JPH0682446A - 腎疾患の診断法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 抗ヒトアルブミン分解物抗体を用いてヒト尿
中のアルブミン分解物を特異的に検出し、早期腎症の診
断方法を提供する。 【構成】 健常人と腎症患患者との尿中ヒトアルブミン
分解物を検出するにあたり、 １） 腎疾患患者由来の尿中アルブミン分解物およびヒ
トアルブミンを化学的、酵素的処理によって得られるア
ルブミン分解物をそれぞれ免疫原としたポリクロナール
抗体およびモノクロナール抗体の収得。 ２） 上記ポリクロナール抗体およびモノクロナール抗
体を利用したＲＩＡ法、ＥＩＡ法、金コロイド粒子法、
ラテックス凝集法などの測定法を確立。 ２）項の各種測定法を用いて被検者の尿を検査すること
によって早期の腎疾患を診断する。 【効果】本発明の方法によって従来に比べ簡便性、迅速
性、特異性に優れ早期の腎疾患に対する診断が可能とな
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は尿中のアルブミン分解物
を検出することによって早期腎症を発見し診断に役立て
るものである。

【０００２】

【従来の技術ならびに発明が解決すべき問題点】腎症、
特に糖尿病性腎症は腎生検が困難なことから持続性蛋白
尿、腎機能障害、高血圧等の知見から臨床診断がなされ
てきた。しかし、蛋白尿が出現すると治療が難しく、５
〜６年経過で末期腎不全に陥るのが通例である。そのた
め、通常の尿試験紙法で尿蛋白が陽性となる前に腎病変
を診断して早期治療を行なうことが臨床医学の立場から
強く望まれている。この目的で開発されたのが尿中アル
ブミンの微量測定法であり、近年腎症の診療にとって必
須の検査法になりつつある。

【０００３】尿中の微量アルブミンは放射線免疫測定法
（以下ＲＩＡと略す）、酵素免疫測定法（以下ＥＩＡと
略す）や免疫沈澱法により、正確に定量できるが、最近
は簡易キットが市販されており、アルブシュア（登録商
標）（エーザイ株式会社）もその一つである。これは免
疫凝集阻止反応を原理としており、試薬はアルブミン感
作ラテックスとアルブミン抗体であり、尿中にアルブミ
ンが殆どなければ抗原抗体反応でラテックスが凝集する
が、尿中にアルブミンがあればこれを妨害して凝集が阻
止される。

【０００４】このように微量のアルブミンを測定するこ
とにより腎疾患を診断する方法はあるが、さらに早期に
腎症の診断ができるものはない。すなわち、Ｍｏｇｅｎ
ｓｅｎら（Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３１０，３５
６，１９８４）の分類によると、微量アルブミン尿は糖
尿病発症６〜２０年の早期腎症の時期であり、第四期
（顕性腎症）へ移行する危険性が大きいのでさらに前期
の腎症診断の手法を開発することが望まれている。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、先に糖尿
病性腎症を含めた各腎疾患の早期診断の立場から、尿中
アルブミンに着目しヒトアルブミンとは異なるアルブミ
ン分解物〔以下ｕＡＦと略す。ｕＡＦとはヒトアルブミ
ン（分子量６９ＫＤ，等電点４．９）と異なる分子量ま
たは等電点を示すすべてのヒトアルブミン断片をいう。
ｕＡＦは未還元条件下ではジスルフィド結合を有するも
のが多いため比較的分子量の大きいものが多いが、還元
処理を行うとジスルフィド結合が開裂してさらに低分子
化されるものが多い。〕をはじめて発見するに至り、そ
の検出方法としてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳
動法を用いた「腎疾患の診断法」特願平３−１４８０８
０の発明を完成させた。その後、ｕＡＦの検出方法を精
査した結果、セルロースアセテート膜電気泳動法や等電
点ゲル電気泳動法さらには高速液体クロマトグラフィー
による分析法によってもｕＡＦの検出や定量にも有効で
あることが判り、これらの方法をまとめて「腎疾患の診
断法」特願平４−１０５２１４の発明を完成させるに至
った。しかしながら、これらの方法を詳細に検討した結
果迅速性や簡便性に欠ており、またかなりの熟練と経験
を必要とするものであることが判り、いつでもどこでも
誰にでもｕＡＦの検出や定量を行い得ることが要望され
ていた。

【０００６】本発明はこれらの問題を解決するためにヒ
トアルブミン（６９ＫＤ）とは反応せずｕＡＦのみに反
応する抗体を用いて例えばＥＩＡ法、金コロイド粒子
法、ＲＩＡ法、ラテックス凝集法、逆受身赤血球凝集反
応（以下ＲＰＨＡと略す）法など抗原抗体反応を基本原
理としたあらゆる公知の方法を用いてｕＡＦを検出し定
量できる方法を見出し本発明の完成に至った。

【０００７】１） 免疫原の調製方法 （ａ） ヒトアルブミン分子の化学的切断によるアルブ
ミン分解物（以下ｃＡＦと略す）の調製 ヒトアルブミン分子は分子量６９ＫＤを有しアミノ酸残
基が５８５個からなり、かつ１７ケ所にわたってジスル
フィド結合をした強固な球状タンパク質であることはよ
く知られた事実である。ヒトアルブミン分子の化学的な
切断方法としては、

【０００８】・ ヒトアルブミン分子の一次配列中のメ
チオニンや一部アスパラギン酸−プロリン結合残基を選
択的に切断するＢｒＣＮ法 ・ システイン残基を選択的に切断する２−ニトロ−５
−チオシアノ安息香酸や１−シアノ−４−ジメチルアミ
ノピリジン塩を用いる方法 ・ アスパラギン−グリシン結合残基を選択的に切断す
るヒドロキシルアミンを用いる方法

