JPH06508614A - ２型糖尿病および関連疾患の治療におけるβ−細胞トロピン（ＡＣＴＨ２２−３９）拮抗薬の使用 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 ■型糖尿病および関連疾患の治療におけるβ−細胞トロピン（ＡＣＴＨ２２−３ ９）拮抗薬の使用 本発明は、化合物および組成物を含む薬物、ならびに■型糖尿病および■型糖尿 病に関連する症状（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　 Ｔｙｐｅ　ＩＩ　ｄｉａｂｅｔｅｓ）の治療におけるかかる薬物の使用に関する 。

■型糖尿病、またはインスリン非依存性糖尿病は、ヒトならびにイヌおよびネコ などの他の哺乳動物の重篤かつ一般的な代謝疾患状態である。現在、当該疾患に 対して有効な治療を提供する市販の薬物はない。

アミリンは、近年、■型糖尿病性膵臓から抽出したアミロイド塊から単離された ポリペプチドである［プロノーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オ ブ・サイエンシズ・ニー・ニス・エイ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、ＵＳＡ）、第８４巻、第８６２８−８６３２頁、１９８７年１２月コ。アミ リンは、（グルコースとして）炭水化物エネルギーの分布を制御するための体内 の内分泌恒常性メカニズムにおける活性部分を果たすと記載されていた。特に、 アミリンは、（１）ランゲルハンス島内のβ−細胞からのインスリンの放出を抑 制すること、（２）筋肉細胞にインスリンフグナルを無視させることによって骨 格筋における基本的なインスリン刺激性グリコーゲン合成を抑制することが開示 されている［ＷＯ３９１０６１３５］。■型糖尿病、および、特にインスリン耐 性は、アミリンの過剰分泌の影響であると記載されている。

β−細胞−トロピン（β−ＣＴ）は、遺伝的に肥満の（ｏｂｌｏｂ）マウスの単 離された下垂体神経中葉（ｎｅｕｒｏｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ　１ｏｂｅｓ） のベリヒューゼート（ｐｅｒｉｆｕｓａｔｅｓ）　（スーパーヒューゼート（ｓ ｕｐｅｒｆｕｓａｔｅｓ））から最初に単離されたペプチドである［ベロラフ− チェイン（Ｂｅｌｏｆｆ−Ｃｈａｆｎ）ら、エフ・イー・ビー・ニス・レター（ ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、）、（１９８０）１１７．３０３−３０７］。

β−ＣＴは、一連の生物学的活性を有する。（１）それは、亜刺激性濃度（ｓｕ ｂｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ）のグルコースによ る、単離された潅流ラット膵臓からのインスリンの放出［ダンモア・アンド・ベ ロラフ−チェイン（Ｄｕｎｍｏｒｅ　＆　Ｂｅ１ｏｆｆ−Ｃｈａｉｎ）、ジャー ナル・オブ・エンドクリノロジー（Ｊ。

Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　）　（１９８２）　９２．１５−２１１、およびペリ ヒユーズした（ｐｅｒｉｆｕｓｅｄ）ランゲルハンス島からのインスリンの放出 ［ビリンガム（Ｂ　ｉｌｌｉｎｇｈａｍ）ら、リサーチ・ル・オブ・エンドクリ ノロジー（Ｊ　、　Ｅ　ｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　）（１９８２）９４．１２５− １３０１を刺激して、単相性応答を誘発する。（２）それは、高濃度のグルコー スによって誘発されたインスリンの、潅流した膵臓からの二相性放出を可能にす る［ベロラフ−チェイン（Ｂｅｌｏｆｆ−Ｃｈａｉｎ）ら、バイオケミカル・ソ サイエティ・トランスアクションズ（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　Ｓ　ｏｃ、　Ｔ　ｒ ａｎｓ、　）（１９８１）９．５２２−５２４１゜（３）それは、脂肪組織中の 脂質生成を促進する際のインスリン様作用を有する［ワトキンソン・アンド・ベ ロラフ−チェイン（Ｗａｔｋｉｎｓｏｎ　＆　Ｂｅ１ｏｆｆ−Ｃｈａｉｎ）、ホ ルモン・アンド・メタポリツク・リサーチ（Ｈｏｒｍ、Ｍｅｔａｂ、Ｒｅｓ、） 　（１９８４）　１６．５５−５８　（Ｓｕｐｐｌ、）］。

