JPH0661267B2 - 細胞融合方法および細胞融合装置 - Google Patents
細胞融合方法および細胞融合装置Info
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- JPH0661267B2 JPH0661267B2 JP3300434A JP30043491A JPH0661267B2 JP H0661267 B2 JPH0661267 B2 JP H0661267B2 JP 3300434 A JP3300434 A JP 3300434A JP 30043491 A JP30043491 A JP 30043491A JP H0661267 B2 JPH0661267 B2 JP H0661267B2
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- cells
- cell fusion
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
- C12M35/02—Electrical or electromagnetic means, e.g. for electroporation or for cell fusion
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- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、電気パルスを利用して
２種類の細胞を融合させ、新規な異種細胞（以下、ヘテ
ロカリオンと言う）を作成する方法、および装置に関す
るものである。
２種類の細胞を融合させ、新規な異種細胞（以下、ヘテ
ロカリオンと言う）を作成する方法、および装置に関す
るものである。
【０００２】
【従来の技術】ヘテロカリオンを作成する技術につい
て、電気融合法と微小電極法とが公知である。電気融合
法は１対の平行電極間に２種類の細胞を懸濁させた細胞
懸濁液を置き、前記１対の平行電極間に交流電圧を印加
することにより細胞が１列に並んだ状態（以下、パール
チェーンと言う）を作り出し、次に直流パルスを流して
接触している細胞同志を融合させる。また微小電極法
は、微小ガラス管内に細い杆状ないし針状の電極を挿入
して、該電極の先端部を露出させるとともに先端部以外
にガラス管壁を密着させて包みこんだ形の微小電極を用
い、この微小電極に交流電圧を印加して細胞懸濁液中の
細胞を誘導電気泳動現象により誘引して該微小電極の先
端に付着させ、電気パルスを与えてヘテロカリオンを作
成する。
て、電気融合法と微小電極法とが公知である。電気融合
法は１対の平行電極間に２種類の細胞を懸濁させた細胞
懸濁液を置き、前記１対の平行電極間に交流電圧を印加
することにより細胞が１列に並んだ状態（以下、パール
チェーンと言う）を作り出し、次に直流パルスを流して
接触している細胞同志を融合させる。また微小電極法
は、微小ガラス管内に細い杆状ないし針状の電極を挿入
して、該電極の先端部を露出させるとともに先端部以外
にガラス管壁を密着させて包みこんだ形の微小電極を用
い、この微小電極に交流電圧を印加して細胞懸濁液中の
細胞を誘導電気泳動現象により誘引して該微小電極の先
端に付着させ、電気パルスを与えてヘテロカリオンを作
成する。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】前記の電気融合法で
は、任意の細胞を融合させて所望のヘテロカリオンを得
ることが困難である。すなわち、遺伝的に発生の異なる
細胞核を有する２種類の細胞Ａと細胞Ｂとを融合させて
新規な異種細胞Ａ・Ｂを特異的に作成することができな
い。その上、３つ以上の細胞が融合する可能性が有っ
て、２個の細胞に限って融合させるという制御ができな
い。
は、任意の細胞を融合させて所望のヘテロカリオンを得
ることが困難である。すなわち、遺伝的に発生の異なる
細胞核を有する２種類の細胞Ａと細胞Ｂとを融合させて
新規な異種細胞Ａ・Ｂを特異的に作成することができな
い。その上、３つ以上の細胞が融合する可能性が有っ
て、２個の細胞に限って融合させるという制御ができな
い。
【０００４】前記の微小電極法では、作成したヘテロカ
リオンを分取するという操作を必要とし、微小電極から
ヘテロカリオンを離脱させる操作に高度の熟練と多大の
精神的負荷とを必要とする。その上、熟練者であっても
融合されたヘテロカリオンを傷つけてしまう虞れ無しと
しない。
リオンを分取するという操作を必要とし、微小電極から
ヘテロカリオンを離脱させる操作に高度の熟練と多大の
精神的負荷とを必要とする。その上、熟練者であっても
融合されたヘテロカリオンを傷つけてしまう虞れ無しと
しない。
【０００５】本発明は上述の事情に鑑みて為されたもの
であって、前記の微小電極法に改良を加えて、 ａ．電極の先端に、任意の細胞を１個だけ付着させるこ
と、および、付着状態を目視確認することができ、 ｂ．上記のようにして付着させた１個の細胞に対して、
さらに任意の１個の細胞を付着させること、および、２
個の細胞の付着状態を目視確認することができ、 ｃ．付着させた１個若しくは複数個の細胞を安全，確実
に保持すること、および移送すること、並びに、保持し
ている複数個の細胞同志を融合させることができ、 ｄ．保持している細胞に対して機械的に操作力を加える
ことなく、（従って、該細胞を傷つけるおそれ無く）電
極から細胞を離脱させること、および、その状態を目視
確認することができる、 細胞融合方法、および、上記融合方法の実施に好適な細
胞融合装置を提供することを目的とする。
であって、前記の微小電極法に改良を加えて、 ａ．電極の先端に、任意の細胞を１個だけ付着させるこ
と、および、付着状態を目視確認することができ、 ｂ．上記のようにして付着させた１個の細胞に対して、
さらに任意の１個の細胞を付着させること、および、２
個の細胞の付着状態を目視確認することができ、 ｃ．付着させた１個若しくは複数個の細胞を安全，確実
に保持すること、および移送すること、並びに、保持し
ている複数個の細胞同志を融合させることができ、 ｄ．保持している細胞に対して機械的に操作力を加える
ことなく、（従って、該細胞を傷つけるおそれ無く）電
極から細胞を離脱させること、および、その状態を目視
確認することができる、 細胞融合方法、および、上記融合方法の実施に好適な細
胞融合装置を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】上記の目的を達成するた
めに創作した本発明の基本的原理について、実施例に対
応する図１を参照しつつ略述すると次のごとくである。