【０００９】・ トリプトファン残基を選択的に切断す
る２−（２−ニトロフェニルスルフェニル）−３−メチ
ル−３−ブロモインドール−スカトール、ＤＭＳＯ−Ｈ
Ｃｌ−ＨＢｒ，氷酢酸−１２ＮＨＣｌ−ＤＭＳＯ，４８
％ＨＢｒ−ＤＭＳＯ，ＢｒＣＮ−ヘプタフオロ酪酸，ｏ
−ヨード安息香酸，Ｎ−ブロモコハク酸イミド，などが
良く知られている。

【００１０】ｃＡＦを得るためには上記いずれの試薬に
よる化学的な切断を行うことが可能であり、所期目的は
達成される。特にヒトアルブミン由来のｃＡＦの分子量
は抗体産生可能な長さのペプチド鎖を有していれば問題
はないが、余り分子量の小さいペプチド断片が得られる
化学的切断方法は一般的に好ましいとは云えない。

【００１１】上記化学的切断法と単離精製に関する実施
方法は通常の化学的知識を有しておれば容易に目的を達
成しうるが、特に参考となる実験書としては続生化学実
験講座第２巻「タンパク質の化学」２７０〜２９２ペー
ジ（日本生化学会編、東京化学同人）に実験例を列挙し
て懇切丁寧に解説されている。化学的切断を終えた混合
物から、ｃＡＦの単離精製については一般に反応試薬を
不活性化し、これを反応系外へ取出すことが必要とな
り、また未反応のヒトアルブミンの除去も重要なポイン
トとなる。

【００１２】通常の反応試薬は低分子化合物であるため
透析やゲルフィルトレーションクロマトグラフィーの手
法で容易に取り除くことができる。

【００１３】ゲルフィルトレーションに用いる担体とし
てはセファデックス類（例えばセファデックス（登録商
標）Ｇ−１５，Ｇ−２５，Ｇ−５０などファルマシア社
製）や近年高速液体クロマトグラフィーに使用されてい
る有機ゲルの担体（例えばＴＳＫ−ｇｅｌ（登録商標）
３０００ＳＷなど、東ソー株式会社製）などが有効に利
用される。充分な反応時間と適切な温度管理のもとで反
応を制御することによりヒトアルブミンを完全に部分分
解へと導びくことが可能であるが、万一、未分解のヒト
アルブミンが分解液中に混入した場合は、先のゲルフィ
ルトレーションクロマトグラフィー法や通常汎用されて
いる電気泳動法、さらには、分子量の差で分離されるＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法や等電点の差
を利用して分離される等電点電気泳動法、各種イオン交
換クロマトグラフィーなどの方法を単独もしくは組合せ
によってｃＡＦを単離することが可能である。

【００１４】このようにして得られるｃＡＦ溶液を透析
後、凍結乾燥することにより容易にｃＡＦを取得するこ
とができる。以上、化学的切断によるｃＡＦの調製法に
ついて記載してきたが、いづれの化学的切断法を用いて
もｃＡＦを取得できるが、本出願の実施例１には、その
１例として「ＢｒＣＮによる切断法」を示したものであ
って、特にこの方法によって本出願は限定されるもので
はない。

【００１５】（ｂ） ヒトアルブミン分子の酵素的切断
によるアルブミン分解物（以下ｅＡＦと略す）の調製 ヒトアルブミン分子の酵素的切断としては通常のタンパ
ク質の部分加水分解に使用されているプロテアーゼ類を
用いることができる。

【００１６】プロテアーゼ類はペプチド結合の切断方法
からみるとエキソ（ｅｘｏ）型とエンド（ｅｎｄｏ）型
に大別されるが、本目的となるｅＡＦの取得にはエンド
型のプロテアーゼを使用するのが好ましい。

【００１７】エンド型のプロテアーゼにはペプチド配列
の特定な配列を認識して選択的に切断することが可能で
あるため、先の化学的切断にくらべて副反応も少なく常
温、常圧で反応し、また高純度の酵素を同一条件下で使
用すれば極めて再現性に優れ、かつ高収率でペプチド断
片（ここではｅＡＦを云う）を得ることが可能である。

【００１８】エンド型プロテアーゼの代表的な酵素は一
般に市販されているものが多く、容易に入手することが
できる。例えば、牛膵臓由来のトリプシンやキモトリプ
シン、牛胃液や豚胃粘膜由来のペプシン、微生物の産生
するサーモライシンやズブチリシン、さらには植物由来
のブロメラインやパパインなどが工業的にも良く用いら
れる酵素である。

【００１９】また研究用に使用されているエンド型プロ
テアーゼとしてはリジン残基を特異的に認識して切断す
るＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｌｙｔｉｃｕｓ産生の
プロテアーゼＩ（和光純薬株式会社製）やＬｙｓｏｂａ
ｃｔｅｒ ｅｎｚｙｍｏｇｅｎｅｓ によって産生され
るセリンプロテアーゼの一種であるエンドプロティナー
ゼＬｙｓ−Ｃ（ベーリンガーマンハイム社製）がある。

【００２０】その他、アルギニンを特異的に認識して切
断するセリンプロテアーゼの一種であるエンドプロティ
ナーゼＡｒｇ−Ｃ（ベーリンガーマンハイム社製）やＣ
ｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍの産
生するチオールプロテアーゼの一種であるクロストリパ
イン（ベーリンガーマンハイム社製）、グルタミン酸お
よびアスパラギン酸を特異的に認識して切断するＳｔａ
ｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ産生のＶ８プロ
テアーゼ（メレス社製）、プロリンを特異的に認識して
切断するプロリン特異性エンドペプチダーゼなどがよく
知られており通常タンパク質の一次構造解析（アミノ酸
配列の決定）によく利用されているが、これらの酵素も
ｅＡＦの取得に使用することができる。

