JPH06511236A - シリルアルコールの合成方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 シリルアルコールの合成方法 本発明は一般にシリルアルコール、その合成及びその使用に係る。より詳細には 、本発明は特定のシリルアルコール及び、ヒドロキシルよりもむしろ炭素に結合 したケイ素原子を有するシリルアルコールの合成方法に係る。本発明は更に、オ リゴヌクレオチドをリン酸化するための試薬及び方法、並びにリン酸化オリゴヌ クレオチドの精製に有用な中間化合物及び方法に係る。

発明の背景 化学的に合成されたオリゴヌクレオチドはしばら（以前からハイブリダイゼーシ ョンア・ソセイで使用されており、今日ではかなり日常的に行われている。しか しながら、生物学的プロセスを模倣する使用、例えば鋳型上の核酸プローブのハ イブリダイゼーションとそれに続く連結のためには、リガーゼの適正な基質を提 供するよう番二通常の５°　ヒドロキシル末端をリン酸基に変換しなければなら なＧ１゜１ノン酸化方法は後述するような酵素法及び合成法を含む。本発明は、 シリル置換アルコールを有用な試薬とする特定の合成方法に係る。

シリル置換アルコールの合成は従来有機ボランの酸イヒにより達せられている。

有機ボランはグリニヤール反応又はビニル−及びアリル−シランのヒドロホウ素 化により製造されている。この手法はＫｕｍａｄａら、　Ｊ、Ｏｒｇａｎｏｍｅ ｔａｌ、ｃｈｅｍ、　６：４９０−４９５　（１９６６）及び５ｅｙｆｅｒｔｈ 、　Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ。

Ｓｏｃ、　８１　：１８４４　（１９５９）に記載されている。

この手法は必要なビニル又はアリルシランが合成可能な場合又は市販されている 場合にしか利用できない。一方、所望のビニルシランが市販されていない場合又 は合成が困難な場合にはこの方法は有用ではない。

α−シリルエステルはクロロシラン及びα−ブロモエステルをレフオルマドスキ ー条件下で亜鉛と反応させることにより製造されている。Ｆｅ５ｓｅｎｄｅｎら 、Ｊ、Ｏｒｇ、Ｃｈｅｍ、３２：３５３５　（１９６７）参照。

これらの合成方法の主要な欠点は望ましくない生成物をもたらし、収率を低下さ せる副反応が生じ得るという点にある。シリル置換エステルを対応するシリル置 換アルコールに加水分解するための従来方法では、一般にカルバニオン中間体が 形成される。β−シリル置換アルコールではシラノールとオレフィンに分解する 可能性があり、α−シリル置換アルコールでは、Ｂｒｏｏｋ転位にょリシリル保 護エーテルを生じる。即ち、これらのカルバニオン中間体では脱離反応の傾向が 強（、ケイ素原子は酸素原子にシフトし、Ｒ３５ｉＯＨ副生物を形成する。この 傾向は反応が強酸中で行われる場合及びケイ素上で置換された基が格別嵩高な場 合に特に顕著である。

オレフィンの二重結合間にＨ及びシリル化合物を付加するヒドロシル化（ｈｙｄ ｒｏｓｉｌａｔｉｏｎ）も文献中に記載されている。Ｃｏ　ｌ　１ｍａｎら、　 Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｏｒｇａｎ ｏｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ　Ｍｅｔａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　Ｕｎｉｖｅｒｓ ｉｔｙ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｂｏｏｋｓ　（１９８０）　Ｉ）、３８４−３８９及 びＰｅｇｒａｍら、　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１８４： ２７６　（１９８８）参照。特に関連するヒドロシル化反応において、Ｓａｌｉ ｍｇａｒｅｅｖａら。

Ｚｈ、０ｂｓｈｃｈ、Ｋｈｉｍ　４８　（４）：９３０−３１　（１９７８）（ ロシア）（Ｃ，Ａ、　８９：１４６９６１ｙも参照）はジメチルシランによる酢 酸ビニルのヒドロシル化を報告している。この反応では２種のシリル置換生成物 、即ちモノアセテートとジアセテートが生成された。しかしながら、シリルアル コールの合成又は嵩高のシリル置換化合物の使用もしくは合成について記載され ていない。

Ｈｏｎｄａら、　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒ−ｓ、　２２　（２２ ）：　２０９３−２０９６　（１９８１）は、シリル基が２個のフェニル置換基 と１個のメチル置換基を担持するβ−シリル置換エタノールを記載している。Ｈ ｏｎｄａらはオリゴヌクレオチド合成でヌクレオチド間に保護リン酸基を配置す るリン酸化剤を製造するためにこの化合物を使用した。置換シリル保護基を除去 すると、シリルフルオライド化合物、エチレン及びリン酸化合物が得られる。置 換シリルエタノールは、Ｇｅｒｌａｃｈ、Ｈｅ１ｖ　Ｃｈｉｍ、　Ａｃｔａ、　 ６０：３０３９　（１９７７）の手順の変法に従ってビスフェニルメチルシリル アセテートをＬｉＡｌＨ４で還元することにより得られた。

他のシリル置換エタノールは文献に記載されているが、主にアルキル置換シリル 基を含む。このようなシリルエタノールの例及びその引用文献名を以下の表に示 す。

表ニ トリフェニルシラン（アルコールでない）はＬｅｓａｇｅら、　Ｊ、Ｏｒｇ、Ｃ ｈｅｍ　５５：５４１３　（１９９０）により有用な還元剤として記載されてい る。

Ｈｏｎｄａら（前出）の方□法以外に、オリゴヌクレオチドの５′末端をリン酸 化するための数種の方法が知られている。オリゴヌクレオチドを合成し、固体支 持体から除去した後にポリヌクレオチドキナーゼを使用する酵素法が最初に使用 された。その他に、固体支持体から除去する前に合成オリゴヌクレオチドを化学 的にリン酸化するための方法及び試薬が教示されている。これらの教示の一部を 以下に記載する。

Ｋｏｎｄｏら、　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　５ｅｒ ｉｅｓ　１６：１６１−１６４（１９８５）は５°末端をリン酸化するためのホ スホトリエステル（１）及びホスホラミシト（２）試薬を記載している。リン酸 化は鎖中の最後のヌクレオチドとして付加される特別のニリン酸化（３°−５° ）ヌクレオチドを調製することにより達せられる。３゛　リン酸基はホスホトリ エステル又はホスホラミシトを介して伸長するヌクレオチド鎖に結合される。５ ゛　リン酸基は最終的に除去される保護基で保護される。

Ｕｈｌｍａｎｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２７　（９）＋ 　１０２３−１０２６　（１９８６）は、ブロッキング基としてｐ−ニトロフェ ニルエチル基を使用するホスホラミシトリン酸化試薬を記載している。

この文献によると、疎水性ｐ−ニトロフェニルエチルは逆相ＨＰＬＣによりリン 酸化化合物を非リン酸化化合物から分離できるという利点がある。

しかしながら、Ｕｈｌｍａｎｎらはｐ−ニトロフェニルエチル「ハンドル（ｈａ ｎｄｌｅ）Ｊが結合した６量体しか使用しなかった。２０量体でｐ−ニトロフェ ニルエチルハンドルを使用する同様のアプローチがＧ、Ｚｏｎ、ＨＰＬＣｉｎ　 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　（Ｗ、Ｓ。

Ｈａｎｃｏｃｋ編）、　Ｊ、Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ＮＹ、　ｐｐ３５９−３６３　（１９９０）の第１４章に 記載されている。Ｚｏｎによりこの方法で得られた精製結果はかろうじて許容で きる程度である。

