JPH06511387A

JPH06511387A - β−アミロイド調節のための組成物および方法

Info

Publication number: JPH06511387A
Application number: JP5511719A
Authority: JP
Inventors: モニア，ブレット・ピー; フレイアー，スーザン・エム; エッカー，デーヴィッド・ジェイ
Original assignee: アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド
Priority date: 1991-12-24
Filing date: 1992-12-16
Publication date: 1994-12-22
Also published as: EP0644889A4; AU3249793A; EP0644889A1; US5837449A; CA2126451A1; US6177246B1; WO1993013114A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

［発明の名称］ β−アミロイド調節のための組成物および方法［技術分野］本発明はβ−アミロイド蛋白質の生成を調節するために投与できるアンチセンス　オリゴヌクレオチドの設計および合成に関する。これらの化合物はβ−アミロイドの異常な蓄積により引き起こされる疾病の程度を軽減するため予防的にまたは治療的に使用できる。ＲＮＡ標的に特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドが記載されている。［背景技術］多くの先進国においてアルツハイマー病は老化に伴う痴呆症の最も一般的な原因である。記憶、情緒的安定および判断力が徐々に失なわれ、通常発症後４年および１２年の間にゆっくりした死を迎える。患者は定常的な監視を必要とし、ついには生じる重度の衰弱状態のため保護的トータルケアが必要とされる。アルツハイマー病患者の診断および処置の費用は米国のみで現在−年間に８００億ドル以上であると見積もられティる［５ｅｌｋｏｅ、Ｄ、Ｊ、（１９９１）、Ｓｃ±ｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　２６５＋６８−７８１゜Ａｌｏｉｓ　Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ博士により痴呆症の患者において２つの型の脳病変、即ち老人斑および神経原線維変性が記載されている。老人斑は認識機能に対応する脳の領域（特に、大脳皮質、海馬および小脳扁桃）に多数少じている。これらの球形斑はニューロンの長い先細の形態を持つ部分であり細胞外フィラメントの塊で取り囲まれている変性した神経突起（軸索および…状突起）から成り立っている。現在のところこのフィラメント　マトリックスのからみ合いの結果としてニューロンが変性すると信じられている。この疾患の進行を阻止または遅延させる処置は知られていない。［発明の開示］発明の目的 β−アミロイドのメツセンジャーＲＮＡの機能を調節するためにメツセンジャーＲＮＡにハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドを提供するのが本発明の目的である。メツセンジャーＲＮＡとのアンチセンス相互作用を通してβ−アミロイドの発現を調節できるオリゴヌクレオチドを提供するのも本発明のさらなる目的である。 β−アミロイド蓄積に伴う疾患の診断および治療法を提供するのも本発明の別の目的である。 β−アミロイド　メツセンジャーＲＮＡの存在が疑われる試料においてその存在または不在を検出するための方法、材料およびキットもまた本発明の目的である。新規のオリゴヌクレオチドは本発明のさらなる目的である。本発明の別の目的はβ−アミロイド遺伝子の突然変異形のメツセンジャーＲＮＡへ選択的にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドを提供することである。 β−アミロイド　メツセンジャーＲＮＡの突然変異コドン−６４２領域とのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを通してのβ−アミロイドの突然変異形の発現の特異的阻害も本発明のさらに別の目的である。 β−アミロイドの正常形（野生型）から突然変異形への突然変異の検出も本発明の別の目的である。突然変異体β−アミロイドの存在に基づく高い危険状態の同定も本発明のさらに別の目的である。本発明のさらなる目的はβ−アミロイドの野生型から突然変異型への突然変異により生じる状態の診断および処置法を提供することである。これらおよび他の目的は本明細書および付随する請求の範囲を検討することにより当業者には明らかになるであろう。発明の要約本発明に従うと、β−アミロイドをコードしている遺伝子に由来するＤＮＡまたはＲＮＡと特異的にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドが提供される。オリゴヌクレオチドはそのような特異的ハイブリダイゼーションを有効にするために十分な同定性および数を持つヌクレオチド単位を含んでいる。オリゴヌクレオチドは遺伝子の翻訳開始コドンと特異的にハイブリダイズできることが好適であり、オリゴヌクレオチドが配列ＣＡＴを含むことが好適である。別の好適な実施態様に従うと、β−アミロイドをコードしている遺伝子のコドン７１７と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが提供される。別の実施態様では突然変異体β−アミロイドをコードしている遺伝子のコドン７１７と優先的および特異的にハイブリダイズし、好適には配列ＧＡＴ、ＧＡＡまたはＧＣＣを含んでいるオリゴヌクレオチドが提供される。そのようなオリゴヌクレオチドは都合が良いようにおよび望まれるように医薬として受容可能な担体中に存在する。別の好適な実施態様に従うと、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位間の少くともいくつかの連結基がホスホロチオエート部分のような硫黄含有種を含むようにオリゴヌクレオチドが形成される。本発明の他の態様は、細胞または組織中のβ−アミロイドをコードしている遺伝子の発現を調節するための方法、特に、β−アミロイド突然変異がひそむと疑われている細胞または組織において突然変異したβ−アミロイドをコードしている遺伝子の発現を調節するための方法に関する。本発明のさらに別の態様は、細胞または組織中のβ−アミロイドをコードしている遺伝子の検出法および突然変異したβ−アミロイド遺伝子がひそむと疑われる細胞または組織中での突然変異体 β−アミロイドをコードしている遺伝子の特異的検出法に関している。そのような方法は、前記遺伝子の効果を妨げ、またそれを検出するため、前記遺伝子を含んでいると疑われる細胞または組織を本発明に従ったオリゴヌクレオチドと接触させることから成っている。本発明の別の態様は、β−アミロイドをコードしている遺伝子中に突然変異を持つと疑われる動物の診断および治療法に関している。そのような方法は、この遺伝子の発現を調節するため、この遺伝子の過剰発現または突然変異により生じる病状を処置するため、またはそれらの診断を果たすために、動物または細胞または組織または動物からの体液を本発明に従ったオリゴヌクレオチドと接触させることから成っている。発明の詳細な説明アミロイド斑の中心の細胞外フィラメントの主成分はその名が示すようにデンプンではな（蛋白質である。