JPH0676340B2 - イミユノソ−ムおよびその製造方法 - Google Patents
イミユノソ−ムおよびその製造方法Info
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- JPH0676340B2 JPH0676340B2 JP56139627A JP13962781A JPH0676340B2 JP H0676340 B2 JPH0676340 B2 JP H0676340B2 JP 56139627 A JP56139627 A JP 56139627A JP 13962781 A JP13962781 A JP 13962781A JP H0676340 B2 JPH0676340 B2 JP H0676340B2
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明はリポソームの名で知られる人工膜に再結合した
ウイルス抗原のみからなる新製品に関するものである。
この新製品は今後イミュノソームと呼ばれる。本明細書
および付属のクレーム中で用いられる限り、“イミュノ
ソーム”という語は常に上に定義した内容をもつものと
理解される。
ウイルス抗原のみからなる新製品に関するものである。
この新製品は今後イミュノソームと呼ばれる。本明細書
および付属のクレーム中で用いられる限り、“イミュノ
ソーム”という語は常に上に定義した内容をもつものと
理解される。
現在用いられているインフルエンザ・ウイルスのワクチ
ンはしばしば局部的または全身的な発熱をひき起して困
ることがある。それゆえにこのような副反応の原因とな
る物質を含まないワクチンが求められている。
ンはしばしば局部的または全身的な発熱をひき起して困
ることがある。それゆえにこのような副反応の原因とな
る物質を含まないワクチンが求められている。
この考えに沿って、ジェー・ディー・アメイダその他の
人は一つの新製品を作り出し、それを“バイロソーム”
と命名した。その結果は“インフルエンザのサブユニト
ットとリポゾームからのバイロソームの生成”と題する
論文として、1975年11月８日号“ランセット”のpp.899
-901に掲載されている。
人は一つの新製品を作り出し、それを“バイロソーム”
と命名した。その結果は“インフルエンザのサブユニト
ットとリポゾームからのバイロソームの生成”と題する
論文として、1975年11月８日号“ランセット”のpp.899
-901に掲載されている。
“バイロソーム”と名付けられた製品をアメイダは次の
ようにして調製した。レシチンとリン酸ジセチルの（9:
1）混合物をクロロホルム中に溶解して、クロロホルム
を窒素気流中で蒸発させて多重層脂質膜とし、これにPB
S緩衝液（phosphate buffer saline）を加え、この混合
物に50kHzの超音波を１時間30分当てて閉鎖小胞をつく
り出す。ウイルスのサブユニットすなわち赤血球凝集
素、とノイラミニダーゼをリポソームの懸濁液に加え、
その混合物を超音波で15分間処理してサブユニットが集
って膜を形成するのを助ける。
ようにして調製した。レシチンとリン酸ジセチルの（9:
1）混合物をクロロホルム中に溶解して、クロロホルム
を窒素気流中で蒸発させて多重層脂質膜とし、これにPB
S緩衝液（phosphate buffer saline）を加え、この混合
物に50kHzの超音波を１時間30分当てて閉鎖小胞をつく
り出す。ウイルスのサブユニットすなわち赤血球凝集
素、とノイラミニダーゼをリポソームの懸濁液に加え、
その混合物を超音波で15分間処理してサブユニットが集
って膜を形成するのを助ける。
得られた結果は次の通りである：いくつかのリポソーム
の表面に低密度のウイルスサブユニットがある。ウイル
スサブユニットはリン脂質性物質の二枚の膜の中に固着
しているようである。これらの物質の赤血球凝集活性や
免疫原性を証明するテストは行わなかった。
の表面に低密度のウイルスサブユニットがある。ウイル
スサブユニットはリン脂質性物質の二枚の膜の中に固着
しているようである。これらの物質の赤血球凝集活性や
免疫原性を証明するテストは行わなかった。