Ｍ　ａ　ｒ　ｕ　ｇ　ｇら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１２　（２２） ＋８６３９−８６５１　（１９８４）は、新規リン酸化剤として２−シアノ−１ ，１−ジメチルエトキシジクロロホスフィンを記載している。この物質は塩基性 条件下で除去されるという利点があると主張されている。

Ｈｉｍｍｅ　Ｉ　５ｂａｃｈら、ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ　２３ 　（４６）　：４７９３−４７９６　（１９８２）は、新規リン酸化剤としてビ ス−（ｐ−ニトロフェニルエチル）ホスホロモノクロリゾートを記載している。

Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｍａｒｅｌら、　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ。

ｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　２２（１９）＋１４６３−１４６６（１９８１）は、モ ルホリノホスホロビス−３−ニトロ−１，２，４−１−リアシリデートを記載し ている。

Ｈｏｒｎら、Ｔｅｔ、ｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ２７　（３９）：４７ ０５−４７０８　（１９８６）は、遊離後にリン酸化効率を監視するために使用 可能な４，４′　ジメトキシトリチル基を含むリン酸化試薬を記載している。こ の開示はＥＰ−Ａ−３０４２１５の開示及び５゜Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｏｎとし て知られる市販のＣｏｏｎｔｅｃｈ製品に非常に類似していると思われる。

Ｌｉｐｓｈｕｔｚら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　３０　（５１ ）：　７１４９−７１５２　（１９８９）（“Ｌｉｐｓｈｕｔｚ　１９８９”） 、Ｌｉｐｓｈｕｔｚら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２１：３３ ４３−３３４６　（１９８０）（“Ｌｉｐｓｃｈｕｔｚ　１９８０”）及びＶｏ ｎ　Ｐｅｔｅｒ　５ｉｅｂｅｒ、　Ｈｅ１ｖｅｔｉｃａ　Ｃｈｉｍｉｃａ　Ａｃ ｔａ６０　：２７１１　（１９７７）はいずれもシリル保護基の除去におけるフ ッ化物の使用を開示している。この点で、これらの文献はＨｏｎｄａら（上記参 照）の開示内容に類似している。

上記試薬及び方法の各々は合成オリゴヌクレオチドのリン酸化に適しているが、 各々欠点もある。例えば、上記文献の各々は天然５°　リン酸基を生成するため にリン酸基ブロッキング基を除去するための方法を開示している。リン酸化の程 度を監視することが可能な検出可能な特徴（例えば色）を有するブロッキング剤 を開示しているものもある（例えばＨｏｒｎら）。リン酸化の程度はこの手段に より監視することができるが、精製手段は提供されていない。

Ｕｈｌｍａｎｎらは、開裂前に疎水性ｐ−ニトロフェニルエチル基を使用してＨ ＰＬＣによりリン酸化６量体を分離できることを示唆している。Ｕｈｌｍａｎｎ により言及されている保護６量体は比較的低分子／保護基質量比を有しており、 一般に非常に短いため、ハイブリダイゼーションアッセイで必要な特性を提供す ることができない。

しかしながら、これらの文献のうちでシリル置換基を含むリン酸化／ブロッキン グ試薬を教示しているものは皆無である。更に、非リン酸化不良生成物からリン 酸化ヌクレオチドを精製するためにシリル保護基を使用できることを示唆してい るものも皆無である。本発明の目的はこれらの欠点を解決することである。

発明の要約 第１の態様によると本発明は、 ａ）アルケニル基の二重結合間にＨ及びシリル基の付加を触媒することが可能な 金属触媒の存在下で、式：（式中、Ｒ，は炭素数２〜約２０の直鎖又は枝分かれ 鎖アルケニル基であり、Ｒ５はＨ又は低級アルキルである）のビニルエステルを 式： （式中、Ｒ，、Ｒ，及びＲ７はＨ；アルキル、アリール、置換アルキル、置換ア リール；アルキル、アリール、置換アルキル及び置換アリールのオキサ及びチア 類似体；並びにハロゲンから構成される群から独立して選択される）のシランで ヒドロシル化し、シリル置換エステルを形成する段階と、 ｂ）級塩基の存在下でシリル置換エステルをアルコールに加水分解する段階と を含むシリルアルコールの合成方法に係る。

一般に、Ｒ１は低級アルケニルであり、好ましくはＲ１はビニルである。一般に Ｒｂは低級アルキル、好ましくはメチルである。リン酸化剤として使用するため には、Ｒ６゜Ｒ＠及びＲ７の少なくとも１個、好ましくは２個以上は立体的に嵩 高で理想的には疎水性の基から構成されるべきである。

好ましくは、ヒドロシル化は約０．１〜約４モル、特に約１モルのトルエン溶液 中で実施される。金属触媒は通常、コバルト、ニッケル、白金、パラジウム及び ロジウムから構成される群から選択される金属を有する遷移金属錯体、例えば（ ＲｈＣＩ　（Ｃｏ）　２１　！である。加水分解は通常、メタノール又はエタノ ールのようなプロトン性溶剤とＫ。

ＣＯ３のような級塩基の存在下で実施される。

本方法は更に、例えばクロマトグラフィーによりシリル置換アルコールを望まし くない副反応生成物から分離する段階を含み得る。

図面の簡単な説明 図１は不良生成物（８，４分のビーク１）からのリン酸化オリゴヌクレオチド（ １５，５分のビーク４）の分離を示すクロマトグラムである。クロマトグラムは 流速１．５ｍｌ、７分のＷａｔｅｒｓ　μＢｏｎｄａｐａｋ（登録商標）Ｃ１８ カラム、３．９ｍｍＸ１５０ｍｍから作成した。溶剤Ａは１００ｍＭｈリエチル アンモニウムアセテートであり、溶剤Ｂはアセトニトリルである。Ａ：Ｂの比が 時刻＝０では９０　：　１０、時刻＝１５分では６０　：　４０、時刻＝２５で は６０　：　４０、時刻＝３０では９０：１０となるような直線勾配表に従って 溶剤を混合した。検出値は２６０ｎｍの吸光度単位で表した（実施例１０ａ参照 ）。

図２は他の生成物（例えばシリルフルオライド）からの脱保護リン酸化オリゴヌ クレオチド（８，４分のビーク１）の分離を示すクロマトグラムである。条件は 図１の場合と同じである（実施例１０ｂ参照）。

詳細な説明 一般に、「アルキル」、「アルケニル」及び「アリール」のような用語は、有機 化学業者により通常使用されている意味を有する。例えばアルキルは一般に、１ 個の水素を除去することによりアルカンから誘導され得る１価の直鎖又は枝分か れ鎖脂肪族基を意味し、一般式Ｃ、Ｈ、、や宜を有する。アルキル基は１〜約３ ０個の炭素、より実質的には１〜約１５又は２０個の炭素を有し得る。「低級ア ルキル」なる用語は炭素数１〜約６のアルキルを意味する。低級アルキルの例と しては、ＣＨｓ−１ＣＨ３ＣＨ，−１ＣＨ，ＣＨ（ＣＨ３）−及びＣＨｓ（ＣＨ ２）４−が挙げられる。本明細書中で使用する「アルキル」なる用語はシクロア ルキル及び直鎖アルキルを含む。従って、シクロヘキシル等が含まルケンから誘 導され得る１価の直鎖又は枝分かれ鎖脂肪族基を意味し、一般式Ｃ＊Ｈ＊ｓ−＋ を有する。アルケニル基は１〜約３０個の炭素、より実質的には１〜約２０個の 炭素を有し得る。「低級アルケニル」なる用語は炭素数１〜約６のアルケニルを 意味する。「オレフィン」はアルケニルと同義である。

