JPH06510750A - 炎症性関節炎治療を目的としてインタ−ロイキン受容体を標的にした分子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 炎症性関節炎治療を目的としてインターロイキン受容体を標的にした分子発明の 背景 本発明の分野は炎症性関節炎の治療である。

炎症性関節炎はリンホカインによって仲介される関節の炎症を特徴とする一部の 関節疾患である。炎症性関節炎は変形関節炎、乾癖関節炎、及び狼癒関連関節炎 の場合のようにその起源はしばしば自己免疫である。炎症性関節炎の最も普通の 型は変形関節炎で、人口の約１パーセントに起こっている。変形関節炎は関節の 持続性炎症が特徴である。炎症は究極的には軟骨破壊と骨腐食に至ることがある 。

５ｔｕｋｅｌら（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　６４：６８３．　１９８８）は抗イン ターロイキンー２受容体に対する単クローン抗体が、受動的にラットに転移され たアジュバント関節炎（即ち、アジュバント関節炎を持つラットから採取した牌 臓細胞を実験未使用ラットに移入することによって誘導されたアジュバント関節 炎）を抑制するが、ラットにおけるアジュバント関節炎の発生を抑制する活性は 無いと報告している。

Ｃａ５ｅら（Ｐｒｉｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、ＳｃＬ、ＵＳＡ　８６：２８７、 １９８９）は、明白に臨床症状が確立する前に細胞毒性インターロイキン−２− シュードモナス外毒素融合蛋白質をラットに投与すると、アジュバント誘導関節 炎を緩和すると報告している。

発明の概要 一般に本発明は炎症性関節炎を持つ患者を治療する方法を特徴とし、この方法に は患者のリンパ球上に発現された蛋白質様細胞受容体に特異的に結合する能力が あり、患者の炎症性関節炎の一因となる分子の患者への投与が含まれている。

この分子はリンパ球の生存率を減少させる力がある。“細胞受容体°とは、細胞 のＤＮＡによってコードされ、リガンドを結合し、発現されると分子の少なくと も一部は細胞表面上に露出しているような分子を意味する。“特異的結合”とは 、その分子が他の細胞受容体あるいは細胞表面蛋白質には実質的に結合しないこ とを意味する。“生存率を低減する°とは、死滅させる、あるいは増殖を妨害す ることを意味する。“リガンド”とは、ある蛋白質に結合する能力を有する分子 を意味する。

種々の好適な態様において、炎症性関節炎は変形関節炎であり、炎症性関節炎は 全身性エリテマトーデス関連の関節炎であり、炎症性関節炎は乾癖関節炎のこと もある。蛋白質様細胞受容体は、高親和性インターロイキン−２−受容体であり 、分子は細胞受容体保持リンパ球を死滅させるもので、この分子は互いに共有結 合した第一と第二の部分を含むハイブリッド分子であり、第一の部分は細胞の生 存率を低下させる能力のある分子を含み、第二の部分は細胞受容体に特異的に結 合できる分子を含んでいる。この分子はシクロスポリンＡと共に投与され、シク ロスポリンＡは十分に無毒な用量で投与される。分子は患者の関節炎の症状が十 分に改善される迄投与され、これに続いてシクロスポリンＡが患者に投与され、 シクロスポリンＡは十分に無毒な用量で投与される。

さらに好適な態様において、分子の第二の部分は、細胞受容体に特異的な抗体の 全体あるいは結合部分を含む。分子の第二の部分は細胞受容体に対するリガンド の全体あるいは結合部分を含む。このリガンドはインターロイキンである。この 分子の第一の部分は細胞毒素を含む。細胞毒素はペプチド毒素の断片で、酵素的 活性を持つが、一般化された真核細胞受容体に結合する活性は持っていない。

そして細胞毒素の断片はジフテリア毒素の断片Ａと細胞膜に細孔を作るのに十分 なジフテリア毒素の断片Ｂを含む。

なお一層好適な態様においては、分子はＤＡＢ４８６１Ｌ−２である。分子はＤ ＡＢ　ＩＬ−４であり、分子はＤＡＢ３８９１Ｌ−６のこともある。インター口 イキンはインターロイキン−４てあり、また、インターロイキンはインターロイ キン−６である。

他の好適な態様において、分子は細胞受容体に対する特異的抗体の全体あるいは 結合部分を含み、この抗体は補体を活性化する抗体である。

関連する局面において、本発明は炎症性関節炎を持つ患者における骨腐食を軽減 する方法を特徴とする。この方法は、患者のリンパ球上に発現されたインターロ イキン受容体に特異的に結合する能力を持ち、患者の炎症性関節炎の一因となっ ている分子を患者に投与することを含む。この分子はリンパ球の生存率を低下さ せる能力を持つ。

好適な態様において、炎症性関節炎は変形関節炎である。分子はＤ　Ａ　８４８ ６１Ｌ−２であり、また、分子はＤＡＢ３８９１Ｌ−２である。

関連する局面において、本発明は炎症性関節炎を持つ患者の疼痛を軽減する方法 を特徴とする。この方法は患者のリンパ球上に発現された蛋白質様細胞受容体に 特異的に結合することができ、患者の炎症性関節炎の一因となっている分子の患 者への投与を含む。この分子はリンパ球の生存率を低減する能力を持つ。

関連する局面において、本発明は炎症性関節炎を持つ患者を処置するためにシク ロスポリンＡを用いる方法を特徴とする。この方法は患者のリンパ球上に発現さ れた蛋白質様細胞受容体に特異的に結合することができ、患者の炎症性関節炎の 一因である分子を患者に投与することを含む。この分子はリンパ球の生存率を低 減することができる。シクロスポリンＡは十分に無毒な用量で投与される。

本発明の他の特徴と利点は、その好適な態様についての以下の記述と特許請求の 範囲から明白になるであろう。

発明の詳細な説明 最初に図の簡単な説明をする。

図１は、アジュバント関節炎の誘発に対するＤＡ８４８６１Ｌ−２による処置効 果のグラフ表示である。関節炎指数（下記のようにして測定）は、アジュバント 免疫後の日数の関数として表現されている。動物は、−１日〜９日にトリス緩衝 食塩液（実線）、あるいは０．５ｍｇ／ｋｇＤＡＢ４８６１　Ｌ−２（破線）で 処置された。

図２は、−１日〜９日に緩衝液（図面Ａ）、あるいはＤＡＢ４８６１Ｌ−２（図 面Ｂ）で処置されたアジュバント誘導関節炎ラットの２２日目の後肢の一対のラ ジオグラフである。

図３は、免疫後２２日目のアジュバントで関節炎を誘導されたラットから採取し た足首関節の一組の写真である。ラットは、−１日〜９日にトリス緩衝食塩液（ 図面ＡとＢ）、あるいはＤＡＢ４８６１Ｌ−２（図面ＣとＤ）で処置された。

図４は、アジュバント関節炎を誘導され、ＣｏｎＡあるいはＭ、　ｂｕｔｙｒｉ ｃｕｍで刺激されたラットから分離した膝窩リンパ節リンパ球の増殖応答のグラ フ表示である。刺激指数は緩衝液のみ（白抜き棒）、あるいはＤＡＢ４８．ＩＬ −２（斜線棒）で処理された細胞に対して示されている。

図５は、抗ジフテリア毒素抗体を既に持っているラットにおけるアジ二ノ（ント 関節炎誘導に対するＤＡＢ４８６１Ｌ−２の効果のグラフ表示である。関節炎指 数（下記のように測定）は、アジュバント免疫後の日数の関数として表現されて いる。実験未使用動物は、−１日〜９日にトリス緩衝食塩液（実線、Ａ）、ある いは０．５ｍｇ／ｋｇＤＡＢ４８６１Ｌ−２（破線、Ｄ）で処置された。免疫前 の動物は同様に一１日〜９日にトリス緩衝食塩液（破線、Ｂ）、あるいは０．　 ５ｍｇ／ｋｇＤＡＢ　ＩＬ−２（点線、Ｃ）の処置を受けた。

図６は、既に発症しているアジュバント関節炎に対するＤＡＢ、８８１Ｌ−２効 果のグラフ表示である。関節炎指数（下記のように測定）はアジュノ（シト免疫 後の日数の関数として表されている。動物は１１〜２１日にトリス緩衝食塩液（ 実線）、あるいは０．５ｍ　ｇ／　ｋ　ｇＤＡＢ４ｓａ　Ｉ　Ｌ　２で処置され た。

