JPH06508114A - パリトキシン関連プロドラッグおよびその投与方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 バリトキシン　プロドラッグおよび ｉ旦段二方造 皮血豆！ 本発明は、バットキシンのプロドラッグおよびそ１７）関連化合物、並びにその ようなプロドラッグを標的に同はテ放出すれる薬剤と共に投与することに関する 。この投与プロトコルでは、標的に同けて放出される薬剤が毒性薬物を局所的に 放出する媒介となり得る。

！量ユ亘 ／ｌｌトンンは、江江旦」属の熱帯腔腸動物がら単離された、非常に毒性が高く 、非タンパク貫禄で、比較的低分子量の海洋天然生成物である。珊瑚のｈ江■ｎ ｔｏｘｉｃａの毒性は、まず、古代ハワイ人によって認識された。特殊な戦士た ちは、戦いの前に、槍の穂先に珊瑚の滲出物を塗り付けるように指示された。近 代になって、この言伝えによって、ハワイ大学の研究者たちは、マウイ島のハナ （Ｈａｎａ＞の近くでｈｕユ赳圧■」を含む１連の潮溜りを再発見したのである ；　Ｍｏｏｒｅ、Ｒ，Ｅ、ら、０ｃｅａｎｕｓ　（１９８２）２５工ｉ：　５４ −６３゜これらの潮溜りで収集された珊瑚から、高度に精製された毒素が１９７ １年に単離され、その化学構造がＭｏｏｒｅ、　Ｒ，Ｅ、ら、正−υＬ旦胞１− 兆瓜（１９８１）■１３：２４９１によって、そして、別個にＵｅＩＩｕｒａ、 　Ｄ、ら、Ｔｅｔ上ｅｔ　（１９８１）　２２：２７８１によって報告された。

後者は、より豊富な種であるｈ旦ユ因ｔｕｂｅｒｅｕｌｏｓａがら毒素を単離し た。パット牛ジンカルボン酸、ホモパリトキシン、ビスホモパリトキシン、ネオ バリト牛シン、およびデオ牛シバリド半シンを含む、さらなる毒素関連化合物も また同定された（Ｗａｔｔｅｎｂｅｒｇ、　Ｅ、Ｖ、ら、江肛区」以（１９８９ ）　４９：５Ｈ７−５８４２、およびＵｅｍｕｒａ、　Ｄ、ら、Ｔｅｔｒａｈｅ ｄｒｏｎ　（１９８５）　唾：１００７−１（１１７）。図１にこれらの化合物 の構造を示す。追加的微量成分も、紐江珪且の種の中でしばしば検出されてきて いる。

図１に示すように、パリトキシンは１１５位にアミ７基を有し、このアミン基が カルボン酸で誘導されて、アシル化バリトキシン誘導体が得られ、この誘導体は 、天然のパリトキシンの１００〜１０００倍も細胞毒性が弱いことが示されてい る（Ｗａｔｔｅｎｂｅｒｇ、ＥＪ、ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　（１９ｇ９）　 ４９：５８３７−５８４２、および０ｈｉｚｔ＋ｍｉ、Ｙ、ら、　Ｐｈａ　ｔａ ａｃｏｌ　ｘ　丁ｈｅｒ　（１９８０）　ｌｕｎｇ：２０９−２１２）　。

このようなアシル化は、分析および構造解析研究に用いられる誘導体に限定され てきた。Ｈｉｒａｔａ、　Ｙ、ら、ｈ」ニアｅｍ　（１９７９）　５１：１８７ ５−１８８３は、ｐ−ニトロフェニルアセテートによってパリトキシンをアセチ ル化して、Ｎ−アセチルパリトキシンを生成することを記載した。この化合物は 、Ｕｅｍｕｒａ、　Ｄ。

ら、シ■−しｌ　（１９８０）ｉｌ：４８５７−４８６０．ＭａｃＦａｒｌａｎ ｅ、Ｒ，Ｄ、ら、Ｊｍ　Ｃｈｅｗ　Ｓｏｃ　（１９８０）　辻■Ｄ：８７５−８ ７６、およびＭｏｏｒｅ、　Ｒ，Ｅ、、Ｐｒｏ　ｓｓ　’ｎ　ｔ　ｅ　Ｃｈｅｍ ｉｓｔ　Ｏｒ　ａｎｉｃ　Ｎａｔｕｒａｌ　ｏｄｕｃｔｓ（１９８５）　４８： ８２−２０２によっても記載された。さらに、Ｍｏｏｒｅ、　Ｒ２Ｅ、ら、Ｌハ 」■１」匹（１９８０）庄ニア３７０−７３７２、および上述のＭｏｏｒｅ　（ １９８５）は、Ｎ−（ｐ−ブロモベンゾイル）パリトキシンを調製シ、Ｎ−（ｐ −ブロモベンゾイル）ビスホモパリトキシンｆ）ＫＵｅｍｕｒａら（上述）によ って調製された。Ｌｅｖｉｎｅ、　Ｌ、ら、二ｃｏｎ　（１９８８）’ｎ■ｎ： ０１５−１１２１は、ハリト牛シンノラシオイムノア・２セイに用いるための、 Ｎ−３−（４−ヒドロキシー３−＋　２５　（−ヨードフェニル）プロビオニル パリト手シンの調製をご２載しており、５ａｃｈｉｎｖａｌａ、　Ｎ、Ｄ、ら、 未発表結果（１９８５）は、Ｎ−（４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロへ牛サ ンー１−カルボ牛シル）パリトキシン、およびＮ−（３−（２−ビワジルジテオ ）プロピオニル）パリトキシンを、パリトキシンの免疫毒性およヒ免疫原の産生 における、タンパク質への接合のためのハプテンとして調製した。