ウイルスのサブユニットがリポソームの外側と内側の両
方に固着していることは無理なく考えられ、特にいわゆ
るバイロソームが特殊な様式で生産されることからその
ように考えられる。
方に固着していることは無理なく考えられ、特にいわゆ
るバイロソームが特殊な様式で生産されることからその
ように考えられる。
後に他の探求者が種々のウイルスをリポソームに包んだ
タン白質膜を再構成しようと試みている。次の人達が最
も重要な人である。
タン白質膜を再構成しようと試みている。次の人達が最
も重要な人である。
ジェ・ピ・デビス，ディ・ジェ・ブヒア； “精製したインフルエンザ・ウイルスのノイラミニダー
ゼとリポソームとの結合",米国微生物学会年会抄録、19
80年,T114 エ・ヘレニウス，イ・フライス，ジェ・カルテンベッ
ク； “セムリキ森林ウイルス膜",細胞生物学誌,p866-880（1
977） エム・シ・スー（許），エ・シャイト，ピ・エス・ホピ
ン； “個体パラミクソウイルスの糖タン白をもつ膜とリン脂
質のコール酸塩溶液での再結合",ウイルス学誌,95巻,pp
・476-491（1979） アル・ティ・シ・ファン，ケ・ヴァン，エチ・ディ・ク
レンク，アル・ロト； “インフルエンザ・ウイルスのエンヴェロプ糖タン白と
リポソームとの会合",ウイルス・エンヴェロプ群のモデ
ル的研究",ウイルス学誌,97巻,pp.212-217（1979） ディ・ケ・ミラー，ビ・アイ・フィバー，アル・バンデ
ロフ，ジェ・レナード； “小胞口内炎ウイルスからの再結合されたG.タン白−脂
質小胞とその小胞口内炎ウイルス感染の抑止",細胞生物
学誌,84巻,pp.421-429（1980） ダブリュ・エ・ペトリ，アル・アル・ワグナー； “洗剤透析による小胞口内炎ウイルスの糖タン白のリポ
ソームへの再結合",生物化学誌,254巻、pp.4313-4316
（1979） われわれのやり方はアメイダのやり方と全く異ることに
注目してほしい。どの人の使った方法も基本的にはリン
脂質とタン白を洗剤（detergent）中に溶解し、２成分
を混合し、洗剤を透析で除くところにある。この操作は
タン白の存在下にリポソームを生成させることになるの
で、必然的にリポソーム中にタン白の大部分を閉込める
ことになる。このことは免疫原性物質を少なからず失う
ということである。
ゼとリポソームとの結合",米国微生物学会年会抄録、19
80年,T114 エ・ヘレニウス，イ・フライス，ジェ・カルテンベッ
ク； “セムリキ森林ウイルス膜",細胞生物学誌,p866-880（1
977） エム・シ・スー（許），エ・シャイト，ピ・エス・ホピ
ン； “個体パラミクソウイルスの糖タン白をもつ膜とリン脂
質のコール酸塩溶液での再結合",ウイルス学誌,95巻,pp
・476-491（1979） アル・ティ・シ・ファン，ケ・ヴァン，エチ・ディ・ク
レンク，アル・ロト； “インフルエンザ・ウイルスのエンヴェロプ糖タン白と
リポソームとの会合",ウイルス・エンヴェロプ群のモデ
ル的研究",ウイルス学誌,97巻,pp.212-217（1979） ディ・ケ・ミラー，ビ・アイ・フィバー，アル・バンデ
ロフ，ジェ・レナード； “小胞口内炎ウイルスからの再結合されたG.タン白−脂
質小胞とその小胞口内炎ウイルス感染の抑止",細胞生物
学誌,84巻,pp.421-429（1980） ダブリュ・エ・ペトリ，アル・アル・ワグナー； “洗剤透析による小胞口内炎ウイルスの糖タン白のリポ
ソームへの再結合",生物化学誌,254巻、pp.4313-4316
（1979） われわれのやり方はアメイダのやり方と全く異ることに
注目してほしい。どの人の使った方法も基本的にはリン
脂質とタン白を洗剤（detergent）中に溶解し、２成分
を混合し、洗剤を透析で除くところにある。この操作は
タン白の存在下にリポソームを生成させることになるの
で、必然的にリポソーム中にタン白の大部分を閉込める
ことになる。このことは免疫原性物質を少なからず失う
ということである。
本発明の目的の一つは、高度に免疫原性であり、かつ予
め生成されているリポソーム膜上に付着した抗原のみか
らなる“イミュノソーム”と呼ばれる製品を合成するこ
とである。
め生成されているリポソーム膜上に付着した抗原のみか