すなわち、針状電極１を板状電極２に対して略直角に対
向せしめる。これにより、双方の電極に電圧を印加した
とき不均一な電界（密度に疎密の差の有る電界）が形成
される。前記針状の電極１を、管状の絶縁カバー３で覆
い、両者の間に微小間隙Ｇを形成させる。前記電界密度
が局部的に大きくなる、針状電極１の先端付近におい
て、前記管状の絶縁カバーの内径を縮小して微細な孔３
ｂを形成する。上記のように構成した電極（図１）を細
胞懸濁液中に浸漬して交流電圧を印加すると、懸濁して
いる個々の細胞ａは誘導電気泳動現象によって電界密度
の大きい方に誘引され、付記矢印のごとく泳動して絶縁
カバー３の孔３ｂ付近に付着する。上記の孔３ａを、細
胞ａが通過できない大きさ，形状に構成しておくと、該
細胞ａは針状電極１に接触することなく、絶縁カバー３
の外周面に付着して保持される。前記の細胞ａは針状電
極１に対して接触しないので、該針状電極から直接的に
電荷を与えられることが無く、静電気的に孔３ｂの付近
に付着して保持される。従って、交流電圧の電圧値を変
化させると保持力が変化し、この保持力を加減すること
によって１個の細胞のみを保持したり、２個の細胞を保
持したりすることができ、また、保持している細胞を放
出することもできる。上記の操作を顕微鏡の視野内にて
行うと、細胞の挙動や操作の進行状態を目視確認しつつ
遂行することができて好都合である。
めに創作した本発明の基本的原理について、実施例に対
応する図１を参照しつつ略述すると次のごとくである。
すなわち、針状電極１を板状電極２に対して略直角に対
向せしめる。これにより、双方の電極に電圧を印加した
とき不均一な電界（密度に疎密の差の有る電界）が形成
される。前記針状の電極１を、管状の絶縁カバー３で覆
い、両者の間に微小間隙Ｇを形成させる。前記電界密度
が局部的に大きくなる、針状電極１の先端付近におい
て、前記管状の絶縁カバーの内径を縮小して微細な孔３
ｂを形成する。上記のように構成した電極（図１）を細
胞懸濁液中に浸漬して交流電圧を印加すると、懸濁して
いる個々の細胞ａは誘導電気泳動現象によって電界密度
の大きい方に誘引され、付記矢印のごとく泳動して絶縁
カバー３の孔３ｂ付近に付着する。上記の孔３ａを、細
胞ａが通過できない大きさ，形状に構成しておくと、該
細胞ａは針状電極１に接触することなく、絶縁カバー３
の外周面に付着して保持される。前記の細胞ａは針状電
極１に対して接触しないので、該針状電極から直接的に
電荷を与えられることが無く、静電気的に孔３ｂの付近
に付着して保持される。従って、交流電圧の電圧値を変
化させると保持力が変化し、この保持力を加減すること
によって１個の細胞のみを保持したり、２個の細胞を保
持したりすることができ、また、保持している細胞を放
出することもできる。上記の操作を顕微鏡の視野内にて
行うと、細胞の挙動や操作の進行状態を目視確認しつつ
遂行することができて好都合である。
【０００７】上述の原理に基づいて前記の目的（任意の
細胞を傷つけることなく保持，融合，離脱させる）を達
成するため、本発明に係る細胞融合方法は、不均一な電
界を生じるように構成された１対の電極の片方を電気絶
縁材料製の絶縁カバーで覆うとともに、上記不均一な電
界の分布密度が局部的に大きくなる個所に微小な孔を設
け、上記片方の電極と絶縁カバーとの間に微小間隙を形
成し、上記１対の電極を細胞懸濁液中に浸漬し、交流電
圧を印加して誘導電気泳動現象によって細胞を前記絶縁
カバーの孔の付近に付着させ、細胞融合処理を施し、細
胞融合処理を終えた後、前記の交流電圧の印加を解消し
て、前記の孔の付近に付着している融合処理済みの細胞
を絶縁カバーから離脱させることを特徴とする。
細胞を傷つけることなく保持，融合，離脱させる）を達
成するため、本発明に係る細胞融合方法は、不均一な電
界を生じるように構成された１対の電極の片方を電気絶
縁材料製の絶縁カバーで覆うとともに、上記不均一な電
界の分布密度が局部的に大きくなる個所に微小な孔を設
け、上記片方の電極と絶縁カバーとの間に微小間隙を形
成し、上記１対の電極を細胞懸濁液中に浸漬し、交流電
圧を印加して誘導電気泳動現象によって細胞を前記絶縁
カバーの孔の付近に付着させ、細胞融合処理を施し、細
胞融合処理を終えた後、前記の交流電圧の印加を解消し
て、前記の孔の付近に付着している融合処理済みの細胞
を絶縁カバーから離脱させることを特徴とする。
【０００８】また、上記の方法を実施するために創作し
た本発明に係る細胞融合装置の構成は、不均一な電界を
生じるように構成した１対の電極と、上記１対の電極の
内のいずれか一方の電極を覆う電気絶縁材料製の絶縁カ
バーと、前記不均一な電界の分布密度が局部的に大きく
なる個所に位置せしめて上記絶縁カバーに設けた微小な
孔と、前記一方の電極と前記絶縁カバーとの間に形成さ
れた微小な間隙と、前記１対の電極を浸漬させる細胞懸
濁液を貯える液槽と、前記１対の電極に交流電圧を印加
するための交流電源と、前記１対の電極に直流パルス電
圧を印加するための直流電源と、を具備していることを
特徴とする。
た本発明に係る細胞融合装置の構成は、不均一な電界を
生じるように構成した１対の電極と、上記１対の電極の
内のいずれか一方の電極を覆う電気絶縁材料製の絶縁カ
バーと、前記不均一な電界の分布密度が局部的に大きく
なる個所に位置せしめて上記絶縁カバーに設けた微小な
孔と、前記一方の電極と前記絶縁カバーとの間に形成さ
れた微小な間隙と、前記１対の電極を浸漬させる細胞懸
濁液を貯える液槽と、前記１対の電極に交流電圧を印加
するための交流電源と、前記１対の電極に直流パルス電
圧を印加するための直流電源と、を具備していることを
特徴とする。
【０００９】
【作用】前記の細胞融合方法によれば、選択的に１個の
細胞を絶縁カバーに付着させることができ、さらに交流
印加電圧を上昇させて２個の細胞を付着せしめるに適し
た保持力を有する状態として、もう１個の細胞を付着せ
しめて、上記２つの細胞を相互に接触せしめて保持する
ことができる。上記のようにして所望のヘテロカリオン
を得るように任意の細胞を一つずつ誘引吸着した状態で
直流パルスを印加して細胞膜を破ると、接触している２
個の細胞が融合する。その後、交流電圧の印加を解消す
ると、付着していた融合済みの細胞は絶縁カバーから離
脱する。機械的な力を与えることなく、従って細胞を破
損させるおそれ無く上記の離脱作用を電圧制御のみで行
い得るためには、 イ．図１に示したように、細胞ａが針状電極１に直接接
触できない構成であること、および、 ロ．図１に示したように、針状電極１と絶縁カバー３と
の間に微小間隙Ｇが形成されていること、 上記イ，ロの構成であることを必要とするが、さらに、 ハ．絶縁カバー３の先端が半球面３ａをなしていると、