【００２１】上記酵素的切断法と単離精製に関する実施
方法は通常の化学的または生化学的知識を有しておれば
容易に目的を達成しうるが、特に参考となる実験書とし
ては続生化学実験講座第２巻「タンパク質の化学」２６
０〜２７０，２７８〜２９２ページ（日本生化学会編、
東京化学同人）に実験例を列挙して懇切丁寧に解説され
ている。

【００２２】酵素的切断を終えた混合物からｅＡＦの単
離、精製については使用した酵素を不活化しこれを反応
系外へ取出すことが必要である。通常使用する酵素はｅ
ＡＦより高分子化合物であるためゲルフィルトレーショ
ンクロマトグラフィーや各種電気泳動（通常の電気泳
動、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動）や各
種イオン交換クロマトグラフィー、などの手法を単独も
しくは組合せによってｅＡＦを単離することができる。

【００２３】また、実施例２に示すごとく使用する酵素
をいろいろな樹脂に固定化することによってバイオリア
クターとして利用すれば基質であるヒトアルブミンを効
率よく加水分解することができる。反応終了後は固定化
酵素（樹脂に結合した酵素＝不溶化酵素）を濾別した
り、遠心分離することによって容易に使用した酵素を除
くことができる。このようにして得られるｅＡＦ溶液を
透析後、凍結乾燥することによって容易にｅＡＦを取得
できる。

【００２４】以上、酵素的切断によるｅＡＦの調製法に
ついて記載してきたが、いずれの酵素的切断法を用いて
もｅＡＦを取得することができるが、本出願の実施例２
にはその１例として「トリプシンによる切断法」を示し
たものであって、特にこの方法によって本出願は限定さ
れるものではない。

【００２５】（ｃ） 腎症患者の尿中に含まれるｕＡＦ
の単離精製 糖尿病性腎症を含めた腎症患者の尿を多量に集尿し−８
０℃に凍結保存を行うか、適当なプロテアーゼ阻害剤や
アジ化ナトリウムを加えて低温保存を行って集尿する。

【００２６】これらの集尿した尿を例えば抗ヒトアルブ
ミン抗体をリガンドしたアフィニティークロマトグラフ
ィーに吸着せしめ、洗浄後溶離することによって効率よ
くヒトアルブミン及びｕＡＦの混合物の画分を得ること
ができる。このようにして得られる画分をさらにヒトア
ルブミンとｕＡＦを分離する手段としては先に記載した
（ａ）項の「化学的切断法によるｃＡＦの調製」で示し
たと同様な分離方法が適用できる。

【００２７】例えば、分子量の差で分離できるゲルフィ
ルトレーションクロマトグラフィーや調製用のＳＤＳ−
ＰＡＧＥ電気泳動あるいは等電点の差によって分離でき
る調製用の等電点電気泳動（アンホライン（登録商標）
ＬＫＢ社製、ファルマライト（登録商標）ファルマシア
社製など）、さらには通常の調製用アガロースゲル電気
泳動や各種イオン交換クロマトグラフィーなどの方法を
単独もしくは組合せによってｕＡＦを単離することがで
きる。

【００２８】電気泳動に用いる装置のタイプとしてはデ
ィスク（円柱状）型とスラブ（平板状）型が主に汎用さ
れているが、目的とするｕＡＦの分離には特に限定する
ものではない。しかしながら、調製すると云う観点に立
てばスラブ電気泳動法の方が好ましい。その理由とし
て、泳動を終えたゲルからｕＡＦを単離するには、例え
ばスラブ型のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の場合スラブゲ
ルの両端の一部をそれぞれ切り取りクマシーブリリアン
トブルーで染色し、ヒトアルブミン（分子量６９ＫＤ）
と同じ移動度を示すバンドを切り捨て残りのゲルを集め
て例えばテフロン製のホモゲナイザーを用いてゲルを細
かく砕いた後に適当な緩衝液でｕＡＦを抽出することも
簡単に行い得るからである。

【００２９】また、スラブ型の調製用等電点電気泳動の
場合も泳動後調製用のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法と同
様にスラブゲルの両端の一部を切り取ってクマシーブリ
リアントブルーで染色し、ヒトアルブミン由来のｐＩ
４．９のバンドを切り捨て残りのゲルを集めて先に説明
した例えばテフロン製ホモゲナイザーを用いて細かく砕
いた後に適当な緩衝液でｕＡＦを抽出することもでき
る。

【００３０】一方、カラム型の等電点電気泳動の場合は
泳動後は容易に下部より一定量ずつ分画するこができる
のでｐＩ４．９附近のヒトアルブミンに由来する画分を
取り去ることによって容易にｕＡＦ画分を得ることがで
きる。このようにして得られるｕＡＦの抽出液または分
画液を透析後、凍結乾燥してｕＡＦを単離することがで
きる。

【００３１】また、実施例２に示したごとく抗ヒトアル
ブミン抗体に反応しない抗ｕＡＦモノクロナール抗体を
収得しているので、このモノクロナール抗体をリガンド
したアフィニティークロマトグラフィーを利用すること
によって腎症患者の尿を処理すると一挙に目的とするｕ
ＡＦを得ることができる。この方法の詳細については実
施例３に記載した通りである。

【００３２】２） 抗体の調製法 （ａ） ポリクロナール抗体の作製 本発明で用いるポリクロナール抗体はまず免疫原である
アルブミン分解物（以下ＡＦと略す。ＡＦとはｕＡＦ，
ｃＡＦ，ｅＡＦのいずれかを示す総称である。）をアジ
ュバントに混合し、他動物に免疫して抗血清を得ること
によりなされる。免疫法は通常の抗血清を得るための方
法であれば特に限定されるものではないが、Ｆｒｅｕｎ
ｄのコンプリートアジュバントが最適である。