β−ＣＴは、アドレノコルチコトロピン（ＡＣＴＨ）−（２２−３９）として特 徴付けられ［ベロラフ−チェイン（Ｂｅ１ｏｆｆ　−Ｃｈａｉｎ）ら、ネイチャ ー（ロンドン）（Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ））、３０１、（１９８３）２５ ５−２５８１、そのホルモン性性質は、肥満マウス血漿［ビリンガム（Ｂ　ｉｌ ｌｉｎｇｈａｍ）ら、１９８２］およびヒト血漿［サルバトーニ（５ａｌｖａｔ ｏｎｉ）ら、ジャーナル・オブ・エンドクリノロジー（Ｊ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎ ｏｌ、）　（１９８６）　１１０．３０３−３０７１中のその存在によって証明 される。合成β−ＣＴは、緩和固相法（ｍｉｌｄ　５ｏｌｉｄ　ｐｈａｓｅ　ｐ ｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）を使用しても製造された［バイオケミカル・アンド・バイ オフィジカル・リサーチ−］ミュニケーノヨンズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　ａｎｄ　 Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｅ、　）　（１９８３）、第１１４巻、第 ２号、第７６３−７６６頁］。

β−ＣＴの構造に対するある種の修飾がβ−ＣＴのインスリン放出能を変調させ ることが知られている［ニス・ダンモア（Ｓ　、　Ｄ　ｕｒ＋ｍｏｒｅ）ら、バ イオケミカル・ジャーナル（Ｂｊｏｃｈｅｍ、Ｊ、）（１９８７）２４４．７９ ７−８００１゜今、β−ＣＴの脂質生成活性が調節され得ることが見いだされた 。

β−ＣＴは、アミリン放出の調節において重大な役割を果たすことも見いだされ た。特に、β−ＣＴがアミリン放出増加の原因となることがあり、これによって 、インスリン耐性の発生に寄与することが示される。

したがって、β−ＣＴは、インスリン放出の増加による■型糖尿病状態の発生、 特に、高インスリン血症、結果としてのインスリン耐性の発生において、および 、増加したアミリン放出によるインスリン耐性の発生において、および増加した 脂質生成による肥満症の発生において、中心的な役割を果たすことが示される。

β−ＣＴの形成もしくは放出の調節、またはβ−ＣＴの生物学的活性の調節は、 ■型糖尿病、ならびに高インスリン血症、高インスリン血症に関連する症状（高 脂血症、高血圧およびアテローム性動脈硬化症など）、インスリン耐性、肥満症 および高血糖症などの■型糖尿病に関連する症状の治療能を提供すると思われる 。

したがって、本発明は、β−細胞トロピン（β−ＣＴ）の形成、放出または生物 学的活性を調節する化合物の非毒性有効量を投与することからなる、ヒトなどの 哺乳動物において、高インスリン血症、高インスリン血症に関連する症状、高血 糖症、インスリン耐性および肥満症などの■型糖尿病に関連する症状の治療方法 を提供する。

１つの態様では、本発明は、高インスリン血症および高インスリン血症に関連す る症状の治療方法を提供するものである。さらなる態様では、本発明は、肥満症 の治療方法を提供するものである。

高インスリン血症に関連する症状としては、高脂血症、高血圧およびアテローム 性動脈硬化症が挙げられる。

１つの化合物は、β−細胞トロピンの形成を調節するものである。１つの化合物 は、β−細胞トロピンの放出を調節するものである。１つの化合物は、β−細胞 トロピンの生物学的活性を調節するものである。

β−ＣＴの生物学的活性を調節する特定の化合物は、β−ＣＴ拮抗薬などの、β −ＣＴの生物学的活性を抑制する化合物である。

β−ＣＴ拮抗薬の一例としては、β−ＣＴに対して特異的な抗体、好適には、β −ＣＴに対して特異的なモノクローナル抗体などの非競合拮抗薬が挙げられる。

β−ＣＴ拮抗薬のさらなる例としては、競合β−ＣＴ拮抗薬が挙げられる。

競合β−ＣＴ拮抗薬は、β−ＣＴ受容体についてβ−ＣＴまたはβ−ＣＴ作動薬 と競合する拮抗薬である。

競合β−ＣＴ拮抗薬の例としては、不能なβ−ＣＴ作動薬が挙げられる。不能な β−ＣＴ作動薬は、それが、なお、β−ＣＴ受容体に対する結合能を有している が、生物学的応答の低下を誘発し、好適には、医薬的に関連する生物学的応答を 全く誘発しないように構造的に修飾されたβ−ＣＴ作動薬である。

不能な作動薬の例としては、架橋作動薬が挙げられる。

好適な架橋作動薬としては、架橋β−ＣＴまたはβ−ＣＴの架橋断片が挙げられ る。

不能な作動薬の例としては、置換β−ＣＴまたはβ−ＣＴの置換断片が挙げられ る。「置換β−ＣＴＪおよび「β−ＣＴの置換断片」なる語は、アミノ酸配列を 変化させたか、または正常な配列由来のアミノ酸を構造的に修飾したβ−ＣＴま たはその断片を意味する。

競合β−ＣＴ拮抗薬のさらなる例は、β−ＣＴ受容体を指向する抗体、好適には モノクローナル抗体である。

さらなる態様では、本発明は、有効治療物質としての使用のための、β−細胞ト ロピン（β−ＣＴ）の形成、放出または生物学的活性を調節する化合物を提供す るものである。

