JPH06507543A - ヒト血小板由来成長因子レセプターポリペプチドの細胞外領域ドメイン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト血小板由来成長因子レセプターポリペプチドの細胞外領域ドメイン 発明の分野 本発明は成長因子に対するレセプター、特にヒト血小板由来成長因子レセプター （ｈＰＤＧＦ−Ｒ）に関する。より詳しくは、ヒト血小板由来成長因子レセプタ ーの様々な複合構造体を提供し、これらの構造体はこのレセプターの天然の細胞 外領域において見い出せるリガンド結合性領域を保持している。更に、かかるポ リペプチドをコードし、典型的には発現のためのプロモーターをも含んで成る組 換え核酸、及び発現した細胞外複合構造体のアミノ又はカルボキシ末端上の融合 ペプチドを提供する。細胞外領域の種々のドメインにおいて含まれているアミノ 酸を含むエピトープを認識する抗体を提供する。

かかるポリペプチド及び核酸を含んで成る細胞、並びにこれらの試薬の診断利用 も提供する。

発明の背景 ポリペプチド成長因子は分裂促進剤（ミトゲン）であり、これは細胞の形質膜の 上にあるレセプターに特異的に結合することにより細胞に作用する。血小板由来 成長因子（ＰＤＧＦ　）は生化学応答の種々の群、例えばイオン流出における変 化、様々なキナーゼの活性化、細胞の形状の変化、様々な遺伝子の転写及びリン 脂質代謝に関連する酵素活性の調節を刺激する０例えばＢｅ１ｌら（１９８９） 　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆＰｌａｔｅｌｅｔ　Ｆａｃｔｏｒｓ　ｏｎ　Ｍｉｇｒａ ｔｆｏｎ　ｏｆ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｄ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ａｏｒｔｉｃ６５　：　１ ０５７−１０６５を参照のこと。

血小板由来成長因子は高等動物、特に温血動物、例えば哺乳動物において見い出 せる。インビトロにおいて、ＰＤＧＰは間葉起源の細胞、例えば繊維芽細胞、平 滑筋細胞及びダリア細胞のための血清中の主要たるポリペプチドミトゲンである 。インビボにおいては、ＰＤＧＦは血液の中で通常は自由に循環せず、しかしな がら循環する血小板のアルファー顆粒の中に貯蔵される。凝血及び血小板接着の 際、通常は損傷した血管の部分においてこの顆粒が放出され、これにより血管の 修復にＰＤＧＦは関与する。　ｐｏｃｐは動脈平滑筋細胞の動脈の中間から内側 の層に至る移動を刺激することができ、ここでこの筋細胞は増殖しうる。これが 傷害への初期応答のようである。

ＰＤＧＦは創傷治癒に、アテローム症に、骨髄増殖病に、そして細胞の癌化形質 転換に関与する遺伝子、特にＣ−！及びｃ−ｂ型の刺激にも関連している。

血小板由来成長因子は２本の相同なポリペプチド鎖より成る；これはジスルフィ ンド連結した１６キロダルトンタンパク質の二量体である。これらのポリペプチ ドには２つのタイプ、即ちＢ型鎖とＡ型鎖とがある。この成長因子二量体の３つ の形態は、２本のＡ型鎖のホモニ置体、２本のＢ型鎖のホモニ量体、及びＡ型鎖 とＢ型鎖とのへテロニ量体に相当することが見い出されている。これら３通りの 異なる組合せのそれぞれはＰＤＧＦイソフオーム（ｉｓｏｆｏｒ■）と呼ばれて いる。　ＰＤＧＦについては、Ｒｏｓｓら（１９８６）　Ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏｇ ｙ　ｏｆ　Ｐｌａｔｅｌｅｔ−Ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ’ 　Ｃｅ１ｌ　４６　：　１５５−１６９を参照のこと、マウス及びヒトに由来す る成長因子配列は相同性が高い。

ＰＤＧＦは血小板由来成長因子レセプター（ＰＤＧＦ−Ｒ）に結合することによ って作用する。このレセプターは典型的には間葉起源の細胞上に見い出せる。そ の機能的なレセプターは２つのトランスメンブラン糖タンパク質を含んで成る形 態にありながら作用し、それぞれは約１８０キロダルトンである。２種類の異な るポリペプチド、Ｂ型レセプターポリペプチド及びＡ型レセプターポリペプチド が単離されている。

マウス血小板由来成長因子レセプターポリペプチドのＢ型レセプターポリペプチ ドの配列はＹａｒｄｅｎら（１９８６）　Ｎａｔｕｒｅ　３２３　：　２２６− ２３３に公開されている。Ａ型ヒト血小板由来成長因子レセプター（ｈＰＤＧＦ −Ｒ）ポリペプチドの配列はＭａｔｓｕｉら（１９８９）　５ｃｉｅｎｃｅ　２ ４３　：　８００−８０３に開示されている。

これらＰＤＧＦレセプターは通常３種類の主要な同定可能な領域を有する。第１ はトランスメンプラン（ＴＭ）６Ｎ域であり、これは形質膜に達すると、細胞に 対して外部のレセプター領域と細胞に対して内部のレセプター領域とを分ける。

第２　ｆｉｌ域は細胞外領域（ＸＲ）であり、これはポリペプチド成長因子に結 合するドメイン（即ち、リガンド結合性ドメイン）を含む、第３は細胞内領域（ ＩＲ）であり、これはチロシンキナーゼ活性を保有する。このチロシンキナーゼ 活性は、約１００個のアミノ酸のインサートを有することで注目に値し、それに 比べてほとんどの他のレセプターのチロシンキナーゼドメインは隣接し合ってい るか、又は短いインサートセグメントを有する。

ヒｌ−Ｂ型及びヒトＡ型レセプターポリペプチドの完全配列は他に例えば本明細 書に参考として組入れるＵ、Ｓ、Ｓ、Ｎ、　０７／３０９．３２２に報告されて いる。しかしながら、数多くの目的のため、全長機能性タンパク質より小さい又 は短いものが所望されるであろう０例えば、小さめの分子は折衷循環（ｃｏｍｐ ｒｏｓ＋１ｓｅｄ　ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）　？＋１域をより簡単に標的とす ることができ、又は注目の様々な活性と無関係のエピトープもしくは外来ドメイ ンをほとんど示さない、若干改質された活性の範囲又は異なる特異性を有する機 能性類似体は非常に有用であろう。

従って、血小板由来成長因子レセプターポリペプチドに共通する生物学的活性を 示す新規の複合構造体の利用は研究用試薬、診断用試薬及び治療用試薬としての 多大な用途を有するであろう、特に、血小板由来成長因子レセプターポリペプチ ドの細胞外領域における重要なポリペプチド特性の同定は、このドメインの特定 の特性の置換及び欠失を可能にするであろう、更に、インビトロアッセイ系の利 用は細胞障害性又は膜崩壊性化合物の能力を試験するのに担う。

発明の概要 本発明に従い、改質されたヒト血小板由来レセプターポリペプチドの規定の構造 体を提供する。細胞外領域ドメイン構造体が同定され、そしてこのレセプターセ グメントの改質及び組合せ配列度えを行う、細胞結合型及び可溶性型の改質セグ メントの両者は、それらを用いるアッセイに関する方法のために有用にされ、従 ってリガンドｌ１ｆＲ体のスクリーニングを可能にする。

本発明は、細胞外ドメインＤＩ、Ｄ２又はＤ３に由来する１又は複数の血小板由 来の成長因子（ＰＤＧＦ）リガンド結合性領域（ＬＢＲ）を含んで成る約８〜４ ００のアミノ酸の血小板由来成長因子レセプター（ｈＰＤＧＦ−Ｒ）フラグメン トを提供し、ここでこのフラグメントは血小板由来の成長因子リガンドに結合す る。一般に、このフラグメントは約５ｎＭ又はそれより優れた結合親和力を示し 、そしてドメインＤ３システィン内領域に由来する少なくとも約６又は８個の隣 接アミノ酸、好ましくは少なくとも約１５個以上の隣接アミノ酸の配列を有する であろう。このフラグメントは通常トランスメンプラン領域を欠いている。他の 態様において、このフラグメントは可溶性であり、実質的に純粋であり、又はド メインＤ３に由来する少なくとも１つのりガント結合性領域を有している。この フラグメントは例えば表１又は表２に由来する、Ｂ型又はＡ型のＰＤＧＦ−ＲＬ ＢＲフラグメントに由来しうる。特定のＩ１１様において、このフラグメントは 以下の一般式の群より選ばれる； ａ）Ｘａ　Ｄ＠　Ｘｃ？ ｂ　）　Ｘａ−Ｄ＋ｗ−ＸＩ−Ｏｎ−ＸＣ；ｃ　）　Ｘａ−Ｄｓ−ＸＩ−Ｄｎ− Ｘ２−Ｄｐ−Ｘｃ　；及びｄ　）　Ｘａ−ロー−ＸＩ−ｏｎ−Ｘ２−Ｄｐ−Ｘ３ −Ｄｑ−Ｘｃ　；ｅ　）　Ｘａ−Ｄｓ＋−ＸＩ−Ｏｎ−Ｘ２−Ｄｐ−Ｘａ−Ｄｑ −Ｘ４−Ｄｒ−Ｘｃ　；（ここで、このフラグメントはＤＩ　−０２−０３−０ ４−０５ではなく；Ｘａ、　Ｘｌ、　Ｘ２．　Ｘａ及びＸｃのそれぞれは、存在 しているならば、Ｄドメインを欠くポリペプチドセグメントであり；そしてＯｓ 、　Ｄｎ＋　Ｄｐ及びＤｑのそれぞれは互いに独立して、Ｄｉ、　Ｄ２．　Ｄ３ ．　Ｄ４及びＤｓより成る群から選ばれる）、好ましいフラグメントは以下ａ） 口ｌ−０２−Ｄ３又はＤ３−Ｄ４−０５；及びｂ　）　ＤＩ−０２−０３−０４ 又はＤ２−０３−０４−０５より成る群から選ばれる。

本発明は更に、ドメインＤ３に由来する少なくとも１つの血小板由来成長因子（ ＰＤＧＦ　）リガンド結合性領域（ＬＢＲ）を含んで成る約１０〜３５０のアミ ノ酸の可溶性ヒト血小板由来成長因子レセプター（ｈＰＤＧＦ−Ｒ）を包括し、 ここでこのフラグメントは血小板由来の成長因子リガンドに特異的に結合する０ 通常、このフラグメントはドメインＤ３のシスティン内領域に由来する少なくと も約１５個の隣接アミノ酸の配列を含んで成り、そして約５ｎＭ以上の結合親和 力を有している。その他の有用なフラグメント態様は可溶性であり、実質的に純 粋であり、又は例えば表１又は表２に由来する、Ｂ型又はＡ型のＰＤＧＦ−１？ 　ＬＢＲであろう。

本発明は更に核酸配列を含み、これは前記したポリペプチドフラグメントをコー ドするものを含んでいる０通常、この核酸配列は、このフラグメントをコードす る配列に一般に作動連結したプロモーターを含んでいる。

本発明の核酸又はペプチドを含んで成る細胞も包括する。特定の細胞の態様にお いて、この細胞は哺乳動物細胞であり、そしてしばしば核酸及びこの核酸のタン パク質発現生成物の両者を含むであろう。

前記の組成物は、天然のＰＤＧＦ−Ｒエピトープではなく、記載のＰＤＧＦ−Ｒ フラグメントのエピトープを認識する抗体を提供する。この抗体は通常モノクロ ーナル抗体であろう。

本発明はまた生物学的サンプルのＰＤＧＦレセプター結合活性を測定するための 方法を提供し、この方法は以下の工程：ａ）第１の分析において、前記のＰＤＧ Ｆ−Ｒフラグメントの存在下においてサンプルのアリコートをＰＤＧＦリガンド に接触させる；ｂ）第２の分析において、このＰＤＧＦ−Ｒフラグメントの非存 在下においてサンプルのアリコートをＰＤＧＦリガンドに接触させる；次いでＣ ）この２つの分析における結合の程度を比較する；ことを含んで成る。ある状況 においては、ＰＤＧＦ−Ｒフラグメントは細胞又は固相基板、例えばマイクロタ イター皿に結合しておく。

本発明は更に、生物学的サンプルのＰＤＧＦリガンド含有量を測定するための方 法を包括し、この方法は以下の工程：ａ）第１の分析において、前記のＰＤＧＦ −Ｒフラグメントの存在下においてサンプルのアリコートをリガンド結合性領域 （ＬＢＲ）に接触させる； ｂ）第２の分析において、このＰＤＧＦ−Ｒフラグメントの非存在下においてサ ンプルのアリコートをＬＢＲに接触させる；次いでＣ）この２つの分析における 結合の程度を比較する；ことを含んで成る。一定の態様において、この接触工程 は同時に行う。

図面の簡単な説明 図１は可溶性ｈＰＤＧＦ−Ｒ細胞外ドメインのオリゴヌクレオチド特異的インビ トロ欠失突然変異誘発のための手法を示す、これらの構造体の多くは可溶性ペプ チドであるか、又はそれらの改質されたものでありうる。

利用している略語は： ＰＲ＝ＰＤＧＦ−Ｒ、インタクト Ｐ　＝Ｐ［１ＧＦ−１７；細胞外領域 ＴＭ＝トランスメンプラン に＝キナーゼ Ｓ＝シグナル配列、である。

図２は様々な欠失ポリペプチドを発現させるために用いた、ｐｃＤＬ−Ｓα２９ ６に由来するプラスミドの構造である。

図３はｐｃＤＬα２９６に由来するプラスミドｐＢＪΔの構造を示す。

Ｔａｋａｂｅら（１９８８）　Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　８　：　４６６ −４７２を参照のこと。

１　、ｐｃＤＬ−５Ｒα２９６をＸｈｏ　Ｉで切断する。

２、ポリリンカー（χｈｏｌ−Ｘｂａｌ−Ｓｆｉ　Ｉ−ＮｏｔＩ−ＥｃｏＲＩ− ＥｃｏＲＶ−Ｈ４ｎｄｌｆｆ−Ｃ１ａ　１−５ａｌ　Ｉ　）をＸｈｏ　Ｉで切断 したベクターに挿入する。

３、　５ａｌｌはＸｈｏ　１部位に適合する；従って５ａｌｌ及びＸｈｏ　ｒ部 位の両者を築きあげる。

４、　ＳＶ４０１６Ｓスプライス連結部はもはや存在していない。

図４はヒトＢ型ＰＤＧＦレセプターポリペプチドによるレセプターのリン酸化の 阻害を示す、リン酸化チロシンに結合する試薬によるラベル化は、このレセプタ ーポリペプチドフラグメントの存在下においてリン酸化活性が減少することを示 す。

好ましい態様の詳細な説明 ■、一般的な説明 Ａ、　ＰＤＧＦ−Ｒ １、構造の特徴 ａ、細胞外ドメイン（ＸＲ） ｉ、シグナル配列 ｉｉ、Ｄドメイン（Ｉｇ一様） ｂ、トランスメンプランセグメント（ＴＭ）Ｃ９細胞内ドメイン（ＩＲ） ２．１１能 ａ、結合リガンド（ＰＤＧＦＩ［似体）ｂ、チロシンキナーゼ活性 ｃ、　ＰＤＧＦ−Ｒペプチドへの結合（二量体形成）ｄ、リン酸化セグメント Ｂ、生理学的機能 １、細胞 ２、組織分化 ３、有機体 ■、ポリペプチド ２、システィン残基 Ｂ、可溶性型、細胞外領域 Ｃ１省略型／欠失型 り、融合タンパク質 Ｅ、遺伝子変異体（部位特異的突然変異誘発化）Ｆ、タンパク質を含んで成る組 成物 ■、核酸 Ａ、単離した核酸 Ｂ９組換核酸 Ｃ０核酸を含んで成る組成物 ＩＶ、ＰＤＧＦ−Ｒ構造体を作製するための方法Ａ、タンパク質精製 １、誘導化ＰＤＧＦとの親和力 ２、欅々なリガンド、同一のレセプターＢ、核酸の発現 Ｃ１合成方法 ■、抗体 ■、利用のための方法 Ａ０診断用 Ｂ、治療用 ■、一般的な説明 Ａ、血小板由来成長因子レセプター（ＰＤＧＦ−Ｒ）ヒト血小板由来成長因子レ セプター（ｈＰＤＧＦ−Ｒ）は典型的には２つのポリペプチドを含んで成る。同 一であるか又は若干のみ異なることのあるこれらのポリペプチドはリガンドの結 合の機能的活性及びリガンド結合シグナルの細胞への変換（ｔｒａｎｓｄｕｃｉ ｎｇ）の際に関与する。

この血小板由来成長因子レセプターは、グリコジル化された約１８０キロダルト ンのタンパク質の主要成分を有するものとして同定されている。この糖タンパク 質は血小板由来成長因子レセプターポリペプチドとして同定されている。ポリペ プチドの２つの相同な形態の一次構造が報告されている。Ｂ型レセプターの核酸 及びマウスに由来するその対応のポリペプチド配列はＹａｒｄｅｎら（１９８６ ）　Ｎａｔｕｒｅ　３２３　：２２６−２３２において報告されており；そして 相同性遺伝子配列がヒトから単離されている。　Ｕ、Ｓ、Ｓ、Ｎ　０７／３０９ ，３２２を参照のこと、ヒトＡ型レセプター配列がＭａｔｓｕｉらＣ１９８９） 　５ｃｉｅｎｃｅ　２４３　：　８００−８０３に報告されている。これらのレ セプターポリペプチドの２つの異なる形態が相同性であるにもかかわらず、それ らは２の別々の遺伝子によりコードされる。

機能的なレセプターは明らかにこれらのポリペプチドの二量体、即ちＢ型レセプ ターポリペプチドもしくはＡ型レセプターポリペプチドのホモニ量体のいづれか 、又はＢ型レセプターポリペプチドとＡ型レセプターポリペプチドのへテロニ量 体を含んでいる。このレセプターのこのような形態、即ちＡ＾、　８Ｂ又はＡＢ 形態（マウスもしくはヒトのいづれか、又は可能としてその他の哺乳動物に由来 する）の結合特異性は血小板由来成長因子（ＰＯＧＦ）の種々の形態のそれぞれ に対して異なる。

ＰＤＧＦ−Ｒは近縁レセプターの科（ファミリー）の構成員である０例えばＹａ ｒｄｅｎら、前掲を参照のこと、かかるレセプターポリペプチドのそれぞれは疎 水性膜に広がる領域（膜透過のためのＴＭ）　、規則的な間隔の開いたシスティ ン残基を有する大きな細胞外領域（ＸＲ）、及び細胞内チロシンキナーゼ活性を 有する細胞質の細胞内領域（ＩＲ）を有している。ＰＤＧＦ−ＲのＸｌｌは５つ のβ饋に富む免疫グロブリン（Ｉｇ）樟ドメインを含む推定構造を有する。

これらのＩｇｔｌドメインのそれぞれは約１００個のアミノ酸より成り、より詳 しくは約８８〜約１１４個のアミノ酸に範囲し、第４ドメインを除き、規定的な 間隔の開いたシスティン残基を含む、マウス及びヒト型のＰＤＧＦ−Ｒを含む種 々の成長因子レセプターの構造的特徴の多くは相同性である。従って、本明細書 で規定する構造的特徴の多くはその他の近縁タンパク質に共有されている。しか しながらほとんどの場合、特定の構造的特徴についての機能との関係はわかって いない。

細胞内領域（ＩＲ）はトランスメンブラン（ＴＭ）セグメントにカルボキシ近位 するＰＤＧＦ−Ｒのセグメントである。この細胞内領域はある程度、スプリント チロシンキナーゼ構造ドメインの存在により特徴付けられている。ヒ）Ｂ型レセ プターポリペプチドにおいて、チロシンキナーゼドメインは約２４４個のアミノ 酸であり、約１０４個のアミノ酸のインサートを有している０表１を参照のこと 、ヒトＡ型レセプターポリペプチドにおいて、そのドメインは約２４４のアミノ 酸の長さであり、約１０３個のアミノ酸のキナーゼインサートを有している。表 ２を参照のこと。機能性において、このドメインはある程度、そのチロシンキナ ーゼ活性によって規定され、これは典型的には細胞外領域において見い出せる結 合部位へのリガンドの結合によって調節され、そして二量体の状態で機能するこ とが認められている。リン酸化のための基質には、付随のレセプターポリペプチ ド鎖上の種々のチロシン残基、及びこのレセプターに結合するその他のタンパク 質が含まれる。このチロシンキナーゼドメインは更にある程度、その他のチロシ ンキナーゼ活性含有タンパク質における類似のドメインに対するその相同性によ り規定される。　Ｙａｒｄｅｎら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ　３２３　：　２２ ６−２３２を参照のこと、三量化レセプター複合体の各ＩＲ上セグメントその他 のポリペプチド鎖上の特定のチロシン残基をリン酸化することが認められている 。

ヒトレセプターポリペプチドの各トランスメンプランセグメントは約２４又は２ ５のアミノ酸の長さであり、そして疎水性アミノ酸残基によって特徴付けられて いる。これらのセグメントは膜に達するセグメントの特徴的な配列を有している 。ヒトＢ型レセプターのポリペプチドにおいて、このトランスメンプラン傾城は およそｖａｌ　（５００）からｔｒｐ　（５２４）にまで及ぶ約２５のアミノ酸 の長さであることが認められており、一方、ヒトＡ型レセプターポリペプチドに おいては、このトランスメンプランセグメントはおよそｔａｕ　（５０２）から ｔｒｐ　（５２６）にまで及ぶ約２４個のアミノ酸であると認められている０例 えばＣ１ａｅｓｓｏｎ−Ｗｅｌｓｈら（１９８９）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ ａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８６　：　４９１７−４９２１を参照のこと。

ポリペプチド又は核酸は、もしそれが天然のヒト起源に由来する、又は部分的に 由来するなら、「ヒト」配列である０例えば、ヒト細胞に由来する、又はヒト遺 伝子配列によりもとからコードされるタンパク質はヒトタンパク質であろう、更 に、天然のヒトサンプルにおいて見い出せる配列に対する高い類似性を基礎とし て選んだのなら、又はそれに由来するなら、配列はヒトである。

融合ポリペプチド又は核酸は、自然には互いに連なっていない配列に由来するセ グメントの融合の結果としての分子である。従って、キメラタンパク質又は核酸 は融合分子である。異種タンパク質は異なる起源に由来するタンパク質である。

Ｂ、生理学的機能 ＰＤＧＦ−Ｒは少なくとも４つの主要な異なる生物学的機能を有することが認め られた。第１はリガンド、通常はＰＤＧＦミトゲンタンパク質又はそれらの類似 体との結合である。これらのりガント及び類似体は作動因子又は拮抗因子として も働く、リガンド結合性領域（ＬＢＲ）より成るこのリガンド結合部位は細胞外 領域（ＸＲ）の中にある。この機能性レセプターはりガントの結合に応答してシ グナルを変換せしめ、従って生ずる応答はリガンド調節型活性である。リガンド はＰＤＧＰ又はその類似体でありうるため、シグナルは通常ＰＤＧＦ調節型であ ろう。

第２生物活性はチロシンキナーゼ酵素活性に関連する。この活性は典型的にはり ガント結合に応答して細胞内的に活性化される。しかしながら、これらのレセプ ターは明らかに二量体状態で機能するため、鎖間結合相互作用が第３の生物学的 活性と考えられ、これはブロッキング剤が介在しうる。二量体相互作用、詳しく は機能性リガンド結合又はチロシンキナーゼ活性のブロッキング又は干渉は、レ セプタータンパク質フラグメントにより仲介されうる。従って、天然又は他のレ セプターポリペプチドへのこのレセプタードメインの類似体の導入はりガント仲 介活性のＰＤＧＦ仲介に影響を及ぼす付加手段として働きうる。

ＰＤＧＦレセプターの第４の機能は、他のタンパク質、例えばＰＩ３キナーゼに 対する結合性基質としてである。特に、このＰＤＧＦレセプターはりガント結合 又はその他の現象に応答して様々な位置にてリン酸化される。この結合相互作用 は、結合性タンパク質の細胞又は代謝応答を更に活性する部分の上の酵素活性を 活性化する。

「リガンド」なる語は、通常血小板由来の成長因子の科の構成員である分子であ って、リガンド結合性領域（ＬＢＲ）に結合するものを言う、この結合性領域は 典型的にはＸＲの中に見い出せる。更に、リガンドは、レセプターが結合する天 然リガンドとして、又はリガンドの機能的類似体のいづれかとして働く分子であ る。この類似体は作動因子又は拮抗因子として働きうる。典型的なリガンドは天 然ＰＤＧＦの構造的特徴を共有する分子、例えば類似のアミノ酸配列を有するポ リペプチド又はリガンドと分子特性を共有しているその他の分子であろう９分子 がリガンドとして機能するかどうかの決定は、リガンドの結合によって変化する パラメーター又は応答、例えば二量体又はチロシンキナーゼ活性の測定に依存す る０例えばＧｉｌｍａｎら（編）　（１９９０）並列μｎ　ａｎｄ工山咀１し」 肚」勧１ム遅四山１Ｌ旺組Ｌｏｒ　Ｔｈｅｒａ　ｅｕｔｉｃｓ、第８版、Ｐｅｒ ｇａｍｏｎ　Ｐｒｅｓｓ　（本明細書に参考として組入れる）を参照のこと。

このレセプターはりガント結合性領域（ＬＢＲ）　、言い換えればＰＤＧＦ及び その類似体のようなりガントの結合の親和力及び特異性の両方を決定するうえで 重要な領域を有している。このリガンド結合性領域はレセプターとりガントとの 結合相互作用を決定する。典型的には、これらの領域はりガント分子とレセプタ ーとの接点である。これらの分子の相互作用は結晶グラフ技術により、又はレセ プターのどの領域がリガンド相互作用において重要であるかを調べることによっ て決定できる。　ＰＤＧＦレセプターの細胞外領域の様々なセグメントがリガン ド結合性領域を構成し、一方、その他のセグメントはりガントを適切に結合させ るようにＬＢＲを適切な配置に立体的に並べる構造セグメントを構成する。

一般に、このフラグメントは少なくとも約６個の隣接アミノ酸、通常は少なくと も約８個の隣接アミノ酸、より通常には少な（とも約１０個の隣接アミノ酸、好 ましくは少なくとも約１３個の隣接アミノ酸、そしてより好ましくは少なくとも 約１５個以上の隣接アミノ酸の配列を有するであろう０通常、ＬＢＲは各Ｉｇ様 ドメイン、例えばドメインＤＩ、Ｄ２．Ｄ３．Ｄ４及びＤ５のシスティン（又は 相当物）内残基内にあるであろう、これらは好ましくはＤ３配列に由来するが、 ＤＩ及びＤ２に由来する配列も一般的であろう０時折り、Ｄ４゜Ｄ５又は他のタ ンパク質に由来する配列がＬＢＩ？機能を提供するであろう。