細胞ａと絶縁カバー３とが点接触に近い状態で接触し、
広い面で接触しないので、いっそう離脱作用が容易に行
われる。 前記のロ項の微小間隙Ｇの存在によって細胞の離脱が容
易になることの理由について、理論的にはまだ解明され
ていないが、本発明者らが慎重に実験を繰り返して確認
した経験的事実であって、針状電極１に対して誘電率の
高い物質（絶縁カバー３）を密着させずに、誘電率が低
くて導電性を有する物質（細胞懸濁液）の薄層を介して
高誘電率の物質（絶縁カバー）に対向させることによっ
て、好ましい結果が得られるような電界分布が形成され
るものと推察される。本発明を実施する際、前記の微小
間隙Ｇの中へ細胞懸濁液もしくは培養液などの液体が流
入して該微小間隙Ｇ内に液体が充満するように構成して
おくことが必要である。
細胞を絶縁カバーに付着させることができ、さらに交流
印加電圧を上昇させて２個の細胞を付着せしめるに適し
た保持力を有する状態として、もう１個の細胞を付着せ
しめて、上記２つの細胞を相互に接触せしめて保持する
ことができる。上記のようにして所望のヘテロカリオン
を得るように任意の細胞を一つずつ誘引吸着した状態で
直流パルスを印加して細胞膜を破ると、接触している２
個の細胞が融合する。その後、交流電圧の印加を解消す
ると、付着していた融合済みの細胞は絶縁カバーから離
脱する。機械的な力を与えることなく、従って細胞を破
損させるおそれ無く上記の離脱作用を電圧制御のみで行
い得るためには、 イ．図１に示したように、細胞ａが針状電極１に直接接
触できない構成であること、および、 ロ．図１に示したように、針状電極１と絶縁カバー３と
の間に微小間隙Ｇが形成されていること、 上記イ，ロの構成であることを必要とするが、さらに、 ハ．絶縁カバー３の先端が半球面３ａをなしていると、
細胞ａと絶縁カバー３とが点接触に近い状態で接触し、
広い面で接触しないので、いっそう離脱作用が容易に行
われる。 前記のロ項の微小間隙Ｇの存在によって細胞の離脱が容
易になることの理由について、理論的にはまだ解明され
ていないが、本発明者らが慎重に実験を繰り返して確認
した経験的事実であって、針状電極１に対して誘電率の
高い物質（絶縁カバー３）を密着させずに、誘電率が低
くて導電性を有する物質（細胞懸濁液）の薄層を介して
高誘電率の物質（絶縁カバー）に対向させることによっ
て、好ましい結果が得られるような電界分布が形成され
るものと推察される。本発明を実施する際、前記の微小
間隙Ｇの中へ細胞懸濁液もしくは培養液などの液体が流
入して該微小間隙Ｇ内に液体が充満するように構成して
おくことが必要である。
【００１０】
【実施例】次に、本発明に係る細胞融合装置を用いて、
本発明に係る細胞融合方法を実施した例について説明す
る。図１は本発明に係る細胞融合装置の１実施例におけ
る要部の断面図であり、２はそのII−II断面図である。
１は針状の電極で、その先端を鋭利に研摩してある。こ
の針状電極を板状電極２に対して略直角に対向させる。
本発明を実施する際、板状電極２は必ずしも平板状であ
ることを要せず、針状電極１の先端よりも著しく広い電
極面を有する導電性の部材であれば足りる。３はガラス
管で構成した絶縁カバーであって、前記の針状電極１と
同心をなすように相互に固定されていて、該針状電極が
移動するときは、この絶縁カバーも一緒に動くようにな
っている。上記のガラス製の管状に構成された絶縁カバ
ーの先端（詳しくは、針状電極１の鋭利な先端と同じ側
の端）は半球面３ａに研摩仕上げしてある。その球面の
直径を２０ミクロンないし１００ミクロンの間に設定す
ると好結果が得られる。これよりも大きい直径にする
と、細胞の離脱を容易にするという効果が不充分にな
り、これよりも小さい直径にすると次に述べる孔３ｂと
の設定関係が難しくなる。前記ガラス製の絶縁カバー３
の先端に、その中心線と同心に微細な孔３ｂを設ける。
この孔３ｂは必然的に針状電極１の先端に対向する位置
となり、かつ、１対の電極（１，２）によって形成され
る不均一な電界の中で、電界密度が極部的に大きくなる
個所に位置するようになる。この孔３ｂの径は、取扱い
対象である細胞の径よりも小さくするものとし、取扱い
対象である細胞の径が不同であればそれらの内の最小の
ものよりも小さくする。要するに細胞ａが通過しないよ
うな微細な孔３ｂを設ける。取扱い対象である細胞の種
類や性状を特定できない場合は、この孔３ｂの径を５ミ
クロンないし３０ミクロンに設定しておけば、特殊な場
合を除いて汎用性が有る。細胞融合に使用する器具類の
多くは滅菌操作を必要とするが、本実施例におけるがご
とく絶縁カバーをガラス材料で構成しておくと、高温滅
菌を施しても軟化して変形するおそれが無く、また、紫
外線滅菌を施しても合成樹脂などのように変質するおそ
れが無い。また、汚れが付着しにくい上に、汚損したと
きは目視で汚損の程度を識別し易く、その上、汚損の清
浄が容易である。しかも、ガラス材料はいわゆるガラス
細工の技術を適用して半球面３ａや微細な孔３ｂを加工
することができるので好都合である。ただし、本発明を
実施する際、ガラス以外の電気絶縁材料（例えばセラミ
ックス）の使用を禁ずるものではない。針状電極１は、
径０．１ミリメートルないし１．０ミリメートルの針金
の先端を研摩して鋭利にし、絶縁カバー３内に挿入す
る。図示の微小間隙Ｇの寸法は１ミクロンないし５０ミ
クロン、好ましくは２０ミクロンとする。
本発明に係る細胞融合方法を実施した例について説明す
る。図１は本発明に係る細胞融合装置の１実施例におけ
る要部の断面図であり、２はそのII−II断面図である。
１は針状の電極で、その先端を鋭利に研摩してある。こ
の針状電極を板状電極２に対して略直角に対向させる。
本発明を実施する際、板状電極２は必ずしも平板状であ
ることを要せず、針状電極１の先端よりも著しく広い電
極面を有する導電性の部材であれば足りる。３はガラス
管で構成した絶縁カバーであって、前記の針状電極１と
同心をなすように相互に固定されていて、該針状電極が
移動するときは、この絶縁カバーも一緒に動くようにな
っている。上記のガラス製の管状に構成された絶縁カバ
ーの先端（詳しくは、針状電極１の鋭利な先端と同じ側
の端）は半球面３ａに研摩仕上げしてある。その球面の
直径を２０ミクロンないし１００ミクロンの間に設定す
ると好結果が得られる。これよりも大きい直径にする
と、細胞の離脱を容易にするという効果が不充分にな
り、これよりも小さい直径にすると次に述べる孔３ｂと
の設定関係が難しくなる。前記ガラス製の絶縁カバー３
の先端に、その中心線と同心に微細な孔３ｂを設ける。
この孔３ｂは必然的に針状電極１の先端に対向する位置
