JPH06511245A - テトラフェニルポルフィン誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 テトラフェニルポルフィン誘導体 この発明は、概してテトラフェニルポルフィリン触媒を使用する触媒的抗体制御 方法に関するものである。この発明はまた、テトラフェニルポルフィリン誘導体 、それらを含むハブテン、ハブテンを含む抗原および抗原に対して産生ずる抗体 に関するものであり、それらは上記方法で適用される。

金属ポルフィリン類は、多くのタイプの化学反応、特に酸化的変換、例えば水酸 化反応、脱アルキル化反応、エポキシド化反応、脱飽和反応など（例えば、ディ クソン、Ｍおよびウェブ、Ｅ、Ｃ１ｒエンザイムズ」、第３版、アカデミツク・ プレス、１９７９、コリンズ、Ｊ、Ｒ，等、１９９１、「ジャーナル・オブ・ア メリカン・ケミカル・ソサエティー」、１１３．２７３６−２７４３およびレテ イ、ＡＥｌ等、１９８８、「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー 」、２６３．１３７３３−１３７３８）における触媒として作用し得る。しかし ながら、金属ポルフィリン類の化学−および／または位置−選択的攻撃（または 酸化）の選択性は普通は乏しいものであるため、所与の基質に関して予め定める ことはできない。通常金属ポルフィリン触媒を使用すると、異性体および非異性 体生成物の錯体混合物が得られ、これらを分離するのは難しい。

生成物の形成を制御するため、最近では抗体仲介反応における触媒またはコファ クターとしての金属ポルフィリン類の使用が提案されており、この場合、前記抗 体はこの方法に位置選択性を付与する（シュバノくヒエル、Ａ、Ｗ、、ウェイレ ノ１ウス、Ｍ、１．、オーディター、Ｍ、Ｍおよびラーナー、Ｒ，Ａ、、１９８ ９、「ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー」、１１１．２ ３４４〜２３４６）。著者らの提案は、基質および基質に結合させるべく選択さ れた金属ポルフィリンの錯体により動物を免疫化することである。次に、ポルフ ィリンおよび基質の両方に相補的な結合部位を有する抗体を単離する。次いで、 ポルフィ１ノン触媒を前記抗体に結合させることにより、正確な配向の基質のみ が結合および反応され得ると提案されている。

シュババヒエル等は、ひざらかいヘモンアニン（ＫＬＨ）または牛血清アルブミ ン（Ｂ　Ｓ　Ａ）に錯体を結合させ、標準モノクローナル技術を適用することに より、合成メゾ−テトラ−キス（４−カルボキシフェニル）ポルフィンのＦｅ” およびＣ。

３゛錯体に対する抗体の製造に成功した。しかしながら、提案された方法のそれ 以上の段階については実施されなかった。

ＥＰＯ３０５８７０は、反応物および触媒の遷移状態錯体に対応はするが、それ とは異なるハブテンを選択することにより化学反応用免疫近接触媒が製造される という類似概念をあい味な形で開示している。次に、ハブテンから誘導した抗原 を用いて免疫応答を刺激すると、ハブテンに対して抗体が産生ずる。次いで、抗 体を単離する。次に、「変換性」ハブテンを用いて、抗体に触媒を共有結合させ 、「修飾」抗体を製造する。次いて、修飾抗体を単離して使用する。これらの修 飾抗体は、標的分子における結合の開裂を触媒し、多くは酵素の形をとる。前記 抗体は、反応を゛速め、部位特異性を導入すると言われている。

ＥＰＯ３０５８７０は、触媒が一般的酸一塩基性触媒、求核触媒、親電子的触媒 および金属触媒であり得ることを示唆している。金属ポルフィリンについては具 体的には述べられていない。また、多くの方法の場合、これらの触媒の多くに関 する遷移状態錯体の単離は、不可能ではなくても、難しいことが充分に立証され 得る。いずれにしても、ＥＰＯ３０５８７０は、修飾抗体が実際に製造されたと いうことを説明する具体的な製造例を全（開示していない。

ＰＣＴ特許公開Ｗ○９２１０１７８１は、金属ポルフィリン誘導体をコファクタ ーまたは触媒として使用する類似方法を開示している。また、生成する抗体がア ルキルまたはアリール結合部位を有するようにアルキル基により誘導体化された ポルフィリンが漠然とした形で提案されている。前記誘導体を用いることにより 、反応の進行に必要とされる相対的配向および間隔て実際の触媒および基質によ く似たハブテンが生成される。次に、ハブテンを用いて、正確な配向で触媒およ び基質に相補的な結合部位を有する抗体を生成させる。ＥＰＯ３０５８７０に記 載された方法とは異なり、前記抗体は、使用前に触媒をそれらに共有結合させる 必要は無い。

不運なことに、上記ＰＣＴ公開で開示された金属ポルフィリン誘導体からハブテ ンを製造するのは単純なことてはない。これは、ポルフィリンに好都合な結合点 が無いため、基質とポルフィリンが結合し得ないからである。

従って、容易に基質に結合してハブテンを形成し得る金属ポルフィリン誘導体の 提供がこの発明の対象である。また、金属ポルフィリン類を含むハブテン、ハブ テンを含む抗原、抗原に対して産生じた抗体、前記抗体を用いる方法および上記 方法で使用される触媒を提供することも対象である。