本明細書中で使用する「アルキレン」なる用語は３０個未満の炭素原子を有する ２価の直鎖又は枝分かれ鎖スペーサー基を意味し、非限定的な例として−ＣＨ， −１−ＣＨ（ＣＨｓ）−１ＣＨ（Ｃ，ＨＩｌ）−１−ＣＨ（ＣＨｓ）　ＣＨｘ− １−（ＣＨｚ）ｓ−等が挙げられる。一般にアルキレンスペーサー基は脂肪族で ある。

「アリール」は、１個の水素を除去することにより芳香族炭化水素から誘導され 得る１価の基を意味する。アリール置換基はフェニル及びナフチルのような環構 造を有する。

典型的には、アリール置換基は平面状であり、平面の相対向する側に各炭素のπ 電子雲が残存する。

アルキル、アルケニル及びアリールは一般には炭素及び水素以外の原子をもたな い（即ちヘテロ原子をもたない）基に限定されるが、本発明ではこのような制限 がない。ヘテロ原子、特に酸素及び硫黄がＲ基に存在し、夫々「オキサ」及び「 チア」類似体を形成してもよい。しかしながら、脱離が予想されるので、Ｒ基が 該当分子に結合している１価の点から２個の炭素が除去された酸素原子を有する オキサ類似体を避けることが望ましい。オキサ類似体の例としては、アルコキシ （例えばｔ−ブトキシ、イソプロピルオキシ及びエトキシ）、フェノキシ及びエ ーテル置換基がある。

本明細書中で使用される「置換」なる用語は、Ｒ基に共有結合した部分の存在を 意味し、非限定的な例としてはハライド（特にＢｒ及びＣ１）、ニトロ、低級ア ルコキシ（炭素原子数１〜６、特にメトキシ及びエトキシ）、低級アルキル（炭 素原子数１〜６、特にメチル及びエチル）、ヒドロキシ及びアミノ（場合により 保護基が必要）が挙げられる。所望の溶解度及び所望の化合物の疎水性による制 約と有機化学原理の立体的制約下で、Ｒ基土の置換基の位置及び数は任意である 。特定の置換としては、アリール基が１価の点を含むアルキル置換基を担持する １価アリール基（例えばトルイル）を意味するアルカリールや、アリール基を担 持する１価アルキル基を意味するアラルキル基を挙げることができる。後者の場 合、アルキル基は１価の点を含む。ベンジルはアラルキル基の１例である。

本明細書中で使用される「立体的に嵩高」なる用語は、比較的大きい体積を占め る置換基を意味する。５個以上の炭素を有するアリール基は置換アリール基と同 様に「立体的に嵩高」であるとみなされる。アルキル及びアルケニル基は少な（ とも４個の炭素を有しており且つ枝分かれ形状に配置されているときに「立体的 に嵩高」であり、枝数が多いほど嵩高である。ｔ−ブチル以上の体積を占める全 アルキル及びフェニル以上の体積を占める全アリールは「立体的に嵩高」である とみなされる。従って、ネオペンチル、ネオヘキシル等がこの範喀に入る。

「疎水性」なる用語は一般に、水溶液に比較的溶けに（く、実質的に水と混合し ない化合物を意味する。具体的には、水／オクタツール分配試験でオクタツール に対して０゜５１以上の分配係数を有する場合に化合物は疎水性であるとみなさ れる。

Ｂ、シリルアルコール合成 以下に記載する本発明ではどのような方法により製造したシリルアルコールも有 用であり得る。後述する理由で２−シリル−エタン−１−オール（すなわちβ− シリルエタノール、シラプロパツール）が好適である。有機化学業者には自明の ことであるが、「β−シリルエタノール「シラプロパツール」は同義であり、区 別なしに使用され得る。前者命名法はシリル基（Ｒ．Ｓ　ｉ−）をエタノール上 の置換基とみなし、後者命名法はケイ素原子を主鎖の一部とみなしている。

公知製造方法の例については本明細書の発明の背景の項に記載した。しかしなが ら、ここに記載する新規合成方法は特に有用である。

ビニルエステル（さエステル結合の片側（酸素側）のアルケニル基の存在により 特徴付けられるオレフィンエステルである。ビニルエステルは式： （式中、Ｒ．はアルケニルであり、ＲｈはＨ又はアルキル、通常は低級アルキル 、好ましくはメチルである）により表され得る。本発明によると、Ｒ．は炭素数 ２〜約３０であり得るが、低級アルケニルがより一般的である。本発明で有用な このようなエステルの例としては、ビニルアセテート、イソプロペニルアセテー ト、ブテニルアセテート、ペンテニルアセテート等が挙げられる。二重結合が末 端位置にあるエステル、特にビニルアセテートが好ましい。

金属触媒の存在下で式Ｒ３５ｉＨのシランを使用してこのようなエステルをヒド ロシル化すると、アルケニル基Ｒ１の二重結合間にＨ及びシリル基（ＲｓＳｉ　 ）が付加される。ヒドロシル化はＲ基として好ましくはアルキル、アリール、置 換アルキル又は置換アリールを担持するシランを必要とする。シランのＲ基は更 に、独立してハロゲン及び／又はアルキル、了り−ル、置換アルキル及び置換ア リールのオキサ又はチア類似体を含み得る。シラン上には１．２又は３個のＲ基 が存在し得る。後述する使用のためには、嵩高で疎水性の置換基が好適である。

フェニル、ｔ−ブチル、ネオペンチル等が嵩高基の例である。

ヒドロシル化に有用な金属触媒としては、遷移金属錯体、特にコバルト、ニッケ ル、白金、パラジウム及びロジウムの錯体が挙げられるが、他の触媒も使用でき る。特定の錯体の例としては、Ｃｏｗ（Ｃｏ）ｓ、Ｈ４Ｆ　ｔ　ＣＩｇ：　（Ｒ ｈＣＩ　（Ｃｏ）　ｚｌ　を及び前出のＣｏｌｌｍａｎらの表６．５に記載の他 の錯体がある。

触媒ヒドロシル化は以下の条件下で実施され得る。アセテート対シランのモル比 は約３０＝１〜約１：２であり、好ましくは約１：１である。１０：１又は２： １のような中間比も予想される。金属触媒のモル百分率は約０．０１％〜１％〜 約３ましくは約０．２％〜約２％であり得る。

百分率が低いとより長い反応時間又はより高温が必要になる。（’ＲｈＣＩ　（ ＣＯ）ｚｌ　！の場合、最適モル％は約０゜２５％〜約１．０％である。他の触 媒では、最適濃度は文献又は日常実験から得られる。室温で約５０〜７０時間、 好ましくは２週間以内で反応は最良である。しかしながら、高温で短時間、例え ば８２℃で２４時間未満でもよい。主要試薬の濃度は酢酸ビニル中純液からトル エン中４Ｍ、好ましくはトルエン巾約ＩＭとすべきである。この触媒段階の他の 反応条件は、参考資料として本明細書の一部とするＣｏ　Ｉ　Ｉｍａｎらの文献 に記載されている。

ヒドロシル化ではシリル基が二重結合の両側に結合し、１−及び２−置換生成物 を生じるので、２種の主要生成物が生成される。必要に応じてこれらの生成物を 分離し、クロマトグラフィー（例えばフラッシュカラム又はＨＰＬＣのようなシ リカに基づくクロマトグラフィー）により精製することができる。しかしながら 、場合によっては精製は非常に簡易化される。ビニルアセテートをエステルとし て使用する場合にも同様に次のように２種の生成物が得られｌ−０＋ＨＳｉ　Ｒ ３ 水性又はアルコール性緩塩基中で加水分解すると、アセテートはアルコールに変 換される。しかしながら、１−シリル置換アルコールは不安定であり、自然にＢ ｒｏｏｋ転位しくＡ、Ｇ、Ｂｒｏｏｋ、Ａｃｃｏｕｎｔｓ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　 Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　７：７７　（１９７４））、下記化合物： を生じる。２−シリル置換アルコールはこの転位を受けない。２−シリル置換生 成物はアルコールとして挙動し、シリルエーテルはエーテルとして挙動するので 、２種の生成物はシリカゲルクロマトグラフィー、特にＨＰＬＣを使用してこれ らの特性に基づいて容易に分離される。追って実施例に記載するように、この加 水分解反応は酢酸塩の中間精製なしに同一容器中で実施することができる。