インビトロのアッセイでは、上記のアミノ基のアシル化誘導体は、天然の分子よ り毒性が弱いことが示された。０ｈｉｚｕｓｉ、　Ｙ、、および５ｈｉｂａｔａ 、　Ｓ、、Ｊ　Ｐｈａｒｍａｃｏ　Ｅｘ　Ｔｈｅ　（１９８６＞■虹Ｈ：　２０ ９−２１２は、単離されたモルモットの精管の収縮を誘発する活性が、パリトキ シンより１００倍もＮ−７セチルパリト牛ンが低いということを示した。Ｗａｔ ｔｅｎｂｅｒｇ、　Ｅ４−ら、ｈ匹肛」且（１９８９）　ｉｉ：５８３７−５８ ４２は、Ｎ−（ｐ−ブロモベンゾイル）パリトキシンおよびＮ−アセチルパリト キシンが、３Ｔ３細胞に結合した表皮成長因子を低下させるように変えるのに、 少なくとも１００倍効果が低いということ、そして、これらも天然のパリトキシ ンより毒性が低いということを示した。ＥＬ−４マウスＴ−リンパ球を用いた、 追加的細胞毒性アッセイ（Ｈｅｗｅｔｓｏｎ、　Ｊ。

Ｆ、ら、ｕ盈■」（１９８９）　皿：Ａ１１９１）が、本発明者らによって示さ れ、パリトキシンとＮ−アセチルパリトキシンとの間の毒性の差が５００倍まで とされた。Ｗａｔｔｅｎｂｅｒｇら（上述）は、Ｎ−７シル化パリトキシンは実 際には非活性であり、残された細胞毒性は混入しているパリトキシンの影響によ るものである、と述べている。

調製されたＮ−アシル化バリトキシン誘導体の中には、酵素的加水分解のための 基質として設計されたものはなかった。

活性の局所的生成をなし得る技術を利用するために、本発明の化合物は、生物学 的触媒による開裂を起こし易い形態で提供される。

標的に向けたプロドラッグ転化を得ようとする初期のアプローチでは、局所的細 胞内アミダーゼを用いて、アミドプロドラッグの加水分解を行うことが提案され た。特に、シクロホスファミドは、特定の上皮腫瘍において高められると考えら れていたホスファミダーゼによって活性化されるように設計された（Ｇｏｍｏｒ ｉ、　Ｇ、、Ｐｒｏｃ　ＳＯＣＥＸ　Ｂｉｏｌ　Ｍｅｄ　（１９４Ｂ）　６９： ４０７）。シクロホスファミドは、医療的に有用なものではあるが、その場での 開裂についての初期の理論は不正確であることがわかり、一般に、腫瘍細胞にお いて、選択的にプロドラッグを変換する酵素を発見することが困難であった。さ らに最近のアプローチでは、酵素抗体複合体を用いて、プロドラッグ加水分解酵 素を、選択的に標的組織に送達することに焦点が置かれてきた（Ｓｅｎｔｅｒ、 　Ｐ、Ｄ、ら、ＰＮＡＳ　（１９８８）　８５＋４８４２−４８４６；　５ｅｎ ｔｅｒ、Ｐ、Ｄ、ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　（１９８９）４９：５７８９−５ ７９２：Ｂａｇｓｈａｗｅ、　Ｋ、Ｄ、、紅」」ＩＫ虹（１９８９）　６０：２ ７５−２８１；米国特許第４．９７５．２７８号；　Ｂａｇｓｈａｖｅ、に、Ｄ 、ら、　ｒ　Ｊ　Ｃａｎｃｅ　（１９８８）　５８ニア００−７０３；　Ｋｅｒ ｒ、Ｄ、Ｅ、ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｉｍｍｕｎｏ土■工（１９９ ０）　３１：２０２−２０６：　１９８８年１０月６日公開のＰＣＴ出願第ＷＯ ３８１０フ３７８号、　１９８９年２月８日公開のヨーロッパ特許第３０２．４ ７３号：および米国特許第４．９７５．２７８号。このアプローチに関する一般 論については、５ｅｎｔｅｒ、　Ｐ、Ｄ、ら、ｕ上ｌ」（１９９０）　４：１８ ８−１９３を参照のこと。

このアプローチによると、複合体の形の酵素を、固形膿瘍に対するモノクローナ ル抗体を標的として、膿瘍部位でのみ活性化するプロドラッグを送達することに よって、癌を治療するために、酵素／プロドラ・ノブの組合せが用いられる。プ ロドラッグの投与は、酵素複合体が腫瘍の最適部分に位置し、正常な組織および 血漿を取り除くまで遅らされる。用いられた酵素／プロドラッグの組合せには、 アルカリホスファターゼ／エトポンドホスフェート（Ｓｅｎｔｅｒ　Ｐ、Ｄ、ら 、ＰＮＡＳ　（１９８ｇ）８５　：４８４２−４８４６）および細菌カルボキシ ペプチダーゼＧ２／ｐ−Ｎ−ビス−（２−クロロエチル）−アミノベンゾイルグ ルタミン酸（Ｂａｇｓｈａｗｅ、　Ｋ、Ｄ、ら、Ｂｒ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ　（１ ９８８）　５８ニア０Ｏ−７０３）、およびペニシリンＶアミダーゼ／ドキソル ビシンアミド（Ｋｅｒｒ、　Ｄ、　Ｅ。