システィン（又は相当物）外領域は構造的機能を、ドメイン間スペーサーセグメ ントと同様に提供する。システィン内領域又はセグメントは表４及び５に示し、 そしてｃ、ｃ’　、ｃ′、Ｄ及びＥで示すセグメントを、Ｂ及びＦセグメントと の一部と共に表示の通り含んで成る。システィン外残基はＡ及びＧで示すセグメ ント、並びにＢ及びＦの一部を含んで成る。

リガンド結合性領域はある程度、ＰＤＧＦリガンド結合の親和力に及ぼすその存 在の重要性により、又はその影響によって規定される。

通常の、天然の全長ＰＤＧＦ−Ｒは約０．２ｓＭのＫｄで結合する０例えば、Ｄ ｕａｎら（１９９１）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６６　：　４１３−４１ ８（本明細書に参考として組入れる）を参照のこと。ＬＢＩＩは、その存在がリ ガンド結合に有用な影響を及ぼす、一般には少なくとも２倍、通常は少なくとも ４倍、より通常には少なくとも約８倍、そして好ましくは約１２倍以上にするポ リペプチドのセグメントである。　ＰＤＧＦリガンドに結合する本発明のフラグ メントは一般に約１０ｔＩＭ以下、より一般には約１μＭ以下、通常は約０．１ μＭ以下、より通常には約１０ｎＭ以下、好ましくは約１ｎＭ以下、そしてより 好ましくは約０．５ｎＭ以下のＫｄで結合するであろう。

エピトープは抗原決定基であり、これは抗体応答を潜在的に又は事実上誘発させ る。これは抗体結合領域又はその相当物により規定される構造的特徴と呼ばれる こともある。エピトープは免疫原性である必要はないが、しかしながら抗体分子 又はその相当物のための結合部位として働くであろう。

■、ポリペプチド 表１はヒ）Ｂ型車小板由来の成長因子レセプターポリペプチドの一つの対立遺伝 子の配列を開示する。核酸配列及びその対応のタンパク質配列の両方を提供する 。この核酸配列はＳｅｑ、ＩＤ　Ｎｏ、　１に相当する。アミノ酸配列はＳｅｑ 、ＩＤ　Ｎｏ、　２に相当する。相同性のマウス配列がＹａｒｄｅｎら（１９８ ８）ハｔｕｒｅ　３２３　：　２２６−２３２に報告されている。マウスのＰＤ ＧＦレセプターポリペプチドの配列はヒトレセプターポリペプチドの領域、ドメ イン及びβ−鎖セグメントに共通する構造的特徴も示す、マウスのポリペプチド 、及びその他の近縁のレセプターに由来するものは、類似のドメイン、相同性β −鎖セグメント及びセグメント間配列、並びに一般的な交換又は置換のための相 同配列の起源として寄与するであろう。

ｌ−土 ヒ）Ｂ型ＰＤＧＦレセプターのポリペプチドの対立遺伝子及びタンパク質の配列 入ＴＧ　ＣＧＧ　Ｃ”１”’ｒ　ＣＣに　ＧにＴ　ＣＣＧ　入〒Ｇ　ＣＣＡ　Ｃ ＣＴ　ＣＴＧ　ＣＣＣＣＴＣＡＡＡ　ＧＧＣＧＡＧ　ＣＴＣbＴＣ２３７ Ｍａｔ　ｋｒｑ　Ｌａｕ　ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｍａｔ　Ｐｒｏ　入１ａ　 Ｌｊｌｕ　入１ａ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　ＧＬｕ　Ｌａ普@シｕ　−ＬＳ ＴＴＧ　ＣＴＧＴＣＴ　ＣＴＣＣ’ｒに　ＴＴＡ　ＣＴＴ　ＣＴＣ（ＳＭ　ＣＣ Ａ　ＣＡＧ　ＡＴＣＴＣＴ　ＣＡＧ　１１．ＱＣＣ１にＴＣP１ｉ８ Ｌａｕ　Ｌａｕ　５ａｒ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　 Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｈｌｓ　Ｂａｒ　Ｇｌｎ　ＧＩＹＬ４ｕ　uａｎ　２ Ｃ；ＴＣＡＣＡ　ＣＣＣＣＣＧ　ＧＧＧ　ＣＣＡ　ＧＡＧ　ＣＴＴ　ＣＴＣＣＴ ＣＡＡＴ　ＧＴＣＴＣＣ入ＧＣ入ｃｃ　’ｒｒｃ　ｃτＴ　Rコ９ Ｖａｌ　Ｔｈｒ　ＰＬ−ＯＰｒｏ　Ｇｌｙ　ＰｒＯＧｌｕ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ｌ ａｕ　Ａ＋！ｎ　Ｖａｌ　５＠ｒ　Ｓａｒ　ｒｈｒ　Ｐｈ＠uａｌ　１９ ＣＴＧ　入ＣＣＴＧＣＴＣＣＣＣＴ　丁ＣＡ　ＧＣＴ　ＣＣＧ　ＧＴＧ　Ｃ，Ｔ Ｇ　ＴＧＧ　Ｇｋ入　ＣＧＧ　ＡＴＧ　ＴＣｅ　ｃ入に　Ｇ`に　）９０ Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｓａｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　 ｔａｕ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　入ｒｌｉ　Ｍａｔ　Ｂａｒ　Ｇｉ氏@Ｇｌｕ　３６ ＣＣＣＣＣＡ　ＣＡＧ　ＧＡＡ　入子ｃ　ｃｃｃ　大入Ｇ　ＧＣＣＣＡＧ　ＣＡ Ｔ　ｅＧｃ　Ａｃｅ　ＴＴＣＴＣＣ入ＧＣＣＴＣ（ＴＣ４４P Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｍａｔ　入１ａ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　 Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｐｈ唸　５ａｒ　５ａｒ　Ｖａｌ@Ｌａｕ　５１ ＡＣＡ　ＣＴＧ　ＡＣＣ大入ＣＣ′ＴＣＡＣＴ　にＧＧ　ＣＴＡ　ＧＡＣＡＣＧ 　ＣＧＡ　ＣＡＡ　ＴＡＣＴｒＴ　ＴＯＣＡｃＣＣＡＣ４９Q 丁ｈｒ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　ＸＡｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　しｍｕ　入ｓｐ　 Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｐｈａ　ｅｙｓ　丁ｈｒ@Ｈｉｓ　７ａ 入ＡＴ　ＣＡＣＴＣＣＣＣＴ　ｃｃｘ　ｃ’ｒｃ　ＧＡに　ｋｃｃ　ＣＡＴ　Ｇ ＡＧ　ＣＧＧ　大入入　ＣＯＣＣＴＣＴＡＣ＾τＣＴｒＴ５Sコ 入ａｎ　Ａｓｐ　Ｓａｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　ＩＪｕ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　入ｓｐ　 Ｇｌｕ　入ｉ　＋−Ｙｌ’　入ｒｑ　Ｌａｕ　Ｔｙｒ　Ｈｌ刀@Ｐｈａ　８７ ｍ　ＣＣＡ　ＱＡＴ　ＣＣＣＡｃｅ　（ＴＧ　ＧＧＣＴｒＣＣ’ＴＣＣＣＴ　Ａ ＡＴ　ＧＡＴ　ＧＣＣＧＡＧ　ＣＡＡ　ＣＴＡ　ＴｒＣ５９S Ｖａｌ　Ｐｒｏ　入ｓｐ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｐｈ＠　ＴＡｕ　 Ｐｒｏ　入ｓｎ　Ａｓｐ　入工ａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ@Ｐｈａ　１０４ 人Ｔｅ　ＴＴＴ　ＣＴＣＡＣ（ｌ　ＧＡＡ　ＡＴＡ　ＡＣＴ　ＧＡＧ　入ＴＣＡ ｅＣ入’！Ｔ　ＣＣＡ　ＴＧＣＣＧＡ　ＧＴＡ　Ａ（Ａ　Ｇ`Ｃ６４５ 工１ｍ　Ｐｈ１ｌ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　工１＠　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　工１＊ 　Ｔｈｒ　Ｘｉｓ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　入ｒｇ　Ｖａｌ　Ｔｈ秩@Ａｓｐ　１２１ ＣＣＡ　ＣＡＧ　ＣＴＣＧＴＧ　ＧＴＧ　ＡＣＡ　ＣＴＣＣＡＣＣＡＧ　大入Ｇ 　入＾＾　ＧＧＧ　ＧＡＣＣＴｒ　ＧＣＡ　ＣＴに　ＣＣＴ@６９６ Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ｌ４ｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　ＩＪｕ　＋４工ｓ　Ｇｌｕ 　Ｌｙｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｌａ普@Ｐｒｏ　ｌコ８ ＣＴＣＣＴ：、ＣＴＡＴ　に入丁　ＣＡＣＣＭ　Ｃ（：Ｔ　ＧＧＣＴＴＴ　ＴＣ Ｔ　（：ＧＴ　ＡＴＣＴｒＴ　ＧＡＧ　ＧＡＣＡＧＡ　ＡＣb７４７ Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｈｉｓ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｐｈ＠　 Ｂａｒ　Ｇｌｙ　工ｉｔ　Ｐｈ＠　Ｇｌｕ　ＡＩＩＰ　ｋｒ早@Ｓｅｒ　Ｌ５５ τ入ＣＡ丁ＣＴにｉＣ大入人　ＡＣＣ入ＣＣ入ＴＴ　ＧＧＧ　ＣＡＣ入ＧＧＧ入 ＧＧτＣＣ入子　τＣＴＧ入Ｔ　ＧＣＣＴＡＣ７９８’ｒｙｒ　工Ｌ＊　Ｃｙｓ 　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ 　Ａ１１ｐ　Ｂａｒ　入＄Ｐ　入PａＴｙｒ　１７２ Ｔ＾丁　Ｃ，ＴＣＴ入ＧＡＧ入　ＣＴＣＣＡＧ　ＣＴに　ＴＣＡ　ＴＣＣ入子Ｃ ＡＡＣＧＴＣＴＣＴ　ＣＴＧ　Ｍｅ　ＧＣＡ　ＣＴＧ　８４X Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｔ’ｌｒ　入ｒｑ　Ｌａｕ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｓｉｒ　Ｂａｒ 　１ｍ１１　人ｓｎ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　入Pａ　ＶａＬ　Ｌｌ １９ ＣＡＧ　ＡＣＴ　ＧＴＧ　ＧＴＣＣ（ｉＣＣＡに　ＧＧＴ　にＡＧ　ＡＡＣ入Ｔ ＣＡｃｅ　Ｃ’ｒＣＡＴＧ　ＴＧＣＡＴｒ　ＣＴＣ入τＣ９pＱ Ｃ１ｎ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｃ１ｕ　Ａｓｎ　 工１＠τｈＴ：　Ｌ４ｕ　Ｍａｔ　ＣＹＳ　工１ｅ　Ｖａ１H１ｅ　２０６ 表１、頁２ 表１、頁３ 人ＣＣＡＴＣ入子ＣＴＣＣＣＴＴ　入τＣＡＴＣＣ’ｒＣＡＴＣＡＴＣＣＴＴ　 ＴＯＣＣＡＧ　入ＡＧ　ＡＡＧ　ＣＣＡ　ＣＧＴ　１８６９τｈｘ　ＺＬｔ　工 １ａ　Ｂａｒ　Ｌａｕ　Ｘｉｓ　工１ｍ　Ｌａｕ　工ｌ＠　Ｍａｔ　Ｌｓｕ　Ｔ ｒｐ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｌｙｅ　Ｉ’ｒ潤@入ｒｑ　５２９ ＴｋＣＧＡＧ　ＡＴＣＣＣＡ　ＴＧｃ　八＾ｃｃ”ｗ　入ＴＴＣ＾Ｇ　１Ｃｒ　 ＧＴＧ　ＡＧＯＴＣＴ　ＧＡＣＧＧＣＣＡＴ　ＧＡＧ　１９Q０ ＴＹＴ　Ｇｌｕ　エユｅ　入ｎ　ＴｒＰ　Ｌｙｇ　Ｖａｎ　工１ｍ　ｃｌｕ　５ ａｒ　Ｖａｌ　Ｓａｒ　Ｓ龜ｒ　入ａｐＧ工Ｙ　Ｈｌｌｔ　fｉｕ　５４６ Ｔ入ＣＡＴＣＴＡＣにＴＧ　αＡｃ　ｃｃｃ　入ＴＧ　ＣＡＣＣＴＣＣＣＣＴＡ Ｔ　ＣＡｅ　Ｔ’ｅＣ入ｅＧ　Ｔ’ＣＧ　ＣＡＧ　ＣＴｔ：@１９７１ ’ｒｙｒ　エエａ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　入ｊｐ　ｆ’ｒｏ　Ｍａｔ　ＧＬｎ　Ｌａ ｕ　ＰｒＯＴ’ｆｔ　入ＪＩＰ　ｓａｒ　Ｔｈｒ　Ｔｒｐ　fｌｕ　Ｌａｕ　５ ６コ ＣＡＧ　ＧＴｃ　ＧＴに　ＣＡＧ　ＧＣＣＡＣＡ　ＧＣｒ　ＣＡＴ　Ｇｌｒ　Ｃ ＴＧ　ｋＧＣｅＡＴ　ＴＣＴ　ＧＡＧ　ＧＣＣＡＣに　入Ｔb２０フコ Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　人工ａ　Ｔｈｒ　入１ａ　ｔｕｇ　Ｇｌｙ　 Ｌａｕ　５ｅａｔ　Ｆｕａ　Ｓａｒ　Ｇｌｎ　入工ａ　Ｔｈ秩@Ｍａｔ　５９フ Ａ入入　ＧＴＧ　にＣＣＣＴＣ入＾Ｇ　ＡＴＩ：　ＣＴｒ　大入入　ＴＣＣＡＨ Ａ　ＧＣＣＣｃｅ　ＡＧＣｋＧＴ　ＬＪａ　ＡＡＧ　ＣＡＡ@２１２４ １ｙｅ　Ｖａｌ　入工ａ　Ｖａｌ　ＬＹＩＩ　Ｍａｔ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　Ｓａｒ 　Ｔｈｒ　人ユａ　入ｒ９　Ｓｉｒ　ｓｉｒ　Ｇｌｕ　Ｌｙ撃戟@Ｇｉｎ　６１ ４ ＧＣＣＣＴＴ　入τＣＴＣＣｃｋＧ　ＣＴＣ大入Ｇ　ＡＴＣ入ｍ　Ａｌ；Ｔ　Ｃ ＡＣＣ”Ｌ”ｒ　ＧＧＧ　Ｃ（：ＣＣＡＣＣＴＧ　ＡＡＣ２P丁５ 人上ａ　ＸＡｕ　Ｍａｔ　Ｓａｒ：　Ｇｌｕ　ＬＪｌｕ　Ｌｙｓ　工ｉｔ　ｓａ ｔ　Ｓｕｒ　Ｈｌｓ　Ｌａｕ　Ｓｌｙ　Ｐｒｏ　Ｈｌｌｔ　狽≠普@入ｓｎ　６ コエ ＧＴＣＧＴＣＡＡＣ（ＴＧ　ＴＴＣ；　ＧＧＧ　ＧＣＣＴＣＣＡｃｅ　ＡＡＡ　 ＧＧＡ　ＧＧＡ　ＣＣＣ入？Ｃ７１丁　ＡＴＣ入子Ｃ２２２U ｖａｌ　Ｖａｌ　入ｓｎ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｃｙｇ　Ｔｈｒ　 Ｌｙｓ　ｃｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　工１ａＴｙｒ　工１ｔｒ@工λ唸　６４８ ＣＡＣＡｃＣコＴｃ　ＣＴＣｃＡＧ　ＣＡＣＣＡｅ　ＴＣＣＣＡＣ大入Ｇ　ｅｃ ｃ　ＣＧＣＣＣＧ　Ｃｅｅ　Ｍ：ＣＧＣＣＧｊＬｌｌ；　２R２３ １１１ｓ　Ｔｈｒ　！’ｈ＠　Ｌａｕ　Ｇｌｎ　Ｈｌｓ　Ｈｌｓ　Ｓａｔ　入ｓ ｐ　Ｌｙｓ　入ｒ’７　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｓａｒ　■Pａ　Ｇｌｕ　６ １１２ Ｃ’ｒＣＴＡＣＡＧＣ大入Ｔ　ＧＣＴ　ＣＴに　ＣＣＣ（ＴＴ’　（５ＣＴＣＣ ＣＣＣＴＣＣＣＣ入ＧＣＣ入子　ＣＴＧ　ＴＣ（：　２コアX Ｌａｕ　Ｔｙｒ　ＳａｒんｍにＬａ　ＩＪａｕ　Ｐ’ｔ’ＯＶａｌ　ｃｌｙ　Ｌ ａｕ　ケｏ　Ｉｊｌｕ　ｐｒｏ　Ｓｔｒ　）ｌｘｓ　！Ｊａ■rｉｒ　６９９ ＣＣＴ　ＧＡＧ　ＡＧＧ　ＡｃＣＴ（：ＣｅＧＡ　ＧＣＡ　入ＣＴ　Ｔｒに　Ａ ＴＣ入ＡＣＧＡＧ　ＴＣＴ　ＣＣＡ　ＧＴＧ　ＣＴＡ　入Ｇb２５８コ Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　人ｒｑ　Ｔｈｒ　ＣＹｓ　ＡＱ　入１ａ　Ｔｈｒ　ＩＪｕ　エ エｔ　入ｓｎ　ＧＬｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｌａｕ　rａｒ　７６７ 表１、頁４ 表１、頁５ 表２はヒトＡ型皿小板由来成長因子レセプターポリペプチドの対立遺伝子の配列 を開示する。核酸配列及びその対応のタンノ々り質配列の両方を提供する。この 核酸配列はＳｅｑ、ＩＤ　Ｎｏ、　５に相当する。アミノ酸配列はＳｅｑ、ＩＤ 　Ｎｏ、　４に相当する。他のヒ）Ａ型対立遺伝子配列はＭａｔｓｕｉら（１９ ８９）　５ｃｉｅｎｃｅ　２４３　：　８００−８０３に報告されてし為る。

盗−−１ ヒ）Ａ型ＰＤＧＦレセプターのポリペプチドの対立遺伝子及びタンパク質の配列 表２、頁２ τ入Ｔ　ＣＧＡ　ＡＧＣ五人＾　Ｔτ入　入λＧ　ＣＴに　入τＣＣにＴ　ＧＣ Ｔ　ＡＡＧ　Ｇ入入　Ｇ入入　ＧｋＣＡＧＴ　ＧＧＣＣＡＴ@ｌコ０１ Ｔｙｒ　Ａｒｇ　５ａｒ　ＬｙｌＩＬａｕ　Ｌｙｓ　Ｌａｕ　工１ｅ　Ａｒｇλ ｌａ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　ＡＪ！ｐ　Ｓａｒ　Ｇｌｙ@Ｈｉｓ　３６８ Ｔ入Ｔ　入ＣＴ　入Ｔｒ　ＧＴＡ　ＧＣＴ　Ｃ入入　五人Ｔ　Ｃ入入　ＣＡＴ　 ＧＣＴ　ＣＴＣ五人Ｇ　入ＧＣＴ入Ｔ　入ＣＴ　τＴ？Ｇ入O　入入５２ Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｘｌ＠　Ｖａｌ　入１ａ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　 入１ａ　Ｖａｌ　Ｌｙｅ　５ａｒ　’Ｑｒ　Ｔｈｒ　Ｐｈａ@Ｇｌｕ　コＢ５ ＧＧＣＴＣＡ　ＡＣＴ　ＧＧＧ　ＣＧＡ　ＣＡＧ　ＡＣに　ＧＴＩ：　ＡＧＧ　 ＴＣＣＡＣＡ　ＧＣＴ　Ｇ入入　ＧＧＣＡｃＧ　ＣＣＣＣＴ秩@１４５４ Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　入ｒｑ　 Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　（：ｌｕ　Ｇｌｙ　’ｒｈｒ　Ｐ窒潤@ｒ、４ｕ　４ １９ ＣＡＣＴＣＣＣにＡ　ＧＡＣＡＣ，ＣＡＧＴ　ＡＧＣＧＴＧ　ＧＡＧ　ＧＧＣＣ Ｃ；Ｔ　ＣＴＧ　入ＣＴ　ＴｒＣＧｅＣＡＡＡ　ＣＴＧ　１U０７ Ｈ１ｓ　Ｓｅｒ　Ａｒｑ　入ｓｐ　ｘｒｑ　Ｓａｒ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　ＧＬｕ　 ａｌｙ　入ｒｑ　ＶａＬ　Ｔｈｒ　Ｐｈ働　入Ｌａ　Ｌｙｓ@Ｖａｌ　４７０ 表２、頁３ １：ＴＣＧＴＴ　（ＴＣ入ＴＴ　ＴＧＧ　大五人　ＣＡＧ　入ＡＡ　ＣＣＧ　入 ＧＧ　ＴＡＴ　ＣＡＡ　入Ｔτ　ＣＧＣＴＣ：Ｇ　入ＧＧ　fＴＣ１１１１１ Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　工ｉｓ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ｇ工ｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　 Ａｒｇ　Ｔｙｒ　（：ｌｕ　工ｌ−人ｒｇ　Ｔｒｐ　Ａｒｇ@Ｖａｌ　５３Ｂ ＡＴ？　ＧＡＡ　ＴＣＡ　入ＴＣＡＧｅ　ｅＣＡ　ＧＡＴ　ＧＧＡ　ＣＡＴ　Ｇ ＡＡ　ＴＡＴ　入’ｒ’ｒ　Ｔ入”ｌ’　ＧＴＧ　ＧＡＣＣbＧ　ＡＴＧ　Ｌ８ ６２ 工ｌａ　Ｇｌｕ　Ｓｉｒ　工ｉ＠　Ｓｓｒ　Ｐｒｏ　入１１Ｐ　ＧＩＹ　Ｈｉｓ 　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　工ｌ＠　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　入ｍｐ　Ｐｒ潤@Ｍａｔ　５５５ ＣＡＧ　ＣτａｃＣｒ　ＴＡＴ　ｃＡＣＴＣＡ　ＡＧＡ　Ｔ（Ｊ　にＡＧ　’！ ”ＩＩ”’ｒ　ＣＣＡ　ＡＧＡ　ＧＡＴ　ｃｃＡ　ＣＴＡ　モ窒モャ■s　１９ １コ Ｇｉｎ　！Ｊｕ　Ｐｒ口　Ｔ’ｙｒ　Ａｓｐ　５ＩＩｒ　入ｒｇ　Ｔｒｐ　Ｇｌ ｕ　Ｐｈａ　Ｐｒｏ　入ｒ９　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　Ｖ≠戟@Ｌａｕ　５７ ２ ＣＧＴ　ＣＣＧ　ＧＴＣＴＴＧ　ＧＧＧ　ＴＣＴ　ＣＧＡ　ＧＣＧ　ＴＴＴ　に ＩＪ：　入＾Ｇ　ＧＴＧ　ＧＴＴ　Ｇｋｋ　ＧＧＡ　ＡＣＡ@ＧＣＣ１９６４ Ｇｌｙ　入ｒｇ　Ｖａｌ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　ｓａｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｐｈａ　 Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ@Ａｌａ　５１１９ ＴｋＴ　ＣＧＡ　ＴＴＡ　入Ｇｃ　ＣＧＣＴＣＣＣＡＡ　ＣｃＴ　ＧＴＣ入ＴＯ 大五人　ＧＴＴ　ＧＣｋ　ＧＴＧ　ＭＧ　ＡＴＣＣＴＡ　２i１１５ ＴＹ？　Ｇｌｙ　Ｌ−ｕ　Ｓｉｒ　Ａｒｇ　ｓａｒ　Ｇ１．ｎ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ 　Ｍａｔ　Ｌｙｌｌ　Ｖａｌ　入１ａ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｍ≠煤@ｋｕ　６０６ 人入＾五人ＣＣＡｃＧ　ＧＣＣＡＧＡ　ＴＣＣＡにＴ　ＣＡＡ　大五人　ｃ入入 　ＧＣＴ　ＣＴＣＡＴＧ　ＴＣＴ　に五人　ＣＭ；　入ＡＧ@２０６６ Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　入１ａ　入ｒｇ　ｓａｒ　ｓａｒ　Ｇｌｕ　Ｌ、ｙｓ 　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｌ虐ｕ　Ｍａｔ　Ｓｓｒ　Ｇｌｕ　Ｌａ普@Ｌｙｇ　６２３ Ｈ：　Ｑ：　：訂等：：　言：：　Ｈ：　：：　：：　）、’！；：　π↑：： 　＝３＝訂＊２Ｌ：会：ＴＧＣＡＣＣＡＡＧ　ＴＣＡ　ＧＧＣＣＣＣＡ’！Ｔ　 ＴＡＣ入ＴＣＡＴＣＡＣＡ　ＧＡに　ＴＡＴ　ＴＧＣＴＴＣＴＮＴ　にＧＡ　２ １６W ｅｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　５ｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ工１ｔＩＴｙｒエエーエエ＠ 　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｔｙ■７ｓ　Ｐｈｓ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　U５７ Ｇλ丁　ＴＴＧ　ＧＴＣ五人ＣＴλＴ　ＴＴＧ　ＣＩＡＴ　ＡＡＧ　五人Ｔ　Ａ ＧＩ：　ＧＡＴ　ＡＧｃ　ＴｒＣＣＴＣ入ＧＣＣ入ＣＣλｅ@２２１９ ＾ｇｐ　ｔａｕ　Ｖａｌ　入ａｎ　Ｔｙｒ　Ｌ＠ｕ　Ｈｌｓ　Ｌｙｇ　入ｓｎ　 入ｒｇ　入ｓｐ　Ｓｅｒ　Ｐｈａ　Ｌａｕ　５＊ｒ　Ｈｌｓ@）ｌｉｓ　６７４ ｃｅ入　ＧＡＧ　）ＡＧ　ＣＣＡ　五人Ｇ　大五人　ＧＡＧ　ＣＴＧ　ＧＡＴ　 ＡＴＣｒ　ＧＧＡ　’Ｌ”’１’Ｃ入ＡＣＣＣＴ　ＣＣＴ　fＡＴ　２２７゜ Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｌｙｇ　Ｌｙｅ　（：ｌｕ　Ｌａｕ　＾罫ｐ 　Ｉｌｅ　Ｐｈｓ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　入ｓｎ　Ｐｒｏ　入ｌ普@入ｓｐ　（１９ １ ＧＡＡ　ＡＧＣＡＣＡ　ＣＣＧ　入ＣＣＴＡＴ　ＧＴＴ　ＡＴＴ　ＴＴＡ　ＴＣ Ｔ　ＴＴｒ　ＧＡＡ　ＡＡＣＡＡＴ　ＣＧＴ　ＧＡＣτ入ｃ@２コ２１ Ｇｌｕ　５ｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｓａｒ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　工１ａ　Ｌａｕ　 ５ｅｒ　Ｐｈ＠　Ｇｌｕ　Ａｇｎ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ@Ｔｙｒ　７０８ ＡＴＧ　ＧＡＣＡＴＧ　入＾Ｇ　ＣＡＧ　ＧＣ’ｒ　にＧＡＴ　ＡＣＴ　ＡＣＡ 　ＣＡＧ　ＴＡＴ　ＧＴＣＣＣＣＡＴＧ　ＣＴＡ　ＣＡＡ　`（Ｇ　２３７２ Ｍ１　λ！ｐ　Ｍａｔ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　入１ａ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｇ ｉｎ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｉ’ｒｏ　Ｍｓｔ　Ｌａｕ　のり　`ｒｇ　７２５ 人入＾五人Ａに　ＣＴＴ　ＴＣＴ　ＡＡＡ　ＴＡＴ　ＴＣＣＧＡＣＡＴＣＣＡＧ 　ＡＧＡ　ＴＣＡ　ＣｒＣＴＡＴ　ＧＡＴ　ＣＧＴ　ＣＣＡ@２４２ユ Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　ｓａｒ　Ｌｙｅ　Ｔｙｒ　５ａｒ　Ａｓｐ　Ｉｌａ　 ｃ工ｎ　Ａｒｇ　Ｂａｒ　Ｌａｕ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　入ｒｑ@Ｐｒｏ　７４２ ＧＣＣＴＣＡ　ＴＡＴ　入＾Ｇ　五人Ｇ　ＡＡＡ　ＴＣＴ　入ＴＣＴｒＡ　ＧＡ ＣＴＣＡ　ＣＡＡ　Ｃ’ｒＣ五人Ａ　五人ＣＣＴＣＣＴ！’@２４７４ 人１ａ　ｓｅｒ　’ｒｙｒ　Ｌｙｓ　Ｌｙｌｌ　ＬＹｓ　ＳｅＪ：　Ｍｅｔ　Ｌ ａｕ　Ａ１１ｐ　ｓｔｒ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　入ｓｎ@Ｌａｕ　Ｉａｕ　 ７５９ 丁ＣＡＣＣＡＴ　ＣＡＴ　ＡＡＣＴＣＡ　（入＾　ＧＧＣＣＴＴ　ＡＣＴ　ＴＴ Ａ　ＴＴＧ　ＣＡＴ　ＴＴＧ　ＴＴＧ　ＡＧＣＴｒＣＡｃｅ@２５２５ Ｓ＠ｒ　Ａ１１ｐ　ｘｓｐ　Ａｇｎ　Ｓａｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ 　Ｌａｕ　Ｌａｕ　人Ｓｐ　Ｌａｕ　Ｌｓｕ　５ｅｒ　ＰｈPｌ　Ｔｈｒ　７７ ６ Ｔ入Ｔ　ＣＡＡ　ＣＴＴ　ＧＣＣＣＧＡ　ＧＧＡ　ＡＴＣＧＡＧ　ＴＴＴ　ＴＴ Ｇ　にＣＴ　ＴＣＡ　ＡＡＡ　入ＡＴ　ＷＴ　ＧＴＣ（：入b２５７６ Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　入１ａ　ｋｒｑ　Ｇｌｙ　Ｍａｔ　Ｇｌｕ　Ｐｈａ　 Ｌａｕ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ@１４ｉｓ　７９コ 表２、頁４ 表２、頁５ ポリペプチド又は核酸は、それが組成において対応のポリマーの少なくとも約３ ０％、典型的には少なくとも約５０％、より典型的には少なくとも約７０％、通 常は少なくとも約８０％、より通常には少なくとも約９０％、好ましくは少なく とも約９５％、そしてより好ましくは少なくとも約９８％以上を含んで成るとき に実質的に純粋又は実質的に精製されている。

