JPH06508524A - アンギオテンシンｉ変換酵素の遺伝的多形性の試験手段及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト変換酵素（ＡＣＥ）をコードする遺伝子に対応するｃＤＮＡのクローニング により、ヒトにおけるこの遺伝子のレベルでＤＮＡの多形性を研究するために該 ｃＤＮＡをＤＮＡプローブとして使用できるようになった。

この多形性研究の関心は多種多様であった。一方では、血漿中ＡＣＥ濃度は安定 であることが知られており、対立遺伝子が主要遺伝子に与える効果は家族調査後 に提案されていた。従って、ＡＣＥの遺伝子自体が主要遺伝子の効果に関与して いるか否かを知り、遺伝子型によるＡＣＥ濃度の個体間の差の大きさを知ること が注目されるのは当然であった。他方、会合又は結合試験により動脈高血圧のよ うな所定の疾病における遺伝子の関与を試験するために使用可能な遺伝子マーカ ーを実現することにも関心が寄せられた。

臨床面では、８０人の正常個体で血漿中ＡＣＥ濃度が測定され、その遺伝子型が 決定された。ＡＣＥの遺伝子型に応じて個体のＡＣＥ濃度間には著しい差のある ことが確認された（Ｒｉｇａｔ　Ｂ、ら、　（１９９０）、　Ｊｏｕｒｎａｌ　 ｏｆ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、　１３４３−１３４６ ）　。

多形性の研究はサザン法を使用して行われた。種々の個体のＤＮＡが数種の制限 酵素で消化された。ＡＣＥのｃＤＮＡプローブとハイブリダイゼーション後、い くつかのフラグメントは全個体で同一寸法をもたないことが判明した。

酵素切断が異なっても多形性フラグメント間の寸法差は非常に似通っているとい う事実から、この多形性はＡＣＥの遺伝子中のあるＤＮＡ配列（以下、挿入配列 と呼称する）の有無に起因するという結論に至った。

本発明は、遺伝子のエキソン１６とエキソン１７との間のイントロン１６のヌク レオチド構造自体を決定後、このイントロン中の挿入配列を位置付けたことによ り達成された。イントロン、より特定的には挿入配列に隣接する領域と挿入配列 それ自体とを配列決定することにより、発明者らは挿入配列の性賀を決定するこ とができた。この挿入配列はＡｌｕ型反復配列であった。

従って、本発明はこの知見によって得られた産物、特にヌクレオチドフラグメン ト、より特定的には例えばＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａ ｃｔｉｏｎ。

ポリメラーゼ連鎖反応の略称）型の重合による連鎖増幅のような遺伝子増幅法で 使用可能なプライマーに係る。

以下の文中で参照する図１は、挿入配列を有する被験者（Ｉ　Ｉ）と挿入配列を 欠失する被験者（ＤＤ）とに由来する対立遺伝子中のイントロン１６の一般構造 を示す。図２（ａ）　、２　（ｂ）及び２（Ｃ）はＡＣＥ遺伝子転子イントロン １６及びイントロン１６の両側即ち隣接するエキソン（エキソン１６及び１７） の配列を示す。イントロン１６のヌクレオチド（ｎ　ｔ）のみに番号を付けた。

個体によって存在する場合と存在しない場合がある配列は、ヌクレオチド１４５ １〜１７３８からなる。

本発明はより特定的には、少なくとも８ヌクレオチドからなり、イントロン１６ のＤＮＡに含まれる配列（図１のｎｔ１〜１８５６）、従って最大１８５６ヌク レオチドを有することを特徴とする全ＤＮＡフラグメントに係る。しかしながら 、本発明はより特定的には、−配列ｎｔ１４５１〜１７３８　（挿入配列）の全 部又は一部を含むことを特徴とするＤＮＡフラグメント、−挿入配列の内側に完 全に配置されていることを特徴とするＤＮＡフラグメント、 一前記挿入配列の隣接領域の少なくとも一方を含むことを特徴とするＤＮＡフラ グメント、 −その配列が配列ｎｔ１４５１〜１７３８　（挿入配列）の外側にあることを特 徴とするＤＮＡフラグメントのうちいずれかに係る。

有利には、これらの種々のＤＮＡフラグメントは１５〜４０ヌクレオチドを含む 。

本発明はより特定的には、上記フラグメントから選択され、特にＰＣＲ型の配列 増幅法で使用可能なプライマーの構築に適用可能な別個のフラグメントからなる 対に係り、これらの別個のフラグメントはオーバーラツプしないヌクレオチド配 列を含む。

これらのプライマー対は例えば以下の特徴を有する。

−その固有配列は、イントロン中で前記２つのプライマーに対応する２つの配列 の間に位置するように前記イントロンのＤＮＡ中に配置された中間配列が挿入配 列（ｎｔ１４５１〜１７３８）の少なくとも一方の末端（ｎｔ１４５１又は１７ ３８）及び該末端に隣接する領域とオーバーラツプするように構成される。