−態様において、この発明は、式（Ｉ）Ｒ５ ［式中、 各Ｒ１は、独立して−Ｈ，−Ｆ、−Ｃ１、−Ｂｒ、−ＣＨ３、−ＣＯＯＨ，−５ ゜３Ｈ，−Ｃｏｏ−Ｃ白アルキル、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ００Ｈ１−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ ＱＯ−Ｃ白−アルキル、−８０３−Ｃ白−アルキル、−Ｎｏ！、フェニル、−Ｎ Ｈ２および−ＮＨ−Ｃｏ−Ｃ，−，−アルキルから選択され、各Ｒ６およびＲ２ ’は、独立して−Ｈ，−Ｆ、＝ｃｉ、−Ｂｒ１　ＣＨｓ、−ＣＯＯＨ，ＳＯ３Ｈ ，ＮＯ！およびフェニルから選択され、各Ｒｓ　＊　タハＲｓ’　ハ、独立しｒ −Ｈ，−Ｆ、−ＣＩ、−Ｂｒ、−ＣＨ３、−０−ＣＩ−＠　７Ｊ１．ｔキル、− Ｎｏ２、’ニアニー／ｌｚ、−ＮＨ，および−ＮＨＣｏ　ＣＩ−ａ　フルキルか ら選択され、 Ｒ３またはＲ３’の少なくとも一つは、独立して（ａ）−ＮＨ−Ｃｏ−アルキレ ン−３Ｎ−イミダゾールまたは−ＮＨ−Ｃｏ−アルキレンー３−ピリジン（ただ し、各アルキレンは２〜４個の炭素原子を有する）、および（ｂ）　−ＣＯ−ア ルキレン−３Ｎ−イミダゾールまたは−ＣＯ−アルキレンー３−ピリジン（ただ し、各アルキレンは３または４個の炭素原子を有する）から選択されるか、また は対向するフェニル基における一対のＲ３およびＲ３゛は、−緒になって（ｃ） 　−Ｎ　Ｈ−ＣＯ−アルキレン−３−ピリジル−５−アルキレン−Ｃｏ−ＮＨ− または−〇〇−アルキレンー３−ピリジルー５−アルキレン−Ｃｏ−（ただし、 各アルキレンは２〜４個の炭素原子を有する）を形成し、Ｒ４は、ａ）水素原子 、ｂ）式（１）の化合物を別の化合物に結合させ得る反応性中心または基を含む リンカ−基、またはＣ）除去可能な保護基であり、各Ｒ８およびＲ８゛は、独立 して−Ｈ１−Ｆ、−Ｃ１，−Ｂｒまたは−ＣＮである］で示される化合物、上記 化合物の酸付加塩並びに上記化合物のナトリウム、カリウムおよびカルシウム塩 類を提供する。

Ｒ４がリンカ−基ｂ）である場合、それは好ましくは式−（ＣＨ２）−Ｒ５（Ｃ Ｈ２）、−（Ｒ，）、−Ａ（ただし、Ｒ５は−（ＣＯ）−１（ＳＯ２）−または −（ＰＯＯＨ）−であり、Ｒ６は一〇−１−８−または−（ＮＨ）−であり、ｍ 、ｎおよびｐの各々は独立して０または１であり、Ａは反応性脱離基または中心 であるか、またはｐが１である場合Ａはまた水素原子であり得る）で示される。

さらに好ましくは、ｍＳｎおよびｐは０であり、Ａはハロゲン、特にＣ１または Ｂ「である。特に好ましいリンカ−基は−ＣＯＣｌであり、これは別の分子の官 能基、例えば−ＯＨまたは−ＮＨ２と容易に反応して架橋基−ＣＯ−Ｏ−または −〇〇−ＮＨ−を形成し得る。

Ｒ４が除去可能な保護基Ｃ）である場合、それは好ましくは試薬、例えば２．３ −ジクロロ−５，６−ジシアツベンゾキノン（ＤＤＱ）による酸化に対して＞Ｎ −ＮＨ２基を保護し、酸性またはアルカリ性条件下での加水分解により除去され 得る保護基である。好ましい保護基はＣＦ３−Ｃｏ−であり、これは緩いアルカ リ性加水分解により除去され得る。

好ましくは、ＲｏはＨ１化合物の水溶度を高める基または化合物に担体蛋白を結 合させ得る官能基である。さらに好ましくは、少な（とも１個のＲ１は−ＮＨ− ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨまたはＮＨ２であり、少なくとも１個のＲ３は−ＣＯ ＯＨ，−ＣＯＯＣＨ３または−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ００ＨＴあり、残りはＨである。

好ましくはＲ２およびＲ２゛は全てＨである。好ましくは１個のＲ３またはＲ３ ゛、または一対のＲ８およびＲ３゛は、Ｒ３およびＲ８“に関する上記ａ）、ｂ ）およびＣ）基から選択される。残りのＲ３およびＲ３゛は好ましくはＨである 。Ｒ８およびＲａ’は好ましくはＨである。

式（Ｉ）において、Ｒ４が閣−ＣＨ５ＣｓＨ４ＳＯｚ−および０２　Ｎ　Ｃ６Ｈ ４ＣＯ−である化合物は知られているが、これら２つの基は結合に関与する反応 性原子または基をもたないためリンカ−基ではなく、それらは＞Ｎ−Ｎ＜結合を 破壊せずに除去され得る保護基でもない。

ＣＩ−ａアルキルは、６個以下の炭素原子を含む分枝鎖状または非分枝鎖状アル キル基であり得る。メチルが好ましい。

リンカ−基は付加された窒素原子に容易に結合され得るため、Ｎ−アミノポルフ ィリン化合物を使用するとハプテンの合成は非常に容易になる。次いで、所望の 基質または所望の基質の官能化誘導体はリンカ−基に結合され得る。

本発明はまた、反応において金属ポルフィリン触媒および基質の遷移状態を模倣 するハプテンの製造に使用される、上述の式（１）の化合物を提供する。

本発明はまた、上述の式（１）の化合物の製造方法であって、ａ）式（■）（た だし［４はＨである）で示される化合物の場合、式（Ｉ）（ただし、Ｒ４は保護 基である）で示される化合物を脱保護し、ｂ）式（Ｉ）（ただし、Ｒ４はリンカ −基である）で示される化合物の場合、式（Ｉ）（ただし、Ｒ４は水素である） で示される化合物を、２つの反応性中心または基（ただし、これらのうちの一つ は＞Ｎ−ＮＨ，基との結合を形成し得る）を含むリンカ−基の前駆体と反応させ 、 Ｃ）式（■）（ただし、Ｒ４は保護基である）で示される化合物の場合、ｌ）式 （ＩＩＩ）（式中、Ｒ３、Ｒ３、Ｒ６゛、Ｒ８、Ｒ８゛、Ｒ８およびＲ８゛は前 記の意味である）で示される化合物の＞Ｎ−ＮＨ，基を保護し、ｉｆ）式（ＩＩ Ｉ）の化合物を式（１）の対応する化合物に酸化する という段階を含む方法を提供する。

段階ａ）において、脱保護段階は、保護基の性質により異なるが、好ましくは酸 性またはアルカリ性加水分解により行なわれる。保護基が−ＣＦ　ｓ　ＣＯ−で ある場合、例えば６５℃〜７５℃の温度でＥｔＯＨ／ＫＯＨまたはＥｔＯＨ／Ｃ ａ（ＯＨ）２を用い、暖いアルカリ性加水分解が使用され得る。