アミロイド蛋白質はアミロイド−シスと総称されている種々の疾患で異なっており、アミロイド−シスは正常または突然変異アミロイド蛋白質の沈着により特徴付けられている。アミロイドは最初、アルツハイマー病の患者の脳膜の血管から単離され、β−蛋白質と名付けられた小さな蛋白質から成り立っていることが発見された。続いてアルツハイマー患者の脳からの老人斑の単離アミロイド核が同一のβ−蛋白質から成り立っていることが発見された。このβ−アミロイドは約４０アミノ酸長の小さな蛋白質であり、β−アミロイド前駆蛋白質（βＡＰＰ）と称される長い（７７０アミノ酸）前駆蛋白質のカルボキシル末端から誘導される。βＡＰＰ蛋白質をコードしている遺伝子は染色体２１上に位置している；このことはこの染色体の余分なコピーを持つダウン症候群の患者が若い年令でβ−アミロイド沈着が進行し、アルツハイマー病の徴候を示すことを説明するものと信じられている［５ｅｌｋｏｅ、Ｄ、Ｊ、（１９９１）。５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ、２６５＋６８−７８］。正常加齢とアルツハイマー病間の差異は病理学的には主として質というよりも量の問題である。多くの人々は７０または８０の年令ではいくらかの神経原線維変性および老人斑が増加している。しかしながら、年令を合わせた対照と比較してアルツハイマー病の患者は成熟斑および変性の数が多い（ある時には非常に）。広がった前アミロイド斑はアルツハイマー病患者の脳組織に生じていることが観察されており、成熟神経性斑よりも実際にたくさん存在する。非常に感度の高い分子プローブを用いると、広がった斑は大脳皮質（認識機能に関する脳の領域で痴呆症の徴候に関係する）のみでなく脳の他の領域でも検出されている。１０代または２０代で死亡するダウン症候群の患者（必然的なアルツハイマー症候群が現れる前でも）には多くのそのような広がった斑が存在していた。それ故、β− アミロイドの沈着は関与するニューロンの成熟斑の発達に先立つものである。従って、β−アミロイドの異常な蓄積はアルツハイマー病の徴候というより原因であると信じられている。この蓄積は多（の遺伝的機構により起こることが可能である。β−アミロイド蛋白質沈着はまたアルツハイマー病患者の脳膜、皮膚、腸およびある種の別の組織の血管中および周囲に観察されている。従って、β−アミロイド沈着に係わる過程は脳に限定されるものではない。これらの沈着の傾向が血管の近くであることはアルツハイマー病は循環起源を持つことが知られているある種の全身性アミロイド蛋白質と類似していることを示唆している。血管壁の上皮細胞へのβ−アミロイドの局在化は脳内に蓄積したβ−アミロイドの起源は血流かもしれないことを示唆している［５ｅｌｋｏｅ、Ｄ、Ｊ、（１９９１）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ、２６５：６３−７８］ｏ従って全身的処置が可能であろう。本発明はβＡＰＰ遺伝子発現の調節のためのオリゴヌクレオチドを提供する。家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）として知られているアルツハイマー病の遺伝性形もまた遺伝的に異種起源である。ＦＡＤに苦しめられている家族について実施された研究では、い（っかの家族においてアルツハイマー病を持つ各人が皆、 β−アミロイド　ペプチド領域内であるβＡＰＰ遺伝子のコドン７１７に突然変異を持っていたことが示されている。［コドン７１７（７７０中の）はしばしば異なった転写番号性はシステムに従ってコドン６４２　（６９５中の）と称される］。印象的なことに、これらの突然変異はＤＮＡレベルでは同一ではないが、各々はアミノ酸７１７をバリンから他のアミノ酸（イソロイシン、フェニルアラニンまたはグリシン等）に変える単一塩基突然変異である［Ｇｏａｔｅ　ｅｔ　ａｌ。（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ　３４９ニア０４−７０６；Ｍｕｒｒｅｌｌ　ｅｔａ＋、（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５４：９７−９９；Ｃｈａｒｔｉｅｒ−Ｈａｒｌｉｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ　３５３：８４４−８４６１゜ＦＡＤを起こすことが知られているＤＮＡ突然変異および生じるアミノ酸突然変異は表１に示されている。表１家族性アルツハイマー病におけるコドン７１７での突然変異正常：　ＧＴＣＡＴＡ　ＧＣＧ　ＡＣＡ　ＧＴＧ　ＡＴＣＧＴＣＡＴＣＡＣｖａｔ　ｉｌｅ　ａｌａ　ｔｈｒ　ｖａｌ　ｉｌｅ　ｖａｔ　ｉｌｅ　ｊｊ・・・　・・・　・・・　・・・　・・・　・・・ＴＴＣ・・・　・・・・・　・拳・　・・・　Φ奢・　ＩＩ−・・壷　ｐｈｅ＝　・−・・―　・・・　・・・　・・・　・・・　・・・ＧＧＣ・・・　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ｇｔｙ・・・・・コドン７１７突然変異とＦＡＤ家族におけるアルツハイマー病との強固な相関およびそのような突然変異は他では生じないことが観察されているという事実はこれらの突然変異がこれらの家族におけるアルツハイマー病の原因であることを示唆している。従って、β−アミロイド過剰蓄積はβＡＰＰ遺伝子における突然変異により直接的に起こすことができる。本発明はβＡＰＰ遺伝子の突然変異形の発現を特異的に調節できるオリゴヌクレオチドを提供する。本発明はβＡＰＰ遺伝子発現のアンチセンス調節に使用するためのオリゴヌクレオチドを使用する。本発明に関して術語“オリゴヌクレオチド″とは天然に存在する塩基とペントフラノシル基がホスホジエステル結合により連結されて形成されたポリヌクレオチドを意味している。この術語は実際上、天然に存在する化学種または天然に存在するサブユニット若しくはそれらと類似の同族体から形成された合成化学種を意味している。術語“オリゴヌクレオチド”はまた天然に存在するオリゴヌクレオチドと機能的に同様であるが天然には存在しない部分を持つ一部分を意味してもよい。従って、オリゴヌクレオチドは作り変えられた糖部分または糖量結合を持っていてもよい。これらの例としてはホスホロチオエートおよび本分野での使用が知られている他の硫黄含有種が挙げられる。い（っかの好適な実施態様に従うと、オリゴヌクレオチドの少くともいくつかのホスホジエステル結合は、その活性が調節されるべきＲＮＡまたはＤＮＡが位置している細胞領域内へ入り込むため組成物の能力を高めるような構造に置換されている。そのような置換はホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合または短鎖アルキルまたはシクロアルキル構造を含むものが好適である。別の好適な実施態様に従うと、ホスホジエステル結合は一体となって本質的に非イオン性および非キラルである別の構造またはキラルであるがエナンチオマー特異的な構造に置換されている。当業者は本発明の実施に使用するための別の結合を選択できるであろう。オリゴヌクレオチドはまた少くともいくつかの修飾がなされた塩基形を持つ化学種を含んでいてもよい。従って、天然に発見された以外のプリンおよびピリミジンも同様に使用してもよい。同様にヌクレオチド　サブユニットのペントフラノシル部分の修飾もまた、本発明の本質的教義を堅持する限りは有効であろう。そのような修飾の例は２′−〇−アルキルーおよび２°−ハロゲン置換ヌクレオチドである。