JPH06509329A - 細胞の部位特異的な点滴注入または細胞の部位特異的形質転換による疾患の治療およびそのためのキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞の部位特異的な点滴注入または 細胞の部位特異的形質転換による疾患の治療およびそのためのキット 技−術分」 本発明は、細胞の部位特異的な点滴注入または細胞の部位特異的形質転換による 疾患の治療、およびそのためのキットに関する。

背１Ｕ支術 多くの全身的および先天的な疾患に対する効果的な治療は現代の医学にとっても まだ大きな挑戦課題として残されている。治療薬を生体の特定の部位に運ぶ能力 は、たとえば、局所的な疾患の治療にとって非常に重要なものである。また、治 療薬を循環器系を経由して潅流させることができれば、全身的な疾患の治療など に効果的である。

たとえば、抗腫瘍剤またはトキシンを腫瘍部位のすぐ近くに確実に投与できるこ とは望ましいことである。同様に、たとえば、糖尿病患者の血液中にインスリン を潅流させることができることも望ましいことである。しかしながら、多くの治 療薬に関して、特定部位への投与または全身的投与のいずれにおいても満足でき る方法はない。

加えて、多くの疾患において、局所的または全身的に、欠陥のある内因性遺伝子 の発現、外因性遺伝子の発現、あるいは内因性遺伝子の抑制、を起こさせること ができれば望ましいが、これらもまた、まだ達成されていない課題である。

特に、アテローム性動脈硬化症の発病はつぎの３つの基本的な生物学的なプロセ スで特徴づけられる。これらは＝１）血管内膜の平滑筋細胞の増殖とマクロファ ージの堆積；２）平滑筋細胞の増殖による大量の結合組織マトリックスの生成； ３）細胞の中およびそれをとりまく結合組織中での脂質の蓄積（基本的にはコレ ステロールエステルおよび遊離コレステロールの形で）、である。

最初に起こる事象は内皮細胞の損傷で、これは内皮の浸透膜への干渉となって現 れ、内皮表面の非凝血特性が変化し、内皮の凝血促進特性が昂進する。単球が内 皮細胞間を遊走し、スカベンジャー細胞として活発になり、マクロファージに分 化する。

ついでマクロファージは、血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）、線雑芽細胞成長因 子（ＦＧＦ）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、および形質転換成長因子α（ＴＧＦ− α）を合成し、分泌する。これらの成長因子は、アテローム性動脈硬化プラクの 中の繊維芽細胞および平滑筋細胞の遊走および増殖を強力に刺激する。さらに、 血小板は損傷した内皮細胞および活性化されたマクロファージとの相互作用で成 長因子の生産および血栓の生成をもたらす。

冠動脈系の疾患の臨床管理における２つの大きな問題としては、急性の心筋虚血 における血栓の生成および冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）後の再狭窄がある。この両 者とも、内皮の損傷、活性化されたマクロファージおよび血小板による成長因子 群の放出といった一般的な細胞事象が関与する。冠動脈形成術を行うと、アテロ ーム性動脈硬化プラクを破壊し、内皮を除去することになる。この血管の外傷は 、血小板凝集およびＰＴＣＡ部位での血栓生成を促進する。血小板やマクロファ ージからさらにマイトジェンが放出されると、平滑筋細胞の増殖および単球の浸 潤によって再狭窄にいたる。

この問題は、抗血小板剤を使用する経験医学診療では予防できず、ＰＴＣＡ患者 の１７３で起こっている。再狭窄の解決策は、血小板凝集の防止、血栓生成の防 止、ならびに平滑筋細胞の増殖抑止である。

血栓の生成はまた、冠状症候群の安定から不安定への移行における決定的な細胞 現象である。この病因には、多くの場合急性の内皮細胞の損傷あるいはプラクの 破壊が関与し、内皮細胞の付着部の機能不全を促進し、下層のマクロファージフ オーム細胞を露出させることになる。これによって、循環している血小板の付着 、凝集、および血栓生成の機会が生まれる。

組織プラスミノーゲン活性化剤（ｔＰＡ）のような血栓溶解剤の静脈内注射によ って、急性の心筋梗塞患者の約７０％において血栓を溶解するという結果が得ら れている。にもかかわらず、約３０％の患者では再潅流ができず、また梗塞を起 こした動脈でいったん再潅流をした患者の約２５％が、２４時間以内に血栓の再 発を経験している。したがって、再血栓に対する効果的な治療法は現代の医学界 における重要な課題として残されている。

上述のように、再血栓に対する効果的な治療法のみが現在残されている唯一の重 要な課題というわけではない。不安定なアンギーナ、心筋梗塞や慢性の組織虚血 といった、その他の虚血性の症状の治療、あるいは全身的および先天的な疾患や 癌などの治療も重要な課題である。これらの疾患は、抗凝固剤、血管拡張剤、血 管形成剤、成長因子剤や成長抑制剤などの、患者に対する適切な投与によって治 療することができる。このように、これらの診療分野すべてにおいて効果的な治 療法が切望されている。

兜−町＠阿示 したがって、本発明の一つの目的は、治療薬の部位特異的な投与のための新規な 方法を提供することにある。

本発明のもう一つの目的は、治療薬を患者の血流の中で潅流させる方法を提供す るものである。

本発明のもう一つの目的は、外因性遺伝子を患者の体内で発現させる方法を提供 するものである。

本発明のもう一つの目的は、欠陥内因性遺伝子を患者の体内で発現させる方法を 提供するものである。

本発明のもう一つの目的は、患者の体内の内因性遺伝子の発現を抑制する方法を 提供するものである。

本発明のもう一つの目的は、患者の体内の損傷した細胞を部位特異的に置き換え る方法を提供するものである。

本発明のもう一つの目的は、治療薬の部位特異的な投与または患者の血流内への 潅流のいずれかによって疾患を治療する方法を提供するものである。

本発明のもう一つの目的は、患者の体内で、外因性遺伝子の発現、欠陥のある内 因性遺伝子の発現、または内因性遺伝子の発現の抑制、のいずれかを引き起こす ことによって疾患を治療する方法を提供するものである。

本発明のもう一つの目的は、患者の体内の損傷した細胞を部位特異的に置き換え ることによって疾患を治療する方法を提供するものである。

本発明のもう一つの目的は、患者の体内へ正常または形質転換した細胞を部位特 異的に点滴注入するキットを提供するものである。

本発明のもう一つの目的は、生体内で細胞を部位特異的に形質転換するキットを 提供するものである。

以下の詳細な説明で明らかになる本発明のこれらのおよびその他の目的は、本発 明者らが下記を達成することによって、明らかにされたものである：ａ）（ｉ） 患者への正常細胞（形質転換されていない）または形質転換された細胞の部位特 異的な点滴注入、（１１）患者の細胞の部位特異的な形質転換、いずれかからな る方法；および、ｂ）カテーテルを含んだキットであって、（１）正常細胞また は形質転換された細胞の部位特異的な点滴注入、あるいは、（１１）細胞の部位 特異的形質転換、のためのもの。

正常な細胞の部位特異的な点滴注入は損傷した細胞を置き換えるために使用でき 、一方形質転換された細胞の点滴注入は欠陥のある内因性遺伝子または外因性遺 伝子のいずれかの発現、あるいは内因性遺伝子産物の抑制、のために利用できる 。患者の血管壁への細胞の点滴注入は血流中への治療薬の確実な潅流に使用する ことができる。

本発明およびこれに付随する多くの利点は、添付図面を参照しながら下記の詳細 な説明を理解するにつれ容易に、より完全な理解、評価に到達できるものである 。

図１および図２は本発明のカテーテルを、外科手術的または経皮的に細胞を血管 内に移植するため、または患者の血管に存在する細胞を生体内で形質転換するた めに、使用する方法を示したものである。

１■を＝　−の　の１ ここで、実施態様の１つでは、先天性の疾患、全身的な疾患、心血管系の疾患、 特定の器官の疾患、あるいは腫瘍などの疾患の治療に、本発明の、正常細胞また は形質転換細胞の点滴注入、または細胞の形質転換の方法を使用している。

本流において点滴注入される細胞には、内皮細胞、平滑筋細胞、線雑芽細胞、単 球、マクロファージ、および実質細胞などがある。これらの細胞は治療効果ない しは診断効果を有するタンパク質で、天然に存在するかまたはりコンビナンド遺 伝子物質に由来するタンパク質を産生ずるものである。

つぎに図を参照すると、ここでは、同一または対応する部位には、すべての図に おいて同一の番号を付している。図１では、米国特許４，８３６，１９５に開示 されているデザインのカテーテルを用いた本発明の実施態様を示している（この 特許をここにレファレンスとして援用する）。このカテーテルは正常または遺伝 子的に変換した細胞を血管の壁に供給したり、細胞の局所的形質転換のためにベ クターを導入するために使うことができる。図において互がその血管壁である。