段階ｂ）では、リンカ−基の前駆体は、例えばＸ　（ＣＨｚ）−Ｒｉ−（ＣＨｚ ）−−（Ｒｓ）−Ａ（ただし、Ｘは反応性脱離基または原子、好ましくはＣ１ま たはＢｒであり、他の記号は前記と同じ意味である）であり得る。リンカ−基が 一〇〇−ＣＩ−である場合、適当な前駆体はホスゲンまたはジホスゲンである。

　。

段階Ｃ）において、保護基がＣＦ３−Ｃｏ−である場合、式（ＩＩＩＸただし、 Ｒ４は水素である）で示される化合物は、極性非水性溶媒中で無水トリフルオロ 酢酸と反応し得る。酸化段階ｉｉ）は、不活性溶媒、例えばメチレンクロリド中 、酸化剤、例えばＤＤＱを用いて行なわれ得る。

式（ＩＩＩ）の出発物質は、キャロット、Ｈ，Ｊ、、１９７９、「テトラヘドロ ン」、３５．１４５５−６の記載に従い対応するポルフィリンをＯ−■−トルエ ンースルホニルヒドロキシルアミンと反応させることにより製造され得る。

別の態様において、この発明は、基質の残基に結合した金属ポルフィリンコファ クターを含むハプテンを提供し、前記ハプテンは、反応において金属ポルフィリ ン触媒および基質の遷移状態を模倣し、金属ポルフィリンコファクターは式（Ｉ Ｉ）（式中、 Ｒ３、Ｒ２、Ｒ２゛、Ｒ８、Ｒ３゛、Ｒ８およびＲ８゛は式（１）における前記 の意味と同じであり、 Ｒ４゛は、金属ポルフィリン触媒を基質の残基に連結する架橋基であり、Ｍは少 なくとも４の配位数を有する金属イオンである）を有するか、その酸付加塩また はそのナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩類である。

架橋基は任意の適当な架橋基であり得るが、ただし残基に関する金属ポルフィリ ンコファクターの空間的配向が、反応中に対応する金属ポルフィリン触媒および 基質により形成される遷移状態の場合に可能な限り近くなるように選択されるべ きである。一旦遷移状態が同定され、基質の残基が選択されると、架橋基の選択 は常用の手順で行なわれる。

好ましくは、架橋基は、式−（ＣＨ２）、−Ｒｆｉ−（ＣＨ２）ゎ−（Ｒ８）、 −［ただし、Ｒ６は−（ＣＯ）−１（５０２）−または＝（ＰＯＯＨ）−であり 、Ｒ６は一〇−１−８−または−（ＮＨ）−であり、ｌは０または１であり、ｎ はＯまたは１であり、ｐは０または】である］で示される。好ましくはｍ、ｎお よびｐは０である。具体例において、架橋基は−（ＳＯ２）−０−または−Ｃ（ ＝Ｏ）−０−である。

ハブテンは、架橋基が中央に位置するアミノ基から軸方向に突出するという利点 を有するものとする。従って、ハブテンは遷移状態における対応する基質および 金属ポルフィリン触媒の相対的位置をより密接に模倣し得る。

少なくとも１個のＲ３またはＲ３“が独立して（ａ）−ＮＨ−Ｃｏ−アルキレン −３Ｎ−イミダゾールまたは−ＮＨ−ＣＯ−アルキレンー３−ピリジン（ただし 、各アルキレンは２〜４個の炭素原子を有する）、および（ｂ）−Ｃｏ−アルキ レン−３Ｎ−イミダゾールまたは−ＣＯ−アルキレンー３−ピリジン（ただし、 各アルキレンは３または４個の炭素原子を有する）、または対向しているフェニ ル基の一対のＲ８およびＲ３’が一緒になって（ｃ）−ＮＨ−Ｃｏ−アルキレン −３−ピリジル−５−アルキレン−Ｃｏ−ＮＨ−または−ＣＯ−アルキレンー３ −ピリジル−５−アルキレン−ＣＯ−（ただし、各アルキレンは２〜４個の炭素 原子を有する）を形成する場合から選択されるとき、複素環における窒素原子は 金属イオンＭに対する第５のリガンドとして作用する。第５リガンドを有するポ ルフィリンの側面は保護されており、ハブテンを含む抗原に対して産生される抗 体との接触には至り得ない。

基質は、酸化的変換、例えば水酸化、脱アルキル化、エポキシド化または脱飽和 反応が遂行される分子であればよい。残基は、基質分子に対応し、架橋基に結合 される基である。残基は、それを架橋基に結合する追加的官能基を含み得るとい う点で基質とは異なり得る。別法として、残基は、基質に存在する原子または官 能基を通して架橋基に結合し得る。いずれの場合でも、残基は、金属ポルフィリ ン触媒との反応経路において基質の遷移状態を模倣する形で架橋基に結合する。

例えば、基質は、水酸化される非活性化１次、２次または３次炭素原子を含み得 る。次いで、残基は、水素が炭素原子から除去されたかまたは水素が架橋基に結 合している官能基により置換された基質分子を含む。−具体例で、シクロスポリ ンＡ（ＣｓＡ）からＳ　ｅｔ’−シクロスポリンＡの製造において、基質はシク ロスポリンＡであり、残基はＳｅｔ’のＯＨを通して架橋基に結合されたＳ　ｅ ｔ’−シクロスポリンＡである。ヒドロキソの一〇−は、残基または架橋基の一 部であると考えられ得る。

別の例として、残基は、式〉Ｎ−アルキレノ−（ただし、アルキレノは分枝鎖状 、非分枝鎖状、置換または非置換アルキレン基であり得る）で示される基を含み 得る。この場合、基質は式〉Ｎ−アルキルで示される基である。

上記基質の一具体例は、Ｌｅｕ’のＮ−メチルが水酸化されてＮ−ヒドロキシメ チルロイノン４を生じるシクロスポリンＡである。

別の例では、残基は、式−〇−アルキレノー（式中、アルキレノは前記の意味で ある）で示される基を含み得る。その場合、基質は式−〇−アルキルで示される 基を有し、ハブテンは一〇−の脱アルキル化および水酸化における遷移状態を模 倣する。