本発明でを用である糖部分の２°位での修飾のいくつかの特別の例としてはＯＨ，ＳＨ，ＳＣＨ３，Ｆ、０ＣＨｓ、ＯＣＮ、Ｏ（ＣＨ２）−ＮＨ２またはＯ（ＣＨ２）−ＣＨｓ　（ここでｎは１から約１０である）および類似の性質を持つ他の置換基などが挙げられる。そのようなオリゴヌクレオチドは天然のオリゴヌクレオチド（または天然のライン沿った合成オリゴヌクレオチド）と機能的に相互変換できるがしかし、天然の構造と一つまたはそれ以上の相違を持つものとして最もよく表わすことができる。すべてのそのようなオリゴヌクレオチドはそれらがβＡＰＰ　ＲＮＡとハイブリダイズするように有効に機能する限り本発明に包含される。本発明に従ったオリゴヌクレオチドは好適には約５から約５０の核酸塩基単位を含んでいる。約８から２５の核酸塩基単位を含むオリゴヌクレオチドがより好適であり、約１２から２５ヌクレオチド単位を持つものがさらにより好適である。ヌクレオチド単位とは塩基−糖の組合せがホスホジエステルまたは他の結合を通して隣接するヌクレオチド単位に適切に結合されているものであることが認められるであろう。本発明に従って使用されるオリゴヌクレオチドは固相合成のよく知られた技術により都合良（および日常の仕事として作製されるであろう。そのような合成のための装置はＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ。ＣＡ）を含むい（つかの会社により販売されている。そのような合成のための他の手段もまた用いてもよいが、オリゴヌクレオチドの実際の合成は機械的に仕事をする人の手腕にかかっている。ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体のような他のオリゴヌクレオチドの製造に類似の技術を用いることもまた良く知られている。本発明に従うと、メツセンジャーＲＮＡは３文字遺伝コードを用いて蛋白質をコードしている情報だけでなく、５゛　−非翻訳領域、３゛　−非翻訳領域、５゛キヤツプ領域およびイントロン／エキラン連結部リボヌクレオチドとして知られている領域を形成する付随するりボヌクレオチドを含んでいることを当業者は理解するであろう。従って、オリゴヌクレオチドは本発明に従い、情報コードリボヌクレオチドに対するのと同様にこれらの付随するりボヌクレオチドの全部又は一部を標的するように処方できる。好適な実施態様において、本オリゴヌクレオチドは転写開始部位、翻訳開始部位、５゛キヤツプ領域、イントロン／エキラン接合部、コード化配列または５゛−または３゛−非翻訳領域中の配列と特異的にハイブリダイズ可能である。本発明のオリゴヌクレオチドはβＡＰＰ遺伝子から誘導されるメツセンジャーＲＮＡとハイブリダイズ可能なように設計されている。そのようなハイブリダイゼーションが達成された場合、メツセンジャーＲＮＡの正常の機能が妨害され、細胞中でその機能が調節される。妨害されるべきメツセンジャーＲＮＡの機能には蛋白質翻訳のための部位へのＲＮＡの転位、ＲＮＡからの蛋白質の実際の翻訳、一つまたはそれ以上のｍＲＮＡ種を得るＲＮＡのスプライシング、および可能であればＲＮＡに従属されているであろう独立した触媒活性のようなすべての生命の維持に必要な機能が含まれている。ＲＮＡへのそのような妨害のすべての効果はβＡＰＰ遺伝子の発現調節に対するものである。本発明のオリゴヌクレオチドは診断、治療、予防および研究用試薬およびキットに使用できる。本発明のオリゴヌクレオチドはβＡＰＰ遺伝子およびそのｍＲＮＡにハイブリダイズするので、この事実を開発するためにサンドイッチおよびその他のアッセイが容易に作製できる。さらに、本発明のオリゴヌクレオチドは優先的にβＡＰＰ遺伝子の突然変異形にハイブリダイズするので、そのようなアッセイは野生型から突然変異形へのβＡＰＰの変換についての細胞および組織のスクリーニングに対して工夫できる。このようなアッセイはβＡＰＰ遺伝子の突然変異に由来するＦＡＤの診断に用いることができる。βＡＰＰ遺伝子とオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの検出のための方法の準備は日常の作業で達成できる。そのような準備には酵素複合、放射性標識またはその他の適当な検出系が含まれるであろう。βＡＰＰまたは突然変異βＡＰＰの存在または不在を検出するためのキットもまた製造されるであろう。治療的または予防的処置のためには、オリゴヌクレオチドは本発明に従って投与される。オリゴヌクレオチドは医薬組成物中に処方され、それはオリゴヌクレオチドに加えて担体、粘稠化剤、希釈剤、緩衝剤、保存剤、界面活性剤などを含んでいてもよい。医薬組成物はまた、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔薬などの一つまたはそれ以上の活性成分をオリゴヌクレオチドに加えて含んでいてもよい。医薬組成物は局所または全身的処置が望まれるかに、および処置されるべき領域に依存して多くの方法で投与されるであろう。投与は局所的（点眼、膣内、直腸内、鼻腔内を含む）、経口、吸入または腸管外（例えば静脈内点滴、皮下、腹腔内または筋肉内注射により）であろう。局所投与のための処方には軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐剤、スプレー、水剤および散剤が含まれるであろう。通常の医薬担体、水性、粉末または油性基剤、粘稠化剤などが必要とされるであろうし、または望まれるであろう。被覆サックもまた有用であろう。経口投与のための組成物には散剤または顆粒、水または非水媒質による懸濁液または溶液、カプセル、サシエトまたは錠剤が含まれるであろう。粘稠化剤、芳香剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤または結合剤が望まれるであろう。腸管外投与のための処方には緩衝剤、希釈剤およびその他の適切な添加物を含んでいる無菌水溶液が含まれるであろう。服用量は処置されるべき状態の重症度および応答性に依存しているが、通常１日当り１回またはそれ以上の投薬で、数日から数ケ月続く処置過程の間または、治療が有効になるまでまたは疾患状態の軽減が達成されるまで続けられるであろう。当業者は容易に最適投薬量、投薬法および反復速度を決定できるであろう。以下の実施例は本発明を例示するものであって本発明をこれらと同一のものに制限するのを！図しているわけではない。オリゴヌクレオチドの合成：　非修飾ＤＮＡオリゴヌクレオチドはヨウ素で酸化する標準ホスホロアミド化学を用いて自動化ＤＮＡ合成機（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　モデル３８０Ｂ）により合成される。β−シアノエチルジイソプロピルーホスホロアミダイトはＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、ＣＡ）から購入された。ホスホロチオエート　オリゴヌクレオチドに対してはホスファイト結合の段階的チオール化のために標準酸化ボトルを３Ｈ−１，２−ベンゾチオール−３−オン　１．１−ジオキシドの０゜２Ｍアセトニトリル溶液に置き換えた。チオール化サイクル待ち時間は６８秒に延長され、キャッピング工程が続いて行われた。２′−〇−メチル　ホスホロチオエート　オリゴヌクレオチドは２’　−０−メチル　β−シアノエチルジイソブロピルホスホロアミダイト（Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ、Ｎｅｅｄｈａｍ　ＭＡ）および非修飾オリゴヌクレオチドに対する標準サイクルを用いて合成されたが、ただし、テトラゾールおよび塩基のパルス注入後の待ち工程は３６０秒に延長された。