となり、かつ、１対の電極（１，２）によって形成され
る不均一な電界の中で、電界密度が極部的に大きくなる
個所に位置するようになる。この孔３ｂの径は、取扱い
対象である細胞の径よりも小さくするものとし、取扱い
対象である細胞の径が不同であればそれらの内の最小の
ものよりも小さくする。要するに細胞ａが通過しないよ
うな微細な孔３ｂを設ける。取扱い対象である細胞の種
類や性状を特定できない場合は、この孔３ｂの径を５ミ
クロンないし３０ミクロンに設定しておけば、特殊な場
合を除いて汎用性が有る。細胞融合に使用する器具類の
多くは滅菌操作を必要とするが、本実施例におけるがご
とく絶縁カバーをガラス材料で構成しておくと、高温滅
菌を施しても軟化して変形するおそれが無く、また、紫
外線滅菌を施しても合成樹脂などのように変質するおそ
れが無い。また、汚れが付着しにくい上に、汚損したと
きは目視で汚損の程度を識別し易く、その上、汚損の清
浄が容易である。しかも、ガラス材料はいわゆるガラス
細工の技術を適用して半球面３ａや微細な孔３ｂを加工
することができるので好都合である。ただし、本発明を
実施する際、ガラス以外の電気絶縁材料（例えばセラミ
ックス）の使用を禁ずるものではない。針状電極１は、
径０．１ミリメートルないし１．０ミリメートルの針金
の先端を研摩して鋭利にし、絶縁カバー３内に挿入す
る。図示の微小間隙Ｇの寸法は１ミクロンないし５０ミ
クロン、好ましくは２０ミクロンとする。
【００１１】図３は前記１対の電極１，２に電圧を印加
するための機構を示す模式的な説明図である。同図の４
ａは直流電源であって、直流パルス電圧を発生する機能
を備えている。また同図の４ｂは交流電源であって、
０．１メガヘルツないし１．０メガヘルツの交流電圧を
発生する機能、および、その電圧値を調節する機構を備
えている。上記直流電源４ａから発生する直流パルスお
よび交流電源４ｂから発生する交流電圧は、スイッチ５
によって開閉，切替制御され、制御部７を介して前記１
対の電極１，２に印加される。その電気的な作動状態は
測定部６によって監視され、記録される。上記１対の電
極１，２は図１について説明したような構造であって、
液槽８内の細胞懸濁液９内に浸漬されている。さらに詳
しくは、上記の電極１，２がそれぞれ図外のマニピュレ
ータ（小形ロボット）によって支持されていて、電極間
距離の調整が可能であり、かつ、双方の電極が１対をな
した状態を保ちつつ一緒に液槽８内を移動せしめ得る構
造である。本例の液槽８は透明なガラス製である。本発
明を実施する場合、この液槽は少なくとも底面（正しく
は底壁）を透明な部材で構成し、倒立型の顕微鏡１０の
ステージ１１上に設置する。図示を省略したが、電極
１，２付近を照明する手段を設けて、該電極１，２に挟
まれている区域を拡大して観察し得るように構成する。
顕微鏡の倍率は、融合処理対象である植物の種類に応じ
て変化せしめ得ることが望ましく、１００倍ないし４０
０倍の範囲が一般に用いられる。前記の液槽８は、その
中の細胞懸濁液の液面よりも低い仕切りの突条８ａ，８
ｂによって３つの区画Ａ′，Ｂ′，Ｃ′に区分されてい
る。これは、細胞Ａの単離細胞ａを貯えるための区画
Ａ′と、細胞Ｂの単離細胞ｂを貯えるための区画Ｂ′
と、細胞Ａ，Ｂを融合させたヘテロカリオンａ・ｂを培
養液中に放出するための区画Ｃ′とを設けたものであっ
て、本発明を実施する場合の区画数は必ずしも３区画に
限らないが、３もくしはそれ以上に区画することが望ま
しい。前述したマニピュレータ（図示省略）による電極
１，２の移動は、これらの区画の間を液面下で移動し得
る構造とする。この場合、必ずしも電極１，２の全部が
液面下に沈んでいなければならない訳ではないが、少な
くとも針状電極１の先端部および絶縁カバーの孔３ｂ付
近が液面下を通って移動できなければならない。これ
は、絶縁カバー３の先端部に付着させた単離細胞を空気
に触れさせずに液中に保つためである。
するための機構を示す模式的な説明図である。同図の４
ａは直流電源であって、直流パルス電圧を発生する機能
を備えている。また同図の４ｂは交流電源であって、
０．１メガヘルツないし１．０メガヘルツの交流電圧を
発生する機能、および、その電圧値を調節する機構を備
えている。上記直流電源４ａから発生する直流パルスお
よび交流電源４ｂから発生する交流電圧は、スイッチ５
によって開閉，切替制御され、制御部７を介して前記１
対の電極１，２に印加される。その電気的な作動状態は
測定部６によって監視され、記録される。上記１対の電
極１，２は図１について説明したような構造であって、
液槽８内の細胞懸濁液９内に浸漬されている。さらに詳
しくは、上記の電極１，２がそれぞれ図外のマニピュレ
ータ（小形ロボット）によって支持されていて、電極間
距離の調整が可能であり、かつ、双方の電極が１対をな
した状態を保ちつつ一緒に液槽８内を移動せしめ得る構
造である。本例の液槽８は透明なガラス製である。本発
明を実施する場合、この液槽は少なくとも底面（正しく
は底壁）を透明な部材で構成し、倒立型の顕微鏡１０の
ステージ１１上に設置する。図示を省略したが、電極
１，２付近を照明する手段を設けて、該電極１，２に挟
まれている区域を拡大して観察し得るように構成する。
顕微鏡の倍率は、融合処理対象である植物の種類に応じ
て変化せしめ得ることが望ましく、１００倍ないし４０
０倍の範囲が一般に用いられる。前記の液槽８は、その
中の細胞懸濁液の液面よりも低い仕切りの突条８ａ，８
ｂによって３つの区画Ａ′，Ｂ′，Ｃ′に区分されてい
る。これは、細胞Ａの単離細胞ａを貯えるための区画
Ａ′と、細胞Ｂの単離細胞ｂを貯えるための区画Ｂ′
と、細胞Ａ，Ｂを融合させたヘテロカリオンａ・ｂを培
養液中に放出するための区画Ｃ′とを設けたものであっ
て、本発明を実施する場合の区画数は必ずしも３区画に
限らないが、３もくしはそれ以上に区画することが望ま
しい。前述したマニピュレータ（図示省略）による電極
１，２の移動は、これらの区画の間を液面下で移動し得
る構造とする。この場合、必ずしも電極１，２の全部が
液面下に沈んでいなければならない訳ではないが、少な
くとも針状電極１の先端部および絶縁カバーの孔３ｂ付
近が液面下を通って移動できなければならない。これ
は、絶縁カバー３の先端部に付着させた単離細胞を空気
に触れさせずに液中に保つためである。
【００１２】以上のように構成された細胞融合装置を用
いて細胞融合操作を行った１例について、添付の図面を
参照しつつ次に述べる。説明の便宜上、２つの異なる種
類の細胞を細胞Ａ，細胞Ｂとし、それぞれの単離細胞の
１個をａ，ｂで表わすものとする。本実施例において
は、シバ（Ｚｏｙｓｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）の種子か