図７は、アジュバント関節炎のラジオグラフの特徴に対するＤＡＢ、８６１Ｌ− ２遅延処置の効果をグラフで表現したものである。後肢のラジオグラフ番よ、１ １〜２１日にわたって緩衝液（白抜き捧）、あるいはＤＡ８４８Ｂ　Ｉ　Ｌ　２ 　（斜線棒）で処置されたラットから２２日目に撮影された。ラジオグラフは次 のよう１こ等両分けされた：〇−疾病の証拠なし、１−軟組織腫張、２−軽度の 新前形成を伴う軟組織腫張、３−広範な新前形成を伴う重度の軟組織腫張。

ラットのアジュバント関節炎に対するＤＡ８４８６１Ｌ−２の効果慢性アジュバ ント関節炎は一つの自己免疫疾患であり、遺伝的感受性ラットを細菌由来のアジ ュバントで免疫することによって実験的に誘導すること力（できる。

この疾病は末端四肢を含む亜急性多発関節炎を特徴とし、ヒトの変形関節炎１こ 臨床的にも病理学的にも類似している。類似には、骨膜炎、）くンヌス形成、軟 骨破損、及び骨腐食が含まれる（Ｈｏｌｏｓｈｉｔｚ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｌｎｃ ｅｔ。

２：３０５．　１９８６）。疾病の病因に活性化ＴリンＸ球が関連することｌよ 、アジュバント関節炎が、特定の他の自己免疫疾患動物モデルのように（例えば 、アレルギー性脳を髄炎、連鎖球菌細胞壁誘導による関節炎、コラーゲンＩＩ型 誘導関節炎、及び非肥満型糖尿病）、罹患動物から新たに分離されたリンパ球、 あるいは選別されたＴ細胞クローンを受容動物に注射することによって受動的に 移入できるという観察によって証明されている（Ｐｒｕｄ’ｈｏｍｍｅ　ｅｔ　 ａｌ、、　Ｌａｂ、　Ｉｎｖｅｓｔ、、　５９：１５８．　１９８８）。

アジュバント関節炎は、雌Ｌｅｗｉｓ系ラット（１００〜１２５ｇ；　ＨａｒＩ ａｎ　Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ　Ｉｎｃ、、　Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ 、　ＩＮ）に殺菌乾燥したＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ（ Ｄｉｆｃｏ、　Ｄｅｔｒｏｉｔ、Ｍｌ）１０ｍｇ／ｍｌの重鉱油懸濁液（Ｓｉｇ ｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｔｓ、ＭＯ）を注射するこ とによって誘導された。前記懸濁液１００μｌを、軽いメトキシフルラン麻酔ド にある動物の上背部の４〜６箇所に対し、０日に皮肉注射した。各ラットは毎日 関節炎の臨床症状を評価された。関節炎の重症度は６足を０〜４の尺度で評点し て定量化した。これは末端関節の腫張と紅斑の重症度を示すもので（〇−疾病症 状なし、１−疾病が少数の定末端関節に顕性、２−疾病が足末端関節全部に顕性 、３−疾病が全部の足に顕性、及び４−重症疾病が全部の足に顕性（Ｔｒｅｎｔ ｂａｍ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、　１４６：８５７）。関節 炎指数は各動物について、最大可能評点を１６とする全四肢の評点の合計と定義 された。動物は各実験の期間にわたって数人の異なる観察者によって評価された 。

ミコバクテリアアジュバントで免疫されたラットは免疫後はぼ１０日目に典型的 に東端疾病の兆候を顕す。犀の腫張と紅斑の重症度は２０日〜２５日目迄急速に 上昇し、各個の関節炎指数も１０〜１４と高くなる。臨床症状は次いて漸減し、 ４０日迄にピーク値の凡そ５０９６のレベルとなる。ラットは無差別に実験グル ープ（１０匹／グループ）に配分され、０．０２Ｍ１−リス（ｐＨ８，２）　− ０゜１５ＭＮａＣ１に溶かしたＤ　Ａ　８４８６１　Ｌ　２　、あるいは緩衝液 のみで処置された。処置は疾病の誘導期間（−１〜９日）、あるいは関節炎症候 が発現（１１〜２１日）した後に行われた。

０．５ｍｇ／ｋｇのＤＡＢ４８６１Ｌ−２をアジュバント投与の前日から免疫後 ９日目迄毎日皮下注射すると、疾病に関連した炎症が著しく減少した。疾病の始 まりはほぼ２日遅延し、末端関節の腫張と紅斑の度合いは、緩衝液処置動物にお けるよりも２〜４倍、ひどくはなかった。図１に示された研究において、ＤＡＢ ４８６ＩＬ−２で処置された動物は、２２日目に最高平均関節炎指数３．０を示 したが、この値はその後減少して、動物は４０日目に平均評点、凡そ１，６に到 達した。これに対して緩衝液で処置された対照動物は最高平均関節炎指数８．５ を示し、この値は平均値でたったの３．８に減少したに過ぎなかった。その後の 研究によって０日〜９日にわたるＤＡ８４８ＢＩＬ−２による処置は、−１日〜 ９日にわたる処置に匹敵する結果を与えることが証明された。

免疫後２２日目に緩衝液処置の終了した動物の後肢のラジオグラフ分析は、足と 足首部分全体にわたって広範な軟組織腫張を示した（図２、パネルＡ）。この観 察結果に伴って、関節間隔の狭搾、及び中足部に放射活性密度のより大きな不規 則な領域によって示されるように中度の新前形成が見られた。これに対し、誘導 期間（−１日〜９日）中、ＤＡＢ４８．ＩＬ−２で処置された動物から採取され た後肢のラジオグラフは足首領域にほんの軽度の軟組織腫張を示したのみで、骨 破壊あるいは新開形成は認められなかった（図２、パネルＢ）。

組織病理学的分析のために、後肢はＴｅ１ｌｙの固定液（氷酢酸：ホルムアルデ ヒド：７０％エタノール比　１：２：１０）に保存された。肢は次いで脱カルシ ウム処理し、パラフィンに包埋し、中足領域を通じ中線に沿って切片とし、ヘマ トキンリンとエオシンで染色した。切片の評価は、炎症性単核細胞浸潤、関節間 隔狭搾及び骨膜新１形成に基づいて行われた。

免疫後２２日目に実験終了した緩衝液処置対照動物からの切片の顕微鏡検査によ って広範な疾病の兆候が明らかとなった。発見の中には、肥厚した滑液関節内膜 、広範な炎症性浸潤形成肉芽腫病変、及び、付破壊と既存の竹に垂直、及び突き 刺さる新前形成を特徴とする重篤な増殖性骨髄炎が含まれていた（図３、パネル Ａ１図３、パネルＢ）。誘導期間（−１日〜９日）中、ＤＡ８４８６で処置され た動物の関節の検査により、ＤＡ８４８６１Ｌ−２処置はアジュバント関節炎の 特徴である広範な肴の作り替えを完全に阻害することを示唆し、前記放射線学的 検査の結果を確二旧〜た。誘導期間中ＤＡＢ４８６１　Ｌ−２の処置を受けた動 物における関節炎の唯一の証拠は滑液分圧・内膜の軽度の肥厚であった（図３、 パネルＣ；図３、パネルＤ）。

ミコバクテリアアジュバントで免疫後１０日の動物から分離した膝窩リンパ節細 胞の増殖性応答を評価した。

動物は安楽死させ、膝窩リンパ節細胞を無菌状態で採取した。リンパ節は細裂し て単一細胞の懸濁液を得た。細胞は、９６ウエルＵ型底のミクロタイタープレー ト上、５９６ウシ胎児血清と２Ｘ１０−５Ｍの２−＝メルカプトエタノールを含 むＲＰＭＩ　１６４０中で、Ｉ　Ｘ　１０Ｇ／ｍ　ｌ　ノ４１度Ｔ培ｉ１シタ。

次イテ、１００μｍのＣｏｎＡ（’ｇ１ｇ／ｍｌ）、Ｍ、ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ（ ８０／７ｇ／ｍｌ）あるいは培地のみを１ＱＱ７１１の細胞懸濁液を含む４つ一 組のウェルに添加した。