特に、本発明は、■型糖尿病、あるいは高インスリン血症、高インスリン血症に 関連する症状、高血糖症、インスリン耐性および肥満症などの■型糖尿病の治療 用の、β−細胞トロピン（β−ＣＴ）の形成、放出または生物学的活性を調節す る化合物を提供するものである。

さらなる態様では、本発明は、■型糖尿病、または高インスリン血症、高インス リン血症に関連する症状、高血糖症、インスリン耐性および肥満症などの■型糖 尿病に関連する症状の治療用薬物製造のための、β−細胞トロピン（β−ＣＴ） の形成、放出または生物学的活性を調節する化合物の使用を提供するものである 。

不能なβ−ＣＴ作動薬は、適切な慣用の方法によって製造される；かくして、例 えば、架橋β−ＣＴまたはβ−ＣＴの架橋断片は、バイオケミストリー（Ｂｉｏ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　１７．１９７８．１４９９、インターナショナル・ジャ ーナル・オブ・ペブタイド・アンド・プロティン・リサーチ（Ｉ　ｎｔｅｒｎａ ｔｉｏｎａｌ　Ｊ　。

Ｐｅｐｔｉｄｅ　＆　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ、）、２７．１９８６．２８５− ９２およびピアス（Ｐ　１ｅｒｃｅ）、１９８９ハンドブツク・アンド・ジェネ ラル・カタログ（クロス−リンキング・リージエンツ）　（Ｈａｎｄｂｏｏｋ　 ａｎｄ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｃａｔａｌｏｇｕｅ　（Ｃｒｏｓｓ−１ｉｎｋｉｎｇ 　Ｒｅａｇｅｎｔｓ））、第２８３−３１１頁に開示されているような慣用のペ プチド架橋技術によって製造される。

また、置換β−ＣＴまたはβ−ＣＴの置換断片は、ソリッド・フレイズ・ペプタ イド・シンセシスーア・プラクティカル・アプローチ（Ｓｏｌｉｄ　Ｐｈｒａｓ ｅＰｅｐｔｊｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　−ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒ ｏａｃｈ）、イー・アサ−トン（Ｅ。

Ａｔｈｅｒｔｏｎ）、アール・シー・シェパード・パブリッシャ−（Ｒ，Ｃ，５ ｈｅｐｐａｒｄＰｕｂ、）、アイ・アール・エル・プレス（Ｉ　ＲＬ　Ｐｒｅｓ ｓ）に開示されているような慣用のペプチド化学技術によって製造される。

β−ＣＴ拮抗薬は、β−ＣＴがβ−ＣＴ受容体と相互作用する特定の方法が決定 された場合に特に好都合に製造されると思われる。これは、まず、β−ＣＴ受容 体と相互作用するβ−ＣＴの活性部位の同定を含む。かかる情報を確立すると、 置換または架橋によって不能であるかもしれないβ−ＣＴまたはその断片の関連 アミノ酸残基の同一性をより簡単に測定することができる。

受容体または受容体の一部と同時に結晶化されるβ−ＣＴの構造の結晶学的分析 によって、β−ＣＴおよびその受容体間の相互作用が分析される。かかる分析に よって、β−ＣＴおよびその受容体間の相互作用において最も重要なこれらのア ミノ酸残基が測定され、次に、該残基が、例えば、拮抗薬を生成するために置換 または架橋されているかが判明する。

また、β−ＣＴ対β−ＣＴ受容体相互作用の構造的分析によって、ペプチドまた は非ペプチド有機抑制薬の適切な分子形状および該抑制薬に対して必要な他の構 造的特徴が決定される。

β−ＣＴ受容体に対する抗体は、適切な慣用方法［プロシーディングズ・オブ・ ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・ニー・ニス・エイ（Ｐ　ｒｏｅ 。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）（１９８２）、７９．７３１２−７３１ ６１を使用してβ−ＣＴ受容体受容体性下、モノクローナル抗体などの抗体を生 じさせることによって得られる。かくして、β−ＣＴ受容体の精製もしくは部分 精製調製物、または高濃度のβ−ＣＴ受容体を有する細胞による免疫化によって 、ＢＡＬＢ／Ｃまたは他の同様のマウス株などの適切な試験動物中でβ−ＣＴ受 容体に対する抗体を生じさせることができる。該動物の膵臓を取り出し、そのリ ンパ球をマウスの骨髄腫細胞株に融合させることができる。公知技術によるハイ ブリッドのスクリーニング後、β−ＣＴ受容体に対する抗体を形成する安定なハ イブリッドを単離する。かかる活性は、抗体の、放射性標識β−ＣＴ（例えば、 １２５■標識β−６丁または３Ｈ−β−ＣＴ）のその受容体への結合を防止する 能力によって示すことができる。次いで、以下に説明するスクリーニング技術の 使用によって、モノクローナル抗体を、その拮抗活性について試験することがで きる。