細胞外領域の可溶性フラグメントは一般に約４００個以下のアミノ酸、通常は約 ３５０個以下のアミノ酸、より通常には約３００個以下のアミノ酸、典型的には 約２００個以下のアミノ酸、そして好ましくは約１５０個以下のアミノ酸であろ う。

Ａ、Ｄドメイン 数多くの観察に基づき、これらのＰＤＧＦレセプターポリペプチドの細胞外領域 （χＲ）は５つの免疫グロブリン様ドメインを含んで成る。

第１に、そのアミノ配列はＩｇ様ドメイン構造の特徴的な５つのセグメントを含 み、それぞれのセグメントは免疫グロブリンドメインについての適切なサイズを 有している。第４を除く各セグメントは、免疫グロブリン様ドメインの診断特性 である特徴的な間隔の開いたシスティン残基を有している。このレセプターポリ ペプチド配列は免疫グロブリン様ドメイン構造のその他の特徴、例えば特徴的に 位置したトリプトファン及びチロシン残基の存在を示している。このレセプター ポリペプチドと、真性免疫グロブリンドメインの対応のセグメントとの直接的な 比較は、ＰＤＧＦレセプターポリペプチドドメインと免疫グロブリンドメインと の統計学的に有意な類似性を示した０例えば−ｉｌｌｉａｍｓ　（１９８９）　 ５ｃｉｅｎｃｅ　２４３　：　１５６４−１５７０を参照のこと。

このレセプターポリペプチドドメインが免疫グロブリンドメインの折りたたみパ ターンを帯びている説はこのレセプターポリペプチドの推定二次構造を調べるこ とによって強めることができる。

相同性地図化分析を行うとき、ＰＤＧＦレセプターポリペプチドは細胞外領域に おいて５つのＩｇ−ｍドメインを示し、それぞれのドメインは５、規定されたＩ ｄ？！ドメインに統計学的に有意な相同性を示す。

例えば−ｔｌｌｉａａｓとＢａｒｃｌａｙ　（１９８Ｂ　）　劾ル２…、　ｔ■ ｕｎｏ１．郭ｏｃｈｅｓ、　６　：３８１−４０５を参照のこと。相同の領域は 特に１ｇ様ドメインに対して有意な配列相同性を示し、そしてＩｇ様トドメイン 特徴的な特定の二次及び三次構造のモチーフを示すであろう、このドメイン構造 は好ましくはドメイン構造の境界にほぼ一致する境界を有するようなセグメント であろう、これらの境界は好ましくは約９個以内のアミノ酸、典型的には約７個 以内のアミノ酸、より典型的には約５個以内のアミノ酸、通常は約３個以内のア ミノ酸、そしてより通常には１個以内のアミノ酸で一致する０例えばＣａｎｔｏ ｒとＳｃｈｉｍｍｅｌ　（１９８０）Ｂｆｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔ ｒ−第１−１［１巻、Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏ、、　５ａｎＦｒａｎｃｉ ｓｃｏ　；　Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ　（１９８４）　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　：　５ｔ ｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃ　ｆａｒＰｒｑμ汀土１−ｅｓ、　Ｆｒｅ ｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　ｉ並びに―ａｔｓｏｎら（１ ９８７）Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｅｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｇｅｎｅ、 第１及び第２巻、Ｂｅｎｊａｍｉｒ＋。

Ｍｅｎｌｏ　Ｐａｒｋ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　（それぞれ本明細書に参考と して組入れる）を参照のこと。

ヒトＢ型及びヒトＡ型レセプターポリペプチドの配列は、それらのベーター鎖ト ポロジーを推定するために分析に付されうる。疎水性配列パターンのフーリエ分 析及びＧａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ計算法（例えばＧａｒｎｉｅｒら（１９７ ８）　Ｊ、門ｏ１．Ｂｉｏ１．１２０　：　９７を参照のこと）をターンプレデ ィクタ−プログラム（ｔｕｒｎ　ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ　ｐｒｏｇｒａｍ）と組合 せることは（Ｃｏｈｅｎら（１９８６）　Ｂｉｏｃ側１■ｕ２５二２６６に報告 ）、特徴的な構造パターンを提供する。このパターンは上記の通りに分析したと きに、各ドメインにおいて共通β−鎖セグメントを示す。

ＰＤＧＦレセプターの最初の２つの１ｇｌドメイン、Ｄｌ及びＤ２は約７つのβ −鎖セグメントであって、アミノ近位からカルボキシ近位の方向に向って挙げて 、Ａ５、Ｂ、Ｃ，Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧセグメントと表示するものを有する３、第３ 、第４及び第５のＩｇ様トドメインＤ３．Ｄ４及びＤ５はＣ′で表示する追加の β−鎖セグメントを含むのに十分な長さである。第５ドメイン、Ｄ５は種々の重 鎮ドメインと長さにおいて最も近く類似する。Ｂ型しセプターポリペプチドＤ５ は更に、Ｃ′で表示する追加のβ−鎖セグメントを含んで成る。

これらの特徴及び表示は、Ｂ型及びＡ型ｈＰ［１ＧＦ−Ｒポリペプチドにおける ドメイン及びセグメントとマウスのＢ型ＰＤＧＦレセプターポリペプチドのセグ メントとの相同性にある程度基づき、そして更に、その他のタンパク質、特にそ の他の成長因子レセプター上に見い出せるその他の１ｇ様上セグメント対する相 同性に基づ＜ａ　ｃｓｆ　ｌレセプター及びｃ−ｋｉｔプロト癌遺伝子は類似の Ｉｇ様ドメイン構成を有する。例えば−ｉｌｌｉａｍｓ　（１９８９）　５ｃｉ ｅｒ＋ｃｅ　２４３　：　１５６４−１５７０を参照のこと。

ドメイン構造はある程度、近縁のレセプターを含む他のタンパク質において見い 出せる！、様ドメインに共通する特徴を基礎とする。

例えば旧１ｒｉｃｈとＳｃｈｌｅｓｓｉｇｅｒ　（１９９０）　Ｃｅ１ｌ　６１ 　：　２０３−２１２　；　ＹａｒｄｅｎとＵｌｌｒｉｃｈ　（１９８）　Ａｎ ｎ、Ｒｅｖ、Ｂｊｏｃｈｅｍ、　５７　：　４４３−７８を参照のこと。

本明細書で開示する２種類の対立遺伝子に関するドメイン境界を以下に示すが、 しかしながら異なる対立遺伝子はその境界に関して位置が若干異なりうる９表１ ４を参照のこと。

■ｇ様ドメイン（ｍドメイン）は細胞外領域におけるシスティン残基の規則的な 間隔を特徴とする。それぞれが約１００のアミノ酸の長さであるこれらの５つの ドメインはβ−シートに富む構造を有し、免疫グロブリンの可変又は定常領域に 類似する。　Ｗｉｌｌｉａｍｓ　（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４３　：　１ ９６４−１５７０を参照のこと、天然のＸＲｍドメインアミノ近位ドメインＤ１ から、ＸＲのカルボキシ近位末端のＤ５にわたって順に番号付けした。

マウスのＢ型ＰＤＧＦレセプターポリペプチド遺伝子のエキソン構造も妥当な適 合度でこのドメイン構造に一致する。イントロンーエキソン構造と機能性単位と の関係は、この境界がポリペプチドの機能性単位を規定するという仮説を更に裏 付けする０例えば、Ｗｉｌｌｉａｉ＋ｓとＢａｒｃｌａｙ　（１９８８）　Ａｎ ｎ、Ｒｅｖ、ｌｍ５ｕｎｏ１．Ｂｉｏｃｈｅｗ、　６　：　３８１−４０５を参 照のこと、これらの各セグメントについての境界を、本明細書に開示する２つの 対立遺伝子に関する下記に示し、そして類似の境界が配列及び機能的相同性の位 置において、その他の対立遺伝子において見い出せるであろう。

ヒト血小板由来成長因子レセプターポリペプチドのアミノ近位１ｇ様ドメインは Ｄｌで表示した。Ｄ１ドメインは、Ｂ型レセプターポリペプチドにおいておよそ Ｉｅｕ　（１）からｐｒｏ　（１０１）にまで及び、そしてＡ型レセプターポリ ペプチドにおいておよそｇｌｎ　（１）からｐｒ。

（１０１）にまで及ぶ。表１４を参照のこと。Ｄ１ドメインは明らかに約７つの β−シートセグメントを有する。

天然のヒト血小板由来成長因子レセプターポリペプチドのカルボキシ近位方向に おける次のＩｇ様トドメインＤ２で表示した。このＤ２ドメインはＢ型レセプタ ーポリペプチドにおいておよそｔｈｒ　（９２）からｓｅｔ　（１８１）にまで 、そしてＡ型レセプターポリペプチドにおいておよそａｓｐ　（１０２）からｓ ｅｔ　（１８９）にまで及ぶ、このＤ２ドメインはＡ、Ｂ、Ｃ，Ｄ、Ｅ、Ｆ及び Ｇで表示する約７つのβ−シート鎖も有することが認められている。

天然のヒトＰＤＧＦレセプターポリペプチド上に見い出せる第３のＩｇ様トドメ インＤ３と表示した。このＤ３ドメインはＢ型レセプターポリペプチドにおいて およそｔｉｅ　（１８２）がらｇｌｙ　（２８２）にまで、そしてＡ型レセプタ ーポリペプチドにおいておよそｇｌｕ　（１９０）からｇｌｙ　（２９０）　ニ まで及ぶ。このＤ３　ＦメインはＡ、Ｂ、Ｃ，Ｃ’　、Ｄ。

Ｅ、Ｆ及びＧで表示する約８つのβ−シート鎖を有することが認められている。

天然のヒトＰＤＧＦレセプターポリペプチドにおいて見い出せる第４のＩｇ様ト ドメインＤ４で表示した。このＤ４ドメインはＢ型レセプターポリペプチドにお いておよそｔｙｒ　（２８３）からｐｒｏ　（３８４）にまで、そしてＡ型レセ プターポリペプチドにおいておよそｐｈｅ　（２９１）からｐｒｏ　（３９１） にまで及ぶ、このＤ４ドメインは約８つのβ−シート鎖を有することが認められ ている。Ｄ４ドメインは特徴的なシスティン残基を欠き、それらがＢ型配列にお いて示すｖａｌ　（３０６）と■ｅｔ（３６４）、そしてＡ型配列において示す ｖａｌ　（３１３）とｉｌｅ　（３７１）になっていることに注目すべきである 。

第５のＩｇ様トドメイン１）５で表示した。このＤ５ドメインはＢ型レセプター ポリペプチドにおいておよそｖａｌ　（３８５）からＩｙｓ　（４９９）にまで 、そしてＡ型レセプターポリペプチドにおいておよそｓｅｔ　（３９２）からｇ ｌｕ　（５０１）にまで及ぶ、Ｂ型レセプターポリペプチドのＤ５はＡ、Ｂ、Ｃ ，Ｃ’、Ｃ′、　Ｄ、　Ｅ、Ｆ及びＧで表示する約９つの推定β−シート鎖を有 し、他方、Ａ型レセプターポリペプチドはＣ＃上セグメント欠く約８つのβ−鎖 セグメントのみを有している。

これらのドメインとβ−鎖セグメントとのおよその境界を表１４に挙げる。これ らのセグメントの明らかにされた配列を表４及び５に示す。このレセプターポリ ペプチドの他の対立遺伝子も、上記のように相同又は構造解析のいづれかによっ て解析されうる。

！　口　Ｖ　ジ　５１ １　仁　ｏ　Ｂ　ｍ　ｍ ＝　コ　ヨ　；３ｉ 摸笥のｐ１ドメインは前記の＋ｊ、　トＢ型レセプターポリペプチド及びヒトＡ 型し七ブターポリペブチＦの配列である。しかし７ながら、所７の＋１ガント結 合機能を保持する適合的なアミノ酸置換、押入及び欠失がなされうる。この機能 は通常適切な構造セグメントの利用による、！、８Ｒセグメントを正しい方向に 維持することによって保持されるであろう。保存性置換は典型的には以下のグル ープ内置換を含むニゲリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；ア スパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン ；リジン、アルギニン；及びフェニルアラニン、チロシン、Ａ型とＢ型のレセプ ターポリペプチド間の、又は別の近縁のレセプターポリペプチド間を含む、種々 のドメイン由来のβ−シートセグメント又はこのセグメントの中間の配列の置換 又は交換が実施されうる。β−上セグメント及びＦ内の模範のシスティン（ただ し、Ｂ型のＤｉにおいてはｖａｌ　（３０６）とｓｅｔ　（３６４）　、そして Ａ型Ｄ４においてはｖａｌ　（３１３）　とｉｌｅ　（３７１））の外側のセグ メントはそれらの間の残基、例えばＣ，Ｃ’　、Ｃ’、Ｄ；及びＥのβ−鎖セグ メントはど重要ではない。更に、これら開示されているセグメントに相同なセグ メント７、例えば適合性アミノ酸置換、挿入及び欠失されたものが置き代わりう る。類似のドメイン及びセグメントの起源には、ヒト又はその他の哺乳類に由来 する近縁レセプターポリペプチドが含まれる。非哺乳類レセプターポリペプチド も有意なる相同性を示しうることがあり、従って類似のセグメントの起源として 寄与しうる。

その他のＩｇ様トドメインびセグメントも置き代わりうる。

本発明は開示した及び記述したセグメント及びドメインとの相同性を示すポリペ プチドを包括している。これは開示した配列の隣接アミノ酸、典型的には少なく とも約８個の隣接アミノ酸、より典型的には少なくとも約１１個の隣接アミノ酸 、通常には少なくとも約１４個の隣接アミノ酸１．より通常に（１大小なくとも 約１７個例削ｔアミノ酸、そして好ましくは少なくとも約２１個以上の防接アミ ノ酸を含んで成る。Ｌｆ３Ｒ七グメントを保持している構造体が量も有用である ８本発明は更にこれらの配列の改質、例Ａば挿入、欠失及び別のアミ、）酸との 置換を含む。大量に又はわずかのいづれかでのグリ」シル化修飾、同様に他の配 列修飾が考えられる。従って、これらのアミノ酸配列を含んで成る改質タンパク 質、例えば類似体は通常その機能又は構造のいづれにおいてこれらのタンパク質 と実質的に同等であろう。

β−シート鎖はペプチド配列における個々の挿入又は欠失によって若干長くする 又は短くしてよい、従って、一定の態様は、β−シート鎖の特定の配列又はそれ らの鏡開配列に付加又は欠失を行うことにより、若干長めの又は短めの特定のド メインを有するであろう。

適切なドメイン内及びドメイン間相互作用の保持の構造条件に合うようにセグメ ントを挿入又は欠失させてよい、特に、このタンパク質の二次及び三次構造を妨 害する変化は好ましくないであろう０例えばＣａｎｔｏｒとＳｃｈｉｍｓｅｌ　 （１９９０）及びＣｒｅｉｇｈｔｏｎ　（１９８９）を参照のこと。更に、β− シート鎖の外側及びドメインの間の領域においてアミノ酸又はセグメントを挿入 又は欠失させてよい。典型的には、置換は類似の特性を有するアミノ酸により、 そして付加又は欠失はレセプターの生物学的機能、例えばリガンド結合性を保持 せしめるものの中で選ばれるであろう。

β−シートセグメントの配列は典型的にはヒｌ−Ｂ型ポリペプチド又はヒトＡ型 ポリペプチド由来の配列と、約５０％以上相違せず、より典型的には約３９％以 下、通常は約２９％以下、そしてより通常には約２０％以下で相違する。各ドメ インの非β−シート鎖それぞれに通しる匹敵の類似性が好ましい。

ドメイン間の境界はある程度、Ｉｇ様トドメインおけるドメインに関する定義に よって規定される。類似のドメインの例は免疫グロブリン及び成長因子レセプタ ーポリペプチドにおいて見い出せる。

ＤｌとＤ２ｉＤ２とＤ３ｉＤ３とＤｉ；及びＤｉとＤ５の間のドメイン境界はほ ぼエクソン位置に相当しており、このドメイン構造が進化的及び機能的単位に対 応するという仮説を更に裏付ける。例えば１ｌｌａ　ｔｓｏｎら、（１９８７） 　Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｇｅｎｅ、第 １及び第２巻、Ｂｅｎｊａｍｉｎ、　Ｍｅｎｌｏ　Ｐａｒｋ＋　Ｃａ１ｉｆｏｒ ｎｉａを参照のこと。

表４及び５に示した配列により示されている通り、Ｄ２ドメインはＤ１ドメイン に類似な特徴を有している。このドメインの第３セグメント、又はＤ３も相同性 を示すが、しかしながらＣで表示する更なるβ−鎖セグメントを有している。Ｄ ４セグメント又はＤｉは、他のドメインにおいては一般にシスティンに相当する 位置にて非システィン残基を有する。示しているＢ型対立遺伝子において、その 残基はｖａｌ　（３０６）及びｓｅｔ　（３６４）であり、一方Ａ型対立遺伝子 においては、その残基はｖａｌ　（３１３）及びｉｌｅ　（３７１）である、ド メイン５、又はＤ５は、共通のシスティン残基及び更なるＣ′β−鎖セグメント を有し、そしてＢ型レセプターポリペプチドは更なるＣ″β−鎖セグメントを有 している。

本発明はりガント結合性構造体を含んで成る、典型的には実質的に完全なドメイ ンを含んで成る様々な構造体を提供する。これらの構造体はりガントを結合させ るための、又はインタクトレセプターポリペプチドを代替するような様々な用途 を有するであろう。例えば、個々のドメインそれぞれは、個々のポリペプチドの みを含んで成るか、又は別のペプチド、例えばｈＰＤＧＦ−１？のようなレセプ ターペプチドのＴ？ｌ及びＩＲ領領域融合されていてよい０例えば表６を参照の こと。これらの個々の単一ドメインポリペプチドは、これらの特定の）′メイン に関連する比活性を、好ましくは作動因子又は拮抗因子として、好ましくはイン タクトレセプターポリペプチド又はＸＲと共通の特徴を伴って示すであろう、こ れらのドメインはりガントに結合するのに天然のＰＩ）ＧＰレセプターと競合す る、ＰＤＧＦ−Ｒポリペプチドの競合インヒビターとしても働くことが好ましい ０本発明は単一ドメインの繰り返し配列も提供する。＠えば、Ｄ１ドメイン自体 を提供し、単一ポリペプチドにおけるＤ　１−Ｄ　に置体を提供し、Ｄｌ−Ｄｉ −ＤＩ）リブレット反復体も提供する。更に大量のドメイン数に至るまで、数多 くの機能、例えば免疫学特性、種々の天然ＰＤＧＦ−Ｒ配列の特色が示されるで あろう、Ｄ２．Ｄ３．Ｄｉ及びＤ５それぞれの類似体の構造体を、組合せ物と一 緒に提供する０表６．７，８゜９及び１０を参照のこと。これらは通常ＸＲの可 溶性フラグメントであるか、又はＰＤＧＦ−１？　ＴＩ’ｌセグメントを含む別 のポリペプチド、好ましくはＩＲ上セグメント伴って融合されていることがある 。

単一ドメイン形態のＸＲドメイン構造 ＤＩ　Ｄ２　Ｄ３　Ｄｉ　Ｄ５ 二重ドメイン形態のＸＩ？ドメイン構造ＤＩ−ＤＩ　Ｄ２−ＤＩ　Ｄ３−ＤＩ　 Ｄｉ−ＤＩ　Ｄ５−ＤＩＤＩ−Ｄ２　Ｄ２−Ｄ２　Ｄｉ−Ｄ２　Ｄｉ−Ｄ２　Ｄ ５−Ｄ２ＤＩ−Ｄ３　Ｄ２−Ｄ３　Ｄ３−Ｄ３　Ｄｉ−Ｄ３　Ｄ５−Ｄ３ＤＩ− Ｄｉ　Ｄ２−Ｄｉ　Ｄ３−Ｄｉ　Ｄｉ−Ｄｉ　Ｄ５−Ｄ４ＤＩ−Ｄ５　Ｄ２−Ｄ ５　Ｄ３−Ｄ５　Ｄｉ−Ｄ５　Ｄ５−Ｄ５表−」− 三重ドメイン形態のＸＲドメイン構造 ＤＩ−Ｗ　Ｄ２−Ｗ　Ｄ３−Ｗ　Ｄ４−Ｗ　Ｄ５−ＷここでＷは表２に挙げた２ ５通りの可能な組合せのそれぞれであり、この表においては全部で１２５の要素 が挙げられる。

四重ドメイン形態のＸＲドメイン構造 ＤＩ−Ｘ　Ｄ２−Ｘ　Ｄ３−Ｘ　Ｄ４−Ｘ　Ｄ５−ＸここでＸは表５に挙げる１ ２５通りの可能な組合せそれぞれであり、この表において全部で６２５の要素が 挙げられる。

三重ドメイン形態のＸＲドメイン構造 ＤＩ−Ｙ　Ｄ２−Ｙ　Ｄ３−Ｙ　Ｄ４−Ｙ　Ｄ５−ＹここでＹは表６に挙げる６ ２５通りの可能な組合せそれぞれであり、この表において全部で３１２４の要素 が挙げられる。

更に、本発明はドメイン構造間にスペーサー領域を有する類似の構遺物を提供す る。特に、表４及び５に示すドメインのシスティン内残基に相当する領域が有用 である０例えば、スペーサーポリペプチドを隣接し合うドメインの間に挿入する か、又は重要なリガンド結合性セグメント、典型的には前記のシスティン内セグ メント内に見い出せる例えばＢ、Ｃ，Ｃ’、Ｃ’、Ｄ、Ｅ及びＦβ−鎖セグメン トの間に間隔を置いてよい、従って例えば、構造Ｄ　１−Ｘ　１−Ｄｌのポリペ プチドが提供され、ここでＸｌはスペーサーセグメントであってＤドメインでは ない。ドメインの順序は逆転させてよく、従って本発明はＤ２−Ｄｉ又はＤ２− Ｘｉ−ＤＩのようなポリペプチドも提供する。詳しくは、ペプチドＤｉ−ＸＩ− Ｄ３がＤＩ−Ｄ２−Ｄ３となる又は包含することを避けるため、非Ｄドメイン特 色のＸｌを提供する。

本発明の他の特に好ましい態様は前記の細胞外領域ドメイン構造を、ヒト血小板 由来成長因子レセプターの別のセグメント、特にトランスメンプランセグメント （ＴＭ）及び細胞内領域（ＩＲ）と組合されて有するポリペプチドである。従っ て、本発明はアミノからカルボキシに至る方向において変更した順序の細胞外領 域ドメインを有するレセプターポリペプチド、例えば０５−Ｄ４−０３−０２− Ｄｌ−ＴＭ−ＩＲポリペプチド、又はある場合には反転した様々なドメインのレ セプターポリペプチドを提供する。更には欠失したインタクトドメインを有する レセプターポリペプチド及びそれに更なるドメインが付加されたレセプターポリ ペプチドを提供する。その例にはＤＩ−０２−０３−ＴＭ−ＩＲ又は［１ｌ−０ ２−０３−０４−Ｔｌｌ−ＩＲが挙げられる。特に、表６゜７．８．９及び１０ に記載のＸＲ上セグメント有する融合体が好ましい態様である。