細胞は７２時間インキ二へ一トシ、０．６２５７１Ｃｉ／つ１ルの［メチル−３ Ｈコチミン′ン（比放射活性、２０　Ｃｉ　／ｎ１Ｍ）で−晩パルスラヘルし、 採集して放射活性取り込みを測定した。緩衝液処置動物から分離された細胞は、 Ｍ、　ｂｕｔｙｒｉｃｕｍによる刺激には活発に応答したく図４）。これに対し ２、Ｄ　Ａ　８４８　ＢＩ　Ｌ　−、、２で処置された動物からの細胞は、特異 的ミコバクテリア抗原に対して著しく抑制された増殖応答を示した。この発見は 増殖応答の全般的抑制の結果ではない。それはＤＡＢ４８６１Ｌ−２処置動物か らの細胞のＣｏｎＡ刺激は緩衝液処置対象動物からの細胞の応答と同等であった からである（図４）。完全アジュバントで免疫されないで、緩衝液あるいはＤＡ 、８４８６１　Ｌ、−２で処置された動物由来の細胞の増殖応答もまた評価され 、匹敵する結果が得られた。

ＤＡＢ４８６１Ｌ−２活性に対する抗ジフテリア毒素抗体の潜在的効果を評価す るために、アジュバン・ト免疫およびＤＡ８４８６１Ｌ−２処置前にラットをジ フテリアトキソイドで免疫した。ラット（７５〜１００ｇ）は１００μｇのジフ テリアトキソイド（ＭａＳｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ　５ｔａｔｅ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｉｅｓ、　Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）の筋肉内注射を５日間連続して受けた。１ ０日後面液サンプルを各動物から採取し、抗ＤＡＢ４８６１Ｌ−２抗体レベルを ＥＬＩＳＡアッセイで分析した。簡単に述べると、９６ウエル柔軟プレートをウ ェル当たりｌｕｇのＤＡＢ４８６１Ｌ−２で一晩コートし、ＰＢＳ中、００５％ Ｔｗｅｅｎ２０　（Ｓ　ｉ　ｇｍａ）に溶かして作成１−７た０、１％ゼラチン でブロックして０．０５％Ｔｗ　６　ｅ　ｎ　−Ｐ　Ｂ　Ｓて洗浄した。各血清 試料の８回連続５倍希釈液をコートされたプレートに加えた（ウェル当たり１０ ０μｍ）。プレートは室温で］時間インキュベートして、洗浄後、アルカリホス ファターゼを結合し、アフィニティーを用いて精製したヤギ抗ラット免疫グロブ リン（Ｃａｐｐｅｌ、Ｗｅｓｔ　Ｃｈｅｓｔｅｒ、　ＰＡ）を適当に希釈したも のとインキュベートし、アルカリホスファターゼの基質（Ｋｉｒｋｅｇｕａｒｄ 　ａｎｄ　Ｐｅｒｒｙ。

Ｇａｉｔｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ）で発色した。抗体価は、自動プレートと読取 り器で分析する際、４０５μｍにおける吸光度が０．１より大きいか、あるいは それに等し、くなる最大希釈とし、て決定した。

ヒトＩ　Ｌ、＝２受容体発現細胞系に対するＤＡＢ４８６１　Ｌ−２の生物学的 活性を中和することのできる抗体は、インビトロアッセイで測定した。各血清試 料を１５％ウシ胎児血清を含むＲＰＭ＋１６４０培地で２倍希釈（−１同容量の ＤＡＢ４８底ミクロダミクロタイターウェル（１３）。細胞は］晩インキュベー トし、２゜５ｚＣｉ／ｍｌ　［１４Ｃ］　ｏイシン（比放射能３００ｍＣ１／ｍ ｈ４／＞とロイシンを含まぬＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、 ＮＹ）中で２時間パルスラベルして、採取し、放射能の取り込みを測定しｔ；。

このアッセイ終末点は、取り込みのレベルが対照細胞の値の２０％より大きいか 、あるいはそれに等しくなるように細胞を防御する血清の最大希釈と定義される 。このアッセイの結果は中和活性単位として報告される。ジフテリア抗毒素の１ 国際中和単位は、２゜５μｇの毒素を中和する抗体量として定義される。我々は この定義を伸展してモル基準で（２，７Ｉ１ｇ）ＤＡＢ４８６１　Ｌ−２の当量 を中和する抗体量とする。

Ｎ１．　ｂｕｔｒｙｉｃｕｍて免疫する時点で、これらの動物はジフテリア毒素 とＤＡ８４８６１Ｌ−２に対する中度レベルの抗体を持っていた（］：１２５の 甲均ＥＬＩＳＡ値及び少なくとも０．０１ユニット／ｍｌの中和抗体レベル）。

しかしながら、ジフテリア毒素に対する抗体の存在は、疾病誘導期間中、ＤＡＢ ４８６１Ｌ−２処置の効果を変えなかった（図５）。実験未使用及び免疫前動物 両者に対する臨床経過は同一であった。ＤＡＢ４８６１Ｌ−２処置動物は、免疫 前及び実験未使用ともに、最高平均関節炎指数は４であったが、一方、対照動物 は、免疫前及び実験未使用ともに、最高平均関節炎指数は１３であった。

アジュバント誘導関節炎の根底にある骨破壊に影響を与えるＤＡ８４８６１　Ｌ −２の能力をさらにの検討するために、疾病が確立している間のＤＡＢ、８６１ Ｌ−２処置の効果が検討された。疾病誘導期間中のＤＡＢ４８６１Ｌ−２処置で 観察された効果とは異なり、同用量のＤ　Ａ　Ｂ　４ｇ６１　Ｌ　２の投与を、 関節炎症状が１１日日目発症した後に始め、２１日１まで継続しても、疾病の臨 床症状には見るべき変化は起こらなかった（図６）。遅延処置を受けたラットか ら採取した関節の組織学的切片は、広範な単核球の炎症性浸潤を示し、炎症の臨 床徴候と一致していた。しかしながら、ラジオグラフ分析は、臨床的関節炎指数 が同様であるにも拘らず、竹腐食と新管形成が、緩衝液処置対照動物（６０％） よりもＤ　Ａ　８４８６Ｉ　Ｌ−２処置動物の方に低いパーセント（３０％）で 観察されたことを証明していた（図７）。

変形関節炎ダ遭のためのＤＡＢ、８６１Ｌ−２ＤＡ　Ｂ４８６Ｉ　Ｌ−２が変形 関節炎治療のヒト臨床試験で検討された。１３名の重症変形関節炎患者が、その 疾病の治療に使用された他の薬物（普通メトトレキサ＝−トあるいはシクロスポ リン）の洗い出しを３週間受け、Ｄ　Ａ　８４８６１　Ｌ　２を０．０７５ｍｇ ／ｋｇ／Ｂ、あるいは０．１ｍｇ／ｋｇ／日の用量で、１時間かけての静脈内注 射を７Ｆ−１間継続して受けた。１コースの治療後、４名の患者が有意の応答を 示しく関節の腫張と疼痛に５００６以上の改善）、１名は有意の応答（関節の腫 張と疼痛に２５００以上の改善、及び少なくとも２−〕あるいは４つの他の測定 可能のパラメ・−タ（沈降速度、把握力、５０秒歩行時間、及び観察者の評点） に２５０６以上の改善を、６名の患者は生物学的効果（３つのパラメータについ て３週間内に２５９６以」二の改善）を示したが、１名の患者は応答がなかった 。

１３名のうち３名の患者は、２回目の治療コースを受けた。このうち２名は相当 な応答を、１名は事物学的応答を示した。

一般的に、本発明に有用な分子が作用するには３つの手段がある：　（１）分子 が細胞毒性ドメインを持っているので、その分子が細胞を殺す；　（２）分子（ 抗体）が補体結合を誘導することにより細胞溶解を引き起こすことができる；及 び（３）分子が受容体のリガンドの結合あるいは取り込みを阻止することができ る。

３つすべての場合において、分子は受容体保持細胞を標的としてそれに向けられ なければならない。これは、受容体のリガンド（あるいはその一部またはその誘 導体）、あるいは抗受容体抗体を分子の一部分として含むことによって達成され る。

炎症性関節炎の治療に有用でインターロイキン−２受容体を標的とするようにさ れた分子は、これら３つの解決手段の夫々の例を提供する。ＩＬ−２のＩＬ−２ 受容体への結合部分及びあるサイトトキシンを含む融合分子は、炎症性関節炎に 関連する活性化されたリンパ球、及び単球／マクロファージを殺すのに用いるこ とができる。同様に、前記の第二型分子、この場合ＩＬ−２受容体に対する補体 結合体は、！Ｌ−２受容体保持細胞を除去することができる。この例では、第三 型分子はＩ　Ｌ−２がその受容体に結合することを阻害するような分子である。