【００３３】他動物としてはウサギ、ラット、ヤギなど
が利用できるが抗血清の量的確保の問題、飼育条件など
を考慮するとウサギが適している。免疫方法としては、
例えばウサギに免疫する場合、皮下、腹腔内、静脈内、
筋肉内、皮内などのいずれでも可能であるが、主とし
て、皮下、腹腔内、静脈内に注入するのが好ましい。ま
た接種間隔、接種量についても特に限定されるものでは
ないが、例えば２週間隔で２〜１０回接種する方法が適
している。接種量は１回にＡＦ量１０μg 以上好ましく
は１００μg 〜１０mg用いることが望ましい。

【００３４】最終免疫後、３〜１０日目好ましくは７日
目に全採血を行ない、抗血清を得ることができる。得ら
れた抗血清はＡＦと反応する抗体の他にヒトアルブミン
とも反応する抗体を含有しているため、ヒトアルブミン
と反応する抗体を除去する必要がある。

【００３５】そこで、ＡＦに対する特異抗体を得る方法
は通常の抗体を精製する種々の方法を利用できるが、特
にアフィニティークロマトグラフィーが最適である。ア
フィニティークロマトグラフィーの担体としては種々の
市販品があり、特に限定されるものではないが、ＢｒＣ
Ｎ活性化セファロース４Ｂ（ファルマシア社製）などが
適している。ＡＦ特異抗体を得る一例を示すと、まずヒ
トアルブミンをＢｒＣＮ活性化セファロース４Ｂに一定
量結合させ、ヒトアルブミン−セファロースカラムを作
製する。カラムを一定量の緩衝液（ｐＨ７．０〜８．
５）で平衡化させ、一定量の抗血清を吸着させる。吸着
後、平衡化に用いた緩衝液で洗浄を行ない、未吸着画分
を集める。

【００３６】次にＡＦをＢｒＣＮ活性化セファロース４
Ｂに一定量結合させ、ＡＦ−セファロースカラムを作製
する。カラムを一定量の緩衝液（ｐＨ７．０〜８．５）
で平衡化させ、一定量のヒトアルブミン−セファロース
カラムより得られた未吸着画分を吸着させる。吸着後、
平衡化に用いた緩衝液で洗浄を行ない、溶離液（ｐＨ
２．０〜４．０）にて溶出を行ない、ＡＦ特異的抗体を
得ることができる。

【００３７】精製抗体は硫安塩析、限外濾過、イオン交
換クロマトグラフィー、凍結乾燥などを用いてｕＡＦ測
定に必要な濃度に濃縮する。

【００３８】（ｂ） モノクロナール抗体の作製 本発明で用いるモノクロナール抗体はＫｏｅｈｉｅｒ
Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５，１
９７５）によって示された免疫動物の脾臓細胞と同種動
物由来のミエローマ細胞との融合によってつくられる融
合細胞（ハイブリドーマ）から製造することができる。
免疫する動物としてはマウス、ラット、ハムスターなど
の実験動物が用いられるが、最も実績のあるマウスが適
している。細胞融合に用いられるミエローマ細胞として
は細胞融合の効率が高く、増殖性が良いマウスミエロー
マ細胞とくにヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシ
ルトランスフェラーゼ欠損株やチミジンキナーゼ欠損の
ようなマーカーをもったミエローマ（Ｐ３−ｘ６３−Ａ
ｇ８，ｘ６３−Ａｇ８−６．５．３，ＳＰ２／０−Ａｇ
１４）が利用できる。

【００３９】モノクロナール抗体を収得するためには、
マウス、ラット、ハムスターなどの実験動物を利用する
ことができるがその中でもマウスが好適である。

【００４０】免疫方法としては、例えばマウスに免疫す
る場合、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮内などのい
ずれでも可能であるが主として皮下、腹腔内、静脈内に
注入するのが好ましい。また接種間隔、接種量について
も特に限定されるものではないが、例えば１週間隔で２
〜１０回接種し、最終免疫後、１〜５日、好ましくは２
〜４日後の脾細胞を用いる方法が好適である。接種量は
１回にＡＦ量として１μg 以上好ましくは１００μg 〜
１０mg用いることが望ましい。

【００４１】リンパ球とミエローマ細胞との細胞融合は
例えば、免疫したマウスのリンパ球（脾臓細胞由来のも
の）をヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトラ
ンスフェラーゼ欠損やチミジン欠損のようなマーカーを
持った適当なミエローマとの間で融合させる。融合には
センダイウィルス、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
などの融合剤が用いられる。

【００４２】また、ＤＭＳＯその他の融合促進剤を加え
ることもできる。ＰＥＧの平均分子量は通常１，０００
〜１０，０００好ましくは１，０００〜５，０００、濃
度は１０％〜８０％などが利用されるが通常４０〜６０
％で行なった場合に効率よく融合させることができる。
融合細胞（ハイブリドーマ）はヒポキサンチン−アミノ
プテリン−チミジン培地（ＨＡＴ培地）などを用いて、
選択的に増殖させることができる。

【００４３】増殖した細胞の培養上清は目的とする抗体
を産生しているか否かをスクリーニングすることによっ
て達成されるが、特に本スクリーニングはヒトアルブミ
ンとＡＦに対する抗体の反応性の差異を調べ、ＡＦに対
してのみ特異性の高い抗体を得ることが重要である。

【００４４】すなわち、本反応性の差異を調べるに当っ
ては、ＥＩＡ法またはＲＩＡ法などの方法で調べること
ができるが、これらの方法についても種々の変法が可能
である。一例として、ＥＩＡ法を用いる方法について記
載する。

【００４５】ＡＦおよびヒトアルブミンを９６穴のマイ
クロタイタープレートに一定の蛋白濃度で常法に従って
固定化する。これに測定したい培養上清を一定量加え、
一定時間、一定温度で反応させる。ついで反応物をよく
洗浄後、酵素標識抗マウスＩｇＧを加え、一定時間、一
定温度で反応させる。反応物を洗浄後、基質を加え、一
定時間、一定温度で反応させ、その後反応生成発色物を
吸光度または蛍光強度などで測定することができる。