図では膨張可能のバルーン手段１および２を膨らませることによって、カテーテ ル部４が所定の位置に保持されているところを示している。バルーン手段↓およ び？−の間の部分に点滴注入口手段旦が備えられている。このカテーテルにはさ らにガイドワイヤ手段旦を備えることもできる。図２は同様のカテーテルの使用 が示されているが、このカテーテルには１個の膨張可能バルーン手段２と複数の 点滴注入口手段旦が備えられている点が図１のカテーテルと異なる。このカテー テルは最大１２個の独立した点滴注入口手段ａを備えることができるが、図では ５ｆｌＩＡＷえているところを示している。

器官への供給のケースでは、このカテーテルは組織への補給を行う主要動脈に導 入される。リコンビナント遺伝子またはベクターを含んだ細胞は、動脈循環を一 時的に閉塞した後、中央の点滴注入口を通して導入される。このようにして、細 胞またはベクターＤＮＡは毛細管循環を通して、大量の実質組織に移入される。

リコンビナント遺伝子もまた、ダブルのバルーンカテーテル手法を目的の器官の すぐ近くの動脈循環に使用して、脈管中に導入することができる。このようにす れば、リコンビナント遺伝子を、関与する組織を潅流する循環系の中に直接分泌 させたり、その器官の中で直接合成させることができる。

１つの実施態様では、治療薬は血管細胞によって分泌され、病気に冒されている 特定の器官に供給されている。たとえば、虚血性心筋症は冠循環系に脈管形成性 の因子を導入することによって治療することができる。このアプローチはまた、 脈管形成性の因子が脳やその他の組織の循環を改善できるような末梢血管や大脳 血管の疾患に使用することができる。真性糖尿病はグルコース反応性のインスリ ン分泌細胞を門脈の循環（そこでは通常肝臓に他の組織より高いインスリン濃度 が見られる）に導入することによって治療することができる。

治療薬の局所的濃度を高めるためのほか、本流はりコンビナンド遺伝子を実質組 織に供給するためにも使用することができる。なぜならば、本流では高濃度のウ ィルス性ベクターやその他のベクターを特定の循環系に供給することができるか らである。このアプローチを用いて、器官に特異的なタンパク質不全もまた治療 することができる。たとえば、肝臓で、α−抗トリブシンインヒビター不全や高 コレステロール血症は、α−抗トリブシンまたはＬＤＬ受容遺伝子を導入するこ とによって治療することができる。さらに、このアプローチは悪性疾患の治療に も利用することができる。手術不能の腫瘍の循環系に対するリコンビナントトキ シン遺伝子の分泌は治療効果をもたらす。例としては、切除不能の聴覚腫瘍やあ るいはある種の血管腫がある。

臨床的状況においては、これらの治療用リコンビナント遺伝子は関与器官におい て循環供給される細胞の中に導入される。これらの細胞の導入場所としては動脈 系および毛細血管系が好ましいが、静脈系でもよい。

局所的な血管損傷の治療の場合、本発明は、その局所にこの症状を改善するタン パク質を発現させる。１つの実施態様では、それらの部位に血管細胞が認められ たので、それらを治療薬を運ぶキャリヤとして利用した。

本発明はこのように、その１つの様相においては、内皮およびその他の血管細胞 の遺伝子的な変換、あるいは体細胞の遺伝子治療によって治療薬剤（すなわち、 タンパク質、成長因子群）を損傷した局所に運ぶ。細胞への遺伝子移植を成功さ せるためには、４つの条件を満たさなければならない。第１に、細胞に移植しよ うとする遺伝子を同定し、単離しなければならない。第２に、発現させようとす る遺伝子はクローン化され、遺伝子操作ができるようになっていなければならな い。第３には、遺伝子は発現可能またはその機能が発揮されるような形で細胞に 導入されなければならない。第４に、遺伝子的に変換された細胞は、それが必要 とされる血管部位に正しく存在させなければならない。

本発明によれば、変換された細胞もしくは適当なベクターは、外科的、経皮的に 、または静脈内に導入され、患者の血管壁の１部分に付着させる。あるいは、患 者の血管壁に存在するいくつかの細胞を、望ましい遺伝子材料を用いて、または 直接ベクターを適用して、形質転換させる。場合によっては、血管表面から失わ れたまたは損傷した細胞を置き換えるために、これらの方法を用いて、遺伝子的 に変換されていない血管細胞を導入することもできる。

本発明によって、どのような血管も、すなわち動脈、静脈、毛細血管系も治療す ることができる。これらの血管は、ヒト、あるいはは乳動物類の体内のいずれの 器官の中、あるいはその近辺のものでもよい。

血管今夕ＪＪ欠ｌゴＪえ這１し１町Ｎｕ換−さＪリビ細ａプ岑ノ、以下、本発明 の実施態様を説明する。

■、　組織培養中での内皮またはその他の血管細胞の確立最初に、１つの細胞系 が確立され、液体窒素の中に貯蔵される。低温貯蔵に先だって、一定量を取り出 し、希望する遺伝子材料を含んだベクター、ウィルスその他に感染もしくは形質 移入させる◎ 内皮またはその他の血管細胞を、すでに発表されているＪ、Ｗ、Ｆｏｒｄ他。

ｉｎ　Ｖｉｔｒｑ、１７．４０　（１９８１）の手法を用いて、酵素学的に血管 の一部から取り出す。血管を切除し、ステンレススチールのロッドの上に反転し て置き、Ｃａ”およびＭｇ”を含まなイＨａ　ｎ　ｋのバランス塩溶液（ＢＳＳ ）、に０．１２５％のＥＤＴＡを加えた培液のＯ，１％トトリシン博液中で、ｐ Ｈ８，３７℃で１０分間、インキュベートする。

細胞群（０，４から１．５ｘｌＯ’）は遠心分離によって回収され、１０％胎児 牛血清、２５μｇ／ｍｌの内皮細胞成長補助液（ＥＣＧＳ。

Ｃｏ１１ａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　ウォルサム、マサチューセ ッツ州）、１５Ｕ／ｍｌのヘパリン、および５０μｇ／ｍ１のゲンタミシンを含 んだ培養液１９９　（ＧＩＢＣＯ）中に再懸濁させる。細胞を、ゼラチン（蒸留 水中２ｍｇ／ｍｌ）をプレコートした７５ｃｍ”の組織培養フラスコに加える。

細胞群は交合に達するまで、２日ごとに上記培養液が与えられる。

培養２遍間後、ブタの内皮を培養する場合には、ＥＣＧ５およびヘパリンを培養 液から除外する。もし、血管の平滑筋細胞あるいは線帷芽細胞を培養する場合に は、ＥＣＧ５およびヘパリンは培養過程から完全に除外する。細胞のアリコート は、約１０６個の細胞を０．５ｍｌの水冷胎児子ウシ血清中に氷の上で再懸濁さ せることによって、液体窒素の中で貯蔵する。１０％のＤＭＳＯを含む同量の水 冷胎児子ウシ血清を加え、細胞を冷やしたスクリューキャップ式のコーニング冷 凍チューブに整す。これらの細胞は、長期間の液体窒素中での貯蔵の前に、３時 間−７０℃の冷凍庫に移される。

その後この細胞は、希望する遺伝子材料を含んだベクターに感染させる。

Ｉｌ、正常または外因性タンパク質を発現している細胞の脈管系への導入。

Ａ、関連タンパク質を発現している細胞のカテーテル法による導入。

患者は、無菌手法を厳密に適用して、外科的にまたは経皮的にカテーテルを挿入 できるように準備する。目標とする血管の静脈切開を行うか、あるいは適当な麻 酔処理の後、目標とする血管の中に針を挿入する。血管（５）を穿刺し、米国特 許４，６３６，１９５のようなカテーテル（これはＵＳＣＩ。

Ｂ１１１ｅｒｉｃａ、マサチューセッツ州から入手可能。この米国特許の開示を ここに援用する）、をもし必要なら蛍光透視カイトのもとで、ガイドワイヤ手段 （６）により、血管（５）の中に進ませる（図１）。このカテーテル手段（４） は、感染した内皮細胞を動脈の別々の部位に導入するようにデザインされている 。

このカテーテルは、遠位および近位のバルーン手段（２）および（１）を有し、 （それぞれのバルーンの手段は、たとえば長さ約３ｍｍ、幅約４ｍｍである）、 バルーン手段の間には一定の長さのカテーテル手段がある。バルーンの間のカテ ーテル手段は、点滴注入口部（３）につながる１つの口部を有する。遠位および 近位のバルーン手段が膨らまされると、血管の中に１つの中央スペースが形成さ れ、口部を通して感染された細胞を点滴注入することができる。