上記基質の一具体例は、−〇−アルキルが番号１５を付した炭素原子のメトキン 基に対応するアスコマイシン（ＥＰ１８４１６２に記載されている）である。そ の場合、残基はアスコマイ／ンであるが、ただしメトキシ基の水素原子の一つは 架橋基との結合により置換されている。その場合、ハブテンは、アスコマイシン 別の例では、残基は、炭素原子が架橋基に結合している芳香族基を含み得る。

その場合、基質はまた芳香族基を含み、ハブテンは芳香族環の水酸化における遷 移状態を模倣する。

別の例では、残基は、エポキシ環を模倣する、式（式中、ＲｆｉおよびＲ１３は 各々独立して置換炭素原子である）で示される基を含み得る。この場合、基質は エポキシド化される基ＲＨ”ＲＨを含む。

さらに別の例において、残基は、基 ＲＩ　４　ＣＨ２ＣＨ−Ｒｌ　４゜ （式中、Ｒ１４はＨまたは非置換もしくは置換アルキル基であり、Ｒ１４°は非 置換または置換アルキル基である） を含み得る。その場合、基質は、ＣＨ２−ＣＨ２間の単結合が脱飽和される基Ｒ １４−ＣＨ２−ＣＨ２Ｒ＋＋’を含む。平易に述べると、基Ｒ１４およびＲ１， ゛における置換基は、Ｃ−Ｃ結合の脱飽和、従って炭素原子の一つからの水素原 子の除去を可能にしなければならない。具体例は、ジヒドロ−ＭｅＢｍｔ’シク ロスポリンＡからシクロスポリンＡへの脱飽和およびパルプロ酸から４．５−デ ビドローバルブロ酸への脱飽和である。

好ましい一例ては、Ｒ２、Ｒ２゛、Ｒ３およびＲ８゛の各々はＨであり、少なく とも１個のＲ１は−ＮＨＣｏ　ＣＨ２ＣＨ２Ｃ０ＯＨまたはＮＨ，であり、その 池はＨである。１個（７）Ｒ＋が　ＮＨＣｏ　ＣＨ２ＣＨｚ　Ｃ０ＯＨまたはＮ Ｈ２Ｆあるハブテンを使用すると、ハブテンへの担体蛋白の結合が容易になる。

またハブテンの溶解度も高められ得る。またハブテンの溶解度は、フェニル基の パラ位をカルボキシまたはエステル基で置換することにより高められ得る。

好ましくは金属イオンＭは、それがハブテンで配位結合した場合特に酸素に対し て不活性となるものである。例えば、金属イオンはＮｉ”、Ｚｎ”またはＳｎ” であり得る。

さらに別の態様において、本発明は、上述の免疫原応答を誘発し得る担体蛋白に 結合されたハブテンを含む抗原を提供する。

担体蛋白は、ハブテンのポルフィリン部分、特にＲ，基の一つに連結され得る。

別法として、担体蛋白はハブテンの残基部分に連結され得る。担体蛋白は、適当 な蛋白、例えばひざらかいヘモシアニン（ＫＬＨ）、うし血清アルブミン（Ｂ　 Ｓ　Ａ）または卵アルブミンであり得る。

別の態様において、この発明は、上述のハブテンに結合する抗体またはそのフラ グメントを提供する。好ましくは、抗体はモノクローナル技術により製造される 。抗体またはフラグメントは、一方はポルフィリン部分に対するものであり、他 方は残基部分に対するものである、２つの結合ポケットを有するという利点を有 する。

別の態様において、この発明は、基質が金属ポルフィリン触媒の存在下で反応に 付され、特異的な位置異性体（ｒｅｇｉｏｉｓｏｍｅｒ）または光学対車体純粋 化合物が生成される反応を制御するのに適した抗体の製造方法であって、基質お よび触媒の遷移状態に対応する上記ハブテンを提供し、は乳類、好ましくはマウ スにおいて免疫応答を刺激して、ハブテンに対する抗体を産生じ、そして ハブテンに特異的な免疫応答からの抗体を単離および精製することを含む方法を 提供する。

好ましくは抗体はモノクローナル抗体である。

この方法は、さらにクロマトグラフィーカラムに固定化またはトレーサー蛋白に 結合された上記ハブテンに抗体を結合することによる抗体の選択段階を含み得る 。

別の態様において、この発明は、金属ポルフィリン触媒の存在下で基質を酸化し 、特異的位置異性体または光学対車体を生成する方法であって、基質および触媒 の遷移状態を模倣するハブテンに特異的な上記抗体を提供し、抗体に結合する金 属ポルフィリン触媒を提供し、酸化剤を提供し、そして 抗体、触媒、酸化剤および基質を合わせて基質を反応させることを含む方法を提 供する。

好ましくは、金属ポルフィリン触媒は、Ｆ　ｅ”、Ｃｒ３４およびＭｎ”から選 択される金属イオンにより配位結合する。

式（１）のＮ−アミノ−ポルフィリンは、適当な溶媒、例えばクロロホルム中テ トラフェニルポルフィリンをＯ−ｍ−トルエンスルホニルヒドロキシルアミンと 反応させ、Ｎ−アミノテトラフェニルクロリンを製造することにより合成され得 る。Ｎ−アミノテトラフェニルクロリンは、クロマトグラフィーを用いて単離お よび精製され得る。次いで、適当な保護基、例えばトリフルオロアセチル基が導 入されて、導入されたアミノ基が保護され、化合物は酸化されてＮ−（保護基） アミノ−テトラフェニルポルフィリンが得られる。次に保護基は除去され、適当 なリンカ−または架橋基が付加され得る。Ｎ−トンルーアミノテトラポルフィリ ンが生成される類似方法は、キャロツト、Ｈ，Ｊ、、１９７９、「テトラヘドロ ン」、３５．１４５５−６頁に記載されている。キャロットは、除去可能な保護 基を使用しなかったため、アミノテトラフェニルポルフィリンを得られなかった が、記載された方法は容易に適合され得る。第５リガンドをもつポルフィリンの 製造方法は、例えばメウニア等、１９８８、「イノ−ガニツク・ケミストリー」 、２７．１６１により知られている。