この分子は疾病細胞が［Ｌ−２からの増殖信号の受信を防止し、それによって炎 症反応を抑制し得るものである。

炎症性関節炎を持つ患者の治療に有用な分子はいくつかの形態を取ることができ る。ＩＬ−２自身が標的指向試薬である場合、その分子は、Ｉ　Ｌ−２が毒素分 子、望ましいのはポリペプチドトキシンに融合したハイブリッド分子であり得る 。

ＩＬ、−２Ｈに結合し、Ｉ　Ｌ−２活性を欠き、本物のＩＬ−２の結合及び／あ るいは取り込みを阻止するＩ　Ｌ−２誘導体は、本発明の方法に有用である。そ れは、これら誘導体は夏Ｌ−２Ｒ保持細胞のＩＬ−２誘導の増殖を阻害するから である。

抗ＩＬ−２Ｒ抗体が標的指向試薬である場合、抗体全体あるいはその一部をサイ トトキシンに融合することによって、細胞毒性ハイブリッド分子を形成すること ができる。このような抗体／トキシンハイブリッドの有効性は、ＩＬ−２／）キ シンハイブリッドの場合のように、ハイブリッド分子が結合する細胞によって取 り込まれることに依存する。Ｉ　Ｌ−２の結合及び／あるいは取り込みを阻止す る抗ＩＬ−２Ｒ抗体もまた本発明の方法にｆｆ用である。細胞溶解性抗Ｉ　Ｌ− ２Ｈ抗体は、ＩＬ−２Ｒ保持細胞の補体仲介による溶解を引き起こすことができ るので本発明に有用である。

分子のあるものは、２つ、あるいはそれ以上の分子の全体、あるいは一部の融合 によって作ることができる。ハイブリッド分子は組換えＤＮＡ分子によってコー ドされるハイブリッド蛋白質でもあり得る。この場合、２つのドメインはペプチ ド結合により連結される（直接、あるいは中間ドメインを介して）。その代わり に、２つのドメインは別々に作られ、別途の化学的連結手段において共有結合に より連結することもできる。ある場合には、ハイブリッド分子の細胞毒性ドメイ ンはそれ自身２つの別個の分子に由来することもある。

標的指向試薬としてのインターロイキン−２Ｉ　Ｌ　−２、あるいはＩＬ−２受 容体と結合するその誘導体は、サイトトキシンのための標的指向試薬として使用 することができる。ＩＬ−２のＤＮＡ及びアミノ酸配列は知られており（Ｔａｄ ａｔｓｕｇｕ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ３０２：３０５．　１９８３）、 その構造はＸ線結晶学により予測されている（Ｂｒａｎｄｈｕｂｅｒ　ｅｔ　ａ ｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３８：１７０７゜１９８７）。ＩＬ−２の遺伝子操 作変異型の分析は、どの残基がＩＬ−２Ｒとの結６（Ｃｏｌｌｉｎｓ　ｅｔ　ａ ｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５ニア７０９．　１９８８）及び生物活性（Ｃｏｈｅｎｅ ｔ　ａｌｌ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３４：３４９．　１９８９；　Ｃｏ１１ｉｎ ｓ、、前出）にとって重要であるかに関しである程度の情報を提供している。

本発明に有用なＩ　Ｌ−２変異型には、残基７４と７９間領域（番号付けはＷｉ ｌｌｉａｍｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１６：１０４ ５．１．９８８に従って）のアミノ酸残基の１つ、あるいはそれ以上を欠く欠失 突然変異体（Ｇｅｎｂａｕｆｆｅ　ｅｔ　ａｌ、、ＵＳＳＮ　３８８：５５７゜ 本願に引用して編入されている）が含まれる。これらの突然変異体はトキシン（ 毒素）を効果的に標的であるＩＬ−２Ｒ保持細胞に向ける（Ｇｅｎｂａｕｆｆｅ 　ｅｔ　ａｌ、、前出）。一般的に、サイトトキシンを標的に向けるのに有用な ＩＩ、−２変異体は効率よ＜　Ｉ　Ｌ−２Ｈに結合し、エンドサイト−シスされ なければならない。種々の誘導体のＩ　Ｌ−２受容体結合能力は、下記のＩＬ− ２Ｈ結合アッセイで検査することができる。

Ｉ　Ｌ−２受容体保持細胞を標的とする分子を設計するに当たって、Ｉ　Ｌ−２ 受容体には、他の受容体のように、いくつかの型があることを認識すべきであり 、１つの型を保持し、他の型を保持しない細胞を標的とすることが望ましいがも しれない。ヒトのインターロイキン２受容体には、高親和性、中間親和性、及び 低親和性の型がある。高親和性受容体は、〜１０”Ｍの見掛けのＫ　を持ち、２ つのサブユニット、ｐ５５とｐ７５　（ｐ７０とも呼ばれる）からなっている。

細胞表面に発現された時、ｐ７５及びｐ５５サブユニットは共にＩ　Ｌ−２を結 合すＭ）に相当する。ｐ７５サブユニットは、休止Ｔ細胞、ナチュラルキラー細 胞である単球／マクロファージ、及びリンフ才力インで活性化されるキラー（Ｌ ＡＫ）細胞前駆体の表面に発現されるが、高親和性受容体は活性化されたＴ細胞 とＢ細胞上に発現される。

本発明の方法においては、高親和性受容体保持細胞のみを標的とすることが望ま しいかもしれない。このような状況下で、有用な分子は、中間、あるいは低親和 性受容体を保持する細胞には殆ど影響を与えないような濃度で、高親和性受容体 保持細胞を除去、あるいは中和する。分子が、Ｉ　Ｌ−２自身のように、ＩＬ− ２受容体の３つの型すべてに親和性を持つ場合、選択性は、親和性のより低い受 容体を保持する細胞にはそれ程結合させないような濃度で分子を投与することに よって達成することができる。ハイブリッド分子は、Ｉ　Ｌ−２に比べ、受容体 親和性を変えるかもしれない。このようなハイブリッド分子は、多かれ少ながれ 、高親和性Ｉ　Ｌ−２受容体保持細胞に対して選択的であることがある。例えば 、高親和性受容体保持細胞は、中間親和性受容体保持細胞よりも、ＤＡＢ４８６ １Ｌ−２、即ち、ジフテリアトキシンの一部とＩ　Ｌ−２の一部からなる融合蛋 白質に対して５００〜１０００倍も感度が高い（Ｗａｔｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ、、 　Ｅｕｒ。

Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　２０ニア８５．　１９９０）。

サイトトキシンは、ＩＬ−２誘導体にいくつかの手段で結合することができる。

望ましいのは、ＩＬ−２／トキシンハイブリツドが、人工融合遺伝子の発現によ って作られたハイブリッド蛋白質であることである。代わりに、サイトトキシン とＩＬ−２誘導体は別々に作り、後に、非ペプチド共有結合によ７て連結するこ とができる。連結方法は以下に記す。

標的指向試薬としてのインターロイキン４及びインターロイキン６インターロイ キ゛／４（ＩＬ４）は種々の細胞型に作用するサイトカインの１つである。その 受容体は、ＣＤ４　Ｔ細胞及び単球を含むいくつかの細胞型上に発現する。ＩＬ −４はＴ細胞の１つの成長因子とＬ７て働くことができ、Ｉ　Ｌ　−２誘導のリ ンパ球増殖に影響を持つと考えられている。高レベルのインターロイキン６　（ ＩＬ−６）が活性変形関節炎を持つ患者の滑液に検出されている（Ｈｉｒａｎｏ 　ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１８：１７９７゜１９ ８８）。

Ｉ　Ｌ　−４受容体保持細胞、あるいはＩＬ−６受容体保持細胞向けのサイトト キシンはＩＬ−２Ｒ保持細胞向けの分子のｑ幼性を高めることがある。ＩＬ−４ 、及び！Ｌ−６の蛋白質とＤＮＡの配列は分かつている（Ｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ、 。

Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６３：１０８１７．　１９８８；　Ｈｉｒａ ｎｏ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３２４ニア３．　１９８６）ｏ　これら のリンホカインは１１−２／トキシンハイブリソド分子に類似したノ＼イブ１ル ツドであるリンホカイン／トキシン分子を創製するのに用いることができる。