加水分解条件は注意深く制御することが好ましい。アニオン形の２−又はβ−置 換中間体は発明の背景の項に記載したようにシラノールに分解する。しかしなが ら、望ましくない生成物の形成を最小限にするような反応条件を選択することが できる。まず第１に、好ましくは約３〜８のｐＫｂを有する緩塩基を選択する。

許容可能な塩基としては、８２Ｂ　Ｏ５−１ＨＰ　Ｏ４２−１ＳＯｓ”−１ＨＣ Ｏ３−及びｃｏ３”−のナトリウム又はカリウム塩が挙げられる。解離傾向の弱 い緩塩基は従来技術で教示されている強塩基又は水素化物（例えばＬｉＡ］Ｈ， ）よりもアニオン種をプロトン付加状態に維持する傾向がある。

塩基は、塩基：アセテートモル比が約０．０１：１〜約３＝１、好ましくは０． １：１〜２．５：１、最適には１：１〜２：１となるように配合すべきである。

反応時間は一般に０．５〜２４時間であるが、好ましくは約１時間である。更に 、溶剤は望ましくない生成物の形成を最小限にするように選択され得る。例えば 、特定溶剤中の塩基の溶解度により塩基性度は変化する。溶液中で進行中のイオ ン化平衡を緩衝するように実質的な量の塩基を不溶性に維持することが望ましい 。また、プロトン性溶剤はアニオン種の形成を停止できるので非プロトン性溶剤 よりも好ましい。

適切なプロトン性溶剤としては水、メタノール及びエタノールが挙げられる。反 応は水性媒体中で行われるが、溶剤としてメタノールを使用することが好ましい 。

この方法により合成されるシリルアルコール及び他の方法により合成されるシリ ルアルコールは、別項に記載するリン酸化試薬及び保護剤の合成に有用である。

Ｃ，シリルアルコール 上記方法を使用して多数のシリル置換アルコールを合成することができるが、あ る類のシリルアルコールが特に有用である。ケイ素に結合した３個の大形で嵩高 の基を有するシリルアルコールを合成することは従来方法には記載されていない 。これは、Ｋｕｍａｄａら及び５ｅｙｆｅｒｔｈ、前出の文献により教示されて いるようなビニルシランを介する主要な従来技術の合成方法が、必要な嵩高基で 適切に置換されたビニルシラン試薬を必要とするためである。

恐ら（立体的理由により、嵩高のビニルシランは容易に入手できず、容易に合成 できない。トリフェニルシランは公知である（Ｌｅｓａｇｅら、　前出参照）が 、このような嵩高のシランは嵩高のビニルシランを形成するためにビニル基と関 連付けられていない。

一方、一般式： ［式中、ＲＩＳＲ２及びＲ３はアリール（例えばフェニル及びナフチル）、置換 アリール（例えばメトキシフェニル又はニトロフェニル）；アラルキル（例えば トリフェニルメチル）：枝分かれ鎖中に少なくとも４個の炭素を有するアルカリ ール及びアルキル又は置換アルキル（例えばｔ−ブチル、ネオペンチル、ネオヘ キシル、シクロヘキシル、３−ペンチル及び３−エチル−３−ペンチル）のよう な立体的に嵩高の基から独立して選択される］を有する立体的に嵩高のシリルア ルコールを上記方法により製造することができる。上式中、ｎは２〜約２０の整 数、通常は２〜約６、最適には２である。化合物の例を下表に列挙するが、化合 物の例は表中の例に止まらない。

表２＝　新規シリルアルコールの例 フェニル　ナフチル　ネオペンチル　２ｔ−ブチル　ｔ−ブチル　ネオペンチル 　２フエニル　ナフチル　ｔ−ブチル　２ フエニル　ｔ−ブチル　ネオヘキシル　２フエニル　ナフチル　ネオペンチル　 ３ｔ−ブチル　ｔ−ブチル　ネオペンチル　３後述する理由から置換嵩高基は非 極性置換基を有することが好ましい。

上述のように、シリルアルコールはリン酸化剤及び保護剤を製造するのに有用で ある。これらの物質については以下に詳述する。

Ｄ、リン酸化試薬 多種の試薬がオリゴヌクレオチドをリン酸化することができ、即ちオリゴヌクレ オチドの末端にリン酸基を加えることができる。一般に、これらの試薬はホスホ トリエステル試薬、ホスホネート試薬（水素又はアルキル）及びホスホラミシト （ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）試薬として分類される。これらの試薬の各 々がオリゴヌクレオチドをリン酸化する機序については文献に記載されている。

新規リン酸化試薬は式： （式中、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７はＨ；アルキル、アリール、置換アルキル、置換ア リール；アルキル、アリール、置換アルキル、置換アリールのオキサ及びチア類 似体：並びにハロゲンから独立して選択され、Ｑはホスホラミシト、アルキルホ スホネート、ホスホン酸水素塩及びホスホトリエステルから構成される群から選 択される部分を表す）により表される。

ホスホラミシトの場合、Ｑは式： ％式％ −フェニルエチル及び２−（２−ナフチル）エチルがら構成される群から選択さ れ、Ｒ，及びＲ１゜は一般にＨｌ又は炭素数１〜６の直鎖もしくは枝分かれ鎖ア ルキルから独立して選択される］を有する。非常に一般的なホスホラミシト部分 において、Ｒ，は２−シアノエチルであり、Ｒ９及びＲＩＧはいずれもイソプロ ピルである。

新規シリルホスホラミシトはクロロホスホラミシトをシリル置換アルコールと反 応させることにより常法で製造され得る。例えば参考資料として本明細書の一部 とするＫ。

５ｔｅｒ　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ。

２４　：　５８４３　（１９８３）を参照されたい。ここでは、２−シリル−エ タン−１−オールを使用するのが好ましい。

反応条件は文献から周知である。

ホスホトリエステル試薬の場合、Ｑは式：（式中、Ｙはヒドロキシル又はアルコ キシである）を有する。

ホスホン酸水素塩又はアルキルホスホネート試薬の場合、Ｑは上記式を有するが Ｙは夫々Ｈ又はアルキルである。

Ｅ、リン酸化剤を使用する方法 上記ホスホラミシト、ホスホトリエステル及びホスホネート試薬は、オリゴヌク レオチド、特に固体支持体上で合成されたオリゴヌクレオチドをリン酸化するた めの方法で使用することができる。単一のヌクレオシドやもっと長いポリヌクレ オチドも同様にリン酸化できることは当業者に理解されよう。簡単にするために 、「オリゴヌクレオチド」なる用語は１〜数百個のヌクレオシドサブユニットを 有する構造を含むものと理解されたい。

オリゴヌクレオチドの合成方法としては多くの方法が文献から公知であり、使用 される特定方法は本発明には関係ない。しかしながら、一般には自動合成が好ま しく、ＡＢｌ　３８０Ａ　５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ又はＭｉｌｌｉｇｅｎ　８７ ００　５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒのような市販の装置を使用して実施することがで きる。