Ｄドメインの改質された組合せは天然レセプターを擬態し、且つ、異なるものと 予測される。この改質ポリペプチドはある態様において、改質された結合親和力 、例えば高いもしくは低い親和力を示すか、又は様々なリガンドもしくはりガン ト類似体に結合する様々なスペクトラムを示すものと予測されるであろう、これ らは変化したりガント結合性変換効率又は改質された鏡開結合親和力をも有しう る。

本発明は血小板由来成長因子レセプター、好ましくはヒトレセプターの様々な機 能を示すのに必要な最少構造特性を決定するための手段を提供する。マウス又は その他の哺乳動物種において似たような決定が行われうるが、ヒトレセプターが 診断又は治療目的のために典型的に好ましいであろう。

機能的活性、例えばリガンド結合のための最小領域を決定するため、その活性に ついてのアッセイを開発した。主要のレセプター機能は前記した通り、リガンド 結合、チロシンキナーゼ活性及びレセプターの三量化を含む、これらの分子機能 それぞれについての簡単、且つ、迅速なアッセイが開発できうる。リガンド結合 アッセイは例えばＧｒｏｎｗａｌｄら（１９８８）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’１．Ａ ｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳ＾８５　：　３４３５−３４３９１Ｈｅｌｄｉｎら（１ ９８Ｂ）　ＥＭＢＯＪ、　７　：　１３８７−１３９３　ｉ及びＥｓｃｏｂｅｄ ｏら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４０　：　１５３２−１５３４に記載され ている。レセプター三量化アッセイは例えばＹａｒｄｅｎとＳｃｈｌｅｓｓｉｎ ｇｅｒ　（１９８７）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　２６　：１４３４−１４４２ 及び１４４３−１４５１に記載されている。

特定の他のタンパク質と相互作用する部位を決定するための他の手段として、例 えばＸ線結晶学又は２次元Ｎ？ＩＲ技術が、どのアミノ酸残基が分子接触領域を 成すかの指針を提供するであろう、タンパク質構造決定の詳細な説明については 、例えば本明細書に参考として組入れたＢｌｕｎｄｅｌ　ＩとＪｏｈｎｓｏｎ　 （１９７６）　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｒ　５ｔａｌｌｏ　ｒａ　ｈ　＊Ａｃａｄｅ ｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋを参照のこと拳リガンド結合アッセイ にはラベル化リガンドの結合又は結合性に関する競合アッセイが含まれる。シグ ナル変換はりガント結合活性により調節される活性例えばチロシンキナーゼを測 定することにより、又はレセプター構造におけるコンホメーション的もしくは他 の変化の測定によって間接的にアッセイされうる０例えば、レセプターポリペプ チドに特異的に結合する又はリガンドの結合によってそれから解離する、抗体又 は他の結合性タンパク質が利用されうる。

レセプターの三量化は蛍光消失又は他の光学手段を含む近位（ブロクシミティー ）アッセイによって測定されうる０種々の近位アッセイが知られており、例えば υｌ１ｒｉｃｈとＳｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ　（１９９０）　Ｃｅ旦６１　：　 ２０３−２１２　；　ＹａｒｄｅｎとＳｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ　（１９８７） 　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　２６　：１４３４４９４２及び１４４３−１４５１ 　；を参照のこと（これらは本明細書に参考として組入れる）。

アッセイが開発できたら、ドメイン又は他のセグメント、例えばＬＢＨの様々な 組合せがその活性の影響について試験されうる。競合阻害アッセイはリガンドに 結合できるような構造体を検定しうる。

試験する最初のドメイン構造は通常側々のドメインとし、単独で、又はキメラタ ンパク質もしくはこのレセプターのＴＭ−ＩＲ上セグメント連結させて行う０種 々の対立遺伝子、個りのドメインへの改質、又は関連キメラドメインが試験され るであろう、欠失及びキメラタンパク質の両方が作製されるであろう。

各ドメインの種々の組合せを作製し、そしてどれが測定活性に影響するかを選ぶ のに試験する。これらのドメインの反復体、例えばＤｉ−ＤＩを試験すべきであ る。どの単一ドメインも機能に影響を及ぼさないなら、種々の２重ドメイン構造 、例えばＤＩ−０２−ＴＭ−Ｉｌｌ。

Ｄ２−０３−ＴＭ−Ｉｔ？、　Ｄ３−０４−ＴＭ−ＩＲ及びＤ４−０５−ＴＭ− ＩＲを順に調べる。

表６．７，８．９及び１０に挙げる選択した組合せを作製し、そして試験した。

可溶性型を作るため、適当なアミノ末端セグメントを付加するのが通常所望され 、そのいくつかはＤ１ドメインの中に、又は前駆体型の中に存在していることが 予測されうる。適切な分泌及びプロセシングは種々のアミノ近位特性、例えばシ グナル配列、及び適切な標的化及びプロセシングに必須な他の特徴に依存しうる ０例えばＷａｔｓｏｎら（１９Ｂ？）　Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌ 四　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｇｅｎｅ、第１及び２巻、Ｂｅｎｊａａｉｎ、　Ｍｅｎｌｏ 　Ｐａｒｋ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａを参照のこと。

一定の機能を調節又はそれに競合するのに特に有効である適切な！＝’メインが 選ばれたら、β−鎖セグメントのレベルに至るより詳細な分析を進める。β−鎖 又］よ鏡開セグメントそれぞれの樺ノ・なキメラ、欠失、挿入又は置換構造体を 前記の通りに作り、そして試験する。各！ｌ！ｉ造休は標体の遺伝子工学の方法 、特に合成プライマーを用いる方法によって作れる。かかる因子を利用する手順 は例えばＳａｗｂｒｏｏｋら（１９８９）　ｈｏｌｅｃＩＩｌへ１！−９」−９ ｙＩＬ田１ユｊ−濃Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａユ、第１〜３巻、Ｃｏ１ｄ 　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ及びＡｕ５ｕｂｅｌら（＆Ｗ）　（ １９８９）ＱＵμ山上ｒｏｔｏｅｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｌｏｌ ｏ　ｌ＋　Ｗｉｌｅｙに記載されている（それぞれ本明細書に参考として組入れ る）。

Ｂ、可溶性型 いくつかの態様において、細胞外領域のみを提供する。従って、トランスメンブ ランセグメントを有さない細胞外領域全体は、通常可溶性ポリペプチドであろう 。トランスメンプラン領域及び細胞内領域から独立し、従ってそれらを欠（細胞 外領域全体はりガント結合性ペプチドとして働き続けることが示された。特に、 可溶性ポリペプチドＤＩ−Ｄ２−Ｄ３−Ｄ４−Ｄ５が種々のＰＤＧＦの型に結合 することが実証されている。　ＰＤＧＦの型に対する結合特異性が、包含されて いる特定のドメインにある程度依存するにもかかわらず、リガンド結合の特異性 の改質は様々な異なるドメインの置換又はドメインの配置変えによって行われう る。他の相同性セグメントによる置換、例えば血小板由来成長因子に結合する抗 体のような抗体分子に由来するＩｇ様ドメインを置換することも行われうる。他 方、別の近縁成長因子又はリガンドレセプター、例えばＰＧＦレセプター又は他 のＰＩ）ＧＦレセプター由来のドメインを置換してよい、ドメインの順序も、例 えばＤ５−　Ｄ４−　Ｄ３−　Ｄ２−　ＤＩのように変えてよい。

特に、細胞外構造体にとって通常最も重要である活性はりガントの結合性に関連 する。例えば、ドメインＤ４及びＤ５は可溶性細胞外領域Ｐ１１ＧＦ−Ｒポリペ プチドのりガント結合性にとって必須ではないことが発見されている。残りのド メインのうら、もしドメインＤ３が１′メインＤ１及びＤ２から離されているな ら、構造体Ｄ　Ｉ−Ｄ２は低親和力でのみリガンドに結合するが、しかしＤｉＤ ２−０３構造体は高親和力でリガンドに結合する。

典型的なｈＰ［１ＧＦ−１１１核酸配列は一過性アミノ末端疎水性配列をコード し、これは通常膜トランスロケーション過程の際に切断される。

シグナル配列の伝統的な機能は発生ポリペプチド鎖を膜結合リポソームに導き、 これにより膜トランスロケーション又は細胞標的化をもたらすことにある。しか しながら、シグナル配列は典型的にはトランスロケーション過程において除去さ れるため、シグナル配列は通常成熟タンパク質には存在していない１通常、シグ ナル配列は本発明の所望の可溶性ペプチドの上流に連結されているであろう。

ポリペプチドの溶解度は環境及びこのポリペプチドに依存する。

温度、電解質環境、このポリペプチドのサイズ及び分子特性、並びに溶媒の性質 を含む数多くのパラメーターがポリペプチドの溶解度に影響する。典型的には、 このポリペプチドを利用する温度は約４°Ｃから約６５゛Ｃに範囲する０通常、 利用する温度は約１８℃以上であり、そしてより通常には約２２℃以上である。

治療目的のため、その温度は通常は体温、典型的にはヒトにとって３７°Ｃであ るが、一定の状況のもとでは、この温度は現場（ｉｎ　５ｉｔｕ）で、又はイン ビトロで高められる又は低められうる。

電解質は通常はぼ現場生理学条件であろうが、しかし都合により高い又は低いイ オン強度に変更されうる。実際のイオンは生理学又は分析学内容物に用いられる 標準緩衝液に合うように改質されうる。

ポリペプチドのサイズ及び構造は実質的に安定で球状であるべきであり、そして 通常は変性状態にない、このポリペプチドは四次構造において他のポリペプチド と会合し、て例えば可溶性が授けられている。

溶媒は通常、生物活性の維持のために用いられるタイプの生物学的適α性緩衝液 であり、そして通常は生理学的溶媒に近いであろう。

ある場合、典型的には温和な非変性的な清浄剤を加えてよい。

溶解度は通常スベトバーグ（Ｓｖｅｄｂｅｒｌ　）単位において測定され、これ は特定の条件のもとての分子の沈降速度の尺度である。沈降速度の決定は伝統的 に分析用超遠心機において行われていたが、しかしながら現在は一般に標準の超 遠心機において行われている。

Ｆｒｅｉｆｅｌｄｅｒ　（１９８２）　Ｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｂｊｏｃｈｅｍｉｓ ｔｒｙ　（第２版）　、Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ及びＣａｎｔｏｒと５ｃｈｉｓ ＋ｗ＋ｅｌ　（１９８０）　Ｂｔｏ　ｈ　５ｔｅａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ、１〜 ３部、讐、）１．Ｆｒｅｅｍａｎ　＆　Ｃｏ、、　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ を参照のこと（それぞれ本明細書に参考として組入れる）。おおまかな決定とし て、「可溶性Ｊポリペブチ１′を含むサンプルを標準のフルサイズ鰯遠心機の中 で約５０ｋｒｐｓで約１０分間遠心する。可溶性分子はこの上清液の中に残るで あろう。可溶性粒子又はポリペプチドは典型的には約３０Ｓ以下、より典型的に は約１５Ｓ以下、通常は約１０Ｓ以下、より通常には約６Ｓ以下、そして特別な 態様においては、好ましくは約４Ｓ以下、そしてより好ましくは約３Ｓ以下であ ろう。

本発明は血小板由来成長因子レセプターリガンド結合活性を有する血小板由来成 長因子ポリペプチド及びタンパク質を提供する０本発明のレセプターには表６． ７，８．９及び１０に示したようなＰＤＧＦレセプターアミノ酸配列が含まれる 。また、相同性配列、対立遺伝子変異体、誘発化突然変異体、択一的に発現した 変異体、及び天然材料より回収したＰＤＧＦレセプターコード化核酸に高緊張条 件のもとてハイブリダイズするＤＮＡによりコードされたタンパク質を提供する 。

本発明の血小板由来成長因子レセプターペプチドはドメインＤ１゜Ｄ２．Ｄ３． Ｄ４及びＤ５におけるｈＰＤＧＦレセプター配列の天然のドメインと少なくとも 約８０％の相同性を、典型的にはレセプター配列の天然型と少なくとも約８５％ の相同性を、より典型的には少なくとも約９０％の相同性を、通常は少なくとも 約９５％の相同性を、そしてより通常には少なくとも約９７％の相同性を示すで あろう。

ポリペプチドについての相同性は一般に配列解析ソフトウェア−を用いて決定さ れる。例えば、５ｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｔｓ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ　Ｐａ ｃｋａｇｅｏｆ　ｔｈｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ、 　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ ｙ　Ｃｅｎｔｅｒ＋　１７１０　Ｕｔ＋１ｖｅｒｓｉｔｙ　Ａｖｅｎｕｅ＋　Ｍ ａｄｉｓｏｎ、　Ｗｉｓｃｏｎｓ奄■ ５３７０５を参照のこと。タンパク質解析ソフトウェア−は種々の置換、欠失、 置換及びその他の改質に帰する相同性の尺度を利用して類似の配列同志を合わせ る。１！似の又は相同のＬＢＲセグメントの置換既知の配列において行われるこ とができ、これにより改質された親和力及びリガンド結合特異性を有する新たな 結合分子が作られる。

種りのその他のソフトウェア−解析プログラムがポリペプチドのコンホメーショ ン構造を解析せしめることができる。相同なコンホメーションはアミノ酸配列の 適切な挿入、欠失、置換又は修飾によって達成されもする。ドメイン及びβ−鎖 セグメントのコンホメーション構造は部分的にしか理解されていないため、本発 明は開示の配列に対する様々な改質及びその構造特性の保持も包括する。

特に、リガンド結合性機能は細胞外ドメイン、特にＬＢＨに局在すると信じられ ており、従って可溶性型は好ましくはその特定機能を保持するであろう。ＰＤＧ Ｆレセプターの可溶性フラグメントはインビトロ又はインビボの両方において天 然レセプターの機能を代替するために、又はＰＤＧＦ結合に関して競合すること によって妨害する、例えば阻止するために有用であろう、他方、可溶性型はＰＤ ＧＦレセブタ−ポリペプチドの三量化を妨害することがある。このタンパク質は 通常二量体にある、又はそれにおいて機能する。レセプターの三量化は適切な生 理学的シグナル変換にとって必須であることがあり、そしてフラグメントの導入 はその三量化を阻止することによってこれらの過程を妨害するのに働きうる。

ＰＤＧＦレセプターポリペプチドは伝統的なタンパク質化学の技術を利用して精 製されうる０例えばＤｅｕｔｓｃｈｅｒ　（Ｗ）（１９９０）　Ｇｕｉｄｅ　ｔ 。

Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　；　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｓｏｌｏｇｙ 　ｓ第１８２巻（本明細書に参考として組入れる）を参照のこと、他方、レクチ ンアフィニティークロマトグラフィ一工程、又は特異性の高いりガントアフィニ ティークロマトグラフィー手順、例えばタンパク質ミトゲンのシスティン残基を 介してビオチンにコンジュゲートされたＰＤＧＦを利用するものが利用されうる 。精製ＰＤＧＦレセプターポリペプチドは、Ｉｍａｍｕｒａら（１９８Ｂ）　Ｂ ｉｏｃｈｅ艶Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、Ｒｅｓ、ｃｏｓ＋ｓｕｎ、　１５５　：　５８３ −５９０ニ記載のように、第一アミノ基を介してＰＤＧＦにカップル化された活 性化ＣＨ−セファロースを利用するＰＤＧＦアフィニティークロマトグラフィー のような方法によって獲得されうる。

特異的抗体の有用性に応じて、イムノアフィニティークロマトグラフィーを利用 しても特定のＰＤＧＦレセプターペプチド構造体が精製されうる。下記の通りに 調製した抗体を不活性基体に固定化させて特異性の高いイムノアフィニティーカ ラムを作ることができる０例えばＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ　（１９９０）　Ｍｏ ｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　：　Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒＭａｎ ｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（本 明細書に参考として組入れる）を参照のこと。

種々の細胞又は組織が出発材料として選ばれることができ、通常は所望のレセプ ター構造体又はポリペプチドの大量の発現に基づいて選ばれる。高発現性プロモ ーター配列、好ましく誘発性プロモーターが組換え配列に作動連結されうる。こ のプロモーターはそれが配列をプロモートするように作動する場合に作動連結さ れている。

比較的大量のレセプタータンパク質を含む適切な細胞（ＰＤＧＦの高親和結合に より決定）を、ＰＤＧＦレセプターがポリペプチドの変異体によって形質転換さ せることができる。これらは欠失又は挿入を有する構造によりＰＤＧＦレセプタ ーの天然型に代わるように利用されうる。

リガンド結合性領域（ＬＢＲ）又はその他のセグメントは、種々の新しい融合構 造体又はフラグメント間で「スヮップコされうる。従って、セグメントの新たな 組合せを示している新たなキメラポリペプチドが、種々の機能性ドメインの構造 連結により得られうる。所望の、又は改質された特異性を授けるリガンド結合性 領域を、別の機能を有する他のドメインと組合わせてよく、例えば各１ｇ様トド メイン別の近縁ポリペプチド由来の類似のドメインで置き代えてよく、又は種々 の対立遺伝子もしくは類似のレセプター間でＬＢＲを組合わせてよい。

本発明はまた、レセプターポリペプチドドメインと他の相同性又は異種タンパク 質との融合ポリペプチドを提供する。相同性タンパク質は、類似であるが異なる 成長因子レセプターの融合体であることができ、例えば他の細胞内ドメインを有 する一方のレセプターのりガント特異性を示すバイブリドタンパク質、あるいは 改変アフィニティー又は広いもしくは狭い結合特異性を有しうるレセプターがも たらされうる。同様に、異種融合体を作製することができ、これは誘導タンパク 質の特性又は活性の組合せを示す、典型的な例はレポーターポリペプチド、例え ばルシフェラーゼと、レセプターのドメイン、例えばヒト血小板由来成長因子レ セプターの細胞外領域に由来するりガント結合性ドメインとの融合体であり、こ れにより、所望のりガントの存在又は位置は容易に決定されうる０例えばＤｕｌ ｌら、米国特許第４，８５９，６０９号を参照のこと（本明細書に参考として組 入れる）、その他の遺伝子融合パートナ−には細菌β−ガラクトシダーゼ、ｔｒ ｐＥ、プロティンＡ１β−ラクタマーゼ、α−アミラーゼ、アルコールデヒドロ ゲナーゼおよび酵母α−交配因子が挙げられる０例えばＧｏｄｏｗｓｋｉら（１ ９８８）　５ｃｉｅｎｃｅ　２４１　：　８１２−８１６を参照のこと。種々の 規定の機能を有する更なる配列が、ＧｅｎＢａｎｋ　（商標）（Ｎａｔｉｏｎａ ｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ）シーケンスデーターバンクを 介して探索することによって見つけられうる。異種融合タンパク質は天然には互 いに連結しているのが見い出せない配列を含むものである。従って、異種融合タ ンパク質は２つの類似で相同な配列の融合体でありうる。

融合タンパク質は典型的には、発現を伴う組換核酸法又は合成ポリペプチド法の いづれかにより作られるであろう、核酸の操作についての技術は一般に、例えば 本明細書に参考として組入れるＳａｍｂ−ｒｏｏｋら　（１９８９）のＭｏ１ｅ ｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ　（第 ２版）第１〜３巻、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｙに記載されている。ポリペプチドの合成についての技術は例えばそれぞれ本 明細書に参考として組入れる、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　（１９６３）　Ｊ、Ａｍ ｅｒ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、　８５：２１４９−２４５６　；　＾ｔｈｅｒｏｎら 　（１９８９）　５ｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅ　ｔｉｄｅ　Ｓ　ｎｔｈｅｓｉ ｓ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａ　ｒｏａｃｈ、　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ＋　０ｘ ｆｏｒｄ　；及びＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３２　 ：　３４１−３４７に記載されている。

本発明の融合タンパク質を作るのに利用される組換核酸配列は天然又は合成配列 に由来しうる。数多くの天然遺伝子配列が種々のｃＤＮＡより、又は適当なプロ ーブを用いてゲノムライブラリーより獲得できる０例えばＧｅｎＢａｎｋ（商標 ）　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈを参照のこ と。

血小板由来成長因子レセプター遺伝子を単離するための典型的なプローブは標準 の手順に従った表１及び２の配列から選ばれうる。

適切な合成りＮＡフラグメントは例えばＢｅａｕｃａｇｅとＣａｒｒｕｔｈｅｒ ｓ　（１９８１）Ｔｅｔｒａ、Ｌｅｔｔｓ、２２　：　１８５９−１８６２に記 載のホスホラミジット法によって調製されうる。二本鎖フラグメントは、相補鎖 を合成し、次いでこれらの鎖を適当な条件のもとでハイブリダイズさせ合うこと により、又は適当なプライマー配列と共にＤＮＡポリメラーゼを用いて相補鎖を 付加することのいづれかにより獲得できる。

■、核酸 本発明は前述の様々なＰＤＧＦレセプター配列をコードする核酸配列を提供する １表１及び２のそれぞれにはヒ）Ｂ型及びＡ型ＰＤＧＦレセプターポリペプチド をコードする対応のｃＤＮＡ配列が記載されている。

核酸文脈における実質的相同性とは、このセグメント又はその相補鎖のいづれか が、比較されたとき、適当なヌクレオチド挿入又は欠失を伴って適当に並べられ たとき、少なくとも残基の約６０％、典型的には少なくとも約７０％、より典型 的には少なくとも約８０％、通常は少なくとも約９０％、そしてより通常にはヌ クレオチドの少なくとも約９５〜９８％同しであることを意味する。適切なヌク レオチド挿入又は欠失にはドメイン間配列、又はドメインにおけるシスティンの 外側のものが含まれるが、しかしシスティンの組内の配列（又はＤ４ドメインに おけるその対応物）が通常保持されていることが非常に重要であろう、構造相同 性とは、少なくとも約１４個のヌクレオチドの鎖にわたって少なくとも約５５％ 、典型的には少なくとも約６５％、より典型的には少なくとも約７５％、通常は 少なくとも約９０％、そしてより通常には少なくとも９５％以上ある場合に存在 する。

他方、実質的な相同性はセグメントが特定のハイブリダイゼーション条件のもと で鎖又はその補体にハイブリダイズするであろう場合に存在し、典型的には表１ 又は２に由来の少なくとも約２０の隣接ヌクレオチドの配列を用いる。しかし２ ながら、通常は大きめのセグメント、例えば少なくとも約３０の隣接ヌクレオチ ド、より通常には少なくとも約４０、そして好ましくは約５０以上が好ましい、 ハイブリダイゼーションの選択性は特異性の完全に欠失したものより選択的なハ イブリダイゼーションが生じたときに存在する。　ＫａｎｅｈｉＳａ（１９８４ ）　展哄＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　１２　：　２０３−２１３（本明細書に参考と して組入れる）を参照のこと。

緊張ハイブリダイゼーション条件は通常約１Ｍ以下、典型的には約７００ｍＭ以 下、より典型的には約５００ｍＭ以下、通常は約４０（１ｗＭ以下、より通常に は約３００−門以下、そして好ましくは約２００ｍＭ以下の塩濃度を含むであろ う、温度条件は典型的には約２０°Ｃ以上、より典型的には約２５°Ｃ以上、通 常は約３０°Ｃ以上、より通常には約３７℃以上、そして好ましくは約４０℃を 趙え、これは特定の用途に依存する。その他の要因、とりわけ、塩基組成及び相 補鎖の大きさ、有機溶媒の存在、並びに塩基誤対合の程度を含む要因がハイブリ ダイゼーションの緊張度に有意に影響を及ぼし、パラメーターの組合せはいづれ かの絶対的手段よりも重要である。

表１及び２に提供するＰＤＧＦレセプターコード化配列の配列を基礎としてプロ ーブを作ることができる。このプローブは標準の方法によって他のＰＤＧＦレセ プター核酸配列を単離するのに利用されうる。

例えばＳａｍｂｒｏｏｋら　（１９８９）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ 　：　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ迫す旦、第１〜３　Ｓ、　Ｃ５ＨＰｒｅｓｓ、　Ｎ、 Ｙ、　（本明細書に参考として組入れる）を参照のこと、相同性核酸を利用する ことにより、その他の類似の核酸が選ばれうる。他方、これらの同−又は類似の レセプターポリペプチドをコードする核酸を、遺伝コードにおける冗語（ｒｅｄ ｕｎｄａｎｃｙ）を利用して合成又は選別できうる。種々のコドン置換を導入し てよく、例えばサイレント変化により、種々の常用の制限部位を提供する、又は 特定の系についての発現性を最適化する、例えば最適コドン用語に合わせること ができる。突然変異を導入して、レセプターの特性を改質させる、おそらくはり ガントの結合親和力、鏡開親４和力、又はポリペプチドの分解又は代謝速度を変 えることができる。

本発明のＩＩＮＡ組成物はゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡに由来し、合成により調製 されるか、又は種々の組合せのバイブリドでありうる。天然では連なっていない 配列を含んで成る組換核酸も本発明によって提供する。単離されたＤＮＡ配列に は、プライマーもしくはハイブリダイゼーションによって獲得された、又は制限 酵素等の処理に付された任意の配列を含む。

合成オリゴヌクレオチドはＭａｔｔｅｕｃｃｉら（１９８１）　Ｊ、八−、Ｃｈ ｅｍ、Ｓｏｃ。

１０３　：　３１８５に従うトリエステル法により、又は市販の自動オリゴヌク レオチド合成装置による他の方法によって作られうる。オリゴヌクレオチドは過 剰量のポリヌクレオチドキナーゼによりラベル化されうる（例えば、０．１ナノ モルの基質に対して約ＩＯ単位を、５０ａＭのトリス、ｐＨ７，６，５ｍＭのジ チオスレイトール、ｌＯ＊ＭのＭｇＣ１□、１〜２ｍＭのＡＴＰ、　１．７ｐｍ ｏ！ｅの”Ｐ−ＡＴＰ（２，９ａ＋Ｃｉ／ｗｓｏｌｅ）、０．１ｍＭのスペルミ ジン、０．１ｓＨのＥＤＴＡと共に用いる）、プローブはニックトランスレーシ ョン、フレノウ補完反応、又は当業界に知られるその他の方法によっても作られ うる０例えばＳａｍｂｒｏｏｋらを参照のこと。

様々なタイプのｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーが新たな対立遺伝子又は近縁配 列のためにスクリーンに付されうる。　ｅＤＮＡライブラリーの選択は通常、所 望のレセプターに関するｍＲＮＡに冨む組織源に対応する。ファージライブラリ ーが通常は好ましいが、しかしながらプラスミドライブラリーも利用できる。ラ イブラリーのクローンをプレート上にまき、スクリーンのための基板に移し、変 性させ、そして所望の配列の存在についてプローブする。