解剖学的標識点により血管の部位が特定され、血管の層化を行うために、近位の バルーン手段（２）を膨らませ、内皮を機械的外傷（たとえば、血管の中に部分 的に膨らませたバルーンカテーテルを強制的に通過させる）または機械的外傷と 少量のディスパー七、トリプシン、コラゲナーゼ、パパイン、ペプシン、キモト リプシン、またはカテプシンなどの蛋白分解酵素の組み合わせ、あるいはこれら の蛋白分解酵素だけを用いた培養により、層化する。蛋白分解酵素のほか、リパ ーゼも使用できる。血管の当該部位はまた、ＮＰ−４０、ＴｒｉｔｏｎＸｌｏｏ 、デオキシコール酸塩、あるいはＳＤＳなどの弱い洗浄剤による処理によっても 層化できる。

層化の条件は、細胞移入のためには基本的に内皮を完全に落とすか、直接感染の 場合は約２０から９０％、好ましくは５０から７５％、の細胞を血管壁から落と すように調整する。ある場合には、細胞の除去をしなくてもよいこともある。

ついでカテーテルを、点滴注入口（３）が層化された内皮の部位にくるように進 める。つぎに動脈の特定の部分に、感染、または形質移入した、あるいは正常な 細胞を３０分間点滴注入する。もし、血管がある程度の虚血を許容できる器官を 潅流している場合、たとえば骨格筋、は遠位の潅流は特に問題にはならないが、 もし必要ならば外部シャントで、あるいは遠位の潅流ができるカテーテルを使用 して回復させることができる。感染した内皮細胞を点滴注入した後、バルーンカ テーテルをはずし、動脈穿刺部位および皮膚切開箇所を修復する。もし、遠位の 潅流が必要ならば、遠位潅流ができるようにデザインされた別のカテーテルを使 用する。

Ｂ、リコンビナント遺伝子の血管壁の細胞への直接導入、または生体中の特定の 循環系による潅流：器官壁または器官の細胞の感染または形質移入。

上記と同様の外科的手法が用いられる。感染した細胞を使うかわりに、形質導入 したウィルス性ベクター（１０６から１０６個／ｍ１）または運搬ベクターに複 合化したＤＮＡのような高力価の希望する遺伝子材料を、ダブルバルーンカテー テル手法を用いて、器官壁に直接点滴注入する。このベクターは、感染の効果を 高めるために、血清およびポリブレン（１０μｇ／ｍｌ）を含んだ培養液の中に 注入される。カテーテルによってできたデッドスペース中で、充分な時間（０， ２から２時間またはそれ以上）培養した後、この培養液は脱気され、燐酸緩衝生 理塩液で静かに洗浄し、そして動脈循環を回復させる。術後の回復のためにも同 様の手順が適用される。

器官の表面は機械的な層化のみでも、あるいは少量のデイスパーゼ、トリプシン 、コラゲナーゼまたはカテプシンなどの蛋白分解酵素との組み合わせ、またはこ れらの蛋白分解酵素だけを用いた培養、によっても準備することができる。層化 の条件は器官壁からの細胞脱落が適当になるように調節される。

ウィルス性ベクターまたはＤＮＡ−ベクター複合体は、精製ウィルスまたは０原 性の血清を含んだ複合体を用いて、ダルベツコの改変イーグル培地に滴下注入す る。または、目標細胞に対するウィルス粒子の付着性を強化して感染効果を高め るために、ポリブレン（１０μｇ／ｍｌ）、ポリーＬ−リジン、デキストランサ ルフェートのような粘着性の物質、または生理学的に適当なポリカチオン性物質 、またはウィルスあるいはベクターの被膜糖蛋白に対するハイブリッド抗体や器 官壁中あるいは器官から潅流する組織中の関連する目標に対するハイブリッド抗 体を含んだ複合体を用いる。ウィルスあるいはベクターの被膜糖蛋白や関連する 目標細胞に対するハイブリッド抗体は、２つの方法のいずれかで作られる。異な るエピトープに対する抗体は化学的に架橋することができる（Ｇ、　Ｊ　ｕ　ｎ 　ｇ、　Ｃ。

Ｊ、Ｈｏｎ５ｉｋ、Ｒ，Ａ、Ｒｅ１ｓｆｅｌｄ、およびＨ，Ｊ、Ｍｕｌｌｅｒ− Ｅｂｅｒｈａｒｄ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８３゜４ ４７９　（１９８６）；Ｕ、Ｄ、５ｔａｅｒｚ、Ｏ，Ｋａｎａｇａｗａ、および Ｍ、Ｊ、Ｂｅｖａｎ、Ｎａｔｕｒｅ、３１４，６２８　（１９８５）；およびＰ 。

Ｐｅｒｅｚ、Ｒ，Ｗ、Ｈｏｆｆｍａｎ、Ｊ、Ａ、Ｔｉｔｕｓ、およびり、　Ｍ。

Ｓｅｇａｌ、、Ｊ、１３ｃｐ、Ｍｅｄ、、１６３，１６６　（１９８６））、ま たはハイブリッドハイブリドーマを用いて生物学的にカップリングされる（Ｕ、 　Ｄ。

５ｔａｅｒｚおよびＭ、Ｊ、Ｂｅｖａｎ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ｐｓΔ、８３．１４５３　（１９８６）；およびＣ，Ｍｉｌｓｔｅｉｎ およびＡ、Ｃ，Ｃｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ、３０５，５３７　（１９８３）） ｅカテーテルの中央スペースの中で、０．２から２時間またはそれ以上培養した 後、この培養液は脱気され、燐酸緩衝生理塩液で静かに洗浄し、そして循環を回 復させる。

異なったカテーテルデザイン（図２参照）を用いて、異なった点滴注入プロトコ ールを使用することもできる。この２番目のアプローチでは、単一のノルルーン 手段（２）のカテーテルで、部分的に層化された動脈部分の中にレトロウィルス を高圧で運搬できるような複数の口部手段（３）を有するものを使用する。器官 の表面は上記のように準備され、同様の粘着性分子を使用して、欠陥ベクターを 導入する。この場合、高圧運搬システムの使用は、ベクターと隣接する血管組織 中の細胞との相互作用を最適なものとするのに役立つ。

本発明はまた、感染の効果を高めるために、成長因子をカテーテルによって局所 的にまたは全身的に使用する方法も提示している。レトロウィルスベクターのほ かに、ヘルペスウィルス、アデノウィルス、あるいはその他のウィルス性ベクタ ーも本流の手法に適したベクターである。

また、器官の中または組織の中で細胞の形質転換を行わせることも可能である。

器官または組繊細胞の直接形質転換は、２つの方法のいずれかで行うことができ る。第１の方法では高圧による形質導入が用いられる。高圧によって、ベクター は血管壁を通して回りの組織中に移行する。第２の方法では、キャピラリーベッ ドの中への注入（これは浸潤させるために損傷を受けた後でもよい）によって、 とりまく組織を直接感染させる。

ベクターや細胞の点滴注入のために必要な時間は本発明のうちどの方法を使用す るかによって異なる。細胞やベクターを血管中に点滴注入するのに適当な時間は ０．０１から１２時間であり、好ましくは０．　１から６時間、最も好ましくは ０．２から２時間である。あるいは、ベクターや細胞の高圧点滴注入を行う場合 は、より短時間が好ましい。

本光朋ヱ使１０Ｌ（細ｌ匡しく１士 ”遺伝子的材料”という用語は、一般的にタンパク質をコードするためのＤＮＡ を指す。またＲＮＡについても、ＲＮＡウィルスまたはＲＮＡをベースとしたそ の他のベクターとともに使用されるときには、この用語を適用する。

形質転換は、直接感染、形質導入、または他の取り込み方法によって外因性遺伝 子を細胞の中に組み込むプロセスである。

”ベクター”という用語は、広く知られており、よく使われることば”クローニ ングビヒクル”と同義である。ベクターは非染色体の二重らせんＤＮＡで、完金 なレプリコンからなり、単細胞有機物の中におかれたときに、たとえば形質転換 のプロセスによって、複製される。ウィルス性ベクターには、レトロウィルス類 、アデノウィルス類、ヘルペスウィルス、パボウィルス、または変性天然ウィル ス類がある。ベクターはまた、ＤＮＡと細胞によって取り込むことができる化学 品または物質の処方晶も意味する。

もう１つの実施態様では本発明は遺伝子の発現を抑制する方法を提供する。この 目的を達成するためには４つのアプローチを使うことができる。これらにはアン チセンス剤の使用が含まれ、ｍＲＮＡに対して相補的な合成オリゴヌクレオチド （Ｍａｈｅｒ　ＩＩＩ、Ｌ、Ｊ、　およびＤｏｌｎｉｃｋ、Ｂ、Ｊ、Ａｒｃｈ。