ら、（１９９０）上述）が含まれる。

ｌ豆旦笠丞 本発明は、上述のプロドラ・ノブ活性系において、ペニシリンアミダーゼによっ て開裂可能であり、そのために毒素としテ有用な、パリトキシンの新規なアミド および天然に生じたアナログを含む、パリトキシン関連化合物のプロドラッグを 提供する。これらのアミドは、フェニルアセチルアミド、ヒドロキシフェニルア セチルアミド、フェノキシアセチルアミド、またはヒドロキシフェノキシアセチ ルアミドでアル。パリトキシン類のプロドラ・ノブを用いることによって、標的 化剤が使用可能な細胞または組織のいずれかをも標的とした毒性が得られる。

上述のように、本発明は、ペニシリンアミダーゼ開裂可能なプロドラッグを参照 して説明されるが、本発明には、生物学的触媒で開裂可能なあらゆるパリトキシ ンプロドラッグを用いる、化合物および方法が含まれる。

１つの局面においては、本発明は、パリトキシン、パリトキシンカルボン酸、ホ モパリトキシン、ビスホモパリトキシン、イソパリトキシン、ネオパリトキシン 、デオキシパリトキシン、および天然に生じた共存アナログからなる群から選択 される、パリトキシン関連プロドラッグを含有する薬学的組成物に関し、所望で ない細胞または組織の作用を、これらのプロドラッグを投与することによって破 壊または損傷する方法に関する。この方法は、典型的には、パリトキシン関連毒 素をプロドラッグから放出し得る、関連の標的に向けた生物学的触媒を投与する ことを包含する、プロトフルによって行われる。

他の局面においては、本発明は、パリトキシンおよびそのアナログの特異的プロ ドラッグに関する。フェニルアセチル誘導体、ヒドロ牛ジフェニルアセチル誘導 体、フェノキシアセチル誘導体、またはヒドロキシフェノキシアセチル誘導体を 含む、ペニシリンアミダーゼで開裂可能な形態のアミドプロドラッグが好ましい 。

図面の簡単な説明 図１は、パリトキシンおよびいくつかの天然に生じた共存アナログの構造を示す 。

図２は、ペニシリンアミダーゼの存在下における本発明のプロドラッグ形態およ びパリトキシン形態の細胞毒性を示すグラフである。

図３は、ペニシリンアミダーゼの存在下におけるプロドラック、Ｎ−アセチルパ リトキシンおよびパリトキシンの細胞毒性を示すグラフである。

Ｕを　るための≦熊 本発明は、組織を標的とし得る特定の生物学的触媒によって開裂し得るプロドラ ッグに変換された、パリトキシン関連の毒素に関する。本発明の組成物は、パリ トキシンおよびそのアナログの顕著な毒性、ならびにこれらトキシンの官能基が 誘導体化してプロドラッグ形態が得られることを利用する。

パリトキシンおよびそのアナログは天然源から単離され、パリトキシンは現在で は市販されている。最近、６４個のキラル炭素および従って１０２１個の可能な 異性体を含む、パリトキシンカルボン酸の全ての合成が報告されている（　Ａｒ ｍｓｔｒｏｎｇ。

Ｒ，Ｗ、ら、Ｊ　Ａｍ　Ｃｈｅｗ　Ｓｏｃ　（１９８９）　１１１７５２５−７ ５３０）。ノくリドキシンの化学、毒物学および薬理学についての総説が、Ｈａ ｂｅｒｍａｎ、　Ｅ、、Ｔｏｘｉｃｏｎ　（１９８９）　ｕ」且：１１７１−１ １８７およびＨｉｒａｔａ、　Ｙ、ら、Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｎａｔｕｒａ ｌ　Ｔｏｘｉｎｓ、第３巻、１１章、ノ寸１ノドキシンの化学および薬理学、Ｔ ｕ、　Ａ、Ｔ、編（１９８ｇ）　Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ、、　Ｎ ｅｗ　Ｙｏｒｋ、　３７−４５頁により公表されて（Ｘる。）ぐリドキシンおよ びそのアナログ、ホモノ（リドキシン、ビスホモノ＜　パリトキシン、ネオパリ トキシン、デオキシ、パリトキシン、イソ示す。ハ江止ｎ種に共存する天然に生 じたアナログ力ｆさら（二発見されることもあり得る。従って、本明細書で（ま 、］（１ノドキシン「およびその天然に生じた共存アナログ」の上述の形態は、 上述の化合物自体、および上述のアナログと共（こ、ム打■慕種に生じる同様の 構造の関連する任意の化合物を指す。

