JPH06510208A - 多量体形態のヒトライノウイルスレセプタ蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 多量体形態のヒトライノウィルスレセプタ蛋白質発明の背景 本出願は、同時係属中のＵ、Ｓ、Ｓ、Ｎ、　０７１５５６．２３８　（１９９０ 年７月２０日出願）の部分的継続である同時係属中のＵ、Ｓ、Ｓ、Ｎ、　０７／ ７０４，９８４　（１９９１年５月２４日出願）の部分的継続である。

本発明は、ヒトのライノウィルスと有効に結合しそしてＨＲＶ感染力を有効に低 下させ得る細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）の新規な形態および多量体構造（これら の蛋白質の短縮されていない形態および切形の形態を含む）、並びにそれらの製 造および使用方法に関する。

ヒトのライノウィルスレセプタ（ＨＲＲ）としても知られている短縮されていな いＩＣＡＭは、トランスメンプランＩＣＡＭ　（ｔｍｌｃＡＭ−１）と呼ばれて おり、切形ＩＣＡＭ　（ｔ　ＩＣＡＭ）としても知られている非トラシスメンプ ランＩＣＡＭ形態は、短縮されている。多量体構造、好適には二量体として存在 している場合、これらの蛋白質は、増強されたヒトライノウィルス（ＨＲＶ）結 合性を示し、そしてＨＲＶ感染力を低下させ得る。更に、これらの多量化された 蛋白質はまた、「主要」群のヒトライノウィルスレセプタ（ＨＲＲ）、例えばコ クサラキー（Ｃｏｘｓａｃｋｉｅ）Ａウィルスと結合することが知られている他 のウィルスの感染力を低下させる目的でも用いられ、そしてまた、免疫学的応答 に関連している数多くの細胞接着過程に重要な、トランスメンプラン細胞間接着 分子（ｔｍｌｃＡＭ）とリンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）との相互作用 を防止する目的でも使用され得る。最後に、これらの多量化された蛋白質は、特 にこの相互作用に影響を与えることを意図した池の薬剤の設計に関するＩＣＡＭ −１／ＨＲＶ相互作用の研究目的で用いられてもよい。

ヒトのライノウィルスは、通常の風邪の原因となる主要な仲介物である。それら はピコルナウィルス科に属し、そしてそれらが結合する宿主細胞のレセプタを基 準にして分類され得る。Ｔｏｍａｓｓｉｎｉ池、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、、５８・２ ９０　（１９８６）には、ヒトのライノウィルスの細胞付着に関連しているレセ プタ蛋白質の単離が報告されている。１１５以」二の抗原型のライノウィルス並 びに数種のコクサソキーＡウィルスの約９０％は、「主要」ヒトライノウィルス レセプタ（ＨＲＲ）として呼ばれている単一の共通レセプタと結合し、残りの１ ０％は他の１種以上の細胞レセプタと結合する。

最近、コノ共同発明者Ｇｒｅｖｅ、　Ｊ、他による共著のＣｅ１１１５６：８３ ９　（１９８９）において、９５．０００ダルトンの見掛は分子質量を有し、そ して前述した細胞間接着分子（ＩＣＡＭ−１）と呼ばれている細胞表面蛋白質の ヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸配列と本質的に同一なアミノ配列を有 する糖蛋白質として、該主要ＨＲＲを同定した。［図１参照；Ｓｉｍｍｏｎｓ、 　Ｄ他、Ｎａｔｕｒｅ　３３１：６２４　（１９８８）　；　５ｔａｕｎｔｏｎ 、他、Ｃｅ１ｌ、５２：９２５−９３３　（１９８８）］　。続いて、５ｔａｕ ｎｔｏｎ、　Ｄ、Ｅ、池、Ｃｅ１ｌ、５６：８４９　（１９８９）において、Ｉ ＣＡＭ−１が１−（ＲＶのための主要な表面レセプタであることが確認された。

５ｔａｕｎｔｏｎ、他、Ｃｅ１ｌ、６１：２４３−２５４　（１９９０）も参照 。

ｌＣＡ〜１−１は、長さが５０５個のアミノ酸から成る内在性メンプラン蛋白質 であり、そしてｉ）このアミノ末端に５個の免疫グロブリン様細胞外ドメイン（ アミノ酸残基１−４５３）　、ｉ　ｉ）疎水性トランスメンブランドメイン（４ ５４−４７７）、およｉ　ｉ　ｉ）カルボキシ末端に短い細胞質ドメイン（４７ ８−５０５）を有している。図２参照。ＩＣＡＭ−１は、免疫グロブリン超遺伝 子科の１貝であり、そして白血球分子のためのリガンド、リンパ球機能関連分子 −１（ＬＦＡ−１）　、インテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎ）科の１員として機能 する。ＩＣＡＭ−１に対するＬ　Ｆ　Ａ、−１の異型結合は、多様な細胞種の細 胞接着を仲介し、そしてこれは、幅広い範囲の免疫相互作用において重要であり 、そして炎症応答中のサイトカイン類によるＩＣＡＭ−１発現の誘発によって、 炎症部位に対する白血球の局在化が調節され得る。ＩＣＡＭ−１の主要構造は、 ２つの細胞接着分子、即ち神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）およびミニリン関連糖 蛋白質（ＭＡＧ）と同族であることが見いだされた。

一般的なウィルス、特にライノウィルスの感染力を低下させるための研究のいく つかの方法には、次のものが含まれる：ｉ）細胞に対するウィルスの結合をブロ ックする用途のための、細胞表面レセプタに対する抗体の開発、ｉｌ）宿主細胞 における抗ウイルス状態を促進するためのインターフェロンの使用、１ｉｉ）ウ ィルスの複製を抑制するための種々の薬剤の開発、ｉｖ）ウィルスカプシド蛋白 質／ペプチドに対する抗体の開発、そしてＶ）単離した細胞表面レセプタ蛋白質 を用いたウィルス感染のブロック（これは特に、細胞表面レセプタのウィルス結 合ドメインをブロックするものである）。

コ（７）最後の方法を用いた上記Ｇｒｅｖｅ、他、Ｃｅ１ｌ、５６：８７９　（ １９８９）には、精製したｔｍｌｃＡＭ−１をインビトロでライノウィルスＨＲ Ｖ　３に結合させることができたと報告されている。ＨＲＶ２、ＨＲＶ　３、お よびＨＲＶ　１．４を用いた未公開の結果は、特に、ＩＣＡＭ−１を以下で更に 考察するような特別な形態および構造で提示する条件下で結合の研究を行う場合 、ライノウィルスに対する結合能力と、ライノウィルスを中和する能力との間に 正の相関関係があることを明らかに示している。ＨＲＶ１４およびＨＲＶ２を用 いた結果（未公開）は、ウィルスのレセプタの種類と、インビトロでｔｍｌｃＡ Ｍ−１に結合する能力との間に正の相関関係があることを明らかに示している。

即ち、主要レセプタであるＩＣＡＭ−１は、ＨＲＶ３、ＨＲＶ１４、オヨヒ他ノ 「主要」レセプタ抗原型と結合でき、そしてそれらを中和できるが、一方それは 、ＨＲＶ２、即ち「少数」レセプタ抗原型とは結合することもなく、それを中和 することもない。精製したｔｍｌｃＡＭ−１を用いたさらなる試験（未公開）は 、ライノウィルスを予めｔｍｌｃＡＭ−１で処理したとき、プラーク減少定量法 においてライノウィルスの感染を有効に抑制（１００Ｍのレセプタで５０％のタ イター減少、および１１００ｎのレセプタ蛋白質で１０グのタイター減少）する ことを明らかに示している。これらのデータは、ｌＱｎＭの見掛は解離定数を有 する、ヒーラ−（Ｈｅｌａ）細胞のＩＣＡＭ−１に対するライノウィルスの親和 力と一致しており、そしてこれは、このウィルスに対する該レセプタの結合能力 と、該ウィルスを中和する能力との間に直接の関係があることを示していた。

ｔｍｌｃＡＭ−１の大規模生産は現在のところ経済的には不可能であることから 、そして活性を示す形態でｔｍｌｃＡＭ−１を維持するには界面活性剤の使用が 必要であることから、ライノウィルス抑制因子として使用する目的でレセプタ蛋 白質を製造する代替手段が望まれている。

切形ＩＣＡＭ−１分子を産生させる目的で遺伝学的に変質させた形態のｔｍｌｃ ＡＭ−１ｃＤＮＡ遺伝子が開発された（並びに、発現産物を産生ずる細胞系：　 Ｕ、　Ｓ、　Ｓ、　Ｎ、　０７／３９０．６６２）。これらの切形形態のＩＣＡ Ｍ−１（ｔ　ＩＣＡＭ　（４５３））および（ｔ　ＩＣＡＭ　（１８５）　）は 、そのトランスメンプラン領域が欠失しており、そして細胞培地中に分泌される 。それらは、上記Ｇｒｅｖｅ、他、Ｃｅ１ｌ、５６：８７９　（１９８９）中に 記述されている定量法においてライノウィルスと結合するが、しかしながら、ｔ ｍｌｃＡＭ−１に比較して本質的に低いレベルである。従って、ライノウィルス 感染抑制因子としてのそれらの有効性は、ｔｍｌｃＡＭ−１のそれよりも低いと 考えられる。一般的に、同時係属中のＵ、Ｓ、Ｓ、Ｎ、　０７／２３９．５７１ ．　Ｕ、Ｓ、Ｓ、Ｎ、　０７／２６２．４２８、Ｕ、Ｓ、Ｓ、Ｎ、　０７／６７ ８，９０９、Ｕ、Ｓ、Ｓ、Ｎ、０７／６３１゜３１３、Ｕ、Ｓ、Ｓ、Ｎ、　０７ ／３０１，１９２、Ｕ、Ｓ、Ｓ、Ｎ、　０７／４４９，３５６、Ｕ、Ｓ、Ｓ、Ｎ 、　０７／７９８，２６７、Ｕ、Ｓ、Ｓ、Ｎ、　０７１５５６，２３８、Ｕ、Ｓ 、Ｓ、Ｎ、　０７／７０４，９９６およびＵ、Ｓ、Ｓ、Ｎ、　０７／７０４、９ ８４参照。

１９８８年９月１日出願のＵ、Ｓ、Ｓ、Ｎ、　０７／２３９，５７１およびその ＣＩＰ出願Ｕ、　Ｓ、　Ｓ。

Ｎ、　０７／２６２．４２８、Ｕ、Ｓ、Ｓ、Ｎ、　０７／３９０，６６２　（Ｕ 、Ｓ、Ｓ、Ｎ、　０７／６７８．９０９継続のため廃棄）　、Ｕ、Ｓ、Ｓ、Ｎ、 　０７／６３１，３１３およびＵ、Ｓ、Ｓ、Ｎ、　０７／７０４，９９６は、溶 液内にトランスメンプラン蛋白質を維持する目的で非イオン系界面活性剤を用い た、ライノウィルス感染抑制因子としてのトランスメンプランライノウィルスレ セプタの使用を意図したものであり、モしてｔｍｌｃＡＭの細胞外ドメイン■、 ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶの１種以上を含む切形細胞内接着分子（ｔｌｃＡＭ ）［これらの切形形態は、可溶化の目的で非イオン系界面活性剤の存在を必要と しない］を意図したものである（図２参照）。

１９８７年１２月８日出願のＵ、Ｓ、Ｓ、Ｎ、　０７／１３０，３７８　（Ｕ、 Ｓ、Ｓ、Ｎ、　０７／７９８．２６７継続のため廃棄）およびＣＩＰ出願１１． 　Ｓ、　Ｓ、　Ｎ、　０７／２６２．５７０　（ここで廃棄）は、主要ライノウ ィルスレセプタ（ＨＲＲ）を発現する、移入された、ヒトでない哺乳動物細胞系 、並びに細胞内接着分子としてのＨＲＲ同定を意図したものである。

１９８９年１月２４日出願のＵ、Ｓ、Ｓ、Ｎ、　０７／３０１，１９２およびそ のＣＩＰ出願Ｕ、　Ｓ。

Ｓ、Ｎ、　０７／４４９．３５６は、ｔｍＩＣＡＭに関連しているがｔｍＩＣＡ Ｍとは異なる天然に存在する可溶ＩＣＡＭ　（ｓ　ＩＣＡＭ）（このｓｌｃＡＭ は、該トランスメンプラン領域および細胞質領域に伸びているアミノ酸が欠失し ており、更に、このｓｌｃＡＭはそのＣ末端に１１個のアミノ酸から成る新規な 配列を有している）を意図したものである。

次に、Ｍａｒｌｉｎ、　Ｓ、　Ｄ、　、池、Ｎａｔｕｒｅ　３４４ニア０　（１ ９９０）には、可溶切形形態の、通常はメンプランと結合しているＩＣＡＭ−１ 分子（彼らは、これをＳＩｃＡＭ−１と呼んでいる）の構築および精製が報告さ れている。これは、この蛋白質のトランスメンブランドメインと細胞質ドメイン の両方が欠失しており、そしてこれは、そのカルボキシル末端が単一同類置換さ れていることで野生型のアミノ酸配列とは異なっている。これは、■ＣＡＭ−１ の残基１−４５２と、Ｃ末端に新規なフェニルアラニン残基を有している。これ らの研究書違は、細胞とＨＲＶ１４ウィルスとが結合するのを防止するにはｓｌ ｃＡＭ−１が〉５０μｇ／ｍＬのレベルで必要であることを示した。しかしなが ら、彼らはまた、ｓｌｃＡＭ−１が培地中に一定して存在している場合、これは 、ｌμｇ／ｍＬ（１８％Ｍ）でＩ（ＲＶ５４による感染の進行を５０％まで抑制 し得ることも見い出した。この抑制活性は、このウィルスのレセプタの種類と関 連していた（しかしながら、ここでは、ポリオウィルスまたはｔｌＲＶ２ではな くコクサツキ−Ａ１３が抑制され、モしてＨＲＶ１４に関する感染力データは報 告されていなかった）。このように、彼らは、結合と感染力抑制との間の直接的 相関関係を示していなかった。更に、以下により詳しく考察するように、Ｍａｒ ｌｉｎ、他が得た結果を再現する試みは不成功に終わりた。

今日まで、誰も、ｔｍｌｃＡＭ−１と同じ程有効に、ヒトのライノウィルスと結 合しそしてその感染力を有効に低下させる（単離された細胞表面レセプタ蛋白質 を用いたウィルス感染のブロックによる）薬剤を示すことはできなかった、従っ て、本分野では、ヒトライノウィルスと有効に結合でき、そしてＩ（ＲＶ感染力 を有効に低下させ得る形態のＩＣＡＭ−１に対する必要性が継続して存在してい る。

発明の簡単な要約 本発明は、改良されたライノウィルス結合および抑制活性を示す多量体構造のト ランスメンプランＩＣＡＭ　（ｔｍｌｃＡＭ−１）および多量体構造の非トラン スメンプランＩＣＡＭ　（ｔ　ＩＣＡＭ）を提供するものである。

上に示したように、哺乳動物細胞から単離されたｔｍｌｃＡＭ−１は、主要レセ プタ群に属するヒトライノウィルス類を中和する能力を有しているが、しかしそ れは、界面活性剤が入っている溶液内に保持されている場合のみである。ＩＣＡ Ｍ−１の特定可溶フラグメントが示すウィルスとの結合能力は低下しており、そ してｔｍｌｃＡＭ−１と同じ程有効には感染力を低下させないことを見い出した 。今日まで、誰も、この能力が低下する理由を確かめることは出来なかった。

他の人達によって、ライノウィルスのレセプタが三量体の形態で細胞上に存在し ているとの提案がなされた［Ｔｏｍａｓｓｉｎｉ、　Ｊ、およびＣｏ１ｏｎｎｏ 、Ｒ，、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、５８：２９０−２９５　（１９８６）］　。しかし ながら、ヒーラ−細胞と結合するライノウィルスおよび抗ＩＣＡＭ−１モノクロ ーナル抗体（Ｍａｂ）の定量を行った結果（この共発明者の未公開結果）、細胞 １個当たりに結合するのは最高で３０．０００ピリオン（［３ｓＳ］メチオニン 標識したＩ（ＲＶの結合により測定）であり、そして細胞１個当たり５０．００ ０−６０．０００個のＩＣＡＭ−１分子（ＩＣＡＭ−１に対する放射能標識Ｍａ ｂの結合により測定）であることがわかった。これらの結果により、この細胞に 結合するＨ　ＲＶ粒子毎に結合するこの細胞表面上のＩｃＡＭ−１分子の数は、 ５個というよりはむしろ、１および２個のみであると言った可能性について試験 するさらなる研究を促進させた。

Ｃ末端のトランスメンブランドメインが欠失している、遺伝子工学で製造した形 態の切形ＩＣＡＭ−１を、組換え型遺伝子を移入した哺乳動物細胞の培地中に分 泌させる。それ用の遺伝子を用いて安定に移入させた細胞の消費培地からの、上 記分泌されたＩＣＡＭ分子精製を、本明細書の中に説明する。溶液−ＨＲＶ結合 定量法およびＩＩＲＶ中和定量法において、これらの単量体形態はｔｍｌｃＡＭ −１に比較して、ＨＲＶに対して本質的に減少した親和性を示すことを見い出し た。しかしながら、上記ｔｒｃＡＭ類は多量体形態て存在しておりそして次にＨ ＲＶと一緒にインキュベートすると、これらの多量体ｔｌｃＡＭ類が示すウィル ス結合活性はｔｍｌｃＡＭ−１のそれに匹敵するようになることがここに見いだ された。Ｉ（ＲＶに対する多量体ｔｌｃＡＭ類が示すこのような結合は、ヒーラ −細胞上のＩＣＡＭ−１に対するＨ　ＲＶの結合と同様の特性を有しており、即 ち、これは抗ＩＣＡＭ−Ｉ　Ｍａｂで抑制され、そしてこれは主要レセプタ群の ライノウィルスにとって特異的であり、並びにこれは、細胞に対するライノウィ ルス結合と同様な温度依存性を有している（即ち、３７℃で良く結合し、そして ４℃では検出できない）。