このような自動合成器により使用される反応段階は一般に当業者に公知であるの でここで繰り返す必要はない。しかしながら、ホスホラミシト又はホスホン酸水 素塩試薬を使用する場合には、形成される中間体が３価亜リン酸塩であることに 留意されたい。後段階で中間体を酸化し、生物学的に有用な５価リン酸塩を得る 。この酸化段階は例えば自動合成方法でヨウ素を使用して容易に実施される。

本発明の主要な利点は、支持体からオリゴヌクレオチドを除去せずに合成と同一 の装置でリン酸化段階を実施できるという点にある。あるいは、存在するアミノ 及びヒドロキシ基が保護され得るという条件下で、他の方法（例えば酵素法）に より合成したオリゴヌクレオチドを本発明の方法によりリン酸化してもよい。

公知のリン酸化方法は発明の背景の項で説明したが、シリル試薬を使用している ものは皆無である。本発明によると、前項に記載したように調製したリン酸化試 薬の任意のものを使用してオリゴヌクレオチドをリン酸化することができる。方 法及び条件は従来通りであるが、試薬は新規である。実施例により詳細を説明す るが、方法は一般にオリゴヌクレオシドの５°　ヒドロキシルを上記リン酸化試 薬と反応させ、最終的にシリル基により保護されたホスホジエステルを形成する ことからなる。

シリルで保護されたリン酸化中間体は下記構造：（式中、Ｒ６、Ｒ６及びＲ７は 上記のように選択され、ＺはＨ又はＯＨであり、ＢＡＳＥは核酸塩基Ａ、Ｃ，Ｇ 、ＴもしくはＵの１種又はその類似体を表す）を有する。末端ヌクレオシドは３ ′炭素で支持体に結合される（単一ヌクレオシドをリン酸化する場合）か、又は より一般には１個以上の他のヌクレオシドの鎖に結合され得る（オリゴヌクレオ チドを形成する）。一般に、このようなヌクレオシド鎖はホスホジエステル結合 を介して結合されるが、他の結合も可能である（例えばアルキルホスホネート中 性プローブ）。自明のことながら、ＺがＨであるならばヌクレオシドはデオキシ リボヌクレオシドであり、ＺがＯＨであるならばリボヌクレオシドである。塩基 Ａ、Ｃ，Ｇ、Ｔ又はＵの類似体は、オリゴヌクレオチドに取り込まれた場合に夫 々の相補的塩基とのワトソンークリック型塩基対合が許容可能な化合物である。

参考資料として本明細書の一部とするＵＳＰＴＯ公報１１１４　０Ｇ　４３には 数種の塩基類似体の例が記載されている。

生物学的用途（例えば鋳型案内連結）のためにはシリル保護基を除去しなければ ならないが、保護中間体も有用である。シリル基は特に嵩高の疎水性置換基Ｒ１ １Ｒ，及びＲ７を有する場合、クロマトグラフィー（例えばＨＰＬＣ）により非 リン酸化不良生成物からリン酸化オリゴヌクレオチドを精製及び分離するための 「ハンドル」として有用である。Ｒ基が十分に疎水性であるならば、シリル保護 基を有するオリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチドが５０量体の長さに近い場 合でも非リン酸化非保護オリゴヌクレオチドから容易に区別できる。当然のこと ながら、もっと短い長さも容易に分離される。従って、リン酸化の首尾を監視す るためには有用であるが、生成物を分離又は精製するためには有用でない公知ト リチル保護基よりも一歩前進した。

所望に応じてリン酸化及び／又は分離後に脱保護段階を実施し、５′末端リン酸 基を生成してもよい。脱保護段階は所望のリン酸基を生成するために有用な任意 の方法により実施される。上述のようにシリル置換基が酸素に対してβ位にある ときに特に有用な好適方法は、保護ホスホジエステルをフッ化物イオンと反応さ せ、シリルフルオライド、エチレン及び末端リン酸基を得る。テトラブチルアン モニウムフルオライド（ＴＢＡＦ）はシリル保護基を除去するために有用なフッ 化物イオンである。この反応は、上記リン酸化試薬を使用する場合にエチレンの 遊離により駆動される。例えばＧｒｏｂ、Ｈｅ１ｖ、Ｃｈｉｍ、Ａｃｔａ。

３８　：　５９４　（１９５５）参照。このため、２−シリル−エタン−１−オ ール（β−シリルエタノール）が好適なシリルアルコール試薬である（ホスホジ エステルのケイ素と酸素の間に２個の炭素を有するので、エチレンをＧｒ。

ｂ脱離することが可能である）。脱保護段階では他の部分はβシリル−エタノー ル誘導体はど容易に除去されない。

「保護」基及び「脱保護」段階は、リン酸基の酸素に結合したシラプロピル置換 基に関連する。保護基は酸素原子に影響するその後の反応から通常の意味での「 保護」を与えるものであってもよいし、与えないものであってもよい。

しかしながら、シラプロピル基を使用してリン酸化オリゴヌクレオチドを非リン 酸化不良生成物から分離する能力と、所望のリン酸基を得るための後続する基の 除去とにより、保護基なる用語は「ハンドル」と同義として使用される。

以下、非限定的な実施例により本発明をより詳細に説明Ａ、シリルアルコールの 調製： ａ）１，１．１−）ジフェニル−３−アセトキシ−１−シラプロパン（３）の調 製 酢酸ビニル（１）３．６９ｍＬ　（４０ｍｍｏ　ｌ）　、トリフェニルシラン（ ２）１０．４２ｇ　（４０ｍｍｏｌ）及びＲｈｚＣ１２（Ｃｏ）４７７．８ｍｇ 　（０，２５ｍｍｏ　１）をトルエン４０ｍＬに溶解してなる溶液を室温でＮ！ 雰囲気下に合計６３時間撹拌した。この規模で反応を数回繰り返し、予期不能な 誘導期後、迅速に発熱した。この反応の拡大は予め用意した冷却浴で実施すべき である。非常に暗色の反応混合物を脱色用活性炭５ｇで処理し、混合物を短時間 煮沸した。冷却後、混合物をＣｅ１ｉｔｅ（登録商標）の１ｃｍパッドで濾過し 、濾液及び洗液を集めた。溶剤を蒸発させ、残渣を減圧乾燥した。この時点で粗 材料を加水分解段階に移した。ＮＭＲ分析によると、ａ：β比は１：１．５７で あった。化合物同定の目的で以下のプロトコルを実施した。２５ｍｍ１．Ｄ、Ｘ １５０ｍｍ長シリカゲ長寿リカゲルカラム上キサン中４％ＥｔＯＡｃを使用して 粗材群の１００ｍｇサンプルをフラッシュクロマトグラフィーにかけた。ＭｅＯ Ｈから再結晶後、化合物（３）２９ｍｇを得た。ｍｐ６７−６８℃。

ＩＲ：　（ＣＤＣ１ｓ、ｃｍ−’）　３０７０（ｍ）。

１７２８　（ｖｓ）、　１４２５　（ｖｓ）、　１２４９　（ｖＳ）。

ＭＳ　：（ＤＣＩ／ＮＨｓ）ｍ／ｅ３６４　（Ｍ＋ＮＨ４）。

ＮＭＲ＋　（３００ＭＨｚ、　ＣＤｔＣ１ｔ）δ７．６−７゜３　（ｍ、１５Ｈ ，フェニル）、　４．２２　（ＡｚＢｚのＢｌ、２Ｈ，ＣＨｚＯ）、　１．８７ 　（ｓ、３Ｈ，ＣＨｓ）、　１゜８６（Ａ、ＢｔのＡｚ＋　２８．ＣＨＩＳｉ） 。