パリトキシンはきわめて毒性であり、０．０２５−０．４５μｇ／ｋｇの範囲で の２４時間静脈投与量でのＬＤｓｓを有し、これ（よ種ζこ依存する。筋肉内、 皮下および腹腔的注射による投与で（ま毒性ｉｔ低く、胃内投与では静脈投与よ り少なくとも２００倍効果力（低（Ｘ０バＩＪ　）キシンの投与量が多いと、投 与力）ら数分以内で死１こ至る。また、パリトキシンは既知の最も強力な血管収 縮薬の１つであり、アンジオテンシン−１１より約１００倍効力カ５強（１゜イ ンビボにおいて示される効力には、シコ・ツクおよび尿毒症を伴う腎不全、壊死 を起こす脈管炎および虚血を伴う全身性のまれる。また、マウス皮膚モデルでは 腫瘍プロモーターであることが報告されている（Ｆｕｊｉｋｉ、　Ｈ，ら、「膿 瘍プロモーターの新しいクラス：テレオシジン、アプリシアトキシン（ａｐｌｙ ｓｉａｔｏｘｉｎ）およびパリトキシン」江■凪よ、堕よ、お工、□１Ｅｎｖｉ ｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｔｕｍｏｒ　Ｐｒｏｍｏｔｏｒｓ　Ｆｕｊｉｋｉ、Ｈ，ら 編、ＪａｐａｎｅｓｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　５ｏｃｉｅｔｙ　Ｐｒｅｓｓ、　 Ｔｏｋｙｏ／ＶＮＵ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｕｔｒｅｃｈｔ　（１９ ８４）、３７−４５頁；　Ｆｕｊｉｋｉ、Ｆｌ、ら、Ｃａｒｃｆｎｏ　ｅｎｅｓ ｉｓ　（１９８６）　７４０７）。毒性のインビトロにおける実験では、パリト キシンの効力としては、細胞膜における一価陽イオン孔形成、興奮性膜の脱分極 、平滑筋収縮、心筋収縮、赤血球溶血、ノルエピネフリン放出およびヒスタミン 放出、刺激アラ牛トン酸代謝、骨吸収、血小板凝集およびＥＧＦ受容体転形が含 まれる。

パリトキシンおよびそのアナログは触媒介在の放出システムにおけるプロドラッ グとして使用するのに特に適している。

例えば、これらは酵素の非存在下で安定するアミドを形成し得、また、本発明の プロドラッグは内因性酵素によっては開裂し得ない。トキシンの分子量は比較的 低いため、分散による腫瘍への浸透は比較的容易であり、またプロドラッグ形態 は毒性形態よりはるかに効力が低い。これら薬物の毒性形態は効力が極めて高い 。

パリトキシンは、腫瘍の通常に隣接し、た位置で生成されると、はとんどの細胞 の表面のＮａ、　Ｋ−ＡＴＰａｓｅに対して高い親和性を有するため（Ｂｏｔｔ ｉｎｇｅｒ、　Ｆｌ、ら、Ｂｔｏｃｈｉｍ　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ　Ａｃｔａ（１９８ ６）　８６１：１６５−１７６）、毒素は標的化剤のためのマーカーが存在する かどうかに関わらずすべての膿瘍細胞を結合するようである。さらに、パリトキ シンの強力な血管収縮活性により、腫瘍組織を通して薬物が効果的に分布するの を妨げる対流力が低減するのが期待される。

本発明のパリトキシンプロドラッグは、適切な生物学的触媒の存在下で効果的な パリトキシンへと開裂され得るように設計される。「生物学的触媒」とは、反応 速度への影響に関して、酵素と類似した振舞いをする生体系と適合性のある分子 を意味する。最も一般的に使用される生物学的触媒は酵素である。しかし、抗体 およびＲＮＡのような他の適合性のある分子が触媒活性を示すことが見い出され ている。これらの他の形態もまた本発明の方法で有用な触媒の範囲に含まれる。

本発明の例示的な実施態様は、哺乳類の組織で生じることが知られていない酵素 であるペニシリンアミダーゼによって開裂され易い新規のパリトキシンアミダー ゼを含み、これにより、ペニシリンアミダーゼが処理される被験体内の特定の位 置を標的とする標的化プロトコルで、これらのプロドラッグが有用となる。

ペニシリンアミダーゼ（ペニシリンアミドヒドロラーゼ、ＥＣ３，５，１，１１ ）は、ペニシリン−Ｇおよびペニシリン−■から６−アミツベニシラン酸を産生 ずるために商業的に使用される８６ｋｄの微生物酵素である（Ｌｉｎｄｓａｙ、 　Ｃ，Ｄ、ら、Ｅｕｒ　Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９９０）　ｌｊｌ：１３３−１ ４１）。この酵素はインビトロにおけるドキソルビシンのアミドプロドラッグ誘 導体を活性化するために使用されている（　Ｋｅｒｒ、　Ｄ、　Ｅ、、Ｃａｎｃ ｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅ（１９９０）　３１：２０２−２０ ６；　５ｅｎｔｅｒ、　Ｐ、Ｄ、、ＦＡＳＥＢ　Ｊ　（１９９０）　４：１！１ ８−１９３）。この酵素のモノクローナル抗体への連結はＫｅｒｒ、　Ｄ、Ｅ、 ら（上述）により記載されており、本明細書において参考として援用されている 。簡単に述べれば、抗体は、２−イミノチオラン塩酸塩による誘導体化によって スルフヒドリル基が与えられ、そしてリンカ−のスクシンイミジル４−（Ｎ−マ レイミドメチル）シクロへ牛サンー１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）により誘 導体化され、反応性マレイミド基を有する酵素を提供するアミダーゼに、標準的 な連結技術を用いて結合させる。ペニシリンアミダーゼの任意の適切な標的化剤 との複合体は本明細書に示す治療方法において有用である。