例えば、プラークハイブリダイゼーション手順に関して、バクテリオファージを 含む各プレートをデエプリケートでニトロセルロースフィルター紙（Ｍｔｌｌｉ ｐｏｒｅ−ＨＡＴＦ）にレプリケートさせる。ファージＤＮＡを５００５ＭのＮ ａ０）１．　１．５ＭのＮａＣ１のような緩衝液により約１分間変性させ、次い で例えば０．５Ｍのトリス−）１ｃＩ、ｐＨ７，５，１，５ＭのＮａＣｌで中和 する（３回、各１０分づつ）０次にフィルターを洗う、乾かした後、これらのフ ィルターを一般には、例えば真空オープンの中で８０°Ｃで２時間焼く、このデ エプリケートフィルターを４２°Ｃで４〜２４時間、１０１／フイルターのＤＮ ＾ハイブリダイゼーション緩衝液〔２０〜５０％のホルムアルデヒド、５×のＳ ＳＣ，ｐＨ１，０，５Ｘのデンハーツ溶液（ポリビニルピロリドン＋フィコール 及びウシ血清アルブミン；１×−それぞれ０．０２％〕、５０１ＩＭのリン酸ナ トリウム緩衝液、ｐＨ７，０，０，２％のＳＯ３及び５０μｇ／ｍｌの変性サケ 精子ＤＮＡ）で予備ハイブリダイズさせる。適切なプローブとのハイブリダイゼ ーションは４２°Ｃで１６時間、放射性ラベル化プローブを含む１０１／フイル ターのｌＸ１０’Ｃｐ−／１のＤＮ＾（ハイブリダイゼーション緩衝液を用いて 行ってよい。ホルムアルデヒドの最終濃度はプローブの長さ及び所望する緊張度 に従って変える０例えば、ハイブリダイゼーション条件及び配列相同性について の詳細は、本明細書にそれぞれ参考として組開示したアミノ酸配列に基づ（オリ ゴヌクレオチドプローブは部位特異的突然変異誘発又は組換え融合もしくは欠失 構造体を作るために利用されうる９例えば好ましいオリゴヌクレオチド因子につ いては表１１及び１２を参照のこと、　Ｋｉｍｂｅｌら（１９８７）　Ｍｅｔｈ ｏｄｓ　ｉｎ　Ｈｎｚ　−ｍｏｌｏ■１５４　：　３６７に記載されているよう な方法が利用されうる。配列ＰΔ１からＰΔ９はそれぞれＳｅｑ、ＩＤ　Ｎｏ、 　６〜１４に相当し、そして配列ＰΔ１０１からＰΔ１０９はそれぞれＳｅｑ、 ＩＤ　Ｎｏ、１５〜２３〜に相当する。

表１１ ヒ）Ｂ型ＰＤＧＦ−Ｒ突然変異誘発オリゴマー捷案ヒｌ−Ａ型ＰＤＧＰ−Ｒ突然 変異誘発オリゴマー本発明に従い、ＰＤＧＦ−Ｒの完全横道配列を実質的にコー ドする任意の単離化Ｄ）ｉＡ配列がプローブとして利用できうる。他方、ＰＤＧ Ｆ−［１疎水性シグナル配列及びその翻訳開始部位をコードする任意のＤＮＡ配 列が利用されうる。　ＰＤＧＦ−Ｒ活性（例えばリガンド又はＰＤＧＦ−Ｒ結合 性）を示すインタクトドメインを実質的にコードする単離された部分ＤＮＡ配列 も本発明の一部である。好ましいプローブはＰＤＧＦレセプターポリペプチドの ｃＤＮＡクローンである。

本発明において用いるＤＮＡ配列は通常、インタクトドメイン構造、典型的には 少なくとも約５コドン（１５ヌクレオチド）、より典型的には少なくとも約９コ ドン、通常は少なくとも約１３コドン、より通常には少なくとも約１８コドン、 好ましくは少なくとも約２５コドン、そしてより好ましくは約３５コドンを含ん で成る。１又は複数のイントロンも存在していてよい、この数のヌクレオチドは 通常、ＰＤＧＦレセプター配列と特異的にハイブリダイズするであろう有効なプ ローブにとって必要とされるほぼ最小の長さである０例えば、ＰＤＧＦ−Ｒの特 徴的なエピトープは長いペプチドにおいてコード化されうる０通常、野生型配列 が利用されるであろうが、ある状況においては、ｌ又は複数の突然変異、例えば 欠失、置換、挿入又は反転が導入されうる。これらの改質はアミノ酸配列におい て変化をもたらすことがあり、サイレント突然変異を担い、制限部位を変える、 又は特定の突然変異を担うことがある。このゲノム配列は通常的２００ｋｂを超 えず、より通常には約１００ｋｂを超えず、好ましくは約０．５ｋｂより大きく ないであろう。

ＰＤＧＦレセプターペプチドをコードするＤＮＡ配列に由来する少なくとも約１ ０個のヌクレオチドを有するＤＮＡ配列の部分、より典型的には少なくとも約１ ５個のヌクレオチド、通常は少な（とも約２０個のヌクレオチド、より通常には 少な（とも約２５個のヌクレオチド、そして好ましくは少なくとも約３０個のヌ クレオチドのそれが利用されるであろう、これらのプローブは典型的には約６ｋ ｂ以下、通常は約３．Ｏｋｂ以下、そして好ましくは約１ｋｂ以下であろう。こ れらのプローブは特定のＰＤＧＦ−ＲをコードするｍＲＮＡが細胞又は種々の組 織の中に存在しているかどうかを決定するためにも利用されうる。

所望の血小板由来成長因子レセプターフラグメントをコードする天然又は合成り ＮＡフラグメントは通常、インビトロ細胞培養物に導入されて発現されることの 可能なりＮＡ構造体の中に組込む。通常このＤＮＡ構造体は単細胞宿主、例えば 酵母又は細菌の中での複製に適するものであろうが、しかしながらゲノムの中へ の組込みを伴って及び伴わないで、培養哺乳動物の、もしくは植物の又はその他 の真核細胞系に導入することを意図するものであってもよい、ヒト細胞が好まし い宿主でありうる。高等の真核生物宿主細胞が通常は好ましく、なぜならそのグ リコジル化及びタンパク質プロセシングパターンはヒトのプロセシングを擬態し がちであるからである。細菌又は酵母の中への導入のために調製したＤＮＡ構造 体は典型的には、宿主により認識される複製系、所望のレセプターポリペプチド 構造体をコードする目的のＤＮＡフラグメント、このポリペプチドコード化セグ メントに作動連結した転写及び翻訳開始調節配列、並びにこのポリペプチドコー ド化セグメントに作動連結した転写及び翻訳終止調節配列を含むであろう、この 転写調節配列は典型的には、宿主により認識される異種エンハンサ−又はプロモ ーターを含むであろう。

適切なプロモーターの選択は宿主に依存するであろうが、しかしながらｔｒｐ、 　Ｉａｃ及びファージプロモーター、ｔＲＮＡプロモーター及び解糖酵素プロモ ーターのようなプロモーターが知られており、且つ、有用である０例えば５ａｌ ｂｒｏｏｋら（１９８９）を参照のこと、複製系、並びに転写及び翻訳調節配列 を、血小板由来成長因子レセプターＤＮＡ配列に関する挿入部位と共に含む常用 の有用な発現ベクターが採用されうる。細胞系と発現ベクターとの有効な組合せ 例は例えば５ａｓｂｒｏｏｋら（１９８９）に記載されているｉ　Ｍｅｔｚｇｅ ｒら（１９８８）　Ｎａｔｕｒｅ３３４　：　３１−３６　も参照のこと。

これらの細胞のための発現ベクターは、発現コントロール配列、例えば複製起点 、プロモーター、エンハンサ−及び必須のプロセシング情報部位、例えばリポソ ーム結合部位、ＲＮ＾スプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写終止配列を 含みうる。好ましくは、このエンハンサ−又はプロモーターはこのＰＤＧＦレセ プターポリペプチドをコードする遺伝子に天然に結合しているものであろうが、 しがしながら数多くのケースにおいて他のものが同等又はより適切でありうるこ とが理解されるであろう、その他の好ましい発現コントロール配列は、ウィルス 、例えばＳＶ４０．アデノウィルス、牛バビロマウィルス等に由来するエンハン サ−又はプロモーターである。

同櫟に、好ましいプロモーターは免疫グロブリン生産細胞において天然に見い出 せるものであるが（例えば、米国特許第４，６６３．２８１号を参照のこと；本 明細書に参考として組入れる）、シかしながら、ＳＶ４０、ポリオーマウィルス 、サイトメガロウィルス（ヒト又はネズミ）並びに種々のレトロウィルス、例え ばネズミ白血病ウィルス、ネズミ又はラウス肉腫ウィルス及び旧■に由来するＬ ＴＲ，更にはＰＩ）ＧＦ−Ｒ遺伝子にとって内因性であるプロモーターを利用し てよい。

Ｅｎｈａｎｃｅｒ　ａｎｄ　Ｅｕｋａｒ　ｏｔｉｃ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘ　ｒｅｓｓ ｔｏｎ　（１９８３）　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ＋　 Ｎ、Ｙ、　（本明細書に参考として組入れる）を参照のこと。

注目のＤＮＡセグメント、例えばＰＤＧＦレセプターポリペプチド遺伝子又はｃ ＤＮ＾ＤＮＡ配列ベクターは、細胞宿主のタイプに応じて変わりうるよく知られ た方によって宿主細胞の中に移し入れることができる０例えば、塩化カルシウム トランスフェクシッンは原核細胞に一般に利用されており、他方リン酸カルシウ ム処理が他の細胞宿主にとって利用されうる。一般にはＳａｍｂｒｏｏｋら（１ ９８９）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒり男１」三」−は的」上カヨ（岨虹（第２版）　 Ｃ５ＨＰｒｅｓｓ（本明細書に参考として組入れる）を参照のこと、「形質転換 細胞」とは形質転換細胞の子孫も含むことを意味している。

精製ポリペプチドと同様に、リガンド結合性セグメント、細胞外ドメイン及び細 胞内ドメインに関連する核酸配列は特に有用である。

これらの遺伝子セグメントは類似の生物活性を示す新たな遺伝子のスクリーニン グのためのプローブとして有用であろうが、これらの遺伝子の調節要素も重要で ありうる。

ＴＶ、ＰＤＧＦレセプターポリペプチド構造体を作るための方法ＤＮＡ配列はＰ ＤＧＦ−１１ポリペプチドを発現させるためにも利用できる。

例えば、約２１個のヌクレオチド（約７個のアミノ酸をコードする）から約２． １ｋｂ（約７００個のアミノ酸）のＤＮＡ配列を、ＰＤＧＦレセプター特異的活 性、典型的にはリガンド結合性を有するポリペプチドを発現させるのに利用され うる。特に、リガンド結合性領域を保持する構造体が有用であり、なぜならこれ らの構造体は結合活性を保有するからである。

特に、ＰＤＧＦ−Ｒ核酸配列の遺伝子操作を促進せしめるために種々の合成リン カ−及びプローブが作製されうる。この構造体をコードする配列の適切な操作に おいて有用な大量のフラグメント又はセグメントを作るのにポリメラーゼ連鎖反 応（ＰＣＲ）技術が適用されうる。

例えばＩｎｎ１ｓら（１９９０）　ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ　Ａｃａｄｅｍｉ ｃ　Ｐｒｅｓｓを参照のこと。他方、核酸合成装置は、例えば表１又は２に由来 の任意の予備選定配列にハイブリダイズさせるための、又は特定のドメインもし くはセグメントを配列に付加もしくは欠失させる操作のための、十分に大量のフ ラグメントを捷供することができる。特に重要なセグメントはＬＢＲであろう。

大量のレセプタータンパク質は、適合性宿主、例えば旦一旦ユ（Ｅ、ｃｏ旦）、 酵母、哺乳動物細胞、昆虫細胞又は蛙の卵母細胞において、発現媒体の中に含ま れているレセプター全体又はレセプターの一部を発現させることによって製造さ れうる。この発現媒体は当業界に周知の方法、例えばリン酸カルシウム沈殿（以 下に詳細）、リボフェクチンエレクトロポレーション又はＤＥＡＥデキストラン 形質転換を利用して細胞の中に導入することができる。

通常、哺乳動物細胞は不死化細胞系であろう、　ＰＤＧＦ−Ｒ及びその対応のり ガントの特性を調べるため、ＰＤＧＦレセプターを欠く、又は低レベルのそれを 有する哺乳動物細胞をトランスフェクト又は形質転換させるのが有用であろう、 好ましくは、シグナル配列はペプチドを細胞膜に導くため、又は分泌させるため に働きうる。有意な量のＰＤＧＦレセプターを欠く細胞にはチャイニーズハムス ター卵巣（ＣＨＯ）細胞、はとんどの上皮細胞系及び種々のヒト腫瘍細胞系が含 まれる。

野生型レセプターと機能的に同等であり、従ってＰＤＧＦ感受性ミトゲン応答を 担うレセプターをコードするＤＮＡ配列を含む形質転換又はトランスフェクトさ れた細胞が選別できる。かかる細胞は様々な更なるＰＤＧＦレセプターポリペプ チドの結合特性の分析を可能にするであろう、トランスフェクト細胞は、ＰＤＧ Ｆ拮抗因子又は作動因子としての組成物又は薬剤の有効性の評価のためにも利用 されうる。レセプターチロシンキナーゼのレベル又は核酸合成の速さは、トラン スフェクト細胞を薬剤又はリガンドと接触させ、次いでコントロールに対してこ の種々のりガント類偵体の効果を比較することによって決定できる。宿主として 利用されている最も一般的な原核細胞はＥ、コリの株であるが、その他の原核細 胞、例えばバチルススブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）又はシ ュードモナス（ガＪ止１組ｕ）も利用できうる。インタクト構造ドメインを含ん で成るレセプターポリペプチド、レセプターの一部、又はＰＤＧＦ−Ｒ活性を有 するポリペプチドをコードする配列のフラグメント又は一部を含む本発明のＤＮ Ａ配列は、ＰＤＧＦ−Ｒポリペプチド又はＰＤＧＦ−Ｒ活性を有するポリペプチ ドに関する発現媒体又は構造体を製造するために利用できる０通常、コントロー ル配列は哺乳動物細胞における発現のためには真核系プロモーターであろう、い くつかの媒体においては、レセプター自体のコントロール配列も利用できうる。

Ｅ、コリを形質転換させるための一般的な原核系プラスミドベクターはρＢＲ３ ２２又はその誘導体、例えばプラスミドｐｋｔ２７９　（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ）で ある、　Ｂｏｌａｖａｒら（１９７７）Ｇｅｎｅ、２　：　９５を参照のこと、 原核系ベクターは転写開始のための原核系プロモーターを、任意的にオペレータ ーと一緒に含みうる。最も一般的に利用されている原核系プロモーターの例には ベーターラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）；ラクトース（ｌａｃ）プロモーター （Ｃｈａｎｇら　（１９７７）ハ旦ｐ、１９８　：　１０５６を参照のこと）； トリプトファンプロモーター（ｔｒｐ）　（Ｇｏｅｄｄｅｌｌら（１９８０）　 Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、、　８：４５７を参照のこと）；Ｐ＋　プ ロモーター；及びＮ−遺伝子リポソーム結合性部位（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら（１ ９８１）　Ｎａｔｕｒｅ、２９２：１２８−を参照のこと）が含まれる（それぞ れの文献は本明細書に参考として組入れる）。

酵母に関連して利用されるプロモーターはエノラーゼ遺伝子に由来するプロモー ター（Ｈｏｌｌａｎｄら　（１９８１）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５６　 ：　１３８５を参照のこと）；又は解糖酵素、例えば３−ホスホグリセラーテキ ナーゼの合成のためのプロモーター（旧ｔｚｅｍａｎら（１９８０）　Ｊ、Ｂｉ ｏｌ、Ｃｈｅｍ。

２５５を参照のこと）でありうる。

適切な天然でない哺乳動物には、ＳＶ４０に由来する初期及び後期プ又はネズミ ム口二一（■ｕｌｏｎｅｙ）白血病ウィルス、マウス乳癌ウィルス、鳥肉腫ウィ ルス、アデノウィルス■、生バピロマウィルス又はポリオーマに由来するプロモ ーターが含まれるであろう、更に、この構造体は増幅遺伝子、例えばジヒドロホ レートリダクターゼ（ＤＨＰＲ）と連結されてよく、これによりＰＤＧＦレセプ ター遺伝子の多数のコピーが作られうる。例えばＫａｕｆｍａｎら（１９８５） 　Ｍｏ１．ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、　５　：　１７５０−１７５９　；並びにＬｅｖｉｎｓｏｎらＥＰＯ 公開番号０１１７０５９号及び０１１７０６０号を参照のこと（それぞれは本明 細書に参考として組人Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　６９　：　２１１０を参照のこと） ；又はＰｂＣ１法（Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ ｏｎｉｎ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ＋　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ ｎｇ　ＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓを参照のこと）を含む様々な方法によって形質転 換されうる。

法を用いて形質転換されうる。真核細胞に関しては、哺乳動物細胞はリン酸カル シウム沈殿法（例えば、Ｇｒａｈａ−とｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ　（１９７Ｂ）■ ｒｇｊｇ７４．５２　：　５４６）を用いて；又はりポフエクチン（ＢＲＬ）も しくはレトロウィルス感染により　（例えばＧ１１ｂｏａ　（１９８３）　ｄＭ ａｎｉ　ｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘ　ｒｅｓｓｉｏｎ、第９章、Ａ ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓ　ｐ、１７５を参照のこと）トランスフェクトされう る。適切な配列を含む実際の発現ベクターはリゲーション及び制限酵素を包括す る標準技術に従って製造されうる０Ｍａｎｉａｔｉｓ前掲を参照のこと、ＤＮＡ の特定の部位を切断する市販の制限酵素はＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａ ｂｓ、　Ｂｅｖｅｒｌｙ。

Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓより入手できる。

特に、他の遺伝子を伴う同時形質転換が特に有用である０例えば、核酸を他のプ ロセシング酵素と一緒に発現させることが所望されうる、かかる酵素にはシグナ ルペプチダーゼ、第三コンホメーシヨンを担う酵素又はグリコジル化酵素が含ま れる。この発現方法は発現宿主において欠いていることのある、例えば原核発現 系における哺乳動物様グリコジル化のプロセシング機能を担うことができる。他 方、発現のために選ばれる宿主細胞はそのようなプロセシング酵素の天然の発現 に基づいて選ばれうる。

細胞クローンはベクターの作製法に応じてマーカーを利用することによって選別 される。このマーカーは同−又は別のＤＮＡ分子上にあってよいが、好ましくは 同一のＤＮＡ分子上にある。哺乳動物細胞に関しては、レセプター遺伝子自体が 最良のマーカーでありうる。

原核系宿主においては、形質転換体はアンピシリン、テトラサイタリン又はその 他の抗生物質に対する耐性によって選別されうる。温度感受性又は補助に基づ（ 特定の生成物の生産は適切なマーカーとして寄与しうる。　ＰＤＧＦ−Ｒレセプ タータンパク質又はペプチドフラグメントを回収及び精製するのに様々な方法が 利用されうる。ペプチドは宿主のリゼートより単離できうる。ペプチドは、もし 分泌されるならば細胞上清液から単離されうる０次にＰＤＧＦ−Ｒペプチドを上 記の通り、ＨＰＬＣ，電気泳動又はアフィニティークロマトグラフィー、例えば イムノアフィニティーもしくはりガントアフィニティーを用いて更に精製する。

ＰＤＧＦ−Ｒ関連種のｃＤＮ＾ＤＮＡンを単離するのに利用することのできる他 の方法はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の利用を包括する０例えば５ａｉｋｉ ら（１９８５）　５ｃｉｅｎｃｅ　２３０　：　１３５０を参照のこと。この手 法において、ＰＤＧＦ−Ｒ配列の別々の領域に対応する２つのオリゴヌクレオチ ドを合成し、次いでＰＣＲ反応に用い、典型的には−ＲＮ＾起源からレセプター 関連５ＲＮＡ転写体を増幅させる。オリゴヌクレオチドのアニーリング及びＰＣ Ｒ反応は低い緊張条件のもとで行う、生ずる増幅フラグメントをサブクローンし 、次いで生ずる組換コロニーを５ｔｐ−ラベル化全長ＰＤＧＦ−ＲｃＤＮＡによ り釣り出す、高めではなく、低めの緊張条件のもとてハイブリダイズするクロー ンばＰＤＧＦ−Ｒ関連−ＲＮ＾転写体を表わす、この手法は択一的なスプライシ ングの結果として生ずる変異ＰＤＧＦ−ＲｃＤＮ八種へ単離するのにも利用でき る。Ｆｒｏｈ−ａｎら（１９８８）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ 、　ＵＳＡ　８５：８９９８を参照のこと。

■、抗体 様々なＰＤＧＦレセプター構造体、レセプターペプチド及びペプチドフラグメン トに対するポリクローナル及び／又はモノクローナル抗体も製造されうる。ペプ チドフラグメントはペプチド合成装置で合成的に製造でき、そして担体分子（即 ち、キーホール結合ヘモシアニン）にカップルさせ、次いでウサギに数ケ月にわ たって注射せしめる。このウサギの血清をＰＤＧＰレセプタータンパク質又はフ ラグメントに対する免疫反応性について試験する。モノクローナル抗体はマウス にＰＤＧＦ−Ｒタンパク質、ＰＤＧＦ−Ｒポリペプチド又は細胞表層上に高レベ ルのクローン化ＰＤＧＦレセプターを発現するマウス細胞を注射することによっ て作られうる。モノクローナル抗体をＥＬＩＳＡによってスクリーンし、次いで ＰＤＧＦレセプタータンパク質又はそのポリペプチドとの特異的な免疫反応性に ついて試験する。　）ｌａｒｌｏｗとＬａｎｅ（１９８８）　Ａｎｔｉｂｏｄｉ ｅｓ　：　Ａ　１．ａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ＋　Ｃ３Ｈａｒｂｏｒ　Ｐ ｒｅｓｓ（本明細書に参考として組入れる）を参照のこと、これらの抗体はアッ セイ及び薬品に有用であろう。

十分な量の所望のＰＤＧＦレセプターポリペプチド作製体が獲得できたら、この タンパク質は様々な目的のために利用されうる。典型的な用途はこれらのレセプ ターの特徴的なエピトープに特異的に結合する抗体の生産にある。これらの抗体 はポリクローナル又はモノクローナルであることができ、そしてインビボ又はイ ンビトロ技術により生産されうる。

ポリクローナル抗体の製造のため、典型的にはマウス又はウサギである適切な標 的免疫系を選ぶ、実質的に精製された抗原を動物にとって適切である方法及び免 疫学者によく知られる他のパラメーターにより決定される状況においてこの免疫 系に提供する。注射のための典型的な箇所は足の裏、筋肉内、腹腔内又は皮肉に ある。むろん典型的には哺乳動物、しかし可能としては鳥類又はその他の動物の ような他の種がマウス又はウサギの代わりになることができる。

免疫学的応答は通常イムノアッセイによっ°Ｃアッセイされる０通常、かかるイ ムノアッセイは例えば抗原が生産されたのと同一の細胞により及び同一の状況に おいて生産された抗原の起源のある程度の精製を包括する。イムノアッセイはラ ジオイムノアッセイ、酵素結合アッセイ（ＥＬＩＳＡ）　、蛍光アッセイ、又は 数多くの選択のうちのいづれかあってよく、はとんどは機能的に同等であるが、 特定の条件のもとて特定の利点を示しうる。

少なくとも約１０’Ｍ−’、好ましくは１０＠、　１０”又はそれより高い親和 力を有する抗体は、例えば本明細書に参考として組入れる！（ａｒｌｏ＠とＬａ ｎｅ　（１９８Ｂ）＾ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａ ｎｕａｌ、　Ｃ３ＨＰｒｅｓＳｉ又はＧｏｄｉｎｇ　（１９８６）　Ｍｏｎｏｃ ｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　：　Ｐｒｊｎｃｉ　１ｅａｎｄ　Ｐｒａｃ ｔｉｃｅ　（第２版）＾ｃａｄｅｓｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋに記 載の標準手法によって作られるであろう、簡潔すると、適当な動物を選び、そし て所望の免疫プロトコールを続ける。適当な期間の後、かかる動物肺臓を切り出 し、そして個々の肺臓細胞を典型的には不死化ミエローマ細胞に適当な選択条件 のもとで融合させる。その後、これらの細胞をクローン選別し、次いで各クロー ンの上清液を抗原の所望の領域に対して特異的な適切な抗体のその生産性につい て試験する。

他の適切な技術には、リンパ球の抗原性ポリペプチドへの試験管内側し又はそう でなければファージもしくは類似のベクターにおける抗体のライブラリーの選別 が包括される。本明細書に参考として組入れるＨｕｓｅら”Ｇｅｎｅｒａｔｉｏ ｎ　ｏｆ　ａ　Ｌａｒｇｅ　Ｃｏｍｂｊｎａｔｏｒｉａｌ　Ｌｉｂｒａｒｙｏｆ 　ｔｈｅ　Ｉｍｓｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　Ｒｅｐｅｒｔｏｔｒｅ　ｉｎ　Ｐｈ ａｇｅ　Ｌａｍｄａ″　５ｃｉｅｎｃｅ２４６　：　１２７５−１２８０１９８ ９）を参照のこと０本発明のポリペプチド及び抗体は改質を伴って又は伴わない で利用されうる。しばしば、このポリペプチド及び抗体は、検出可能なシグナル を提供する物質を共有的又は非共有的のいづれかによって連結せしめることによ ってラベル化されるであろう、広範囲にわたる種々のラベル及びコンシュゲージ ロン技術が知られており、そして科学及び特許文献の両方にかなり報告されてい る。適当なラベルには注射性核種、酵素、基質、補体、インヒビター、蛍光物質 、ケミルミネツサー、磁粒子等が含まれる。かかるラベルの利用を教示する特許 には、米国特許第３、８１７．８３７号；第３，８５０，７５２号；第３．９３ ９，３５０号；第３，９９６．３４５号；第４，２７７．４３７号；第４，２７ ５，１４０号；及び第４，３６６．２４１号が含まれる。

更に、組換免疫グロブリンも製造されうる。　Ｃａｂｉｌｌｙの米国特許第４． ８１６，５６７号を参照のこと。

特に注目の抗体はりガント結合性領域に対して発生させたものである。これらに はリガンドとして機能するいくつかの抗体が含まれるであろう。あるいは、抗体 は改質レセプターにとってのりガントとして働きうる化合物について選択するた めに利用されうる０例えばＭｅｙｅｒ（１９９０）　Ｎａ旦ｒｅ　３４７　：　 ４２４−４２５　；及びＰａ１ｎら（１９９０）　Ｎａｔｕｒｅ３４７　：　４ ４４−４４７を参照のこと；それぞれ本明細書に参考として組入れる。

■、利用方法 本発明は、血小板由来成長因子レセプター（ＰＤＧＦ−Ｒ）ポリペプチドの精製 方法及び細胞内でＰ［ｌＧＦレセプターを合成するための方法を提供する。更に 、これらの方法によって製造した相同レセプター、このレセプター又はこのレセ プターの一部をコードする核酸配列、並びにこれらの配列を含む発現担体、ＰＤ ＧＦレセプターを含んで成る細胞、及びこのレセプターに対する抗体を提供する 。特に、本発明は、ドメインの組合せの配置変えされたレセプター様タンパク質 の結合性及びその他の活性をアッセイするための方法を提供する。