ら得られた培養細胞を細胞Ａとし、コウライシバ（Ｚｏ
ｙｓｉａ ｍａｔｒｅｌｌａ）のランナーの先端部から
採取した細胞を細胞Ｂとした。シバの培養細胞Ａは、植
物ホルモンを含む倍地に種子を置床し、得られたカルス
を液体倍地で振盪してサスペンジョン細胞とした。一
方、コウライシバの細胞Ｂはランナーの先端部を切断
し、高張液（０．５Ｍマンニトール、塩化カルシウム２
水塩を含む）で３０分間ないし１時間振盪した。これら
の細胞Ａ，Ｂのそれぞれを、３％セルラーゼＲＳ、２％
マセロザイムＲ−１０、０．１％ペクトリアーゼＹ−２
３、０．５Ｍマンニトール（いずれも商標名）を含む酵
素液で２６℃、３０ｒｐｍで３時間ないし６時間処理し
て単離し、裸の細胞（プロトプラスト）を得た。（図３
参照）液槽８内の区画Ａ′に、上記のようにして得られ
たシバの単離細胞ａの多数を含む細胞懸濁液を入れる。
単離細胞ａは液よりも比重が大きいので仕切突条８ａを
越えず、区画Ａ′内に滞留する。そしてコウライシバの
単離細胞ｂの多数を含む細胞懸濁液を区画Ｂ′に入れ
る。このように準備しておいて電極１，２を区画Ａ′内
に移動させ、板状電極２を区画Ａ′内で固定的に支持す
るとともに針状電極１を移動可能な状態とし、顕微鏡１
０の視野中に入れるとともに照明を調節して拡大像の観
測を可能ならしめる。（図４参照）針状電極１および板
状電極２に交流電圧を印加すると、鋭い先端を有する電
極が面を有する電極に対向しているので不均一な電界が
誘起される。このため、単離細胞ａは電界密度の大きい
個所に向けて誘引され（誘導電気泳動現象）、付記した
矢印のごとく孔３ｂ付近に付着する。この部分は球面状
に研摩されているので単離細胞ａが傷つけられない。こ
の場合、多数の単離細胞が誘引されて付着すると、ぶど
うの房状になって、その後の融合操作に支障を来たすの
で、印加している交流電圧を加減して、１個の単離細胞
を吸着，保持するに適した電圧に制御する。この操作は
顕微鏡ステージ１１上の透明な液槽８内で行われ、顕微
鏡１０によって観察される。このようにして、交流電圧
を調整して付着する単離細胞ａの個数を制御する際、１
対の電極１，２の電極間隔寸法の調整を併せ行うことも
可能である。しかし本実施例においては、単離細胞の付
着力調整は交流電圧の電圧値を加減して行い、電極間寸
法の調節は図７について後述する直流パルス電圧印加の
際に使用した。（図３参照）１対の電極１，２を区画
Ａ′内に位置せしめて上述（図４）のごとく１個の単離
細胞ａを絶縁カバー３の先端部に付着させた後、上記単
離細胞ａが液面上に露出しないように経路を選んで、す
なわち絶縁カバー３の孔３ｂを液面下に保ちつつ該１対
の電極１，２を区画Ｂ′（図３）に移動し、単離細胞ａ
を区画Ｂ′内に移送する。この区画Ｂ′内には予め単離
細胞ｂが入れられている。（図５参照）この段階では、
印加されている交流電圧の電圧値は単離細胞１個を付着
保持するに適した値であるから、この電圧を適宜に上昇
させて２個の単離細胞を付着保持し得る程度にする。す
ると、既に付着している単離細胞ａの他に、もう１個の
単離細胞ｂが誘引されて付着する。この操作状態もま
た、前述の顕微鏡１０によって観察することができる。
図６は、１個の単離細胞ａと１個の単離細胞ｂとが相互
に接触して絶縁カバー３の先端付近（半球面３ａの、孔
３ｂ近傍に付着している状態を模式的に描いたものであ
る。この状態で、前記の交流電圧は引き続いて印加して
いる。上記図６の状態で、スイッチ５（図３）を操作し
て１対の電極１，２に直流パルス電圧を印加し、単離細
胞ａと単離細胞ｂとを融合させる。この操作に際しては
前記１対の電極１，２の電極間隙寸法を調節して、直流
パルス電圧の分布勾配が細胞Ａ，Ｂの種類に応じた適宜
の値（例えば０．１〜１０キロボルト／センチメート
ル）となるようにする。この融合操作の後、前記交流電
圧の印加を継続して、融合されたヘテロカリオンを図７
に示すように絶縁カバー３の先端に付着させておく。こ
の状態で３０秒間ないし１００秒間（好ましくは３０秒
間）静置して該ヘテロカリオンが球形に戻るのを待つ。
前記の液槽８内には細胞懸濁液９が貯えられているが、
区画Ｃ′には単離細胞が入れられていない。
いて細胞融合操作を行った１例について、添付の図面を
参照しつつ次に述べる。説明の便宜上、２つの異なる種
類の細胞を細胞Ａ，細胞Ｂとし、それぞれの単離細胞の
１個をａ，ｂで表わすものとする。本実施例において
は、シバ（Ｚｏｙｓｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）の種子か
ら得られた培養細胞を細胞Ａとし、コウライシバ（Ｚｏ
ｙｓｉａ ｍａｔｒｅｌｌａ）のランナーの先端部から
採取した細胞を細胞Ｂとした。シバの培養細胞Ａは、植
物ホルモンを含む倍地に種子を置床し、得られたカルス
を液体倍地で振盪してサスペンジョン細胞とした。一
方、コウライシバの細胞Ｂはランナーの先端部を切断
し、高張液（０．５Ｍマンニトール、塩化カルシウム２
水塩を含む）で３０分間ないし１時間振盪した。これら
の細胞Ａ，Ｂのそれぞれを、３％セルラーゼＲＳ、２％
マセロザイムＲ−１０、０．１％ペクトリアーゼＹ−２
３、０．５Ｍマンニトール（いずれも商標名）を含む酵
素液で２６℃、３０ｒｐｍで３時間ないし６時間処理し
て単離し、裸の細胞（プロトプラスト）を得た。（図３
参照）液槽８内の区画Ａ′に、上記のようにして得られ
たシバの単離細胞ａの多数を含む細胞懸濁液を入れる。
単離細胞ａは液よりも比重が大きいので仕切突条８ａを
越えず、区画Ａ′内に滞留する。そしてコウライシバの
単離細胞ｂの多数を含む細胞懸濁液を区画Ｂ′に入れ
る。このように準備しておいて電極１，２を区画Ａ′内
に移動させ、板状電極２を区画Ａ′内で固定的に支持す
るとともに針状電極１を移動可能な状態とし、顕微鏡１
０の視野中に入れるとともに照明を調節して拡大像の観
測を可能ならしめる。（図４参照）針状電極１および板
状電極２に交流電圧を印加すると、鋭い先端を有する電
極が面を有する電極に対向しているので不均一な電界が
誘起される。このため、単離細胞ａは電界密度の大きい
個所に向けて誘引され（誘導電気泳動現象）、付記した
矢印のごとく孔３ｂ付近に付着する。この部分は球面状
に研摩されているので単離細胞ａが傷つけられない。こ
の場合、多数の単離細胞が誘引されて付着すると、ぶど
うの房状になって、その後の融合操作に支障を来たすの
で、印加している交流電圧を加減して、１個の単離細胞
を吸着，保持するに適した電圧に制御する。この操作は
顕微鏡ステージ１１上の透明な液槽８内で行われ、顕微
鏡１０によって観察される。このようにして、交流電圧