Ｔｊ−ｉ　ｏ−■」」シリ１［９世１．２５３．　２１４−２２０　（１９８７ ）およびＺａｍｅｃｎｉｋ、Ｐ、Ｃ，、他、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ ｃｉ、。

８３．４１４３−４１４６．（１９８６））、またはこの遺伝子の逆相補体を発 現するプラスミド（Ｉｚａｎｔ、Ｊ、Ｈ，およびＷｅｉｎｔｒａｕｂ、Ｈ，。

５−ｃｉｅｎｃｅ、２２９，３４５−３５２．（１９８５）；Ｃｅ１ｌ、３６゜ １０７７−１０１５　（１９８４）　）、のいずれかを使用する。さらに、リボ ザイムと呼ばれる触媒的ＲＮＡ５は特にＲＮＡシーケンスを分解させることがで きる（Ｕｈｌ、ｅｎｂｅｃｋ、Ｏ，Ｃ，、Ｎａｔｕｒｅ、３２８，５９６−６０ ０゜（１９８７）、Ｈａｓｅｌ、ｏｆｆ、Ｊ、およびＧｅｒｌａｃｋ、Ｗ、Ｌ、 。

ｊｊａ　ｔ、−ｕ、、ｒ−、ｅ、３３４，５８５−５９１．（１９８８））、第 ３のアプローチは、″細胞内免疫化”であり、細胞内タンパク質の類似体が特に それらの機能を阻害する（Ｆｒｉｅｄｍａｎ、Ａ、Ｄ、、Ｔｒｉｅｚｅｎｂｅｒ ｇ、Ｓ、Ｊ、およびＭｃｋｎｉｇｈｔ、Ｓ、Ｌ、、Ｎａｔｇｒｅ、３３５，４． ５２−４５４（１９８８））もので、以下に詳細を示す。

第１のアプローチは特に細胞内の転写を除去するのに使用できる。転写の除去は Ｓ１ヌクレア一ゼ分析で確認することができ、結合タンパク質の発現は機能分析 で確認される。転写ファクタｍＲＮＡのプロセシングおよび翻訳の阻害に単一ら せんオリゴヌクレオチド類似体を使用することができる。要約すれば、目的遺伝 子のコード鎖に相補的な合成オリゴヌクレオチドまたはチオールから誘導された アナログ（２０−５０ヌクレオチド）が準備される。これらのアンチセンス剤は ｍＲＮＡの異なる領域ごとに準備される。それらは、遺伝子の５”非翻訳領域、 翻訳開始サイトおよびそれに続＜２０−５０の塩基対、中央のコード領域、また は３′非翻訳領域、に相補的なものである。アンチセンス剤は活性化の前に形質 導入された細胞と一緒に培養される。どの領域がこれらの遺伝子の発現を阻止す るのにより効果的かを確認するために、メツセンジャーＲＮＡの異なる部位に対 するアンチセンス剤の競合物質の効果を比較する。

ＲＮＡはまた、自動触媒的にはたらいて自己融解を起こさせたり、特に相補的Ｒ ＮＡシーケンスを分解させる機能を有している（Ｕｈｌ、ｅｎｂｅｃｋ、Ｏ，Ｃ ，。

Ｎａｔｕｒｅ、３２８，５９６−６００　（１９８７）、Ｈａｓｅｌｏｆｆ、Ｊ 。

およびＧｅｒｌａｃｋ、、Ｗ、Ｌ、、、Ｎａｔｕｒｅ、３３４，５８５−＋５９ １゜（Ｊ、９８８）、およびＨｕｔｃｈｉｎｓ、Ｃ，Ｊ、、他、Ｎｕｃ上旦上皇 １／ｊｑ　ｉ伏−５Ｒｅｓ工、１４．３６２７−３６４０（１９８６））。ＲＮ Ａ開裂がうまくゆくための条件としては、ハンマーヘッド構造と構造のフランキ ング部位についた保存ＲＮＡシーケンスがある。この触媒的領域の隣接領域は特 定のＲＮＡに対して相補的であり、したがってリボザイムが特定の細胞ｍＲＮＡ ５を特徴とする特定の目標遺伝子の生産を阻止するためには、この遺伝子をコー ドするｍＲＮＡをリボザイムを使用して分解してやればよい。要約すれば、ＲＮ Ａ転写の中のどのようなＧＵＧシーケンスもリボザイムを使用した分解の目標に なりえる。これらはＤＮＡシーケンス分析で確認され、ＲＮＡ転写にまたがるＧ ＵＧサイトがその特異的分解のために使用される。５′非翻訳領域の中のサイト 、コード領域のサイト、および３′非翻訳領域の中のサイトが、この転写を分解 するのにより効果的かどうかを決定するための目標とされる。ＧＵＧサイトの上 流の２０塩基対の相補的シーケンスをコードする合成オリゴヌクレオチド、ハン マーヘッド構造とこのサイトの下流の一２０塩基対の相補的シーケンスが、ｃＤ ＮＡの関係サイトに挿入される。このようにして、リボザイムは同じ細胞区画を 内因性メツセージとして目標にする。特別のエンハンサ−の下流に挿入されたり ボザイムは、特定の細胞の中で高い発現を示すものを作り出す。これらのプラス ミドは、ネオマイシン耐性プラスミドｐｓＶ２−Ｎｅｏまたは選択的マーカーと ともにエレクトロポレーションおよび同時形質導入によって、関係する目的細胞 に導入される。これらの転写の発現はノーザン・プロットおよびＳ１ヌクレア一 ゼ分析によって確認される。確認されると、ｍＲＮＡの発現を８１ヌクレアーゼ プロテクシヨンによって、これらの転写の発現が目的ｍＲＮＡおよびそれを規制 する遺伝子の定常レベルを下げているかどうか評価する。タンパク質のレベルも また確認する。

遺伝子はまた、活性化に必要な領域を欠いた変異転写を用意することによって阻 害される。要約すれば、その領域を確定した後、機能を刺激できないような変異 型を合成する。この切形遺伝子を、ネオマイシン耐性遺伝子を含んだプラスミド の５Ｖ−４０エンハンサ−の下流に挿入する（Ｍｕ　１１　ｉ　ｇａｎ、　Ｒ， およびＢｅｒｇ、Ｐ、、５ｃｉｅｎｃｅ、２０９．Ｌ４２２−１４２７　（１９ ８０）（別の転写ユニットの中）。このプラスミドを細胞の中に導入し、０４１ ８を使って選別する。この遺伝子の変異型の存在は、Ｓ１ヌクレア一ゼ分析およ び免疫沈降法によって確認される。これらの細胞中の内因性タンパク質の機能は ２つの方法によって評価される。第１は、正常な遺伝子の発現を確認する。第２ は、これらのタンパク質の既知の機能を評価する。もし、この細胞間阻害型変異 株がその宿主に対して毒性がある場合には、メタロチオネインプロモーターのよ うな胱導性のコントロールエレメントに導入する。安定した株を単離したあと、 細胞をＺｎまたはＣｄとともに培養しこの遺伝子を発現させる。そのあと宿主細 胞に対する影響を評価する。

特定の遺伝子を不活性化させるもう１つのアプローチは、その他の活性の機能や 発現と拮抗するりコンビナンドタンパク質を過剰に発現させることである。たと えば、もしＴＰＡの発現を減らしたい場合（たとえば、播種性の血栓溶解の診療 手段において）には、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビターを過剰に発 現させればよい。

近年の生化学および分子生物学の発展により、”リコンビナント”ベクター、た とえばその中のレトロウィルスおよびプラスミドが、外因性のＲＮＡまたはＤＮ Ａをそれぞれ含むもの、を作ることが可能になった。特殊なものでは、リコンビ ナントベクターが非相同のＲＮＡまたはＤＮＡ　（これはりコンビナンドベクタ ーによる形質転換ができる有機体では通常生成されないポリペプチドをコードし たＲＮＡまたはＤＮＡという意味であるが）を含むことも可能になった。リコン ビナントＲＮＡまたはＤＮＡベクターの生産についてはよく知られており、詳細 を説明するまでもない。しかし、参考のためにこのプロセスについて簡単に述べ ておく。

たとえば、レトロウィルスまたはプラスミドベクターは、開裂により連結可能な 末端部をもつ直鎖ＲＮＡまたはＤＮＡにすることができる。これらの末端部は相 補的な同様の連結可能な末端部を有する外因性ＲＮＡまたはＤＮＡと結びつき、 完全なレプリコンおよび希望する発現特性を有して生物学的機能を発揮できるリ コンビナントＲＮＡまたはＤＮＡ分子となる。