ヒトＢ型ＰＤＧＦレセプタータンパク質の細胞外ドメインはレセプター活性アフ セイにおいてＰＤＧＦ　ＢＢリガンドを効果的に結合させるために利用される。

ＮＩＨ３Ｔ３細胞結合化ＰＤＧＦレセプターに対するＰＤＧＦ　ＢＢリガンドの 結合性を測定した。リガンドの結合は細胞に結合したレセプターのリン酸（活性 ）をもたらす、レセプターのリン酸化は多段プロセスで追尾され、これは第１に ＮＩＨ３Ｔ３細胞の可溶化及びドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル での細胞抽出物の電気泳動による細胞タンパク質の分離を包含する。ゲルをニト ロセルロース上にプロットし、次いでリン酸化ＰＤＧＦレセプターの検出を補助 するために抗ホスホチロシンモノクローナル抗体で処理する。モノクローナル抗 体は、このアッセイの最終段階にて導入する抗体結合化１２５−１プロテインへ のオートラジオグラフィーを介して識別化させる。

もしヒトＢ型レセプタータンパク質（ＰＤＧＦ　ＢＢリガンドに対して約６０倍 モル過剰）をリガンドと１時間、ＮＩＨ３Ｔ３細胞とのインキュベーション前に 予備インキュベートしたら、細胞結合化ＰＤＧＦレセプターのリン酸化はない、 このことは、ヒトＢ型ＰＤＧＦレセプタータンパク質が溶液の中でＰＤＧＦ　Ｂ Ｂリガンドと結合し、そしてリガンドが細胞結合化ＰＤＧＦレセプターを活性化 するのを妨害することを示唆する。

従って、ＬＢ）ｌを含むポリペプチドは正常なＰＤＧＦ応答をブロックする。

本発明の構造体を含むドメインは診断及び治療薬として有用であろう。このレセ プターポリペプチドはりガントを検出又は結合せしめるためのアフィニティー試 薬として、及びレセプター様タンパク質と相互作用する、例えばレセプタータン パク質の三量化に影響を及ぼすものとして利用されうる。このポリペプチドは、 レセプター又はそのフラグメントに結合する他のタンパク質を検出又は精製する ための試薬としても有用であろう。

このレセプターポリペプチドはその他の試薬、例えば改質レセプターに固有の結 合性エピトープに特異的な抗体を作るうえでの用途も見い出せるであろう、特に 、新たに作ったりガント結合決定セグメントに対して発生せしめた抗体はこの改 質レセプターのためのりガントとして寄与しうる。これらの技術はレセプターの 様々な機能体を分け、これによってＰＤＧＦ結合に応答する種々のエフェクター 機能それぞれを他から単離すること客担う。

本発明の改質レセプターはそれらに対するリガンドをアッセイするための方法も 提供する０例えば、可溶性リガンド結合性フラグメントは、リガンド結合アッセ イにおいて有用な特性である、リガンド結合のための競合部位として有用であろ う、特に、本発明はＰＤＧＦ結合阻害についてスクリーンするためのアッセイを 提供し、大量の化合物のスクリーニングを可能とする。これらの化合物はインビ トロでアッセイされることができ、これは細胞障害性又は膜崩壊性化合物の試験 を可能にする。当該の固相系は再現性のある、高感度で、特異的な、そして容易 に自動化されるアッセイ手順を可能とする。

リガンド結合活性をアッセイするために、ポリスチレン製９６穴プレートをＬＢ Ｒを有する適当な構造体でコートすることができる。

更に、リガンド結合性ドメインに対する改質は種々のりガント結合親和性を有す る結合領域組合せをもたらすであろう、従って、リガンドが及ぼす応答の調節は 適当な親和性改質化類似体を含ませる４とによって容易に達成されうる。

これらの改質化レセプターを利用する固相アッセイも開発でき、未改質結合領域 よりも高感度又は向上した能力を提供する。

これらの試薬を含んで成る診断キットも提供する。このキットは典型的には、本 発明の診断試薬が結合している区分けされた囲い、例えばプラスチック基板を含 んで成る。この包装品は典型的には種々の緩衝剤、ラベル試薬、及び実施すべき 診断検査にとって適切な他の試薬も含む、関連の試薬の利用及び結果の判断のた めの仕様書が提供されるであろう。

特に、細胞外ドメインの重要な機能性セグメントを通常プラスチック又はその他 の面相基板に結合させることがある。この結合領域は通常、改質化結合性セグメ ントの親和性とりガント結合性スペクトラムとの組合せに対して選ばれる。適当 なりガントを通常導入してリガンド結合活性及び親和性を決定する０種々のＬＢ Ｒの組合せが利用され、そして異なる改質化された、例えばラベル化されたりガ ントのための試験に用いられうる。

更に、これらのペプチドは治療用投与にとって有用であろう、有効な治療にとっ て必要な試薬の量は、投与の手段、標的部位、患者の生理学的状況及びその他の 投与された医薬品に依存するであろう。

従って、処置用量は安全性及び薬効を最適化するために力価検定すべきである。

一般には、インビトロにおいて利用する用量は、これらの試薬の現場投与にとっ て有用な量の有用な指針を担うことができる。特定の障害の処置にとって有効な 用量の動物試験はヒトの用量の推定指標を更に提供するであろう０種々の考察が 例えば本明細書に参考として組入れるＧｉ　１ｅａｎら（Ｗ）（１９９０）　Ｇ ｏｏｄｍａｎ　ａｎｄ　Ｇ１１−想コ：田り防払μ匪回山測Ｂａ５ｉｓ　ｏｆ　 Ｔｈｅｒ朋見旦■、第８版、Ｐｅｒｇａｗｏｎ　Ｐｒｅｓｓ　；及び７ヱｈａｒ ｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ（１９Ｂ５）第７版、Ｍａｃｋ　Ｐｕ ｂｌｉｓｈｉｎｇ　（：ｏ、、　Ｅａｓｔｏｎ、　Ｐｅｎｎ　；に述べられてい る。

投与方法、例えば経口、静脈内、腹腔膜内、又は筋肉内投与、経皮拡散等がそれ らに記述されている。薬理的に許容されうる担体には水、生理食塩水、緩衝液及 び例えばＭｅｒｃｋ　Ｉｎｄｅｘ＋　Ｍｅｒｃｋ　＆　Ｇｏ、。

Ｒａｈｗａｙ、　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙに記述の他の化合物が含まれるであろう 、　ＰＤＧＦとそのレセプターとの強い親和結合力のため、低用量のこれらの試 薬がまず有効であると予測されるであろう、従って用量の範囲は適切な担体を伴 って、通常１ｍＭの濃度以下、典型的には約１０μＭの濃度以下、通常は約１１ ００ｎ以下、好ましくは約１０ｐＭ　（ピコモラー）以下、そして最も好ましく は約１ｆＭ（フェムトモラー）以下であろう。

該薬学組成物は予防及び／又は治療的処買のために非経口的、局所的、経口的又 は局在投与により、例えばエアロゾール又は経皮的に投与されるであろう、この 薬学組成物は投与方法に依存して様々な単位投与形態において投与されうる０例 えば経口投与に適切である単位投与形態には粉末、錠剤、ビル、カプセル及び糖 剤が含まれる。

好ましくほこの薬学組成物は静脈内投与する。従って、本発明は静脈投与のため の組成物を提供し、これは適当な担体、好ましくは水性担体の中に溶けている又 は懸濁されている化合物の溶液を含んで成る。様々な水性担体、例えば水、緩衝 水、０．４％の食塩水等が利用されうる。これらの組成物は常用のよく知られた 滅菌操作によって滅菌されうるか、又は滅菌濾過されうる。得られる水性溶液を そのまま利用するために包装するか、又は凍結乾燥させる。この凍結乾燥調製物 は投与前に滅菌水性溶液と組合わせる。該組成物は適切な生理条件に必要とされ る薬理的に許容されうる補助物質、例えばｐＨ１１節及び緩衝剤、等張調節剤、 湿潤剤等、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリ ウム、塩化カルシカム、ソルビタ：／モノラウレート、■リヱタノールアミンオ レエート等を含んでいてよい。

固形組成物のため、常用の無毒な固形担体が利用でき、これには例えば薬理等級 のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリ ンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシ ウム等が含まれる。経口投与のため、薬理的に許容されうる無毒な組成物は、任 意の通常利用される賦形剤、例えば前記したものと、一般的に１０〜９５％、好 ましくは約２０％の活性成分を含ませることにより作る（む凪コ１並前掲を参照 のこと）。

エアロゾール投与のためには、この化合物を好ましくは界面活性剤及び噴射剤と 一緒に細く分割した状態で供給される。さらにこの界面活性剤は無毒でなくては ならず、そして好ましくは噴射剤において可溶性である。かかる試薬の代表例は ６−２２個の炭素原子を含む脂肪酸、例えばカプロン酸、オクタノン酸、ラウリ ン酸、バルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リルン酸、オクタノン酸及び オレイン酸と、脂肪多価アルコール又はその環式無水物、例えばエチレングリコ ール、グリセロール、エルトリトール、アラビトール、マンニトール、ソルビト ール、ソルビトールに由来するヘキシトール無水物とのエステル又は部分エステ ル、並びにこれらのエステルのポリオキシエチレン及びポリオキシプロピレン誘 導体である。複合エステル、例えば複合又は天然グリセリドが利用できうる。

界面活性剤はこの組成物の０．１〜２０重量％、好ましくは０．２５〜５重量％ を構成していてよい、この組成物の残りは通常噴射剤である。

液化噴射剤は典型的には周囲条件で気化し、そして加圧のもとで凝縮する。適当 な液化噴射剤には、５回までの炭素原子を含む低級アルカン、例えばブタン及び プロパンがあり；そしてフッ素化又はフルオロ塩素化アルカンが好ましい。以上 の混合物も利用されうる。

エアロプールの製造において、適切なバルブの４１いた容器に、細（分割した化 合物及び界面活性剤を含む適切な噴射剤を充填する。これらの成分はバルブの作 動により放出されるまで高圧で維持されている。

該化合物を含んで成る組成物は予防及び又は治療用処置のために投与されうる。

治療的用途においては、組成物を前記の通り、疾患に既に苦しむ患者にこの疾患 の症状及びその合併症を治癒する、又は少なくともある程度緩和させるのに十分 な量で投与する。これを達成せしめるのに適切な量を「治療的有効投与量」と定 義する。この用途に有効な量は疾患の重症度並びに患者の体重及び−膜状態に依 存するであろう。

予防的用途においては、本発明の化合物を含む組成物を特定の疾患に敏感な、又 はそうでなければ危険性のある患者に投与する。かかる量は「予防的有効投与量 」と定義する。この用途においては、ここでも正確な量は患者の健康状態及び体 重に依存する。

本発明は以下の実施例を参照することによりより良く理解されるであろう、以下 の例は限定ではなく例証のために提供する。

実験 一般に、組換ＤＮＡ技術の標準的操作は種々の論文、例えば本明細書に参考とし て組入れるＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉ ｎ　：　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕ　Ｉ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ　；　Ａｕ５ｕｂｅｌら（１９８７）Ｃｕｒｒｅｎｔ　ｒｏ ｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｕ、第１及び２巻と付録 ；並びに−ＵとＧｒｏｓｓ曽ａｎ　（＆ｉ）　（１９８７）　ハ肋郵Ｌ」−モｖ 刀す１ｊ上、第５３巻（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ　Ｐａｒｔ　Ｄ）に記 述されている。

■、竺上豊惣五１１ ヒトレセプター由来可溶性細胞外レセプターフラグメントの省略型又は欠失Ｕｍ 体の作製、発現及び生理学的効果の決定のための同等の複数の技術が核酸、ポリ ペプチド及びここで提供するその他の試薬を利用して実施されうる。

Ａ、Ｂ型セグメント Ｂ型レセプターポリペプチドの構造体は以下の通りに作った：ヒトＢ型ｈＰＤＧ Ｆ−Ｒの３．９ｋｂのＥｃｏＲＩ　−Ｈｌｎｄｌｌ［ｃＤＮＡフラグメントを旧 ３　Ｍｐ１８のＥｃｏＲＩ−旧ｎｄｎ１部位の中にサブクローンしてベクターＭ ｐ１８ＰＲを作った。操作については、本明細書に参考として組入れるＭａｎｉ ａｔｉｓら　（１９８２）　Ｍｏ１ｅｃｕ！ａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：八Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ。

Ｃｏ１ｄ　５ｐｒｉｎ（Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎ、Ｙ、を参照のこと、サブクローニ ングの評価は、Ｓａｎｇｅｒら（１９７７）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’１．Ａｃａｄ 、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７４　：　５４６３に記載の制限酵素消化分析及びジデ オシキ連鎖停止シーケンシングによって作った。オリゴヌクレオチド特異的イン ビトロ突然変異誘発をＫｕｎｋｅｌら（１９８７）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｈ ｎｚ　ｓｏｌ、、　１５４　：　３６７に記載の方法に従って行った。門ｐ１８ ＰＲのオリゴヌクレオチド特異的インビトロ欠失突然変異誘発のための手法を図 １に概略した。

簡潔すると、一連のオリゴヌクレオチドをデザインし、欠失突然変異誘発により 入れ子穴（ｎｅｓｔｅｄ）セットの可溶性Ｂ型ｈＰＤＧＦレセプター細胞外ドメ イン１〜５（Ｄ１〜Ｄ５）を作り上げた。これらのドメインをドメイン１〜ドメ イン５（Ｄ１〜Ｄ５）と表示し、適当な真核発現係の中での発現に適する。突然 変異オリゴヌクレオチドの詳細はヒトＰＤＧＦレセプターの対応の領域と並べて 表１０に挙げている０表１３に示している得られる構造体をラベル化した。全体 にわたり、突然変異誘発のためにアンチセンス鎖を利用した。Ｐｂ０゜Ｐｂ２． 　Ｐｂ３．　Ｐｂ４及びＰｂ５の突然変異誘発は鋳型としてＭＰ１８Ｐｌ？を利 用し、そしてＰｂ６．　Ｐｂ７．　Ｐｂ０及びＰｂ９の突然変異誘発は鋳型とし てＭ＋）１８ＰΔ１を利用した。　４１ｂｐのオリゴマーであるＰｂ０はＤ５の リジン４９！（Ｋ４？９）の後にＴＡＧ停止コドンを導入せしめ、従ってトラス ンメンプラン（ＴＭ）及び細胞内キナーゼドメイン（Ｋ）全体を除去せしめ、Ｍ ｐ１８ＰΔ１をもたらした（図１参照のこと）。

Ｐｂ０は５３０．．１４８’　ｓａ前駆体タンパク質をコードする。

ヒトＢ型ＰＤＧＰ　Ｒ発現構造体 −Ｈｉｎｄ　ｍ部位の中にサブクローンし、次いで５ｏｕｔｈｅｒｎとＢｅｒｇ 　（１９８２）Ｊ、Ｍｏ１．Ａ　１．Ｇｅｎ、、１　：　３２７に記載の通りニ ｐｓＶ２ＮＥＯと共に、チャイニーズハムスター卵巣細胞（Ｃ）１０）中にトラ ンスフェクトせしめた。

図２及び３参照のこと。

この構造体の機能は以下の通りに実証される：０．３３ｎＭのＰＤＧＦ　ＢＢリ ガンドのサンプルを４℃で１時間、以下の条件のもとてブレインキュベートする ： １、ヒトＰＤＧＦに対するポリクローナル抗体（この抗体はヒトＰＤＧＦＡＡ、 　ＰＤＧＦ　ＢＢ及びＰＤＧＦ　ＡＢを認識する）；２、１８ｎＭ（ＰＤＧＦ　 ＢＢに対して６０倍モル過剰）のヒトＢ型ＰＤＧＦレセプター； ３、このレセプター及び抗体を入れるリン酸緩衝生理食塩水；又は ４、リガンド自体以外の添加物なし。

デエブリケートセットの実験において、０．３３ｎＭのＰＤＧＦ　ＡＡを上記の ３通りのインキュベージロン条件、例えば上記の２．３と４でインキュベートし た。ヒトＢ型ＰＤＧＦレセプターはＰＤＧＦ　ＡＡを認識することが認められな かったが、このリガンドはＮＩＨ３Ｔ３細胞由来の細胞結合型ヒトＡ型ＰＤＧＦ レセプターを活性化せしめたので、これはヒトＢ型ＰＤＧＦレセプター特異性及 びＰＤＧＦ　８８依存活性、対、非特異的一般細胞作用、例えば、細胞障害性に ついてのコントロールとなる。

プレインキュベートした材料は０．５ｍｌの最終容量とした。これらを、４°Ｃ に冷やした無血清（休止）　ＮＩＨ３Ｔ３細胞の集密層を含む６穴組織培養皿の 各ウェルの中に入れた。これらの細胞及びインキュベーション混合物を４°Ｃで ２時間撹拌、例えばゆらした０次にそれらを４　”Ｃのリン酸緩衝食塩水で２回 洗った。マイクロタイターウェル当り　１２５ｍＭのトリス　（ヒドロキシメチ ル）アミノメタン（トリス）、ＰＨ６，８，２０％（Ｖ／Ｖ）のグリセロール、 ２％（ｗ／ｖ）のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＯＳ）　、２％の（Ｖ／Ｖ）の２ −メルカプトエタノール及び０．００１％のブロムフェノールブルー（ＳＯＳサ ンプル緩衝液として知られる）４０μｍを加え、次いで１００ｍＭのトリス、ｐ ）１８．０＋３０−Ｍのビロリン酸ナトリウム、５０−Ｍのフッ化ナトリウム、 ５■Ｈのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）　、５ｍＭのエチレンビス（オキ シエチレンニトリリオ）四酢酸、１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ　、１００＋ｗＭのジ チオスレイトール、２■Ｈのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ） 及び２００μＭのバナジン酸ナトリウム　４０μｌを細胞に加えた。これらの細 胞は可溶化し、そして４０ｕｌの更なるＳＯＳサンプル緩衝液をこの溶解物に加 えた。この材料を５分間煮沸し、そして７．５％のドデシル硫酸ナトリウムポリ アクリルアミドゲルの単一ゲルサンプルウェルに載せた。細胞性タンパク質を電 気泳動によって分離させた。

分離したタンパク質をエレクトロトランスファーでニトロセルロースに移し、そ して得られる「ウェスタンプロット」を室温で２０分間、０．５％（Ｗ／Ｖ）の 塩化ナトリウム、５ｓｇ／請ｌのウシ血清アルブミン、５０ＭＭのトリス、ｐＨ ７，５（ブロッキング緩衝液と呼ぶ）を３回交換しながらインキュベートした。

　１／１０００希釈率のブロッキング緩衝液中のＰＹ２０　（ホスホチロシンに 対する市販のモノクローナル抗体（ＩＣＮ〕）をこのプロットと４℃で一夜イン キュベートした。このプロットをブロッキング緩衝液の中で室温で２０分間、３ 回洗った。

このプロットをブロッキング緩衝液中の４μＣｉ／４０μｌの１！ＳＩ−プロテ ィンＡ　（Ａｍｅｒｓｈａｗ）と室温で１時間インキュベートし、次いでブロッ キング緩衝液の中で室温で２０分づつ３回洗った。このプロットをＸ線フィルム に、−７０”Ｃの一枚の増強スクリーンで４８ｈ暴露せしめ、次いで標準の試薬 により現像した。

図４は上記の条件とりガントを加えていない（ＰＤＧＦなし）の追加の条件によ るオートラジオダラムの結果を示す、この追加の条件は任意のリガンドなしての 細胞結合化レセプターの活性（例えばリン酸化）のレベルを規定する。抗体及び ヒ）Ｂ型ＰＤＧＦレセプターの両者ともＰＤＧＦ　ＢＢによる細胞結合化ＰＤＧ Ｆレセプターの活性を中和せしめた。このことは、ＰＤＧＦレセプター活性にと ってリガンドが役格立たずのものとなる、リガンドへの直接的な結合及び封鎖に 基づくことが明らかである。　ｐ１８５はレセプター位置を示している。

Ｂ、　Ａ復配列 表１２の突然変異誘発オリゴヌクレオチドを利用する類似の操作を利用して、表 １５に挙げるＡ型構造体を作製する。Ａ型作製体は実際には製造していないが、 しかしこれらの方法によって容易に製造されうることに注目すべきである。これ らの構造体の機能を試験するのに類似のアッセイが利用される。

予想のヒ）Ａ型ＰＤＧＦ−Ｒ発現構造体Ｃ９ＰＤＧＦブレートアッセイ ポリスチレンマイクロタイタープレート　（■■ｗｕｌｏｎ＋　Ｄｙｎａｔｅｃ ｈＬａｂｏｒａ　ｔｏｒ　１ｅｓ）にＢ型ヒトＰＤＧＦレセプター（前記）の細 胞外領域フラグメントを、ウェル当り　１００μｍの２５−Ｈのトリス、７５曽 ＨのＮａＣ１＋ｐＨ７，７５中の約１０−１００　ｎｇのこのタンパク質を４° Ｃで１２〜１８時間インキュベートすることによってコートせしめた。トランス フェクト化Ｃ）＋Ｏ細胞においてタンパク質を発現させ、そして０．２〜ｌｔＩ ｇ／ｍｌの濃度で無血清培地（Ｇｉｂｃｏ　ＭＵＭα）中で集め、総タンパク質 濃度１５０〜３００　μｇ／蒙１であった。

ヒトＰＤＧＦ　Ｂ型レセプター細胞外領域フラグメントを濃縮し、次いでこの培 地を小麦胚芽凝集素−セファロースに４℃（４８■１／ｈにて）にて１ｉ＋Ｍの ＰＭＳＦの存在下で通すことによって精製した。よく洗った後、タンパク質を０ ．３ＭのＮ−アセチル−グルコサミン、２５−ＭのＨＥＰＥＳ、　１００ｍＭの ＮａＣｌ、１　ｍＭのＰＭＳＲ，ｐＨ７，４の中で溶離させた。この画分を次に ０．１５Ｍの炭酸水素アンモニウムｐＨ７，９の中で平衡化した５ｅｐｈａｃｒ ｙ　Ｓ−２００ＨＲ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に適用した。レセプター（３〜１０ ｎｇ／端１）を含む画分を５Ｏ３−ＰＡＧＥ、及びこのレセプターの外部領域に 由来するドメイン１（ＤＩ）セグメントに対して標準の方法により作ったポリク ローナルウサギ抗体を伴うウェスタンブロッティングによって検定した。

これらの両分（３〜１０ｎｇ／ｍｌ）を上記の通りマイクロタイターウェルをコ ートするために用いた０次にこれらのウェルを排液し、０．５％のゼラチン（Ｂ ｉｏ−Ｒａｄ、　ＥＩＡ級）　、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ＋　１００ｍＭのＮａＣ １゜ｐＨ７，４２００＊Ｉで１回洗い、次いで同一の溶液１５０μｌで２４℃で １〜２時間インキュベートした。このウェルを排液し、そして０．３％のゼラチ ン、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ＋　１００ｍＭのＮａＣ１，ｐＨ７，４（各１５０． ！１１）で２回すすいだ、各ウェルに０．３％のカゼイン溶液９０μｌを入れた （非特異的結合を試験するのに用いたウェルには８０μｍしか入れず、次いで０ ．３％のゼラチン溶液中の０．０１ｉ＋ｇ／ｍｌの非ラベル化ＰＤＧＦ　１０μ ｍを入れた）、ジ−ヨードポルトンハンター（Ｂｏｌｔｏｎ　Ｈｕｎｔｅｒ）試 薬（Ａｍｅｒｓｈａ−）でＰ［ｌＧＦ　ＢＢ　（Ａ−ｇｅｎ）を４℃で５２．０ ００　ＣＰＭ／ｎｇまでヨウ素化し、次いでウェル当り、０．０２４％のＢＳＡ 、　０．４％のゼラチン、２０−ＭのＨｅｐｅｓ＋　８抛ＨのＮａＣｌ、　７抛 Ｈの酢酸、ＰＨ７，４を含む１０μｍ中の約４０．０００　ＣＰＭを加えた。こ のプレートを２４°Ｃで２−３時間インキュベートし、その後、このウェルを０ ．３％のゼラチン、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ　。

１００ｍＭのＮａＣ１，ｐＦＩ７．４１５０７／　ｌづつで３回洗った。残留結 合放射活性物をウェルから、２００μｌの１％のＳＯ５，０，５％のＢＳＡの中 で可溶化し、ガンマ−カウンターで計測した。１５０倍過剰量の非ラベル化ＰＤ ＧＦ　ＢＢ　（Ａｍｇｅｎ）の存在下において非特異的結合を決定し、それは全 結合”’Ｉ−ＰＤＧＦの約７％であった。

Δ型し／−ｆＰブタ・−フラグメントを泪いて類似のアッセイが可能であろう。

しかしながら、Ａ型１／セブターフラグノントはＢ型フラグメントよりも他のタ ンパク質の存在に対してより敏感であり、従ってセ°ラチンとは異なるコーティ ング試薬をデするものと思われる。ヘモグロビンが緩衝中のゼラチンにほぼ同一 の濃度で代用される゛。有用であろうその他のブロッキングタンパク質は例えば Ｓｉｇ■ａ　Ｃｂｅｍｉ−ｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙより選べる。タンパク質のタ イプ及び濃度を最適化する力価検定はこのレセプタータンパク質結合に影響を及 ぼさないタンパク質を見い出すのに実施されるであろう。

本アッセイはトランスフェクト化ＣＨＯ細胞において発現され、そしてアフィニ ティー及びゲルクロマトグラフィーにより部分精製された５μｇ／ウェル以下の レセプター可溶性型を必要とする。ヨウ素化ＰＤＧＦ−ＢＢを利用して、１０ｐ ｇ以下のリガンドの特異的結合性が１００μｇ／ウェルのアッセイ容量において 検出されうる。４°Ｃにて、固定化レセプターに対する”’Ｉ−ＰＤＧＰ　ＢＢ の結合は飽和となることができ、従って高親和力となる。　５ｃａｔｃｈａｒｄ 分析によるＫｄはウェル当り１．８Ｘ１０”部位を伴って約１ｎＭであった。１ ００倍過剰量の低温ＰＤＧＦＢＢの存在下において決定した非特異的結合は通常 全結合の約５〜１０％のみであった。この結合は、過剰の低温ＰＤＧＦ　ＡＡが ”５Ｉ−ＰＤＧＦ　ＢＢ結合を阻害しない限り、リガンドのイソフオームに対し ても特異的であった。更に、溶液中のＢ型ＰＤＧＦレセプターの外部領域はその 固定化形態と、ヨウ素化ＰＤＧＦ　ＢＢの結合に対して競合する（ＩＣｉｏ＝５ ｎＭ）。４°Ｃで４時間後に結合した”’Ｉ−ＰＩ）ＧＦ　ＢＢ結合は結合用緩 衝液の中でゆっくりと解離したが（ｔ＋ｚｚ＞６ｈ）、１５０倍過剰量の非ラベ ル化ＰＤＧＦ　ＢＢ（ｔ　＋ｚｚ　＜　１　ｈ　）の添加により完全に置換され た（ｔ＋／ｌ＜ｌｈ）。