パリトキシン関連プロドラッグを対応する毒素に変換するための開裂薬剤として 適切な他の生物学的触媒には、誘導体化されるとき毒性活性を失うパリトキシン の誘導体形態に対して適切であるものが含まれる。候補となる酵素は、例えば上 述のＰＣＴ出願第ＷＯ３８１０７３７８号に示されている。

プロドラッグのＡ パリトキシンは、Ｍｏｏｒｅ、　Ｒ，Ｅ、および５ｈｅｕｅｒ、　Ｐ、Ｊ、、５ ｃｉｅｎＣｅ　（１９７１）　１７２：４９５−４９８の方法によってｈ江旦用 ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓ盈から単離される。純度は標準的な分析方法を用いて確認 され得る。特に、単離された薬物は、４０％アセトニトリル／　０．０５Ｎ酢酸 、１　ｍ１７分で、２６３　ｒ＋ａ＋でのＵＶ吸光度による検出を行うＺ。

ｒｂａｘ　ＯＤＳカラム（４，６ｘ　２５Ｏｎ＋ｍ）、もしくは１０：１の０． ０２Ｎリン酸緩衝液、ｐＨ４，６：エタノール、１　！１１／分、２６３　ｎｍ のＳｈｏｗｄｅｘ　０Ｈｐａｋ　Ｂ８０４カラム（８Ｘ　５００　ｍｍ）を使用 して、ＨＰＬＣにおける単一ピークとして移動すべきである。

アンル化バリトキシンは標準的なアシル化方法を使用して合成される。これらに は、アシルハロゲン化物のような関連するカルボン酸の活性化形態の使用、また は、ジイミド試薬、例えば、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチル カルボジイミド（ＥＤＣＩ）のような凝縮剤の使用が含まれる。ペニシリンアミ ダーゼが生物学的触媒として使用される場合は、アシル化反応におけるカルボン 酸の相手は、得られるアミドがこの酵素により開裂し易くなるように選択され、 通常は、フェニル酢酸、ヒドロキシフェニル酢酸、フェノ牛シ酢酸、およびヒド ロキシフェノキシ酢酸よりなる群から選択される。

典型的な調製では、不活性で極性の非プロトン性溶媒中のカルボン酸は、Ｎ−ヒ ドロキシスクシンイミドおよびＥＤＣＩとの反応によって活性化ヒドロキシスク シンイミドエステルに変換される。次に、１０倍過剰のＮＨＳ活性エステルを使 用して、非水性の穏やかな塩基性溶媒中でパリトキシンを処理する。生成物アミ ドを標準的な方法を使用して回収し、そしてクロマトグラフィーによって精製す る。陽イオン交換クロマトグラフィーが特に好適である。

他の生物学的触媒の作用によって可逆性のある非活性化となるＮ−末端アミ７基 または他のパリトキシンの官能性に対する他の誘導体は、選択された触媒に感応 する適切な置換基を選択する必要がある。

アシルアミドまたは他の誘導体の調製は他にも様々な標準的な方法が使用され得 る。得られるアミドは、上述のバリト牛シン単離体の純度の基準として示される ＨＰＬＣ方法を使用して非反応性パリトキシンがら、または薄層クロマトグラフ ィーによって分離され得る。分析方法として行われるこれらの方法はまた、プロ ドラッグの酵素による加水分解を評価するために使用され得る。

精製および単離されたプロドラッグは、望ましくない細胞または組織を傷つける または破壊するように設計された治療法において被験体に投与するための組成物 に処方するのに連木発明のプロドラッグは、一般的に、プロドラッグ自体を投与 する前の、標的化剤−プロドラッグ開裂触媒複合体の予備的な投与を用いるプロ トコルで投与するために設計される。

本複合体は、標的組織、典型的には腫瘍、においてマーカーと反応するように特 に設計された標的化剤を含む。最も典型的には、標的化剤は、完全な免疫グロブ リンの免疫反応性を保有する抗体、またはその、Ｆａｂ、　Ｆａｂ”、もしくは Ｆ（ａｂ’）２フラクメントなどの、免疫学的に反応するフラグメントである。

膿瘍を標的する抗体の性質に関する議論は、上記に引用した第Ｗ０８ｇ１０７３ ７８号およびヨーロッパ特許第３０２４７３号の出願書類に見られる。しかし、 標的組織上のレセプター部位または他の表面タンパク質に結合するように設計さ れたリガンドの使用などの、他の標的化戦略もまた用いられ得る。種々の糖タン パク質、炭水化物、および他のリガンドが当該分野で周知であり、適切な標的化 剤の選択は、破壊される細胞または組織の性質に依存する。一般には腫瘍組織が 破壊の候補であるが、上述したように、この戦略は、ウィルス感染細胞、種々の 良性増殖、炎症部位、血管組織の閉塞などの、他の望ましくない細胞および組織 に拡大され得る。これらの細胞および組織に適切な標識化剤は、当業者に理解さ れる。

連結された生物学的触媒は、典型的には、アミダーゼなどの通常の酵素であるが 、触媒性抗体またはそれらの機能フラグメントもしくは核酸などの他の形態もま た、用いられ得る。

