そして該分画のNAPT時間が約200秒以上
    で該分画の第VIII因子補正時間が約89秒以上の場合のみ
    該分画が活性化される請求の範囲第５項の方法。
20. 【請求項２０】前記分画の活性化処理は、活性化遅延剤
    の存在下に実施される請求の範囲第５項の方法。
21. 【請求項２１】活性化した分画をポリエチレングリコー
    ルで沈澱することにより濃縮することを含む請求の範囲
    第５項の方法。
22. 【請求項２２】前記プロトロンビン含有血液タンパク分
    画は、コーン分画Ｉ＋II＋III,IおよびIII,IIおよびII
    I,III,III−0,IV−１またはIV−４の溶液をリン酸カル
    シウムまたはジエチルアミノエチル置換樹脂へ吸着さ
    せ、吸着したプロトロンビン複合体濃縮物（PCC）を分
    離し、そしてPCCをリン酸カルシウムまたは樹脂から溶
    離することによって製造した血液タンパク分画である請
    求の範囲第５項の方法。
23. 【請求項２３】血液凝固因子の阻害因子を有する患者の
    止血処置に使用するための活性プロトロンビン複合体濃
    縮物を製造する方法であって、 （ａ）コーン分画IV−１のペーストを溶解する工程、 （ｂ）該分画中の凝固因子をリン酸カルシウムへ吸着さ
    せる工程、 （ｃ）リン酸カルシウムから該凝固因子を溶離する工
    程、 （ｄ）前記工程（ｃ）の溶離液のNAPTおよび第VIII因子
    補正時間を測定する工程、 （ｅ）工程（ｄ）において測定したNAPTおよび第VIII因
    子補正時間がそれぞれ約200秒以上および約89秒以上の
    場合、前記溶離液の部分標本を採取し、そしてそれらを
    異なる時間活性化する工程、 （ｆ）各部分標本についてNAPT時間を測定する工程、 （ｇ）約70ないし100秒のNAPT時間を得る活性化時間を
    決定する工程、 （ｈ）工程（ｅ）の残りのバルクを工程（ｅ）の部分標
    本を活性化するのに使用したのと実質上同じ条件下で活
    性化する工程、 （ｉ）工程（ｇ）において決定した活性化時間の終了前
    に規則的間隔で前記バルクのNAPT時間を測定する工程、 （ｊ）該NAPT時間が約70ないし100秒のとき該バルクの
    活性化を停止する工程、 （ｋ）活性化されたプロトロンビン複合体をポリエチレ
    ングリコールによる沈澱によって濃縮する工程、 （ｌ）ポリエチレングリコール沈澱物をヘパリン約１な
    いし２単位/mlを含有する水溶液に溶解する工程、そし
    て （ｍ）溶解した沈澱を凍結乾燥する工程 よりなり、前記活性プロトロンビン複合体濃縮物は、前
    記患者へ直接投与できる水性組成物へ復元した時、単位
    /mlで表わし、血液凝固因子を下記濃度： プロトロンビン １〜10 第VII因子 37〜190 第VII a因子 ８〜80 総第IX因子（IX＋IX a） 15〜112 第IX a因子前駆体 ０〜30 第Ｘ因子 １〜30 第X a因子 １〜20 トロンビン ＜0.003 で含むことを特徴とする活性プロトロンビン複合体濃縮
    物の製造法。