標的指向試薬としての単クローン抗体 特に選ばれたリンホカイン受容体に対する単クローン抗体は、その受容体保持細 胞にトキシンを向けるのに利用することができる。これらの抗体、あるいは抗体 断片は、トキシンと抗体が／Ｘイブリッド蛋白質分子をコードする人工融合遺伝 子によってコードされるようにするか、あるいは別々に生成されたりガントとト キシン分子を連結するために用いられる非ペプチド共有結合によってサイトトキ シンと融合することができる。いくつかの有用なトキシンを以下に記す。

抗体／トキシンハイブリッドは、下記のＩ　Ｌ−２Ｒ保持細胞に対する試験に類 似の毒性試験を用い、受容体保持細胞を殺す能力を試験することができる。

トキシン 本発明の方法に有用なトキシン分子て望ましいのは、細胞内に存在する時のみ十 分に毒性を示すペプチドトキシンのようなトキシンである。勿論、このような条 件下で、分子は標的にされた受容体を保持する細胞に入ることができなければな らない。この能力は分子及び細胞受容体の性質に依存する。例えば、リガンドの 取り込みを当然可能にする細胞受容体は、トキシンを含む分子がその受容体を保 持する細胞に入る手段を提供する見込みがある。望ましいのは、ハイブリッド蛋 白質分子をコードする組換えＤＮＡ分子を生成することによって、ペプチドトキ シンがＩＬ−２Ｒと結合するドメインと融合することである。このような手段は 構成物の一貫性を保証する。

多くのトギシンは一般化された真核受容体への結合ドメインを持っている。この ような場合、トキシンは、標的とされている受容体を保持しない細胞の中毒を防 止するように修飾されなければならない（例えば、Ｉ　Ｌ−２受容体を保持１２ ないが、無修飾トキンンに対する受容体を保持する細胞の中毒を防止するために ）。

このような修飾は、いずれにせよ、分子の細胞毒性機能を保全するような様式で 行われなければならない（Ｕ、Ｓ、　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔ ｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　５ｅｒｖｉｃｅｓ、Ｕ、Ｓ、　５ｅｒｉａｌ　Ｎｏ。

４０１．４１２）。潜在的に引用なトキシンには、これらに限られるわけではな いが、以下のものが含まれる：コレラトキシン、リシン、０−ツガ様トキシン（ ＳＬＴ−１，５ＬＴ−１１，５ＬＴ−目ｖ）、ＬＴヒトシン、Ｃ３）キシン、シ ガトキンン、百日せきトキシン、破傷風トキシン、シュウトモナス外毒素、アロ リン、サボリン、モデクシン、及びゲラニン。

ジフテリア毒素を基盤とする分子 ジフテリア毒素は本発明の方法に有用な分子の生成に使用することができる。

ジフテリア毒素、その配列は既知で、マーフィ　（Ｍｕｒｐｈｙ）の米国特許第 ４゜６７５．３８２号に詳しく記載されており、本願に引用され編入されている 。コリネバクテリウム　シフ　エリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｄｉ ｐｈｔｈｅｒｉａｅ）によって分泌される天然のジフテリア毒素は、いくつかの 機能ドメインから成り、それらは、分子のアミノ末端から数え始めて、酵素的に 活性なフラグメントＡ（アミノ酸Ｇｌｙ　−Ａｒｇ１９３）、及びフラグメント Ｂ（アミ）酸Ｓｅｒ　−３ｅｔ　）と固定することができ、後者は転移ドメイン 、及び一般性のある細胞結合ドメイン（アミノ酸残基４７５から５３５）を含む 。

ジフテリア毒素が感受性真核細胞を中毒させる過程には少なくとも以下のステッ プが含まれる・　（１）ジフテリア毒素の結合ドメインが感受性細胞上の特異的 受容体に結合する：（ｉｉ）その受容体に結合している間に、毒素はエンドサイ トーシス（ｅｎｄｏｃｙｔ　ｉｃ）小胞内面に取り込まれる；（ｉ目）内面化以 前、あるいはエンドサイトーンス小胞内て毒素分子はフラグメントＡとＢの間で 、蛋白質分解的切断を受ける：　（ｉｖ）エンドサイト−シス小胞のｐＨが６以 下に下がると、毒素はエンドソーム膜を横断してフラグメントＡの細胞質ゾルへ の放出を容易にする。（Ｖ）フラグメントＡの触媒活性（即ち、“延長因子２′ と呼ばれる真核細胞蛋白質合成因子のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド依 存性アデノンンニリン酸（ＡＤＰ）リボンル化）は中毒された細胞の死をもたら す。

細胞質ゾルに導入されたたった１分子のフラグメントＡが細胞の蛋白質合成機構 を阻害して細胞を死滅させるのに十分なことは明らかである。シュードモナス外 毒素Ａ１及び恐らくは自然界に存在するある種の他のトキシンによる細胞を殺す 機構は非常に類似している。

ＤＡＢ　ＩＬ−２は、ジフテリア毒素の受容体結合ドメインをヒトＩ　Ｌ−２８ Ｂ の一部で置換した融合蛋白質で（Ｗｉｌｌｉａｍｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂ ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　３５：２０６７３．　１９９０；　Ｗｉｌｌｉａｍｓｅ ｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇ、　１：４９３．　１９８７も参照のこ と）、本発明の方法において有用な分子の一例である。この分子は選択的１こＩ Ｌ−２Ｒ発現癌細胞及びリンパ球を殺す（Ｗａｔｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｕ ｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　２０ニア８５．　１９９０；　Ｋｉｙｏｋａｗ ａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４９：４０４２．　１９８９） 。

活性化されたリンパ球を殺すその能力のために、ＤＡＢ　ＩＬ−２は移植片拒８ Ｂ 絶制ｉｌｌ（Ｐａｎｋｅｗｙｃｚ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｔｒａｎｓｐ＋ａｎｔａｔ ｉ。

ｎ　４７：３］３．　１９８９；　Ｋｉｃｋｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｔｒａｎ ｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　４７：３２７．　１９８９）、及びある種の自己免疫 疾病の治療（Ｆｏｒｔｅ　ｅｔ　ａｌ、、　２ｎｄ　Ｉｎｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ、　１９９０）Ｉこ用（ Ａられて来た。

ＤＡＢ、８６１Ｌ−２はキメラ分子てあり、Ｍｅｔに続＜ＩＬ−２のアミノ酸残 基２から１３３に融合された成熟ジフテリア毒素のアミノ酸残基１から４８５か ら成っている。このようにＤＡ８４８６１Ｌ−２は、分子の酵素的に活性な部分 をコードするジフテリア毒素のフラグメントＡ全体とフラグメントＢの一部を含 んでいる。ＤＡＢ４８６１Ｌ−２に存在するフラグメントＢの部分は一般化され た受容体結合ドメインを含まないが、酵素的活性部分を細胞質ゾルへの放出を容 易にする転移ドメインを含む。

旦Δ旦、８６　ＩＬ−２の調製 ＤＡＢ　ＩＬ−２はＤＡＢ４８６１　Ｌ−２をコードするプラスミド、ｐＤＷ２ ４を収納している大腸菌内で生成された（Ｗｉｌｌｉａｍｓ　ｅｔ、　ａｌ、。

Ｊ、Ｂ　ｉ　ｏ　ｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６５　：　２０６７３．　１９９０．例 外としてａｍｐ　がｋａｎ　で置換されている）。蛋白質は免疫アフィニティー クロマトグラフィー及び高圧液体クロマトグラフィーによって精製された（Ｗｉ ｌｌｉａｍｓ　ｅｔ　ａｌ、、前出）。

旦Δ旦、８９１Ｌ−４の調製 ヒトのインターロイキン４をコードする合成遺伝子が合成された（Ｍｉｌｌｉｇ ｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ　７５００　ＤＮＡ　シンセサイザー）。ＩＬ−４配 列（Ｙｏｄｏｔａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃ　 ｔ、　ＵＳＡ、　８３　；　５８９９４．　１９８６）は修飾されて大腸菌好適 コドン用法を編入しくｄｅＢｏｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　ｉｎ　Ｍａｘｉｍｉｚｉ ｎｇ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、　Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ　ｅｔ　ａｌ、 。

ｅｄｓ、　、１９８６．　Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ、Ｂｏｓｔｏｎ）、制限エ ンドヌクレアーゼ切断部位を導入して以後のクローニング段階に便宜を与えた。