らなる“イミュノソーム”と呼ばれる製品を合成するこ
とである。
本発明の他の一つの目的は、アメイダの方法や他の技法
と全く異なる方法を提供することである。
と全く異なる方法を提供することである。
本発明の他の一つの目的は、アメイダの方法、すなわち
リン脂質を有機溶媒中に溶解し、その溶媒を蒸発させて
多重層構造を形成し、超音波を用いてタン白の性質の破
壊に貢献させることを特徴とする方法、を離れてイミュ
ノソームを製り出す方法を提供することである。
リン脂質を有機溶媒中に溶解し、その溶媒を蒸発させて
多重層構造を形成し、超音波を用いてタン白の性質の破
壊に貢献させることを特徴とする方法、を離れてイミュ
ノソームを製り出す方法を提供することである。
本発明の他の一つの目的は、ウイルスのサブユニットが
生化学的手段により膜中に介入させられる方法を提供す
ることである。
生化学的手段により膜中に介入させられる方法を提供す
ることである。
本発明のさらに他の一つの目的は、予め調製されたリポ
ソームを用い、そのリポソームの表面に生化学的手段に
よって糖タン白を挿入する方法を提供することである。
ソームを用い、そのリポソームの表面に生化学的手段に
よって糖タン白を挿入する方法を提供することである。
サブユニットHA（hema-glutinine,赤血球凝集素）が予
め調製されたリポソームと共存するときには、赤血球凝
集素とノイラミニダーゼは免疫を生ずるが、リン脂質の
二重層への介入は極めて低い収率でしか起らないという
ことはよく知られている。
め調製されたリポソームと共存するときには、赤血球凝
集素とノイラミニダーゼは免疫を生ずるが、リン脂質の
二重層への介入は極めて低い収率でしか起らないという
ことはよく知られている。
この難点は、上述の定義のイミュノソームを調製する方
法に次にあげるａ）からｄ）の条件を付与することで克
服することができる。
法に次にあげるａ）からｄ）の条件を付与することで克
服することができる。
ａ）ある量のリポソームを予め調製すること； ｂ）抗原・ウイルスのサブユニットと洗剤の複合体を提
供すること； ｃ）予め調製されたリポソームを処理して、その上に抗
原サブユニットを固着せしめ、リポソームの外表面上に
突起を形成させること；そしてさらに ｄ）上述の抗原・ウイルスサブユニットと洗剤の複合体
とｃ）で得られたリポソームとを結合して既述のイミュ
ノソームを作り出すこと。
供すること； ｃ）予め調製されたリポソームを処理して、その上に抗
原サブユニットを固着せしめ、リポソームの外表面上に
突起を形成させること；そしてさらに ｄ）上述の抗原・ウイルスサブユニットと洗剤の複合体
とｃ）で得られたリポソームとを結合して既述のイミュ
ノソームを作り出すこと。
本発明の望ましい態様に従って、洗剤の存在下でリン脂
質を溶解し、次いで得られた溶液を緩衝液中に注入し、
透析することによりリポソームを調製する。
質を溶解し、次いで得られた溶液を緩衝液中に注入し、
透析することによりリポソームを調製する。
本発明のもう一つの望ましい態様に従って一つのウイル
スを洗剤に混ぜてその膜を溶解し、それによってHA、ノ
イラミニダーゼ、核タン白から生成した核およびＭタン
白の混合物をつくり、その混合物を遠心分離して核タン
白とＭタン白を分離しHAとノイラミニダーゼを得、HAと
ノイラミニダーゼを緩衝水溶液中で透析し、洗剤を加え
てタン白と洗剤の複合体を得る。
スを洗剤に混ぜてその膜を溶解し、それによってHA、ノ
イラミニダーゼ、核タン白から生成した核およびＭタン
白の混合物をつくり、その混合物を遠心分離して核タン
白とＭタン白を分離しHAとノイラミニダーゼを得、HAと
ノイラミニダーゼを緩衝水溶液中で透析し、洗剤を加え
てタン白と洗剤の複合体を得る。
本発明のさらに一つの望ましい態様に従って、リポソー
ムを予め処理して上記のサブユニットを固着させやすく
したものにウイルスサブユニットと洗剤の複合体を加
え、洗剤濃度を直線的に減少する勾配をもたせて透析し
てイミュノソームをつくる。必要ならば、勾配がゼロに
なったときに懸濁液をPBS緩衝液中で透析する。
ムを予め処理して上記のサブユニットを固着させやすく
したものにウイルスサブユニットと洗剤の複合体を加