これらの試験は、他の成長因子の夾雑物を有さない成長因子調製物の有用性ζよ り、及びレセプター発現系の利用により可能となり、ここで測定されたＰＤＧＦ 応答の全゛Ｃはこの単一・ｉランスフェクト化しセブクーｃＤＮＡに寄与しうる 。

本明細書における全ての文献及び特許出＠は本明細書に参考として組入れる。本 発明を完全に説明し７たきたが、任意の変更及び改良は本発明の範囲をｍ脱する ことな（実施されうろことを当業者は理解しているであろう。

配列表 （１）一般情報： （ｉ）出願人：　Ｗｏｌｆ、　ＤａｖｉｄＴｏｓｌｉｎｓｏｎ、　Ｊａｔａｅｓ 　Ｅ。

Ｅｒｅｔｔｏ、　Ｌａｒｒｙ　Ｊ。

Ｇｔｅｓｅ、　Ｎｅ１ｌｌ　Ａ。

Ｅｓｃｏｂｅｄｏ、　Ｊａｉｍｅ　Ａ。

Ｗｉｌｌｉａｉ＊ｓ、　Ｌｅｗｉｓ　Ｔ。

（ｉｉ）発明の名称：ヒト血小板由来成長因子レセプターポリペプチドの細胞外 領域ドメイン （ｉｉｉ）配列の数：２３ （ｔｖ）宛先： （Ａ）住所：　Ｔ（ＶＮＳＥＮＤ　ａｎｄ　ＴＯＷＮＳＥＮＤ（Ｂ）街：　５ｔ ｅｕａｒｔ　５ｔｒｅｅｔ　Ｔｏｗｅｒ、　２０ｔｈ　Ｆｌｏｏｒ＼Ｏｎｅ　Ｍ ａｒｋｅｔ１ａｚａ （Ｃ）市：　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃ。

（Ｄ）州：　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ （Ｅ）国：υＳ （Ｆ　）　ＺＩＰ　：　９４１０５ （ｖ）コンピューター読取方式： （Ａ）媒体タイプ：　Ｆｌｏｐｐｙ　ｄｉｓｋ（Ｂ）コンピューター：　ＩＢＭ 　ＰＣＣｏｍｐａｔｉｂｌｅ（Ｃ）作動システム：　ＰＣ−００５／ＭＳ−００ ５（Ｄ）ソフトウェアー：　Ｐａｔｅｎｔｒｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ　ｌ１１．ｏ＋ 　ＶｅｒｓｉｏｎＨ，２５ （ｖｉ）現出頃日： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （ｖｉ）代理人／代理店の情報： （Ａ）名称：　Ｃｈｉｎｇ、　Ｅｄｗｉｎ　Ｐ。

（Ｂ）登録番号：　３４．０９０ （Ｃ）参考／事件番号：　１２４１Ｂ−１４（ｔｘ）通信情報： （Ａ）を話：　（４１５）　３２６−２４００（Ｂ）テレファックス：　（４１ ５）　３２６−２４２２（２）ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１についての情報＝（ｉ） 配列の特＠： （Ａ）長さ：　５４２７塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡから−ＲＮＡ（迅）仮説：なし くｉｖ）アンチセンス：なし くｖｔ）起源： （Ａ）生１１１Ｉ：人類 （Ｂ）株ニラムダｇｔｌ。

（ｉｘ）特＠： （Ａ）名称／キー：　Ｃ０５ （Ｂ）位置：　１８７．．３５０４ （ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ　１０　ＮＯ：　１　：ＧＧＡＧｃＰＡＳＣ　人Ｃ τＣτｃｃ入ｃａ　ａｃｃ’ｒｃｃ入入Ｃτ　Ｃ丁ａｃｅ仁入ＣＡＣ　こ入Ｇ入 ＾ＧＣＣ＾τ　Ｃ入ＧＣ入ｃｅλ■f　１８０ ＧＡＣＡｅ（：　入ＴＧ　ＣＣＧ　ＣＴ？　ＣＣＣ　ＧＣτ　ＣＣＯ　ＡＴＣ　 ＣｅＡ　ＧＣ？　ＣＭ　ＧＣＣ　ＣＴＣ　Ａ入Ａ　ＧＧＣ　Q２ｌ ＭＩＩＣ　入ｒｑ　ＸＡｕ　Ｐｒｏ　ＧＬｙ　入Ｌａ　Ｍａｃ　Ｐｒｏ　入Ｌ＆ 　Ｌａｕ　入工ａＬ蟲ｕ　Ｌｙｓ　ＧＬｙＳ　１０ ｃｘｃ　ａｒｃ　ｃ’ｒｃ　τテａｃｒｅ　テｃｙ　ｅｒＣ　ｃ’ｒｃ　’！Ｔ Ａ　ｅｒｒ　ｃ’ｒｃ　（；入Ａ　ＣＣＡ　（：入Ｇ　ＡＴb　？’？　２７６ Ｇｌｕ　ＩＪｕ　ＩＪｕ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｓ＠Ｔ：　Ｌａｕ　Ｌｓｕ　Ｌ４ｕ 　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｇ工ｎ工工＠　ＳａｒＣＡＧ　ＧＧＣ　Ｃ ＴＣ　Ｇ？（：　Ｃ？Ｃ　入ｃＡ　ＣｅＣ　ｅＣ（ｕ　ＧＩＩＪ　ＣｅＡ　（Ｊ ＬＧ　ＣＴｒ　ｆｆｃ　ＣＴＣ　入入Ｔ@ＣＴｅ　コ２４ ＧＬｎ　ＧＬｙ　Ｌａｕ　Ｖａλ　ＶａＬ　τｈｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　ＧＡＹ　 Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　Ｖａ工　Ｌａｕ　λａｎ　ＶａＬコ５　４０　４５ τｅｃ　ＡＧＣ　ＡＣＣ　ＴＴｅ　ｃτＴＣＴＧ　入ｃｃ　ＴＧＣ　Ｔｅａ　ａ ｓτ　ＴｅＡ　ＧＣ丁　ＣＣＧ　ＣＴＩ：　Ｃｆｌ　ＴＣＯ@コフ２ Ｓ＠ｒ　５ａｒτｈｒ　Ｐｈ＠’Ｊ＆Ｌ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　ｃｙｓ　Ｓｉｒ　Ｇ ＡＹ　Ｓ＠ｒ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｖａｉ　Ｖａｌ　ＴｒｐＯＡＡ　ＣＩＩＪ　入 ＴＧ　ＴＣＣ　ＣｈＱ　ＧＡＧ　ＣｅＣ　ｌ：ｃＡ　ＣＡＧ　Ｃ；入入　ＡＴＣ 　Ｇｅｅ　入ＡＧ　ＧＣＣ　Ｃ入Ｃ　f入Ｔ　４２０ ＧＬｕ　入ｒｑ　Ｍ＠ｔ　Ｓａｒ　ｅｌｒ＋　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　＋：ｌ ｎ　Ｇｌｕ　Ｍａｔ　＾上ａ　Ｌｙｅ　入Ｌａ　（；ｉｎ　■Pｐ Ｇｌ：Ｃ　Ａｃｅ　ＴＴＣ　ＴＣＣ　ＡＧＣ　ＣＴＣ　ＣＴｅ　入Ｃ入　Ｃ丁Ｃ 　ＡＣＣ　ＡＡ（：　ＣＴＣ　Ａ（Ｔ　ｅｅＧ　ＣＴ入　Ｇ■b　４６１１ Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｐｈ＊　５＠ｒ　Ｓ＠ｒ　Ｖａ↓　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ｌ＊ｕ　 τｎｒ　入Ａｎ　Ｌａｕ　τｈｒ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　入１ｐＳｏ　８５　９０ 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（ｉｉ）分子のタイブ：タンパク質 （ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ　１０　Ｎｏ：　２　：Ｔｈｒ　ＰＭ　Ｖａｌ　Ｌ ａｕ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｓａｒ　ｃ′１．ｙ　Ｓａｒ　入１ａ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ 　Ｖａｌ　Ｔｒｐ　Ｇ工Ｕ　入ｉＭａｔ　Ｓ＠ｒ　Ｇｉｎ　Ｇ工ｕ　Ｐｒｏ　Ｐ ｒｏ　Ｇｉｎ　Ｇｉｕ　Ｍａｔ　入１ａ　Ｌｙｓ　入１ａＧ工ｎ　入ｓｐ　Ｇｌ ｙ　τｈｒＰｈ＠　ｓａｒ　５虻　Ｖａｌ　Ｌａｕ　ｒｈｒ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　 ｋｍｎ　Ｌ４ｕ　Ｔｈｒ　ｃｘｙ　Ｌａｕ　入ｓｐ　Ｔｈｒ　ＧｌｙＧλｕ　Ｔ Ｙｒ　Ｐｈ＠　Ｃｙｇ　Ｔｈｒ　Ｈ！ｓ　＾ａｎ　入ｍｐ　Ｓａｔｒ　入ｒｑ　 ｃｌｙ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　でｈｒ　入ＩＡｐ　Ｇ撃■ ＩＱ０　１ロ５　１１口 Ａｒ＋ｉ　Ｌｙｓ　ｋｘ′ｑＬａｕ　Ｔｙｒ工ｌ．ｓ　Ｐｈａ　Ｖａｌ　Ｐｍ　 ＪＡｐＰｒｏ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｐｈ曝ｔａｕ１工５　１２０　１２５ Ｐｒｏ　入１ｎ　Ａｓｐ　入１ａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　ＴＡｕ　Ｐｈｅ　Ｉｌａ　 Ｐｈｅ　Ｌａｕ　’ｒｈｒ　Ｇｌｕ　エ１ｍ　Ｔｈｒ　Ｇｌ■ １：１０　Ｌコ５　１４ｏ Ｘｌ＠　τｈｒ　工ｌ＠　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　入Ｍ　Ｖａｌ　τｈｒ　入ｌｉｐ　 Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｌａｕ　ｖａｘ　Ｖａｌ　τｈｒ　ｔａｕＨｉｓ　Ｇλｕ　Ｌ ｙｓ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　入１ａ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｖａ工　Ｐ ｒｏ　’！’ｙｒ　八ｇｐ　Ｘｉ！ｌ　fｉｎ １６５　１７０　Ｌ７５ 人ｒｑ　Ｇｌｙ　Ｐｈ＠　Ｓａｒ　Ｇｌｙ　Ｉｌ＠　Ｐｂｅ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　 入ｒｑ　Ｓｅｒ　↑ｙｒ　！ｌｍ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒｌａｏ　１８５　１ ９０ Ｔｈｒ　工１ａ　Ｇａｙ　Ａｍｐ　入ｒｑ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ａｍｐ　Ｓ＠ｒ　 ＭＰ　入１ａ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　入ｒｑＸＡｕ　Ｇｉｎ　Ｖａ ｌ　Ｓａｒ　５ｅｒ　工１ｅ　Ａｇｎ　Ｖａｌ　Ｓ＠ｒ　Ｖａｌ　入ｓｎ　入１ ａ　Ｖａｌ　（；ｉｎ　τｈｒ　Ｖａ■ Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｇａｙ　Ｇｌｕ　入ａｎ　工ｍｅ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　 Ｍ＠ｔ　Ｃｙｓ　工１ｅ　Ｖａｌ　工ｌｍ　ＧＡＹ　入ｓｎ２２５　２コｏ　２ コ５　２４ｏ 入ｓｐ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　入ｓｎ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　 Ｐｒｏ　＾ｒｇ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　５ａｒ　Ｇｌｙ　人ｒｇＬａｕ　ＶａＬ　Ｇ 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ｒ　Ｌａｕ　入ＱＬａｕ　Ｇｉｎ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　入ｓｐ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　 Ｌａｕ　Ｓｉｒ　ＶａＬ　λｒｑ　ｃｙｓ　τｈｒ　Ｌ●ｕ　Ａｒｇ　入ｓｎ人 １ａ　Ｖａｌ　のｙ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　工１ ＠　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　Ｓｉｒ　ＬａｕＰｒｏ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ 　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　工ｌ＊　Ｓ＠ｒ　入１ａ　！ｌ＠　Ｌａｕ　Ａｌａ 　Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｌａｕ５コｏ　５コ５　５４ｏ ？ｈｒ　ＸＬｅ　Ｘ１ａ　Ｓｍｒ　Ｌｅｕ工１ｅ工ｌｍ　Ｌａｕ工ｌｍ　Ｍｅｔ 　Ｌａｕ　Ｔｒｐ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ人ｒｑ　Ｔｙｒ　Ｃｌｕ　 工１ａ　Ａｒｑ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｘ１ｍ　Ｇｌｕ　Ｓ＠ｒ　ＶＪＬＩ 　Ｓａｔ　Ｓ＠ｒ　Ａｓｐ　ｃｌ■ Ｈｉｓ　（；ｌｕ　Ｔｙｒ　Ｚｌｅ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　入ｓｐ　Ｐｒｏ　Ｍｅｔ 　（；工ｎ　Ｉｊｕ　Ｐｒｏ　’ｒｙｒ　入ｓｐ　Ｓａｒ　■■■ ５ａ０　５１１５　５９０ Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　＾ｒｑ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　 Ｌ−ｕ　Ｇユｙ　入ｒｑ　τｈｒ　ｔａｕ　Ｇｌｙ　ＳａｒＧｌｙ　入１ａ　Ｐ ｈ＠　Ｇ工ｙ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　入１ａ　Ｔｈｒ　入１ａ　Ｈ ｉｓ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　Ｓｅｒ　ＨｉｓＳｅｒ　Ｇｉｎ　＾１＆　τｈｒ　Ｍｅ ｔ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　入１ａ　Ｖａｌ　Ｌｙｌ１　Ｍｅｔ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　ｓ ａｒ　Ｔｈｒ　Ａｌ■ ６２５　６コｏ　６コ５　６４ｏ 入ｒｑ　ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｃｌｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　ＴＡｕ　Ｍ＠ｔ　 Ｓ＠ｒ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　工ｌｍ　Ｍｅｔ　ＳａｒＨｉｓ　Ｌａｕ　Ｇ ｌｙ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　Ｌａｕ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　入ａｎ　Ｌａｕ　Ｌ ａｕ　Ｇｌｙ　λｌａ　Ｃｙｓ　Ｔｈ：６６０　６６５　６フＯ Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｚｌｅ　Ｔｙｒ　工１ｅ　工ｉｓ　Ｔｈｒ　 （：ｌｕ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ａｒ９　’！’ｙｒ　Ｇｌｙ　■唐■ Ｌａｕ　Ｖａｌ　入ｓｐ　Ｔｙｒ　ｕｕ　Ｈｉｓ　Ａｒｑ　入ｓｎ　Ｌｙｅ　Ｈ ｉｓ　？ｈｒ　Ｐｈｅ　Ｌａｕ　Ｇｉｎ　Ｈｉｓ　Ｈｉｓ６９０　６９５　フ０ ０ Ｓｅｒ　Ａ５ｐ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａｎｇ　ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　入１ａ　 Ｇｌｕ　Ｌａｕ　Ｔｙｒ　ｓａｒ　Ａｇｎ　入工ａ　Ｌｓｕ７０５　ｎｏ　７１ ５　７２０ 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ｒｇ　５＊ｒ　Ａｓｐ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　入１ａ　工ｌｍ　Ｌａｕ　Ａｒｇ　ｓ ｉｒ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　入ｒｇ　ＬａｕＰｒｏ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｈｉｓ　Ｇｌ ｙ　Ｌａｕ　Ａｒｑ　Ｓａｒ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｓａｒ　Ｓｔ ｒ　Ｖａｌ　ＩａｕＴｙｒ　τｈｒ　入１ａ　Ｖａｌ　Ｇ工ｎ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ 　ｃ工ｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　入ｓｎ　入ｓｐ　Ｔｙｒ　工１＊　Ｚｌ＠　Ｐｒｏ しａｕ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　入１ａ　 Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｇユｙ　Ｐｒｏ　Ｉ．ａｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌ■ ＬＣ２４　Ｌロコ０　１０１５　ＬＯ４０５ｅｒ　ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｌａｕ　Ａ Ｌａ　Ｓｉｒ　Ｓｅｒ　τ？．ｒ　Ｌａｕ　入ｓｎ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　八ｓｎ　 τｈｒ　Ｓｅｒ　５ａ■ 工０４５　１０５ロ　エロ５５ Ｔｈｒ　：ｌａ　Ｓａｔ　Ｃｙｓ　入Ｎｐ　Ｓｅｒ　ｐｒｏ　Ｌａｕ　Ｃｌｕ　 Ｐｒｏ　Ｇ１ｎ　入ｓｐ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ１０６０　１０６５ 　１０フＯ ＳＬｕ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　 Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ１０フ５　１０Ｂ０ 　１０８５ Ｌ＠ｕ　Ｐｒｏ　入ｓｐ　５＠ｒ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　入１ａ　Ｐｒｏ　 入ｒｑ　人１ａ　Ｇｌｕ　入１ａ　Ｇｌｕ　ｋｓｐ　５ａｒ（２）ＳＥＱ　ｒＤ 　ＮＯ：　３についての情報：（ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：　４１００塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖：二本鎖 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｉｖ）アンチセンス：なし くｖｉ）起源： （Ａ）生物：人類 （Ｂ）株ニラムダｇｔｌＯ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：　ＣＤ５ （Ｂ）位置：　１２９．．３３９５ ＣＴＣＧＣＴ　ＧＣＴ　ＣＣＡ　ｆｆ１ｃ　（Ｔ（ｉ　ＣＴＣＣＴＣＴ丁ｔ：　 ＣＴＯＡＴ？　ＧＴＧ　ＡＴＣＡＴＣＴ（ｕ　ＣＴＴ　ニアT４ Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｖａｎ　Ｌ＠ｕ　Ｖａｎ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　 ｖａｌ　Ｚｌ＊　Ｖａｌ　ｍｌ−エエ・　Ｓ＠ｒ　ＬａｕＳコｏ　ｌ）５　５４ ０ ＣＴＣＣＡＣＣＣ：Ｔ　Ｇ入Ｔ　ＣＴｃ　Ｇ（Ｔ　ＧＣＴ　ＣＧＣ入Ａｃ　ＣＴ Ｔ　ＣＴＣＣＴＣＧｅＡ　（：ＡＡ　ＧＧＡ　）ＪＪｋ　２P１８ Ｖａｌ　にｉ！　ｋｒｑ　Ａｌ１９　し−ｕ　入Ｌａ　入１ａ　入ｒ９　人ｓｎ 　ＶａＬ　シ龜ｕ　Ｌａｕ　Ａｌａ　ＧＬｎ　＋Ｌｙ　Ｌｙ■ ８１５　１１２０　８’１５　８コＯ τＣＧ　五人Ｃτ入丁　ＣＴＣτｅｃ　五人入　ｃｃｃ　入Ｃτ　入ＣＣτ〒τ 　ｅｒａ　ａｃｅ　ＧＴＧ　入λＧ　丁ｃｃ　λτＧ　；τP４ ５ｓｒ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｓａｒ　ＬＹｓ　にｌｙ　Ｓａｒ　τｈｒ　 Ｐｈ＊　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｖ龜Ｉ　Ｌｙｓ　丁ｒｐ　Ｍ＠ＣＧＣＴ　Ｃ（Ｔ　Ｇ ＡＧ　ＡＧＣＡｒｃ　’！Ｔτ　ＣＡＣ入ＡＣＣＴＣ丁ＡＣＡｃｅ　ＡＣＡ　Ｃ ＴＣ入Ｇτ　Ｇ入Ｔ　ＣＴＣ２７ｇ２人１ａ　Ｐｒｏ　ａｌｕ　Ｓａｒ　工ｉｓ 　Ｐｈ＠　入ＩＩｐ　大群ｎ　Ｌａｕ　ＴＹＴ　τｈ；　τｈｒ　Ｌａｕ　Ｓａ ｒ　入ａｐ　Ｖａ■ ＧＡＩＳ　ｋＴｃ　入ＴＣＧ？Ｇ　ＡＡＡ　丁ＱＣＴＣＧ　五人ｃ　Ａ１７　Ｇ ＡＧ　ＣＣＣ；　ＣＡＣＡＡＧ　ＡＧＡ　ｅｅｃ　ＴＣｅ　Q９５４ ＧＬｕ　ｎ＠　Ｍ＠ｕ　ＶａＬ　Ｌｙａ　ｃｙｓ　τｒｐ　Ａｓｎ　Ｓａｒ　Ｇ Ｌｕ　Ｐｒｏ　ＧＬｕ　Ｌｙｓ　ｋｒｑ　Ｐｒｏ　５ａｔ９コ０　９３５　９４ ０ 入八入　五人Ｇ　八Ｇ〒　τ入丁　Ｇ入入　五人＾　＾Ｔ？Ｃ入Ｃロテク　Ｃ入 ＣＴτｃｃ’ｒｃ　入＾Ｇ　λＧＴ　ＣＡＣ仁λ丁　３０５O Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｓｕｒ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　工１１１　Ｈｊｊ　Ｌａｕ 　入ｍｐ　Ｐｈ＊　Ｌａｕ　Ｌｙｇ　５＊ｒ　＾ｍｐＨ工５Ｓｅｔ　ＰＭ　し川 （２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　４についての情報：（ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：　１０８９アミノ酸 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子のタイプ：タンパク質 （ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ　１０　Ｎｏ：　４　：ｏａｔ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　 Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｐｈａ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ｌａｕ　Ｃ１ｙ　 Ｃｙｍ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｔｈｒｌ　５　１０　１５ Ｇｌｙ　Ｌａｕ　Ｓｅｒ　Ｌ４ｕ　Ｘ１ｅ　Ｌａｕ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ｌａｕ　 ５＠ｒ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｓｉｒ工１ｍ　Ｌａｕ　Ｐｒ。

２０　２５　コロ 入ｓｎ　Ｃ１ｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｌ４Ｉｕ 　入ｓｎ　Ｓａｒ　Ｓａｒ　Ｐｈａ　Ｓａｒ　Ｌａｕ　入ｒ■ コ５　４０　４５ Ｃｙｓ　Ｐｈ＠Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　５＊ｒ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｓａｒ　Ｔｒｐ　Ｇ ｉｎ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｍａｔ　Ｓａｒ　Ｇｌｕ　ＧｌｕＧｌｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅ ｒ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　入ｓｎ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｓ ｎ　Ａｓｎ　Ｓａｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ６５　フＯ７５１１０ Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｌｓｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｓａｒ　Ｓａｒ　 入１ａ　Ｓｅｒ　入１ａ　入１ａ　Ｈｌｓ　Ｔｈｒ　に１ｙＬａｕ　Ｔｙｒ　Ｔ ｈｒ　ＣｙＳ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｈｉｓ　Ｔｈｒ　ｃ工ｎ　Ｔｈｒ　Ｇ ｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｊ！ｎ　Ｇｌｕ　Ｌａ■ ｌｏｏ　１０５　１１０ （、ｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｑ　Ｈｉｓ　工ｌａ　Ｔｙｒ　Ｈｌｓ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ 　Ｐｒｏ　入ｇｐ　Ｐｒｏ　入ｓｐ　Ｖａｌ　入１ａ　Ｐｈ■ Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｍａｔ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　 Ｖａｌ　工ｉｓ　Ｖａｌ　Ｃ１ｕ　Ａｓｐ　Ａｍｐ　入ｓｐ１コｏ　１コ５　１ ４゜ Ｖａｌ　Ｌｌ／ｓ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐｈａ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｉｌｓ 　Ｐｒｏ　Ｐｈｓ　Ａ１ｎ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　入１ａ　Ｌ＊■ １９５　２０ｏ　２０５ Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｓａｒ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　Ａｓｐ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　 Ｍｅｔ：　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｌａｕ　ＬＹＩＩ　Ｔｈｒ　Ｖ≠P ’ｒｙτ　Ｌｙｓ　５＠ｒ　Ｇ工ＹＧ工ｕ　Ｔｈｒ　工１ｍ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　 Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　入１ａ　Ｖａｌ　Ｐｈｓ　入ａｎ　入５ｉ■ ２２５　２コ０　２コ５　２４゜ Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｌａｕ　Ｇｉｎ　Ｔｒｐ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　 Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｌｙｅ　Ｇｌｙ　ＬｙｓＧｌｙ　Ｚｌａ　Ｔ ｈｒ　Ｍａｔ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　ｃｌｕ　Ｘ１＊　Ｌｙｍ　Ｖａｌ　ｐｒｏ　ｓ ａｒ　工ｌ＠　ＬＹＩＩ　Ｌａｕ　ＶａP ２６０　２１ｉ５　２７゜ ＴＹττｈｒ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　入１ａ　Ｔｈｒ　Ｖ ａｌ　Ｌｙｓ　入ｓｐ　Ｓｕｒ　Ｇｌｙ　λＪ！ＰＴＹτＧｌｕ　Ｃｙｓ　入１ ａ　入１ａ　入ｒｇ　Ｇｌｎ　Ａｈａ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｇ工ｕＶａ工　Ｔ、ｙ ｍ　ＧＬｕ　Ｍａｔ　Ｌｙｓ　ＬｙｓＶａｌ　Ｔｈｒ　Ｈｌｓ　Ｓａｒ　Ｖａ工 Ｈ１ｓ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｐｈ−工１ａ　Ｇｌｕ工１ａ　ＬＹＩＩ　Ｐ ｒ。τｈｒコロ５　コ１ｏ　コニ５　コ２゜ Ｐｈａ　Ｓａｔ　Ｇｉｎ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　入１ａ　Ｖａｌ　入ａｎ　ｘＡｕ　 １（ｉｓ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｈｌｓ　Ｐｈ豐　Ｖａ■ コ２５　ココ。　ココ５ Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　入ｒ”ｆ　入ＩＪＩ　’ｒｙｒ　ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐ ｒｏ　入ｒｇ　工１＠　Ｓａｒ　Ｔｒｐ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　l５ｎ ）４０　）４５　’　）５０ 人＠ｎ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｌｊｌｕ　工ｌ＠　Ｇｌｕ　Ａｓｈ　ｔａｕ　丁ｈｒ 　Ｇｌｕ　工１ｅ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　入ｓｐ　Ｖａｌ　Ｇｌ■ ｌココ　コロｏ　コロ５− 人Ｌａ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｓａｒ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｐｈａ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　 Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　ｐｒｏ　Ｓａｒ　５ａｒ４０５　４ｚＯ４工 ５ Ｚｌａ　Ｌ＠ｕ　入ｓｐ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　八ｓｐ　Ａｓｐ　Ｈｌｓ　Ｈｌｓ　 Ｇｌｙ　Ｓｉｒ　Ｔｈｒ　Ｃ１ｙ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ４２０　４２５　４ コ０ Ｖａｌ　入１−９　ＣＹＳ　Ｔｈｒ　入１ａＧ工ｕ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　 Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　工ｌａ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ｍｅｔ４コ５　４４０　４ ４５ １１＠　Ｃｙｓ　ＬＹｓ　Ａｓｐ　Ｚｌ＠　ＬＹ１４　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ 　Ａｓｎ　ｃｌｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｔｈｒ　ｌ１■ ｔａｕ　入１ａ　入ｓｎ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　入ｓｎ　工１ｃ　工ｌａ　 Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　工１ａ　Ｈｌｓ　Ｓｅｒ　入ｒ９　＾ｓｐ４ｇ５　、　４７０ 　４７５　４１１０人ｒｇ　５ａｒ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ 　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｐｈａ　入１ａ　Ｌｙｅ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ ４”５　４９０　４９５ Ｘｉｓ　入１ａ　Ｖａｌ　入ｒｇ　ｃｙｓ　Ｌａｕ　入１ａ　Ｌｙｓ　Ａｇｎ　 Ｌａｕ　しｒｐ　Ｇｌ’／　入１ａ　Ｃ１ｕ　Ａｓｎ　Ａｒ■ Ｇｌｕ　Ｌａｕ　Ｌ、ｙｓ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　入１ａ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ 　入ｒ９５ＩＬＴ　Ｇｌｕ　Ｌｃｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　入１■ 人１ａ　入１ａ　Ｖａｌ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ｌａｕ　Ｌ＠ｕ　Ｖａｌ　工１峨　 Ｖａｌ　工１ａ　Ｉｌａ　Ｓｉｒ　ｔａｕ　工１ｍ　Ｖａ１５コｏ　５コ５　５ ４゜ Ｌ４ｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　工１＠　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　 Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　工１ａ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　ＡｒｑＰｒｏ　Ｍ＠ｔ　Ｇ ｉｎ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　５＠ｒ　Ａｒｑ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｐ ｈｅ　Ｐｒｏ　入ｉ　入ｓｐ　ＧｌｙＬＪｕ　Ｖａｌ　Ｌ４ｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ 　Ｖａｌ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ｓａｒ　ＧＡＹ　入１ａ　Ｐｈａ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ 　Ｖａｌ　Ｖａ１Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　入１ａ　 Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｓａｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　工１ａ　↑Ｙτ　工１ｅＩ ｌ・　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｐｈａ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　ＡＪＩＰ　 Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｌａｕ　Ｈｌｓ　Ｌｙ■ 人１ｎ　入ｒｑ　入ｓｐ　Ｓｉｒ　Ｐｈａ　ＩＡｕ　Ｓｉｒ　Ｈｌｓ　Ｈｌｓ　 Ｐｒｏ　ＧＬｕ　Ｌｙ露　Ｐｒ口　Ｌｙｇ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ６９０　６９５　フ ＯＯ しｓｕ　Ａｓｐ　工１＠　Ｐｈａ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　Ａｓｈ　Ｐｒｏ　入１＆　 入ａｐ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　入ｒｇ　Ｓｅｔ：　Ｔｙ■ フ０５　７１０　７１５　７２０ Ｖａｌ　工１ａ　Ｌａｕ　Ｓａｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　 入ｓｐ　Ｔｙｒ　Ｍ＠ｔ　Ａｓｐ　Ｍａｔ　Ｌｙｓ　Ｇ１ｎ７２５　７コ０　７ コ５ 人１ａ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｍｅｔ　 Ｌａｕ　Ｇｌｕ　入ｒ：ｑ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　５ａ■ ７４０　７４５　フ５０ Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　工ｍｅ　Ｇｉｎ　入ｒｇ　Ｓａｒ　Ｌａｕ　 Ｔｙｒ　Ａｍｐ　Ａｒｑ　ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｓａｔ　↑ｙｒ７５５　フロ０　７ ６５ Ｌｙｅ　Ｌｙｓ　Ｌｙｍ　Ｓａｒ　Ｍａｔ　Ｌａｕ　Ａｍｐ　Ｓｉｒ　Ｇｌｕ　 Ｖａｌ　Ｌｙｓ　入ｇｎ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｓｅｒ　入ｓｐ７フ０　７７５　フ ８０ ＾ｓｐ　Ａｓｎ　５＠ｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｌａｕ　 入ｓｐ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｓａｒ　Ｐｈｅ　丁ｈｒ　Ｔｙｒ１８５　７９０　７ ９５　ｇｏ。