ｔｍｌｃＡＭは現実として多量体形態、恐らくは二量体形態として存在している と仮定され、そして上記構造は、その未変性構造により密に類似しており、それ に付随してヒトライノウィルスに対する高い親和力を有している。上記三量化は 、便利に、例えば化学的手段を用いるか或は適当な抗体を用いた架橋によって２ つのＩＣＡＭ単量体単量体積させるか、或はモノマー類を適当な不活性物質に結 合させることにより、インビトロで達成される。多量化もまた、選択したＩＣＡ Ｍをコードする遺伝子配列を修飾して相当するペプチド配列内に適当な結合部位 を生じさせることにより、インヒポで達成され得る。例えば、鏡開ジスルフィド 結合を通した多量化をインビボで可能にする適当なシスティン残基を含んでいる ミューティン（ｉｕｔｅｊｎ）を工学処理することも可能である。別法として、 ＩＣＡＭをコードするＤＮＡ配列と、適当な免疫グロブリンもしくはそれらのフ ラグメントをコードするＤＮＡ配列とを融合させる結果として、この融合遺伝子 産物に、鏡開結合に適切な少なくとも１つの部位を持たせることも可能である。

次に細胞を用いて、この得られる―合ペプチド単量体を多量体形態で発現させる ことができる。特定の環境下では、多数のライノウィルス結合部位を含んでいる ＩＣＡＭミューティンを構築することによっても達成され得る。

本発明はまた、リガンド、即ちヒトのライノウィルス、および「主要」群レセプ タウィルス類、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）　、熱帯マラリア原虫 （マラリア）などに対するＩ　ＣＡＭおよびそれらの機能誘導体の結合を増強さ せるための方法を提供し、ここで、このＩＣＡＭは、そのリガンドに対して多量 体構造で提示されることにより、そのリガンドに対するＩＣＡＭの結合が容易に なる。

本発明は更に、ヒトライノウィルスの不可逆的脱外被を誘発する方法を含んでお り、上記方法は、上記ヒトライノウィルスとＩＣＡＭ−１もしくはそれのフラグ メンｌ−とを接触させることを含んでいる。

本発明はまた、ヒトライノウィルスによる哺乳動物細胞への感染を不可逆的に抑 制する新規方法を提供し、上記方法は、該ＩＣＡＭ−］もしくはそれのフラグメ ントと上記ライノウィルスとを結合させる条件下で」二記ヒトライノウィルスと ＩＣＡＭ−１もしくはそれのフラグメントとを接触させることにより、上記ライ ノウィルスの不可逆的脱外被を刺激する、ことを含んでいる。

本発明はまた、薬学的に許容される溶媒、希釈剤、アジュバントまたは担体と共 に、活性材料として、ヒトライノウィルスとの結合活性を示しそしてウィルス感 染を低（することによって特徴づけられるポリペプチドを有効量で含有している 新規な薬学的組成物を提供するものである。

二量体構造のＩ　ＣＡ　Ｍおよびそれらのフラグメントが現在のところ好適であ る。

本発明の他の面および利点は、本発明の実施に関する数多くの説明的実施例を含 む下記の詳細な説明を考慮するとき明らかになるであろう。

図の説明 図１は、ｔｍｌｃＡＭ−１の蛋白質配列を示している。

図２は、ａ）ｔｍｌｃＡＭ−１、ｂ）ｔ　ＩＣＡＭ　（４５３）　、Ｃ）ｔＩＣ ＡＭ　（２８３）　、ｄ）ｔ　ＩＣＡＭ　（１，８５）およびｅ）ｔＩＣＡＭ（ ８８）の図式的描写である。

図３は、実施例１２の構築物の図式的図である、即ちａ）ヒトＩｇＧの重鎮、ｂ ）イムノアドビーシン（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ）を製造する時に用いられ る重鎖のフラグメント、ｃ）ＩＣＡＭのフラグメント、ｄ）完成したＩ　ｇＧ／ Ｉ　ＣＡＭイムノアドヒービー。

図４は、水溶性カルボジイミド／Ｎ−ヒドロキシスクシニミドを用いたｔ　ＩＣ ＡＭ　（４５３）の架橋で二量体を生じさせることを示している。

示した濃度のｔ　ＩｃＡＭ　（４５３）は、１００ｍＭのＥＤＣ１５ｍＭのＮＩ ＴＳ　（ｐＨ７，５）と２０℃および１８時間で架橋を生じた。５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅに続く抗Ｉ　ＣＡＭ−１抗血清を用いたウェスタンプロットを用いてこれらの サンプルの分析を行った。ａ）架橋させたＩＣＡＭ　（４５３）のウェスタンプ ロットは単量体と二量体種を示している、ｂ）架橋はｔ　ＩＣＡＭ　（４５３） ｓ度に依存している、ｃ）　ｔ　Ｉ　ＣＡＭ　（４５３）の架橋は過剰の第三者 の蛋白質による抑制を受けない。

図５は、ｔ　ＩｃＡＭ　（ｌ−４５１）／ＬＦＡ−３（２１０−２３７）キメラ の構築を示す図式である：即ちａ）ｔｍｌｃＡＭ−１；　ｂ）ｔ　ＩＣＡＭ（１ −４５１）；ｃ）ＬＦＡ−３；ｄ）ＬＦＡ−３（２１０−２３７）；　ｅ）ｔ　 ＴＣＡＭ　（１−４５１）／ＬＦＡ−３（２１０−２３７）のキメラであり、比 較の目的でｔｍｌｃＡＭ−１の構造を示す。

図６は、２４時間かけたｔ　ＩＣＡＭ　（４５３）によるＨ　ＲＶの脱外被を示 している。ａ）ｔ　ＩＣＡＭ　（４５３）による、未変性１４８Ｓ形態から脱外 被４２Ｓ形態へのシフト、ｂ）ｔ　ＩＣＡＭ　（１８５）による、未変性１４８ Ｓ形塘から脱外被４２Ｓ形態へのシフト；　ｃ）［”Ｓ］　−メチオニン標識し たＩ（ＲＶ　−３の５ＤＳ−ＰＡＧＥはＶＰ４の損失を示しており＋ｄ）ＨＲＶ のためのオリゴヌクレオチドプローブを用いて１４ＲＶ３種から回収されたＲＮ Ａのドツトプロットハイブリッド形成。５０ｎｇの、精製ＨＲＶ３のＲＮＡ、お よび８ｎｇの、ＨＲＶ　３種から抽出したＲＮＡを、このプロットにかけた。

図７は、免疫グロブリンの折り畳みモチーフ上の、ドメイン■ｖおよびＶ内のＩ ＣＡＭ−１アミノ酸配列の推定配置を示している。矢印は、Ｎ末端からＣ末端に 向かうベータストランドを示しており、ボールド体内のイタリック体文字はこれ らのベータストランドを示しており、そして番号を付けた残基は、線で示したジ スルフィド結合を有するシスティン残基を示している。点線は、これらのドメイ ンのｒＢＪ面とｒＦＪ面を分割している。それらの中で、＊で示した残基は、シ スティン残基で置換されている。

発明の詳細な説明 本明細書で用いる下記の省略形および言葉には下記の定義が含まれているが、必 ずしもこれに限定されるものではない。

省略形および定義 ＩＣＡＭ 細胞間接着分子　−この蛋白質の短縮されていない（トランスメンプラン）およ び切形（非トランスメンプラン）形態の両方を示す目的で用いられてもよい。

Ｉ　ＣＡＭ−１ 細胞間接着分子−１、またｔｍｌｃＡＭおよびＨＲＲとしても知られている；短 縮されていないトランスメンプラン蛋白質を示す。

ｔｍｌｃＡＭ−１ トランスメンプラン細胞間接着分子−１、またＩＣＡＭ−１，およびＨＲＲとし ても知られている：可溶化の目的で、例えば界面活性剤条件が必要とされる。

ＨＲＲ ヒトライノウィルスのレセプタ、またＩＣＡＭ−１およびｔｍｌｃＡＭ−１とし ても知られている。

ｓｌｃＡＭ−１ １ＣＡＭ−１の疎水性トランスメンブランドメインおよびカルボキシ末端細胞質 ドメインの両方が欠失している、天然に存在している可溶切形形態のＩＣＡＭ− １；　ＩＣＡＭ−１のアミノ酸１−４４２と１１個の新規アミノ酸とから成る： 末端チロシンがフェニルアラリンで置き換えられているアミノ酸１−４５３から 成るｔ　Ｉ　ＣＡＭ４５３　（Ｓｔａｕｎｔｏｎ。

池）から区別され得る。

ｔｌｃＡＭ類 切形細胞間接着分子、ＩＣＡＭ−１の疎水性トランスメンブランドメインおよび カルボキシ末端細胞質ドメインが欠失している、溶解性を示す非トラシスメンプ ランＩＣＡＭ類。

ｔ　ＩＣＡＭ　（１−４５３） ｔ　ＩＣＡＭ−４５３ ｔ　ＩＣＡＭ　（４５３） ｔｍｌｃＡＭの細胞外アミノ末端ドメイン全体を含んでいる切形形蝮のＩＣＡＭ （ドメインＩ−Ｖ、アミノ酸残基１−４５３）。

ｔ　ＩＣＡＭ　（１−２８３） ｔｌｃＡＭ−２８３ ｔ　ＩＣＡＭ　（２８３） ドメイン■、ＩＩおよびＩＩＩを含んでいる切形形態のＩＣＡＭ（アミノ酸残基 １−２８３）。

ｔ　ＩＣＡＭ　（１−１８５） ｔＩＣＡＭ−１８５ ｔ　ＩＣＡＭ　（１８５） ドメインＩおよびｉｔを含んでいる切形形態のＩＣＡＭ（アミノ酸残基１−１８ ５）。

ｔ　ＩＣＡＭ　（１−８８） ｔｌｃＡＭ−８８ ｔ　ＩＣＡＭ　（８８） ドメインＩを含んでいる切形形態のＩＣＡＭ（アミノ酸残基１−８８）。

ｔ　ＩＣＡＭ　（８９−１８５） ドメインＩＩを含んでいる切形形態のＩＣＡＭ（アミノ酸残基８９−１８５）。

ｔ　ＩｃＡＭ　（１８６−２８３） ドメインＩＩＩを含んでいる切形形態のＩＣＡＭ（アミノ酸残基１８６−２８３ ）。

ｔ　ＩｃＡＭ　（２８，４−３８５） ドメインＩＶを含んでいる切形形態のＩＣＡＭ（アミノ酸残基２８４−３８５） 。

ｔ　ＩＣＡＭ　（３８６−４５３） ドメイン■を含んでいる切形形態のＩＣＡＭ（アミノ酸残基３８６ｉ５３）。

ｔ　ＩＣＡＭ　（７５−７７） アミノ酸残基７５−７７を含んでいる切形形態のＩＣＡＭ。

ｔ　ＩＣＡＭ　（７０−７２） アミノ酸残基７０−７２を含んでいる切形形態のＩＣＡＭ。

ｔ　ＩＣＡＭ　（６４−６６） アミノ酸残基６４−６６を含んでいる切形形態のＩＣＡＭｏｔ　ＩＣＡＭ　（４ ０−４３） アミノ酸残基４０−４３を含んでいる切形形態のＩＣＡＭ。

ｔ　ＩＣＡＭ　（３６−３８） アミノ酸残基３６−３８を含んでいる切形形態のＩＣＡＭ。

ｔ　ＩＣＡＭ　（３０−３３） アミノ酸残基３０−３３を含んでいる切形形態のＩＣＡＭｏｔ　ＩＣＡＭ　（２ ６−２９） アミノ酸残基２６−２９を含んでいる切形形態のＩＣＡＭ。

特定フラグメントを定義する上記言葉は、機能的誘導体およびそれらの類似物を 包含することを意図している。本分野の技術者は、その与えられた境界は数個の アミノ酸残基までならばその与えられたフラグメントが示す機能に影響を与える ことなく変化し得ることを理解するであろ「多量化」および「多量体」は、二量 体および二量体に限定されるものではなく、これには、ＩＣＡＭ−１分子のいか なる多量体構造、或はウィルスの結合および感染力の低下に有効性を示すそれら のフラグメントも含まれる。

「トランスメンプラン」は、一般に、疎水性を示す、膜を渡る（ｍｅ■ｂｒａｎ ｅ−ｓｐａｎｎｉｎｇ）配列を有し７ておりそして膜に結合している、ＩＣＡＭ −１蛋白質分子の形管を意味している。

「非トランスメンプラン」は、一般に、膜に結合しているというよりはむしろ、 可溶蛋白質として細胞培地内に分泌される、蛋白質のいわゆる「切形」形態、並 びに非イオン系界面活性剤中に細胞を溶解させることによって細胞膜から可溶化 されたトランスメンプラン形態を含む、ＩＣＡＭ’−１蛋白質の可溶形管を意味 している。

「切形」には、一般に、ＩＣＡＭの、短縮されていないトランスメンブラン形管 以下のいかなる蛋白質形態も含まれる。

「イムノアドビーシンコは、免疫グロブリンのフラグメント、好適には免疫グロ ブリンが有する重鎮の少なくとも１つの定常部を含んでいるフラグメント、に融 合している蛋白質もしくはペプチドの全てもしくはそれの一部を含む構造物を意 味している。

「形態Ｊは、一般にここでは、短縮されていない（全長）ＩＣＡＭ形態と、部分 的な長さく部分長）ＩＣＡＭ形態とを区別する目的で用い、一方、「構造」は、 一般に、可能なＩＣＡＭ形態の単量体、二量体、および多層体構造を区別する目 的で用いる。

Ｉ　ＣＡＭ−１分子の全ての形態および構造は、単量体または多量体に拘らず、 ミューティンおよびイムノアドビーシンを含む、その全長またはフラグメントに 拘らず、この分子が、ウィルスの結合および感染力の減少において有効性を保持 している限り、完全にもしくは部分的にグリコノル化されていてもよいか、或は 完全に非グリコノル化であってもよい。

「リカンド」は、一般にここでは、ＩＣＡＭの形態および構造いずれかの少なく とも１つと結合する能力を有するいずれをも包含する目的で用い、そしてこれに は、限定されるものではないが、ヒトのライノウィルス、「主要」群のヒトライ ノウィルスレセプタと結合する他のウィルス、リンパ球機能関連抗原−１、およ び熱帯マラリャ原虫（マラリャ）が含まれる。

［ヒトのライノウィルス」には、一般に、ｌｌａｍｐａｒｉａｎ、　Ｖ１他、Ｖ ｉｒｏｌ、、１５９：１．９１−１９２　（１，９８７）て分類されているよう な全てのヒト抗原型のヒトライノウィルスが含まれる。

ペプチド内のアミノ酸残基の配列を、Ｌｅｈｎｊｎｇｅｒ’ｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ ｉｓｔｒｙ　（ｔ。

ｒｔｈ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９７０）に示されて いる如き標準的学術用語に従って表示する。

ヒトのライノウィルスレセプタ（ＨＲＲ）としても知られている短縮されていな いＩ　ＣＡＭ−１は、トランスメンプランＩＣＡＭ（ｔｍｌｃＡＭ−１，）と呼 ばれている。非トラシスメンプランＩＣＡＭ類は、切形ＩＣＡＭ類としても知ら れている、即ちカルボキシル細胞内ドメインを本質的に有しておらずモしてｔｍ ｌｃＡＭの疎水性膜ドメインを有していないＩＣＡＭとしても知られており、こ れらは、界面活性剤の添加なして溶解性を示す。ｔｌｃＡＭ類は、便利にｔｍｌ ｃＡＭの細胞外領域のドメイン■、１．１．Ｉ　Ｉ　１．ＩＶおよびＶがら本質 的に選択される１種以上のドメインを含んでいてもよい。ｔｌｃＡＭ類はまた、 ｔｍｌｃＡＭの機能的類似物またはそれのフラグメントを含んでいてもよく、そ してまた、−緒にスプライスされたｔｍＩＣＡＭの１種以上のフラグメントを含 んていてもよいが、ここでは非ｔｍｌｃＡＭライニング（Ｉｉｎｉｎｇ）配列が 介在しているか介在していなくてもよく、そして必ずしも未変性のｔｍｌｃＡＭ の中で見いだされるのと同じ位でなくてもよい。現在のところ好適なｔｌｃＡＭ 類には、これに限定されるものではないが、形態１．　Ｉ　ＣＡＭ　（４５３） 、ｔ　ＩＣＡＭ　（１８５）、ｔ　ＩＣＡＭ　（８８）、ｌ１ＣＡＮ１（２８３ ）が含まれ、そして１．ＩｃＡＭ類は、ｔｌｃＡＭ（８９−１，８５）、ｔ　Ｉ ｃＡＭ　（１８６−２８３）、ｔ　ＩＣＡＭ　（２８３−３８５）　、ｔ　ＩＣ ＡＭ　（３８６−４５３）、ｔ　ＩＣＡＭ　（７５−７７）、ｔ　ＩＣＡＭ　（ ７０−７２）　、ｔ　ＴＣＡＭ　（６４−６６）、ＺＣＡＭ（・１０−７ｉ、　 ３　）、ｔｌｃＡ〜１　（３Ｇ−３８）　、ｔ　ＩＣＡＭ　（３０−３３）　、 ｔ　ＩＣＡＭ　（２６−２９）から選択される１種以−Ｌの配列を含んている。