【００４６】選択培地で増殖を示し、ＡＦに対してのみ
抗体活性を示すウエルの細胞を限界希釈法などによりク
ローニングを行なう。クローン化された細胞の上清につ
いて同様にスクリーニングを行い、抗体価の高いウエル
の細胞を増やすことにより、目的とする本発明のモノク
ロナール抗体産生ハイブリドーマクローンが得られる。

【００４７】３） ｕＡＦの測定法について ｕＡＦの測定は得られたＡＦ特異抗体（モノクロナール
抗体、ポリクロナール抗体）を用いて、抗原抗体反応を
行なうことによりなされる。抗原抗体反応を利用した測
定は種々の方法が開発されているが、本測定の手法は特
に限定されるものではない。すなわち一般に対象物の測
定に用いられているラテックス凝集反応、ＲＰＨＡ法、
ＥＩＡ法、ＲＩＡ法、金コロイド粒子法などが本測定に
も利用できる。

【００４８】ｕＡＦの測定について２〜３の例を以下に
示す。ＥＩＡ法には競合法、非競合法など種々の反応様
式があり、本出願においても特に限定されるものではな
いが、一例として非競合法のサンドイッチ法を述べる。

【００４９】まず、精製抗ＡＦ抗体を一定量に希釈し、
９６穴マイクロタイタープレートのウエルに一定量添加
する。一定時間、一定温度で反応後、過剰の抗体液を除
去する。安定化剤（例えばウシ血清アルブミン、以下Ｂ
ＳＡと略す）を含むリン酸生理緩衝液（以下ＰＢＳと略
す）を各ウエルに一定量添加し、一定時間、一定温度で
マスキングを行なう。その後液を除去し、安定化剤を含
むＰＢＳを各ウエルに一定量添加し、ＡＦ抗体結合プレ
ートを作製する。

【００５０】次にＡＦ抗体結合プレートに尿検体の一定
量を添加し、一定時間攪拌した後、一定温度、一定時間
反応させる。反応後の液を除去した後、安定化剤を含む
ＰＢＳを各ウエルに一定量ずつ添加して洗浄を行なう。
洗浄を数回好ましくは３〜５回繰り返した後、酵素標識
抗ＡＦ抗体を各ウエルに一定量を添加し、数分間攪拌し
た後、一定温度で一定時間反応を行なう。反応後、洗浄
し、基質液を一定量ウエルに添加し、一定時間、一定温
度で反応させる。反応停止液を一定量添加し、酵素反応
を停止させる。その後、反応生成発色物を吸光度または
蛍光強度などで測定し、判定を行なうことができる。

【００５１】次に金コロイド粒子を用いたｕＡＦの免疫
測定法を示す。金コロイド粒子は一般に２〜２０nm程度
のものが使用されるが本法においても粒子径は特に限定
されるものではないが好ましくは３〜１７nmが適してい
る。この粒子の調製法はＳｌｏｔ ＆ Ｇｅｕｚｅ（Ｅ
ｕｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，３８，８７，１９８
５）らによって報告されている方法により容易に調製す
ることができる。すなわち４倍容の塩化金酸（１％塩化
金酸を８０倍に蒸留水で希釈したもの）に１倍容の還元
液（１％クエン酸ナトリウムにタンニン酸の量を変化さ
せ、蒸留水で５倍希釈したもの）を一定温度で混合し、
淡黄色から紫ないし赤に変色したら、沸騰させ直ちに氷
冷することにより得ることができる。

【００５２】金コロイド粒子懸濁液の一定量を結合した
い抗体の等電点付近に調整し、抗ＡＦ抗体を一定量加え
る。数分間攪拌した後、数％のＢＳＡを一定量加え、メ
ンブランフィルターを用いて濾過を行い、抗ＡＦ抗体感
作金コロイド粒子を得ることができる。

【００５３】金コロイド粒子着色法に用いる固相化シー
トとしてはニトロセルロース、ナイロン、ポリフッ化ビ
ニリデンなどの担体が用いられるが好ましくはニトロセ
ルロースが最適である。ニトロセルロースは種々市販さ
れているがＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ
社製が適している。担体への結合は容易になされる。す
なわち第１の領域として抗ＡＦ抗体をＰＢＳにて一定濃
度に調製したものを担体上に垂直方向に印字する。第２
の領域として同一担体上に抗マウスＩｇＧをＰＢＳにて
一定濃度に調製したものを水平方向に印字し、一定温度
で一定時間反応させ固相化する。次にスキムミルク、カ
ゼイン、ＢＳＡ、ブロックエースなどの安定化剤を用い
るが、好ましくはスキムミルクを一定濃度に調製し、一
定温度で一定時間含浸させ、マスキングを行なう。マス
キング後乾燥を行ない抗ＡＦ抗体固相化シートとして用
いることができる。

【００５４】測定は抗ＡＦ抗体固相化シートの断片を試
験管に入れ、尿検体液を一定量加え、一定温度で一定時
間反応させる。反応後、未反応液を除去し、洗浄剤とし
て界面活性剤などを用いるが、その中でも好ましくはＴ
ｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳで洗浄するのが望まし
い。数回洗浄を行なった後、抗ＡＦ抗体感作金コロイド
粒子を一定量加え、一定温度で一定時間反応させる。次
に過剰の抗ＡＦ抗体感作金コロイド粒子を除去し、緩衝
液好ましくはＨＥＰＥＳ緩衝液で洗浄した後、＋印字さ
れたものを陽性、−印字されたものを陰性として肉眼判
定を行なうことができるが、陽性、陰性の表示はこれに
限定されるものではない。なお金コロイド粒子による検
出法の一例を上記に示したが、他に金コロイド粒子凝集
法を用いて、反応液の色調変化で測定を行なうことも可
能である。