Ｇｉｎ　Ｖａｌ　入１ａ　入ｒｇ　Ｇｌｙ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｐｈａ　Ｌａｕ　 Ａｌａ　Ｓａｒ　ＬＹＩＩ　入ｓｒ＋　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｈ奄■ ８０５　ａｇｏ　！１１５ ＾ｒ９　Ａｍｐ　Ｌａｕ　Ａｌａ　入１ａ　Ａｒｑ　入ｓｎ　Ｖａｌ　ＸＪｕ　 Ｌａｕ　入１ａ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｌｙｇ　：ｌａ　Ｖａ１１１２０　８２５　 ＩＩココ Ｌｙｓ　Ｉｌａ　Ｃｙｓ　Ｍｐ　Ｐｈａ　Ｇｌｙ　Ｌ４ｕ　入ｌａ　人ｒｑ　人 ｓｐ　工ｍｅ　Ｍｅｔ　ＨＬｓ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ８コ５　１１４０　８ ４５ ）τＶａｌ　５ｅｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｓａｒ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｌａｕ　Ｐｒ ｏ　Ｖａｌ　Ｌｙｇ　Ｔｒｐ　Ｍａｔλｌａ　Ｐｒ。

Ｇｌｕ　Ｓａｒ　Ｘｌｅ　Ｐｈｅ　入ｓｐ　Ａｇｎ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　 Ｔｈｒ　Ｌａｕ　５ｅｒ　入ｓｐ　Ｖａｌ　Ｔｒｐ　５ｅｒＴｙｒ　Ｇｌｙ　Ｉ ｌａ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｌａｕ　に ｌｙ　Ｇｌｙτｈｒ　ｐｒ口ＴｙｒＰｒｏ　Ｇｌｙ　Ｍｅｔ　Ｍｅｔ　Ｖａｌ　 ｋｓｐ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｐｈａ　”Ｐｙｒｏ　入ａｎ　ＬＹ＊　Ｘ１＊　Ｌｙ ｓ　Ｓ億ｒ　Ｇ撃■ ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｍｅｔ　入１ａ　Ｌｙｇ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｈｉｓ　入１ａ　 Ｔｈｒ　５ｅｒ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｚｌ＠Ｍｅｔ　Ｖａｌ　Ｌ ｙｓ　Ｃｙｓ　Ｔｒｐ　Ａｓｎ　５＠ｒ　Ｃ１ｕ　Ｐｒｏ　ＧＬｕ　Ｌｙｓ　＾ ｑ　Ｐｒｏ　５ａｒ　Ｐｈｅ　？ｙｒ９コ０　９１５　９４０ Ｓｉｒ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　工１ｅ　Ｈｉｓ　Ｌａｕ　Ａｍｐ　Ｐｈａ　 Ｌａｕ　Ｌｙｓ　Ｓａｒ　入ｇｐ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　λ工ａ９６５　９７０　９ フ５ （２）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　５についての情報：（ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：　６３７５塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖：二本鎖 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｉｉ　）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡ（ｉｉ）仮説：なし く１ｖ）アンチ−センス：なし くｖｉ）起源： （Ａ）生物二人類 （Ｂ）株ニラムダｇｔｌ。

（ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：　ＣＤ５ ＣＢ）位置：　１２９．．３３９５ （Ｄ）他の情報：／注−「この配列のヌクレオチド番号１は先の長さ４０００の 配列のヌクレオチド番号１と同じである」（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ　１０　 ＮＯ：　５　：丁入ＡＡσｒＴｃｃ’ｒ　ｃｃｃ入ｃｃｃ丁ＧＣＡＣＣ入入五人 ？（ＪＣ：　（、ＣＣＣＣＡＴＴＴｋ　ＣＡＴｃ入ＴＣＡＣ入　Ｇ入Ｇτ入■■ bＣτ　２１６゜ ＴＣ丁入Ｔに（：ＡＧＡ　ｍＧＧＴｃＪＪｋｃ　τ入τＴτＣＣＡ？Ａ　ＡＧＡ ＡＴ入ＧＧＧＡ　Ｔ入ＧＣＴｒＣＣＴＣ；　入ＧＣＣＡＣＣ`ＣＣ２２２０ τ入丁Ａ丁丁八ＣＣＣ入へτＣＧ五人入入τ　＾τ入五人Ｃ入丁Ｃ＾　ｃｃｃｃ 入Ｈ入入入五人　Ａｃｒａα入τｒｒａｃλＧ入入Ｇ丁五人噤@４５００ ｒＴｃτＴＣＴＴＣｅＣＴＯ人ＴＯ入五人ＧＣＴＴＴＣＧＣα入ＣＣＣＣ入五人 入ＴｋＴＧ　ＴｋτＴ丁Ｔ−丁Ｃ入　４５６０７丁入入入Ｔ五人ＣＣＴτ入＾Ｇ 　６コ７５（２）ＳＥＱ　１０　ＮＯ：　６についての情報：（ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：４１塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）Ｍニ一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 ＜ｉｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （ｉｉ）仮説：なし く　ｉｖ　）アンチ−センス：なし くｖｉ）起源： （Ａ）生物二人類 （ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　６　：（ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：４１塩基対 （Ｂ）タイプ二核酸 （Ｃ）鎖ニ一本鎖 （Ｄ）トポロジー−線状 （ｉｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （ｉｔｉ）仮説：なし くｔｖ）アンチ−センス：なし くｖｉ）起源： （Ａ）生物：人類 （ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ　１０　Ｎｏ：　７　：（２）ＳＥＱ　１０　ＮＯ ：　８についての情報：（ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ＝４１塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖ニ一本饋 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （ｉｉ）仮説：なし くｉｖ）アンチ−センス：なし くｖｉ）起源： （Ａ）生物二人類 （ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　８　：ＡＴＣＡＣＣＧＴＧＧ　Ｔ ＴＧＡＧＡＧＣＧＧ　ＣＴＡＧＣＴＴＣＣＴ　ＧＴＡＧＧＧＧＧＣＴ　Ｇ　４１ （２）ＳＥＱ　１０　Ｎｏ：　９についての情報：（ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：４１塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ＩＩニ一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （ｊｉ）仮説：なし くｉｖ）アンチ−センス：なし くｖｉ）起源： （Ａ）生物二人類 （ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ　ｒｏ　Ｎｏ：　９　：ＴＡＣＡＧＡＣＴＣＣＡＧ ＧＴＧＴＣＡＴＣＣＴＡＧＣＴＴＣＣＴ　ＧＴＡＧＧＧＧＧＣＴ　Ｇ　４１（２ ）ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１０についての情報：（ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：４４塩基対 （ｉｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）仮説：なし くｔｖ）アンチ−センス：なし くｖｉ）起源： （Ａ）生物：人類 （ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０：ＣＴＣＴＡＣＡＴＣＴ　Ｔτ ＧＴＧＣＣＡＧＡ　ＴＣＣＣＴＡＧＣＴＴ　ＣＣＴＧＴＡＧＧＧＧ　ＧＣＴＧ　 ４４（２）　ＳＥＱ　Ｉｎ　Ｎｏ　：　１１についての情報：（１）配列の特徴 （Ａ）長さ＝４５塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）［ニ一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （ｔｔｉ）仮説：なし く　ｉｖ　）アンチ−センス：なし くｖｉ）起源： （Ａ）生物：人類 （ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ　ｒｏ　ＮＯ：１１：ＣＡＧＡＴＣＴＣＴＣＡＧＧ ＧＣＣＴＧＧＴ　ＣＡＣＣＧＴＧＧＧＣＴＴＣＣＴＣＣＣＴＡ　ＡＴＣＡＴ　４ ５（２）　ＳＨＱ　ＩＤ　Ｎｏ　：　１２についての情報：（ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ＝４８塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖ニ一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （ｔｊ）仮説：なし く　ｉｖ　）アンチ−センス：なし くｖｉ）起源： （Ａ）生物二人類 （ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１２：ＣＡＧＡＴＣＴＣＴＣＡＧＧ ＧＣＣＴＧＧＴ　ＣＡＴＣＡＡＣＧＴＣＴＣＴＧＴＧＡＡＣＧ　ＣＡＧＴＧＣＡ Ｇ　４８（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３についての情報：（ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：４５塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖ニ一本鎖 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｉｉ　）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）仮説：なし くｉｖ）アンチ−センス：なし くｖｉ）起源： （Ａ）生物二人類 （ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１３：ＣＡＧＡＴＣＴＣＴＣＡＧＧ ＧＣＣＴＧＧＴ　ＣＡＴＣＧＴＧＣＧＧ　ＣＴＣＣＴＧＧＧＡＧ　ＡＧＣＴＧ　 ４５（２）　ＳＥＱ　１０　Ｎｏ　：　１４についての情報：（ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ＝４２塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ＩＩニ一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （ｉｊ）仮説：なし く１ｖ）アンチ−センス：なし くｖｉ）起源： （Ａ）生物：人類 （ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４：ＣＡＧＡＴＣＴＣＴＣＡＧＧ ＧＣＣＴＧＧＴ　ＣＧＴＣＣＧＡＧＴＧ　ＣＴＧＧＡＧＣＴＡＡ　ＧＴ　４２（ ２”）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　：　１５についての情報：（ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：４１塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ＩＩニ一本饋 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ〜ｍＲＮＡ（ｊｉ）仮説：あり （ｉｖ）アンチ−センス：なし くｖｉ）起源： （Ａ）生物：人類 （Ｂ）株ニラムダｇｔｌ。

（ｘｉ）配列の詳１１１：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５：ＧＣＴＣＣＣＡＣＣＣＴ ＧＣＧＴＴＣＴＧＡ　ＡＴＡＡＣＴＧＧＣＧ　ＧＡＴＴＣＧＡＧＧＧ　Ｇ　４１ （２）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　：　１６についての情報：（ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：４１塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖ニ一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ〜ｍ［１ＮＡ（ｉｉｉ）仮説：あり （ｉｖ）アンチ−センス：なし くｖｉ）起源： （Ａ）生物：人類 （ｘｉ）配列の詳１１：ｓＥＱ　ｒｏ　ＮＯ：１６：ＧＡＡＣＴＧＴＴＡＡ　Ｃ ＴＣＡＡＧＴＴＣＣＴＴＡＡＣＴＧＧＣＧ　ＧＡＴＴＣＧＡＧＧＧ　Ｇ（２）　 ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　：　１７についての情報；（ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：４１塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 ＣＣ）＊ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｉｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ　〜ｍＲＮＡ（溢）仮説：あり （ｉｖ）アンチ−センス：なし くｖｉ）起源： （Ａ）生物二人類 （Ｂ）株ニラムダｇｔｌＯ （ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１７：ＡＴＴＴＣＴＧＴＣＣＡＴＧ ＡＧＡＡＡＧＧ　ＴＴＡＡＣＴＧＧＣＧ　ＧＡＴＴＣＧＡＧＧＧ　Ｇ（２）ＳＥ Ｑ　Ｉｎ　ＮＯ：１Ｂについての情報：（ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：４１塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー−線状 （ｉｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ〜ｍＲＮ＾（ｉｉ）仮説：あり （ｔｖ）アンチ−センス：なし くｖｉ）起源： （Ａ）生物：人類 （Ｂ）株ニラムダｇｔｌ。

４１　（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１８：ＴＡＴＧＣＴＴＴＡＡ 　ＡＡＧＣＡＡＣＡＴＣＡＴＡＡＣＴＧＧＣＧ　ＧＡＴＴＣＧＡＧＧＧ　Ｇ　４ （２）　ＳＥＱ　１０　Ｎｏ　：　１９についての情報：（ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：４４塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｉｉ　）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ〜−ＲＩＩＩＡ（ｉｆ）仮説：あり （ｉｖ）アンチ−センス：なし くｖｉ）起源： （Ａ）生物：人類 （Ｂ）株ニラムダｇｔｌ。

４１　（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１９：（ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ＝４５塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）頷ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー＝ｗＡ状 （１１）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ〜ｗＲＮＡ（ｉｉｉ）仮説：あり （ｉｖ　）アンチ−センス：なし くｖｉ）起源； （Ａ）生物二人類 （Ｂ）株ニラムダｇｔｌＯ （ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０：ＡＧＣＣＴＡＡＴＣＣＴＣＴ ＧＣＣＡＧＣＴ　ＴＧＡＴＧＴＡＧＣＣＴＴＴＧＴＡＣＣＴＣ丁ＡＧＧＡ　４５ （２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　２１についての情報：（ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ；４８塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 ＣＣ）鎖ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ〜−ＲＮＡ（ｉｎ）仮説：あり （ｉｖ）アンチ−センス：なし くｖｉ）起−ａ： （Ａ）生物：人類 （Ｂ）株ニラムダｇｔｌ。

（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ　１０　ＮＯ：２１：ＡＧＣ（：ＴＡＡＴＣＣＴＣ ＴＧＣＣＡＧＣＴ　ＴＧＡＧＣＴＧＧＡＴ　ＣＴＡＧＡＡＡＴＧＧ　ＡＡＧＣＴ ＣＴＴ　４８（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　：　２２についての情報：（ｉ）配 列の特徴 （Ａ）長さ：４５塩基対 （Ｂ）タイプ；核酸 （Ｃ）［ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮ＾〜ｓ＋ＲＮＡ（ｉｊ）仮説：あり （１ｖ）アンチ−センス：なし くｖｉ）起源： （Ａ）生物：人類 （Ｂ）株ニラムダｇｔｌＯ （ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ　１０　ＮＯ：２２：ＡＧＣＣＴＡＡＴＣＣＴＣＴ ＧＣＣＡＧＣＴ　ＴＴＴＣＡＴＴＧＡＡ　ＡＴＣＡＡＡＣＣＣＡ　ＣＣＴＴＣ４ ５（２）　ＳＥＱ　１０　Ｎｏ　：　２３についての情報：ＣＢ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｉｉ）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ〜−１２ＮＡ（ｉｉｉ）仮説：あり （ｉｖ）アンチ−センス：なし くｖｉ）起源： （Ａ）生物−人類 （Ｂ）株ニラムダ＠ｔ１０ （ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ　１０　ＮＯ：２３：ＡＧＣＣＴＡＡＴＣＣＴＣＴ ＧＣＣＡＧＣＴ　ＴＴＣＡＴＣＣＡＴＴ　ＣＴＧＧＡＣＴＴＧＧ　ＴＣ４２Ｉｎ ｔｅｒｎａｔ１ｍｓｌ＾ｐｐＨｃａｔｌｏｎ）Ｉｏ、ＰＣＴＡ１１１２１＜１’ ６７３（１フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｎ　５／１０ １５／１２　Ｚ　Ｎ　Ａ Ｃ１２Ｐ　２１１０８　８２１４−４８ＧＯＩＮ　３３１５３　Ｄ　８３１０− ２ＪＹ　８３１０−２Ｊ ／／（Ｃｌ３Ｆ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：９１） ８４１２−４Ｂ （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ５，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、ＬＵ、Ｍ Ｇ、ＭＮ、　ＭＷ、ＮＬ、Ｎｏ、ＰＬ、ＲＯ、ＲＵ、ＳＤ、５Ｅ （７１）出願人　ウィリアムス、ルウイス　ティー。

アメリカ合衆国、カリフォルニア　９４９２０゜ティブロン、アベニダ　ミラフ ロアーズＩ Ｃ１２Ｎ　５１００　Ｂ （７２）発明者　エスコベド、ジエイム　ニー。

アメリカ合衆国、カリフォルニア　９４１１７゜サンフランシスコ、アッパー　 テラス ＃３　４５５ （７２）発明者　ウィリアムス、ルウイス　ティー。

アメリカ合衆国、カリフォルニア　９４９２０゜ティブロン、アベニダ　ミラフ ロアーズ（７２）発明者　ウォルフ、デビット アメリカ合衆国、カリフォルニア　９４３０３゜パロ　アルド、ベルビュー　ド ライブ フロントページの続き （７２）発明者　トムリンソン、ジェームズ　イー。

アメリカ合衆国、カリフォルニア　９４１２２゜サンフランシスコ、トウウエル ブス　アベニュ　１４８９ （７２）発明者　フレット、ラリ−ジエイ。

アメリカ合衆国、カリフォルニア　９４００２゜ベルモント、ニスコンデイド　 ウェイ （７２）発明者　ギース、ネイル　ニー。

アメリカ合衆国、カリフォルニア　９４１１０゜サンフランシスコ、ゾロアズ　 レーン

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. １．血小板由来成長因子リガンドに結合する、細胞外ドメインＤ１，Ｄ２又はＤ ３に由来する１又は複数の血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）のリガンド結合性領 域（ＬＢＲ）を含んで成る、約８〜４００個のアミノ酸の血小板由来成長因子レ セプター（ｐＰＤＧＦ−Ｒ）フラグメント。
2. ２．前記フラグメントが約５ｎＭの親和力を示す、請求項１に記載のＰＤＧＦ− Ｒフラグメント。
3. ３．前記フラグメントが、ドメインＤ３システイン内領域に由来する少なくとも 約１５個の隣接アミノ酸を含んで成る、請求項１に記載のＰＤＧＦ−Ｒフラグメ ント。
4. ４．前記フラグメントがトランスメンブラン領域を欠く、請求項１に記載のＰＤ ＧＦ−Ｒフラグメント。
5. ５．前記フラグメントが可溶性である、請求項１に記載のフラグメント。
6. ６．前記ＬＢＲの少なくとも１つがドメインＤ３ＬＢＲである、請求項に記載の ＰＤＧＦ−Ｒフラグメント。
7. ７．前記ＬＢＲの少なくとも１つがＢ型又はＡ型ＰＯＧＦ−ＲＬＢＲである、請 求項１に記載のＰＤＧＦ−Ｒフラグメント。
8. ８．前記フラグメントが表１又は表２における隣接配列である、請求項１に記載 のＰＤＧＦ−Ｒフラグメント。
9. ９．前記フラグメントが以下の式の群：ａ）Ｘａ−Ｄｍ−Ｘｃ； ｂ）Ｘａ−Ｄｍ−Ｘ１−Ｄｎ−Ｘｃ； ｃ）Ｘａ−Ｄｍ−Ｘ１−Ｄｎ−Ｘ２−Ｄｐ−Ｘｃ；及びｄ）Ｘａ−Ｄｍ−Ｘ１− Ｄｎ−Ｘ２−Ｄｐ−Ｘ３−Ｄｑ−Ｘｃ；（ここで、 Ｘａ，Ｘ１，Ｘ２，Ｘ３及びＸｃのそれぞれは、存在しているならば、Ｄドメイ ンを欠くポリペプチドセグメントであり；そしてＤｍ，Ｄｎ，Ｄｐ及びＤｑのそ れぞれは、互いに独立して、Ｄ１，Ｄ２，Ｄ３，Ｄ４及びＤ５より成る群から選 ばれる）から選ばれる、請求項１に記載のＰＤＧＦ−Ｒフラグメント。
10. １０．前記フラグメントが以下より成る群：ａ）Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３；及び ｂ）Ｄ１−０２−Ｄ３−Ｄ４ から選ばれる、請求項１に記載のＰＤＧＦ−Ｒフラグメント。
11. １１．血小板由来成長因子リガンドに特異的に結合する、ドメインＤ３に由来す る少なくとも１つの血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）のリガンド結合性領域（Ｌ ＢＲ）を含んで成る、約４００個以下のアミノ酸の可溶性ヒト血小板由来成長因 子レセプター（ｈＰＤＧＦ−Ｒ）。
12. １２．前記フラグメントがドメインＤ３のシステイン内部分に由来する少なくと も約１５個の隣接アミノ酸の配列を含んで成る、請求項１１に記載のｈＰＤＧＦ −Ｒフラグメント。
13. １３．前記フラグメントが実質的に純粋である、請求項１１に記載のｈＰＤＧＦ −Ｒフラグメント。
14. １４．前記ＬＢＲがＢ型又はＡ型ｐＤＧＦ−Ｒに由来し、そして更に表１又は表 ２における配列である、請求項１１に記載のｈＰＤＧＦ−Ｒフラグメント。
15. １５．請求項１に記載のＰＤＧＦ−Ｒフラグメントをコードする核酸配列。
16. １６．請求項１１に記載のｈＰＤＧＦ−Ｒフラグメントをコードする核酸配列。
17. １７．前記のコード配列がプロモーターに作動連結している、請求項１５に記載 の核酸。
18. １８．請求項１に記載のＰＤＧＦ−Ｒフラグメントを含んで成る細胞。
19. １９．請求項１１に記載のｈＰＤＧＦ−Ｒフラグメントを含んで成る細胞。
20. ２０．請求項１５に記載の核酸を含んで成る哺乳動物細胞。
21. ２１．請求項１６に記載の核酸を含んで成る哺乳動物細胞。
22. ２２．請求項１５に記載の核酸と、前記核酸のタンパク質発現生成物の両方を含 んで成る細胞。
23. ２３．天然のＰＤＧＦ−Ｒ上には見い出せない、請求項１に記載のＰＤＧＦ−Ｒ フラグメントのエピトープを認議する抗体。
24. ２４．前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２３に記載の抗体。
25. ２５．生物学的サンプルのＰＤＧＦリガンド結合活性を測定するための方法であ って、以下の工程： ａ）第１分析において、前記サンプルのアリコートを請求項１に記載のＰＤＧＦ −Ｒフラグメントの存在下においてＰＤＧＦリガンドと接触させる； ｂ）第２分析において、前記サンプルのアリコートを前記ＰＤＧＦ−Ｒフラグメ ントの非存在下においてＰＤＧＦリガンドと接触させる；及びｃ）これら２通り の分析において前記ＰＤＧＦリガンド結合の程度を比較する； を含んで成る方法。
26. ２６．前記ＰＤＧＦ−Ｒフラグメントが細胞に結合している、請求項２５に記載 の方法。
27. ２７．前記ＰＤＧＦ−Ｒフラグメントが固相基板に結合している、請求項２６に 記載の方法。
28. ２８．前記固相基板がマイクロタイターディッシュである、請求項２７に記載の 方法。
29. ２９．生物学的サンプルのＰＤＧＦリガンド含有量を測定するための方法であっ て、以下の工程： ａ）第１分析において、前記サンプルのアリコートを請求項１に記載のＰＤＧＦ −Ｒフラグメントの存在下においてリガンド結合性領域（ＬＢＲ）と接触させる ； ｂ）第２分析において、前記サンプルのアリコートを前記ＰＤＧＦ−Ｒフラグメ ントの非存在下においてＬＢＲと接触させる；及びｃ）この２通りの分析におけ る結合の程度を比較する；ことを含んで成る方法。
30. ３０．前記の接触工程を同時に実施する、請求項２９に記載の方法。