Ｕ、Ｓ、Ｓ、Ｎ、　０７／６３１，３１３、Ｕ、Ｓ、Ｓ、Ｎ、　０７／６７８． ９０９およびＵ、　Ｓ、　Ｓ、　Ｎ。

０７／７０４．９９６参岡。非トラシスメンプラン形帖のＩＣＡＭには、ＩＣＡ Ｍの機能誘導体、達成を容易にするミューティン形態のｔｌｃＡＭ、並びにｔｌ ｃＡＭのイムノアドビーシンが含まれ得る。これらのｔｌｃＡＭ類が多量体構造 、好適には二量体として存在している場合、これらはヒトライノウィルス結合増 強を示すと共に、ウィルスの感染を低下し１与る。

多量化は、適切な架橋剤、例えばヘテロニ官能およびホモニ官能架橋削、例えば 三官能Ｎ−ヒト口キシスクシニミドエステル、イミドエステル、またはヒス−マ レイミドヘキサン類などを用い、第−ＩＣＡＭを第一二ＩＣＡＩＴに架橋させる ことによって達成され得る。

このＩＣＡＭの異なる形態、即ちトランスメンプランおよび非トランスメンプラ ンは、支持体に吸着させることによって多量化され得る。こノ支持体は、ニトロ セルロース、ｐＶＤＦ、Ｉ）ＥＡＥ、脂質ポリマー類、並びにアミノデキストラ ン、或はスペーサーまたはリンカ−の有無に拘らず、ＩＣＡＭを吸着できるか或 は達成できる種々の不活性ポリマー類からできていてもよい。

多量体ＩＣＡＭはまた、このＩＣＡＭを、例えばｔ（ＲＶ結合を阻害しない抗体 もしくはそれのフラグメントの如き１員、或は蛋白質担体に連成させることによ って多量化され得る。抗体の例には、抗ＩＣΔＭ抗体ＣＬ　２０３もしくはそれ らのフラグメントが含まれ、適切な蛋白質担体にはアルブミンおよびプロテオグ リカン類が含まれる。

達成を容易にする目的で、このＩＣＡＭは、少な（とも１種の反応性アミノ酸残 基、例えばリジン、システィン、或は達成を容易にする部位（類）を与える池の アミノ酸残基（類）を用いて修飾され得る。これらの種類の修飾されたＩＣＡＭ をミューティンと呼ぶ。この方法のＩＣＡＭのためのヌクレオチド配列は、ベク ター、例えばプラスミド内に含まれていてもよく、そしてこのベクターを宿主細 胞、例えば真核もしくは原核細胞に導入することができる。好適な真核細胞は、 哺乳動物の細胞、即ちチャイニーズハムスター卵巣細胞またはＩＩＥＫ２９３Ｓ 細胞であり、好適な原核細胞は大腸菌である。加つるに、このＩＣＡＭのどちら かの末端を修飾して、オリゴマーミセルの形成を促進させ得る脂質をこれに含有 させることができる。多量体ＩＣＡＭを含むＩＣＡＭは、完全グリコノル化また は部分グリコジル化されているか、或はグリコノル化されていなくてもよい。

多量体形態のＩＣＡＭ−１を構築するに好適な様式は、ＩＣＡＭ−１単量体上の 天然の自己会合部位か或はそれに近い適当な位置で、このｔＩＣＡＭ配列ｃｔ　 ＩＣＡＮ　（４５３）が特に好適である）の中にシステイン残基を工学処理して 入れることによる様式である。システィン残基を適当な位置に有するミューティ ンは、インビボにおける非共有結合的相互作用を安定化する共有結合（ジスルフ ィド結合）を形成する。上記ミューティンは、細胞内集合して、ジスルフィド連 結した二量体として発現し、また、ジスルフィド交換を助長する穏やかな還元条 件下、高蛋白質濃度下でインキュベートすることによるか、或は遊離スルフヒド リル基と反応する三官能化学架橋剤を用いて架橋させることにより、インビトロ で単量体ミューティンを架橋させることができる。上記蛋白質が示す別の利点は 、ＩＣＡＭ−１の中に工学処理された新規アミノ酸のいずれもその二量体界面に 隠されることで、免疫原性を示す可能性が低くなる点である。

別の好適な態様において、免疫グロブリン類のフラグメントと融合させてＩＣＡ Ｍイムノアドヒーシビー生じさせることによって、ＩＣＡＭを多量化することも 可能である。例えば、ＩＣＡＭもしくはそれのフラグメントと、重鎮もしくは軽 鎖の免疫グロブリンもしくはそれのフラグメント、特にＴｇＧ、ＩｇＡもしくは ＩｇＭが有する重鎮の定常部とを融合させ得る。好適には、この定常部は、ヒン ジ領域とＣＨ２およびＣＨ３の１つ以上を含んでいるが、ＣＨＩは含んでいない 。このように、免疫グロブリンの可変領域（Ｆ　ａ　ｂ）をＩＣＡＭもしくはそ れのフラグメントで置き換える。便利に、適切な発現系内で適切な融合遺伝子を 構築するか或は発現させることによって上記構築物を産生させ［例えば、Ｂｅｂ ｂｉｎｇｔｏｎ、　Ｃ，Ｒ，およびＣ，Ｃ，Ｇ、　ｌ１ｅｎｔｓｃｈｅｌ著［＠ 乳動物細胞内でクローン化した遺伝子を発現させるための、遺伝子増幅を基とす るベクターの使用Ｊ　、ＤＡＮ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　ＩＩＩ巻、Ｄ、　Ｇｌｏｖ ｅｒ編集、（１９８７）参照］、そして二量体構造として分泌させる。

本発明はまた、リガント、即ちヒトのライノウィルス、および「主要」群レセプ タウィルス類、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）　、熱帯マラリア原虫 （マラリア）などに対するＩＣＡＭおよびそれらの機能誘導体の結合を増強させ る方法を提供し、ここで、このＩＣＡＭは、そのり′ガントに対して多量体構造 で提示されることにより、このＩＣＡＭとそのリガンドとの結合が容易になる。

本発明は更に、ヒトライノウィルスの不可逆的脱外波を誘発する方法を包含して おり、上記方法は、上記ヒトライノウィルスとＩＣＡＭ−１もしくはそれのフラ グメント、例えば上に定義した如きｔｌｃＡＭとを接触させることを含んでいる 。

本発明はまた、ヒトライノウィルスによる哺乳動物細胞への感染を不可逆的に抑 制する新規方法を提供し、上記方法は、該ＩＣＡＭ−１もしくはそれのフラグメ ント（例えば、上で定義した如きｔｌｃＡＭ）と上記ライノウィルスとを結合さ せる条件下で上記ヒトライノウィルスとＩＣＡＭ−１もしくはそれのフラグメン トとを接触させることにより、上記ライノウィルスの不可逆的脱外波を刺激する 、ことを含んでいる。

本発明はまた、薬学的に許容される溶媒、希釈剤、アジュバントまたは担体と共 に、活性材料として、ヒトライノウィルスとの結合活性を示しそしてウィルス感 染を低くすることによって特徴づけられるポリペプチドを有効量で含有している 新規な薬学的組成物を提供するものである。

二量体構造のＩＣＡＭおよびそれらのフラグメントが現在のところ好適である。

下記の実施例は本発明の詳細な説明するものである。

実施例１は、ライノウィルスの増殖、精製および定量に関する。

実施例２は、ＩＣＡＭ−１に対するモノクローナル抗体の産生および単離に関す る。

実施例３は、短縮されていないＩＣＡＭ−１ｃＤＮＡからの非トランスメンブラ ン切形形態のＩＣＡＭｃＤＮＡの構築に関する。

実施例４は、哺乳動物細胞のトランスフエクンヨンおよび非トランスメンブラン 切形形態ＩＣＡＭｃＤＮＡの発現に関する。

実施例５は、非トランスメンブラン切形形態ＩＣＡＭ−１の単離および精製に関 する。

実施例６は、ｔｍｌｃＡＭ−１、ｔ　ＩｃＡＭ　（１８５）　、およびｔｒＣＡ Ｍ（４５３）の放射能標識、およびモノクローナル抗体に対する結合能力が保持 されていることの立証に関する。

実施例７は、トランスメンブランおよび非トランスメンブラン切形形管のＩＣＡ Ｍ−１のヒトライノウィルス結合アッセイに関する。

実施例８は、ＣＬ２０３　１ｇＧ抗体が仲介するｔ　ＩＣＡＭ　（４５３）の架 橋に関する。

実施例９は、トランスメンブランおよび非トランスメンブラン切形形管のＩＣＡ Ｍ−１の多量化に関する。

実施例１０は、多量体トランスメンブランおよび多量体非トランスメンブラン切 形形態のＩＣＡＭ−１の感染カー中和定量に関する。

そして、実施例１１は、ＩＣＡＭ／ＦＬＡ−１相互作用の有効な抑制因子として の、トランスメンブランおよび切形形態ＩＣＡＭ−１の多量体形態の使用に関す る。

実施例１２は、ｔｌｃＡＭ（１８５）／ＩｇＧおよびｔｌｃＡＭ（４５３）／Ｉ ｇＧイムノアドヒーンビー構築に関する。

実施例１３は、ｔｉＣＡＭ／ＩｇＧイムノアドヒーシンによるラビーウィルス結 合および中和に関する。

実施例１４は、ＩＣＡＭ−１のインビトロニ量化に関する。

実施例１５は、ｔ　ＩＣＡＭ　（１−４５１）／ＬＦＡ−３（２１０−２３７） キメラに関する。

実施例１６は、ＩＣＡＭによるＨ　ＲＶの不可逆的不活性化に関する。

実施例１７は、システィンミューティン類に関する。

＾ｂｒａｈａｍ、　Ｇ、　、池、Ｊ、　ＶｉｒｏＬ、、５１．＋３４０　（１９ ８４）およびＧｒｅｖｅ、他、Ｃｅ１１．５６：８３９　（１９８９）中に本質 的に記述されているように、ライノウィルスを増殖させ、精製し、そして定量し た。これらの試験のために選択した抗原型には、ＨＲＶ１４、即ちこの分野の標 準型、およびＨＲＶ３　（これは、ＨＲＶ１４よりも約１０倍高い、ＩＣＡＭに 対する親和力を有している）が含まれる。ＨＲＶ２（これは、「主要」レセプタ とではなくむしろ「少数」レセプタと結合する）を負の対照として用いた。

ライノウィルスＨＲＶ２、ＨＲＶ　３、およびＩＩＲＶ１４は、Ａｍｅｒｉｃａ ｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎから入手し、プラーク精製 し、そして感染させたヒーラ−（Ｈ，ｅＬａ）−３３細胞の溶解産物から単離し た。精製したライノウィルスは、ポリエチレングリコール沈澱およびスクロース 勾配沈降で調製した。ウィルスの純度は、カプシド蛋白質の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分 析および電子顕微鏡で測定した。ＭｉｎｏｒＳＰ、　Ｄ、　、　Ｇｒｏｗｔｈ著 、［ピコルナウィルスの定量および精製Ｊ　（ａｓｓａｙ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆ ｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｉｃ。

ｒｎａｖｉｒｕｓｅｓ）　［ｒウィルス学：実用アプローチＪ　（Ｖｉｒｏｌｏ ｇｙ　：＾ＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ）　、Ｂ、Ｗ、Ｊ、　１ｌａｈ ｙｌｉ集、（Ｏｘｆｏｒｄ：ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ）　、２５−４１頁］に本質的 に記述されているように、細胞変性効果を記録する制限希釈感染定量法によって 、感染力を定量した。

３週間間隔で３回、０．５ｍＬの燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢｓ）中の１０７個の無 傷ヒーラ−細胞を腹こう内注射することによって、ＢＡＬＢ／　ｃ　Ｂ　ｙ　Ｊ のメスのマウスを免疫化させた。２週間後、このマウスから採血し、そして一定 量の血清を、ヒーラ−細胞のｆ（ＲＶ　ｌ　４感染に対する保護効果を試験する ため用いた。陽性のマウスに、最終的に、更に１０７個のヒーラ−細胞を追加し 、そして３日後、肺臓の細胞をＰ３Ｘ６３−Ａｇ８゜６５３骨髄腫細胞（Ｇａｌ ｆｒｅ、　ｆｕ！、Ｎａｔｕｒｅ、２６６：５５０−５５２　（１９７７）　） に融合させて、全体で約７００個のハイブリドーマ含有ウェルを生じさせた。９ ６個のウェルを有するプレート中で、３ｘｌＯ’ヒーラ−細胞を、１００μＩ、 の上澄み液と一緒に３７℃で１時間インキュベートし、次に、この細胞をＰＢＳ で洗浄し、そして充分な量の）ＩＲＶ１４を加え、２４−３６時間で完全な細胞 変性効果を生じさせた後、各々のウェルを検査した。陽性（感染から保護された ）のウェルを３６時間後記録した。

この最初のスクリーン試験で陽性を示したウェルから細胞を取り出した後、９６ 個のウェルを有するミクロタイタープレート中で制限希釈することによってクロ ーン化した。これらのウェルから得た」二澄み液を、細胞保護定量法で試験した 後、陽性を示すウェルを再び同定した。ハイブリドーマ含有ウェルの全てが陽性 になり、クローン集団が得られたことが示されるまで、更にクローン化を行った 。４つのクローン化した細胞系、およびそれらの相当する抗体が得られ、そして これらを各々、Ｃ７８，１Ａ、、Ｃ７８，２Ａ、Ｃ７８，４Ａ、Ｃ７８，５Ａ、 Ｃ９２，ＩＡおよびＣ９２，５Ａと表示した。

Ｃ９２，ＩＡを、■９８７年１団１９日、＾ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉＯｎ、１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ 、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０８５２に寄託し、ＨＢ９５ ９４と表示された。

実施例３ 短縮されていないＩＣＡＭ−１ｃＤＮＡがらのｔ　ＴＣＡＭ　ｃＤＮＡの供給者 が推奨する条件下、＾ｍｅｒｓｈａｍ　（商標）　ｃＤＮ＾合成キットを用いて 、ＨＥＩ細胞からのポリＡ＋ＲＮＡがら、ランダムにプライムされたｃＤＮＡを 合成しｔニー。フライ７−　Ｐ　ＣＲ５、１：　（ｇｇａａｔｔｃＡＴＧＧＣＴ ＣＣＣＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＧＣＣＣ）およびＰ　ＣＲ３、１：　（ｇｇａａ ｔｔｃＴＣＡＧＧＧＡＧＧＣＧＴＧＧＣＴＴＧＴＧＴＧＴＴ）を用い、２５サイ クルのための１１００ｎのｃＤＮＡを用いて、ＰＣＲ増幅を行った。増幅サイク ルは、９４℃で１分間、５５℃で２分間、および７２℃で４分間からなっていた 。ＰＣＲ反応の生産物を、ＥｃｏＲｌて消化させた後、ＥｃｏＲ１消化したファ ージベクターラムダＧＴＩＯ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　（商標））でクローン化 した。組換え型ファージクローン体を、ＩＣＡＰｔＬ−１特異オリゴヌクレオチ ド：　ＧＡＧＧＴＧＴＴＣＴＣ＾＾ＡＣＡＧＣＴＣＣＡＧＣＣＣＴＴＧＧＧＧＣ ＣＧＣＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣ（ＩＣＡＭＩ）およびＣＧＣＴＧＧＣＡＧＧＡＣ ＡＡＡＧＧＴＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＡＧＧＧＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＴＴＣＴ（ ＩＣＡ１１３）を用いたプラークハイブリッド形成でスクリーンにかけた。

ラムダ１１　ＲＲ４と表示する陽性クローン体を選択した後、精製した。

ＥｃｏＲ１消化により挿入断片を除去した後、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳ＋の Ｅ　ｃ　。

Ｒ１部位にサブクローン化した。このクローン体をｐ　Ｉ−Ｉ　ＲＲ，２と表示 する。この挿入断片全体の配列を決め、そしてこれは、Ｇ！ｙの代わりにＡｈａ −１４６２を弔置換しまたＩ）ＣＲＩＣＡＭ−１Ａ列（Ｓｆｍｍｏｎｓ、他、Ｎ ａｔｕｒｅ、３３１：６２４　（１９８８）　：　５ｔａｕｎｔｏｎ、他、Ｃｅ 　１．ｌ、５２：９２５−９３３　（１９８８）　）で特性が与えられているよ うな、イニシェークーＡＴＧコドンで始まりＴＧＡ終止コドンて終わる全体のＩ ＣＡＭ−１コーディング配列を有することが堅いだされた。同様の変化が、個々 の数種のクローン体中で同定され、従−って、これはＩＣＡＭ−１遺伝子の多摩 性を表している。

Ｂ、ｔｌＣＡＭ（４５３）およびｔＩＣΔ〜ｔ（１８５）の構築鋳型とじ一〇、 短縮されていないＩＣＡＬｉ−１ｃＤＮＡクローン体ｐ１１ＲＲ−２を用いたＰ 　ＣＲ増幅反応（Ｓａｉｋｉ、池、５ｃｉｅｎｃｅ、　２３０：１３５０−］３ ５４　（１９８５）　）で、ＩＣＡＭ　−ｉ　ｃＤＮＡの修飾形態を創作した。

このプラスミドＤ　Ｎ　ＡをＥｃｏＲｌて消化させて、該ＩＣΔＭ−１挿入断片 を切除した後、アルカリ性ホスファターゼを用いて処理し、次の連結反応段階で 二のベクターが再び円形になるのを防止した。１０ｇの鋳型ＤＮ　Ａに、下記の 条件下 ７１　４（最終伸長） て、ｔｌｃＡＭ−４５３のためのオリゴヌクレオチドブライマーＰＣＲ５５およ びＰＧＥ３．３、そしてｔｌｃＡ〜１−１８５のためのＰＧＥ１．５および３． １０を用いて１ｏサイクルのＰＣＲ増幅を受けさせた。