ＩＬ−４Ｄ−ディング配列（Ｈｉｓ’から５ｅｒ１２９）をｐＤＷ２７ブラスミ ドに挿入した。ｐＤＷ２７はｐＤＷ２４（Ｗｔｌｌｉａｍｓ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６５：１１８８５．　１９９０）から天然の ジフテリア毒素のアミノ酸３８８から４８５を除去して誘導した。

旦Δ旦。８９　Ｉ　Ｌ　４の細胞毒性 ＤＡＢ　ＩＬ−４が種々の細胞型の生存率を低下させる能力は、蛋白質合成阻害 検定を用いて測定された。この検定結果を表３に示す。ＩＣ５ｏ（Ｍ）は蛋白ｔ 、Ｄ成の５０％低下に必要なりＡＢ３８９１Ｌ−４の濃度である。ラットのＣ０ ｎＡ活性化を受けた正常評臓リンパ球は、いずれの他の細胞、あるいは細胞系よ りもＤＡ８３８９１　Ｌ−４に対して遥かに感受性が低かった。ラットのインタ ーロイキン４受容体はヒトのインターロイキン４を結合しないので、この結果は ＤＡＢ　ＩＬ−４の特異性を証明している。これらのう・ソト細胞はジフテリア 毒素／ラットインターロイキン２ハイブリッド分子に感受性がある。

表３ 正當及び腫瘍細胞ならびに細胞系のＤＡＢ３８９１Ｌ−４感受性細胞または　分 類　ＩＣ５ｏ（Ｍ） 細胞系 Ｔ細胞起源 ＨＬＩＴ　１０２／６ＴＧ　ヒト、ｃＴＣＬ、ＨＴＬＶ−１２，９ｘ　１０　” Ｃ９１／ＰＬ　ヒト、ＨＴＬＶ−１＋　６．　３ｘｌＯ−１１形質転換された Ｂ細胞起源 Ｒａ　ｊ　ｉ　７．２Ｘ１０” 髄単核細胞　ヒト、バーキット Ｕ９３７　’）ンバ腫　ＥＢＶ＋　２．０ＸＩＯ−９正常ＰＢＭＣヒト、組織球 ＰＨＡ活性化　リンパ腫　１．６ｘｌＯ”Ｔ細胞 非霊長類 ＣｏｎＡ活性化　ヒト　＞１０’ −ミス１町ｌ−−−−二辷ムｈ−−−一−−−ミス一一−−−−−−−−一旦Δ 旦、８９　ＩＬ−６の調製 ヒトのインターロイキン６をコードする合成遺伝子が合成された（Ｍｉｌｌｉｇ ｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ　７５００　ＤＮＡ　シンセサイザー）、ＩＬ−６配 列（Ｒｅｖｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、　ＥＰＡ　８６１１４０４．９）は修飾されて 大腸菌好適コドン用法を編入（ｄｅＢｏｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、前出）、制限エン ドヌクレアーゼ切断部位を導入して、以後のクローニング段階の便宜をはかった 。Ｉ　Ｌ−６をコードする配列全体を、前記ＤＡＢ３８９１　Ｌ−４に対するよ うに、ｐＤＷ２７ブラスミドに挿入した。

混合トキシン 本発明に有用ないく一つかの分子の細胞毒性部分は、混合トキシン分子によって 提供することができる。混合トキシン分子は２つの異なるポリペプチドトキシン から誘導された分子である。一般的に、ジフテリア毒素に関連して前述されたよ うに、ポリペプチドトキシンは、全般的な真核細胞結合の責任を担当するドメイ ンに加えて、酵素的に活性なドメインおよび輸送ドメインを持つ。結合及び輸送 ドメインは夫々細胞認識とトキシンの移入に必要である。酵素的活性ドメインは 、分子が一端細胞内に入った場合、細胞毒活性の責任を持つドメインである。輸 送ドメインを持つことが知られている自然界に存在する蛋白質にはジフテリア毒 素、シュードモナス外毒素Ａ、及び恐らく他のペプチドトキシンが含まれる。ジ フテリア毒素及びシュードモナス外毒素Ａの輸送ドメインはよく特徴が記載され ており（例えば、Ｈｏｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ 。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２：１６９２．　１９８５；　Ｃｏｌｏｍｂａｔｔｉ　ｅ ｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６１：３０３０．　１９８６； 及びＤｅｌｅｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ、、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　１６０：８２゜１ ９８３参照）、他の分子におけるこのようなドメインの存在と局在性は、Ｈｗ　 ａ　ｎ　ｇら（Ｃｅｌｌ　４８：１２９．　１９８７）、及びＧｒａｙら（Ｐｒ 。

ｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８１：２６４５．　１９８４ ）によって採用された方法で恐らく決定することができる。

有用なＩＬ−２部混合トキシンハイブリッド分子の１つは、大腸菌（Ｅ、　ｃｏ ｌｉ）シガ様トキシン（Ｃａｌｄｅｒｗｏｏｄ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４：４３６４．　１９８７）の 酵素的に活性なＡサブユニットをジフテリア毒素の輸送ドメイン（アミノ酸残基 ２０２から４６０）に、そしてＩＬ−２に融合することによって形成される。

この３部からなるハイブリッド分子、５ＬＴ−Ａ／ＤＴＢ−／ＩＬ−２は、前記 ＤＡ８４８６１Ｌ−２と同じような具合に、本発明の方法に有用である。３部か ら成るハイブリッドの！Ｌ−２部分は分子を特異的にＩＬ−２Ｒ保持細胞に付着 させ、ジフテリア毒素輸送部分はシガ揉トキシンの酵素活性のあるＡサブユニッ トを標的細胞内に挿入するように働く。ンガ様トキシンの酵素活性のある部分は 、ジフテリア毒素のように、細胞の蛋白質合成機構に働いて蛋白質合成を阻害し 、それによって細胞を殺す。これら２つのタイプのハイブリッドトキシン間の差 は、それらの酵素活性の性質にある。Ｄ　Ａ　Ｂ　４８６１　Ｌ　２の酵素部分 は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドによる延長因子２のＡＤＰ−リボシ ル化を触媒し、それによって蛋白質合成に必要なこの因子を不活性化する。一方 、５ＬＴ−Ａ／ＤＴＢ″／ＩＬ−２の酵素部分はリポソームＲＮＡを重要なサイ トで切断することのできるリボヌクレアーゼであり、それによってリポソームを 不活性にする。

従って５ＬＴ−Ａ／ＤＴＢ７１Ｌ−２ハイブリツドはＤＡ８４８Ｇ　■Ｌ−２の 場合と同様の症候に対する治療として有用であり、もし、例えば、患者の活性化 Ｔ細胞がＤＡＢ４８６１Ｌ−２に耐性を発現すれば、それと置換したり、あるい はそれと共に使用することもてきる。

トキ／ンの結合リガンドへの連結 有用ないイブリッド分子の、結合リガンドとサイトトキシンはいくつかの方法で 連接することができる。もし、ハイブリッド分子が人工融合遺伝子の発現によっ て生成されるのであれば、あるペプチド結合がサイトトキシンと結合リガンド間 の繋ぎ手の役を務める。または、トキシン及び結合リガンドを別々に作られ、後 に非ペプチド共有結合によって連結されることも可能である。

例えば、共ａ結合がジスルフィド結合の形を取ることもある。この場合、もし、 結合リガンドが蛋白質、例えばＩＬ−２であれば、マーフィら（Ｍｕｒｐｈｙｅ ｔａｌ、）米国出願番号　３１３．５９９に記載され、本願に引用編入されティ るよ・うに、ＩＬ−２をコードするＤＮＡを操作して余分のシスティンコドンを 含むようにすることができる。システィンはこの分子のＩ　Ｌ−２部結合活性を 妨害しないように位置されなければならない。例えば、システィンコドンは成熟 型Ｉ　Ｌ−２のＰｔＯ２をコードするＤＮＡのすぐ上流に挿入することができる 。

トキシン分子は修飾されたＩ　Ｌ−２のシスティンと反応するスルフヒドリル基 によって誘導体化されなければならない。ペプチドトキシンの場合、このことは トキシンをコードするＤＮＡ配列にシスティンコドンを挿入することによって達 成することができる。または、スルフヒドリル基は、単独に、あるいはシスティ ン残基の一部として、固相ポリペプチド合成法を用いて導入することができる。