合成の開始に使用された３゛−塩基は２′− デオキシリボヌクレオチドである。２′−〇−アルキル化アデノシンおよび対応するアミダイトはＰＣＴ特許出願番号ＵＳ９１１００２４３，１９９１年１月１１日出願（本発明のごと（同一の譲受人に譲渡されており、ここに引例として含まれている）に開示されているごとく製造される。制御細孔ガラス　カラム（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）がら切断し、濃水酸化アンモニウム中５５℃で１８時間脱保護した後、オリゴヌクレオチドは２．５容量のエタノールで０．５Ｍ　ＮａＣ１から２回沈殿させることにより精製される。２０％アクリルアミド、８Ｍ尿素、４５ｍＭトリス−ポウ酸緩衝液中で分析ゲル電気泳動が実施された。オリゴデオキシヌクレオチドおよびホスホロチオエートは電気泳動により８０％以上の完全長物質であると判断された。ているβＡＰＰ−ルシフェラーゼ　レポーター遺伝子はＰＣＲ技術を用いて組立てられた。最終的な構築物は２つの工程で組立てられた。最初の工程においては β−アミロイドの５°領域のＰＣＲクローニングのためのプライマーとして使用　゛するためにオリゴヌクレオチド　プライマーが合成された。β−アミロイドｃＤＮＡ鋳型はＢｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤのＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ番号６１９１０）から購入された。クローニング過程のこの工程で使用されたオリゴヌクレオチド　プライマーは５ ’　−ＡＣＡ−ＴＴＡ−ＴＧＣ−ＴＡＧ−ＣＧＣ−ＡＧＣ−ＧＧＴ−ＡＧＧ−ＣＧＡ−ＧＡＧ−ＣＡＣ−３’　（セ：ｚス；配列Ｉ　Ｄ番■F ２４）および５’　−ＧＡＧ−＾ＴＣ−ＴＧ＾−＾ＧＣ−ＴＴＣ−ＧＴＣ−ＣＡＧ−ＧＣＧ− ＧＣＣ−ＡＧＣ−＾ＧＧ−＾−３°（アンチセンス；配列ＩＤ番号＝２５）である。これらのプライマーは鋳型として非突然変異β−アミロイドｃＤＮＡを用いる標準ＰＣＲ反応において使用される。これらのプライマーからはＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位が隣接するβ−アミロイド遺伝子の配列−１４２から＋４８（翻訳開始部位に関して）に対応する２０４塩基対のＤＮＡ生成物を産生ずることが期待される。このＰＣＲ生成物はβＡＰＰ遺伝子の５′−非翻訳および翻訳開始領域を含んでいる。ＰＣＲ生成物は常法を用いてゲルで精製、沈殿、洗浄して水に再懸濁する。この生成物は次に制限エンドヌクレアーゼＮｈｅｌおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて我々が作製したステロイド制限可能（マウス哺乳類腫瘍ウィルス　プロモーター）ルシフェラーゼ発現プラスミド内へクローン化する。プラスミド作製の第２の工程においては、βＡＰＰ遺伝子のコドン−７１７（突然変異感受性）領域のクローニングのためにプライマーが合成された。クローニング過程のこの工程のために使用されたオリゴヌクレオチドＰＣＲは５°−ＧＡＧ−＾ＴＣ−ＴＧ＾−ＡＧＣ−ＴＴＧ−ＧＴＧ−Ｃ＾＾−ＴＣＡ−ＴＴＧ−ＧＡＣ−ＴＣＡ−ＴＧ−３’　（センス：配列ＩＤ番号：２６）および５’　−ＧＡＧ−＾ＴＣ−ＴＧ＾−＾ＧＣ−ＴＴＡ−ＣＣ＾−ＣＣＣ−ＣＴＣ− ＡＧＣ−ＡＴＣ−＾ＣＣ−＾＾Ｇ−ＧＴＧ−ＡＴＧ−ＡＣ−R’　（アンチセンス：配列ＩＤ番号：２７）である。これらのプライマーは鋳型として非突然変異βＡＰＰ　ｃＤＮＡを用いる標準ＰＣＲ反応に使用される。これらのプライマーからはＨｉｎｄＩＩＩが隣接するβＡＰＰ遺伝子の配列＋４８９から＋６６０（翻訳開始部位に関して）に対応する１３５塩基対のＤＮＡ生成物が産生されることが期待される。Ｐ　ＣＩ？、生成物の精製に続いて、ＤＮＡ挿入物は制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩを用いて本過程の工程１に記載した構築物内へクローン化される。得られる発現ベクターはステロイド誘導可能ＭＨＴＶプロモーターの制御下に発現されるβＡＰＰ／ルシフェラーゼ融合ｍＲＮＡをコードしている。この融合ｍＲＮＡの翻訳はβＡＰＰ　ＡＵＧコドンでの開始に依存している。さらに、βＡＰＰ／ルシフェラーゼ融合部位での蛋白質プロセシング認識配列Ａｒｇ−ＧｌＶ　Ｇｌ　ｙｔ−：＋−Ｆしている配列（ＡＣＣ−ＡＣＣ−ＣＣＴ）を工程２のアンチセンス　プライマー内へ取り込ませた。この配列は翻訳後に特定の酵素により切断され、β−アミロイド蛋白質断片および遊離のルシフェラーゼを産生ずることが知られている。実施例３工２匡月ひ込枠す遺榊對うλん巨久乃上：　Ｑｒｅ、ｅｎｂｅｒｇ。Ｍ、Ｅ、、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ　（Ｆ、Ｍ、Ａｕ５ｕｂｅｌ、Ｒ，Ｂｒｅｎｔ、Ｒ，Ｅ、Ｋｉｎｇｓｔｏｎ、Ｄ、Ｄ、Ｍｏｏｒｅ、Ｊ、Ａ、Ｓｍｉ　ｔｈ、Ｊ、Ｇ、Ｓｅｉｄｍａｎおよびに、５ｔｒａｈ１編）、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ、ＮＹ。により記載されている方法を下記のように修正してトランスフェクションが実施される。ヒーラ細胞を５Ｘ１０５細胞／血の密度で６０ｍｍの皿に播く。総計で１０μｇのＤＮＡを各々の皿に加える（その９μｇはβＡＰＰ−ルシフェラーゼレポーター　プラスミドであり、１μｇは構成性ラウス肉腫ウィルス（ＲＳ　Ｖ）プロモーターの制御下ラットグルココチコイド　レセプターを発現するベクターである）。リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿物は３ｍＭ　ＥＧＴＡを含むトリス−緩衝化塩溶液［５０ｍＭトリス−ＣＩ　（ｐＨ７，５）、１５０ｍＭ　ＮａＣ１］で洗浄することにより１６〜２０時間後に除去される。次に細胞に１０％ウシ胎児血清を補給した新鮮な培地を加える。デキサメタシンによるレポーター遺伝子発現の活性化に先立って、この時点で細胞はアンチセンス　オリゴヌクレオチドで前処理される。実施例４細胞のオリゴヌクレオチド処理　プラスミド　トランスフェクションの直後に細胞を前もって３７°Ｃに暖めたＯｐ　ｔ　ｉ　−ＭＥＭ（Ｇ　ｉ　ｂ　ｃ　ｏ）で３回洗浄する。１０ｕｇ／ｍＩのＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウム　クロリド（ＤＯＴＭＡ）（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ、ＭＤ）を含む２ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭを各々の皿に加え、オリゴヌクレオチドを直接添加して３７℃ にて４時間インキュベートする。次に、Ｏｐ　ｔ　ｉ−ＭＥＭを除去し、オリゴヌクレオチドを含む適当な細胞増殖培地に置き換える。この時点で、細胞を０．２μＭの最終濃度までのデキサメタシンで処理してレポーター遺伝子発現を活性化させる。細胞はステロイド処理後１２〜１６時間に採取する。実施例５ルシフェラーゼ　アッセイ：　Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ、Ｍ、Ｅ、、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、（Ｆ。Ｍ、Ａｕ５ｕｂｅ　１．