Ｐ　ＣＲ５、５ハ、配列：　ＧＧＡＡＴＴＣＡＡＧＣＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＧ ＣＴＡＴＧＧＣＴＣＣＣＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＧＣＣＣ（これは、ＥｃｏＲｌ および１（ｉｎｄｌ１１部位、１２ｂｐＩＣＡＭ−１５“非翻訳配列、およびシ グナルペプチドをコード化する第一２４ｂｐからなっている）を有している。

ＰＧＥ３．３は、配列：　ＧＧＡＡＴＴＣＣＴＧＣＡＧＴＣＡＣＴＣＡＴＡＣＣ ＧＧＧＧＧＧＡＧＡＧＣＡＣＡＴＴ（これは、ＥｃｏＲｌおよびＰｓｔ１部位、 終止コドン、およびＩＣＡＭｌの最後の８個の細胞外アミノ酸（残基４４６−４ ５３）をコード化する塩基に相補的な２４ｂｐがらなっている）を有している。

ＰＧＥ３．１０ｆｉ、配列：　ＴＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＴＣＡＡＡＡＧＧＴ ＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＡＧＧＧＧＧ（これは、ＸｂａｌおよびＢａｍＨ１部位 、終止コドン、およびＩＣＡＭ−］の残基］、　７８−１８５をコード化する塩 基に相補的な２４ｂｐからなっている）を有している。

このＰＣＲ反応生産物を、ＥｃｏＲｌ　（ｔ　ＩＣＡＭ　（４５３））　、或は Ｅｃ　ｏ　Ｒ１およびＢａｍ）Ｉｌ、（ｔ　ＩＣＡＭ　（１８５））を用いて消 化させた後、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　（商標）　ＳＫ＋　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ ｅ）のポリリンカ一部位にクローン化した。この所望挿入断片を含有しているク ローン体は、制限分析およびＤＮＡ配列決定によって確認された。Ｈｉｎｄｌｌ ｌおよびＸｂａｌを用いて消化することにより、該挿入断片をＢｌｕｅｓｃｒｊ ｐｔ　（商標）から切除した後、この発現ベクターＣＤＭ８　（Ｓｅｅｄ、　Ｎ ａｔｕｒｅ、２３９８．１０　（＋９８７））のｔｌｉｎｄｌｌｒおよびＸｂａ 、１部位に挿入した。ｐＨＲＲ−８，２として表示したｔ　ＪＣＡＭ　（４５３ ）挿入断片含有クローン体、およびｐ）ＩＲＲ２３−１３として表示１．たｔ　 ＩＣＡＭ　（１８５）　挿入断片含有クローン体を選択し、そして一層の配列決 定分析を行った。

これによって、所望終止コドン９存在が立証され、そしてＩＣＡＭ−１コーディ ング配列の選択さｔＷこ領域の完全性が立証された。

ＤＥＡＥ−デキストラン技術を用いて、これらのプラスミドをｃｏｓ細胞中に移 入させた後、この細胞を、分析前７２時間培養した。間接免疫蛍光、およびＩＣ ＡＭ−１に特異的なモノクローナル抗体を用いたＦＡＣ３で、表面発現を監視し た。ＣＯ８細胞中の一過性発現、およびＣ７８，４Ａ　Ｍａｂ　（モノクローナ ル抗体）を用イｔ：代謝’１Ｍｒａ　（［”Ｓ］ノンテイン）細胞上澄み液の免 疫沈澱の結果、それぞれ、ｐＨＲＲ２３−１３およびｐＨＲＲ８，２がら（７） ４５ｋｄおよび８Ｑｌ＜ｄｃ７）可溶ＩＣＡＭ−１フラグメントの産生が示され た。安定なチャイニーズハムスター卵巣細胞トランスフェクシント（ｔｒａｎｓ ｆｅｃｔａｎｔｓ）の調製は、下記の実施例４で記述する。

Ｃ１修飾非グリコジル化ｔｌｃＡＭ−１Ｇｉｎに対する位置１０３．１１８．１ ５６および１７３各々におけるＡｓｎの同時変異誘発で、修飾した短縮されてい ないＩＣＡＭ−１を製造した。これにより、ＩＣＡＭ−１分子の細胞外ドメイン ＩＩがら４つのＡｓｎ連結連結グリコジル化部万全除去する。非グリコジル化ト ランスメンプランＩＣＡＭと呼ばれているこのとき得られる分子は、ＣＯ８細胞 の表面上に発現し、未修飾ＩＣＡＭ−１に匹敵するレベルで、放射能標識された ）ＩＲＶ３と結合することができた。この結果は、ドメインＩＴ（最初の１８５ 個のアミノ酸）のグリコジル化はＩＣＡＭ−１に対するウィルスの結合には不必 要であることを示している。

非トランスメンプランＩＣＡＭは、同様に修飾され、修飾された非グリコジル化 トランスメンプランＩＣＡＭ−１分子を生じ得ると期待される。

Ｃ末端に新規なりノン残基を付加させたＩＣＡＭ−１の４５３アミノ酸細胞外ド メインから成る分子を、実施例３Ｂに記述したように、ｐＨＲＲ−２ｃＤＮＡの ＰＣＲ修飾により構築した。使用したプライマーは、ＰＣＲ５，５（実施例３Ｂ ）およびＰＣＲ３，１９（これは次の配列：　ＴＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＴＣ ＡＣＴＴＣＴＣＡＴＡＣＣＧＧＧＧＧＧＡＧＡＧＣＡＣＡＴＴを有し、そしてＸ ｂａｌおよびＢａｍＨ１部位、終止コドン、Ｌｙｓコドン、およびアミノ酸残基 ４４６−４５３をコード化する配列に相補的な２４個の塩基から成る）である。

ＣＤＭ８ベクター中へのクローン化に続いて、ＣＯ８細胞中の一過性発現によっ て、位置４５３にＬｙｓを有するｔｌｃＡＭの産生が確認された。安定なＣＩ（ ０細胞系が、実施例４に記述したように、ｐＳＶ２−ＤＨＦＲを用いた共トラン スフェクションによって生じた。ＰＣＲ５，５およびＰＣＲ３，２０（これは次 の配列：　ＴＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＴＣＡＣＴＴ＾＾＾ＧＧＴＣＴＧＧＡＧ ＣＴＧＧＴＡＧＧＧＧＧＣを有し、そしてＸｂａｌおよびＢａｍＨ１部位、終止 コドン、Ｌｙｓコドン、および残基１７８−１８５をコード化する配列に相補的 な２４個の塩基から成る）を用いて、同様な方策を、ｔ　ＩＣＡＭ　（１８５） Ｃ末端へのＬｙｓ残基付加に用いた。

一過性ＣＯ８細胞発現により、ｔｌｃＡＭ−１８５の産生が確認され、そして安 定なＣｌｌ０細胞系が実施例４に記述したように誘導された。

各々が追加的Ｃｙｓ残基を有するｔ　ＩＣＡＭ　（４５２）の３つの修飾形態を 、短縮されていないＩＣＡＭ−１ｃＤＮＡの部位特異的変異誘発て構築した。各 々の構築において、位置４５３のＧｌｕ残基をＧＡＧからＴＡＧに変えることに よって終止コドンを導入した。このように、このＣ末端はＴｙｎ−４５２である 。２番目の部位特異的変異誘発を用いて、残基Ａｓｎ−３３８、Ｔｈｒ−３６０ 、およびＧｌｎ−３８７を各々別々にＣｙｓに変異させた。所望の変異の存在は 、ＤＮＡ配列決定によって確認した。

Ｃｙｓへの変異の目的で選択した残基は、これらの領域の表面暴露を予測する表 面確率に関するコンピューターで生じさせたプロットを基にして選択した。また 、Ｔｈｒ−３６０は、効力のあるＡｓｎ連結グリコノル化の部位であるＡｓｎ− ３５８の直ぐ近くに存在している。この３つのＣｙｓ変異体の各々は発現し、そ して移入したＣＯ８細胞の媒体中に分泌される。還元および非還元条件下でこの 蛋白質を検査した結果、二量体の存在に関するいかなる示唆も示されなかった。

スルフヒドリル基に対して反応性を示す架橋剤が、多量体形態を得る目的でＣｙ ｓ修飾ｔｌｃＡＭ形態を架橋させるために用いられ得ると予測される。

実施例４ 細胞のトランスフェクションおよびｔ　ＩＣＡＭ　ｃＤＮＡの発現Ａ　真核細胞 のトランスフェクション ジヒドロ葉酸塩還元酵素（ＤＨＦＲ）が欠損しているチャイニーズハムスター卵 巣細胞（ＣＩＩＯ）を、Ｃｕｔｔｅｒ　Ｌａｂｓ　（ＢｅｒｋｅｌｅｙＳＣ＾、 ）から入手した。ＳＶ４０プロモーターの制御下のマウスジヒドロ葉酸塩還元酵 素（ＤＩＩＦＲ）　を含有しテイルブラスミドｐ　Ｓ　Ｖ　２−　Ｄ　ＨＦ　Ｒ 、！：、ｔＩＣＡＭ−４５３か或はＣＤ　Ｍ　８ベクター（５ｅｅｄおよび＾ｒ ｕｆｆｏ、ＰＡＮＳ。

８４・３３６５−３３６９　（１９８７））内のｔｌｃＡＭ−１８４構築物とを 一緒に、上記細胞に共移入した。

エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）および燐酸カルシ ウム方法の両方を用いてトランスフェクションを行った。上記Ｂｅｂｂｉｎｇｔ ｏｎ０移入したＤ　Ｉ（Ｆ　Ｒ陽性細胞を、ヌクレオシドが入っていない培地上 で増殖させることによって選択し、そしてトランスフェクシントのプールを制限 希釈でクローン化させた。

次のように、Ｍａｂｃ７８．４ＡおよびＣ７８，５Ａを用いた、ＩＣＡＭに関す る二部位放射免疫検定（ＲＩ　Ａ）で、培養の上澄み液を検査することによって 、ｔｌｃＡＭを分泌する細胞系を同定した。ＩＣＡＭ上の１つのエピトープ（例 えば、Ｍａｂ　Ｃ７８，４Ａ）に対するモノクローナル抗体を、９６個のウェル を有するプラスチック製プレート（Ｉｍｍｕｎｌｏｎプレート、Ｄｙｎａｔｅｃ ｈ　Ｉｎｃ、　）に吸着させ、このプレート上の過剰な結合部位をウシ血清アル ブミン（ＢＳＡ）でブロックし、そして次に、培養上澄み液をプレートと一緒に 培養した。その後、このプレートを洗浄し、そして、［”５１］　−Ｍａｂ　（ ＩＣＡＭ上の２番目のエピトープ、例えばＣ７８，５Ａに対して特異的）を−緒 に培養し、そして洗浄後、結合した［＋２５］　１　ｇＧの量を測定した。ｔｌ ｃＡＭの濃度を、公知濃度のｔｍｌｃＡＭの標準曲線に対して、未知濃度から得 られるＲＩＡデータと比較することによって測定した。陽性クローン体を拡張さ 疫沈澱させることによって、ｔｌｃＡＭ形態の発現を確認した。

さらなる試験を行う目的で、細胞系ＣＴ、２Ａ　（ｔ　ＩＣＡＭ（４５３））お よびＣＤＩ２．ＬＡ　（ｔ　ＩＣＡＭ　（１８５））を選択し、そして上記のＢ ｅｂｂｉｎｇｔｏｎ、他が記述しているように、メトトレキセート含有媒体中で 遺伝子増幅を受けさせた。１１００ｎのメトトレキセートに耐性を示すＣＴ２Ａ から誘導されたクローン体、およびＩＩＩＭのメトトレキセートに耐性を示すＣ ＤＩ２．ＩＡクローン体を、可溶切形ＩＣＡＭ〜１蛋白質の精製を行う目的で用 いた。

Ｂ　原核細胞のトランスフェクノヨン ウイルス結合の保持には、ＩＣＡＭのウィルス結合ドメインのグリコノル化が必 要とされていないことから（実施例３Ｃで示したように）、原核細胞、例えば大 腸菌は成功裏に移入され、機能的蛋白質を産生じ得ると期待される。

以前、同時係属中のＵ、Ｓ、Ｓ、Ｎ、　０７／１３０．３７８およびＧｒｅｖｅ 、他、Ｃｅ１ｌ、５６８３９−８４７　（１９８９）中に、ｃ　７８　、　４　 Ａ　−３ｅｐｈａｒｏｓｅ　（商標）を用いたモノクロ−±ル抗体アフィニティ ークロマトグラフィーが記述されている。

血清含有媒体中に分泌される１、ＩｃＡＭは、この血清中に混在している蛋白質 の水準が高いため、追加的精製段階が必要とされた。Ｍａｂアフィニティーカラ ムからの溶離を行う前に、このカラムをＩＭのＮａＣｌで洗浄して、弱く結合し ている蛋白質を除去した。ｔ　ＩＣＡＭ　（４５３）に関しては、このｃ　７８ ．　４−５ｅｐｈａｒｏｓｅ　（商標）カラムから溶離した部分的に精製された ｔ　ＩＣＡＭ　（４５３）を、１０ｍＭのトリス（ｐＨ６（））中に透析させ、 七ノー〇（商標）カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上に吸収させ、そして０−０． ３ＭのＮ　ａ、　ＣＩ勾配で溶離させた。更に、５ｅｐｈａｒｏｓｅ−１２（商 標）カラムてゲル濾過することによって、ｚｃＡＭ１８４を精製した。

非トランスメンブラン切形形態ＩＣＡＭｉは、モノクローナル抗体アフィニティ ーグロマトグラフィーを用いることなく、標準イオン交換方法でも精製さ得ると 理解される。

実施例６ ｔｍｌｃＡＭ−１、ｔ　ｒｃＡＭ　（１８５）　、およびｔ　ｒｃＡＭ　（４５ ３）の放射能標識、およびモノクローナル抗体に対する結合能力が保持されてい ることの立証 モノクローナル抗体ｃ７８．４ＡおよびＣ７８，５Ａに対して反応性を示すエピ トープ類は、構造依存性エピトープ類であり、従って未変性Ｉ　ＣＡ　Ｍ構造の 保持を確かめるための分析プローブとして使用され得る。

公知量の精製ＩＣＡＭを、Ｃ７８，４ＡまたはＣ７８，５Ａ　ＩｇＧ−３ｅｐｈ ａｒｏｓｅ　（商標）と−緒にインキュベー］・シた後、結合した放射能の両分 を測定した。これらの試験によって、この精製したｔｍｌｃＡＭ−１、ｔ　ｉＣ ＡＭ　（１８５）　、およびｔ　ＩＣＡＭ　（４５３）は、これらのモノクロー ナル抗体との結合能力を完全に保持していることが示された。

トランスフェクタントを　［３５Ｓ］システインで代謝標識した後、細胞溶解産 物（トランスメンプランＩＣＡＭのための）または培養上澄み液（切形ＩＣＡ〜 １のための）を製造し、そしてＣ７８，４Ａ　ＩｇＧ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ　（ 商標）ビートと一緒にインキュベ−１−した。このヒートを洗浄し、ドデシル硫 酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いて、吸着された蛋白質を溶離させ、そして５ＤＳ −ＰＡＧＥで分析した。Ｇｒｅｖｅ、他、Ｃｅ１ｌ、　５６：８３９−８４７　 （１，９８９）参照。この単離された蛋白質は定量的にＣ７８４ＡおよびＣ７８ ，５Ａ　Ｍａｂと結合することが見いだされた。

従って、このＬ　ｒｃＡＭ　（１８５）およびｔ　ＩＣＡＭ　（４５３）は両方 共、未変性のＩＣＡＭ構造を保持していた。

実施例７ 以下に、種々の形態のＩｃＡＭが示す結合活性を評価する目的で用いた３種の結 合定量法を記述する。

Ａ　ベレット化定量法 ［３５Ｓ］　ノステイン・標識しｆコｔ　ｍ　Ｉ　ＣΔＮ１−１まｔコは１．Ｉ ｃＡＭを、１、００　μＬの１０ｍＭ　＋（ＥＰＥＳ　（ｐＨ７，５）　、１５ ０ｍＭ　ＮａＣ１，１ｍＭ　ｈｌｇＣＩ　２、ｉｍＭｃａｃＬ、領　１％トリト ンＸ−１００中、＋１　ＲＶ　３と混合した。この混合物を３７°Ｃで３０分間 インキュベート腰）トドで冷却し、２００１ＪＬの１０％グリセロール、０．２ Ｍのトリエタノールアミン（ｐＨ７，５）から成る敷物の土に層状に置き、そし て１３４．ＯＯＯｘｇて３０分間、４℃で、Ｂｅｃｋｍａｎ空気駆動遠心分離機 中で遠心５）離した。土部の２７５μＬを取り出し、そしてＳ　Ｉ）　Ｓ−Ｐ　 Ａ　Ｇ　ｒ＞およびノンチレーンヨンカウンテイングでベレットを分析した。対 昭区のＳ　Ｄ　Ｓケルを銀染色する実験により、これらの条件下で本質的に全て の該１１ＲＶ３がベレット化され、そして本質的に全ての該■Ｉ　ｍ　Ｉ　ＣＡ Ｍ　−１１，１，６％ｔ　Ｉ　Ｃノ〜ｈｘ　＜　・１５３）　１．０　％ｔ　Ｉ ＣＡＭ　（１８５）　４．３％ ＊　・１回の実験の平均、これらの値を直接には相対的親和力に変換することは できない。