”ＣＮＭＲ：　（７５ＭＨｚ、ＣＤＣＩｇ）δ１７１゜１　（Ｃ＝Ｏ）、　１３ ５．５（メタ）、１３４（イブソ）、１２９．７（パラ）、　１２８（オルト） 、　６２．１（ＣＨ，Ｏ）、　２１（Ｍｅ）、　１４．４（ＣＨｚＳｉ）。

元素分析：　Ｃｚ２ＨｚｚＯ□Ｓｔの計算値Ｃ７６，２６゜Ｈ６，４０；　実測 値Ｃ７６，４５，Ｈ６，３７゜ｂ）１，１．１−トリフェニル−１−シラプロパ ン−３−オール（４）の調製 粗化合物（３）をＭｅＯＨｌｏｏｍＬに溶解させ、ＫｔＣＯｓｌｏ、Ｏｇを一度 に加えた。反応は室温で１時間撹拌後に完了した。固体を濾別し、濾液を濃縮し た。濃縮残渣を１００／１００ｍＬ　ＨｚＯ／ＥｔＯＡｃ間で分配した。溶剤を 有機層から除去後、残渣を減圧乾燥した。４１ｍｍ　１．Ｄ、Ｘ１５０ｍｍ長シ リカゲルカラムを使用してフラッシュクロマトグラフィー（シクロヘキサン中１ ８％ＥｔＯＡｃ、Ｒｃ＝０．３２）にかけ、化合物（４）３゜４２ｇ（２８％） を得た。シクロヘキサンから再結晶させ、分析サンプルを純白固体として得た。

ｍｐ９６−９７℃。

ＩＲ：　（ＣＤＣｌ３．ｃｍ−’）　３６１６（ｍ）。

２９７０　（ｍ）、　１４２９　（ｖｓ）。

ＭＳ：　（ＦＡＢ／ＤＭＦ−Ｋｌ）　ｍ／ｅ３４３（Ｍ＋Ｋ）。

ＮＭＲ：　（３００ＭＨｚ、ＣＤ５ＯＤ）δ７．５５−７．３　（ｍ、１５Ｈ， フェニル）、　３．７３　（Ａ、Ｂ、のＢｌ、２Ｈ，ＣＨｔＯ）、　１．７８　 （ＡｚＢｚのＡ、、２Ｈ。

ＣＨｚＳｉ）　。

”ＣＮＭＲ：　（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ５）δ１３５゜５（メタ）、　１３４． ４（イプソ）、　１２９．６（パラ）、　１２８（オルト）、　５９．８　（Ｃ ＨｚＯ）　。

１８、　７　（ＣＨｚＳ　ｉ）　。

元素分析：　ＣｚｏＨｚｏＯ８ｉ　・０．２Ｈ！０（７）計算値：Ｃ７７，９８ ，Ｈ６，６７；　実測値：Ｃ７７，９２、Ｈ６，６２゜ 実施例２： ａ）１．１−ジメチル−１−フェニル−３−アセトキシ−１−シラプロパンの調 製 ＰｈＭｅｔＳ　ｉＨ６，１３ｍＬ　（４０ｍｍｏ　１）及び酢酸ビニル３．６９ ｍＬをトルエン４０ｍＬに溶解してなる溶液１，１．Ｒｈｔｃ　Ｉｔ　（Ｃｏ） 　４６１．３ｍｇ　（０，１６ｍｍｏｆ）を加えた。すぐに反応物は熱及び気体 を発生した。

５分以内に山吹色の反応物は濃茶色に変色した。１時間後、反応は完了した。反 応物を実施例１ａに記載したように処理し、組付加物８．３９ｇを得た。陽子Ｎ ＭＲ分析によると、ａ：β付加比は１．４４：１．０であった。サンプル１００ ｍｇを実施例１ａと同様にフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、標記化 合物２８ｍｇを無色油状物として得た。

ＩＲ：　（ＣＤＣ１３，ｃｍ−’）　２９６０　（ｍ）。

１７２４　（ｖｓ）、　１４２６　（ｍ）、　１２５５　（ｖＳ）。

ＭＳ：　（ＤＣＩ／ＮＨ３）ｍ／ｅ２４０（Ｍ＋ＮＨ４）。

ＮＭＲ：　（３００ＭＨｚ、ＣＤＣ１ｓ）δ７．６−７゜３　（ｍ、５Ｈ，フェ ニル）、　４．１８　（ＡＪｚのＢｌ。

２Ｈ，ＣＨｚＯ）、　１．９９　（ｓ、３Ｈ，Ｍｅ）、　１゜２５（ＡｚＢｚの Ａ！、２Ｈ，ＣＨ，Ｓ　ｉ）、　０．３５　（ｓ。

６Ｈ，ＳｉＭｅ）。

”ＣＮＭＲ：　（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ５）δ１７１゜１　（ＣＯ）、　１３８ 　（イプソ）、　１３３．４（メタ）。

１２９．２（パラ）、　１２７．９（オルト）、　６２゜３　（ＣＨｔＯ）、　 ２１．１　（Ｍｅ）、　１６．５　（ＣＨｔＳ　ｉ）、　−２，９（Ｓ　ｉＭｅ ）。

元素分析：　Ｃ＋ｚＨ＋ｓＯａｓ　ｉの計算値：Ｃ６４，８２、Ｈ８，１６゜実 測値：　Ｃ６５，０２，Ｈ８，０ｂ）１．１−ジメチル−１−フェニル−１−シ ラプロパン−３−オールの調製 上記すからの粗生成物の残り８．２９ｇを実施例１の場合と同様に処理し、１． １−ジメチル−１−フェニル−１−シラプロパン−３−オール１．６４ｇを無色 油状物として得た（全体収率２３％）。

ＩＲ：　（ＣＤＣＩｓ、ｃｍ−リ　３６１６（ｍ）。

２９６０（ｍ）、　１４２５（ｍ）、　１２５１（ｓ）。

ＭＳ＋　（ＤＣＩ／ＮＨｓ）ｍ／ｅ１９８（Ｍ＋ＮＨｎ）。

ＮＭＲ：　（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ５）δ７．６−７゜３　（ｍ、５Ｈ，フェ ール）、　３．７５　（Ａ２Ｂ！のＢ２゜２Ｈ，ＣＨ２０）、　１．４９　（ｓ 、１．２Ｈ，ＯＨ）。

１．２２　（Ａ、ＢｚのＡ！、２Ｈ，ＣＨ２５ｉ）、　０．３３　（ｓ、６Ｈ， Ｓ　ｉＭｅ）。

”ＣＮＭＲ：　（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ５）６１３８゜５（イブソ）、　１３３ ．４（メタ）、　１２９（バラ）。

１２７．８（オルト）、　５９．９　（ＣＨ２０）、　２１．１　（ＣＨｚＳ　 ｉ）、　２．８　（Ｓ　ｉＭｅ）。

元素分析：　Ｃ１６Ｈ１６０Ｓ　ｉ　・０．ｌＨ２Ｏの計算値：Ｃ６５，９２， Ｈ８，９９；　実測値：Ｃ６５，９５、Ｈ８，９７゜ 実施例３ ａ）１，１．１−）ジエチル−３−アセトキシ−１−シラプロパンの調製 ＥｔｓＳｉＨ６，３９ｍＬ　（４０ｍｍｏｌ）及び酢酸ビニル３．６９ｍＬ　（ ４０ｍｍｏ　１）をトルエン４０　ｍ　Ｌ　１．：溶解してなる溶液にＲｈｚＣ ｌｘ　（Ｃｏ）４６１．３ｍｇ（０，１６ｍｍｏ　１）を加えた。注意：　反応 物は熱及びガスを発生する。約５分以内に反応混合物は暗色に変色した。１時間 後にＴＬＣ分析（シクロヘキサン中１０％ＥｔＯＡｃ）により反応は完了したと 判断した。必要に応じて実施例１ａに記載したように反応物を処理及び精製した 。