Ｒ，Ｂｒｅｎｔ、Ｒ，Ｅ、Ｋｉｎｇｓ　ｔｏｎ、Ｄ、Ｄ、Ｍｏｏｒｅ、Ｊ、Ａ、Ｓｍｉ　ｔｈ、Ｊ、Ｇ、Ｓｅｉｄｍａｎおよびに、５ｔｒａｈ１編）、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ、ＮＹ、により記載されているごとく、界面活性剤トリトンＸ−１００で溶解させることにより細胞からルシフェラーゼを抽出する。６２５μＭまでのルシフェリン（Ｓ　ｉ　ｇｍａ）の添加によるピーク発光の測定にはＤｙｎａｔｅｃｈ　ＭＬ１００Ｏ発光計が使用される。各々の抽出物に対し、データがアッセイの直線範囲に集まるのを確実にするため異なった量の抽出物を用いてルシフェラーゼ　アッセイを多数回実施する。オエート　オリゴヌクレオチドが前記の実施例に記載したβＡＰＰ−ルシフェラーゼ　レポーター遺伝子系を用いてスクリーニングされた。これらのオリゴヌクレオチドの塩基配列および配列ＩＤ番号は表２に示されている。１　ＧＣＣＭＡ　ＣＣＧ　ＧＧＣＡＧＣＡＴＣＧＣ２ｋＧＣＡＴＣＧＣＧ　ＡＣＣＣＴに　ＣＧＣＧＣ３ＭＡ　ＣＣＧ　ＧＧＣＡＧＣＡＴＣＧＣＧ　ＡＣホロチオエート結合を持ち、５“−および３゛末端の少くとも１つの塩基に２゜−〇− メチル　ヌクレオチド修飾をも持つように一連のオリゴヌクレオチドが設計された。得られるものは２゛−〇−メチル修飾部に“ギャップ”を持つホスホロチオエート、２′−〇−メチル化オリゴヌクレオチドである（“ギャップ”領域中のヌクレオチドは２゛−デオキシヌクレオチドである）。２′−〇−メチル化ヌクレオチドはＲＮＡａｓｅ　Ｈ切断に対し耐性であるので、デオキシ“ギャップ” はＲＮａｓｅ　Ｈ切断をオリゴヌクレオチドのこの領域、および従って標的ｍＲＮＡの所望の領域（ここではＡＵＧ）に標的させることを可能にする。これらのオリゴヌクレオチドは表３に示されている＝表３ βＡＰＰｍＲＮＡのＡＵＧ領域を標的としたギャップを持つ２′−〇−メチルホスホロチオエート　オリゴヌクレオチド（全体を通してホスホロチオエート；２ ’−０−メチルヌクレオチドはボールド体で示されている）配列ＩＤ番号−配ダレ１　ＧＣＣＡＪｕ　ＣＣＧ　ＧＧＣＡＧＣλＴＣＧＣ２ｋＧｃ　ＡＴＣＧＣ（：　ＡＣＣＣＴＧ　ＣＧＣＧＣコ　Ａ＾Ａ　ＣＣＧ　ＧＧＣＡＧＣＡ’！’ＣＧＣＧ　ｋｃ実施例８コドン７１７にＧからＡへの突然変異を持つ突然変異体βＡＰＰ−ルシフェラーゼ遺伝子発現のアンチセンス　オリゴヌクレオチド阻害：　突然変異体βＡＰＰ遺伝子のコドン７１７（このコドンでのＧからＡへの突然変異はバリンからイソロイシンヘの突然変異を生じる）［Ｇｏａｔｅ　ｅｔ　ａｌ、（１９９１）Ｎａ ±ｕｒｅ　３４９ニア０４−７０６３を標的とした一連のアンチセンス　ホスホロチオエート　オリゴヌクレオチドが前記の実施例に記載したβＡＰＰ−ルンフエラーゼ　レポーター遺伝子系を用いてスクリーニングされた。これらのオリゴヌクレオチドの塩基配列および配列ＩＤ番号は表４に示されている。突然変異体βＡＰＰコドン７１７のＧからＡへの突然変異を標的とするオリゴヌクレオチド配列Ｈ）番号：　配列：４　ＧＴＧ　ＡＴＧ　ＡＴＧ　ＡＴＣＡＣＴ５　ＧＯＴ　ＧＡＴ　ＧＡＴ　ＧＡＴ　ＣＡＣＴＧ６　ＡＧＧ　ＴＧＡ　ＴＧＡ　ＴＧＡ　ＴＣＡ　ＣＴＧ　Ｔ７　ＭＧ　ＧＴＧ　ＡＴＧ　ＡＴＧ　ＡＴＣＡＣＴ　ＧＴＣ実施例９ギヤツブを持つ２′−〇−メチル　ホスホロチオエート　オリゴヌクレオチドを用いた突然変異体βＡＰＰ−ルシフェラーゼ発現のアンチセンス阻害：　全体を通してホスホロチオエート結合を持ち、５゛　−および３′末端の少くとも一つの塩基に２’　−０−メチル　ヌクレオチド修飾をも持つように一連のオリゴヌクレオチドが設計された。得られるものは２゛−０−メチル修飾部に“ギャップ ”を持つホスホロチオエート、２’　−０−メチル化オリゴヌクレオチドである（“ギャップ“領域のヌクレオチドは２゛−デオキシヌクレオチドである）。２ ′−０−メチル化ヌクレオチドはＲＮＡａｓｅ　Ｈ切断に対し耐性であるので、デオキシ“ギャップ”はＲＮａｓｅ　Ｈ切断をオリゴヌクレオチドのこの領域および従って標的ｍＲＮへの所望の領域（ここではコドン７１７でのＧからＡへの突然変異）に標的させることを可能にする。これらのオリゴヌクレオチドは表５に示されている：表５突然変異体βＡＰＰｍＲＮＡのコドン７１７を標的とするギヤ・ノブを持つ２゛ −〇−メチルホスホロチオエート　オリゴヌクレオチド（全体を通してホスホロチオエート；２’−０−メチルヌクレオチドはボールド体で示されている）配列ＩＤ番号：　配列；４　ＧＴＧλＴＧ　ＡＴＧ　ＡＴＣλご５　ＧＯ’ｌ’　ＣＡＴ　ＧＡＴ　ＣＡＴ　ｅλＣテＧ６　人ＧＧ　’Ｊ’ＧＡ　ＴＧＡ　ＴＧＡ　ＴＣｈ　ＣＴＧ　’ ！’７　ｕＧ　Ｇ’Ｊ’Ｇ　ＡＴＧ　ＡＴＧ　ＡＴＣＡＣＴ　Ｇ’ｌ’ＣＰ遺伝子のコドン７１７（このコドンでのＧからＴへの突然変異は）くリンからフェニルアラニンへの突然変異を生じる）［Ｍｕｒｒｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５４：９７−９９コを標的とした一連のアンチセンス　ホスホロチオエート　オリゴヌクレオチドが前記実施例に記載したβＡＰＰ−ルシフェラーゼ　レポーター遺伝子系を用いてスクリーニングされた。これらのオリゴヌクレオチドの塩基配列および配列ＩＤ番号は表６に示されている。表６ βＡＰＰのＧからＴへの突然変異を標的としたオリゴヌクレオチド配列［）番号：　配列：８　ＧＴＧ　ＡＴＧ　ＡＡＧ　ＡＴＣＡＣＴ９　ＧＧＴ　ＣＡＴ　ＧＡＡ　ＧＡ ’ｓ’　ＣへＣＴＧ１０　ＡＧＧ　ＴＧＡ　ＴＧＡ　ＡＧＡ　ＴＣＡ　ＣＴＧ　Ｔ１１　ＭＧ　ＧＴＧ　ＡＴＧ　ＡＡＧ　ＡＴＣＡＣＴ　ＧＴＣ実施例１１ギャップを持つ２′−０−メチル　ホスホロチオエート　オリゴヌクレオチドを用いる突然変異体βＡＰＰ−ルシフェラーゼ発現のアンチセンス阻害：　全体を通してホスホロチオエート結合を持ち、５°　−および３′−末端に少（とも一つの２′−〇−メチル　ヌクレオチド修飾をも持つ一連のオリゴヌクレオチドが設計された。得られるものは２゛−〇−メチル修飾部に“ギャップ”を持つホスホロチオエート　２′−〇−メチル化オリゴヌクレオチドである（“ギャップ” 領域中のヌクレオチドは２゛−デオキシヌクレオチドである）。２′−〇−メチル化ヌクレオチドはＲＮＡａｓｅ　Ｈ切断に対し耐性であるので、デオキシ“ギャップ”はＲＮａｓｅ　Ｈ切断をオリゴヌクレオチドのこの領域、および従って標的ｍＲＮＡの所望の領域（ここではコドン７１７でのＧからＴへの突然変異）に標的させることを可能にする。これらのオリゴヌクレオチドは表７に示されている：表７突然変異体βＡＰＰｍＲＮＡのコドン７１７領域を標的とするギャップを持つ２ ’−〇−メチルホスホロチオエート　オリゴヌクレオチド（全体を通してホスホロチオエート；２°−Ｏ−メチルヌクレオチドはボールド体で示されている）配列［Ｄ番号：　配列：８　ＧＴＧ　ＡＴＧ　ＡＡＧ　ＡＴＣｋｃＴ９　ＧＧＴ　ＧＡＴ　ＧＭ　ＧＡＴ　ＣＡＣＴＧ１０　人ＧＧ　ＴＣＡＴＧＡ　ＡＧＡ　ＴＣＣＡＴＧ　Ｔ１１　１ＡＧ　Ｇ”ｌ”Ｇ　ＡＴＧ　ＡＡＧ　ＡＴＣＡＣ’ｒ　ＧＴＣ実施例１２突然変異体βＡＰＰ−ルシフェラーゼ遺伝子発現のアンチセンス　オリゴヌクレオチド阻害：　突然変異体βＡＰＰ遺伝子のコドン７１７（このコドンでのＴからＧの突然変異はバリンからグリシンへの突然変異を生じる）［Ｃｈａｒｔｉｅｒ−Ｈａｒｌｉｎ　Ｃｔ　ａｌ、（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ　３５３：８４４− ８４６］が前記実施例に記載したβＡＰＰ−ルシフェラーゼ　レポーター遺伝子系を用いてスクリーニングされた。これらのオリゴヌクレオチドの塩基配列および配列ＩＤ番号は表８に示されている。