−２つのプライマーのうちの一方の配列が挿入配列の一方の末端（ｎｔ１４５１ 又は１７３８）にオーバーラツプするか又はその外側に位置しており、他方のプ ライマーの配列が挿入配列の他方の末端（ｎｔ１７３８又は１４５１）にオーバ ーラツプするか又は同様にその外側に位置する。

＝２つのプライマーのうちの一方の配列が挿入配列の一方の末端（ｎｔ１４５１ 又は１７３８）にオーバーラツプするか又はその外側に位置しており、他方のプ ライマーの配列が挿入配列に含まれる。

従って、本発明はより特定的にはアンギオテンシン１変換酵素の遺伝子（ＡＣＥ 遺伝子）中の多形性の検出方法に係り、該方法は特にハイブリダイゼーション又 は配列増幅法により調査し、ＡＣＥ遺伝子のイントロン１６中の挿入配列ｎｔ１ ４５１〜１７３８の有無を検出することを特徴とする。例えば、下記に定義する プライマー対の１種を使用してＰＣＲ型の方法を実施し、挿入配列の末端部分の 少なくとも一方と２つの隣接領域の少なくとも一方とを同時に含む可能性のある 増幅鎖の有無を検出する。

検出が陽性であるならば挿入配列は存在しないし、結果が陰性であるならばこの ような挿入配列は存在しない。

多形性の検査を必要とする被験者（特にその血清）に由来する細胞のゲノムＤＮ Ａにアクセスするためにあらゆる慣用方法を利用できることは当業者に自明であ る。

本発明の方法は例えば次のように実施することができる。

該方法は、 ａ）第１のプライマーとＡＣＥ遺伝子のＤＮＡとのハイブリダイゼーションを可 能にする条件下で、ＡＣＥ遺伝子、特に第１のプライマーに予めアクセスできる ようにしておいたイントロン１６を含む被験生物サンプルをヌクレオシド三リン 酸及び重合誘導剤（ポリメラーゼ）の存在下で前記第１のプライマーと接触させ 、遺伝子のｃＤＮＡにハイブリダイズしたこれらのプライマーから重合し、場合 により、ハイブリダイズしたプライマーの伸長産物とイントロンとの間に形成さ れるデュプレクスを生成する段階と、ｂ）検出すべきＤＮＡからプライマーの伸 長産物を「分離」するように、段階ａ）で得られたデュブレクスを変性させる段 階と、 Ｃ）得られた伸長産物を、（１）第１のプライマーに対して非相補的であって、 （２）先に形成された伸長産物の配列に対して相補的なヌクレオチドの配列を有 する第２のプライマーと接触させる段階と、 ｄ）場合により、過剰に使用される第１及び第２のプライマーと、補助合成用鋳 型として使用される新しい伸長産物の生成に必要な試薬との存在下で、使用され るプライマーの伸長産物から検出するために十分な量が得られるまで段階ａ）及 びｂ）及びＣ）を繰り返す段階と、ｅ）挿入配列（ｎｔ１４５１〜１７３８）の 少な（とも一部を有する伸長産物の存在を（場合により）検出する段階とを含む 。

上記検出方法に関する技術をより詳細に把握するため又はこの方法の変形を考案 するためには、米国特許第４６８３２０２号及び４６８３１９５号に記載の原理 を参照するとよい。

多形性領域の少なくとも一部の両側に配置された２つのプライマーを使用するこ とにより、例えば増幅フラグメントのアガロースゲル上の移動及び臭化エチジウ ム染色を介して、挿入配列の有無に起因する寸法差を容易に可視化することがで き、従って、ＤＮＡ増幅反応により被験個体の表現型を決定することができる。

本発明は従って、ＡＣＨの正常及び異常値に基づいて多形性を決定するための方 法、特にＡＣＥの血漿中濃度の増加を伴うことが既に観察されている（例えば類 肉腫を有する糖尿病個体における）症状に及ぼすその影響を試験するための方法 を提供する。

更に、本発明の方法を実施することにより得られる結果に基づき、ＡＣＨの多形 性が血管作用性ペプチドの代謝及び高血圧症の機序に関与する程度をより十分に 把握することができよう。