ＲＮＡおよびＤＮＡの組換えには、別々のＲＮＡまたはＤＮＡの隣りあった末端 フラグメントを連結しやすいように調整するなど、種々の手法がある。

本発明で使用する外因性、すなわちドナーである、ＲＮＡまたはＤＮＡは適当な 細胞群から得ることができる。公知の手法を使って、ベクターを作り、治療薬タ ンパク質の生体中発現が可能な形質転換細胞を得る。形質転換細胞は、目的細胞 を、目的細胞の中にＲＮＡまたはＤＮＡを取り込み形質転換できるような処方の ＲＮＡまたはＤＮＡに接触させることにより得ることができる。そのような処方 には、たとえば、レトロウィルス類、プラスミド類、リポソーム組成物、または ポリ−ルーリジン、ＤＥＡＣ−デキストランのようなポリカチオン性の物質およ び目的リガンドなどが含まれる。

このよう−に本発明は、治療薬または診断薬を、局所的または全身的な目的のた めに、血管の局所′に送り込む方法として、細胞の遺伝子的変換を利用する方法 を提供するものである。これらの細胞中で発現されるリコンビナントタンパク質 の範囲は広くかつ種類が多い、これには、血栓症および再狭窄症、脈管形成の治 療のためのｔＰＡ、または再血管形成の目的のための成長因子、および血管収縮 または血管けいれんを改曹するための血管作用性因子、などのタンパク質を発現 するベクターを使用する遺伝子変換も含まれる。この手法はまた、遺伝的疾患、 または後天的な病気、局所的あるいは全身的な疾患に対する遺伝子的な治療にお よぶものである。本発明はまた、細胞が失われた特定の部位に正常な細胞を導入 する、たとえば、血管形成手術やカテーテル処置の間に損傷した内皮を置き換え る、ためにも使用できる。

たとえば、虚血性疾患（血栓症）の治療においては、ｔＰＡまたはその修飾物、 ウロキナーゼまたはストレプトキナーゼなどをコードする遺伝子的材料が、細胞 を形質転換するために使用される。虚血性器官（たとえば、心臓、腎臓、大腸、 肝臓、など）疾患の治療においては、形質転換成長因子ａ　（ＴＧＦ−α）、形 質転換成長因子ｓ　（ＴＧＦ−β）、アンジオジェニン、腫瘍壊死因子α、腫瘍 壊死因子β、酸性フィブロブラスト成長因子または基本フィブロブラスト成長因 子のような側副枝再生剤（ｒｅｃｏｌｌａｔｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ　ａｇｅｎ ｔｓ）をコードする遺伝子的材料を使用することができる。血管運動系の疾患の 治療においては、血管拡張剤または血管収縮剤をコードする遺伝子的材料を使用 することができる。これらには、心房性ナトリウム排泄増加因子、血小板から誘 導された成長因子またはエンドセリンが含まれる。糖尿病の治療においては、イ ンスリンをコードする遺伝子的材料を使用することができる。

本発明はまた、悪性疾患の近接部に形質転換した細胞を置くことによって悪性疾 患を治療するのに利用することができる。この用途では、ジフテリアトキシン、 百日咳トキシン、またはコレラトキシンをコードする遺伝子的材料が使われる。

本発明をＡＩＤＳの治療に使用する場合、溶解性ＣＤ４またはその誘導物をコー トする遺伝子材料を使用することができる。遺伝子的な疾患の治療の場合（たと えば成長ホルモン欠乏）にはその必要とする物質をコードする遺伝子的材料、（ たとえばヒト成長ホルモン）を使用することができる。これらすべての遺伝子材 料は、本分野の技術に習熟した当業者ならば容易に入手することができる。

もう１つの別の実施態様において、本発明は患者の病気を治療するキットを提供 するが、このキットはカテーテル、ならびに酵素または弱性の洗浄剤のいずれか を含み、カテーテルは血管の中に挿入できるようになったものであり、かつ、前 記血管の中に挿入できるようになったバルーンエレメントを備え、かつ、カテー テル部を血管の中に正しく保持できるように、血管の壁に対して膨らませること ができるようになっている主カテーテル部、ならびに主カテーテル部に備えられ た血管の中に溶液を供給するための手段、を含み、酵素または弱性の洗浄剤を含 んだ溶液は生理学的に許容される溶液である。この溶液は、デイスパーゼ、トリ プシン、コラゲナーゼ、パパイン、ペプシン、キモトリプシンなとの蛋白分解酵 素を含む。弱性の洗浄剤として、この溶液はＮＰ−４０、Ｔｒｉｔｏｎｘｔｏｏ 、デオキシコール酸塩、あるいはＳＤＳなどを含む。

あるいは、このキットには生理学的に許容される溶液として、ヘパリン、ポリー Ｌ−リジン、ポリブレン、デキストランサルフェート、ポリカチオン性物質のよ うな薬剤、または二価の抗体を含んだものでもよい。この溶液はまた、ベクター 類または細胞類（正常または形質転換されたもの）を含んでもよい。さらに別の 実施態様では、このキットはカテーテルおよび酵素または弱性の洗浄剤を含んだ 溶液と、ヘパリン、ポリーＬ−リジン、ポリブレン、デキストランサルフェート 、ポリカチオン性物質のような薬剤、または二価の抗体を含んだ溶液（この溶液 にはベクター類または細胞類を含んでもよい）の両方を含んだものでもよい。

このキットは、１個のバルーンと中央の遠位潅流口を備えたカテーテル、ならび に特定の器官への細胞の導入、またはキャピラリーベッドへのベクターの導入、 あるいはこのキャピラリーベッドによって潅流される特定の器官や組織への細胞 の導入を行うのに許容される溶液を含んでもよい。

あるいは、このキットは、間隔を開けて設けられ、血管に挿入できるようにした ２つのバルーンエレメントを有し、血管の中に１つのチャンノ１（室）を形成で きるように、また主カテーテルを所望の位置に保持できるように、この両方のエ レメントとも血管の壁に対して膨らませることができるようになってＩｌｌる１ つの主カテーテル部を含んだものでもよい。この場合、チャン／（へ溶液を供給 する手段は、２つのバルーンの間に設ける。このキットは血管の中へ溶液を送り 出すための複数の出口手段を備えたカテーテルとしてもよい。

このように、本発明は患者の疾患を治療する方法として、器官の壁に付着してい る細胞、または患者のこの器官から潅流される細胞に外因性の治療性タン／１り 質を発現させようとするもので、このタンパク質が疾患を治療し、また１よ診断 目的に有用なものとなる。本発明方法は虚血性疾患、血管運動系疾患、糖尿病、 悪性疾患、ＡＩＤＳ、または遺伝子的疾患の治療に用ｂ４ことができる。

本発明では、外因性治療性タンパク質として、ｔＰＡまた１よその修飾物、ウロ キナーゼ、ストレプトキナーゼ、酸性フィブロブラスト成長因子、塩基性フィブ ロブラスト成長因子、腫瘍壊死因子α、腫瘍壊死因子β、形質転換成長因子α、 形質転換成長因子β、心房性ナトリウム排泄増加因子、血小板から誘導された成 長因子、エンドセリン、インスリン、ジフテリアトキシン、百日咳トキシン、コ レラトキシン、溶解性ＣＤ４またはその誘導物、および成長ホルモンなどを疾患 治療のために使用できる。

末法では診断効果を持つ外因性タンパク質もまた使用できる。たとえＩｉ、β− カラクトシダーゼのようなマーカープロティンを細胞遊走をモニタするために使 用できる。

外因性の治療性タンパク質を発現させる細胞類は内皮細胞類が好まし０゜本発明 のその他の特性は以下の参考実施態様の説明を通して明らかになると思われるが 、これらの実施態様は本発明の説明のためであって、本発明を限定するものでは ない。

下記の報告データは、内皮細胞の移植および遺伝子移植の可能性を示すものであ り；内皮細胞はカテーテル法により安定的に動脈壁に１几−且１１旦移植され、 リコンビナントマーカープロティン、β−ガラクトシダーゼを生体内で発現して いる。

ブタのしゆく層形成はヒトのそれと近似性があるので、動物モデルとして、遊支 のブタ系列、ユカタン・ミニビッグ（Ｃｈａｒｌｅｓ　ＲｉｖｅｒＬａｂｏｒａ ｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、、ウイルミントン、マサチューセッツ州）が選ばれた（ １）。最初の内皮細胞系は、８力月の雌ミニビッグの内部頚静脈で確立された。