基質の残基は、まず所望の生成物（すなわち反応したときには基質）を合成また は供給することにより製造され得る。これは、古典的化学経路の使用またはポル フィリン触媒を用いた直接水酸化により行なわれ得る。例えば、Ｎ−ヒドロキシ メチルロイシン’−ＣｓＡは、モノペルオキシフタル酸マグネシウムの存在下ポ ルフィリン触媒を用いてＣｓＡを反応させることにより製造され得る。次いで、 生成物は、例えば縮合により、アミノポルフィリンの架橋基に共有結合される。

採用される方法は、目的生成物により異なるが、ポルフィリンのアミノ化により 簡便化される。縮合段階で形成された付加体は、り６マトグラフイーを用いて単 離および精製され得る。

次いで付加体は、例えば金属イオンの塩を適当な溶媒に溶がし、付加体を還流さ せることにより、適当な金属イオンと錯体を形成する。金属イオンは、導入され た窒素およびポルフィリンの３個のピロール窒素原子間で配位結合する。Ｄ−３ ｅｔ’−ＣｓＡハブテンの製造に関する反応式を下記に示す。

他のハブテンも同様の方法により製造され得る。例えば、残基をさらに官能化す ることにより、担体蛋白がそれに結合され得るハブテンを製造するため、下記の 反応式が採用され得る。

抗原は、ハブテン／担体蛋白複合体を免疫原性にする担体蛋白をハブテンに結合 することにより製造される。担体蛋白は、アミノ基形態のＲ１基の１つを供給す ることによりハブテンに共有結合し得、次いで担体蛋白およびハブテン間に架橋 を形成する。適当な方法は、リチャーズ等、１９９０、「カレント・リサーチ・ イン・フォトシンセシス」、３．６９５−８頁に開示されている。残基部分は担 体蛋白の結合用にさらに別の官能基をもつ必要がないため、残基部分とは対向し てハブテンのポルフィリン部分に担体蛋白を結合させる利点は、それが一般的に 適用され得ることである。しかしながら、官能基が残基部分に存在するかまたは 合成により導入され得ると、担体蛋白はそれに結合され得る。担体蛋白をハブテ ンに結合する他の方法は、ハラダ、Ａ９等、１９９０、「ケミストリー・レター ズ」、９１７−９１８頁および１９９１、「ケミストリー・レターズ」、９５３ −９５６頁に開示されている。

次に、抗原を用いてマウスを免疫化し得る。良好な応答を与えるマウスのひ臓細 胞を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを製造する。次に、ハブテンに特異的 なモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを選択する。これらのハイブリ ドーマ技術は慣用的であり、適当な技術は例えばジャコブ、Ｊｌ、シュルツ、Ｐ Ｇｌ、スガサワラ、Ｒｏおよびボーウェル、Ｍ９．１９８７、「ジャーナル・オ ブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティーＪ、１０９．２１７４−２１７６頁、 ケイナン、Ｅｌ等、１９９０、「ピュア・アンド・アプライド・ケミストリー」 、６２．２０１３−２０１９頁およびハラダ、Ａｏ等、１９９０、「ケミストリ ー・レターズ」、９１７−９１８頁に開示されている。

またハブテンを用いて、様々なハイブリドーマにより製造された抗体から所望の 抗体が単離および精製され得る。所望の抗体に結合する放射性標識抗体を製造す る必要がないため、これは顕著な利点である。これは、ハブテンに結合する抗体 を選択することにより、例えばアフィニティークロマトグラフカラムにハブテン を固定化またはそれらを放射性標識し、抗体をそれらに結合させることにより行 なわれ得る。別法として、慣用的技術は、ハブテンの誘導体に対して抗体を産生 させ、放射線免疫検定法でこれらの抗体を用いることにより使用され得る。

一旦所望の抗体が単離されると、抗体をコードするＤＮＡ配列を決定または抗体 のアミノ酸配列を決定することができる。一旦これが為されると、抗体結合領域 を含むフラグメントまたは蛋白ドメインが構築され得る。これを行う方法はＷ０ ９０１０７８６１に記載されている。

次いで、選択および精製された抗体を反応で用いると、ＷＯ９２１０１７８１記 載の方法と同様の方法で所望の生成物が製造され得る。抗体のポケットにはまり 得る金属ポルフィリン触媒が提供される。次に金属ポルフィリン触媒、基質およ び抗体を合わせる。次いで、酸素供給源を制御条件下で加える。所望ならば、触 媒は当業界で周知の通り反応前に抗体に共有結合され得る。別法として、触媒は 抗体から別々に加えられ、その過程中に抗体に結合し得る。基質は、触媒に対し て正しい配向である場合のみ抗体およびポルフィリンにより形成される空洞に入 り、所望の生成物を製造することができる。

例えば、下記方法を用いることにより、ＣｓＡのＤ　−Ａ　ｌａ＠はＤ　−Ｓ　 ｅｔ”に変換され得る。次いで、触媒、ＣｓＡおよびアミノポルフィリン−架橋 基−Ｄ　−Ｓ　ｅｔ”−ＣｓＡ抗原に対して産生した抗体を適当な溶媒中で混合 する。次に、酸素供給源を制御条件下で加える。正確な配向をもつＣｓＡは、抗 体のポケットに入り１、メチル基を提供して金属−酸素基に水酸化され得る。次 いで水酸化Ｄ−８ｅｒ・−ＣｓＡを除去する。必要ならば、触媒を除去し、再生 する。

別の例では、ＣｓＡのロイシン４のＮ−メチル基は、下記方法を用いることによ り４−Ｎ−ヒドロメチルロイシンに変換され得る。次いで、触媒、ＣｓＡおよび アミノポルフィリン−架橋基−Ｎ−ヒドロメチルロイシン’−ＣｓＡ抗原に対し て産生した抗体を適当な溶媒中で混合する。次に、酸素供給源を制御条件下で加 える。正確な配向をもつＣｓＡは、抗体のポケットに入って結合し、ロイシン４ のＮ−メチル基をポルフィリンの金属−酸素基に提供することができる。次に、 水酸化Ｎ−ヒドロメチルロイシン’−ＣｓＡを除去する。

同様の方法は他の全ての反応にも使用され得る。酸素原子の供給源は、Ｈ！０２ 、ヨードソベンゼン、モノペルオキシフタル酸マグネシウム、Ｎａ０Ｃ１、ＫＨ ＳＯ５などから選択され得る。