嚢」− βＡＰＰのＴからＧへの突然変異を標的とするオリゴヌクレオチド配列ＩＤ番号：　配列：１２　ＧＴＧ　ＡＴＧ　ＣＣＧ　ＡＴＣＡＣＴ１３　ＧＧＴ　ＧＡＴ　ＧＣＣＧＡＴ　ＣＡＣＴＧ１４　ＡＧＧ　ＴＧＡ　ＴＧＣＣＧＡ　ＴＣＡ　ＣＴＧ　Ｔ１５　ＡＡＧ　ＧＴＧ　ＡＴＧ　ＣＣＧ　ＡＴＣＡＣＴ　ＧＴＣ実施例１３ギャップを持つ２’　−０−メチル　ホスホロチオエート　オリゴヌクレオチドを用いる突然変異体βＡＰＰ−ルシフェラーゼ発現のアンチセンス阻害：　全体を通してホスホロチオエート結合を持ち、５゛−および３゛−末端に少（とも一つの塩基に２’　−０−メチル　ヌクレオチド修飾をも持つ一連のオリゴヌクレオチドが設計された。得られるものは２’−０−メチル修飾部に“ギャップ”を持つホスホロチオエート　２′−〇−メチル化オリゴヌクレオチドである（“ギャップ“領域中のヌクレオチドは２°−デオキシヌクレオチドである）。２″　 −〇−メチル化ヌクレオチドはＲＮＡａｓｅ　Ｈ切断に対し耐性であるので、デオキシ“ギャップ”はＲＮａｓｅ　Ｈ切断をオリゴヌクレオチドのこの領域および従って標的ｍＲＮＡの所望の領域（ここではコドン７１７でのＴからＧへの突然変異）に標的させることを可能にする。これらのヌクレオチドは表９に示されている：前立突然変異体βＡＰＰｍＲＮＡのコドン７１７を標的とするギャップを持つ２′− 〇−メチル　ホスホロチオエート　オリゴヌクレオチド（全体を通してホスホロチオエート；２’−０−メチルヌクレオチドはボールド体で示されている）配列ＩＤ番号二　配列：１２　ＧＴＧ　ＡＴＣＣＣＧ　ＡＴＣ１０丁１：ｌ　ＧＧＴ　ＧＡＴ　ＧＣＣＧＡＴ　（ＪＣτＧ１４　ＡＧＧ　’ｊ’Ｇλ　ＴＧＣＣＧＡ　ＴＣＡ　ＣＴＧ　Ｔ１５　ＡＡＧ　ＯＡＧ　ＡＴＧ　ＣＣＧ　ＡＴＣＡＣＴ　ＧＴＣＣ）（Ｃ１ｏｎｅｔｉｃｓ、Ｓａｎ　Ｄｉａｇｏ　ＣＡ）をＥＧＭ−ＵＶ培地（Ｃ１ｏｎｅ　ｔ　１ｃｓ）中で培養する。第２および第６継代の間の細胞を使用する。９６− ウェルプレート中で増殖させた細胞を前もって３７℃に暖めたＯｐｔｉ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、ＮＹ）で３回洗浄する。各々１０ｔｔｇ／ｍＩのＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］　 −Ｎ。Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウム　クロリド（ＤＯＴＭＡ、ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を含む１００μＩのＯｐｔｉ−ＭＥＭを各々のウェルに加える。オリゴヌクレオチドは領　２μｍＣｅｎ　ｔ　ｒｅｘ酢酸セロルースフイルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅ　Ｉ　ｌ、Ｋｅｅｎｅ、ＮＨ）を通して遠心分離することにより無菌化する。オリゴヌクレオチドは２０Ｘ保存溶液としてウェルに加え、３７°Ｃで４時間インキュベートする。培地を除き、指定された濃度のオリゴヌクレオチドを含む適当な増殖培地１５０μｌに置き換える。インキュベーションの最初の４時間の間ＤＯＴＭＡをオリゴヌクレオチドと伴に存在させるとオリゴヌクレオチドの力価を少くとも１００倍増加させた。この力価の増加はオリゴヌクレオチドの細胞取り込みの増加と相関した。実施例１５ＨＵＶＥＣ細胞におけるβＡＰＰ遺伝子発現に対する活性のためのアンチセン玉 −ま里１７ノ止字！」ざとＵ辷ロ辷！二乙色去二丑２ダニ　ＨＵＶＥＣ細胞によるβＡＰＰ発現はＥＬＩＳＡにおいて特異的抗体（抗−β−アミロイド、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いると定量化できる。細胞は９６ウエル　マイクロタイタープレート中でコンフルエントになるまで増殖させ、ダル勺コ　リン酸緩衝化塩溶液（Ｄ−ＰＢＳ）のようなカルシウムおよびマグネシウムを含む緩衝化等張液で緩かに３回洗浄する。細胞は続いて２５℃にてＤ−ＰＢＳに希釈した１がら２％のバラホルムアルデヒドで直接マイクロタイタープレート上に固定する。細胞を再びＤ−ＰＢＳで３回洗浄する。マイクロタイタープレート上の非特異的結合部位は３７℃で１時間Ｄ−ＰＢＳに溶解した２％ウシ血清アルブミンでブロックする。細胞は３７℃で１時間ブロッキング溶液に希釈した抗体とインキュベートする。Ｄ−ＰＢＳで細胞を３回洗浄することにより非結合抗体を除去する。細胞に結合した抗体は３７℃で１時間、ブロッキング溶液で１：１０００に希釈したビオチニル化ヤギ抗マウスＩｇＧ　（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ、ＭＤ）とインキュベートすることにより検出される。細胞をＤ−ＰＢＳで３回洗浄し、次に３７℃にて１時間１　：　１０００に希釈したβ−ガラクトシダーゼに複合されたストレプトアビジン（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とインキュベートする。細胞を各々５分間づつ３回Ｄ−ＰＢＳで洗浄する。特異的抗体に結合されたβ−ガラクトシダーゼの量は３．３ｍＭクロロフェノールレッド−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５０ｍＭ　リン酸ナトリウム、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２；ｐＨ＝７．２の溶液で３７℃にて２がら１５分間発色させることにより決定される。生成物の濃度はＥＬＩ　ＳＡマイクロタイタープレート　リーダー中５７５ｎｍの吸光度を測定することにより決定される。

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数＝１本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：ｙｅｓ配列：ＧＣＣＡＡ＾ＣＣＧＧ　ＧＣＡＧＣＡＴＣＧＣ２０配列番号：２配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：ｙｅｓ配列：＾ＧＣＡＴＣＧＣＧＡ　ＣＣＣＴＧＣＧＣＧＧ　２０配列番号：３配列の長さ＝２０配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：ｙｅｓ配列：＾＾＾ＣＣＧＧＧＣＡ　ＧＣＡＴＣＧＣＧＡＣ２０配列番号：４配列の長さ＝１５配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：ｙｅｓ配列：配列番号＝５配列の長さ：１７配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列：ＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧ　ＡＴＣＡＣＴＧ　１７配列番号＝６配列の長さ＝１９配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：ｙｅｓ配列：ＡＧＧＴＧＡＴＧＡＴ　ＧＡＴＣＡＣＴＧＴ　１９配列番号：１３配列の長さ：１７配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：ｙｅｓ配列：ＧＧＴＧＡＴＧＣＣＧ　ＡＴＣＡＣＴＧ　１７配列番号＝１４配列の長さ：１９配列の型：核酸鎖の数＝１本鎖トポロジー：直鎮状アンチセンスニｙｅｓ配列：＾ＧＧＴＧＡＴＧＣＣＧＡＴＣＡＣＴＧＴ　１９配列番号＝１５配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー・直鎖状アンチセンス：ｙｅｓ配列：＾＾ＧＧＴＧＡＴＧＣＣＧＡＴＣＡＣＴＧＴ　