さらなる研究は、抗イデイオタイプ抗体の使用を含む。抗イデイオタイプ抗体は 、β−ＣＴを指向するモノクローナル抗体に対して生じ、その結果、抗イデイオ タイプは、もちろん、β−ＣＴ結合に関連する活性促進なしで、β−ＣＴ受容体 部位に対する相補的な結合親和性を有する。細胞へのウィルス性結合を遮断する ための抗イデイオタイプ抗体の利用は公知である［ジャーナル・オブ・イムノロ ジー（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ）　（１９８３）、１３１．２５３９−２５４１ま たはＭｅｄ。

■吐（１９８７）　３１７．２１９−２２４１゜β−ＣＴの生物学的活性を調節 する化合物は、慣用のスクリーニング技術、特に、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ技術によっ て同定される。がくしで、有効なβ−ＣＴ拮抗薬は、それらが、β−ＣＴ受容体 受容体圧下でβ−ＣＴの生物学的活性を低下させるか否かを測定することによっ て同定される。１つの好適なβ−ＣＴ受容体受容体圧肪組織もしくは脂肪細胞、 または３Ｔ３−ＬＬもしくは３Ｔ３−Ｆ４４２細胞などの適切な細胞株であると 思われる。他の好適なβ−ＣＴ受容体受容体圧流した膵臓、単離した膵島、膵臓 β−細胞、またはＨＩＴもしくはＲＩＮ細胞などの適切な細胞株である。

ｉｎ　ｖｉｔｒｏスクリーンの例としては、β−ＣＴ源の存在下、かつ、インス リンの存在または不在下で、細胞によるグルコースの摂取および／またはトリア ジルグリセロールの合成に対する有効なβ−ＣＴ拮抗薬の効果を測定することを 含む：対照と比較して、摂取の低下は、拮抗活性を示す。ｉｎ　ｖｉｔｒｏスク リーンのさらなる例は、有効な拮抗薬によるβ−細胞トロピン誘発インスリンお よび／またはアミリン放出の抑制である。

別法としては、脂肪組織もしくは膵島細胞、またはβ−ＣＴ受容体を含む好適な 細胞株由来の血漿膜を受容体結合アッセイで配置することができ、これによって 、拮抗薬の、β−ＣＴのその受容体への結合を防止する能力が、慣用のラジオイ ムノアッセイ、エリザまたは時間分解蛍光技術（ｔｉ＋ｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ 　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によってモニターできる。

β−ＣＴの形成または放出を調節する化合物の性質を測定するためには、まず、 下垂体からのβ−ＣＴ形成の代謝制御の性質を測定することが必要である。これ は、例えば、単離した下垂体の神経中葉、または全下垂体および下垂体細胞株を 種々の濃度の候補分子とインキュベートすることによって、中間代謝産物ならび に生物学的に活性なペプチドおよび非ペプチドホルモンなどのシグナル分子の両 方を測定して、分子がβ−ＣＴの形成および／または放出に対して正の効果また は負の効果のいずれを与えるかを測定することによって測定される。種々のシグ ナルに対する下垂体組繊の応答は、β−ＣＴの形成および／または媒体中へのそ の放出の測定によって測定することができる。次に、同様の方法を使用して、分 子の、このメカニズムを遮断する能力を試験することができる。

β−ＣＴは、前記方法によって、例えば、ＡＣＴＨおよびコルチコトロフィン様 中間ペプチド（ＣＬＩＰ、ＡＣＴＨ１８−３９）などの前駆体分子の特異的な切 断によって形成されてもよい。β−ＣＴ形成の制御方法は、含まれる酵素の作用 を阻害すること、および／または該酵素の合成を抑制することを含む。

特定の化合物がβ−ＣＴの生物学的活性を調節することを測定するための試験方 法は、慣用の試験方法と同様である：例えば、使用した方法は、β−ＣＴの脂質 生成活性の測定に使用される慣用の方法と同様である。

例えば、白色または褐色脂肪細胞を、β−ＣＴおよび標識グルコースの存在下、 試験化合物の存在または不在下でインキュベートすることができる。次いで、慣 用のシンチレーションカウント法によって、試験化合物の存在または不在下で脂 肪細胞中に脂質として取り込まれた標識グルコースの量を測定する。

使用した特定の化合物は、適切な方法によって製造される。例えば、該化合物が β−ＣＴに対して生じた抗体である場合、慣用の抗体形成方法によって製造され る。１つの特定の方法は、試験動物にβ−ＣＴを必要な回数注射し、適切な時間 の後、例えば、１８週間後、試験動物中で形成された抗体を収穫することを含む 。

他の試験方法の例は、試験物質の存在または不在下で、単離した膵島［ビリンガ ム（Ｂ　ｉｌＬｉｎｇｈａｍ）ら、またはジャーナル・オブ・エンドクリノロジ ー（Ｊ。

Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ）　（１９８２）　９４．１２５−１３０］またはＨＩＴ もしくはＲＩＮ細胞などの膵臓β−細胞株をβ−ＣＴとインキュベートし、次い で、インスリンおよび／またはアミリン放出に対する試験物質の効果を測定する ことを含む。