え、洗剤濃度を直線的に減少する勾配をもたせて透析し
てイミュノソームをつくる。必要ならば、勾配がゼロに
なったときに懸濁液をPBS緩衝液中で透析する。
上記のサブユニットを固着しやすくするためのリポソー
ムの予備処理としては、リポソームの流動化処理が行わ
れる。この流動化処理は微量の洗剤OGP（オクチルグル
コシド）をリポソームのリン脂質二重層中に導入してOG
Pの最終濃度を1mMとすることにより行われる。このよう
にリポソーム膜に洗剤分子が導入されるとリポソームが
流動化し、従ってウイルスサブユニットを固着できるよ
うになる。OGPの濃度を減少する勾配をもたせて透析さ
せながら洗剤を徐々に除去するとリポソーム膜中に導入
されたOGPの分子が洗剤分子にすでに結合されていた血
球凝集素またはノイラミニダーゼの分子と交換されるた
めである。洗剤OGPの導入によって、OGPが脂質に対して
溶剤として作用し、またリポソームがリン脂質からつく
られているためにリポソームの流動化がもたらされるわ
けである。
ムの予備処理としては、リポソームの流動化処理が行わ
れる。この流動化処理は微量の洗剤OGP（オクチルグル
コシド）をリポソームのリン脂質二重層中に導入してOG
Pの最終濃度を1mMとすることにより行われる。このよう
にリポソーム膜に洗剤分子が導入されるとリポソームが
流動化し、従ってウイルスサブユニットを固着できるよ
うになる。OGPの濃度を減少する勾配をもたせて透析さ
せながら洗剤を徐々に除去するとリポソーム膜中に導入
されたOGPの分子が洗剤分子にすでに結合されていた血
球凝集素またはノイラミニダーゼの分子と交換されるた
めである。洗剤OGPの導入によって、OGPが脂質に対して
溶剤として作用し、またリポソームがリン脂質からつく
られているためにリポソームの流動化がもたらされるわ
けである。
得られたイミュノソームはリン脂質物質からなる膜とウ
イルスサブユニットを含んでおり、後者は膜の外側表面
上に突起の形になって分布している。このイミュノソー
ムは生体に注射しても事実上副作用を起すことはないも
のである。
イルスサブユニットを含んでおり、後者は膜の外側表面
上に突起の形になって分布している。このイミュノソー
ムは生体に注射しても事実上副作用を起すことはないも
のである。
予め生成されたリポソームをタン白・洗剤複合体溶液に
触れさせると、リポソームの膜は流動性を増すと言って
もよいようになり、ちょうど少量の洗剤を加えたように
なることがよく分るであろう。
触れさせると、リポソームの膜は流動性を増すと言って
もよいようになり、ちょうど少量の洗剤を加えたように
なることがよく分るであろう。
洗剤濃度が直線的に減少する勾配をもつ条件下で透析を
行なうと、リポソームのリン脂質層中のタン白・洗剤複
合体のタン白が交換できるようになる。これから結論さ
れることは、極めて高い赤血球凝集能をもち、かつ免疫
原性であることが示されたウイルス粒子とほぼ同一の構
造を人工的につくり出すことができるということであ
る。
行なうと、リポソームのリン脂質層中のタン白・洗剤複
合体のタン白が交換できるようになる。これから結論さ
れることは、極めて高い赤血球凝集能をもち、かつ免疫
原性であることが示されたウイルス粒子とほぼ同一の構
造を人工的につくり出すことができるということであ
る。
本発明を以下の実施例について説明する。
実施例 リポソームの生成 リン脂質：ホスファチジルコリン、コレステロール、リ
ゾレシチンを8:1:0.5の割合で、β−ｄ−オクチルグル
コシドを30mMの濃度で含むpH7.4の10mMトリス−塩酸緩
衝液中に溶解する。
ゾレシチンを8:1:0.5の割合で、β−ｄ−オクチルグル
コシドを30mMの濃度で含むpH7.4の10mMトリス−塩酸緩
衝液中に溶解する。
リン脂質溶液をPBS緩衝液（リン酸塩溶液）に注入し、
得られるリポソームの溶液をセファデックスG-100 の
小カラムに入れて沈殿させる。
得られるリポソームの溶液をセファデックスG-100 の
小カラムに入れて沈殿させる。
カラムを600g（g:重力加速度）の加速度で15秒間遠心分
離にかける。
離にかける。
精製リポソームの懸濁液をPBS緩衝液中で徹底的に透析