本発明の方法はアテローム性動脈硬化症、肉芽腫症及び糖尿病併発症のｉｎ　ｖ ｉｔｒｏ診断に適用すると特に有利である。

Ａ＞トｃｐン１ｓ　ＡＡＴＧＧＧＧＣＣＴＧＧＧＧＧＣＡＧＴＧＣＡＧＧＣＣＣ ＣＡＧＡＧＡＧＡＣＣＡＡＧＴＧＣＡＡＡＡＧＧＡ（Ｍ−Ｊｐｉ）ＧＴＡＣＡＧ ＣＴＣＡＴＴＧＣＣＴＣＴＣＣＴＴＣＣＴＣＣＴＧＣＭａ／ｅＴＴＧＧＧＸ；Ｇ （ＹＣＡＧＧＣＡτＧＡＧＡＡＴＣＧＣＴＴＧＡＧＣＣＣＡＧＣＣＡＧＧＧＣＡ ＡτＭ講ＣＣＣＴＧＣＡＧＧＴｎ？Ｇ？ＧＣＣＣＡＧＧＣＣＧＧαｒｃＭＴＡＡ ＧｃｃＡｃ；午ソン１８　ＧＯ？λ丁σ丁ＡＣ入ＴＧＣλｍｃテＣＧＴＧＧλＧ ＧτＣτλＴＧＴＡＣＣ入Ｇ入Ｃ入ＣＣλＴＣＣＣＴＧＧ入ＧＣｋｋＧλＣＣτ α込ＧＣＧＧＣτＣτ〒Ｃクーα猷χゴＧＣＡＧＣＣ入ＣτＣτＡαゴＣＡＡＣ Ｃ？℃ＣＡ？ＧＣＣ？ＡＣＧＴＧＣＧＣＣＧＧＧＣＣＣＴにＣＡＣＣＧｉコ（ゴ ＡＣＧＧＧＧＣＣＣＡＧＣＡＣＡＴＣ入入ＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＣＣＣＡＴＴＣ Ｃ’ｌ’ＧｃｒＣＡＣＣ’ｌ’ＧＣ’！’ＧＧ／ＦＩＧＬＩＲＥ　２　（Ｃ） フロントページの続き （７２）発明者　コルポル、ビニール フランス国、７５００７・パリ、リュ・ドウ・セーブル、８８

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．少なくとも８ヌクレオチドからなるＤＮＡフラグメントであって、イントロ ン１６のＤＮＡに含まれる配列（図２のｎｔ１〜１８５６）、即ち最大１８５６ ヌクレオチドを有することを特徴とするＤＮＡフラグメント。
2. ２．配列ｎｔ１４５１〜１７３８（挿入配列）の全部又は一部を含むことを特徴 とする請求項１に記載のＤＮＡフラグメント。
3. ３．挿入配列の内側に完全に配置されていることを特徴とする請求項２に記載の ＤＮＡフラグメント。
4. ４．前記挿入配列の隣接領域の少なくとも一方を含むことを特徴とする請求項２ に記載のＤＮＡフラグメント。
5. ５．その配列が配列ｎｔ１４５１〜１７３８（挿入配列）の外側に位置すること を特徴とする請求項１に記載のＤＮＡフラグメント。
6. ６．１５〜４０ヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１から５のいずれか 一項に記載のＤＮＡフラグメント。
7. ７．特にＰＣＲ型の配列増幅法で使用可能なプライマーの構築に適用可能であり 、オーバーラップしないヌクレオチド配列を含む夫々請求項１から６のいずれか 一項に記載の別個のフラグメントからなる対。
8. ８．その固有配列は、イントロン中で前記２つのプライマーに対応する２つの配 列の間に位置するように前記イントロンのＤＮＡ中に配置された中間配列が挿入 配列（ｎｔ１４５１〜１７３８）の少なくとも一方の末端（ｎｔ１４５１又は１ ７３８）及び該末端に隣接する領域とオーバーラップするように構成されること を特徴とする請求項７に記載のプライマー対。
9. ９．２つのプライマーのうちの一方の配列が挿入配列の一方の末端（ｎｔ１４５ １又は１７３８）にオーバーラップするか又はその外側に位置しており、他方の プライマーの配列が挿入配列の他方の末端（ｎｔ１７３８又は１４５１）にオー バーラップするか又は同様にその外側に位置することを特徴とする請求項６に記 載のプライマー対。
10. １０．２つのプライマーのうちの一方の配列が挿入配列の一方の末端（ｎｔ１４ ５１又は１７３８）にオーバーラップするか又はその外側に位置しており、他方 のプライマーの配列が挿入配列に含まれることを特徴とする請求項６に記載のプ ライマー対。
11. １１．アンギオテンシン１変換酵素の遺伝子（ＡＣＥ遺伝子）中の多形性の検出 方法であって、特にハイブリダイゼーション又は配列増幅法により調査し、ＡＣ Ｅ遺伝子のイントロン１６中の挿入配列ｎｔ１４５１〜１７３８の有無を検出す ることを特徴とする方法。
12. １２．請求項８から１０のいずれか一項に記載のプライマー対を使用して特にＰ ＣＲ型の配列増幅法を実施し、挿入配列の末端部分の少なくとも一方と２つの隣 接領域の少なくとも一方とを同時に含む可能性のある増幅鎖の有無を検出するこ とを特徴とする請求項１１に記載の方法。