【００５５】次にラテックス凝集法によるｕＡＦ測定法
の一例を示す。ラテックス凝集法は種々の検査に利用さ
れているが、本出願はこれに限定されるものではない。
例えば抗ＡＦ抗体の一定量を緩衝液（ｐＨ７．０〜９．
０）の一定量に加え溶解する。これにラテックス粒子を
一定量加え、一定温度で一定時間反応させる。なお、ラ
テックス粒子径は特に限定されるものではないが通常
０．３〜０．５μm が好ましい。反応後、一定温度で遠
心分離を行ない、沈渣の抗ＡＦ抗体感作ラテックス粒子
に安定化剤（スキムミルク、カゼイン、ブロックエー
ス、ＢＳＡなど）好ましくはブロックエースを用いてマ
スキングを行ない、抗ＡＦ抗体感作ラテックスを調製す
ることができる。

【００５６】測定は一定量の尿検体を緩衝液（ｐＨ７．
０〜９．０）にて希釈し、試料とすることができる。次
にラテックス凝集板上に一定量の試料と一定量の抗ＡＦ
抗体感作ラテックス粒子懸濁液を加え、攪拌後、混合液
を円運動させながら数分間揺動し、凝集塊の有無により
判定を行なう。

【００５７】

【実施例】

実施例１ 〔ｃＡＦの調製法〕ＢｒＣＮ処理によるｃＡＦの調製は
ＭｃＭｅｎａｍｙらの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２４６，４７４４−４７５０，１９７１）に準じ
て行なった。すなわち、ヒトアルブミン（フラクション
Ｖ，シグマ社製）１ｇを蒸留水４mlに溶解した後、蟻酸
１６ml，ＢｒＣＮ １ｇを加え、４℃、２４時間反応さ
せた。次にあらかじめ１％プロピオン酸で平衡化したセ
ファデックスＧ−２５（ファルマシア社製）カラムに付
し、２８０nmの吸収を示す画分を集め、凍結乾燥してｃ
ＡＦ８００mgを得た。

【００５８】〔抗ｃＡＦポリクロナール抗体の調製〕ｃ
ＡＦを１０mg／mlに調製した抗原液とＦｒｅｕｎｄのコ
ンプリートアジュバント（カルビオケム社製）を等量混
合し、オイルエマルジョンとした。これを家兎（ニュー
ジーランドホワイト、１１週齢、雌）の四肢皮下に１ml
ずつ注射し、初回免疫とした。その後１４日目、２１日
目、２８日目に追加免疫をした。最終免疫から７日目に
採血を行い、抗血清３０mlを得た。

【００５９】次にＢｒＣＮ活性化セファロース４Ｂ（フ
ァルマシア社製）にヒトアルブミン（フラクションＶ、
シグマ社製）を結合したアルブミン−セファロースカラ
ム（３０ml）を５mMホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡
化し、抗血清１０mlを同ホウ酸緩衝液１０mlに混合し、
カラムに吸着させた。その後、カラムを同ホウ酸緩衝液
にて洗浄し、未吸着画分を集めた。

【００６０】次にＢｒＣＮ活性化セファロース４Ｂ（フ
ァルマシア社製）にｃＡＦを結合したｃＡＦ−セファロ
ースカラム（５ml）を５mMホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）
で平衡化し、先の未吸着画分をカラムに吸着させた。そ
の後、同ホウ酸緩衝液にて洗浄後、０．５Ｍグリシン緩
衝液（ｐＨ３．０）にて溶出を行なった。２８０nmの吸
光値により活性画分を集め、６０％飽和硫安を加えた。
懸濁液を３，０００rpm で３０分間冷却下で遠心分離を
行ない、沈渣を集め、ＰＢＳで４℃、一晩透析を行なっ
た。その結果、精製抗ｃＡＦポリクロナール抗体０．５
mgを得た。

【００６１】〔ｕＡＦの測定〕精製抗ｃＡＦポリクロナ
ール抗体をＰＢＳにて１０μg ／mlに希釈し、９６穴Ｅ
ＩＡプレート（コースター社製）に各ウエル２００μl
ずつ添加し、４℃で一晩反応させた。次に過剰の抗体液
を除去した後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳを各ウエル２５
０μl 添加し、３７℃、１時間マスキングを行なった。
その後マスキング液を除去し、０．１％ＢＳＡを含むＰ
ＢＳを各ウエル２００μl 添加し、抗ｃＡＦポリクロナ
ール抗体固相化ＥＩＡプレートとした。

【００６２】次に抗ｃＡＦポリクロナール抗体固相化Ｅ
ＩＡプレートの保存液を除去した後、尿検体２００μl
を添加し、１分間攪拌した後、３７℃、１時間反応させ
た。反応後の液を除去した後、０．１％ＢＳＡを含むＰ
ＢＳを各ウエル２５０μl ずつ添加して洗浄を行なっ
た。洗浄を３回繰り返した後、ペルオキシダーゼ標識抗
ｃＡＦ抗体（１：２００）を各ウエル２００μl 添加
し、１分間攪拌した後、３７℃、１時間反応を行なっ
た。反応後、上記と同様に洗浄を行なった後基質液
（０．１Ｍ ｏ−フェニレンジアミンと０．０１２％過
酸化水素水）を各ウエル２００μl 添加し、室温で１５
分間反応させた。反応後、４Ｎ硫酸を各ウエル５０μl
添加し、酵素反応を停止した。次にマイクロプレート用
比色計で４９２nmの吸光値を測定し、判定を行なった。
吸光値０．３以上を示す検体を陽性とした。

【００６３】健常者５名、ＩｇＡ腎症３名、糖尿病性腎
症３名、糖尿病患者９名について測定を行なったとこ
ろ、表１に示すように健常者では全例陰性を示したのに
対し、ＩｇＡ腎症および糖尿病性腎症では全例陽性であ
った。また糖尿病では９例中５例が陽性であった。