水酸化、脱アルキル化、エポキシド化、脱飽和等され得る複数部位を有する基質 は選択的に攻撃され得ることにより、目的部位のみが改変されるものとする。

同様に、反応時ジアステレオマーを形成し得るブロキラル中心を有する基質は、 選択的に反応に付され得ることにより、１つのジアステレオマーのみが形成され る。同様に、単一光学対掌体生成物は、通常反応時にラセミ体を形成する基質か ら製造され得る。

実施例Ｉ Ｎ−アミノ−５，１０，１５，２０−テトラフェニル−２１Ｈ，２３Ｈ−ポルフ ィリン−誘導体およびＮ−ヒドロキシメチルロイシン４−シクロスポリンＡから 形成されるハブテン。

１１、テトラフェニル−ポルフィリンからのＮ−アミノ−テトラフェニル−クロ リン。

１０ｇのテトラフェニルポルフィリンを５００ｆｆｉｌの温クロロホルムに溶か す。

次に溶液を２０℃に冷却し、９．８ｇのＯ−メシチルスルホニルヒドロキンルア ミンをそれに加える。次に、溶液を室温で２０時間撹はんする。次に、緑色反応 混合物を１時間６０℃に加熱し、２Ｎ炭酸ナトリウムをクロロホルムと共に加え る。

次に、結晶性残留物（１０ｇ）をカラムクロマトグラフィー（５００ｇアロツク スＮ、活性■）を用いて分離する。クロロホルムで溶離後、７．５ｇの付加体が 得られる。

次に、クロロホルムエタノール（１００・０６〜１．０比）混合物を用いて６８ ０■ｇのＮ−アミノ−テトラフェニル−クロリンを溶離する。

１．２．　Ｎ−トリフルオロアセチルアミノ−テトラフェニル−クロリン。

６３１ｍｇのＮ−アミノ−テトラフェニル−クロリンを、３Ｑ＋ｉｌの無水ツメ チル−ホルムアミドおよび２ｍｌのピリジンに溶かす。次に、１２２ｍｇの４− ジメチル−アミノピリジン（１ミリモル）を加え、２０℃で３ｍｌのメチルクロ リドに２３１−ｇの無水トリフルオロ酢酸（１１ミリモル）を溶かした溶液を５ 分間かけて滴下する。次に、溶液を１０分間撹はんする。次に、反応混合物を濃 縮し、残留物を２Ｎ炭酸ナトリウムおよびクロロホルムと共に振り混ぜ、次に水 で１回洗浄する。

８５０ｍｇのＮ−１−リフルオロアセチルアミノ−テトラフェニル−クロリンが 得られる。

１．３．　Ｎ−トリフルオロアセチルアミノ−テトラフェニル−ポルフィリン。

５Ｑｍｌのジクロロメタンに８５０ｍｇのＮ−）リフルオロアセチルアミノ−テ トラフェニル−クロリンを溶かした溶液を６８１ｍｇ（３ミリモル）のＤＤＱと 混合し、５時間還流する。次に、反応混合物を２Ｎ炭酸ナトリウム中で１回およ び水中で１回振り混ぜる。次に、残留物（７８０ｍｇ）をエタノール（６５０＋ ｅｇ）から結晶化し、次いでクロロホルム−エタノール混合物から再結晶化する と、４３０ｍｇのＮ−トリフルオロアセチルアミノ−テトラフェニル−ポルフィ リンが得られる。

１４、Ｎ−アミノ−テトラフェニル−ポルフィリン。

４０ｍ１のエタノール中に４００ｍｇのＮ−トリフルオロアセチルアミノ−テト ラフェニル−ポルフィリンを含む懸濁液を、１０ｍ１のエタノールに０．５ｇの 水酸化カルシウムを溶かした溶液と混合する。次に、混合物を７０〜７５℃で３ ０分間撹はんする。次に、沈澱物を室温に冷却し、ろ過し、エタノールで洗浄す る。次に、沈澱物をクロロホルム−メタノール混合物から結晶化すると、２８０ ｍｇのＮ−アミノ−テトラフェニル−ポルフィリンが得られる。マススペクトル のピーク：ＭＨ’　６３０、［ＭＨ−ＮＨ２］Ｈ’　６１５、および他のピーク 　２１５．２３７．２５５．２７３．２８９．３０７．３４３．３９１．４１９ ．５３９．６４６および７３０゜ １．５．Ｎ−アミノ−テトラフェニル−ポルフィリンとＮ−ヒドロキシメチルロ イノン４−シクロスポリンＡの縮合。

４４．９ｆｆ１ｇの９７％ジホスゲンの溶液を、２ｍｌのジクロロメタンと混合 する。

生成した溶液を０〜５℃に冷却し、次いで５ｍｌのジクロロメタンに２４４１ｇ のＮ−ヒドロキシメチルロイシン４−シクロスポリンＡを溶かした溶液を１５分 間かけて滴下する。次に、溶液を０℃で１５分間撹はんし、１＋＋１のピリジン および８ｍｌのジクロロメタンに１２６のＮ−アミノ−テトラフェニル−ポルフ ィリンおよび２５ｍｇの４−ジメチルアミノピリジンを溶かした溶液を急速に加 える。反応混合物を室温で２時間反応させ、次いで２Ｎ炭酸ナトリウムおよびジ クロロメタンを加える。次に、残留物（４３０ｍｇ）をカラムクロマトグラフィ ー（６５ｇのアロマウス・ベーノック、活性ＴＩ、クロロホルム）を用いて精製 する。３４０１ｇの縮合生成物が得られる。

１．６゜段階１５．の縮合生成物のニッケル錯体の生成。

３００ｆｆ１ｇの縮合生成物を５Ｑｍｌのクロロホルム溶液に溶かす。３０■ｌ のメタノールに０．８ｇのン酢酸二ソケル４水和物を溶がした溶液を加え、混合 物を１時間還流する。次いて、溶液を還元し、クロロホルムと１回および水と１ 回振り混ぜる。残留物をカラムクロマトグラフィー（５６ｇのシリカゲル、アセ トン：ヘキサン１：２）を用いて精製する。１９０ｍｇのニッケル錯体が得られ 、第３級ブチルメチルエーテルおよび少量の石油エーテルを用いてこれを再結晶 化する。