Ｃ２１配列番号：１６配列の長さ＝１５配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：ｙｅｓ配列：ＧＴＧＡＴＧＡＣＧＡ　ＴＣＡＣＴ　１５配列番号＝１７配列の長さ：１７配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー；直鎖状アンチセンス：ｙｅｓ配列：ＧＧＴＧＡＴＧＡＣＧ　ＡＴＣＡＣＴＧ　１７配列番号：１８配列の長さ＝１９配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：ｙｅｓ配列：＾ＧＧＴＧＡＴＧＡＣＧＡＴＣＡＣＴＧＴ　１９配列番号：１９配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数；１本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：ｙｅｓ配列：ＡＡＧＧＴＧＡＴＧＡ　ＣＧＡＴＣＡＣＴＧＴ　Ｃ２１配列番号＝２０配列の長さ：１５配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：ｙｅｓ配列：ＧＴＧＡＴＧＮＮＧＡ　ＴＣＡＣＴ　１５配列番号・２１配列の長さ＝１７配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー、直鎖状アンチセンス：ｙｅｓ配列：ＧＧＴＧＡＴＧＮＮＧ　ＡＴＣＡＣＴＧ　１７配列番号：２２配列の長さ：１９配列の型：核酸鎖の数＝１本鎖トポロジー：直鎮状アンチセンス：ｙｅｓ配列：＾ＧＧＴＧＡＴＧＮＮ　ＧＡＴＣＡＣＴＧＴ　１９配列番号：２３配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数＝１本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス：ｙｅｓ配列：ＡＡＧＧＴＧＡＴＧＮ　ＮＧＡＴＣＡＣＴＧＴ　Ｃ２１配列番号：２４配列の長さ：３３配列の型：核酸鎖の数＝１本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス＝ｎ。配列：＾ＣＡＴＴＡＴＧＣＴ　ＡＧＣＧＣＡＧＣＧＧ　ＴＡＧＧＣＧＡＧＡＧ　ＣＡＣ３３配列番号：２５配列の長さ：３４配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス＝ｎ。配列：ＧＡＧＡＴＣＴＧＡＡ　ＧＣＴＴＣＧＴＣＣＡ　ＧＧＣＧＧＣＣＡＧＣＡＧＧＡ　３４配列番号＝２６配列の長さ＝３５配列の型・核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状アンチセンス＝ｎ。配列：ＧＡＧＡＴＣＴＧＡＡ　ＧＣＴＴＧＧＴＧＣ＾＾ＴＣＡＴＴＧＧＡＣＴＣＡＴＧ　３５配列番号＝２７配列の長さ＝４４配列の型；核酸鎖の数：１本鎖トポロジー、直鎖状アンチセンス二〇〇配列：ＧＡＧＡＴＣＴＧＡＡＧＣＴＴＡＣＣＡＣＣＣＣＴＣＡＧＣＡＴＣＡＣＣ＾＾ＧＧＴＧＡ　ＴＧＡＣ４４手　続　補　正　書平成６年り月／ｇツ田

Claims

【特許請求の範囲】

１．βＡＰＰ遺伝子に由来する選択されたＤＮＡまたはＲＮＡと特異的にハイプリダイズ可能な８から２５のヌクレオチド単位を含むオリゴヌクレオチド。
２．βＡＰＰ遺伝子の翻訳開始部位またはコドン７１７と特異的にハイプリダイズ可能な請求項第１項に記載のオリゴヌクレオチド。
３．薬学的に受容可能な担体中の請求項第１項に記載のオリゴヌクレオチド。
４．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位間の少くとも一つの結合基が硫黄含有種を含む請求項第１項に記載のオリゴヌクレオチド。
５．前記硫黄含有種がホスホロチオエートを含む請求項第４項に記載のオリゴヌクレオチド。
６．ヌクレオチドの少くとも一つが２′位で修飾されている請求項第１項に記載のオリゴヌクレオチド。
７．修飾が２′−Ｏ−アルキルである請求項第６項に記載のオリゴヌクレオチド。
８．βＡＰＰ遺伝子に由来する選択されたＤＮＡまたはＲＮＡと特異的にハイブリダイズ可能で、および配列：５′・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・３′【配列があります】（配列ＩＤ番号：２０）【配列があります】（配列ＩＤ番号：２１）【配列があります】（配列ＩＤ番号：２２）【配列があります】（配列ＩＤ番号：２３）の一つから成るオリゴヌクレオチド。
９．薬学的に受容可能な担体中の請求項第８項に記載のオリゴヌクレオチド。
１０．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位間の少くとも一つの結合基が硫黄含有種を含む請求項第８項に記載のオリゴヌクレオチド。
１１．前記硫黄含有種がホスホロチオエートを含む請求項第１０項に記載のオリゴヌクレオチド。
１２．ヌクレオチドの少くとも一つが２′位で修節されている請求項第８項に記載のオリゴヌクレオチド。
１３．ヌクレオチド修飾が２′−Ｏ−アルキルである請求項第１２項に記載のオリゴヌクレオチド。
１４．βＡＰＰ遺伝子に由来する選択されたＤＮＡまたはＲＮＡと特異的にハイブリダイズ可能で配列：５′・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・３′ 【配列があります】（配列ＩＤ番号：１）【配列があります】（配列ＩＤ番号：２）【配列があります】（配列ＩＤ番号：３）【配列があります】（配列ＩＤ番号：４）【配列があります】（配列ＩＤ番号：５）【配列があります】（配列ＩＤ番号：６）【配列があります】（配列ＩＤ番号：７）【配列があります】（配列ＩＤ番号：８）【配列があります】（配列ＩＤ番号：９）【配列があります】（配列ＩＤ番号：１０）【配列があります】（配列ＩＤ番号：１１）【配列があります】（配列ＩＤ番号：１２）【配列があります】（配列ＩＤ番号：１３）【配列があります】（配列ＩＤ番号：１４）【配列があります】（配列ＩＤ番号：１５）の一つから成るオリゴヌクレオチド。
１５．薬学的に受容可能な担体中の請求項第１４項に記載のオリゴヌクレオチド。
１６．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位間の少くとも一つの結合基が硫黄含有種を含む請求項第１４項に記載のオリゴヌクレオチド。
１７．前記硫黄含有種がホスホロチオエートを含む請求項第１６項に記載のオリゴヌクレオチド。
１８．ヌクレオチドの少くとも一つが２′位で修飾されている請求項第１４項に記載のオリゴヌクレオチド。
１９．ヌクレオチド修飾が２′−Ｏ−アルキルである請求項第１８項に記載のオリゴヌクレオチド。
２０．βＡＰＰ遺伝子を含んでいる組織または細胞を、βＡＰＰ遺伝子に由来する選択されたＤＮＡまたはＲＮＡと特異的にハイブリダイズ可能で８から２５のヌクレオチド単位を含んでいるオリゴヌクレオチドと接触させることから成るβ ＡＰＰ遺伝子発現の調節法。
２１．前記オリゴヌクレオチドがβＡＰＰ遺伝子の翻訳開始部位またはコドン７１７と特異的にハイブリダイズ可能である請求項第２０項に記載の方法。
２２．前記オリゴヌクレオチドが配列：５′・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・３′【配列があります】（配列ＩＤ番号：２０）【配列があります】（配列ＩＤ番号：２１）【配列があります】（配列ＩＤ番号：２２）【配列があります】（配列ＩＤ番号：２３）の一つから成る請求項第２０項に記載の方法。
