JPH06504913A - グルカゴンアンタゴニストの検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 グルカゴンアンタゴニストの検出方法 ゛　の　Δ 本出願は、１９９１年１月１７日に出願された係属中の米国特許出願筒０７／６ ４１．３４３号の一部係属出願である。

及五立！ 本出願は一般的にグルカゴンアンタゴニストの検出法に関し、より詳細には組変 えＤＮＡを使用して多数の潜在的グルカゴンアンタゴニストを生産および検索す る方法に関する。

光ユ■宣量 ヒト１１尿病は、血中のグルコースレベルの上昇を主に示すものであるが、一般 的には低レベルのインスリンと上昇したグルカゴンレベルから生じるものと考え られる。しかし、非インスリン依存症の肥満および非肥満患者において、グルカ ゴンとインスリンレベルの両方の上昇の存在において高血糖症が見いだされた。

インスリンは血中グルコースレベルを急激に減少するものとして知られているが 、一方グルカゴンは２９アミノ酸長のペプチドホルモンであり、肝臓膜受容体に 結合して上昇した血中グルコースレベルに貢献し、これによって解糖の引き金を 引き、グルコースが生産される。グルカゴンレベルの上昇は実質的な糖新生の増 加も伴う。

インスリンレベルの安定な制御を達成することは困難であるため、インスリン依 存性糖尿病およびい（つかの非インスリン依存性糖尿病の治療は、制御された食 事と外因性インスリンの定期的投与の組合せによってなされた。グルカゴンアン タゴニストの治療的使用は、解糖を阻害し糖尿病の低血糖レベルを助けるであろ うと思われている。これらのアンタゴニストは、肝臓膜のグルカゴン受容体に結 合する能力を有するが、アデニル酸シクラーゼ活性を刺激することはできない、 グルカゴンのその細胞性受容体への結合はアデニル酸シクラーゼ活性の刺激を開 始し、サイクリックＡＭＰ　（ｃＡＭＰ）の生産を生じ、ならびに解糖増加とそ れに付随するグルコースの放出を生じる。

グルカゴンアンタゴニスト開発のための現在の方法は、面相合成法を使用する特 異的アミノ酸の削除および置換を通じた特異的グルカゴン類似体の開発、ならび にこれらの固相合成法そして付随するカラムクロマト法を通じたこれらグルカゴ ン類似体の高レベル精製による。たとえば、Ｕｎｓｏｎら、（ｈ旦１ｄｅｓ　１ ０：１１７１−１１７８．１９８９）。

ＡｎｄｒｅｕおよびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１ ６４：５８５−５９０．１９８７）、Ｇｙｓｉｎら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　 ２５：８２７Ｂ−８２８４，１９８６）　、Ｍｅｒｒｉｆｔａｌ（米国特許第４ ．８７９，２７３）、およびＨｒｕｂｙ　（米国特許第４．４３０，３２６号） 、シかし、これらの方法は大量のグルカゴンアンタゴニストの検索の処理量には 適合しない。

当技術において、高純度、グルカゴン類似体の固相合成法に依存したものではな い、グルカゴンアンタゴニストの検出法への要求が存在する０本発明は、組換え ＤＮＡ法の使用を通じて、高処理量アンタゴニスト検索アッセイを通じての検索 のために多数のグルカゴン類似体の生産を可能にするものである。

光里■皿丞 端的に言うと、本発明はグルカゴンアンタゴニストの存在の検出法を提供する。

ひとつの観点において、この方法は、（ａ）グルカゴン類似体の発現が安定な増 殖条件下で、次の要素、転写プロモーター、分泌シグナル配列、グルカゴン類似 体をコードするＤＮＡ配列および転写ターミネータ−が作用可能に連結された構 造物を含んで成るグルカゴン類似体の発現を支配できるＤＮＡ構造物を含有する 宿主細胞を増殖させ：　（ｂ）宿主細胞からこのＤＮＡ配列によりコードされる グルカゴン類似体を単離し：　（Ｃ）単離したグルカゴン類似体を、天然グルカ ゴンの存在下で、反応経路に共役したグルカゴン受容体に、グルカゴン類似体の 受容体への結合および該経路を通じた付随応答可能となるのに十分な時間暴露し ＝　（ｄ）グルカゴン類似体のグルカゴン受容体への結合から生じる応答経路の 刺激の減少を、天然グルカゴンのみの存在による応答経路の刺激と比較して検出 し、そしてそれからグルカゴンアンタゴニストの存在を決定する、 ことを含んで成る。