本発明のプロドラッグは、通常の投与様式を用いて、選択された様式に適切な処 方で投与される。そのような処方は、例えば、肚畦旺匡ｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃ 旦旦」二と」皿＝（最新版）、Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、、Ｅａ ｓｔｏｎ、　ＰＡに見られる。本発明のプロドラッグは、ハンクス液またはリン ゲル液などの種々の担体を用いて注射され得、そして静脈内、腹腔内、筋肉内、 または皮下に、治療する特別な適応症の指示に従って注射され得る。このプロド ラッグはまた、注射用のリポソームまたはマイクロカプセル中に処方され得る。

さらに、このプロドラッグは、徐放性処方で移植物として処方され得るか、また は、皮膚パンチ剤、鼻内噴霧剤、坐剤などの経皮もしくは経粘膜用処方で投与さ れ得る。胆汁酸塩、フシデート、界面活性剤などの浸透剤を用いる適切な処方が 、当該分野で公知である。

錠剤、カプセル剤、粉剤、シロップ剤などとしての経口投与もまた、考えられて いる。局所的治療が望ましい、ある種の適応症では、ペースト剤、軟膏剤、ゲル 剤、またはパップ剤の形態の局所治療もまた、用いられ得る。

典型的なプロトコルでは、プロドラッグの開裂に有効な生物学的触媒に連結され た標的化剤が、全身投与されて標的組織に向かうための任意の適切な経路（上述 した経路に類似する）によって、最初に投与される。この場合はまた、局所的治 療が可能であれば、腫瘍もしくは他の標的中に直接注射するか、または局所治療 によって、これが成し遂げられ得る。

全身投与が用いられるときは、全く正常な組織および血漿に標的化剤／触媒を共 役させて、標的細胞または組織に向かうために十分な時間がかけられる。標的化 剤／触媒の連結が免疫原性であれば、免疫毒素の投与の場合にしばしば見られる ように、／クロスポリンなどの免疫抑制剤の使用によって、この副作用が改善さ れ得る。

特定の被験体および適応症のために投与量レベルおよびプロトコールが設計され 、一般に医学および獣医学の専門家によって実施される。投与量レベルは、苦痛 の重篤度およびその性質とともに、投与様式に依存する。しかしながら、プロド ラッグの投与量レベルは、０．１−５０（ｌμｇ／ｋｇ、好ましくは１−５０μ ｇ／ｋｇのプロドラッグの範囲で全身投与のほとんどの場合に投与されることが 期待される。より低いレベルは、局所的治療で用いられ得る。

以下の実施例は例証を意図し、本発明を限定するものではない。

Ｋ施１−」 Ｌｆｆ−ヒドロキシフェニルアセチルパリトキシン正己ジ」泊五 図１に示す、１１５位のアミ７基のアシル化を以下のように行う。４−ヒドロキ シフェニル酢酸（１０７ｍｇ、　７００　μｍｏｌ）のＴＨＦ　（７ｍ　ｌ）溶 液に、アルゴン雰囲気下、室温で、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（８１ｍｇ、 　７００μｍｏｌ）およびＮ、Ｎ−ジシクロへキシルカルボジイミド（１４４ｍ ｇ、７００μｍｏｌ）を加えた。１時間攪拌した後、析出したジシクロへキシル ウレアを沈澱させた。シリンジを用いて、７０μＨＤ上清（理論的１：　４−Ｈ ＰＡｃＯＨ（Ｄ　Ｎ）Ｉｓ活性エステル（７０μｍｏｌ）を含有する）を乾燥ピ リジン（０，５ｍ１）中のバリトキシン（２，０ｍｇ、０．７μｍｏｌ）を含有 する第２のバイアルに移した。室温で１．５時間後、ＴＬＣ（Ｅ、　Ｍｅｒｃｋ 製、ＮＨ２Ｆ２ｓａでプレコートしたＨＰＴＬＣ２１５６４７、ピリジン−水− ｎ−ペンタノール（９：８：６）；Ｅ、　Ｍｅｒｃｋ製、シリカゲル６０　Ｆ２ ５４でプレコードシたＨＰＴＬＣ＄１３７２７、ピリジン−水−〇−ペンタノー ル（７：６：７））は、バリトキシンの完全な消費を示した。溶媒を減圧下で蒸 発させた。得られた残留物を水（２ｍｌ）に溶解し、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄した（ ３ｍ１ｍｌ）。次に水層部分を凍結乾燥し、生成物を陽イオン交換クロマトグラ フィー（ＣＭ−セファデックスｃ−２５，０，０２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ４，５ ）により精製した。ＮＨＰＡＰの収率は、ＵＶ分光法により、バリトキシンに関 して報告されている２６３ｎｍにおける吸光係数２３、６００を用いて、０．８ ７ｍｇ（４１％）と推定された。