【００６４】

【００６５】実施例２ 〔ｅＡＦの調製法〕ＢｒＣＮ活性化セファロース４Ｂ
（ファルマシア社製）にトリプシン（和光純薬社製）を
結合したトリプシン−セファロース４Ｂ（１０ml；１０
mgトリプシン／ml樹脂）を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
８．０）に懸濁させ、ヒトアルブミン（フラクション
Ｖ、シグマ社製）１００mgを加え、室温で２時間攪拌し
た。その後、冷却下で遠心分離（３，０００rpm 、１０
分間）を行ない、樹脂を除去後、濾液を凍結乾燥して分
解物を５０mg得た。

【００６６】〔抗ｅＡＦモノクロナール抗体の作製〕ｅ
ＡＦを滅菌蒸留水に溶解し、蛋白濃度１０mg／mlとした
抗原液とＦｒｅｕｎｄのコンプリートアジュバントを等
量混合し、オイルエマルジョンとした。これをＢＡＬＢ
／ｃマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡｊｃｌ，７週齢、雌）背部
皮下に０．２mlずつ投与した。

【００６７】初回免疫後７日目と１６日目に追加免疫を
行い、さらに細胞融合３日前に抗原液を０．２５mg／
０．２mlずつ腹腔内投与した。最終免疫から３日目のマ
ウス脾細胞とミエローマ細胞（Ｐ３ｘ６３−Ａｇ８−
６，５，３）を１０：１の割合で５０％ポリエチレング
リコール４０００を用いて融合し、ＨＡＴ培地により選
択した。細胞融合後、１４日目に培養上清中のヒトアル
ブミンとｅＡＦに対する抗体活性をＥＩＡ法により測定
した。すなわちヒトアルブミン及びｅＡＦを各々１００
μg ／mlの蛋白濃度で固相化した９６穴ＥＩＡプレート
（コースター社製）を用い、融合細胞の培養液を２００
μl 添加した。３７℃、１時間反応後、洗浄を行ない、
ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ｃａｐｐｅｌ社
製、１：５００）２００μl を添加した。洗浄後、基質
液（０．１Ｍ ｏ−フェニレンジアミンと０．０１２％
過酸化水素水）を各ウエル２００μl 添加し、室温で１
５分間反応させた。反応後、４Ｎ硫酸を各ウエル５０μ
l 添加し、酵素反応を停止した。次に４９２nmにおける
吸光値を測定し、ｅＡＦにのみ陽性のクローンを限界希
釈法により、２回クローニングを行なった。その結果、
クローニング後腹水として得られたモノクロナール抗体
は２クローンであった。２クローンのイムノグロブリン
サブクラスはともにＩｇＧ₁ であり、Ｌ鎖はカッパー型
であった。得られた各々の腹水１mlに対して、ＰＢＳ１
mlで２倍に希釈し、飽和硫酸アンモニウム２mlを滴下
し、４℃で４時間放置後、３，０００rpm 、２０分間遠
心分離し、沈渣をＰＢＳ２mlに浮遊し、透析後、０．２
２μm のフィルターで濾過し、精製モノクロナール抗体
を得た。

【００６８】＜金コロイド着色法＞抗ｅＡＦ抗体固相化シート 固相化シートとして、ニトロセルロースＢＡ−Ｓ−８５
（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ社製、
０．４５μm ）を使用した。第１の領域として抗ｅＡＦ
モノクロナール抗体をＰＢＳにて０．５mg／mlになるよ
うに調製したものをニトロセルロースシートに垂直方向
に印字した。第２の領域として同一シート上にウサギ抗
マウスＩｇＧ（Ｃａｐｐｅｌ社製）をＰＢＳで０．５mg
／mlに調製したものを水平方向に印字し、室温にて一晩
反応させ、固相化した。これにＰＢＳで３％濃度に調製
したスキムミルク（ＤＩＦＣＯ社製）を３７℃にて３時
間含浸させ、マスキングを行ない、乾燥させたものを抗
ｅＡＦ固相化シートとした。

【００６９】金コロイド粒子の調製 蒸留水３９５mlに１％塩化金酸（和光純薬社製）水溶液
５mlを混合し、６０℃に加熱した（溶液Ａ）。次に１％
クエン酸ナトリウム２０ml、１％タンニン酸（シグマ社
製）２５ml蒸留水７７．５mlを混合し、６０℃に加熱し
た（溶液Ｂ）。溶液Ａを攪拌しながら溶液Ｂを速やかに
混合し、溶液の色が薄い黄色から紫ないし赤色に変わる
まで攪拌した後、沸騰するまで加熱することにより目的
とする金コロイド粒子を得た。

【００７０】抗ｅＡＦモノクロナール抗体感作金コロイ
ド粒子の調製 金コロイド粒子懸濁液１００mlを攪拌しながら、０．１
Ｍ炭酸カリウムでｐＨ７０に調整した。次に精製抗ｅＡ
Ｆモノクロナール抗体５００μg を加え、１０分間攪拌
した後、５％ＢＳＡ２５mlを加え、０．４５μm のメン
ブランフィルターで濾過し、２〜８℃で貯蔵した。

【００７１】金コロイド着色法による測定 抗ｅＡＦモノクロナール抗体固相化シート（１cm×１c
m）を試験管に入れ、尿検体０．５mlを加え、室温で５
分間反応させた。次にアスピレーターで尿検体液を除去
し、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ１mlで洗浄
を行った。３回繰り返し洗浄した後、抗ｅＡＦモノクロ
ナール抗体感作金コロイド粒子溶液（Ａ５４０nm＝５．
０）０．５mlを加え、室温で５分間反応させた。

【００７２】アスピレーターで過剰の抗ｅＡＦモノクロ
ナール抗体感作金コロイド粒子溶液を除去し、０．１％
ＮａＮ₃ を含む１０mM ＨＥＰＥＳ緩衝液で洗浄後、肉
眼判定を行なった。