実施例２ Ｎ−アミノ−５，１０，１５，２０−テトラフェニル−２１８，２３Ｈ−ポルフ ィリン−誘導体およびセリン６−シクロスポリンＡのハブテン。

２１、Ｎ−アミノ−テトラフェニル−ポルフィリンを実施例１、段階１．１゜〜 １４．の記載と同様にして製造する。

２２、セリン８−シクロスポリンＡとＮ−アミノ−テトラフェニル−ポルフィリ ンの縮合。

全体的に実施例１段階１５．に記載された方法と同様にして５ｍｌのメチルクロ リド中２４４ｍｇのセリン３−シクロスポリンＡを、１２６ｍｇのＮ−アミノ− テトラフェニル−ポルフィリンと縮合する。３５０ｍｇの縮合生成物が得られる 。

２．３１段階２２の縮合生成物のニッケル錯体の製造。

生成物を０．８ｇのノ酢酸ニッケル４水和物を含む溶液と還流する。２００ｍｇ のニッケル錯体が得られ、第３級−ブチルメチルエーテルおよび少量の石油エー テルを用いてこれを再結晶化する。マススペクトルのピークニーＭＨ’　１ｓ７ ｓおよび他の主要ピーク、５３８．６００．６１４．６３０．６５６゜実施例３ 実施例２のハブテンから形成される抗原。

段階２．３．から得られたハブテンを、ビス［２−オキソ−３−オキサジノシニ ル］ホスフィンクロリド（ＢＯＰ）／ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ ）を用いてツメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中そのベンゾトリアゾールエステル として活性化する。次にこれを、ｐＨ８，５で２．５：１のＤＭＳ○・ホウ酸緩 衝液に蛋白（ＫＬＨ，ＢＳＡまたは卵アルブミン）を溶かした溶液に加える。５ ：１のハブテン；蛋白化学量を用いて、蛋白の過剰誘導体化および沈澱を阻止す る。４時間後、反応混合物を燐酸緩衝食塩水に対して透析し、有機溶媒を除去す る。各蛋白に対するフンシュゲートが別々に得られる。

実施例４ 抗体の生成。

ＩＲＣＦＩマウスに麻酔をかけ、腹腔を外科的に開いてひ臓に接近する。ひ線表 面に、実施例３から得られたＫＬＨコンジュゲートを含むエタノール性溶液を綿 棒で塗る。マウスを同様の方法で２２日目に免疫化する。ポリスチレンマイクロ タイタープレートの壁に吸収された遊離ハブテンまたはＢＳＡ誘導体に対するＥ ＬＩ　ＳＡ分析により、血清力価を２７日目に測定する。抗体はまた、Ｓ　ｅｔ ’　−ＣｓＡ生成物およびニッケル・モノ−ｐ−アミノ−テトラフェニルポルフ ィリン対照のコンシュケートとの部分反応性を有する。これは、ハブテンの基質 および触媒成分の両方を認識する抗体が血清中に存在することを示している。

実施例３から得られるＢＳＡおよびＫＬＨコンジュゲートをリビ（Ｒｉｂｉ）ア ジュバントに加え、腹腔内注射を用いて６匹のＩＲＣＩマウスを免疫化する。１ ４日目、マウスをベントナイトに吸収させたコンジュゲートて追加抗原刺激し、 １７日目に血清の試料採取を行う。高い血清力価を示す３匹のマウスをさらにコ ンジュゲートで追加抗原刺激し、３１日目に殺す。２匹のマウスからのひ臓を、 ５ｐ２１０骨髄腫細胞およびＰＥＧを用いる標準融合プロトコルで使用する。Ｂ ＳＡコンジュゲートに特異的な抗体を分泌する安定したクローンが単離される。

抗体は、アフィニティークロマトグラフに固定化された遊離ハブテンを用いて選 択および精製され得る。

国際調査報告 ＋＊イｍｍｅｌＡｓｓｌｌｃｅｌｌａｓｌｌａ　ＰＣＴ／ＥＰ　９２１０２２８ ３国際調査報告 フロントページの続き （８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ （ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、　ＭＲ， ＳＮ、　ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　Ｃ５，Ｆ Ｉ、　ＨＵ。