ＮＨＰＡＰは少なくとも６力月間の保存において安定であり、ペニシリンアミダ ーゼによって開裂され得る。

図１に示す１１５位のアミ７基をｐ−ヒドロ牛ジフェノ牛シ酢酸（Ｎ）ＩＰＯＡ Ｐ）を用いて以下のようにアシル化する。室温テア　ルゴン雰囲気下、（４−ヒ ドロキシフェノキシ）酢酸（１１１３ｍｇ、　７００μｍｏｌ）のＴＨＦ　（７ ｍｌ）溶液に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（８１ｍｇ、　７００ｔ１ｍｏｌ ）およびＮ、Ｎ−ジシクロへキシルカルボジイミド（１４４ｍｇ、ＩＱＯμｍｏ ｌ）を添加する。１時間撹拌シタ後、析出したジシクロへキシルウレアを沈澱さ せる。シリンジを用いて、７０μｍの上清（理論的には（４−ヒドロキシフェノ キシ）酢酸のＮＨ８活性エステルを７．０μｍｏｌ含有している）を、乾燥ビリ ジ７　（０，５ｍ１）中バリトキシン　（２，０Ｉｌ１ｇ、　０．７μｍｏｌ） を含有する第２のバイアルに移す。反応液をＴＬＣ（Ｅ、　Ｍｅｒｃｋ製、Ｎｌ ２　Ｆ２５ｍでブレフートした［（ＰＴＬＣ８１５６４７、ピリジン−水−ｎ− ペンタノール（９：８：６）　：　Ｅ、　Ｍｅｒｃｋ製、シリカゲル６０　Ｆ２ ５４でプレコートしたＨＰＴＬＣ１ｔ１３７２７、ピリジン−水−ｎ−ペンタノ ール（７：６：７））によりモニターする。バリトキシンを完全に消耗した後、 溶媒を減圧下でエバポレートする。得られた残留物を水（２ｍｌ）中に溶解し、 ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄する（３Ｘ１ｍｌ）。水層部分を凍結乾燥した後、生成物を 陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＭ−七ファデックスＣ−２５，０，０２Ｍ リン酸緩衝液、ｐＨ４，５）により精製する。収率を、報告されている２６３ｎ ｍでのパリトキシンの吸光係数２３．６００を用いてＵＶ分光法により推定する 。

実」１匹」− ニエΣム？ｙ工三ヱｌユｊ重 クロマトグラフィー　の　。

パリトキシンおよびパリトキシンプロドラッグを、シリカゲル６０　Ｆ２５４　 （ＥＭサイエンス）薄層クロマトグラフィープレート上で、ピリジン：水ニアミ ルアルコールの７：６：７混合物を用いて分離する。このシステムでは、パリト キシンはＲ＋；０．５１で移動し、一方Ｎ−（４−ヒドロキシフェニルアセチル ）パリトキシンはＲｔ＝０．６９で移動する。化合物はＵＶ光（２５４ｎｏ＋） により、またはプレートをｐ−アニスアルデヒド試薬（使用書＃２２、「薄層お よび気相クロマトグラフィー用着色試薬」、Ｅ、　Ｍｅｒｃｋ、　Ｄａｒｍｓｔ ａｄｔ、　Ｇｅｒ＋ａａｎｙｓ　１９８０）を用いて処理することにより目で見 えるようにする。

支皿史１ ■シム滞１１化 ＥＬ−４−マウスのＴ細胞リンパ腫系（ＡＴＣＣＴｌＢ５９）をＤＭＥＭ捕捉し た（フロー）培地中で１０％の仔牛血清、１ｍＭのし一グルタミンおよび２ｍＭ のピルビン酸ナトリウムで培養した。細胞を採取し、１０％（Ｖ／Ｖ）仔牛血清 、１ｍＭのし一グルタミンおよび２ｍＭのピルビン酸ナトリウムで捕捉した、ロ イシンを有さない最少必須培地中で懸濁し、無菌の９６−ウェルコスタ−マイク ロタイタープレート中で１０５細胞／ウエルでプレートした。各ウェルを、全容 量０．１５ｍ１中Ｌ　ｃｏｌｉから調製した０、　３μｇ／ｍｌから３３μｇｅ ｍ　ｌのペニシリン−〇アミダーゼ（ＰＧＡ）の存在下または非存在下で、あら かじめ定められた濃度のＮＨＰＡＰまたはパリトキシンにさらした。アッセイに 用いたＰＧＡの比活性は４７ユニツト／ｍｇであった。

１８時間のインキュベーション後、生存力を決定するためにウェルヲ０．０５μ Ｃｉの［１４Ｃ］−標識されたロイシンで２時間処理した。生存力のある細胞は ［Ｉｊｃ］−ロイシンを細胞タンパク質中に導入し得た。次にウェルをガラスフ ァイバーフィルターの上に採取し、液体シンチレーション計数のために処理した 。

テストウェル中の生存率を複製未処理フントロールｘｌｏｏの平均ｃｐｍで除算 した複製ウェルから得た平均Ｃｐｌとして計算した。

酵素のみで処理し、薬剤またはプロドラッグで処理しなかったコントロールは未 処理のコントロールに匹敵するｃｐｓを示した。

結果を、ＰＧＡの濃度を様々に変えたＮＨＰＡＰ　（四角）またはパリトキシン （丸）（ピコグラム／＋１）に対する生存率％をプロットで表わして図２に示す 。図に示すように、酵素を添加しない場合、生存率を下げずにＦ１当りＬｏ、０ ００ｐｇ／ｍｌを越えるＮＨＰＡＰを添加し得る；パリトキシンのみを添加する と１０ｐｇ／＋＊ｌでのコントロールの生存率が２０％減少した。しかし、ＰＧ Ａが３．３μｇ／ｒａ　Ｉはどに少ない場合、ＮＨＰＡＰを含有するＮＨＰＡＰ 処理された培養物はパリトキシンのみを用いて得られたものと同様の用量作用曲 線を示した。酵素の存在下でパリトキシンを用いて得られた曲線には影響がなか った。