インスリンおよびアミリンの、該島または細胞株からの放出は、慣用のラジオイ ムノアッセイ法によって測定することができる。

膵島および脂肪組織上のβ−ＣＴ受容体部位の同定は、その活性の直接拮抗作用 に対して供給することを可能にする。

本発明の形成、放出または生物学的活性を調節する化合物は、それ自体を投与し てもよく、または、好ましくは医薬的に許容される担体からなる医薬組成物とし て投与してもよい。

したがって、本発明は、β−細胞トロピン（β−ＣＴ）の形成、放出または生物 学的活性を調節する化合物および医薬的に許容される担体からなる医薬組成物を 提供するものでもある。

β−細胞トロピンの形成、放出または生物学的活性を調節する化合物も本発明の 一部であると思われる。

以下、β−細胞トロピンの形成、放出または生物学的機能を調節する化合物を「 本発明化合物」と記す。

本明細書で使用する場合、「医薬的に許容される」なる語は、ヒトおよび獣医学 的使用のための化合物、組成物および成分を包含する。

好適な非ヒト哺乳動物としては、イヌおよびネコが挙げられる。

当該組成物は、所望により、使用説明書を付したノで・ツクの形態であってもよ Ｌ嵐。

通常、本発明の医薬組成物は、経口投与に適しているが、注射および経皮吸収な どの他の経路による投与のための組成物も考えられる。

特に好適な経口投与用組成物は、錠剤およびカプセルなどの単位投与形態である 。す／二剤中に存在する粉末剤などの他の固定化単位投与形態も使用できる。

慣用の製薬業務にしたがって、担体は、希釈剤、充填剤、崩壊剤、湿潤ｉ１、滑 沢剤、着色剤、フレーバー剤または他の慣用の補助剤からなる。

典型的な担体としては、例えば、微結晶性セルロース、デンプン、デンプングリ コール酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、ポリビニルポリピロ１ノドン、ス テアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトｌＪ’７ムまたはンユークロースカ （挙ζｆられる。

最も好適には、当該組成物は、単位投与形態で製剤化される。力）力・る単位投 与は、通常、０．１〜１０００１９、より一般的には、０．１〜５００諺９、特 に、０゜１〜２５０１９の範囲の有効成分を含有する。

好都合には、本発明化合物は、前記で定義した医薬組成物として投与され、この 形態は、本発明の特定の態様を形成する。

■型糖尿病に関連する症状の治療において、本発明化合物は、７０＆９の成人の 合計日用量が０．１〜６０００ｕ、より一般的には約１〜１５００１１９の範囲 であるような方法で、１日１〜６回、前記したような用量で投与される。

以下の実施例は、本発明を説明するが、如何なる場合も本発明を限定するものＩ ａ：１２〜２０週齢の、脂肪過多のラット（ｆａ／ｆａ）および脂肪なしの対照 体（Ｆａ／’＞またはＦａ／Ｆａ）を使用した。

膵臓潅流 ダンモア・アンド拳べＯ−７７−チエイ：／　（Ｄｕｎｍｏｒｅ　ａｎｄ　Ｂｅ １ｏｆｆ−Ｃｈａｉｎ）、ジャーナル・オブ・エンドクリノロジー（Ｊ、Ｅｎｄ ｏｃｒｉｎｏｌ）　（１９８２）　９２．１５．２１に記載の方法によって、前 記の雄性の脂肪過多ラットおよび脂肪なしの同腹の子由来の膵臓を単離し、次い で、潅流した。潅流緩衝液は、ダンモア・アンド・ベロラフ−チェイン（Ｄｕｎ ｍｏｒｅ　ａｎｄ　Ｂｅ１ｏｆｆ−Ｃｈａｉｎ）　（１９８２）（ｌｏｃ、　ｌ ｉｔ、　）の記載に従って、デキストラン（Ｄｅｘｔｒａｎ）　Ｔ４０　（ファ ルマシア（Ｐ　ｈａｒｍａｃｉａ））　３％および高純度ＢＳＡ　１％を含む変 形クレブス−リンガ−重炭酸緩衝液であった。

次いで、単離した調製物を、（「低グルコース」潅流緩衝液で１５分間安定させ た後）以下のもので潅流した＝ １、低グルコース（５，６關ｏ１／ｌ）緩衝液で５分間、２．０．５〜１．　Ｏ ｎｍｏｌ／Ｉβ−ＣＴを添加した１、の緩衝液で５分間、３、高グルコース（１ ６、７ｍｍｏｌ／　Ｉ）緩衝液で１０分間。

流速５．０ｍＡ’／分で、各１分間フラクションを収集した。氷上で、アプロチ ニン（トレイノロール（Ｔ　ｒａｙｓｙｌｏｌ）、バイエル（Ｂａｖｅｒ））　 １８００　Ｋ　Ｉ　Ｕを添加した管中にフラクションを収集した。アッセイする まで、フラクションを−２０°で貯蔵した。