する。
する。
タン白・洗剤複合体の生成 HAとノイラミニダーゼをPBS溶液に溶解し、タン白の濃
度は700μg/mlに調整される。タン白溶液に洗剤として
β−ｄ−オクチルグルコシドを加えてその濃度を7.5mM
までにする。この混合物溶液を22℃で10分間放置する。
度は700μg/mlに調整される。タン白溶液に洗剤として
β−ｄ−オクチルグルコシドを加えてその濃度を7.5mM
までにする。この混合物溶液を22℃で10分間放置する。
イミュノソームの生成 リポソームの懸濁液にβ−ｄ−オクチルグルコシド（pH
7.4のトリス緩衝液に10mMの濃度に溶解したもの）を加
えてその濃度を最終的に1mMになるようにする。混合物
は22℃で10分間放置する。
7.4のトリス緩衝液に10mMの濃度に溶解したもの）を加
えてその濃度を最終的に1mMになるようにする。混合物
は22℃で10分間放置する。
このようにしてリポソームの懸濁液をもつと流動的に、
別の言い方をするとウイルスサブユニットを固着しやす
くするための、それにタン白・洗剤複合体を加え、洗剤
の濃度が直線的に減少する状態で透析することによっ
て、リポソームのリン脂質二重層中で糖タン白の重合を
行なわせてイミュノソームを得る。
別の言い方をするとウイルスサブユニットを固着しやす
くするための、それにタン白・洗剤複合体を加え、洗剤
の濃度が直線的に減少する状態で透析することによっ
て、リポソームのリン脂質二重層中で糖タン白の重合を
行なわせてイミュノソームを得る。
濃度の勾配がゼロになったとき、イミュノソームの懸濁
液をPBS緩衝液中で透析する。
液をPBS緩衝液中で透析する。
本操作は A/イギリス/864/75（H3N2）×−49株と A/バンコック/1/79（H3N2）×73株の２種のインフルエ
ンザウイルスに対して行われた。
ンザウイルスに対して行われた。
サブユニットの活性とイミュノソームの活性を調べるテ
ストを行った。次に掲げる表と第１図を参照されたい。
表は本発明における精製ウイルスサブユニット自体とイ
ミュノソームにおける同じサブユニットとの赤血球凝集
活性の比較を示す。第2,3及び４欄の数字は実験値（15
個の平均）であり、第５欄は蛋白1mg当りの活性、即ち
比活性（UHA）を示す。これから知られる通り、1mgの精
製蛋白は215500の赤血球凝集単位を示すに止るが、イミ
ュノソームにおける同じ蛋白は175762000と極めて大き
い赤血球凝集単位を与える。即ち本発明によるイミュノ
ソームはウイルスサブユニットよりはるかに活性が高
く、全ウイルスとほぼ同程度の活性を示すことが見られ
るだろう。
ストを行った。次に掲げる表と第１図を参照されたい。
表は本発明における精製ウイルスサブユニット自体とイ
ミュノソームにおける同じサブユニットとの赤血球凝集
活性の比較を示す。第2,3及び４欄の数字は実験値（15
個の平均）であり、第５欄は蛋白1mg当りの活性、即ち
比活性（UHA）を示す。これから知られる通り、1mgの精
製蛋白は215500の赤血球凝集単位を示すに止るが、イミ
ュノソームにおける同じ蛋白は175762000と極めて大き
い赤血球凝集単位を与える。即ち本発明によるイミュノ
ソームはウイルスサブユニットよりはるかに活性が高
く、全ウイルスとほぼ同程度の活性を示すことが見られ
るだろう。
第2,3図を参照するとイミュノソームは第２図に示され
るように粒子群として得られることがまず分るだろう。
第３図から明かなように、サブユニットは膜の外表面上
のみに、しかも密に存在すること、そして膜の内部には
注射にあたって二次疾患を与える核酸やその他の物質は
存在しないことが分る。
るように粒子群として得られることがまず分るだろう。
第３図から明かなように、サブユニットは膜の外表面上
のみに、しかも密に存在すること、そして膜の内部には
注射にあたって二次疾患を与える核酸やその他の物質は
存在しないことが分る。
第１図は本発明に従う方法によって製造されたイミュノ
ソームの免疫原性をウイルスとウイルスサブユニットに
比較して示す図である。 第２図は生物の形態を示す写真で本発明に従う方法によ
って製造された１群のイミュノソームを示し、 第３図は生物の形態を示す写真で本発明によるイミュノ