これらのデータは、両方の切形形態ＩＣＡＭはライノウィルスと結合するが、し かしｔｍｌｃＡＭのそれに比較すると本質的に減少したレベルであることを示し ている。

Ｂ　溶液結合定量法 溶液中のｔｍｌｃＡＭおよびｔｌｃＡＭフラグメントの相対的親和力に関する定 員法情報を得る目的で溶液競合定量法を開発し、ここでは、予め固定化したＩＣ ＡＭ−１と［”Ｓ］　）］ＲＶ３との結合を抑制する目的て可溶ｔｍｌｃＡＭま たはｔｌｃＡＭフラグメントを用い、同一条件下で異なる蛋白質が比較できるよ うに非イオン系界面活性剤（トリトンＸ−１００）を緩衝液中に入れた。最初に 、ｔｍｌｃＡＭ−１（）リドンｘ−ｉｏｏの代わりに０１％のオクチルゲルコン ドの存在下で単離）をトリス／ＮａＣｌ緩衝液中で１０倍に希釈した後、−晩、 ミクロタイタープレーｈ　（Ｉｍｍｕｎｌ、ｏｎ−４、Ｄｙｎａｔｅｃｈ）の壁 に吸着させた。次に、このプレート上の非特異的結合部位をｌＱｍｇ／ｍＬのＢ ＳＡでブロックした後、０１％トリトンＸ−１００／１ｍｇ／ｍＬ　）３ＳＡ／ １０ｍＭトリス／２００ｍＭのＮａＣｌ中で結合実験を行った。約２０．０００ ｃｐｍの［”Ｓ］　）−（ＲＶ３を、種々の量のｒｃＡＭ　［ｔｍｌＣＡＭ、ｔ ｒｃＡＭ　（＝１５３）！、？、：はｔ　ＩＣＡＭ　（１８５）］と混合し、３ ７℃で１時間インキュベートシた後、該ミクロタイタープレートのウェルに添加 し、そして３７℃で３時間インキュベートした。このプレートを洗浄した後、結 合したｂシ射能を測定した。

表２に示すヨウニ、ｔｍｌｃＡＭ−１は低濃度（０，００８μＭ）　で、最大値 の半分までウィルスの結合を抑制したが、一方ｔｌｃＡＭ（４５３）およびｔ　 ＩｃＡＭ　（１８５）はずっと高い濃度（それぞれ、２．８ｐＭおよび７．９／ ＩＺＭ）て抑制し、即ちｔｍｌｃＡＭよりも３５０から約１０００倍高い濃度で 抑制した。

ｔｍｌｃＡＭ　８．０±３．３ｏＭ（Ｎ＝３）ｔ　Ｉ　ＣＡＭ（４５３）　２． ８±０．６μＭ（Ｎ＝３）ｔ　Ｉ　ＣＡＭ（１８５）　７．９±２８μＭ（Ｎ＝ ３）＊　ＩＣ，。は、ＩＩ　ＲＶ　３結合を５０％抑制するために必要な可溶Ｉ ＣＡＭの濃度である。

これらのデータは、ｔ　ＩＣＡＭ　（４５３）およびｔ　ＩＣＡＭ　（１８５） はｔｍｌｃＡＭ−１よりも低い親和力ではあるがライノウィルスと結合すること を立証し、以前の観察を拡張しており、そしてこのウィルスの結合部位はＩＣＡ Ｍ−１が有する２つのＮ末端ドメイン（１８５残基）内に包含されているとする 証拠を与えている。

３４℃（この温度はライノウィルスが通常に複製する温度）で行った次の実験に おいて同様な結果が得られた。

Ｃドツト・プロット定量法 結合活性を測定するための代替方法を用いたが、ここでは、ｔｍｌｃＡＭＩ、ｔ ｌｃＡ〜ｆ（４５３）またはｔ　ＩＣＡＭ　（１８５）をニトロセルロースのフ ィルターに吸着させ、このフィルター上の非特異的結合部位を１０ｍｇ／ｍＬの ウシ血清アルブミン（ＢＳΔ）でブロックした後、放射能ウィルス、或はＩＣＡ Ｍ−１に対する［１２５１］Ｍａｂを、３７℃で６０分間該フィルターと一緒に 培養した。このフィルターを緩衝液で洗浄した１麦、このフィルターをＸ線フィ ルムに暴露した。

該フィルターに結合した放射能の量を、オートラジオダラムの濃度計て測定し、 そしてＩＣＡＭに結合した（プロットに結合した）　［１！Ｓｌ１Ｍａｂ　ｃ７ ８．４Ａまたはｃ７８．５Ａの量を平行して測定することによって、該プロット に結合したＩＣＡＭの量に対して正規化したＨＲ■３結合（任意単位で表した） として、このデータを表す。その結果を表３に示す。

表３ 固定化ＩＣＡＭ＊に対する［”Ｓｌ　１１ＲＶ３の結合ＩＣＡＭ　ｔｌｃＡＭ（ ４５３）　比ＩＣＡＭ／ｌＩＣＡＭ４５３１．２±１．１　０．５２±０．４５ 　２．３＊　５回の実験の平均。データは、［３５Ｓ］　１ＩＲＶ３結合／［＋ ２５１］抗ＩＣＡＭＭａｂ結合の任意濃度単位で表す。

ｔｌｃＡＭ１８５を用いた追加的試験を行った。結合実験は不確実な結果を示し た。立体障害がある役割を果しているものと予測される。このウィルスの大きさ は約３０ナノメーターである。ｔｌｃＡＭ（１８５）の長さは１０ナノメーター 未満である。スペーサーまたはリンカ−を使用すれば、結合に対してより確かな 結果が得られるであろう。

この実験から得られる結果は、このような定量条件下では、結合した［１２ｓｌ １Ｍａｂの量に対してウィルスの結合量を正規化したときのｔｍｌｃＡＭ−３レ ベルに匹敵するレベルで、ｔｌｃＡＭ（４５３）がライノウィルスと結合し得る ことを示している。更に、これらの結果は、このｔＩＣＡＭ形態はライノウィル スと結合する能力を有しているが、この結合親和性は該ｔｌｃＡＭの構造に依存 していることを示している。

ｔｍｌｃＡＭ−１は小さい多量体（恐らくは二量体）であってもよ（、そして多 量体形態におけるｔｌｃＡＭの提示は、この多量体構造を模擬したものである。

このような仮説を支持する証拠は、上て考察したように、ライノウィルス粒子の 最大数と、細胞と結合できる抗体分子の最大数との比率が約１．５であるとする 定量的結合試験（未公開）から来るものである。これは、Ｔｏｍａｓｓｉｎｉ、 　Ｊ、他、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、５８：２９０　（１９８６）の以前の研究（これは 、結合には、５個の分子から成る複合体が必要であることを示唆している）と相 反するものである。彼らの結論は、ゲル濾過のデータに関する誤解した解釈を基 としたものであり、結合した界面活性剤分子を考噂することができなかった。

実施例８ ＣＬ２０３　ＴｇＧ抗体が仲介するｔ　ＩＣＡＭ　（４５３）の架橋ＬｍｌＣＡ Ｍ−１が示すこのより高い相対的結合活性がその蛋白質の多量体形態によるもの であることの追加的証拠を得る目的で、該ｔＩＣＡＭ（４５３）蛋白質をＣＬ２ ０３　［即ち、ウィルスとＩＣＡＭ−１との結合を抑制しないが、残基１３４　 （Ｓｔａｕｎｔｏｎ、他、Ｃｅ１ｌ、５６：８４９　（１９８９）およびＣｅ１ ｌ、６１：２４３　（１９９０）　）に対する部位Ｃ末端と結合するところの、 ＩＣＡＭ−１に対するモノクローナル抗体］と一緒に予備インキュベートした。

このように、この抗体は、ｔ　ＩＣＡＭ　（４５３）の２つの分子を有効に「架 橋」させて、ｔ　ＩＣＡＭ　（４５３）の「二量体」を創作することができ、更 に、このｔ　ＩＣＡＭ　（４５３）の２つの分子の各々のウィルス結合部位をブ ロックしないで行うことができる。重量比が４：１のＣｔ、：２ｏ：３　１ｇＧ とｔ　Ｉ　ＣＡＭ　（４５３）との混合物を競争定量法で試験したとき、この抗 体で架橋させたｔ　ＩＣＡＭ　（４５３）が、ｔ　ＩＣＡＭ　（４５３）単独よ りも７．４倍低い濃度でＨＲＶ３結合を抑制することを見い出し、これは、二量 体または小さい多量体であるが故に、ｔｍｌｃＡＭ−１の方がより高い親和力で ライノウィルスと結合するとの考えと一致している。

ｔｌｃＡＭの代替多量体形態を制作する目的で、ＩＣＡＭを更に一層修飾した数 種の切形形態を、上記実施例３に記述したようにして構築した。

その後、これらの形態を、以下の実施例９で示すように多量化させ得る。

ｔｌｃＡＭを、その単量体形態よりも強化されたウィルス結合および中和活性を 有する多量体形態に変換させ得る種々の方法がある。例えば、ホモニ官能（例え ばＮ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨ５）エステル）またはへテロニ官能（例え ば、ＮＨ３−エステルと、光活性化可能基もしくはスルフヒドリルに反応性を示 す基とを含有しているもの）架橋剤を用い、そしてアミノ−デキストラン上のア ミノ基およびｔｌｃＡＭ上のアミノ基または他の基を利用して、第−ｔ［ｃＡＭ を、第二ｔｌｃＡＭ（同一もしくは異なっていてもよい）にか或は不活性なポリ マー、例えばアミノ−デキストラン（ＮＨ４０，０００）に達成（カップル）さ せることができる。適当な架橋剤の数多くの例がＰｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａ ｌ　Ｃａｍｐａｎｙのカタログ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、　ＩＩｌ、）中に見いださ れる。同様に、これらのｔｌｃＡＭ類を、他の適切な不活性ポリマー類、例えば ニトロセルロ−ス、ＰＶＤＦ、ＤＥＡＥ、脂質ポリマー、並びにスペーサーもし くはリンカ−の有り無しでｔｌｃＡＭに吸着され得るか或はそれと連成し得る他 の不活性なポリマー類に結合させることも可能である。

ｔｌｃＡ〜１は、Ｎ１（Ｓ−エステルを基とする化合物に対して弱い反応性を示 すころから、遺伝工学的に処理したＣ末端リジン残基を有するｔｌｃＡＭ（実施 例３参照）は、ホモニ官能試薬を用いると支持体に対する達成効率が改良され、 一方、遺伝工学的に処理したＣ末端システィン残基は、ヘテロニ官能試薬、例え ばスルホマレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクンニミドエステル（ＭＢＳ ）によって、達成が容易になる。

ＩＣＡＭ類はまた、抗体（例えばＣＩ−２０３＞もしくはそれのフラグメントに 連成させるか、或は適切な蛋白質担体、例えばアルブミンもしくはプロテオグリ カンなどに連成させることによって、多量化され得る。

ＩｃΔＮ１類はまた、免疫グロブリンのフラグメントと融合させてＩＣＡＭイム ノアドヒーノビーを生じさせることによっても多量化され得る。

また、可溶ｔｉｃＡＭ多量体は、反応性を示す残基をｔｌｃＡＭに遺伝工学的に 組み込むことによって創作され得る。例えば、ｔｌｃＡＭのＣ末端領域に、比較 的高い親水性を示す配列を有する遊離システィン残基を６り作することがてきる （これが、溶媒にさらされる傾向は大である）。

これは、二量体をインサイチュ−で創作することを可能にし、また、単量体を精 製した後、直接か或は適切なリンカ−を用いてジスルフィド結合を生じさせるこ とにより、二量体をインヒドロで創作することも可能である。

もう１つの方法では、同様な位置にリジン残基を位置させ後、ホモニ官能Ｎ１（ Ｓ−エステルを用い、その精製した蛋白質をインビトロで架橋させる必要がある 。上記リジン残基の例は、残基３３８．３６０．３８７である。図１参照。

システイン残基同士の架橋は、遊離システィン基を有するｔｌｃＡＭと、ビス− マレイミドヘキサン（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　）または他の ビス−マレイミド−同族体とを反応させることによって達成され得る。担体分子 上のアミノ基に対するｔｌｃＡＭ上の遊離システィン残基の架橋は、ｍ−マレイ ミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルを用いた反応によって達 成され得る。

ｔｌｃＡＭ分子上のアミノ基の架橋は、ホモニ官能Ｎ−ヒドロキシスクンニミド エステル（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、のカタログ参照） を用いて達成され得る。また、ｔｌｃＡＭ上の炭水化物基を酸化してアルデヒド を生じさせた後、担体分子上のヒドラジンに対して活性を有するアミノ基と連成 させることができる。

ウィルス感染に関する３つの異なる定量方法を用いた。これらの異なる定量法は 、トランスメンプランＩＣＡＭおよび非トランスメンプラン溶解度の相違を考廖 したものである。

Ａ　界面活性剤存在下でのプラーク減少定量法この定量法の結果は、細胞を死滅 させる効果が存続しているウィルスの最大希釈度を示すものである。０１％のト リトンＴＸ１．ＯＯ存在下トランスメンプランＩＣＡＭ蛋白質と一緒にウィルス を予備培養し、こわを順次、培地中に希釈し、１０′１個細胞／ｍＬのヒーラ− 細胞と一緒に３０分間インキュベートし、１０倍に希釈した後、種々の希釈度の ウィルスの入っている９６個のウェルを有するミクロタイタープレートの複数の ウェル中にプレートアウトさせる。

正の対照としてＯ】％のトリトンｘｉｏｏを用いた。５日後、感染しているウェ ルと感染していないウェルを、細胞変性効果（ＣＩＴＥ）の存在により評価し、 そしてこのタイターを、元のウィルス１ミリリンドル当たりのプラーク形成単位 （ＰＦＵ／ｍＬ）として表す。この定量法は［１，Ｓ、Ｓ、８．０７／２３９． ５７１に記述されており、ｔｍＩｃＡＭ−１の抗ウィルス活性を示すために用い られる（これには、溶液中に保持させるため界面活性剤の存在が必要とされた） 。使用したＩＣＡＭ蛋白質の初期濃度は、最初、該予備インキコベ−１・混合物 中の濃度であるが、しかしながら、このＩＣＡＭ蛋白質は、この感染を通して一 定に存在しているのではなく、ここでは、該蛋白質を順次希釈する。このｔｍｌ ｃＡＭを可溶化させるには界面活性剤の存在が必要であるが、この界面活性剤が 存在すると細胞を死滅させ、従って、このｔｍｌｃＡＭ−１，／界面活性剤を順 次的に希釈し、て細胞の感染を生じさせる必要がある。

Ｂ　界面活性剤なしのプラーク減少定量法このプラーク減少定量法、即ちより古 典的な定量法では、上述したように、ヒーラ−細胞を、順次希釈したライフウィ ルスに感染させるが、界面活性剤はγｒ在していなく、従って、この定量法はｔ ｍｌｃＡＭの分析には使用できない。この定量法において、該ｔＴｃＡＭは、指 示された濃度で一定して該培地中に存在している。この系ではｔｍｌＣＡＭ−１ （これは界面活性剤の存在を必要とする）は定量てきない、何故ならば、必要と される界面活性剤を添加するとヒーラ−細胞を死滅させるからである。

この定量法は、Ｍａｒｌｉｎ、池（Ｎａｔｕｒｅ　１．９９０）が利用した方法 （ここでは、ＩＣＡＭ蛋白質の有り無しで、１．００ＰＦＵのウィルスにヒーラ −細胞の培養物を感染させた後、細胞変性効果（ＣＰ　Ｅ）が現れるまで約４日 間培養する）に類似している。その後、この培養物をＣＰＥに関して可視的に評 価する。この分析条件は、上記Ｍａｒｌ　ｉｎと同様であった。評価は、クリス タルバイオレットを用いた染色操作ではなく可視的に行った。

この定量法では、界面活性剤が全く存在していなく、該ＩＣＡＭが一定して存在 しており、そしてこの分析法は、時間の任意点で、ウィルス複製／増殖の減少の 程度を測定するものである。

ウィルス感染に関するこれらの３つの異なる定量法から得られたデータを表４に 要約する。

点−１ １Ｃ５０％（μＭ）＊ ｔ　ｍ　Ｉ　ＣＡＭ−１０，０３ＮＤ ｔ、　Ｉ　ＣＡＭ　Ｃ４５３）　＞２０　０．２　０．２ｔ　ＩＣＡＭ　（１８ ５）　＞２０　８　ＮＤ＊　ＩＣ５０％は、Ｉ−（ＲＶ　３感染を５０％抑制ｔ 　ルＩ：必ＷすＩ　ＣＡ　Ｍ蛋白質の濃度として定義される。

これらのデータは、異なる定量系で比較したときてさえ、ウィルス感染の減少に おいて、該切形ＩＣＡＭ蛋白質よりもｔｍｌｃＡＭ−１の方が有意に高い活性を 示すことを示している。定量法（Ａ）と定量法（Ｂ）におけるｔ　ＩＣＡＭ　（ ４５３）（７）中和活性の差は、ｔ　ＩＣＡＭ　（４５３）が仲介する中和では 該培地中にｔ　ＩＣＡＭ　（４５３）が一定して存在していることが必要であり 、そしてこれは可逆的であることを示している。

この中和が可逆的であることは、定量法（Ａ）で観察される有意な中和の不足に よって示されている。反対に、定量法（Ａ）において、ｔｍｌＣＡＭ−１１７） 中和活性１；ｉｔ　ＩＣＡＭ　（４５３）およびｔｌｃＡＭ（１８５）よりも〉 ６６７倍高く、そして界面活性剤の存在なしで該培地中にｔｍｌｃＡＭ−１を一 定して存在させることが可能である場合、定量法（Ｂ）ではより高くなる可能性 がある。