血糖、血漿インスリンおよびβ−細胞トロピンの測定尾の血管から、ヘパリン（ ブラソフ（Ｐ　ｕｌａｒｉｎ）、約２００単位／ＩＩＡ’）およびアブロチン（ トラシロール（Ｔｒａｓｙｌｏｌ）、４００　Ｋ　Ｉ　Ｕ／ｍＡ’）を含有する 管中に血液を採取しく約５冨１）、グルコース濃度の測定直前に試料を除タンパ クし、残存物を遠心した。アッセイするまで、上清血漿を一２０’で冷凍した。

アッセイ。

グルコースアッセイ：酢酸ウラニル（ＵＲＡＣＸベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎ ｇｅｒ））で除タンパクした血液について、グルコースオキシダーゼ／ペルオキ シダーゼ法を使用して分光光度計で測定した。

インスリンアッセイ：ダンモア・アンド・ベロラフ−チェイン（Ｄｕｎｍｏｒｅ 　ａｎｄＢｅｌｏｆｆ−Ｃｈａｉｎ）　（１９８２）　（ｌｏｃ、ｃｉｔ、　） に記載の方法をわずかに変形した慣用のラジオイムノアッセイによって、血漿お よび潅流試料に存在するインスリンを測定した。すなわち、試料は、高力価モル モットのインスリン抗血清の好適な希釈物（５０％結合を与える１：３００００ ）および＋１５ヨウ素化したウシのインスリン（クロラミンＴ法によってヨウ素 化した）で、三重に重複してアッセイした。ラットインスリン（Ｎｏｖａ、）を 標準（血漿アッセイ緩衝液（リン酸ナトリウム）または潅流緩衝液で希釈した） として使用した。第２抗体（ロバの抗−モルモットＩｇ）塗布セルロース（サッ ク−セル（Ｓａｃ−Ｃｅｌ、ワシントン）の添加、および、次なる遠心によって 、抗体結合インスリンを遊離インスリンと分離した。ＬＫＢラックガンマ固体シ ンチレーションカウンターで結合数を測定し、核力’）ン９−１：連結シｆ：Ｐ Ｃ−ＡＴ：ｒｚヒｔ−９−（Ｏｐｕｓ　ＰＣＶ）　テＲＩ　ＡＣＡＬＣプログラ ム（ＬＫＢ）によってインスリン計算を行った。

アミリンアッセイ：ペニンスラ・ラボラトリーズ・リミテッド（Ｐ　ｅｎｉｎｓ ｕｌａＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｌｔｄ、）によって供給された凍結乾燥試薬 を使用して、アミリンをラジオイムノアッセイした。ロバ抗ウサギＩｇ（サック −セル（Ｓａｃ−Ｃｅｌｌ）、ワシントン）を使用して行った結合および遊離ア ミリンの分離以外は、供給者のアッセイ方法に従った。全ての標準的な希釈物（ 潅流緩衝液十アプロチニン（４００ＫＩＵ／■ｌ）および潅流試料を三重に重複 してアッセイした。計数および計算は、インスリンＲＩＡについてと同様に行っ た。

統計学的分析：所望により、不対観察または一対観察に関するメチューデントを 検定を使用した。

懸 単離した潅流脂肪過多ラット膵臓からのインスリンおよびアミリン分泌：β−Ｃ Ｔおよびその結果として起こる高グルコース濃度の影響「高」グルコース濃度切 り替える前に５分間、β−ＣＴ　（０，５〜１．０ｎｓｏｌ／ｉ’）で潅流した 結果、従前に報告されたように［ダンモア・アンド・ベロラフ−チェイン（Ｄｕ ｎｍｏｒｅ　ａｎｄ　Ｂｅ１ｏｆｆ−Ｃｈａｉｎ）　（１９８２）、ｌｏｃ、　 ｃｉｔ、　］インスリンの単相性放出が生じた。ｆａ／ｆａ膵臓からの基底放出 を超えた合計インスリン分泌（Δインスリン）は、脂肪なしの対照体と比較して ４．８倍大きかった（第１表）。アミリン分泌（Δアミリン）は、インスリンの 場合と非常に類似しており、２つのグループ間で同様の差（４，５倍）があった 。インスリン：アミリンのモル比は、単離した膵臓のβ−ＣＴ刺激の間じゅう、 脂肪なしでは４２：１から４８：１に、ｆａ／ｆａでは３１：１から４９：１に 、わずかに増加した。

前β−ＣＴ刺激の後の高グルコースによる潅流の効果は、前記のグルコースだけ の試験とは異なった。高グルコースは、脂肪なしからよりも２，１倍大きい脂肪 過多膵臓からのインスリン放出を誘発し、β−ＣＴで予め刺激されなかった脂肪 過多膵臓からよりも１．７倍大きいインスリン放出を誘発した。アミリン分泌は 、非常に大きく増加した：脂肪分泌は、脂肪なしよりも３．９倍大きく、β−Ｃ Ｔによって予め潅流しなかった脂肪過多のものよりも２．０倍大きかった。