を調整して付着する単離細胞ａの個数を制御する際、１
対の電極１，２の電極間隔寸法の調整を併せ行うことも
可能である。しかし本実施例においては、単離細胞の付
着力調整は交流電圧の電圧値を加減して行い、電極間寸
法の調節は図７について後述する直流パルス電圧印加の
際に使用した。（図３参照）１対の電極１，２を区画
Ａ′内に位置せしめて上述（図４）のごとく１個の単離
細胞ａを絶縁カバー３の先端部に付着させた後、上記単
離細胞ａが液面上に露出しないように経路を選んで、す
なわち絶縁カバー３の孔３ｂを液面下に保ちつつ該１対
の電極１，２を区画Ｂ′（図３）に移動し、単離細胞ａ
を区画Ｂ′内に移送する。この区画Ｂ′内には予め単離
細胞ｂが入れられている。（図５参照）この段階では、
印加されている交流電圧の電圧値は単離細胞１個を付着
保持するに適した値であるから、この電圧を適宜に上昇
させて２個の単離細胞を付着保持し得る程度にする。す
ると、既に付着している単離細胞ａの他に、もう１個の
単離細胞ｂが誘引されて付着する。この操作状態もま
た、前述の顕微鏡１０によって観察することができる。
図６は、１個の単離細胞ａと１個の単離細胞ｂとが相互
に接触して絶縁カバー３の先端付近（半球面３ａの、孔
３ｂ近傍に付着している状態を模式的に描いたものであ
る。この状態で、前記の交流電圧は引き続いて印加して
いる。上記図６の状態で、スイッチ５（図３）を操作し
て１対の電極１，２に直流パルス電圧を印加し、単離細
胞ａと単離細胞ｂとを融合させる。この操作に際しては
前記１対の電極１，２の電極間隙寸法を調節して、直流
パルス電圧の分布勾配が細胞Ａ，Ｂの種類に応じた適宜
の値（例えば０．１〜１０キロボルト／センチメート
ル）となるようにする。この融合操作の後、前記交流電
圧の印加を継続して、融合されたヘテロカリオンを図７
に示すように絶縁カバー３の先端に付着させておく。こ
の状態で３０秒間ないし１００秒間（好ましくは３０秒
間）静置して該ヘテロカリオンが球形に戻るのを待つ。
前記の液槽８内には細胞懸濁液９が貯えられているが、
区画Ｃ′には単離細胞が入れられていない。
【００１３】図３に示した液槽８の区画Ｂ′内で単離細
胞ａ，ｂの接触操作，直流パルスの印加（融合）操作を
行い、球形復元のための静置を終えたならば、再び１対
の電極１，２を移動させ、絶縁カバー３に付着している
融合細胞（ヘテロカリオン）ａ・ｂ（図７）を空気中へ
出さないように仕切突条８ｂを越えて区画Ｃ′に移送
し、交流電圧の印加を解消すると、図８に示すごとくヘ
テロカリオンａ・ｂは絶縁カバー３から離脱して培養液
中に放出される。上記絶縁カバー３に対して単離細胞や
ヘテロカリオンが付着する個所は滑らかな半球面３ａに
研摩されているので、付着した細胞やヘテロカリオンが
傷つけられるおそれが無い。さらに、ヘテロカリオンが
上記絶縁カバー３に付着されている状態で半球面３ａに
接しているので接触面積が極微小である。従って、交流
電圧の印加を解消すると容易に離脱し、機械的に離脱を
幇助する必要が無く、該ヘテロカリオンを傷つけるおそ
れ無く離脱させることができる。
胞ａ，ｂの接触操作，直流パルスの印加（融合）操作を
行い、球形復元のための静置を終えたならば、再び１対
の電極１，２を移動させ、絶縁カバー３に付着している
融合細胞（ヘテロカリオン）ａ・ｂ（図７）を空気中へ
出さないように仕切突条８ｂを越えて区画Ｃ′に移送
し、交流電圧の印加を解消すると、図８に示すごとくヘ
テロカリオンａ・ｂは絶縁カバー３から離脱して培養液
中に放出される。上記絶縁カバー３に対して単離細胞や
ヘテロカリオンが付着する個所は滑らかな半球面３ａに
研摩されているので、付着した細胞やヘテロカリオンが
傷つけられるおそれが無い。さらに、ヘテロカリオンが
上記絶縁カバー３に付着されている状態で半球面３ａに
接しているので接触面積が極微小である。従って、交流
電圧の印加を解消すると容易に離脱し、機械的に離脱を
幇助する必要が無く、該ヘテロカリオンを傷つけるおそ
れ無く離脱させることができる。
【００１４】上述の実施例によって明らかにされた作
用，効果が得られたのは、図１に示したように、（イ）
針状電極１に対し、微小間隙Ｇを介して絶縁カバー３で
覆ったこと、（ロ）上記絶縁カバー３の先端に微細な孔
３ｂを設けたこと、（ハ）上記針状電極１に電圧を印加
して不均一な電界を誘起させたこと、が基本となってお
り、本発明はこれら（イ），（ロ），（ハ）の構成によ
る効果を助長する補助的な構造を創作し、併せて、これ
ら（イ），（ロ），（ハ）の構成によって得られる特有
の効果を利用して、その実用価値をより高からしめる操
作方法を創作したものである。上記（イ），（ロ），
（ハ）の構成を適用することにより、前述の実施例にお
けるがごとく、（ａ）誘導電気泳動現象を利用して、任
意の１個の単離細胞を保持することが可能となり、
（ｂ）保持した１個の単離細胞に対して、さらに他の任
意の１個の単離細胞を付着させて保持することが可能と
なり、（ｃ）保持した２個の単離細胞を融合させること
が可能となり、（ｄ）任意の単離細胞もしくは融合した
細胞を保持して移送することが可能となり、かつ、
（ｅ）移送した単離細胞もしくは融合した細胞に機械的
な力を加えることなく放出することが可能となり、しか
も、（ｆ）針状電極は単離細胞の保持用と、融合のため
のパルス電圧印加用と、融合した細胞の保持用との三つ
の役割を兼ねることができる。このように１個の構成部
材が多くの機能を果たすことは、装置全体の構成部品点
数を減じ、構造を簡単ならしめ、製造コストを安価なら
しめることができる。
用，効果が得られたのは、図１に示したように、（イ）
針状電極１に対し、微小間隙Ｇを介して絶縁カバー３で
覆ったこと、（ロ）上記絶縁カバー３の先端に微細な孔
３ｂを設けたこと、（ハ）上記針状電極１に電圧を印加
して不均一な電界を誘起させたこと、が基本となってお
り、本発明はこれら（イ），（ロ），（ハ）の構成によ
る効果を助長する補助的な構造を創作し、併せて、これ
ら（イ），（ロ），（ハ）の構成によって得られる特有
の効果を利用して、その実用価値をより高からしめる操
作方法を創作したものである。上記（イ），（ロ），
（ハ）の構成を適用することにより、前述の実施例にお
けるがごとく、（ａ）誘導電気泳動現象を利用して、任
意の１個の単離細胞を保持することが可能となり、
（ｂ）保持した１個の単離細胞に対して、さらに他の任
意の１個の単離細胞を付着させて保持することが可能と
なり、（ｃ）保持した２個の単離細胞を融合させること
が可能となり、（ｄ）任意の単離細胞もしくは融合した
細胞を保持して移送することが可能となり、かつ、
（ｅ）移送した単離細胞もしくは融合した細胞に機械的