２３．前記オリゴヌクレオチドが配列：５′・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・３′【配列があります】（配列ＩＤ番号：１）【配列があります】（配列ＩＤ番号：２）【配列があります】（配列ＩＤ番号：３）【配列があります】（配列ＩＤ番号：４）【配列があります】（配列ＩＤ番号：５）【配列があります】（配列ＩＤ番号：６）【配列があります】（配列ＩＤ番号：７）【配列があります】（配列ＩＤ番号：８）【配列があります】（配列ＩＤ番号：９）【配列があります】（配列ＩＤ番号：１０）【配列があります】（配列ＩＤ番号：１１）【配列があります】（配列１Ｄ番号：１２）【配列があります】（配列ＩＤ番号：１３）【配列があります】（配列ＩＤ番号：１４）【配列があります】（配列ＩＤ番号：１５）の一つから成る請求項第２０項に記載の方法。
２４．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位間の結合基の少くとも一つが硫黄含有種を含む請求項第２０項に記載の方法。
２５．前記硫黄含有種がホスホロチオエートを含む請求項第２４項に記載の方法。
２６．オリゴヌクレオチドの少くとも一つのヌクレオチドが２′位で修飾されている請求項第２０項に記載の方法。
２７．ヌクレオチド修飾が２′−Ｏ−アルキルである請求項第２６項に記載の方法。
２８．細胞または組織をβＡＰＰ遺伝子に由来する選択されたＤＮＡまたはＲＮＡに特異的ハイブリダイズ可能な８から２５のヌクレオチド単位を含んでいるオリゴヌクレオチドと接触させることから成る細胞または組織中のβＡＰＰ遺伝子の存在の検出法。
２９．前記オリゴヌクレオチドがβＡＰＰ遺伝子の翻訳開始部位またはコドン７１７と特異的にハイブリダイズ可能である請求項第２８項に記載の方法。
３０．前記オリゴヌクレオチドが配列：５′・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・３′【配列があります】（配列ＩＤ番号：２０）【配列があります】（配列ＩＤ番号：２１）【配列があります】（配列ＩＤ番号：２２）【配列があります】（配列ＩＤ番号：２３）の一つから成る請求項第２８項に記載の方法。
３１．前記オリゴヌクレオチドが配列：５′・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・３′【配列があります】（配列ＩＤ番号：１）【配列があります】（配列ＩＤ番号：２）【配列があります】（配列ＩＤ番号：３）【配列があります】（配列ＩＤ番号：４）【配列があります】（配列ＩＤ番号：５）【配列があります】（配列ＩＤ番号：６）【配列があります】（配列ＩＤ番号：７）【配列があります】（配列ＩＤ番号：８）【配列があります】（配列ＩＤ毒号：９）【配列があります】（配列ＩＤ番号：１０）【配列があります】（配列ＩＤ番号：１１）【配列があります】（配列ＩＤ番号：１２）【配列があります】（配列ＩＤ番号：１３）【配列があります】（配列ＩＤ番号：１４）【配列があります】（配列ＩＤ番号：１５）の一つから成る請求項第２８項に記載の方法。
３２．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位間の少くとも一つの結合が硫黄含有種を含んでいる請求項第２８項に記載の方法。
３３．前記硫黄含有種がホスホロチオエートを含んでいる請求項第３２項に記載の方法。
３４．オリゴヌクレオチドの少くとも一つのヌクレオチドが２′位で修飾されている請求項第２８項に記載の方法。
３５．ヌクレオチド修飾が２′−Ｏ−アルキルである請求項第３４項に記載の方法。
３６．βＡＰＰを含んでいることが疑われる細胞または組織をオリゴヌクレオチド：５′・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・３′【配列があります】（配列ＩＤ番号：１６）【配列があります】（配列ＩＤ番号：１７）【配列があります】（配列ＩＤ番号：１８）【配列があります】（配列ＩＤ番号：１９）の一つと接触させ、および同じ細胞または組織試料をオリゴヌクレオチド：５′・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・３′ 【配列があります】（配列ＩＤ番号：４）【配列があります】（配列ＩＤ番号：５）【配列があります】（配列ＩＤ番号：６）【配列があります】（配列ＩＤ番号：７）【配列があります】（配列ＩＤ番号：８）【配列があります】（配列ＩＤ番号：９）【配列があります】（配列ＩＤ番号：１０）【配列があります】（配列ＩＤ番号：１１）【配列があります】（配列ＩＤ番号：１２）【配列があります】（配列ＩＤ番号：１３）【配列があります】（配列ＩＤ番号：１４）【配列があります】（配列ＩＤ番号：１５）の一つと接触させることから成る、突然変異と野生型βＡＰＰに対する特定のオリゴヌクレオチドの異なった親和性に基づいた突然変異体βＡＰＰの検出法。
３７．少くとも一つのオリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位間の少くとも一つの結合基が硫黄含有種を含む請求項第３６項に記載の方法。
３８．前記硫黄含有種がホスホロチオエートを含む請求項第３７項に記載の方法。
３９．オリゴヌクレオチドの少くとも一つのヌクレオチドが２′位で修飾されている請求項第３６項に記載の方法。
４０．ヌクレオチド修飾が２′−Ｏ−アルキルである請求項第３９項に記載の方法。
４１．動物をβＡＰＰ遺伝子に由来する選択されたＤＮＡまたはＲＮＡに特異的にハイブリダイズ可能な８から２５のヌクレオチド単位を含むオリゴヌクレオチドと接触させることから成るβ−アミロイドの過剰生産により生じる状態の処置法。
４２．前記オリゴヌクレオチドが配列：５′・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・３′【配列があります】（配列ＩＤ番号：２０）【配列があります】（配列ＩＤ番号：２１）【配列があります】（配列ＩＤ番号：２２）【配列があります】（配列ＩＤ番号：２３）の一つから成る請求項第４１項に記載の方法。
４３．前記オリゴヌクレオチドが配列：５′・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・３′【配列があります】（配列ＩＤ番号：１）【配列があります】（配列ＩＤ番号：２）【配列があります】（配列ＩＤ番号：３）【配列があります】（配列ＩＤ番号：４）【配列があります】（配列ＩＤ番号：５）【配列があります】（配列ＩＤ番号：６）【配列があります】（配列ＩＤ番号：７）【配列があります】（配列ＩＤ番号：８）【配列があります】（配列ＩＤ番号：９）【配列があります】（配列ＩＤ番号：１０）【配列があります】（配列ＩＤ番号：１１）【配列があります】（配列ＩＤ番号：１２）【配列があります】（配列ＩＤ番号：１３）【配列があります】（配列ＩＤ番号：１４）【配列があります】（配列ＩＤ番号：１５）の一つから成る請求項第４１項に記載の方法。
４４．オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位間の少くとも一つの結合基が硫黄含有種を含む請求項第４１項に記載の方法。
４５．前記硫黄含有種がホスホロチオエートを含む請求項第４４項に記載の方法。
４６．オリゴヌクレオチドの少なくとも一つのヌクレオチドが２′位で修飾されている請求項第４１項に記載の方法。
４７．ヌクレオチド修飾が２′−Ｏ−アルキルである請求項第４６項に記載の方法。