この種の内皮細胞としての同定は、この細胞群が組織培養においてブタの内皮に 特有の成長特性および形態学的特性を示したことにより確認された。

この内皮細胞はまた、繊維芽細胞（フィブロブラスト）やその他の間葉細胞群（ ２）とは対照的に、アセチル化低密度リポタンパク質（ＡｃＬＤＬ）のレセプタ ーを発現した。ＡＣＬＤＬレセプター発現の分析を行ったところ、蛍光ＡＣＬＤ Ｌの取り込みで判断して、培養した細胞の９９％以上がこのレセプターを含んで いた。

２系列の独立したβ−ガラクトシダーゼ−発現内皮細胞系を、ネズミの両栄養性 β−カラクトシダーゼー形質導入レトロウィルスベクター（ＢＡＧ）で感染させ た後単離した。このベクターは複製欠陥でβ−ガラクトシダーゼおよびネオマイ シン耐性遺伝子（３）の両方を含んだものである。Ｇ−４１８の存在下での成　 。

長能力の点から、このベクターを含んだ細胞種が選ばれた。組織化学的染色によ り、選ばれた細胞群の９０％以上がβ−カラクトシダーゼを合成した。また、こ れらの遺伝子的に変性された細胞群の内皮特性も蛍光ＡＣＬＤＬ取り込みの分析 で確認された。ＢＡＧレトロウィルスによる感染も、さらにサザン・プロット分 析により立証されたが、それによれば完全なプロウィルスＤＮＡがほぼ１ゲノム あたり１コピー存在することが明かとなった。

この通交の同系種からとられた内皮細胞群は、２匹以上のミニビッグの研究に供 することができ、９項目の異なった実験課題で試験を行った。通常の麻酔処理の もとで、大腿および回腸動脈を露出し、カテーテルを器官に導入した（図１）。

動脈壁の内膜組織を、少し膨らませたノ１ルーンカテーテルを強制的に器官内に 通し、機械的に裸化した。動脈をヘパリン化した生理食塩水で洗浄し、中性プロ テアーゼおよびディスパーザ（５０Ｕ／ｍｌ）とともに培養した。これにより、 残っていた管腔内皮細胞も除去された。残った酵素は、カテーテルバルーンをし ぼませ器官の区画中を血液が流れるようにした後、血漿中でα２グロブリンによ り急速に不活化した。β−ガラクトシダーゼを発現した培養内皮細胞群を、２バ ルーンで中央に１個の点滴注入口を持った特別にデザインされた（図１）動脈カ テーテル（ＵＳＣＩ、Ｂｊｌｌｅｒｉｃａ、１４Ａ）を使用して導入した。

これらのバルーンが膨らまされた時、動脈の中に保護されたスペースができ、そ の中に点滴注入口車を通して細胞が注入される（図１）。β−ガラクトシダーゼ を発現するこれらの内皮細胞群は、裸化された器官への付着を容易にするため３ ０分間培養される。そのあとカテーテルが取り除かれ、動脈支流が結さっされ、 切開部が閉じられた。

β−ガラクトシダーゼ−発現内皮を接種された動脈部分を、２−４週間後取り除 いた。Ｘ−ｇａｌクロマゲンを用いた染色の後の動脈標本の全体検査で、複数の 青色着色区域が見られ、感染していない内皮を植え付けた動脈との比較において 、β−ガラクトシダーゼ活性を示している。光学顕微鏡では主として実験的に植 え付けた器官の内膜の内皮細胞にβ−ガラクトシダーゼ着色が記録されている。

対照的に、β−ガラクトシダーゼを含まない内皮細胞を受け取ったコントロール 区画では同様の着色はなんら認められなかった。β−ガラクトシダーゼ着色は、 しばしば深部の内膜組織に認められ、これは植え付けた内皮が以前に損傷した器 官壁に捕ら又られるか、または移入することを示唆している。局所的な血栓症が 最初の２つの実験課題で観察された。この複雑化は、その後の研究で内皮細胞移 植手順に先たってアセチルサリチル酸を投与し、また接種の時にヘパリン抗凝血 剤を使用することによって抑えることができた。血栓が形成されるケースでは、 β−ガラクトシダーゼ着色が器官壁から血栓の表面に至る範囲の内皮細胞に見ら れた。

生体での遺伝子移植に関する第１の関心は、遺伝子的に生成された細胞からの、 複製能力のあるレトロウィルスの生産である。これらのテストにおいては、複製 欠陥のレトロウィルスを使用することで、この問題を最小にすることができた。

これらの細胞系統では、試験管中で２０回継代させた後でもヘルパーウィルスは まったく検出されなかった。感染の確度が高いことと宿主細胞ゲノムに対する同 化が安定しているという理由で欠陥ウィルスを使用したが、遺伝子移植における このアプローチはその他のウィルスベクターでも利用可能である。

２番目の関心は、生体中におけるリコンとナンド遺伝子の発現寿命に関するもの である。現在の研究では、器官の中での内皮細胞のβ−ガラクトシダーゼ発現は 血管への導入後６週間までは安定している。

これらのテストは、遺伝子的に変換された内皮細胞は、動脈カテーテル法によっ てユカタン・ミニビッグの血管壁に導入可能であることを示している。したがっ て本性は、遺伝子的に変換された内皮をベクターとして用い、血管系の疾患の局 所的な生化学的治療に使用可能である。

バルーンによる血管形成とか病気の器官への移植組織の挿入といった血管系疾患 における現在の介入的な方法がもたらす大きな合併症は、アテローム硬化プラー クの破壊ならびに局所的な組織の外傷部位での血栓形成（５）である。部分的に は、内皮細胞損傷がこの合併の媒介となっている（６）。本データは、介入が存 在するときに局所的な血栓症を抑えるために、遺伝子的に変換された内皮細胞の 使用が可能であることを示している。

この手法は、不安定な狭心症や心筋梗塞を含めて、その他の虚血性疾患治療にも 使用可能である。たとえば、組繊プラスミノーゲンアクチベーターやウロキナー ゼの遺伝子を発現する細胞を導入することで抗血栓効果を得ることができる。

この手法はまた、慢性的な組織虚血症の治療にも有用である。たとえば、重症の 虚血組織、たとえば心筋、に側副枝血管の生成を刺激するための脈管形成または 成長因子（７）を形成させるのがそれである。最後に、全身的な先天性疾患のた めの体細胞の遺伝子取り替えも、この内皮細胞遺伝子移植手法を応用すれば可能 である。

実験の部： Ａ、正常なブタ内皮細胞およびβ−ガラクトシダーゼが導入されたブタ内皮細胞 中でのＡｃＬＤＬレセプター発現の分析。

ユカタン・ミニビッグから採取した内皮細胞系で、ＢＡＧレトロウィルスまたは ３Ｔ３フイブロブラストコントロールで感染させた２つのサブ系種について、蛍 光標識したＡｃＬＤＬを用いてＡｃＬＤＬレセプターの発現を調べた。

中性のプロテアーゼ　ディスフ１−ゼ（８）を用いて、外部頚静脈から内皮細胞 を採取した。切除した静脈部分をディスパーザ（５０ＬＪ／ｍｌ、Ｈａｎｋｓの バランス塩泊液中）で満たし、３０°Ｃで２０分間培養した。この方法で得た内 皮を、胎児了ウシ血清（１０％）、５０μｇ／ｍｌの内皮細胞成長補助液（ＥＣ ＧＳ）、およヒヘハリン（１００μｇ／ｍｌ）を添加した培養ｆｉ１９９　（Ｇ ＩＢＣ○。

ＱｒＢｒｌｄ　Ｉｓ　１　ａｎｄ、ニューヨーク州）の中で保管した。これらの 細胞はＢ　Ａ　Ｇレトロウィルスに感染させ、Ｇ−４１８耐性のあるものを選ん だ。この細胞種を、　（１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’　、３’−テ トラメチルインドカルバシアニン・バークロレート）（Ｄｉｌ）ＡｃＬＤＬ　（ ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、スタウトン、マサチューセッ ツ州）（１０μｇ／ｍ１）とともに４−６時間、３７℃で培養し、０．５％グル タルアルデヒドを含んだ燐酸緩衝生理食塩水で３回洗浄した。位相差および蛍光 顕微鏡で細胞を視覚化した。

Ｂ、カテーテルによる内皮細胞の導入法。

内皮細胞の点滴注入にはダブルバルーンカテーテルを使用した。このカテーテル は近位および遠位のバルーンを有し、それぞれ長さ６ｍｍ、幅５ｍｍ、ｍｍ−ン の間の距離は２０ｍｍである。カテーテルの中央部には点滴注入口につながる２ ｍｍの孔がある。近位および遠位のバルーンによって中央にスペースができ、器 官（血管）の特定の区画に注入口を通して感染させた細胞の点滴注入ができるよ うになっている。カテーテルによる細胞導入の図解は、図１および図２を参照さ れたい。