これらの結果をＭａｒｌｉｎ、他の結果と比較する目的で、彼らの分析条件を再 現する試みを行った。表４に示すように、定量法（Ｂ）と定量法（Ｃ）との結果 の間に良好な相関関係が存在しているが、ｔｌｃＡＭ（４５３）に関するＩＣ５ ０％はＭａｒＨｎ他で見られるそれよりも１０倍高い。これが使用したライノウ ィルスの抗原型による相違のためであるか否かを調べるため、ＨＲＶ１４および １ＩＲＶ５４　（Ｍａｒｌｉｎ池が用いた抗原型）を用いてこの定量法を繰り返 した。これらの抗原型の両方に関するＩＣ５０％は０２μＭのｔ　ＩＣＡＭ　（ ４５３）であり、このことは、ＨＲＶｉ４、）ＩＲＶ５４、および１１　ＲＶ　 ３の間には抗原型の感受性に関する相違がないことを示している。

この矛盾を解決する試みのため、Ｍａｒｌｉｎ他が用いたのと同様の緩衝液を使 用して、それが定量法（Ｃ）のライノウィルス感染に影響を与えるか否かを確認 した。Ｍａｒｌｉｎ他は、５０ｍＭトリエタノールアミン（ＴＥＡ）／２０ｍＭ トリス含有緩衝液中で彼らのｓｌＣＡＭ−１蛋白質を製造した。この緩衝液単独 をＨＲＶ３およびＨＲＶ１４の対照感染物（１／１０倍の容積、最終濃度５ｍＭ 　ＴＥＡ／２ｍＭ　）リス）に加えると、実際にＣＰＥの完全な抑制が観察され た。従って、いずれかの形態の■　・ＣＡＭの存在とは関係なく、ウィルス複製 に対して緩衝液が影響を与えている可能性がある。

しかしながら、幅広い種類のＨＲＶ抗原型を用いた次のアッセイにおいて、ＨＲ Ｖ５４に関するＩＣ５０％は実際能のＨＲＶ抗原型、例えばＨＲＶ３よりも有意 に低いことが示されている。

ＩＣＡＭ−１が示す正規な機能は、白血球インテグリンＬＦＡ−１のりガントと して働くことてあり、これらの２つの分子間の相互作用が、白血球と種々の他の 細胞との間の接着をもたらす。細胞上のＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−１の間の接 着を抑制するｔｌＣＡＭ類の能力を下記のように試験した。実施例７Ｃに記述し たように、ＩＣＡＭ−１をミクロタイタープレートに吸着させた。ＬＦＡ−１を 発現するＪＹ細胞が、ＩＣＡＭ発現細胞、或はＩＣＡＭ−１をコートした培養皿 （Ｓｔａｕｎｔｏｎ、他、ＪＣＢ）に接着する。１０ａＣｉ／ｍＬ　［”Ｓ］　 −システィンを用い１８時間かけて標識したＪＹ細胞［ＢＳＡを１ｍｇ／ｍＬ含 んでいる１０ｍＭのＨＥＰＥＳ　（ｐＨ７，５）／１５０ｍＭのＮａＣｌ／１ｍ ＭのＣａＣｌ２／１ｍＭのＭｇＣｌ、の１ｍＬ当たり１０７個の細胞１を、３７ ℃で３０分間、ｔ　ＩＣＡＭ　（４５３）またはｔ　ＩＣＡＭ　（１８５）の有 り無しで予備インキュベートした後、該ＩＣＡＭ−１をコートしたプレートに加 え、そして３７℃で６０分間インキュベートした。次に、このミクロタイタープ レートを培地で３回洗浄した後、これらのプレートに結合した細胞の数を、ンン チレーション計数で定量した。

表５に示すように、ｔ　ＩｃＡＭ　（４５３）およびｔ　ＩＣＡＭ　（１８５） の両方共、５から２０μＭの同じ濃度で、ＪＹ細胞の結合を抑制した。

表５ ＪＹ細胞の結合（％） ＴＣＡ〜１−１（ＩＩ〜１）　ｔ　ＩＣＡＭ（４５３）　ｔ　ＩＣＡＭ（１８５ ）２０　Ｌ　００ ０、６　８３　７２ ０．０２　８６　８０ ０、００６　８９　９７ ＊ＴＣＡＭ−１をコートしたミクロタイタープレートへの結合：１１０ｌ１／ｍ Ｌの抗ＬＦＡ−１または抗ＩＣＡＭ−Ｉ　ＭＡｂは、〈１％に結合を抑制した。

実施例１２ ｔ　Ｉ　ＣＡＭ／Ｉ　ｇＧイムノアトヒビーンの構築ＩＣＡＭ−１の最初の２つ のドメイン（残基１−１８５）をヒト免疫グロブリン型Ｍ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａのセ クメントに連結させるｃＤＮＡ融合により、ＩＣＡＭ−１の可溶誘導体を構築し た。このアプローチは、以前にＣＤ４分子に関して記述されており［Ｚｅｔｔｌ ｍｅｉｓｓｌ、　Ｇ、、Ｊ−Ｐ　Ｇｒｅｇｅｒｓｅｎ、　Ｊよび特徴付け・免疫 グロブリン融合蛋白質Ｊ　ＤＮＡ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　（１９ ９０）　９（５）：３４７−３５３＋　Ｃａｐｏｎ、　ＤＪ、、Ｓ、Ｍ、　Ｃｈ ａｍｏｗ、　Ｊ、　Ｍｏｒｄｅｎｔｉ、Ｓ、Ａ、　Ｍａｒｓｔｅｒｓ、　Ｔ、　 Ｇｒｅｇｏｒｙ、　Ｈ，Ｍｉｔｓｕｙａ、　Ｒ＾、　ＢｒｙｎＳＣ，Ｌｕｃａｓ ＳＦ、Ｍ、　Ｗｕｒｍ、Ｊ、Ｅ、　Ｇｒｏｏｐｍａｎ、　Ｓ、　Ｂｒｏｄｅｒお よびり、Ｈ，Ｓｍ１ｔｈ著「エイズ治療のためのＣＤ４イムノアドヒーソン類の 設計Ｊ　、Ｎａｔｕｒｅ　（１９８９）　３３７：５２５−５３１：　Ｔｒａｕ ｎｅｃｋｅｒ、＾、Ｊ、　５ｃｈｎｅｉｄｅｒ、　Ｈ，Ｋｉｅｆｅｒおよびに、 　Ｋａｒｊａｌａｉｎｅｎ著［組換え型ＣＤ４−免疫グロブリン分子を用いた旧 Ｖの高効率中和Ｊ　、Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）　３３９：６８−７０参］　、 それによって、シスルフィド連結した二量体の発現が生じる。

このｃＤＮＡ融合は、２段階のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方策で達成され た［例えば、Ｈｏｒｔｏｎ、　Ｒ，Ｍ、、　Ｚ、　Ｃａｉ、　Ｓ、Ｎ、　ｌｌｏ およびり、Ｒ，Ｐｅａｓｅ著罰−バラツブ伸長による遺伝子スプライシング　ポ リメラーゼ連鎖反応を用いた、注文に合わせた遺伝子Ｊ　、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉ ｑｕｅｓ　（１９９０）　８（５）：５２８−５３５ｉｉｍ、］　、　コノ第一 段階ハ、ＩＣＡＭ−１の残基１−１８５７ラグメント、並びにヒンノ領域内の残 基２１６がら開始してこの分子のＣ末端で終結する■ｇＧ重鎖フラグメントの、 遺伝情報を指定する個々の増幅を伴うものであった（図３参照）。このＩＣＡＭ −１フラグメントの３゛末端で用いたＰＣＲプライマーは、ＩｇＧフラグメント の最初の２４塩基に相補的な追加的２４塩基を含んでぃた：ＣＧＧ　ＴＧＧ　Ｇ ＣＡ　ＴＧＴ　ＧＴＧ　ＡＧＴ　ＴｒＴ　ＧＴＣＡＪｉＡ　ＧＧＴ　ＣＴＧこの ５’　ＩＣＡＬ＝１−１プライマー（５゛　非コーディングおよびシグナル配列 ）は下記の配列を有していた Ｈｉｎｄエエエ ＧＧＡ　Ａ’ＩＴ　ＣＡＡ　ＧＣＴ　ＴＣＴ　ＣＡＧ　ＣＣＴ　Ｃ（、ＣＴＡＴ 　ＧＧＣＴＣＣＣＡＧ　ＣＡＧ　ＣＣＣＣＣＧＧＣＣに の５”１ｇＧプライマーは、下記の配列・ＧＡＣＡＡＡ　ＡＣＴ　ＣＡＣＡＣＡ 　ＴＧＣＣＣＡ　ｃｃｃ；を有しており、このＩｇＧコーディング配列の末端か らの３°プライマーは、 Ｘｂａ工 Ｇ　ＧＧＡ　ＴＴＣＴＣＴ　ＡＧＡ　ＴＣＡ　ＴＴｒ　ＡＣＣＣＧＧ　ＡＧＡ　 ＣＡＧ　ＧＧＡ　ＧＡＧ　ＧＣＴてあった。クローン化したＩＣＡＭ−１もしく はＩｇＧ１重鎖ｃ　ＤＮＡを１０ｎｇ用い、９４°Ｃて１分間、５５°Ｃで２分 間、および７２°Ｃで１５分間の伸長を用いた１０サイクルで増幅を行った。こ の得られる増幅させたフラグメントを杓等モル量で混合して、第二段階のＰＣＲ 反応のための鋳型として用いた。この反応では、上に示した５°　ＩＣＡＭプラ イマーおよび３°　ＩｇＧプライマーを用いた。この第一段階と同じ条件下の２ ５サイクルで増幅を行うことにより、約１２００ｂｐの主要帯が生じ、これは所 望産物に一致していた（図３参照）。このフラグメントをＨｉｎｄｌｌ＋および Ｘ　Ｉｌｌ　ａ　Ｉで消化させ（開園部位がそれぞれ５゛および３“　プライマ ーにｉ■み込まれる）、精製した後、ｌ１ｉｎｄｌｌ＋／′Ｘｂａｌ開裂ＣＤ八 ・１８ヘクターに結合させる。

所望の挿入断片を含んでいるクローンを、制限分析で同定した後、ｐＩＩＲＲ７ ２およびｐＨＲＲ７３と表示する２種のクローンを配列決定分析で選択した。Ｉ ＣＡＭ−１とＩｇＧヒンンとの間の連結領域の配列決定を行うことにより、これ らの両方のクローンが正確な構造を有していることが確かめられた。これらのプ ラスミドをｃｏｓ細胞に移入させ、そしてこれらを、実施例６と同様に４８時間 の後トランスフェクションで一晩［”Ｓ］システィンの標識を付けた。これらの 上澄み液を、抗ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体ｃ７８．４Ａで免疫沈澱させた 後、実施例６と同様にＳＤＳゲルゲル泳動法で分析を行つた。還元条件下で、見 掛は分子量が６８ｋＤの帯が特異的に免疫沈澱を生じ、これはＩＣＡＭ−１／Ｔ ｇＧ融合に相当している。クローンｐ　ＨＲＲ７２の発現はｐＨＲ，Ｒ７３より も常に高く、その結果としてこのクローンを選択してさらなる研究を行った。

実施例３の方法に従って、ＣＯ８細胞にｐ　ＨＲＲ７２を移入し、そしてトラン スフエクソヨン後４８時間で、この培地を、［３５３］システインが入っている 無血清培地で置換した後、上と同様にしてこれらの細胞の標識付けを一晩行った 。これらの上澄み液を蛋白質Ａ−セファロースピードと一緒に培養し、そして結 合した蛋白質を０．１Ｍの酢酸で溶離させ、中和した後、還元条件および非還元 条件下のゲル電気泳動で分析を行った。機能的抗体の重鎮および軽鎖を発現する プラスミドを共移入した対照も試験した。この実験では、ｐＨＲＲ７２が産生す る蛋白質は蛋白質Ａに結合し得ることが示され、このことは、このｐ　ＨＲＲ７ ２蛋白質はＩｇＧ定常部を含んでいることを示していると共に、還元条件下で見 られる６８ｋＤ帯は、非還元条件下で、高分子量の二量体形態にシフトすること を示している。従って、二量体１ｇＧのみが蛋白質Ａと結合し、そして非還元条 件下の可動度はその単量体の少なくとも２倍であることから、このｔ　ＩＣＡＭ 　（１，８５）／Ｉ　ｇＧイムノアドヒビーンは二量体であると結論付けた。実 施例６と同様なＯ７８，４Ａを用いた特異的免疫沈澱、並びに実施例４と同様な ラジオイムノアッセイ（ＲＩ　Ａ）における２つのＩＣＡＭ−］特特異的体を用 いた融合蛋白質の定量検定により、このＩＣＡＭ−１領域の正確な折り畳みが示 された。

実施例４の燐酸カルシウム方法を用いて、１）ＨＲＲ７２をｐＳＶ２−Ｄ　ＨＦ 　Ｒと一緒に０１１０細胞の中に共移入した後、ヌクレオシドが入っていない培 地の中でＤ　ＨＦ　Ｒ＋細胞の選択を行った。個々のコロニーを取り上げ、拡張 させた後、ＲＩＡを用いて発現に関する試験を行った。

最も高い発現を示すコロニーを３つ選択して、さらなる研究で用い、制限希釈で 再クローン化を行った。蛋白質Ａ結合による標識細胞上澄み液の分析およびゲル 電気泳動法により、１．ＩＣＡＭ　（１８５）／ＩｇＧ二量体の発現が確認され た。

同様な様式で、ＩＣＡＭ−１のドメイン１−■（残基１．−４５３）を、ヒト免 疫クロプリンの重鎮ｃＤＮＡのセグメントに連結させた。ＩＣＡＮｌ−１の残基 １−４５３の遺伝情報を指定するフラグメント、並びにヒンジ領域内の残基２１ ６から開始してこの分子のＣ末端て終結するＩｇＧ重鎖の遺伝情報を指定するフ ラグメンＩ・を各々個別に増幅させた。このＩＣＡＭ−１フラグメントの３°末 端て用いたＰＣＲプライマーは、ＩｇＧフラクメントの最初の２４塩基に相補的 な追加的２４塩基を含んでいた ＣＧＧ　ＴＧＧ　ＧＣＡ　ＴＧＴ　ＧＴＧ　ＡＧＴ　ＴＩＴ　ＧＴＣＣＴＣＡＴ Ａ　ＣＣＧ　ＧＧＧ　ＧＧＡＧＡＧ　ＣＡ、ＣＡＴＴ。

この５°　ＩＣＡＭ−］プライマー、５’１ｇＧプライマー、並びに１ｇＧコー ディ／グ配列末端からの３゛　プライマーは、」二のｔｌｃｉ、ｉ（１８５）１ ｇＧ融合と同じてあった。ＰＣＲ増幅を行った後、ＬＩＣＡＭ（４５３）／Ｉｇ Ｇ融合に一致している約２０００ｂｐの帯が生じた。

所望の挿入断片を含んでいるクローンを制限分析で同定し、モしてｐＨＲＲ９５ −９と表示するクローンを選択して配列決定分析を行った。

このｃＤＮＡ配列は下記の通りである。

ｃｘｍ　’ｒｃｒｃｃｃｃｃ’ｘ℃λυμΩココロ℃ＣＴＧＣＣＣＣＧＧＧ　Ｇ ＡＧＧＩコ℃απ１３５Ｌαズか人気−ａ ｇ　ａｃａａａａｃｔｅａ　ｃａｃ：ａｔｇｃｅｅａ　ｃｃｇｔｇｃｃｃａｇ　 ｃａｃｅｔｇａａｃｔ（ここで大文字は、ＩＣＡＭ−１のアミノ酸残基１−４５ ３の遺伝情報を指定するヌクレオチド類を示しており、そして小文字は、ヒト重 鎖■ｇＧ１のアミノ酸残基２１６−４４２の遺伝情報を指定するヌクレオチド類 を示している。） 成熟した融合ポリペプチドの相当するアミノ酸配列は下記の通りである。

これらのプラスミドをＣＯ８細胞に移入させ、そして実施例６と同様に４８時間 の後トランスフェクションで一晩［３ＳＳ］　ノステインの標識をｆ寸けた。こ の融合ポリペプチドを、蛋白質Ａと結合する可溶分泌ジスルフィド連結二量体と して発現させる。これらの上澄み液を、抗ＩＣＡＭｌモノクローナル抗体ｃ７８ ，４Ａで免疫沈澱させた後、実施例６と同様にＳＤＳゲル電気電気泳動性析を行 った。還元条件下で、見掛は分子量が１．００　ｋ　Ｄの帯が特異的に免疫沈澱 を生じ、これはＩＣＡＭ−１、／ＩｇＧ融合に相当している一方、非還元条件下 において、これは２００ｋＤ二量体として泳動する。

実施例１３ ｔｌＣＡ〜１／ＩｇＧイムノアドヒーノン類によるライノウィルス結合および中 和 実施例１２のｔ　ＩＣＡＭ　（１８５）／ＩｇＧイムノアドヒーシビー、ＩｇＧ １重鎖のヒンジ領域の中に残基２１６と融合しているＩＣＡＭ−。

１の残基１−１８５を含んでいる。この分子は、ライノウィルス結合部位を２つ 含んでいるジスルフィド連結した二量体である。イムノアドビーシンを分泌する ＣＨＯ細胞系ＣＨＯ７２，２を、［３５Ｓｌ　システィンが入っている血清なし 媒体内で一晩増殖させた後、この融合蛋白質を蛋白質Ａビード上で精製した。こ の標識した蛋白質を、実施例７（Ａ）に記述したのと同様なペレット化アッセイ でライノウィルス結合に関して試験した。これらのサンプルは、ｔ　ＩＣＡＭ　 （１８５）／Ｉ　ｇＧ　（ウィルスなし）　、ｔ　ＩＣＡＭ　（１８５）／Ｉｇ Ｇ＋ＨＲＶ３、ｉＣＡＭ（１８５）／ＩｇＧ＋ＨＲＶ３＋ｃ７８．４Ａおよびｔ ｌｃＡＭ（１８５）／Ｉ　ｇＧ＋ＨＲＶ３＋無関係な抗体から成っていた。ＳＤ Ｓゲルを用いた分析により、ウィルス結合の指示となる標識蛋白質のペレット化 が、ウィルスおよびウィルス＋無関係な抗体を用いた時見られた。ウィルスが存 在していない場合全くペレット化が見られず、モしてＯ７８゜４Ａを含んでいる サンプルで見られるペレット化は有意に低下していた。