ソームを拡大して表わしたものであって、ウイルスサブ
ユニットが膜の外側表面に固着しているのが示されてい
る。
ソームの免疫原性をウイルスとウイルスサブユニットに
比較して示す図である。 第２図は生物の形態を示す写真で本発明に従う方法によ
って製造された１群のイミュノソームを示し、 第３図は生物の形態を示す写真で本発明によるイミュノ
ソームを拡大して表わしたものであって、ウイルスサブ
ユニットが膜の外側表面に固着しているのが示されてい
る。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭52−44228（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−66520（ＪＰ，Ａ)
Claims (8)
- 【請求項１】リン脂質物質からできた膜とウイルスサブ
ユニットからなるイミュノソームにおいて、該ウイルス
サブユニットは本質的に膜の外部表面上に突起物として
分布したHAとノイラミニダーゼから成り、該イミュノソ
ームは生体に注射しても事実上なんらの副作用を生じな
いことを特徴とするイミュノソーム。 - 【請求項２】ａ）ある量のリポソームを予め準備し ｂ）ウイルスと洗剤とを混合してウイルス膜を溶解し、
HAとノイラミニダーゼ、核タン白及びＭタン白の混合物
を得 ｃ）同混合物から核タン白とＭタン白を分離してHAとノ
イラミラーゼを得 ｄ）これを洗剤の存在下で緩衝水溶液中で透析すること
により、本質的にHAとノイラミニダーゼから成るウイル
スサブユニットと洗剤の複合体を得 ｅ）ａ）で準備されたリポソームを洗剤で処理して ｄ）ウイルスサブユニットと洗剤との複合体とｅ）で処
理したリポソームとを結合して、HAとノイラミラーゼを
洗剤の濃厚の減少勾配下で透析を行ってリポソームの表
面にHAとノイラミニダーゼを突起状に分布せしめること
から成るイミュノソーム製造方法。 - 【請求項３】デタージェントの存在のもとにリン脂質を
溶解し、次いで得られた溶液を緩衝液中に注入し透析す
ることによって予めつくるリポソームを製造する特許請
求の範囲第２項に記載の方法。 - 【請求項４】β−ｄ−オクチルグルコシドを約30mMの濃
度で含むトリス−塩酸緩衝液中に、ホスファチジルコリ
ン、コレステロール、リゾレシチンをモル比で8:1:0.5
の割合で混ぜた混合物からなるリン脂質を溶解し、得ら
れた溶液をPBS緩衝液に注入してリポソームの懸濁液と
し、このリポソームの懸濁液を透析して上述の予めつく
るリポソームを製造する特許請求の範囲第３項に記載の
方法。 - 【請求項５】特許請求の範囲第４項において、上述のリ
ポソームをクロマトグラフィーにかけて事実上均質でか
つ30ないし90nmの間の大きさをもつリポソームを得る特
許請求の範囲第４項に記載の方法。 - 【請求項６】上述の洗剤を溶液の状態でトリス緩衝液に
加えてその最終濃度を7.5mMとし、その混合物を22℃で
約10分間放置し、これによってリポソーム膜に固着しや
すいタン白・洗剤複合体を製造する特許請求の範囲第５
項に記載の方法。 - 【請求項７】洗剤の濃厚勾配がゼロになったときに懸濁
液をPBS緩衝液中で透析する特許請求の範囲第２項に記
載の方法。 - 【請求項８】上述のウイルスサブユニットを固着させや
すくなるように処理した上述のリポソームを製造するた
めに、予めつくったリポソームの溶液にpHが約7.4のト
リス−塩酸緩衝液に溶かしたβ−ｄ−オクチルグルコシ
ドの溶液を加えて、その最終濃度を1mMとし、その混合
物を22℃で約10分間放置する特許請求の範囲第２項に記
載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| US18426480A | 1980-09-05 | 1980-09-05 | |
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| JPS57118794A JPS57118794A (en) | 1982-07-23 |
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