多少の変形を伴ってロッドベル（Ｒｏｄｂｅｌｌ）　（１９６４）の方法によっ て、褐色脂肪細胞を単離した。ハロタン麻酔下で、体重的１５０９の２匹の雄性 ラットから肩甲骨間の褐色脂肪細胞組織を取り出した。グルコース５．６ｍｍｏ ｌ／ｊ！およびウシ血清アルブミン４．０％（Ｗ／Ｖ）と−緒にタレブスーリン ガー重炭酸（ＫＲＢ、　ｐ）Ｉ’７．４）を含有するペトリ皿中に該組織を置い た。いずれの付着白色脂肪も除去し、該組織をＫＲＢ　（５，６ｍｍｏｌ／７グ ルコースおよび４％アルブミン）中で微細に切り刻んだ。３７℃の振盪水浴中で ２時間、グルコース５．６ｗｍｏｌ／／。

アルブミン４％およびコラゲナーゼ（サーバ・ケミカルズ（Ｓｅｒｖａ　Ｃｈｅ ｍｉｃａｌｓ））１、Ｏｍｑ／ｍｅと一緒にＫＲＢ中で該組織を消化した。この 期間じゅう、該緩衝液に気体（０２／ＣＯ２９５＋　５）を通した。

次いで、この消化した組織を２００μ諺メツシユを通して濾過し、新しいＫＲＢ （５，６關ｏ１／ｌグルコースおよび４％アルブミン）に再懸濁し、細胞を８０ ０Ｘｇで１分間遠心した。緩衝洗浄液を除去し、新しい緩衝液５ｍｌに該細胞を 懸濁した。血球計算板を使用して、細胞数を測定するため、この最初の細胞懸濁 液の試料を使用した。

インキュベーション β−細胞トロピン抗血清（８０：１希釈）の存在または不在下、トリチウム化グ ルコース（Ｄ−［３−３Ｈ］グルコース、０．５μＣｉ／バイアル）の存在下、 異なるインスリン（１４、４ｎｆｆ１ｏｌ／ｌ）またはβ−細胞トロピン（１０ ｒ＋ｍｏｌ／　ｌ）を含有するＫＲＢ　（５，６ｍｍｏｌ／ｒグルコースおよび ４％（ｗ／ｖ）アルブミン）中、３７℃の振盪水浴中で１時間、褐色脂肪細胞（ 懸濁液５０μりをインキュベートした。グルコースの脂質中への取込みは、非水 性ンンチレーション液（ベータフルーア（Ｂｅｔａｆｌｕｏｒ）、ナショナル・ クセイアグナスティクス（ＮａｔｉｏｎａｌＤ　１ａｎｏｓｔｉｃｓ）中に一晩 抽出し、次いで、シンチレーションカウンター上でベータ発光を測定することに よって測定した。この期間じゅう、間断なく、脂肪細胞に気体を通した。

ベロラフ−チェイン（Ｂ　ｅｌｏｆｆ　−Ｃｈａｉｎ）ら（１９８０）によって 開示された方法によって、マウスの神経中葉のインキュベーションから、この研 究で使用したβ−細胞トロピンを分離した。

β−細胞トロピン抗血清の生起 ０．１Ｍリン酸緩衝液１ｍｌにβ−細胞トロピン（４０Ｑｎ■ｏｌ）およびチロ グロブリン（１００ｎｍｏｌ）を溶解した。グルタルアルデヒド（０，０２Ｍ溶 液１．５冨ｌ）を１５分間かけて滴下し、該混合物を４℃で一晩インキユベート した。次いで、′該コンジュゲートを蒸留水に対して一晩透析して、グルタルア ルデヒドを除去し、該コンジュゲートを、各々、−次免疫および２つのブースタ ー注射を行うのに充分な、合計５０％、２５％および２５％のアリコツトで凍結 乾燥した。このコンジュゲートの量は、１匹のウサギを免疫化するのに充分であ った。

−次免疫のために、凍結乾燥したコンジュゲートを水道水１１／中に取り、フロ イント完全アジュバント１．５ｍｌで乳化し、０．１禦ｌのアリコツトを、ダッ チ・バーフロップ・ウサギ（Ｄｕｔｃｈ　ｈａｌｆｌｏｐ　ｒａｂｂｉｔ）の背 中および側腹部の多数の部位に陵内注射した。

ブースティグ免疫のため、凍結乾燥したコンジュゲートを水道水１ｍｌに取り、 フロイント完全アジュバント１．５ｍｌで乳化し、０．ｌｌ１１のアリコツトを 、−次接種の後１２週目詰よび１８週目間多数の部位に陵内注射した。二次ブー スター免疫後３日目に開始して、毎日、抗体力価の測定のために血液試料を採取 した。