同様の実験において、ＥＬ−４マウスのＴ−リンパ腫細胞（５ｘｌＯ１細胞／ウ エル）を、指定濃度のパリトキシン（ＰＴＸ）　、Ｎ−アセチルパリトキシン（ ＮＡＣＰＴＸ）　、またはＮ−（４−ヒドロキシフェノキシアセチル）パリトキ シン（ＮＨＰＡＰ　）に、ＰＧＡを用いてまたは用いずに、２時間、全容量０． １ｍｌの１０％の仔牛血清（ＭＥＭ）を含有するロイシンを有さないＭＥＭ中に さらした。ＰＧＡを３．３μｇ／＋＋　１のペニシリンＧアミダーゼとして供給 した。次に０．０５μＣｉ［１４Ｃ］−ロロインを容１０．０５ａ＋ｌのＭＥＭ 中に添加し、混合物をさらに２時間インキュベートした。次に細胞をガラスファ イバーフィルターの上に採取し、液体シンチレーション計数のため処理した。生 存力のある細胞は［＋４ｃ］−ロイシンを細胞タンパク質中に導入した。

結果を図３に示す。図からＮＨＰＡＰ毒性がＰＧＡの存在下で著しく増加してい ること；　ＰＴＸがＰＧＡの有無に関わらず毒性であり、ＮＡＣＰＴＸの毒性は ＰＧＡの存在下で増加しないことがわかる。

〒　〒 烏旬重％ ４ｔＩＩｌｉＲ＋１（ｐｇ／ｍＬ） Ｆｉｇ、　３ フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ３，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ 、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　ＮＯ，ＰＬ、ＲＯ、ＲＵ、ＳＤ、ＳＥ

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．パリトキシン、パリトキシンカルボン酸、ホモパリトキシン、ビスホモパリ トキシン、イソパリトキシン、ネオパリトキシン、デオキシパリトキシン、およ びそれらの天然に生じた共存アナログからなる群から選択される毒素のプロドラ ッグを、非毒性であり薬学的に受容可能な賦形剤との混合物中に活性成分として 包含する、所望でない細胞または組織をインビボで破壊するための薬学的組成物 。
2. ２．さらに前記毒素を前記プロドラッグから放出するのに有効な生物学的触媒を 有効量含有する、請求項１に記載の組成物。
3. ３．前記生物学的触媒が標的特異的試薬に結合する、請求項２に記載の組成物。
4. ４．前記標的特異的試薬が抗体またはその免疫学的反応フラグメントである、請 求項３に記載の組成物。
5. ５．前記生物学的触媒が酵素である、請求項２に記載の組成物。
6. ６．前記酸素がベニシリンアミダーゼである、請求項５に記載の組成物。
7. ７．前記生物学的触媒が触媒抗体またはその機能フラグメントである、請求項２ に記載の組成物。
8. ８．被験体の所望でない細胞または組織の機能を破壊または損傷する方法であっ て、このような処理が必要である該被験体に請求項１に記載の組成物の有効量を 投与する工程を包含する、方法。
9. ９．被験体の所望でない細胞または組織の機能を破壊または損傷する方法であっ て、このような処理が必要である該被験体に請求項２に記載の組成物の有効量を 投与する工程を包含する、方法。
10. １０．被験体の所望でない細胞または組織の機能を破壊または損傷する方法であ って、このような処理が必要である該被験体に、パリトキシン、パリトキシンカ ルボン酸、ホモバリトキシン、ビスホモパリトキシン、イソパリトキシン、ネオ パリトキシン、デオキシパリトキシン、およびそれらの天然に生じた共存アナロ グからなる群から選択される毒素を、そのプロドラッグから放出するのに有効な 生物学的触媒の複合体を包含する組成物を投与する工程、該生物学的触媒は該細 胞または組織と特異的に反応する標的化剤に結合し、該複合体を該細胞または組 織に戻し得る工程、および該被験体に該プロドラッグの有効量を投与する工程を 包含する、方法。
11. １１．前記生物学的触媒が酵素である、請求項１０に記載の方法。
12. １２．前記生物学的触媒が触媒抗体またはその機能フラグメントである、請求項 １０に記載の方法。
13. １３．パリトキシン、パリトキシンカルボン酸、ホモパリトキシン、ビスホモパ リトキシン、イソパリトキシン、ネオパリトキシン、デオキシパリトキシン、お よびそれらの天然に生じた共存アナログからなる群から選択される毒素のアミド ブロドラッグであり、ペニシリンアミダーゼで開裂可能なフェニルアセチルアミ ド、ヒドロキシフェニルアセチルアミド、フェノキシアセチルアミド、またはそ れらのヒドロキシフェノキシアセチルアミドである、アミドプロドラッグ。
14. １４．Ｎ−（４′−ヒドロキシフェニルアセチル）パリトキシンである、請求項 １３に記載のプロドラッグ。
15. １５．Ｎ−（４′−ヒドロキシフェノキシアセチル）パリトキシンである、請求 項１３に記載のプロドラッグ。