ｂ）１，１．１−トリエチル−１−シラプロパン−３−オールの調製 ａ）からの粗生成物をトリフェニルシリルエタノールの場合（実施例１）と同様 に処理すると、１．１．１−トリエチル−１−シラプロパン−３−オールが得ら れる。

実施例４：　１，１．１−トリフェニル−１−シラへブタン−７−オール（５） の調製 ピリジン／無水酢酸１５／１５ｍＬ中でアルコール４゜８ｍＬ　（４０ｍｍｏ　 Ｉ）を４時間還流することにより５−ヘキサン−１−オールの酢酸塩を調製した 。溶剤を減圧下に除去し、残渣を十分に減圧乾燥した。粗酢酸塩をトルエン４０ ｍＬに溶解させ、トリフェニルシラン１０．４２ｇ。

次いでＲｈｚＣ］　２　（ＣＯ）　４７７．　８ｍｇ　（０，２５ｍｍ０１）を 加えた。反応物を室温でＮ２雰囲気下に２４時間撹拌すると、この間に反応物は 濃茶色に変色した。多少量の異性体２−メチル−１，１，１−トリフェニルシラ ヘキサン−６−オールを予想することができる。必要に応じて異性体をクロマト グラフィーにより分離することができる。

実施例１ａに記載したように処理した後、１ｂに記載したように塩基加水分解し 、標記化合物（５）を得た。

Ｂ、リン酸化試薬の調製： 実施例５：　２−トリメチルシリルエチル−２−シアノエチル−Ｎ、Ｎ−ジイソ ブロピルアミノホスホラミジト（１）の調製 ２−トリメチルシリルエタノール（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｍｉｌ ｗａｕｋｅｅ、ＷＩの市販品、又は上記実施例２と同様に調製）５７３μＬ　（ ４ｍｍｏ　１）及び１−ＰｒｔＮＥｔｌ、３９ｍＬ　（８ｍｍｏｌ）をＯ℃ＴＨ Ｆ８ｍＬに溶解してなる溶液に２−シアノエチル−Ｎ。

Ｎ−ジイソプロピルアミノクロローホスホラミジト８９２μＬ　（４ｍｍｏ　１ ）を一度に加えた。反応物はほぼ即座に著しく濁った。水浴を除去し、反応物を 室温で一晩、合計１９時間撹拌した。濾過してｉ　Ｐ　ｒ２ＮＥ　ｔ　ＨＣ１を 除去後、ＴＨＦを蒸発させた。残渣を５０１５０ｍＬ　ＥｔＯＡｃｌｏ、１Ｍ　 ＮａｔＣＯｓ、ｐＨ１２間で分配した。

相分離及び有機相の溶剤除去後、残渣を減圧乾燥した。１５０ｍｍｘ２５ｍｍ　 ＩＤカラム上でシクロヘキサン中１２％ＥｔＯＡｃを使用してフラッシュクロマ トグラフィーにかけ、標記化合物５７３．８ｍｇ　（７８％）を氷状−白色粘性 油状物として得た（シクロヘキサン中１５％ＥｔＯＡｃ中でＲ，＝０．６５）。

ＭＳ：　（ＤＣＩ、ＮＨ３）　３１９　（Ｍ十Ｈ）、　２９１　（Ｍ−ＨＣＮ） 。

ＮＭＲ：　（ＣＤｚＣＩ　Ｚ）δ３．９−３．　６２　（ｍ、４Ｈ）、　３．５ ６　（ｄｓｅｐｔ、２Ｈ，ＪｃｌＩ＝７．０Ｈｚ。

ＪＰＭ＝１０．　ＯＨｚ、ＮＨ）、　２．　５９　（ｔ、２Ｈ，Ｊ＝６．　２Ｈ ｚ、ＣＨｚＣＨ）、　１．　１５　（ｄｄ、１２Ｈ。

ＪＣｌＩ”１．　０．　ＪＰＭ＝２．　２Ｈｚ、Ｍｅ）、　０．　９７（ｔ　Ｑ 、２Ｈ，Ｊ＝８．０．０．７Ｈｚ、ＣＨｚＳ　ｉ）。

０、　０３　（ｓ、９Ｈ，ＳｉＭｅ）　。

実施例６：　２−トリフェニルシリルエチル−２−シアノエチル−Ｎ、Ｎ−ジイ ソプロビルアミノホスホラミジト（６）の調製 化合物（４）３．０４ｇ　（１０ｍｍｏｌ）　、１−ＰｒｚＮＥｔ４．１８ｍＬ 　（２４ｍｍｏｌ）及び４，４−ジメチルアミノピリジン５ｍｇを０℃ＴＨＦ１ ５ｍＬに溶解してなる溶液に、２−シアノエチル−Ｎ、Ｎ−ジイソプロビルアミ ノクロロホスホラミジト（５）２．６８ｍＬ　（１２ｍｍｏｌ）を一度に加えた 。白色沈殿がほぼ即座に形成された。０℃で３０分後に反応は完了した。溶剤の 除去後、残渣を１００／　１００ｍＬ　Ｏ，ＬＭ　ＮａｚＣＯｘ／　Ｅ　ｔ　Ｏ Ａｃの間で分配し、相を分離した。水相をＥｔＯＡｃ５０ｍＬで再抽出し、有機 相を合わせて濃縮及び減圧乾燥した。

４１ｍｍ１．Ｄ、ｘ１５０ｍｍ長シリカゲルカラムを使用してフラッシュクロマ トグラフィー（シクロヘキサン中１０％ＥｔＯＡｃ）にかけ、−晩減圧乾燥後に （６）３．３５ｇを粘性無色油状物として得た（６６％）。この材料を数週間か けて一２０℃フリーザーで徐々に結晶させた。クロマトグラフィー中、フラッシ ュクロマトグラフィーに使用される分画管又はシリカゲル中の外来酸の影響を最 小限にするために、各フラクションにＮＥｔｓｌＯＯμＬを加えた。

ＩＲ：　（フィルム、ｃｍ”）２９６２　（ｍ）、　１４２６（ｍ）。

ＭＳ　：　（ＤＣＩ／ＮＨｓ）ｍ／ｅ５０５　（Ｍ十Ｈ）。

ＮＭＲ：　（３００ＭＨｚ、ＣＤ５ＣＮ）　δ７．　６−７゜３　（ｍ、１５Ｈ ，フェール）、３．９−３．７　（ｍ、　２Ｈ，ＣＨｚＯ）、　３．　６６　（ ｄｔ、２Ｈ，Ｊｃ、＝５．　９Ｈ２，ＪｐＨ＝７．　７Ｈ２，ＣＨ２０）、　３ ．　５１　（ｄｓｅ　ｐ　ｔ、２Ｈ，ＪＣＨ＝６．　６Ｈ２，ＪＰＨ＝９．９Ｈ ２，ＮＨ）、　２．　５４　（ｔ、２Ｈ，Ｊ＝５．　５Ｈ２，ＣＨ２ＣＮ）、　 １．　８７　（ｂｒ　ｔ、２Ｈ，Ｊ＝６．　３Ｈｚ、ＣＨ２５ｉ）、　１．　０ ７　（ｄｄ、１２Ｈ，Ｊｃ−＝６．　６Ｈｚ、ＪｐＨ＝２９．　４Ｈｚ、ＭＥ） 　。