例えば、スルフヒドリル基のペプチドへの導入はヒスキー（Ｈｉｓｋｅｙ）（Ｐ ｅｐｔｉｄｅｓ　３：１３７．　１９８１）によって記述されている。誘導体化 は、また、ペプチドホルモンの誘導体化についてベサら（Ｂａｃｈａ　ｅｔ　ａ ｌ、）米国特許第　４，４６８，３８２号に記され、本願に引用編入されている 方法に従って遂行することができる。スルフヒドリル基の蛋白質への導入はマー センら（Ｍａａｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ、）　（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１３ ４：３２、１９８３）に記されている。一端、正しいスルフヒドリル基が存在す ると、サイトトキシン及びＩＬ−２部結合リガンドは精製され、両サルファー基 は還元され、サイトトキシンとリガンドは混合され（約１：５から１＝２０の比 で）、ジスルフィド結合形成は室温で完了までそのまま進行させる（一般に２０ から３０分）。混合物は次いでリン酸緩衝食塩液に対し透析して未反応リガンド 及びトキシン分子を除去する。次いて、セファデックスクロマトグラフィー、あ るいはこれに類似の方法を行い、分子サイズに基づいて望むところのトキシン− リガンド複合体をトキシン−トキシン及びリガンド−リガンド複合体から分離す る。

ＩＬ−２受容体結合及びＩＬ−４受容体結合の検定種々の分子のＩＬ−２部結合 能は高親和性（Ｊｕ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６２ ＋５７２３．　１９８７）、あるいは中間親和性受容体（Ｒｏｂ　ｅｔ　ａｌ、 、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４　：　２００２ ．　１９８７）に対するＩＬ−２Ｒ検定を用いて測定することができる。種々の 分子のＩＬ−４部結合活性は、パークら（ｐａｒｋ　ｅｔ　ａｌ、）（Ｊ、Ｅｘ ｐ、Ｍｅｄ、　１６６：１７６、１９８４）により記述されている検定法、ある いはフォックスウェルら（Ｆｏｘｗｅｌｌｅｔ　ａｌ、）　（Ｅｕｒ、　Ｊ、Ｉ ｍｍｕｎｏｌ、１３：１６３７．　１９８９）により記述されている検定法を用 いて測定することができる。

毒性の検定 本発明の分子（抗体及びハイブリッド分子両方とも）は標的受容体保持細胞の生 存率低下能について下記のような検定法によってスクリーニングすることができ る。

ＩＬ−２Ｒ保持細胞に対する毒性は以下のようにして検定できる。ＨＵＴ　１０ ２／６ＴＧ（Ｔｓｕｄｏ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８３：９６９４．　１９８６）、あるいはＹＴ２Ｃ２（Ｔｅｓ ｈｉｇｉｗａｒｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　１６５：２２３ 、１９８７）培養細胞を、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ　（ｐＨ７，４）　、２ｍＭの １−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプト マイシン、及び１０％ウシ胎児血清（Ｈａｚｅｌｔｏｎ、　Ｌｅｎｅｘａ。

ＫＳ）を補足したＲＰＭ１１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎ ｄ、　ＮＹ）中に維持する。細胞は９６ウエル■型底プレー）（Ｌｉｎｂｒ。

−Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　ＭｃＬｅａｎ、　ＶＡ）に、１ウエ ル当たり完全培地中１×１０５の濃度で接種する。推定トキシン推定物質を種々 の濃度まで加え（１０”’　Ｍから１０−６Ｍ）　、培養は５％Ｃ０２大気中、 ３７℃で１８時間インキュベートする。インキュベーション後、プレートは１７ ０ｘｇで５分間遠心して培地を除き、８μＣｉ／ｍ１（３Ｈ−ロイシン；　Ｎｅ ｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、　Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を含む無ロイシ ン培地（ＭＥＭ、　Ｇｉｂｃｏ）１．００１１１で置換する。３７℃でさらに９ ０分後、プレートは５分間１７０ｘｇて遠心、培地を除き、細胞は、セルハーベ スタ−（Ｓｋａｔｒｏｎ　Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、　ＶＡ）を用いてガラスファイバ ーフィルター上に集める。フィルターは洗浄、乾燥し、標準法に従ってカウント する。

培地のみで培養された細胞が対照となる。

ＩＬ−４Ｒ保持細胞に対する毒性は、ＩＬ−２Ｒ保持細胞に対する前記の方法に 類似の検定法によって調べられるが、ＭＬＡ１４４細胞（Ｒａｂｉｎ　ｅｔａｌ 、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１２７：１８５２．　１９８１）、あるいはＨＵ Ｔ１０２／６ＴＣ；細胞を用い、１ウエル当たり１×１０５個の細胞を接種、４ ０時間インキュベートスル。

治療 一般に本発明の分子は点滴静注によって投与される。これらの分子はまた皮下注 射投与、あるいは炎症関節内に直接注射してもよい。本発明の方法に有用な分子 の用量は、物質がサイトトキシン、細胞溶解性抗体、あるいは細胞受容体遮断分 子であるかのような諸要因に依存して変動することがある。毒性分子の場合、細 胞による取り込みの程度か重要な因子であり、透過性のより低い分子はより高い 用量で投与されなければならない。

他のＱ様 前記分子はサイトトキシン（あるいは細胞溶解性抗体）を標的細胞に向けること によって細胞生存率を低下するように作用する。標的細胞のサイトカイン利用能 を妨害する分子もまた本発明の方法に有用である。

内在性サイトカインの利用を阻止するＩ　Ｌ−２あるいは他のサイトカインの誘 導体は標的細胞の増殖を妨害するのに有用である。例えば、！Ｌ−２を剥奪され た活性化細胞は増殖することができなくなり、Ｉ　Ｌ−２によって提供される必 須同化刺激が存在しないと究極的には死滅する。特定のＩＬ−２誘導体のｌ　Ｌ −２機能妨害能は、シュら（Ｊｕ　ｅｔ　ａｌ、）（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ ｍ。

２６２：５７２３．　１９８７）によって記述されているようなＩＬ−２生物学 的検定法で試験することができる。トキシンが不活性化されているハイブリッド 分子もまたサイトカイン受容体遮断に用いることができる。無毒化突然変異体の ジフテリア毒素の分子が記載されており（Ｕｃｈｉｄａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２４８：３８３８．　１９７３）、この分子は無毒１ １、−２／ジフテリア毒素ハイブリツドを生成するのに用いることができる。こ のようなハイブリッド分子の例として、本願に引用編入されているスベルガら（ ｖｒｌｕｇａ　ｅｔ　ａｌ、）米国出願番号５９０：１１３参照のこと。

単クローン抗体はサイトカイン受容体保持細胞をいくつかの方法で死滅、あるい は中和するのに用いることかできる。前記のように、トキシン分子に融合された 抗すイトカイン受容体抗体は受容体保持細胞へのトキシン輸送に使用することが できる。溶解性抗すイト力イン受容体抗体は、それ自身で補体を活性化してサイ トカイン受容体保持細胞を殺すことができる。例えば、補体活性化能クローン抗 体はＩ　Ｌ−２Ｒ保持細胞の破壊に使用することができる。補体誘発性抗体は一 般にＩｇＧ１，１ｇＧ２，１ｇＧ３．及び１ｇＭイソタイプの抗体である。単り ローン抗ＩＬ−２Ｒ抗体は、補体依ｆｆ性細胞毒性検査を用い、次のように補体 活性化能のあるものを探索のためスクリーニングにかけることができる。

ヒトＴリンパ球及びＥＢＶ突然変異Ｂリンパ球を５１ｃ、クロム酸ナトリウムで 標識し、標的細胞として使用する。これらの細胞はハイプリドーマ培養上清及び 補体と共にインキユベーシヨンし、次いて上清を集めてガンマカウンターで測定 する。活性化１９２６球に灯して毒性を示すが、静１Ｆ状態のＴあるいはＢリン パ球には示さない」上清を選別する（Ｌｅｏｎａｒｄ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏ ｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８０：６９５７．　１９８３に詳細に記 載されている）。所望する抗ＩＬ−２受容体抗体は上清から定法によって精製さ れる。抗体の特異性は、その活性が外因性ＩＬ−２によって阻害されることを示 して証明することができる。

サイトカインの結合及び／あるいは取り込みを阻害する抗体もまた有用である。

例えば、ＩＬ−２の結合及び／あるいは取り込みを妨害する単クローン抗体は本 発明の方法に引用である。それはＩ　Ｌ−２を剥奪されたＩＬ−２Ｒ保持細胞は 増殖てきないからである。遮断中クローン抗体（及び他の遮断分子）は、ジュー ら（前記）のｊｊ法を用いてＩ　Ｌ−２の生物学的活性について検査することが できる。