血液を、室温で４時間、次いで、４℃で一晩、凝固させた。慣用のラジオイムノ アッセイ系で、抗体力価を測定した。

懸 β−細胞トロピンは、脂質中へのグルコースの取込み、すなわち脂質生成の、イ ンスリンと同様の刺激を生じた。インスリン処理細胞および対照間の差異ならび にβ−ＣＴ処理細胞および対照間の差異は、共に、統計学的に有意であった（Ｐ ＜０．０５）。インスリンおよびβ−細胞トロピン間の効果には、有意な差異は なかった。β−ＣＴ抗体は、β−ＣＴ応答を完全に遮断し、脂質生成の基底速度 を有意に低下させた。′ ロ０ロロロロロＯロロロ ローローローロクロー １−Ｊ　−Ｊ−ｃｖｃヘヘーー ａｔｏｍ　０００００Ｄｔ／Ｌｌ／ＩＱ田Ｕ、、　、、、、、Ｎ＠　ＰＣＴ／Ｇ Ｂ　９２１０１０７Ｂフロントページの続き （７１）出願人　チェイン、ベンジャミン・マイケルイギリス国ロンドン・エヌ ダブリュ１１・８エイジエイ、フィンチレイ・ロード８２９番（７２）発明者　 コーソーン、マイケル・アンソニーイギリス国すリー・ケイティー１８・５エツ クスキユー、ニブツム、ニー・トウリー・ボトム・ロード、グレート・ページ（ 番地の表示ない　スミスクライン・ビーチャム・ファーマシューティカルズ （７２）発明者　ベロツフーチェイン、アンイギリス国エムケー１８・１イージ ー、ザ・ユニバーシティ・オブ・パツキンガム （番地の表示なし）

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．β−細胞トロビンの形成、放出または生物学的活性を調節する化合物。
2. ２．β−細胞トロピン（β−ＣＴ）の形成、放出または生物学的活性を調節する 化合物および医薬的に許容される担体からなる医薬組成物。
3. ３．β−細胞トロピン（β−ＣＴ）の形成、放出または生物学的活性を調節する 化合物の非毒性有効量を投与することからなる、哺乳動物のＩＩ型糖尿病または ＩＩ型糖尿病に関連する症状の治療方法。
4. ４．高インスリン血症および高インスリン血症に関連する症状の治療のための請 求項３記載の方法。
5. ５．高インスリン血症に関連する症状が高脂血症、高血圧およびアテローム性動 脈硬化症である請求項４記載の方法。
6. ６．肥満症の治療のための請求項３記載の方法。
7. ７．β−ＣＴの生物学的活性を調節する化合物がβ−ＣＴ拮抗薬である請求項３ 〜６のいずれか１項記載の方法。
8. ８．β−ＣＴ拮抗薬が非競合拮抗薬である請求項７記載の方法。
9. ９．β−ＣＴ拮抗薬がβ−ＣＴに対して特異的な抗体である請求項７または８記 載の方法。
10. １０．β−ＣＴ拮抗薬が競合β−ＣＴ拮抗薬である請求項７記載の方法。
11. １１．競合β−ＣＴ拮抗薬が架橋β−ＣＴまたはβ−ＣＴの架橋断片である請求 項１０記載の方法。
12. １２．有効治療物質として使用するための、β−細胞トロピン（β−ＣＴ）の形 成、放出または生物学的活性を調節する化合物。
13. １３．ＩＩ型糖尿病またはＩＩ型糖尿病に関連する症状の治療における使用のた めの、請求項１２記載の化合物。
14. １４．高インスリン血症および高インスリン血症に関連する症状の治療のための 請求項１２または１３記載の化合物。
15. １５．高インスリン血症に関連する症状が高脂血症、高血圧およびアテローム性 動脈硬化症である請求項１４記載の化合物。
16. １６．肥満症の治療のための請求項１２記載の化合物。
17. １７．β−ＣＴの生物学的活性を調節する化合物がβ−ＣＴ拮抗薬である請求項 １２〜１６のいずれか１項記載の化合物。
18. １８．β−ＣＴ拮抗薬が非競合拮抗薬である請求項１７記載の化合物。
19. １９．β−ＣＴ拮抗薬がβ−ＣＴに対して特異的な抗体である請求項１７または １８記載の化合物。
20. ２０．β−ＣＴ拮抗薬が競合β−ＣＴ拮抗薬である請求項１７記載の化合物。
21. ２１．競合β−ＣＴ拮抗薬が架橋β−ＣＴまたはβ−ＣＴの架橋断片である請求 項２０記載の化合物。
22. ２２．ＩＩ型糖尿病またはＩＩ型糖尿病に関連する症状の治療用薬物製造のため の、β−細胞トロピン（β−ＣＴ）の形成、放出または生物学的活性を調節する 化合物の使用。