関連する観点から、本方法は、 （ａ）グルカゴン類似体の発現が安定な増殖条件下で、次の要素、転写プロモー ター、分泌シグナル配列、グルカゴン類似体をコードするＤＮＡ配列および転写 ターミネータ−が作用可能に連結された構造物を含んで成るグルカゴン類似体の 発現を支配できるＤＮＡ構造物をそれぞれが含有するプールされた宿主細胞を増 殖させ：　（ｂ）宿主細胞からこのＤＮＡ配列によりコードされるグルカゴン類 似体を単離し＝　（Ｃ）単離したグルカゴン類似体を、天然グルカゴンの存在下 で、反応経路に共役したグルカゴン受容体に、グルカゴン類似体の受容体への結 合および該経路を通じた付随応答を可能にするのに十分な時間暴露し＝　（ｄ） グルカゴン類似体の受容体への結合から生じる応答経路の刺激の減少を、天然グ ルカゴンのみの存在による応答経路の刺激と比較して検出し、そしてそれからグ ルカゴンアンタゴニストの存在を決定する、 ことを含んで成る。

本発明のもうひとつの観点において、グルカゴンアンタゴニストは次の要素：転 写プロモーター、分泌シグナル配列、グルカゴンアンタゴニストをコードするＤ ＮＡ配列（ここで、配列は天然グルカゴンの対応するアミノ酸残基とは異なるア ミノ酸残基をコードする）および転写ターミネータ−が作用可能に連結された構 造物を含んで成るグルカゴンアンタゴニストの発現を支配できるＤＮ＾構造物を それぞれが含有宿主細胞から生産される。

これらのおよび他の観点は以下の詳細な説明と添付図面を参照するとき、明らか なものとなろう。

凹皿■里皇星籠皿 図１はサツカロミセス・セレビシェ−（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＴＰＩＩプ ロモーターおよびアルファ因子プレプロ配列のサブクローニングを説明する。

図２は代表的発現ベクター、ｐＢ５１１４を開示する。使用した省略記号は、Ｔ ＰＩ−Ｐ　、　ＴＰＩＩプロモーター；α、アルファ因子シグナル配列；ＴＰＩ −ｔ　、　ＴＰＩＩターミネータ−；およびｉｒｌ、　２ミクロンプラスミドの 逆反復１゜ 図３は配列番号１および２に対応する天然グルカゴンのコード配列を開示し、こ れはグルカゴンおよびｄｅｓ−旧ｓｌ−グルカゴンオリゴヌクレオチドライブラ リーの合成のための基本配列のために使用された。線の上の数はヌクレオチド配 列を意味する。

図４は代表的グルカゴン類似体存在下での、対照ｄｅｓ−旧ｓｌ−グルカゴンお よびｄｅｓ−Ｈｉｓ’　−（Ｇｌｕ’）グルカゴンと比較した、ラット肝臓膜の ３種のグルカゴン濃度に対するｃＡＭＰ応答曲線を開示する。

ｍヰ１【Ｔ藍肌 発明を説明する前に、今後、本明細書で使用する用語の定義を説明することは発 明の理解に役立つものと思われる。

翌似迷：天然リガンド以外の分子であり、レセプターのりガント−結合ドメイン により結合されることができる。この分子は化学的に合成でき、組換えＤＮＡ技 術を通じて生産するか、または天然に存在するものでもよい。

本明細書で使用するように、グルカゴン類似体は、天然に存在するグルカゴンの 対応するアミノ酸残基とは異なるひとつまたはそれより多くのアミノ酸残基を含 有するグルカゴン−樺ポリペプチドであり、グルカゴン−受容体に結合できる。

これらの差異は関連の天然グルカゴンのアミノ酸の削除、付加、および／または 置換であってよい。

ａ：応答経路は外因性の刺激に応答し活性化される生化学的経路であり、一般的 には常に膜−結合レセプターが共役するわけではない、応答経路は一般的に、反 応細胞系からの細胞外マトリックス分泌、ホルモン分泌、走化性、分化、または 応答細胞の細胞分裂阻害がある。そのような応答経路のひとつは、アデニル酸シ クラーゼ経路であり、これは膜−結合グルカゴン受容体が共役する。アデニル酸 シクラーゼ経路はグルカゴンのその細胞受容体への結合に際して誘導され、それ によってサイクリックＡＭＰ　（ｃＡＭＰ）の細胞内濃度の上昇を生じる。

ヱヱｍ三ス上：受容体に結合できる分子であり、しかし細胞中の応答経路の刺激 減少を刺激または表さない、グルカゴンアンタゴニストは一般的にグルカゴン受 容体に結合できる能力、および細胞性応答経路は刺激できないことによって同定 される。一般的に推定されるグルカゴンアンタゴニストは天然のグルカゴンと混 合され、ｃＡＭＰの生産はアデニル酸シクラーゼアッセイによってアッセイされ る。グルカゴンアンタゴニストは天然のグルカゴン単独よりもｃＡＭＰ生産の刺 激を減少する分子として同定される。

−ｖは構」１詠’　ＤＮＡ分子、またはそのような分子のクローンは単一または 二重鎖のいずれかであるが、ヒトの介在を通じてＤＮＡのセグメントが全体とし て天然には存在しないように組み合わされ、並置されているものを含む。