この結果は、このｔ　ＩＣＡＭ　（１８５）／Ｉ　ｇＧはその可溶単量体ｔｌＣ ＡＭ（１８５）およびｔｒＣＡＭ（４５３）［これらは、このような条件下で容 易に検出され得る稈のレベルの結合を示さない］よりも有意に高い親和力でライ ノウィルスと結合することを示している。実施例７（Ａ）参照。これらの条件下 でｔｍｌｃＡＭ−１の約１０％がペレット化する一方、ｔ　ＩＣＡＭ　（４５３ ）は１％のみがペレット化し、これは恐らくは、ｔｍｌｃＡＭ−１が二量体状態 にあることによるものであろう。ｉ　ＩＣＡＭ　（１，８５）／ｌ　ｇＧを用い た時の結果は、ｔｍｌｃＡＭ−１を用いた時のこのアッセイで見られるそれと類 似しており、このことは、これらの２つの形態のｒｃＡＭは、そのウィルスに対 して同様な親和力を示し得ることを示唆していると共に、ｔｍｌｃＡＭ−１が二 量体であることのさらなる証拠を与えている。

未精製のｔ　ＴＣＡＭ　（１８５）／ＩｇＧを含んでいるＣＨＯ７２，２細抱か ら得られる細胞上澄み液を、実施例１０（Ｂ）の方法に従うウィルス感染アッセ イで、ライノウィルス中和に関して試験した。ＩｇＧの上澄み液か、或は未移入 Ｃ［１０細胞由来の対照上澄み液を５０％含んでいる培地の中で、連続したｌ（ ＲＶ　３希釈を行った。これらのウィルス希釈液をヒーラ−細胞と混合した後、 ９６個ウェルのミクロタイタープレートのウェルの中に入れた（１希釈当たり１ ０個のウェル）。各々の希釈において６日後、感染したウェルの数を計算するこ とによって、ウィルスタイターを測定した。加つるに、感染させて２日後、高ウ ィルス入力における細胞変性効果の定量的評価を行った。ＲＩＡで見積もられた 実験Ａのｔ　ＩＣＡＭ　（１８５）／ＩｇＧ濃度は１．５０％ｇ／ｍｌ、であり 、実験（Ｂ）の濃度は３２５ｅｇ／ｍＬであった。

表６ 実験Ａ　実験Ｂ ＨＲＶ　３　１ｘ１．Ｏ’ＰＦＵ／ｍＬ　４ｘｌＯ’ＰＦＵ／ｍＬＨＲＶ　３　 ＋ ｔｌｃＡＭ（１８５）／ＩｇＧ　６ｘ１．０５ＰＦＵ／ｍＬ　５ｘｌＯ３ＰＦＵ ／ｍＬ両方の実験において、実験Ａでは約１ｎＭの濃度および実験Ｂでは２ｅＭ の濃度で、ウィルスタイターの１０倍低下が生じた。比較として、同じアッセイ におＩジる単量体ｔ　ＩＣＡＭ　（４５３）は、０．３８＊Ｍもしくは３０μｇ ／ｍＬで、５０％のタイター低下を生じる。従って、ライノウィルス結合部位の 二量体で生じる活性の増大は、少なくとも２００倍および恐らくはそれ以上であ る。

６５０％ｇ／ｍＬ　（４ｅＭ）濃度におけるＣＨＯ７２，２由来細胞上澄み液を また、ＩＣＡＭ−１をコートしたプラスチック製ミクロタイターウェルに対する ［３５Ｓ］　ＨＲＶ３の結合を測定する競合結合アッセイで試験した。ウェルの 中でＩＣＡＭ−１とＭａ、ｂ　ｃ７８．４八とを一緒に前培養した場合とそうて ない場合との結合数を比較することによって、特異的結合を測定する。

表７ 結合ｃｐｍ＊　結合％ ＨＲ，Ｖ３　４９４５＋／−５８１００）（ＲＶ３＋ＣＨＯＪ二澄み液　５３５ ８＋／−５１１０８１（ＲＶ３＋ＣＨＯ７２，２上澄み液　３１８７＋／−２０ ６６４＊　３つのウェルから測定した平均値。標準誤差は平均値の１０％未満で あった。

ｔ　ＩＣＡＭ　（１８５）／ＩｇＧ存在下の結合レベルは、通常の対照結合の６ ５％、およびＣＨＯ細胞上澄み液存在下の対照結合の５４％であり、このこへは 、結合が５０％近く抑制されたことを示している。比較として、可溶単量体ｔ　 ＩＣＡＭ　（４５３）が同じアッセイでＨＲＶ　３結合を５０％抑制するのは２ ４０ＩＩｇ／ｍＬもしくは３．１ｅＭである。従って、モルを基準にすると、こ のＩＣＡＭ−１，１ｇＧイムノアドヒービーはその単量体よりもほとんど１００ ０倍良好な競合相手であった。上澄み液を用いて上記実験を行った。高度に精製 したｔ　ＩＣＡＭ　（１８５）／ＩｇＧを用いてこれらの結果を再現しようとす る次の試みは不成功であった。

実施例１２のｔ　ＴＣＡＭ　（４５３）／ＩｇＧイムノアドヒーンビー、ＴｇＧ １重鎖のヒンジ領域内で残基２１６に融合しているＩＣＡＭ−１の残基１−４５ ３を含んでいる。この分子はライノウィルス結合部位を２つ含んでいるジスルフ ィド連結した二量体である。ワクシニア／Ｔ７系を用い、この融合ポリペプチド をヒーラ−細胞内で発現させた後、抗−Ｉ　ＣＡＭ−１モノクローナル抗体が用 いられているアフィニティークロマトグラフィーより、その上澄み液からそれの 精製を行った。この蛋白質の活性を競合結合アッセイで試験したが、このアッセ イは、精製したｔｍｌｃＡＭ−１をコートしたプレートに［＋１５Ｓ］標識ＩＩ ＲＶが結合　・するのを測定するものである。比較としての平行アッセイで、可 溶単量体ｔＴｃＡＭ−４５３を正の対照として含めた。これらの結合値を以下の 表８に示す。

表８ ＩＣ，。＊ ｔ　ＩＣＡＭ（４５３）　４４％Ｍ ｔ、　（４５３）　／１．ｇＧ 実験１．　１１％Ｍ 実験２　１０％Ｍ ＊　ＩＣ５ｅは、結合を５０％抑制するに必要とされる濃度である。

これらの値は、ＲＩＡで測定したｔ　ＩＣＡＭ　（４５３）１モル当たりの値で ある。各融合ポリペプチドは２個のｔ　ＩＣＡＭ　（４５３）ポリペプチドを含 んでいることから、二量体１モル当たりで表される融合ポリペプチドに関する値 はそれぞれ実験１および２に関して５．５ｅＭと５ｅＭである。従って、モルを 基準にすると、この競合結合アッセイにおいてこの融合ポリペプチドが示す活性 はそのｔ　ＩＣＡＭ　（４５３）単量体よりも１０倍高い。次の実験において、 この相対的活性は２がら４倍細胞表面では、ｔｍｌｃＡＭ−１が非共有結合二量 体として存在していることを、いくつかの系の証拠が示している：即ち（１）細 胞表面におけるＨＲＶ／ＩＣＡＭ−］結合部位の化学量論は約２であること：（ ｉｉ）ｔ　ＩＣＡＭ　（４５３）は適当に折り畳まれているにも拘らず、それの ＨＲＶに対する親和力は精製ＬｍＴＣＡＭ−１よりも約１００倍低いこと；そし て（ｉ爾）高密度でニトロセルロースフィルターに吸着させたｔ　ＩＣＡＭ　（ ４５３）およびｔｍｌｃＡＭ−１は相当するレベルでライノウィルスと結合する こと。実施例７参照。加つるに、５ｔａｕｎｔｏｎ他（Ｃｅｌｌ　６１：２４３ −２５４　（１９９０）　）は、ＩＣＡＭＩのいくつかの変異体は細胞表面で共 有結合二量体を生じることを報告しており、このことは、この蛋白質はインビボ で自己会合する能力を有することを示唆している。

水溶性カルボジイミド／Ｎ１−１３（これは、第一級アミンとカルボキシル基と の間の共有結合を生じるヘテロニ官能架橋剤である）を用いた化学架橋による、 二量体の存在を直接的に示す試みは、ｔ　ＩＣＡＭ　（４５３）が架橋して１８ ０ｋＤ種を生じると言った結果がもたらされ、この大きさは二量体に一致してい る（図４Ａ）。この架橋は、ｔ　ＩＣＡＭ　（４５３）の濃度に直接依存してお り、７ａＭの蛋白質の時５０％の架橋が生じた（図４Ｂ）。この濃度は、ヒーラ −細胞の表面における比較的高いｔｍｌｃＡＭ−１濃度に一致しており、これは 約２．５ａＭもしくは１３５＋＋ｇ／ｍＬである。この架橋で検出される自己会 合は特異的である、と言うのは、これは、第三団体の蛋白質が高濃度であること の影響を受けないからである（図４Ｃ）。同じ条件におけるｔ　ＩＣＡＭ　（１ ８５）の架橋は明らかに劣っており、このことは、ドメイン３から５が自己会合 に関与していることを示している。この架橋操作を用いた蛋白質の修飾は激しす ぎることから、この蛋白質は全（ウィルス結合活性を有していなかった。しかし ながら、このデータは、可溶ＩＣＡＭは溶液中で自己会合し得ることを示してい ると共に、この自己会合は濃度に依存しておりそして濃度に特異的であることを 示している。

高親和カライノウィルス結合でｔｍｌｃＡＭ−１のトランスメンプランおよび細 胞質ドメインが果す役割を試験する目的で、我々は、燐脂質テールで細胞表面に 固定されておりそして上記ドメインが欠如しているキメラｌＣＡＭ−１を構築し た（図５参照）。この実験は、ライノウィルスの高親和力結合をもたらすところ の、細胞表面における二量体ＩＣＡＭ−１の生成にとって、その細胞質およびト ランスメンブランドメインが必要であるか否かを試験する目的で設計したもので あった。燐脂質で固定された形態を発現させるようにＩＣＡＭ−１のｃＤＮＡを 修飾する目的で、我々は最初に、部位特異的変異誘発を用いて、細胞外領域の末 端に近い残基４５０／４５１の所にユニークな５ａｃｌｌ部位を作り出した。こ れにより、Ｈｉｎｄｌｌｌおよび５ａｃｌｌによる修飾プラスミドの消化を用い た、ＩＣＡＭ−１の残基１−４５１の遺伝情報を指定するｃＤＮＡフラグメント の単離が可能になる。我々はＰＣＲを用いて、燐脂質に固定された形態のＬＦＡ −３が有するＣ末端２８アミノ酸の遺伝情報を指定するフラグメントを生じさせ た（Ｓｅｅｄ、　Ｂ、、Ｎａｔｕｒｅ　（１９８７）　３２９：８４０−８４２ ）　。５°プライマーの中に５ａｃｌｌ部位を含めることにより、このフラグメ ントをＩＣＡＭ−１の細胞外ドメインに連結させた後、発現ベクターＣＤＭ８に クローン化する結果として、プラスミドｐＨＲＲ７０−１９が得られた。このプ ラスミドは、ＬＦＡ−１の残基２１０−２．３７に融合しているＩＣＡＭ−１の 残基１−４５１の遺伝情報を指定するｃＤＮＡを含んでおり、これは、ＩＣＡＭ −１細胞外領域を含んでいる燐脂質固定分子の発現をもたらすべきである。図５ 参照。

実施例４の方法に従うｐＨＲＲ７０−１９を用いたＣＯ８細胞のトランスフェク ションおよび抗−ＩＣＡＭ−１抗体を用いたＦＡＣ８分析により、この融合蛋白 質の細胞表面発現が確認された。この融合蛋白質を移入したＣＯ８細胞に対する ［３３３　］標識細胞の結合を測定した。

表９ ＩＣＡＭ−１結合Ｃｐｍ　ウィルス人力％　制御％ｔ　ｍ　Ｉ　ＣＡＭ−１２１ ３０＋／−２７８９，４１００１ｃＡＭ（１００１ｃＡ／２３８２＋／−２９３ １１，２１１９ＬＦＡ−３（２１０−２３７） □　キメラ この結果は、ｔｍｌｃＡＭ−１とｔ　ＩＣＡＭ　（１−４５１）／ＬＦＡ−３（ ２１０−２３７）キメラがＨＲＶに結合する能力の間には有意な差が存在してい ないことを示している。従って、これらのトランスメンブランおよび細胞質ドメ インはＨＲＶ結合に必要とされず、モして二量化は、この分子の細胞外領域間の 相互作用に依存しているにちがいないと結論付けられ得る。

ヒーラ−２２９細胞の中にｔ　ＩＣＡＭ　（１−４５１）／ＬＦＡ−３（２１０ −２３７）キメラ遺伝子を移入することによって、この細胞質およびトランスメ ンブランドメインが欠乏している形態のＩ　ＣＡＭ−１がライノウィルスのため のレセプタとして有効に機能することの追加的証拠が得られた。我々は、これら の細胞はその表面上でＩＣＡＭ−１を発現させず、ＨＲＶ感染に耐性を示すこと を測定した。ｔｍｌＣＡＭ−１またはｔ　ｌＣＡＭ　（１−４５１）／ＬＦＡ− ３（２１０−２３７）キメラのトランスフェクションを行うことにより、ライノ ウィルスに容易に感染しそして通常のヒーラ−細胞に匹敵するレベルでウィルス を産生ずる細胞が生じる。

我々は、ｔ　ＩＣＡＭ　（４５３）は、ＨＲＶが細胞に結合するのを遮断するこ とに加えて、不可逆的にＨＲＶを不活性化することを示した。Ｉ］ＲＶをｔ　Ｉ 　ＣＡＭ、（４５３）と−緒に３４℃で培養することにより、このウィルスの両 分が未変性の１４８８形態から４２３形態に変化する（図６）。この４２８形態 は感染性を示さず、ウィルスのサブユニットｖＰ４が欠如していると共に、その ＲＮＡゲノムが不足している（空のカプシド）。このことは、［”Ｓ］メチオニ ン標識したウィルス粒子の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析、およびライノウィルス用［３ １ｐｌオリゴヌクレオチドプローブ（５’　−ＧＣＡＴＴＣＡＧＧＧＧＣＣＧＧ ＡＧ−３’　）を用いたハイブリッド形成によるウィルスＲＮＡ含有量の定量化 で示され得る。従って、ｔ　ｊＣＡＭ　（４５３）はライノウィルスの脱外波（ 感染過程の間に細胞内で通常に生じる出来事）を生じさせ得る。この脱外波はゆ っくりとした過程であり、３４℃では６時間のｔ１／２で生じ、それとは対照的 に、結合の抑制はく３０分のｔ１／２で生じる。この脱外波は高度に温度依存性 を示し、３７℃では、ライノウィルス増殖の最適温度である３４℃よりも１０倍 速く生じる。多量体構造のＩ　ＣＡＭ−１を含む可溶形態のＩＣＡＭ−１による 、このような脱外被活性の増強により、中和を不可逆的にすることによる抗ウィ ルス活性の改良がもたらされる。

ＩＣＡＭ−１の多量化の目的でシスティン残基を位置させる正確な部位を同定す るには、自己会合に関与する蛋白質表面領域を同定する必要がある。ドメインＩ ＶおよびＶはウィルス結合部位（ドメイン■）に対して遠位にあり、そしてドメ インＩｔ−Ｖは自己会合に関係していることから（実施例１４参照）、ドメイン ＩＶと■を選択した。ＩＣＡＭ−１の構造は確かでなく、ＩＣＡＭ−１は免疫グ ロブリン超遺伝子科の１員に相同性を示すことから、ＩｃＡＭ−１の細胞外ドメ インのＣ末端にあるドメインＩＶおよびＶの配列を免疫グロブリン折り畳みの上 に並べ与していると思われる部位を同定する目的で、我々は、免疫グロブリン超 遺伝子科のいくつかの１員、即ちＩｇＧおよびＭＨＣＩ／ベーター２ミクログロ ブリンの三次元構造を検査した。免疫グロブリンのドメインは、ここでｒＢ］面 および「Ｆ」面と表示する２つの幅広い面のベータノート構造を有している。上 記構造を検査することにより、このドメインが有するこれらの面の一方もしくは 他方を通して異なる免疫グロブリン様ドメインが相互作用していることが確認さ れた。ＩｇＧの可変領域はそれらのＦ面を通して会合している一方、ＩｇＧの定 常部（ＣＨＩ、ＣＨ２およびＣｊ（３）およびＭＨＣＩ／ベーター２ミクログロ ブリンは全てそれらのＢ面を通して相互作用している。

ＩＣＡＭ−１ドメインは、定常部様ドメインに最も高い相同性を示している。従 って、相互作用が最も生じ易い部位はこれらのドメインのＢ面上にあり、ここで 、このＢ面」二でシスティン残基が最も位置し易い部位は、このＢ面の中心に近 い所（鎖内ジスルフィド結合を生じるＢストランド上のシスティンに隣接してい る）にあり、この場合、ＩｇＧの０１１３ドメインが自己会合し、或はこのＢ面 のＮ末端上にあり、この場合、ＩｇＧのＣｌＩ２ドメインとＭｌ（ＣＩ／ベータ ー２ミクログロブリンが自己会合する。