動物の管理は、’Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍ ａｌ　Ｃａｒｅ”および”Ｇｕｊ、ｄｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｃａｒｅ　ａｎｄＵ ｓｅ　ｏｆ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ａｎｉｍａｌｓ”　（ＮＩＨＰｕｂｌ　１ ｃａｔｉｏｎ　Ｎｏ、８０−２３．１．９７８年改訂）に準拠した。雌のユカタ ン・ミニビッグ（８０−１，ＯＯｋｇ）をベンドパルビタール（２０ｍｇ／に、 ｇ）で麻酔処理し、挿管し、機械的換気を行った。これらの個体の回腸および大 腿動脈を無菌手術で露出させた。遠位の大腿動脈を穿刺し、カイトワイヤを使っ てダブルバルーンカテーテルを回腸動脈に入れた。外部回腸動脈を確認し；近位 のバルーンを少し膨らませ、内皮を機械的に裸化させるために遠位および近位を 通過させた。ついで、カテーテルの中央スペースが裸化された内皮の位置にくる ように調整して置き、両方のバルーンを膨らませた。裸化された区画をヘパリン 化した生理食塩水で洗浄し、残留付着している細胞をデイスパーゼ（２０Ｕ／ｍ １）を１０分間点滴注入し除去した。裸化された器官（血管）はざらにヘパリン 溶液で洗浄し、Ｂ’Ａ　Ｇ感染内皮細胞を３０分間点滴注入した。その後、バル ーンカテーテルを取り外し、血流を順行状態に戻した。当該器官部分を２−４週 間後に切除した。その動脈の１部を０．５％グルタルアルデヒド溶液に５分間入 れ、燐酸緩衝生理食塩水に入れて保存し、池の部分を切断細分のためにパラフィ ンブロックで覆った。β−ガラクトシダーゼ発現のレトロウィルスの存在が標準 組織化学手法により確認された（１９）。

Ｃ，インビトロおよびインビボの内皮細胞の分析。

β−力ラうトシダーゼ活性は組織化学着色法により下記のものについて記録され た。（Ａ）ユカタン・ミニビッグから取り出された一次内皮細胞、（Ｂ）ＢＡＧ レトロウィルスベクターに感染させたサブ系、　（Ｃ）正常な動脈のコントロー ル区画、　（Ｄ）ＢＡＧレトロウィルスベクターに感染させた内皮を点滴注入し た動脈の区画、（Ｅ）正常コントロール動脈の顕微鏡区画、および（Ｆ）ＢＡＧ レトロウィルスベクターに感染させた内皮を点滴注入した動脈の顕微鏡区割。

組織培養の中の内皮細胞は、組織化学的着色の前に０．５％グルタルアルデヒド の中で固定された。インビトロおよびインビボにおける感染された。内皮細胞を 確認するために、Ｅ、ｃｏｌｉ　β−ガラクトシダーゼタンパク質の酵素活性を 利用した。β−ガラクトシダーゼ形質導入Ｍｏ−ＭｕＬＶベクター（２）、（Ｂ ＡＧ）は、Ｄｒ、Ｃｏｎ５ｔａｎｃｅ　Ｃｅｐｋｏの好意により提供された。

このベクターはワイルドタイプのＭ　ｏ　Ｍ　ｕ　Ｌ　Ｖ　Ｌ　Ｔ　Ｒをβ−ガ ラクトシダーゼ遺伝子のプロモーターとして使用している。Ｔｎ５ネオマイシン 耐性遺伝子にリンクしたサルウィルス４０　（ＳＶ−４０）早期プロモーターが 薬剤Ｇ−４１８に対する抵抗性を与えるが、これをβ−ガラクトシダーゼ遺伝子 の下流に挿入し、レトロウィルスを含んだβ−カラクトシダーゼ発現細胞を選択 するためのマーカーとさせる。この欠陥レトロウィルスはフィブロブラストψａ ｍ細胞（３，１０）から準備し、ダルベツコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）お よび１０％子ウシ血清の中で保存する。細胞はトリプシン化の後、−週間に２継 代代させた。細胞に、上澄み液（力価ｔｏ’−ｉｏ″’／ｍｌ、Ｇ−４１８耐性 Ｂコｏ＝−）を２部３交合で加え、１０％子ウシ血清を加えたＤＭＥＭ中で１２ 時間、３７℃、５％ＣＯ＊。

８μｇ／ｍ１のポリブレンの存在下で、培養した。ウィルス性の上澄み液を取り 除き、細胞を１０％胎児子ウシ血清、ＥＣＧ３　（６０μｇ／ｍｌ）、を加えた 培養液１９９、ざらにＧ−４１８（５０％ラセミ混合体０．７μｇ／ｍｌ）の中 での選別に先立って、２４かも４８時間内皮細胞調整培養液（２０％）で、保存 した。Ｇ−４１８耐性細胞を単離し、標準の組織化学的着色（９）を用いて、β −ガラクトシダーゼ発現の分析を行った。β−ガラクトシダーゼ酵素を安定的に 発現している細胞を連続培養しその後の必要に備えた。冷凍アリコートは液体窒 素中で保存した。

引五Ｈ旧１物 １、　Ｊ、Ｓ；Ｒｅｉｔｍａｎ、Ｒ，Ｗ、Ｍａｈｌｅｙ、Ｄ、Ｌ、Ｆｒｙ。

Ａｔｈｅｒ　ｃｌｅｒｏ　ｉｓ　４３，１１９　（１９８２）。

２、　Ｒ，Ｅ、Ｐｉｔｏｓ、Ｔ、Ｌ、Ｉｎｎｅｒａｒｉｔｙ、Ｊ、Ｎ。

Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ、Ｒ，Ｗ、Ｍａｈｌｅｙ。

Ａｒｔｅ　ｉ　ｃｌｅｒｏｓｉ　１，１１７　（１９８１）；Ｔ、Ｊ、Ｃ，Ｖａ ｎ　Ｂｅｒｋｅｌ、Ｊ、Ｆ、ＫｒｕｉｊｔＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、１３２．６１　 （１９８１）；Ｊ、Ｃ，Ｖｏｙｔａ。

Ｐ、Ａ　Ｎｅｔｌａｎｄ、Ｄ、Ｐ、Ｖｉａ、Ｅ、Ｐ、Ｚｅｔｔｅｒ。

Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、９９，８１Ａ　（要約）（１９８４）；Ｊ、Ｍ、Ｗ ｉｌｓｏｎ、Ｄ、Ｅ、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ。

Ｄ、Ｍ、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ、Ｒ，Ｃ，Ｍｕｌｌｉｇａｎ。

３、　Ｊ、Ｐｒ１ｃｅ、Ｄ、Ｔｕｒｎｅｒ、Ｃ，Ｃｅｐｋｏ、ＰＬ旦１４Ｎ１」 」エコ１虹」伎、５ｋ」ユ」ムーミ、Ａ、、８４，１５６　（１９８７）。

４、　Ｒ，Ｍａｎｎ、Ｒ，Ｃ，Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｄ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ。

むユニ、３３，１５３　（１９８３）；Ｃ，Ｌ、Ｃｅｐｋｏ、Ｂ、Ｅ。

Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｒ，Ｃ，Ｍｕｌ　１　ｉｇａｎ、　ｑ生理１３７゜１０５３　 （１９８４）ｉ Ｍ、　Ａ、　Ｅｇｌｉｔｉｓ、　Ｗ、　Ｆ、　Ａｎｄｅｒｓｏｎ。

Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉ　ｕｅｓ　６，６０８　（１９８８）。

５、　Ｓ、Ｇ、Ｅｌｌｉｓ、Ｇ、Ｓ、Ｒｏｕｂｉｎ、Ｓ、Ｂ、Ｋｉｎｇ。

Ｊ、Ｓ、Ｄｏｕｇｌａｓ、Ｗ、８．Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｃ１ｒｃｕｌ　ｔｉｏｎ　７７．３７２（１９８８）；Ｌ、Ｓｃｈｗａｒｔｚ、 Ｍ、Ｇ、Ｂｏｕｒａｓｓａ。