一般的に、遮断分子に有用な検定法は、分子が１つあるいはそれ以上の受容体天 然リガントの結合を妨害する能力を測定する競合結合検定法であろう。

本発明の方法にｆイ用な単クローン抗体は、マウスをヒトＩＬ−２Ｒ＋Ｔ−リン ベ球で免疫し、二のマウスの牌臓細胞を適当な骨髄腫細胞と融合、その結果中じ た′・イブリトーマ系によって生成される抗体を、ＥＬＩＳＡＩ定法により、必 要ＦｊｌＬ−２Ｒ結合特性をスクリーニングすることによって作ることができる 。抗体の生成及びスクリーニングはウチダら（Ｕｃｈｉｄａ　ｅｔ　ａｌ、）（ Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１２６：１３９３．　１９８１）に従って行うことができる 。または、有用な抗体は、ヒユーズら（Ｈｕｓｅ　ｅｔ　ａｌ、）（Ｓｃｉｅｎ ｃｅ　２４６・１２７５．１９８９）の方法により生成された組合せライブラリ ーから単離することもてきる。

本発明は、無損傷の単クローンあるいはポリクローン抗体のみならず、また免疫 学的活性のある抗体断片、例えば、Ｆａｂあるいは（Ｆ　ａ　ｂ　）　２フラグ メント、抗体の重鎮、抗体の軽鎖、遺伝子操作された単鎖Ｆｖ分子（Ｌａｄｎｅ ｒ　ｅｔａｌ、、米国特許第　４，９４６，７７８号）、あるいはキメラ抗体、 例えばマウス抗体の結合特異性を含むが、その他の部分はヒト起源であるような 抗体も使用する。　ある状況下では、前記分子と共にシクロスポリンＡを非腎毒 性用量（例えば、望ましいのは５ｍｇ／ｋｇ／日よりも多くない）で投与するこ とが好適である。例えば、シクロスポリンＡは前記分子の１つによる治療に続い て投与できる。この後の治療は、前記分子による治療の結果、関節炎症状が相当 に改善された後行うことができる。シクロスポリンＡＬｆｆ活性を持つ免疫抑制 剤をシクロスポリンＡの代わりに用いてもよい。シクロスポリンＡあるいはシク ロスポリンＡ様分子は、効果的な、しかも十分に無毒な用量でなければならない 。

特許請求の範囲は以下の通りである： ｒ：：ＬＩｒｅ　！ 日 ＦＩＧ、　３Ａ　ＦＩＧ、　３Ｃ Ｆｉ；ソｒｅ４ 町Ｕπ５ 日 Ｆｉ；ｖｒｅ　６ 日 Ｆｊ、；ｕｒｅ　７ スクア フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ３，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、ＬＵ、 ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎｏ、ＰＬ、ＲＯ、ＲＵ、　ＳＤ、　ＳＥ

Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. １．炎症性関節炎を持つ患者を治療する薬剤を調製する方法であって、前記方法 は、当該患者のリンパ球上に発現された蛋白質様細胞受容体を特異的に結合する ことができ、かつ当該患者の炎症性関節炎の−因となる分子を製剤上許容される 担体物質に混入してなり、前記分子が前記リンパ球の生存率を低下させることを 特徴とする方法。
2. ２．請求項１に記載されている方法であって、前記炎症性関節炎が変形関節炎で あることを特徴とする方法。
3. ３．請求項１に記載されている方法であって、前記炎症性関節炎が全身性エリテ マトーデス関連の関節炎であることを特徴とする方法。
4. ４．請求項１に記載されている方法であって、前記炎症性関節炎が乾癬関節炎で あることを特徴とする方法。
5. ５．請求項１に記載されている方法であって、前記蛋白質様細胞受容体が高親和 性インターロイキン２受容体であることを特徴とする方法。
6. ６．請求項１に記載されている方法であって、前記分子が前記細胞受容体保持リ ンパ球を殺すことを特徴とする方法。
7. ７．請求項１に記載されている方法であって、前記分子が、共有結合で互いに連 結された第一と第二の部分からなるハイブリッド分子であり、当該第一の部分は 細胞生存率を低下させる能力のある分子を含み、当該第二の部分は、分子を前記 細胞受容体に特異的に結合することのできる分子から成ることを特徴とする方法 。
8. ８．請求項７に記載されている方法であって、前記第二の部分は前記細胞受容体 に特異的な抗体の全部あるいは結合部分からなることを特徴とする方法。
9. ９．請求項７に記載されている方法であって、前記第二の部分は前記細胞受容体 のリガンドの全体あるいは結合部分からなることを特徴とする方法。
10. １０．請求項９に記載されている方法であって、前記リガンドがインターロイキ ンであることを特徴とする方法。
11. １１．請求項７に記載されている方法であって、前記第一の部分がサイトトキシ ンからなることを特徴とする方法。
12. １２．請求項１１に記載されている方法であって、前記サイトトキシンがペプチ ドトキシンの断片であり、酵素活性を有するが、全般的な真核細胞受容体結合活 性を持たないことを特徴とする方法。
13. １３．請求項１２に記載されている方法であって、ペプチドトキシンの前記断片 がジフテリア毒素の断片Ａ及び細胞膜に小孔を作るのに十分なジフテリア毒素の 断片Ｂからなることを特徴とする方法。
14. １４．請求項１３に記載されている方法であって、前記分子がＤＡＢ４８６ＩＬ −２であることを特徴とする方法。
15. １５．請求項１３に記載されている方法であって、前記分子がＤＡＢ３８９ＩＬ −４であることを特徴とする方法。
16. １６．請求項１３に記載されている方法であって、前記分子がＤＡＢ３８９ＩＬ −６であることを特徴とする方法。
17. １７．請求項１０に記載されている方法であって、前記インターロイキンがイン ターロイキン４であることを特徴とする方法。
18. １８．請求項１０に記載されている方法であって、前記インターロイキンがイン ターロイキン６であることを特徴とする方法。
19. １９．請求項１に記載されている方法であって、前記分子が前記細胞受容体に対 する特異的抗体の全体あるいは結合部分からなることを特徴とする方法。
20. ２０．請求項１９に記載されている方法であって、前記抗体が補体活性化抗体で あることを特徴とする方法。
21. ２１．炎症性関節炎を持つ患者における骨腐食を軽減する薬剤を調製する方法で あって、前記方法は、当該患者のリンパ球に発現されたインターロイキン受容体 に特異的に結合することのでき、かつ当該患者の炎症性関節炎の−因である分子 を製剤上許容される担体物質に混入してなり、前記分子が前記リンパ球の生存率 を低下させることを特徴とする方法。
22. ２２．請求項２１に記載されている方法であって、前記炎症性関節炎が変形関節 炎であることを特徴とする方法。
23. ２３．請求項２１に記載されている方法であって、前記分子がＤＡＢ４８６ＩＬ −２であることを特徴とする方法。
24. ２４．請求項２１に記載されている方法であって、前記分子がＤＡＢ３８９ＩＬ −２であることを特徴とする方法。
25. ２５．炎症性関節炎の治療用薬剤であって、シクロスポリンＡと、当該患者のリ ンパ球上に発現されたインターロイキン受容体を特異的に結合することができ、 該患者の炎症性関節炎の−因となる分子とからなり、前記分子が当該リンパ球の 生存率を低減できることを特徴とする薬剤。
26. ２６．請求項１に記載されている方法であって、前記分子が当該患者の関節炎症 状が十分に改善される迄投与され、それに続いてシクロスポリンＡが前記患者に 投与され、前記シクロスポリンＡが十分に無毒な用量で投与されることを特徴と する方法。
27. ２７．炎症性関節炎を持つ患者の治療にシクロスポリンＡを用いる方法であって 、前記方法は当該患者に請求項１に記載されている分子をシクロスポリンＡと共 に投与することからなり、前記シクロスポリンＡが十分に無毒な用量を投与する ことを特徴する方法。
28. ２８．炎症性関節炎を持つ患者における疼痛を軽減する薬剤を調製する方法であ って、前記方法は、前記患者のリンパ球に発現されている蛋白質様細胞受容体を 特異的に結合することができ、かつ当該患者の炎症性関節炎の−因となる分子を 製剤上許容される担体物質に混入してなり、前記分子が前記リンパ球の生存率を 低減できることを特徴とする方法。