適当な相互作用部位を同定する目的で数多くの変異体を調製した。標準的な部位 特異的変異誘発法を用いて、ｔ　Ｉ　ＣＡＭ　（４５３）およびｔｍｌｃＡＭ上 の選択した残基をシスティンに変異させることにより、これらの変異体を調製し た。次に、ベクターＣ０ＭＳ内のこれらのｃＤＮＡをＣＯ８細胞の中に移入させ た後、［”Ｓ］ンステインを用いたＩＣＡＭｉの生合成標識付けに続く免疫沈澱 および非還元Ｓ　Ｄ　５−））　Ａ　ＧＩＥ分析により、二量体の生成を評価し た。１３種の変異体を試験した表ＪＯに示すように、その２種が若干（約５％） であるが有意レベルで二量体を生じることが見いだされた。

表１０ システィンの位置　二量体生成 （ｔｍｆｃＡ〜１−１） （ｔ　ｉｃＡＭ　（４５３）） これらの２つのミューティンＣｙｓ−３０７およびＣｙＳ−３０９は、両方共、 ドメインＩＶのＢ面のＮ末端上に位置している。この比較的低レベルの三量化は 、細胞表面上のＩＣＡＭ−１濃度が低いこと（低発現）を反映しているか、或は 相互作用部位に対するシスティン残基の配向が不完全であることを反映している 可能性がある。これらのデータは、このドメインのこの領域が相互作用部位であ り得ることを示唆している４、残基３０７および３０９に隣接している他の残基 、例えばＨｉｓ−３０８、Ａｒｇ−３１，０、Ｇｌｕ−２９４、Ａｒｇ−３２６ 、Ｇｌｎ−３２８などは、この二量体生成の効率を上昇させる可能性がある。次 に、可溶ＩＣＡＭ−に量体を分泌させる目的で、ｔｍｌｃＡＭ−１の二量体生成 をもたらす変異をｔ　ＩＣＡＭ　（４５３）に対して行う。

ＩＣＡＭ−１アミノ酸配列内の位置３０７の所にあるアラニンをシスティンに置 き換えそしてアミノ酸残基４５２の後ろに終止コドンを挿入することによって、 ｔ　ＩＣＡＭ　（４５２）システィン変異体を調製した。

短縮されていないＩＣＡＭｉのｃＤＮＡを用いた部位特異的変異誘発によって」 二記ミューティンを構築し、これは下記のＤＮＡ配列を有している： ＣＡＣ入Ｃ入ＴＣｒＧ、ＴＧＴＣＣＣＣＣＴＣＡＡＡＡＧＴＣ入τｃ　ｃ’ｒｃ ｃｃｃｃｃｃｃ　ＧＡＧＧＣＴＣＣＧ’Ｔ１３５工　Ｃαテロリ−１Ｇ 前記実施例は、ｔｌｃＡＭ−１の結合および中和活性を本質的に増大させる可溶 な多量体形態のｔｌｃＡＭの創作を記述したものである。

本発明を特定の方法および組成で記述してきたが、本発明を考慮するとき、種々 の変化および修飾が本分野の技術者に思い浮かぶものと理解する。

例えば、ウィルスとの結合部位を有しているＩＣＡＭ−ｉから誘導されるより小 さい蛋白質フラグメントおよびペプチド類もまた多量体構造で有効であることが 予測される。多量体ＩＣＡＭはＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１相互作用の有効な抑制 因子であり得ると期待される、何故ならば、これらの２つの分子間の親和力は極 めて低く、そしてこれらの２つの分子によってもたらされる細胞−細胞結合は非 常に協力的であるからである。

好適な形態および構造は二量体構造の非トランスメンプラン（切形）ＩＣＡＭで あるが、これは、ウィルスとの結合に有効でありそしてウィルスの活性の中和に 有効な他の形態および構造を本発明の範囲内に包含させることの排除を意図した ものではない。

更に、通常は膜と結合している不溶レセプタ蛋白質から可溶な蛋白質形態を製造 する本発明の一般的な方法は、「主要群」のレセプタと結合するもの以外のウィ ルスと結合することでそれらの感染を低下させるに有効性を示す、他のレセプタ 蛋白質の可溶多量体形態を製造する目的で用いられ得る。このような池のウィル スには、ポリオ、単純ヘルペスおよびＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウィルスが含ま れる。

上述した説明的実施例中に記述した本発明の数多くの修飾および変化が本分野の 技術者に思い浮かぶものと予想される、従って、それについては、付随する請求 項で明らかとなる制限のみを置くものとする。

従って、請求する本発明の範囲内に入る相当する上記変化の全てを添付請求の範 囲内に包含させることを意図するものである。

細胞内接着分子−１（工ＣＡＭ−１） Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　 ＬｙｓＶａｌ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｇ ｌｎ　Ｐｒ。

Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　工１ｅ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　 Ｐｒ。

Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｍｅｔ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　 ＡｓｎＰｈｅ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｔｒｐ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇ ｌｕＡｒｇＦＩＧ、１ Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｌｓｕ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｓａｒ　Ｔｒｐ　 Ｇｉｎ：ＬＯ５ｎ。

Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　Ａｒｇ　 ら工１１５　：Ｌ２０ Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｌａ　 Ａｓｎ１２５　：Ｌ３０ Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｌｓｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　 ＬｙｓＰｒｏ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｌ ａｕ　Ｖａｌ（ｘｘ）□ Ｄ二Ａｒｇτｈｒ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｇ１ｎ Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　’Ｅ’ｈｒ　Ｓｅ ｒ　ＡｌａＦＩＧ、　１　（ＣＯＮＴ、） −一−−−−−−一−−−−＞ Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　 ＴｙｒＧｌｙ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｓａｒ　Ｐｈｅ　Ｓａｒ　ＡＬａ　Ｌｙｓ　Ａ ｌａ　５ａｒＶａｌ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｌ ｕ　Ｇｌｙ　ＴｈｒＧｉｎ　Ａｒｇ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　５　Ａｌａ　Ｖａｌ工１ ｅ　Ｌｅｕ　ＧｌｙＦＩＧ、　１　（ＣＯＮＴ、） Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｉ’ｒｏ　Ａｒｇ　Ａｌａ 　Ｇ１ｎＬｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　 Ａｓｐ　ＡｓｎＧｌｙ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｓａｒ　％　Ｓａｒ　Ａｌａ 　Ｔｈｒ　ＬａｕＧｌｕ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｌａｕ工１ｅ　Ｈ ｉｓ　Ｌｙｓ　ＡｓｎＦＩＧ、　１　（ＣＯＮＴ、） Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ａｒｑ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｒｑ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　 ＧｌｙＰｒｏ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　％　Ｐｒｏ 　ＧｌｙＡｓｎ　Ｔｒｐ　Ｔｈｒ　Ｔｒｐ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　 Ｇｉｎ　Ｇ１ｎＴｈｒ　Ｐｒｏ　Ｍｅｔうｒｓ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｔｒｐ　Ｇｌ ｙ　Ａｓｎ　Ｐｒ。

Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　 ＴｙｒＶａｌ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ａ！１ｎ　 Ｖａｌ　ＬｅｕＦＩＧ、　１　（ＣＯＮＴ、） Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ工１ｅ　Ｖａｌ　工１ｅ工１ｅ　Ｔｈ ｒＶａｌ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｖａｌ工１ｅ　Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　 Ｔｈｒ４７５　４Ｂ０ Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｓａｒ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　 ＡｒｇＧｉｎ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ工１ｅ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｌｅ ｕ　Ｇｌｎ−一−−１−−−−□９６− Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒ。

□〉 ＦＩＧ、　１　（ＣＯＮＴ、） ＦＩＧ、　５８ ＦＩＧ、　３Ｃ１８５ ｔｌｃＡＭ（４５３）　（ｕＭ） ＦＩＧ、４ＣＥＤＣ／ＮＨ３，−＋−＋ｔＩＣＡＭ（＋−４５１） ＬＦＡ−３２１０２３７ −、−−−ＶＰｌ 、、、　−ＶＦ６ ・　１４８Ｓ ・　１１０Ｓ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　５／１０　８ ３１８−４Ｈ ２ＮＡ　８３１８−４Ｈ Ｃ１２Ｎ　１５／１２ ／／Ａ６１Ｋ　３９／３９５　Ｄ　９２８４−４ＣＣＯ７Ｋ　９９：００ Ｉ

Claims (43)

【特許請求の範囲】
1. １．多量体ＩＣＡＭ。
2. ２．上記ＩＣＡＭが非トランスメンブランＩＣＡＭである請求の範囲１の多量体 ＩＣＡＭ。
3. ３．上記非トランスメンブランＩＣＡＭが本質的にカルボキシル細胞内ドメイン を有していなくそして疎水性メンブランドメインを有していない請求の範囲２の 多量体ＩＣＡＭ。
4. ４．上記非トランスメンプランＩＣＡＭがｔＩＣＡＭ（４５３）、ｔＩＣＡＭ（ １８５）、ｔＩＣＡＭ（８８）、ｔＩＣＡＭ（２８３）、並びにｔＩＣＡＭ（８ ９−１８５）、ｔＩＣＡＭ（１８６−２８３）、ｔＩＣＡＭ（２８４−３８５） 、ｔＩＣＡＭ（３８６−４５３）、ｔＩＣＡＭ（７５−７７）、ｔＩＣＡＭ（７ ０−７２）、ｔＩＣＡＭ（６４−６６）、ｔＩＣＡＭ（４０−４３）、ｔＩＣＡ Ｍ（３６−３８）、ｔＩＣＡＭ（３０−３３）およびｔＩＣＡＭ（２６−２９） から選択される１種以上の配列を含むｔＩＣＡＭ類から成る群から選択される１ 員である請求の範囲２記載の多量体ＩＣＡＭ。
5. ５．上記ＩＣＡＭを支持体に吸着させることによって多量化させる請求の範囲１ の多量体ＩＣＡＭ。
6. ６．上記支持体が不活性ポリマーでありそしてニトロセルロース、ＰＶＤＦ、Ｄ ＥＡＥ、脂質ポリマー、およびアミノデキストランから成る群から選択される１ 員である請求の範囲５の多量体ＩＣＡＭ。
7. ７．上記多量体ＩＣＡＭを構成要素に連成させることによって多量化させる請求 の範囲１の多量体ＩＣＡＭ。
8. ８．上記ＩＣＡＭを少なくとも１種の反応性アミノ酸で修飾して、連成を容易に する少なくとも１つの部位を与える請求の範囲７の多量体ＩＣＡＭ。
9. ９．上記反応性アミノ酸がりジンおよびシステインから成る群から選択される１ 員である請求の範囲８の多量体ＩＣＡＭ。
10. １０．上記構成要素が抗体および蛋白質担体から成る群から選択される１員であ る請求の範囲７の多量体ＩＣＡＭ。
11. １１．上記抗体が抗ＩＣＡＭ抗体ＣＬ２０３である請求の範囲１０の多量体ＩＣ ＡＭ。
12. １２．上記蛋白質担体がアルブミンおよびプロテオグリカン類から成る群から選 択される１員である請求の範囲１０の多量体ＩＣＡＭ。
13. １３．上記ＩＣＡＭをどちらかの末端で修飾してオリゴマーミセルの形成を促進 させ得る脂質を含有させる請求の範囲１の多量体ＩＣＡＭ。
14. １４．同一もしくは異なっていてもよい２種以上のＩＣＡＭ類を互いに連結させ ることを含む請求の範囲１の多量体ＩＣＡＭ。
15. １５．リンカーなしに上記ＩＣＡＭ類を互いに直接連結させる請求の範囲１４の 多量体ＩＣＡＭ。
16. １６．少なくとも１つのジスルフィドブリッジで上記ＩＣＡＭ類を互いに連結さ せる請求の範囲１５の多量体ＩＣＡＭ。
17. １７．上記ＩＣＡＭ類を、各ＩＣＡＭ上の位置３０７の所で、システインジスル フィドブリッジを通して架橋させる請求の範囲１６の多量体ＩＣＡＭ。
18. １８．上記ＩＣＡＭ類を、各ＩＣＡＭ上の位置３０９の所で、システインジスル フィドブリッジを通して架橋させる請求の範囲１６の多量体ＩＣＡＭ。
19. １９．上記ＩＣＡＭ類を架橋剤で間接的に連結させる請求の範囲１４の多量体Ｉ ＣＡＭ。
20. ２０．上記架橋剤がヘテロ二官能およびホモ二官能架橋剤から成る群から選択さ れる請求の範囲１９の多量体ＩＣＡＭ。
21. ２１．上記架橋剤が二官能Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル、イミドエステ ルおよびビス−マレイミド−ヘキサン類から成る群から選択される１員である請 求の範囲２０の多量体ＩＣＡＭ。
22. ２２．上記ＩＣＡＭが、充分にグリコシル化されたＩＣＡＭ、部分的にグリコシ ル化されたＩＣＡＭまたはグリコシル化されていないＩＣＡＭから成る群から選 択される１員である請求の範囲１の多量体ＩＣＡＭ。
23. ２３．リガンドに対するＩＣＡＭの結合を増強させる方法において、この改良が 、上記ＩＣＡＭを多量体構造で提示する段階を含む方法。
24. ２４．上記ＩＣＡＭがｔＩＣＡＭである請求の範囲２３記載の方法。
25. ２５．上記ＩＣＡＭがｔＩＣＡＭ（４５３）、ｔＩＣＡＭ（１８５）、ｔＩＣＡ Ｍ（８８）、ｔＩＣＡＭ（２８３）、並びにｔＩＣＡＭ（８９−１８５）、ｔＩ ＣＡＭ（１８６−２８３）、ｔＩＣＡＭ（２８４−３８５）、ｔＩＣＡＭ（３８ ６−４５３）、ｔＩＣＡＭ（７５−７７）、ｔＩＣＡＭ（７０−７２）、ｔＩＣ ＡＭ（６４−６６）、ｔＩＣＡＭ（４０−４３）、ｔＩＣＡＭ（３６−３８）、 ｔＩＣＡＭ（３０−３３）およびｔＩＣＡＭ（２６−２９）から選択される１種 以上の配列を含むｔＩＣＡＭ類から成る群から選択される１員である請求の範囲 ２４記載の方法。
26. ２６．上記ＩＣＡＭを少なくとも１種の反応性アミノ酸で修飾して、連成を容易 にする少なくとも１つの部位を与える請求の範囲２３記載の方法。
27. ２７．上記反応性アミノ酸がりジンおよびシステインから成る群から選択される 請求の範囲２６記載の方法。
28. ２８．上記ＩＣＡＭをどちらかの末端で修飾してオリゴマーミセルの形成を促進 させ得る脂質を含有させる請求の範囲２３記載の方法。
29. ２９．上記多量体構造が、第二ＩＣＡＭに架橋している第一ＩＣＡＭを含んでい る請求の範囲２３記載の方法。
30. ３０．上記第一および第二ＩＣＡＭの各々を変異させて位置３０７の所にシステ イン残基を含有させ、そして上記第一および第二ＩＣＡＭを、位置３０７の所で 、上記システイン間のジスルフィドブリッジを通して架橋させる請求の範囲２９ 記載の方法。
31. ３１．上記第一および第二ＩＣＡＭの各々を変異させて位置３０９の所にシステ イン残基を含有させ、そして上記第一および第二ＩＣＡＭを、位置３０９の所で 、上記システイン間のジスルフィドブリッジを通して架橋させる請求の範囲２９ 記載の方法。
32. ３２．上記多量体構造が、支持体に吸着させたＩＣＡＭを含んでいる請求の範囲 ２３記載の方法。
33. ３３．上記支持体が高分子量の本質的に不活性なポリマー類から成る群から選択 される１員を含んでいる請求の範囲３２記載の方法。
34. ３４．上記ポリマーが不活性ポリマーでありそしてニトロセルロース、ＰＶＤＦ 、ＤＥＡＥ、脂質ポリマー類、およびアミノデキストランから成る群から選択さ れる１員である請求の範囲３３記載の方法。
35. ３５．上記多量体ＩＣＡＭを構成要素に連成させることによって多量化させる請 求の範囲３３記載の方法。
36. ３６．上記構成要素が抗体および蛋白質担体から成る群から選択される１員であ る請求の範囲３５記載の方法。
37. ３７．上記架橋剤がヘテロ二官能およびホモ二官能架橋剤から成る群から選択さ れる１員である請求の範囲２９記載の方法。
38. ３８．上記蛋白質担体がアルブミンおよびプロテオグリカン類から成る群から選 択される１員である請求の範囲３７記載の方法。
39. ３９．上記抗体が抗ＩＣＡＭ抗体ＣＬ２０３である請求の範囲３６記載の方法。
40. ４０．上記リガンドがヒトのライノウイルス、主要群レセプタウイルス、リンパ 球関連抗原−１（ＬＦＡ−１）および熱帯マラリア原虫から成る群から選択され る１員である請求の範囲２３記載の方法。
41. ４１．薬学的に許容される溶媒、希釈剤、アジュバントまたは担体を含有してお り、そして活性材料として、有効量の請求の範囲１記載ポリペプチドを含有して いる薬学的組成物。
42. ４２．ヒトライノウイルスの不可逆的脱外被を誘発する方法において、上記ヒト ライノウイルスとＩＣＡＭ−１もしくはそれのｔＩＣＡＭフラグメントとを接触 させることを含む方法。
43. ４３．ヒトライノウイルスによる哺乳動物細胞への感染を不可逆的に抑制する方 法において、上記ヒトライノウイルスとＩＣＡＭ−１もしくはそれのｔＩＣＡＭ フラグメントとを、このＩＣＡＭ−１もしくはｔＩＣＡＭが上記ライノウイルス に結合する条件下で接触させ、それによって上記ライノウイルスの不可逆的脱外 被を刺激することを含む方法。