Ｊ　Ｐ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　Ｎ０２ＰＬ、　Ｒ Ｏ，ＲＵ、　ＳＤ、　ＵＳ

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．基質の残基に結合した金属ポルフィリンコファクターを含むハプテンであっ て、前記ハプテンは反応において金属ポルフィリン触媒および基質の遷移状態を 模倣するものであり、金属ポルフィリンコファクターが、式（ＩＩ）▲数式、化 学式、表等があります▼ＩＩ［式中、 各Ｒ１は、独立して−Ｈ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−ＣＨ３、−ＣＯＯＨ、−Ｓ Ｏ３Ｈ、−ＣＯＯ−Ｃ１−６アルキル、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＯＨ、−ＣＨ＝ＣＨ −ＣＯＯ−Ｃ１−６−アルキル、−ＳＯ３−Ｃ１−６−アルキル、−ＮＯ２、フ ェニル、−ＮＨ２および−ＮＨ−ＣＯ−Ｃ１−６−アルキルから選択され、各Ｒ ２およびＲ２′は、独立して−Ｈ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−ＣＨ３、−ＣＯＯ Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＮＯ２およびフェニルから選択され、各Ｒ３またはＲ３′は 、独立して−Ｈ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−ＣＨ３、−Ｏ−Ｃ−１−６−アルキ ル、−ＮＯ２、フェニル、−ＮＨ２および−ＮＨ−ＣＯ−Ｃ１−６−アルキルか ら選択されるか、または Ｒ３またはＲ３′の少なくとも一つは、独立して（ａ）−ＮＨ−ＣＯ−アルキレ ン−３Ｎ−イミダゾールまたは−ＮＨ−ＣＯ−アルキレン−３−ピリジン（ただ し、各アルキレンは２〜４個の炭素原子を有する）、および（ｂ）−ＣＯ−アル キレン−３Ｎ−イミダゾールまたは−ＣＯ−アルキレン−３−ピリジン（ただし 、各アルキレンは３または４個の炭素原子を有する）から選択されるか、または 対向するフェニル基における一対のＲ３およびＲ３′は、一緒になって（ｃ）− ＮＨ−ＣＯ−アルキレン−３−ピリジル−５−アルキレン−ＣＯ−ＮＨ−または −ＣＯ−アルキレン−３−ピリジル−５−アルキレン−ＣＯ−（ただし、各アル キレンは２〜４個の炭素原子を有する）を形成し、各Ｒ８およびＲ８′は、独立 して−Ｈ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒまたは−ＣＮであり、Ｒ４は、金属ポルフィリ ン触媒を基質の残基に連結する架橋基であり、そしてＭは少なくとも４の配位数 を有する金属イオンである］で示される化合物またはその酸付加塩またはそのナ トリウム、カリウムもしくはカルシウム塩であることを特徴とするハプテン。
2. ２．架橋基が式−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ５−（ＣＨ２）ｎ−（Ｒ６）ｐ−（ただし、 Ｒ５は−（ＣＯ）−、−（ＳＯ２）−または−（ＰＯＯＨ）−であり、Ｒ６は− Ｏ−、−Ｓ−または−（ＮＨ）−であり、ｍ、ｎおよびｐは各々独立して０また は１である）を有するものである、請求項１記載のハプテン。
3. ３．架橋基が−（ＳＯ２）−Ｏ−または−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−である、請求項２記 載のハプテン。
4. ４．Ｒ２、Ｒ２′、Ｒ３およびＲ３′の各々がＨである、請求項１記載のハプテ ン。
5. ５．少なくとも１個のＲ１が−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯＨまたは− ＮＨ２であり、少なくとも１個のさらに別のＲ１が−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＯＨ、− ＣＯＯＨまたは−ＣＯＯＣＨ３であり、残りがＨである、請求項４記載のハプテ ン。
6. ６．金属イオンがＮｉ２＋、Ｚｎ２＋またはＳｎ２＋である、請求項１記載のハ プテン。
7. ７．残基がシクロスポリン残基である、請求項１記載のハプテン。
8. ８．Ｄ−Ｓｅｒ８−ＣｙＳ−カルバマート−Ｎ−アミノ−テトラフェニルポルフ ィリンのニッケル錯体、Ｄ−Ｓｅｒ８−ＣｙＳ−カルバマート−Ｎ−アミノ−モ ノ−ｐ−ニトロ−テトラフェニルポルフィリンのニッケル錯体、およびＤ−Ｓｅ ｒ８−ＣｙＳ−カルバマート−Ｎ−アミノ−モノ−ｐ−アミノ−テトラフェニル ポルフィリンのニッケル錯体から選択される、請求項７記載のハプテン。
9. ９．式（Ｉ） ▲数式、化学式、表等があります▼Ｉ ［式中、 Ｒ１、Ｒ２、Ｒ２′、Ｒ３、Ｒ３′、Ｒ８およびＲ８′は請求項１記載の意味で あり、Ｒ４は、ａ）水素原子、ｂ）式（Ｉ）の化合物を別の化合物に結合させ得 る反応性中心または基を含むリンカー基、またはｃ）除去可能な保護基である］ で示される化合物、前記化合物の酸付加塩並びに前記化合物のナトリウム、カリ ウムおよびカルシウム塩類。
10. １０．Ｒ４が、式−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ５−（ＣＨ２）ｎ−（Ｒ６）ｐ−Ａ（ただ し、Ｒ５は−（ＣＯ）−、−（ＳＯ２）−または−（ＰＯＯＨ）−であり、Ｒ６ は−Ｏ−、−Ｓ−または−（ＮＨ）−であり、ｍ、ｎおよびＰは各々独立して０ または１であり、Ａは反応性脱離基または原子であるか、またはｐが１の場合Ａ は水素でもあり得る）を有するリンカー基である、請求項９記載の化合物。
11. １１．ｍおよびｎが０であり、ＡがＣｌまたはＢｒである、請求項１０記載の花 合物。
12. １２．リンカー基がＣ（＝Ｏ）−Ｃｌである、請求項１１記載の化合物。
13. １３．Ｒ４がＨである、請求項９記載の化合物。
14. １４．請求項９記載の式（Ｉ）で示される化合物の製造方法であって、ａ）式（ Ｉ）（ただし、Ｒ４はＨである）で示される化合物の場合、式（Ｉ）（ただし、 Ｒ４は保護基である）で示される化合物を脱保護し、ｂ）式（Ｉ）（ただし、Ｒ ４はリンカー基である）で示される化合物の場合、式（Ｉ）（ただし、Ｒ４は水 素である）で示される化合物を、２つの反応性原子または基（ただし、これらの うちの一つは＞Ｎ−ＮＨ２基との結合を形成し得る）を含むリンカー基の前駆体 と反応させ、 ｃ）式（Ｉ）（ただし、Ｒ４は保護基である）で示される化合物の場合、ｉ）式 （ＩＩＩ）▲数式、化学式、表等があります▼ＩＩＩ（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ２ ′、Ｒ３、Ｒ３′、Ｒ８およびＲ８′は前記の意味である）で示される化合物の ＞Ｎ−ＮＨ２基を保護し、ｉｉ）式（ＩＩＩ）の化合物を式（Ｉ）の対応する化 合物に酸化する という段階を含む方法。
15. １５．段階ａ）において、保護基がＣＦ３ＣＯ−であり、それがアルカリ性加水 分解により除去される、請求項１４記載の方法。
16. １６．段階ｂ）において、リンカー基の前駆体が式Ｘ−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ５（Ｃ Ｈ２）ｎ−（Ｒ６）ｐ−Ａ（ただし、Ｘは反応性脱離基または中心であり、Ａ、 Ｒ５、Ｒ６、ｍ、ｎおよびｐは請求項１０記載の意味である）を有するものであ る、請求項１４記載の方法。
17. １７．リンカー基が−ＣＯ−Ｃｌ−であり、前駆体がホスゲンまたはジホスゲン である、請求項１６記載の方法。
18. １８．段階ｃ）において、式（ＩＩＩ）（ただし、Ｒ４は水素である）で示され る化合物を、極性非水性溶媒中無水トリフルオロ酢酸と反応させ、次に酸化剤、 例えば２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノベンゾキノンを用いて酸化すること により、式（Ｉ）（ただし、保護基はＣＦ３−ＣＯ−である）で示される化合物 が得られる、請求項１４記載の方法。