Ｊ、Ｌｅｓｐｅｒａｎｃｅ、Ｈ，Ｅ、Ａｌｄｒｉｇｅ。

Ｆ、Ｋａｚｉｍ、ｅｔ　ａｌ、、Ｎ　Ｅｎ　１．Ｊ、Ｍ　、３１８゜１７１４　 （１９８８）。

６、　Ｐ、Ｃ，Ｂｌｏｃｋ、Ｒ，に、Ｍｙｌｅｒ、Ｓ、５ｔｅｒｔｚｅｒ。

Ｊ、Ｔ、Ｆａｌｌｏｎ、Ｎ　Ｅｎ　Ｍ　ｄ、３０１５，３８２（１９８１）；Ｐ 、Ｍ、５ｔｅｅｌｅ、Ｊ、Ｈ，Ｃｈｅｓｅｂｒｏ。

Ａ、Ｗ、５ｔａｎｓｏｎ、　５７，１０！５　（１９８！５）；Ｊ、Ｒ，Ｗｉｌ ｅｎｔｚ、Ｔ、Ａ、５ａｎｂｏｒｎ、Ｃ，Ｃ。

Ｈａｎｄｅｎｓｃｈｉｌｄ、Ｃ，Ｒ，Ｖａｌｅｒｉ、Ｔ、Ｊ、Ｒｙａｎ。

Ｄ、Ｐ、Ｆａｘｏｎ、Ｃ１ｒｃｕｌａｔｉｏ　７５，６３６（１９８７）ｉＷ、 ＭｃＢｒｉｄｅ、Ｒ，Ａ、Ｌａｎｇｅ、Ｌ、Ｄ。

Ｈｉｌｌｉｓ、Ｎ、Ｅｎ　１．Ｊ、Ｍｅｄ、３１８．１７３４（１９８８）。

７、　Ｊ、Ｆｏｌｋｍａｎ、Ｍ、Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ、　旦ユ」」１１免皇２３ Ｊ　４４２　（１９８７）；Ｓ、Ｊ、Ｌｅｉｂｏｖｉｃｈ、　Ｐ、Ｊ。

Ｐｏ１ｖｅｒｉｎｉ、Ｈ，Ｍｉｃｈａｅｌ　５ｈｅｐａｒｄ、Ｄ、Ｍ。

Ｗｉｓｅｍａｎ、Ｖ、５ｈａｖｅｌｙ、Ｎ、Ｎｕｓｅｉｒ。

Ｎ１」己ＬＬ旦　３２９，６３０　（１９８７）；Ｊ、Ｆｏｌｋｍａｎ。

Ｍ、Ｋｌ　ａｇｓｂｒｕｎ、　Ｎ１」己ＬＬ旦　３２９＋　６７１　（１９８７ ）　。

８、　Ｔ、Ｍａｔｓｕｍｕｒａ、Ｔ、Ｙａｍａｎｋａ。

Ｓ、Ｈａｓｈｉｚｕｍｅ、Ｙ、Ｉｒ１ｅ、に、Ｎ１ｔｔａ、　ＪＩＪ」１ｂ−Ｊ 、、Ｅｘ　、Ｍｅｄ、４５，３７７　（１９７５）；Ｄ、Ｇ、Ｓ。

Ｔｈ１ｌｏ、Ｓ、Ｍｕｌｌｅｒ−Ｋｕｓｅｌ、Ｄ、Ｈｅ１ｎｒｉｃｈ。

１、Ｋａｕｆｆｅｒ、Ｅ、Ｗｅｉｓｓ、Ａｒｔｅｒｙ、８．２５ａ（１９８０） 。

９．　Ａ、Ｍ、Ｄａｎｎｅｎｂｅｒｇ、Ｍ、８ｕｇａ、　Ｍｌ」」８と１旦ｆｒ ｓｔｄｉｎＭｎｎｕ Ｐｈａ　ｏｃ　ｔｅｓ、Ｄ、Ｏ，Ａｄａｍｓ、Ｐ、Ｊ、Ｆ、ｄｅｌｓｏｎ。

Ｈ，Ｓ、Ｋｏｒｅｎ、Ｅｄｓ、（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。

ニューヨーク、１９８１）、ｐｐ３７５−３９５゜１０、　Ｒ，Ｄ、Ｃｏｎｅ、 Ｒ，Ｃ，Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｐｒ　Ｎ　ｔｌＡ　ａｄ、　ｉ、ｕ、３　Ａ　８１ ，６３４９　（１９８４）。

いうまでもなく、上記教示に黙らせば本発明は多くの改変法や変形法が可能であ る。したがって、添付のクレームの範囲において、本発明はここに特に記載した 以外の方法でも実施可能であることを了解されたい。

フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　４８１００ 　８３１４−４ＣＡ６１Ｍ　２５１００ ／／　Ａ６１Ｋ　３７１０２　ＡＤＵ　８３１４−４Ｃ３７／２４　ＡＤＰ　８ ３１４−４Ｃ ３７１５４ＡＢＮ　８３１４−４Ｃ Ｃ１２Ｎ　５１０８ Ｉ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．患者の疾患を治療するのに必要なキットで、１つのカテーテル手段と酵素ま たは弱性の洗浄剤を含む溶液で構成され、（ｉ）当該カテーテル手取は血管に挿 入できるようになっており、主カテーテル部は、当該血管に挿入できるように、 また当該主カテーテル部を当該血管内の所望の位置に保持できるように当該血管 の壁に対して膨らますことができるようなバルーンエレメント、および当該血管 の中に溶液を供給するための手段を主カテーテル部に備えたもので構成され；そ して（ｉｉ）当該溶液は生理学的に許容される溶液であるキット。 ２．溶液が酵素として、ディスバーゼ、トリプシン、コラゲナーゼ、ババイン、 ペプシン、キモトリプシン、およびリパーゼよりなる群から選ばれる少なくとも １積類以上のものを含むものである、請求項第１項記載のキット。 ３．溶液が、ＮＰ−４０、ＴｒｉｔｏｎＸ１００、デオキシコール酸塩、および ＳＤＳよりなる群から選ばれる少なくとも１積類以上のものを含むものである、 請求項第１項記載のキット。 ４．主カテーテル部が、血管に挿入できるように、また血管の中に１つのチャン バを形成できるように、また主カテーテルを所望の位置に保持できるように、血 管の壁に対して膨らませることができるようにした２つの間隔を開けたバルーン エレメント手段、および当該溶液を当該チヤンバへ供給する手段を当該バルーン エレメントの間に設けた構成になるものである、請求項第１項記載のキット。 ５．溶液を当該血管の中へ供給する手段が複数の出口手段で構成されている、請 求項第１項記載のキット。 ６．患者の疾患を治療するのに必要なキットで、１つのカテーテル手段と生理学 的に許容される溶液で構成され、 （ｉ）当該カテーテル手段は血管に挿入できろようになっており、主カテーテル 部は、当該血管に挿入できるように、また当該主カテーテルを当該血管内の所望 の位置に保持できるように当該血管の壁に対して膨らますことができるようなバ ルーンエレメント、および当該血管の中に溶液を供給するための手段を主カテー テルに備えたもので構成され；そして（ｉｉ）当該生理学的に許容される溶液は 、へバリン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリブレン、デキストランサルフェート、ポリ カチオン性物質、および二価の抗体よりなる群から選ばれる少なくとも１種類以 上の物質を含むキット。 ７．生理学的に許容される溶液がさらにＤＮＡを含むものである、請求項第６項 記載のキット。 ８．生理学的に許容される溶液がさらに成長因子を含むものである、請求項第６ 項記載のキット。 ９．患者の疾患を治療するのに必要な方法であって、当該患者の血管の壁または 器官あるいは組織に付着させた細胞に、当該疾患を治療する外因性の治療剤タン パク質を発現させることを特徴とする方法。 １０．疾患が虚血性疾患、血管運動性疾患、糖尿病、悪性疾患、ＡＩＤＳ，また は遺伝子的疾患である、請求項第９項記載の方法。 １１．疾患が全身性の疾患である、請求項第９項記載の方法。 １２，外因性治療剤タンパク質がｔＰＡまたはその修飾物、ウロキナーゼ、スト レプトキナーゼ、酸性フィブロブラスト成長因子、塩基性フィブロブラスト成長 因子、腫瘍壊死因子α、腫瘍壊死因子β、形質転換成長因子α、形質転換成長因 子β、心房性ナトリウム排泄増加因子、血小板から誘導された成長因子、エンド セリン、インスリン、ジフテリアトキシン、百日咳トキシン、コレラトキシン、 溶解性ＣＤ４およびその誘導物、および成長ホルモンよりなる群から選ばれるも のである、請求項第９項記載の方法。 １３．細胞が内皮細胞、血管平滑筋細胞、線維芽細胞、結合組織細胞、マクロフ ァージ、単球、および実質細胞よりなる群から選ばれるものである、請求項第９ 項記載の方法。 １４．部位特異的に細胞を点滴注入することを特徴とする疾患を治療する方法。 １５．細胞が形質転換された細胞である、請求項第１４項記載の方法。 １６．細胞が正常細胞である、請求項第１４項記載の方法。 １７．生体内で部位特異的に細胞を形質転換することを特徴とする疾患の治療方 法。