な力を加えることなく放出することが可能となり、しか
も、（ｆ）針状電極は単離細胞の保持用と、融合のため
のパルス電圧印加用と、融合した細胞の保持用との三つ
の役割を兼ねることができる。このように１個の構成部
材が多くの機能を果たすことは、装置全体の構成部品点
数を減じ、構造を簡単ならしめ、製造コストを安価なら
しめることができる。
【００１５】
【発明の効果】以上説明したように、本発明に係る細胞
融合装置を用いて本発明の細胞融合方法を実施すると、 ａ．電極の先端に、任意の細胞を１個だけ付着させるこ
と、および、付着状態を目視確認することができ、 ｂ．上記のようにして付着させた１個の細胞に対して、
さらに任意の１個の細胞を付着させること、および、２
個の細胞の付着状態を目視確認することができ、 ｃ．付着させた１個若しくは複数個の細胞を安全，確実
に保持すること、および移送すること、並びに、保持し
ている複数個の細胞同志を融合させることができ、 ｄ．保持している細胞に対して機械的に操作力を加える
ことなく、（従って、該細胞を傷つけるおそれ無く）電
極から細胞を離脱させること、および、その状態を目視
確認することができる、 という、優れた実用的効果を奏する。
融合装置を用いて本発明の細胞融合方法を実施すると、 ａ．電極の先端に、任意の細胞を１個だけ付着させるこ
と、および、付着状態を目視確認することができ、 ｂ．上記のようにして付着させた１個の細胞に対して、
さらに任意の１個の細胞を付着させること、および、２
個の細胞の付着状態を目視確認することができ、 ｃ．付着させた１個若しくは複数個の細胞を安全，確実
に保持すること、および移送すること、並びに、保持し
ている複数個の細胞同志を融合させることができ、 ｄ．保持している細胞に対して機械的に操作力を加える
ことなく、（従って、該細胞を傷つけるおそれ無く）電
極から細胞を離脱させること、および、その状態を目視
確認することができる、 という、優れた実用的効果を奏する。
【図１】本発明に係る細胞融合装置の１実施例における
針状電極付近を描いた縦断面図である。
針状電極付近を描いた縦断面図である。
【図２】本発明に係る細胞融合装置の１実施例における
針状電極付近を描いた横断面図である。
針状電極付近を描いた横断面図である。
【図３】本発明に係る細胞融合装置の１実施例を示し、
電気系統図を付記した断面図である。
電気系統図を付記した断面図である。
【図４】本発明に係る細胞融合装置の１実施例における
作用を説明するための要部断面図である。
作用を説明するための要部断面図である。
【図５】本発明に係る細胞融合装置の１実施例における
作用を説明するための要部断面図である。
作用を説明するための要部断面図である。
【図６】本発明に係る細胞融合装置の１実施例における
作用を説明するための要部断面図である。
作用を説明するための要部断面図である。
【図７】本発明に係る細胞融合装置の１実施例における
作用を説明するための要部断面図である。
作用を説明するための要部断面図である。
【図８】本発明に係る細胞融合装置の１実施例における
作用を説明するための要部断面図である。
作用を説明するための要部断面図である。
１…針状電極、２…板状電極、３…絶縁カバー、３ａ…
半球面、３ｂ…微細な孔、４ａ…直流電源、４ｂ…交流
電源、５…スイッチ、６…測定部、７…制御部、８…液
槽、８ａ，８ｂ…仕切突条、９…細胞懸濁液、１０…顕
微鏡、１１…顕微鏡ステージ、ａ…細胞Ａの単離細胞、
ｂ…細胞Ｂの単離細胞、Ａ′，Ｂ′，Ｃ′…区画、、Ｇ
…微小間隙。
半球面、３ｂ…微細な孔、４ａ…直流電源、４ｂ…交流
電源、５…スイッチ、６…測定部、７…制御部、８…液
槽、８ａ，８ｂ…仕切突条、９…細胞懸濁液、１０…顕
微鏡、１１…顕微鏡ステージ、ａ…細胞Ａの単離細胞、
ｂ…細胞Ｂの単離細胞、Ａ′，Ｂ′，Ｃ′…区画、、Ｇ
…微小間隙。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/14 13/00
Claims (22)
- 【請求項１】 不均一な電界を生じるように構成された
１対の電極の片方を電気絶縁材料製の絶縁カバーで覆う
とともに、上記不均一な電界の分布密度が局部的に大き
くなる個所に微小な孔を設け、 上記片方の電極と絶縁カバーとの間に微小間隙を形成
し、 上記１対の電極を細胞懸濁液中に浸漬し、交流電圧を印
加して誘導電気泳動現象によって細胞を前記絶縁カバー
の孔の付近に付着させ、細胞融合処理を施し、 細胞融合処理を終えた後、前記の交流電圧の印加を解消
して、前記の孔の付近に付着している融合処理済みの細
胞を絶縁カバーから離脱させることを特徴とする細胞融
合方法。 - 【請求項２】 前記の不均一な電界を生じる１対の電極
の内の片方は針状電極であり、これを覆う絶縁カバーは
上記針状電極と同心をなすように装着された管状の部材
であり、該管状の絶縁カバーの一方の端の開口部が微小
孔径をなし、かつ、前記１対の電極の内の他方は針状電
極に対して略直交する電極面を有していることを特徴と
する、請求項１に記載の細胞融合方法。 - 【請求項３】 前記の管状絶縁カバーをガラスで構成す
ることを特徴とする、請求項２に記載の細胞融合方法。 - 【請求項４】 前記の微小な孔の内径を、融合処理を施
す複数種類の単離細胞の内の最小のものの外径よりも小
さく設定することを特徴とする、請求項１に記載の細胞
融合方法。 - 【請求項５】 前記の細胞融合処理を次の手順で行うこ
とを特徴とする、請求項１に記載の細胞融合方法。 ａ．１対の電極を細胞Ａの懸濁液中に浸漬するとともに
交流電圧を印加して、上記細胞Ａの単離細胞を絶縁カバ
ーの孔の付近に付着させ、 ｂ．上記１対の電極を液面上に引き上げることなく、液
面下で移動させて細胞Ｂの懸濁液中に移し、 ｃ．上記１対の電極に交流電圧を印加して前記細胞Ｂの
単離細胞を前記細胞Ａの単離細胞に密着させ、 ｄ．直流パルス電圧を印加して上記細胞Ａ，Ｂの単離細
胞同志を融合させる。 - 【請求項６】 前記交流電圧の印加を解消して融合処理
済みの細胞を離脱させる操作は、該１対の電極を液面上
に引き上げることなく培養液中に移動させて行うことを
特徴とする、請求項５に記載の細胞融合方法。 - 【請求項７】 前記の細胞Ａの付着操作、細胞Ｂの付着
操作、細胞Ａ，Ｂの融合操作、および、融合細胞の離脱
操作を、液面下で少なくとも三つの区域に区画されたシ
ャーレの中で行い、 上記の区画の内の一つには細胞Ａの単離細胞を沈降させ
ておき、他の一つには細胞Ｂの単離細胞を沈降させてお
き、さらに他の一つには培養液を満たしておくことを特
徴とする、請求項６に記載の細胞融合方法。 - 【請求項８】 前記の細胞Ａの付着操作、細胞Ｂの付着
操作、細胞Ａ，Ｂの融合操作、および、融合細胞の離脱