”　ＣＮ　Ｍ　Ｒ：　（７５Ｍ　Ｈｚ　、ＣＤ　ｓ　ＣＮ　）　６１３６゜３（ メタ）、　１３５．５（イブソ）、　１３０．７（バラ）、　１２９（オルト） 、　１１７．７　（ＣＮ）、　６１、　１　（ｄ、Ｊｐｃ＝１８．３Ｈｚ、ＣＨ ２０）　、５９゜３　（ｄ、Ｊ＝ｃ＝１８．３Ｈｚ、ＣＨ２０）、　４３．６（ ｄ、ＪＰｃ＝１２．２Ｈｚ、ＮＣＨ）、　２４．８　（仮想ｔ、Ｊｐｅ＝７．３ Ｈｚ、Ｍｅ）、　２１　（ｄ、Ｊｐｃ＝７゜３Ｈ２，ＣＨ２ＣＮ）、　１７．２ 　（ｄ、ＪＰｃ＝７．３Ｈｚ、ｃＨｚｓｉ）　。

”Ｐ　ＮＭＲ：　（２０２ＭＨｚ、ＣＤ５ＣＮ）　δ１４５、６゜ 実施例７：　２−トリエチルシリルエチル−２−シアノエチル−Ｎ、Ｎ−ジイソ ブロピルアミノホスホラミジトの調製 実施例３ｂの生成物を出発化合物として使用した以外は実施例５と同様に操作し 、標記化合物を得た。

実施例８：　２〜ビスメチルフエニルシリルエチル−２−シアノエチル−Ｎ、Ｎ −ジイソプロピルアミノホスホラミジトの調製 実施例２ｂの生成物を出発化合物として使用した以外は実施例６と同様に操作し 、標記化合物を得た。

実施例９：　トリフェニルシリルエチルホスホン酸水素塩−ＤＢＵ試薬の調製 Ｎ−メチルモルホリン（８ｇ当量）、トリアゾール（３３当量）及びＰＣＩｓ（ １０当量）の溶液に０℃でトリフェニルシリルエタノールを加えた。反応物をこ の温度で２゜５時間撹拌した。１００Ｍｍ　１．５−ジアザビシクロ［５，４， ０］ウンデク−５−エン（ＤＢＵ）−重炭酸塩を加えることにより反応を停止し 、相を分離した。有機相をストリップして減圧乾燥し、粗ホスホン酸水素塩−Ｄ ＢＵをクロマトグラフィーにより精製した。

Ｃ，リン酸化保護オリゴヌクレオチドの調製及びその脱保護 ａ）ＤＮＡの自動リン酸化における（６）の使用ホスホラミシト（６）（上記実 施例６）を使用してＡＢｌ　（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、ＣＡ）３８０Ａ　ＤＮ Ａ５ｙｎｔｈｅｓ　１ｚｅｒにより２５量体オリゴヌクレオチドを１μｍｏｌレ ベルでリン酸化した。「待機」時間（ホスホラミシト溶液と支持体との接触時間 ）及び「洗浄」時間をいずれも２倍にした以外は、製造業者の合成プログラムに 従ってホスホラミシトカップリングを行った。分取ＨＰＬＣの結果、図１に示す ように全長オリゴから不良配列の分離が観察された。

ｂ）リン酸化オリゴヌクレオチドの脱保護ａｐ　Ｐｔｔ３ＳｉＦ　＋　Ｃ２Ｈ４ ａ）から収集した材料（７）を減圧乾燥した後、エタノール沈殿させた。次にＤ ＭＳＯ／１．０Ｍテトラ−ｎ−ブチルアンモニウムフルオライド（ＴＢＡＦ）　 （Ａ　ｌ　ｄ　ｒ　ｉｃｈ、Ｍｉ　１ｗａｕｋｅｅ、Ｗｌ）１００／１００μＬ を使用して精製ＤＮＡを脱シリル化した。反応は６８℃加熱ブロック中で３．５ 時間行った。反応物を水３００μＬで５００μＬに希釈し、反応物をＮＡＰ−５ カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）に通すことにより 脱塩した。溶離液１．０ｍＬを減圧乾燥した後、エタノール沈殿させ、精製され た末端リン酸化ＤＮＡを得た。

この材料のＨＰＬＣ分析を図２に示す。

実施例１１： 実施例６のホスホラミシト試薬の代わりに実施例５のホスホラミシト試薬を使用 した以外は実施例１０と同様に操実施例６のホスホラミシト試薬の代わりに実施 例７のホスホラミシト試薬を使用した以外は実施例１０と同様に操実施例６のホ スホラミシト試薬の代わりに実施例８のホスホラミシト試薬を使用した以外は実 施例１０と同様に操カップリング試薬を塩化アダマントイルとし、キャッピング 試薬をホスホン酸水素β−シアノエチルとした以外は、Ｆｒｏｅｈｌｅｒら、Ｔ ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　２７：４６９−４７２（１９８６） の一般反応プロトコル及び条件に従い、実施例９からの試薬を使用してオリゴヌ クレオチドをリン酸化した。５゛−ヒドロキシオリゴヌクレオチドを塩化アダマ ントイル触媒によりホスホン酸水素トリフェニルシリルエチルと力・ツブリング 後、オリゴヌクレオチド中の全ホスホン酸水素塩結合をヨウ素でホスホジエステ ル酸化状態まで酸化した。得られたオリゴヌクレオチドは、ホスホラミシト化学 を使用して調製される同一配列のＤＮＡと同様にＨＰＬＣ上で分離することがで きる。この材料をホスホラミシトにより調製されるオリゴヌクレオチドと同様に 脱シリル化してもよい。

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．ａ）アルケニル基の二重結合間にＨ及びシリル基の付加を触媒することが可 能な金属触媒の存在下で、式：▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒａは炭素数２〜約２０の直鎖又は枝分かれ鎖アルケニルであり、Ｒｂ はＨ又は低級アルキルである）のビニルエステルを式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ５，Ｒ６及びＲ７はＨ；アルキル、アリール、置換アルキル、置換ア リール；アルキル、アリール、置換アルキル及び置換アリールのオキサ及びチア 類似体；並びにハロゲンから構成される群から独立して選択される）のシランで ヒドロシル化し、シリル置換エステルを形成する段階と、 ｂ）緩塩基の存在下でシリル置換エステルをアルコールに加水分解する段階と を含むシリルアルコールの合成方法。
2. ２．Ｒａが低級アルケニルであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. ３．Ｒａがビニルであることを特徴とする請求項２に記載の方法。
4. ４．Ｒｂが低級アルキルであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
5. ５．Ｒｂがメチルであることを特徴とする請求項４に記載の方法。
6. ６．Ｒ５、Ｒ６及びＲ７の少なくとも１個が立体的に嵩高の基から構成されるこ とを特徴とする請求項１に記載の方法。
7. ７．Ｒ５、Ｒ６及びＲ７の少なくとも１個が疎水性基から構成されることを特徴 とする請求項１に記載の方法。
8. ８．ヒドロシル化が約０．１〜約４モルのトルエン溶液中で実施されることを特 徴とする請求項１に記載の方法。
9. ９．前記金属触媒がコバルト、ニッケル、白金、パラジウム及びロジウムから構 成される群から選択される金属を有する遷移金属錯体であることを特徴とする請 求項１に記載の方法。
10. １０．前記金属触媒が｛ＲｈＣｌ（ＣＯ）２｝２であることを特徴とする請求項 ９に記載の方法。
11. １１．前記加水分解がプロトン性溶剤中で実施されることを特徴とする請求項１ に記載の方法。
12. １２．前記緩塩基がＫ２ＣＯ３のアルコール溶液であることを特徴とする請求項 １に記載の方法。
13. １３．前記Ｋ２ＣＯ３が０．１：１〜２．５：１の塩基：酢酸塩モル比で存在す ることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
14. １４．望ましくない副反応生成物からシリル置換アルコールを分離する段階を更 に含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。