【００７３】尿検体として健常者５名、ＩｇＡ腎症３
名、糖尿病患者９名について測定を行なったところ、表
２に示すように健常者では全例、第二の領域にのみ印字
され、陰性を示したのに対し、ＩｇＡ腎症および糖尿病
性腎症では全例、第一および第二の領域に印字され陽性
であった。また糖尿病では９例中４例が陽性であった。

【００７４】

【００７５】実施例３ 〔ｕＡＦの調製法〕糖尿病性腎症の患者尿１ＬをｐＨ
８．０に調整し、実施例２で得られた抗ｅＡＦモノクロ
ナール抗体をＢｒＣＮ活性化セファロース４Ｂ（ファル
マシア社製）に結合させた抗ｅＡＦモノクロナール抗体
結合セファロース４Ｂカラム（１０ml：５mgモノクロナ
ール抗体／ml樹脂）に吸着させた。５mMホウ酸緩衝液で
洗浄後、０．５Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ３．０）にて溶
出を行なった。２８０nmの吸光値により活性画分を集め
た。ＰＢＳにて透析後、得られたｕＡＦは６mgであっ
た。

【００７６】〔抗ｕＡＦポリクロナール抗体の調製〕ｕ
ＡＦ１mg／mlとした抗原液１mlとＦｒｅｕｎｄのコンプ
リートアジュバントを等量混合し、オイルエマルジョン
とした。これを家兎（ニュージーランドホワイト、１１
週齢、雌）の四肢皮下に初回免疫した。その後、１４日
目、２１日目、２８日目に追加免疫を行ない、最終免疫
から７日目に採血を行い抗血清３０mlを得た。

【００７７】次にＢｒＣＮ活性化セファロース４Ｂ（フ
ァルマシア社製）にヒトアルブミン（フラクションＶ，
シグマ社製）を結合したアルブミン−セファロースカラ
ム（３０ml）を５mMホウ酸緩衝液で平衡化し、抗血清１
０mlを同ホウ酸緩衝液１０mlに混合しカラムに吸着させ
た。その後、同ホウ酸緩衝液にて洗浄し、未吸着画分を
集めた。

【００７８】次にＢｒＣＮ活性化セファロース４Ｂ（フ
ァルマシア社製）にｃＡＦをリガンドしてｃＡＦ−セフ
ァロース４Ｂカラム（５ml）を調製し、５mMホウ酸緩衝
液（ｐＨ８．０）で平衡化を行い、未吸着画分をカラム
に吸着させた。その後、同ホウ酸緩衝液にて洗浄後、
０．５Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ３．０）にて溶出を行な
った。２８０nmの吸光値により活性画分を集め、６０％
飽和硫安を加えた。懸濁液を３，０００rpm で３０分間
遠心分離を行ない沈渣を集め、ＰＢＳで４℃、一晩透析
を行なった。その結果、精製抗ｕＡＦポリクロナール抗
体１．５mgを得た。

【００７９】〔ラテックス法によるｕＡＦの測定〕抗ｕＡＦポリクロナール抗体感作ラテックス粒子の調製 抗ｕＡＦポリクロナール抗体０．５mgを０．２Ｍアンモ
ニウム緩衝液（ｐＨ８．０）０．５mlに加え溶解した。
１０％ラテックス粒子（０．４μm 、積水化学工業社
製）０．５mlを加え、室温で１時間攪拌した。その後、
冷却下で遠心分離（１０，０００rpm ，３０分間）し、
沈渣の抗ヒトアルブミン分解物抗体結合ラテックス粒子
をブロックエース（大日本製薬社製）に懸濁させ、抗ｕ
ＡＦポリクロナール抗体感作ラテックス粒子が０．２％
になるように調製した。

【００８０】測定 尿検体０．１mlに０．２Ｍアンモニウム緩衝液（ｐＨ
８．０）０．４mlに加え、希釈尿検体液とした。ラテッ
ク凝集板上に希釈尿検体液０．０５mlと０．２％抗ｕＡ
Ｆポリクロナール抗体感作ラテックス懸濁液０．０５ml
を加え、攪拌後、混合液を円運動させながら、３分間揺
動し、凝集塊の有無により、判定を行なった。

【００８１】健常者５名、ＩｇＡ腎症３名、糖尿病性腎
症３名、糖尿病患者９名について測定を行なったとこ
ろ、ＩｇＡ腎症３名、糖尿病性腎症３名および糖尿病４
名について凝集塊が観察され、陽性と判定された。一方
健常者５名、糖尿病５名については凝集塊が観察され
ず、陰性と判定された。（表３）

【００８２】

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒト尿中のアルブミン分解物を検出する
   ことによる腎疾患の診断方法。
2. 【請求項２】 抗ヒトアルブミン分解物抗体を用いるヒ
   ト尿中のアルブミン分解物の検出方法。
3. 【請求項３】 ヒト尿中のアルブミン分解物と特異的に
   反応する下記方法により調製される抗体を利用する検出
   方法。 糖尿病、糖尿病性腎症および各腎疾患に罹病した患
   者の尿より分離精製したアルブミン分解物に対するポリ
   クロナール抗体およびモノクロナール抗体。 ヒトアルブミン（６９ＫＤ）をプロテアーゼ類で部
   分加水分解して得られるアルブミン分解物に対するポリ
   クロナール抗体およびモノクロナール抗体。 ヒトアルブミン（６９ＫＤ）を化学的に切断して得
   られる分解物に対するポリクロナール抗体およびモノク
   ロナール抗体。
4. 【請求項４】 請求項３で得られた抗体を利用する検出
   方法が酵素免疫測定法、放射線免疫測定法、ラテックス
   凝集法、逆受身赤血球凝集反応、金コロイド粒子法であ
   る請求項２記載の検出方法。