操作を、前記シャーレの下方から顕微鏡で観察しつつ行
うことを特徴とする、請求項７に記載の細胞融合方法。 - 【請求項９】 前記の交流電圧を変化させることによ
り、付着させる単離細胞の保持力を調整して、１個のＡ
細胞と１個のＢ細胞とを付着させるように制御すること
を特徴とする、請求項６に記載の細胞融合方法。 - 【請求項１０】 直流パルス電圧を印加して細胞Ａ，Ｂ
の単離細胞を融合させた後、交流電圧の印加を解消して
融合した細胞を培養液中に放出することを特徴とする、
請求項６に記載の細胞融合方法。 - 【請求項１１】 不均一な電界を生じるように構成した
１対の電極と、 上記１対の電極の内のいずれか一方の電極を覆う電気絶
縁材料製の絶縁カバーと、 前記不均一な電界の分布密度が局部的に大きくなる個所
に位置せしめて上記絶縁カバーに設けた微小な孔と、 前記一方の電極と前記絶縁カバーとの間に形成された微
小な間隙と、 前記１対の電極を浸漬させる細胞懸濁液を貯える液槽
と、 前記１対の電極に交流電圧を印加するための交流電源
と、 前記１対の電極に直流パルス電圧を印加するための直流
電源と、 を具備していることを特徴とする細胞融合装置。 - 【請求項１２】 前記の直流電源は、前記１対の電極へ
の交流電圧供給回路を開閉制御するスイッチ手段を有し
ており、かつ、交流電圧値を変化させる調整手段を具備
していることを特徴とする、請求項１１に記載の細胞融
合装置。 - 【請求項１３】 前記一方の電極は針状の電極であり、
かつ、前記の絶縁カバーは上記針状電極と同心状に配置
された管状の部材であることを特徴とする、請求項１２
に記載の細胞融合装置。 - 【請求項１４】 前記の絶縁カバーはガラス製の管状部
材であり、かつ、該ガラス管の電極先端側の開口の径
は、取扱対象である複数種類の細胞の単離細胞の内で最
小の単離細胞の外径よりも小さいことを特徴とする、請
求項１３に記載の細胞融合装置。 - 【請求項１５】 前記ガラス管の電極先端側の開口の径
は５ミクロンないし３０ミクロンであることを特徴とす
る、請求項１４に記載の細胞融合装置。 - 【請求項１６】 前記ガラス製管状の絶縁カバーは、そ
の電極先端側の末端が、直径２０ミクロンないし１００
ミクロンの半球面状をなしていることを特徴とする、請
求項１３に記載の細胞融合装置。 - 【請求項１７】 前記の細胞懸濁液を貯える液槽は、液
面よりも低い仕切りによって少なくとも三つの部分に区
画されているものであることを特徴とする、請求項１３
に記載の細胞融合装置。 - 【請求項１８】 前記液槽は、少なくともその底壁を透
明な材料で構成されており、かつ、上向きに保持されて
いる顕微鏡対物レンズに正対する顕微鏡ステージ上に載
置し得る構造であることを特徴とする、請求項１７に記
載の細胞融合装置。 - 【請求項１９】 前記１対の電極は、針状電極の先端部
および絶縁カバーの先端部開口付近を液面上に上昇せし
めることなく、前記の少なくとも三つに区画されている
区画の間を移動し得る構造であることを特徴とする、請
求項１７に記載の細胞融合装置。 - 【請求項２０】 前記１対の電極は、その電極間の距離
を調節し得る構造であることを特徴とする、請求項１１
に記載の細胞融合装置。 - 【請求項２１】 前記一方の電極と前記絶縁カバーとの
間に形成された微小な間隙の寸法は１ミクロンないし５
０ミクロンであることを特徴とする、請求項１１に記載
の細胞融合装置。 - 【請求項２２】 前記の交流電源の周波数は０．１メガ
ヘルツないし１．０メガヘルツであることを特徴とす
る、請求項１１に記載の細胞融合装置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3300434A JPH0661267B2 (ja) | 1991-11-15 | 1991-11-15 | 細胞融合方法および細胞融合装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3300434A JPH0661267B2 (ja) | 1991-11-15 | 1991-11-15 | 細胞融合方法および細胞融合装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05137576A JPH05137576A (ja) | 1993-06-01 |
| JPH0661267B2 true JPH0661267B2 (ja) | 1994-08-17 |
Family
ID=17884760
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3300434A Expired - Fee Related JPH0661267B2 (ja) | 1991-11-15 | 1991-11-15 | 細胞融合方法および細胞融合装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0661267B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| US8262886B2 (en) | 2006-02-10 | 2012-09-11 | Kochi University Of Technology | Apparatus for analyzing characteristics of particulate with dielectrophoresis of particulate by applying angle-modulated wave and method for the same |
| JP5710135B2 (ja) * | 2010-03-18 | 2015-04-30 | 章博 挾間 | 顕微授精装置、顕微授精用のプローブおよび顕微授精方法 |
| WO2020021896A1 (ja) * | 2018-07-25 | 2020-01-30 | エイブル株式会社 | 細胞刺激装置、細胞刺激方法、培養生成物の製造方法、単離細胞の製造方法及び細胞増殖方法 |
-
1991
- 1991-11-15 JP JP3300434A patent/JPH0661267B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Publication date |
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| JPH05137576A (ja) | 1993-06-01 |
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