ＤＮＡ構造物は発現を支配するために必要な情報を含有し、そして好ましくは目 的ポリペプチドをコードする分泌ＤＮＡ配列である。そのようなりＮＡ構造物は 、発現ベクターとして知られており、一般的にプロモーター、エンハンサ−およ び転写ターミネータ−を含有するであろう、ポリペプチドの分泌を支配するＤＮ Ａ構造物は少なくともひとつの分泌シグナル配列も含有するであろう。

分又之久±土聚■：分泌ペプチドコードするＤＮ＾配列配列０ペ泌ペプチド細胞 から成熟ポリペプチドまたはタンパク質の分泌を支配するアミノ酸配列である０ 分泌ペプチドは疎水性アミノ酸の核が特徴であり、ならびに典型的には（しかし 、排他的ではない）新たに合成されたタンパク質のアミノ末端が見いだされる。

きわめて頻繁に分泌ペプチドは成熟タンパク質から分泌時に切断される。そのよ うな分泌ペプチドはプロセッシング部位を持ち、これは分泌経路を通過する時に 成熟タンパク質から切断できる。プロセッシング部位をたとえばインビトロ突然 変異誘発法などによりシグナルペプチド内にコードするか、またはシグナルペプ チドに付加することができる。特定の分泌ペプチドをポリペプチドおよびタンパ ク質の分泌を支配するのに調和させて使用することができる。そのような他の分 泌ペプチドと使用できる分泌ペプチドのひとつは、酵母バリアータンパク質（Ｂ ａｒｒｉｅｒ−Ｐｒｏｔｅｉｎ）の第三ドメインである。

上述したように、本発明の目的は組換え法および宿主細胞を使用したグルカゴン アンタゴニストの改良された検出法を提供するものである。本発明は形質転換ま たはトランスフェクトした細胞からグルカゴン類似体を生産する能力を提供する 。類似体は天然のグルカゴンの存在下で応答経路に共役したグルカゴン受容体に 暴露される。

天然のグルカゴンのみが存在する刺激と比較した時、応答経路の刺激の減少はグ ルカゴンアンタゴニストの存在の指標である。本発明の中で、応答経路の刺激の 減少は以下に詳細に記載するｄｅｓ−Ｈｉｓ’−グルカゴンに関連する減少と同 等か、またはそれより大きい。本発明により生産されるグルカゴン類似体は高処 理量アンタゴニスト検索で、検索することができる０組換えＤＮＡ法を使用して 本発明は、グルカゴンアンタゴニストを同定するためにそのような高処理量検索 中のグルカゴン類似体のプールを検索する方法も提供する。本発明は組換え宿主 細胞を使用してグルカゴンアンタゴニストの生産方法も提供する。

本発明は、そのようなグルカゴン類似体をコードするＤＮＡ配列のプールを使用 して多数のグルカゴン類似体の生産方法も提供する。

グルカゴンをコードする配列は標準法を使用して合成的に生産することができ、 またはたとえば、Ｍａｎｉａｔｉｓら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｆｎ　； ＡＬａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ 、　ニューヨーク、１９８２　、これは参照により本明細書に編入される）、ま たは５ａｏｒｂｒｏｏｋらＭｏ１ｅｃｕ−１ａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　上Ａ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｔ工第二版、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ 。

ニューヨーク、１９８９　；これは参照により本明細書に編入される）、に記載 されるように、膵臓細胞からクローン化することもできる。

グルカゴンｃＤＮＡは、例えばＬｕｎｄら（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ ｃｉ、ＵＳＡ　７９　；３４５−３４９．１９８２）　、Ｂｅ１ｌら（Ｎａｔｕ ｒｅ、　３０２　ニア１６−７１８．１９８３）、Ｌｏｐｅｚ　ら（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８０；５４８５−５４８９．１９８３） 　、Ｂｅ１ｌら（Ｎａｔｕｒｅ。

３０４　：３６Ｂ−３７１，１９８３）、およびＨｅ１ｎｒｉｃｈら（Ｊ、Ｂｉ ｏｌ、Ｃｈｅｍ−２５９：１４０８２−１４０８７、１９８４）に記載されたよ うに単離された。グルカゴン類似体をコードするＤＮＡ配列のプールは、グルカ ゴンをコードする飽和突然変異法により生成される（たとえば、Ｌｉｔｔｌｅら （Ｇｅｎｅ　８８　：１１３−１１５゜１９９０）またはｔＩｅｒｍｅｓら（Ｇ ｅｎｅ　８８　：１４３−１５１．１９８９）またはセグメント一対象突然経変 異（例えば、５ｈｏｒｔｌｅらに匹」虹り紅組」虹」鉦７７　：　５３７５−５ ３７９．１９８０）　、別法として、グルカゴンａ似体のプールはたとえば、Ｌ ｉａｏおよび一１ｓｅ　（Ｇｅｎｅ　８８　：１０７−１１．１９９０）に記載 された強制的ヌクレオシド誤組み込みにより生成できる。Ｎ単に言うと、Ｌｉａ ｏとＷｉｓｅはクローン化したＤＮＡ断片にランダム点突然変異の導入法を、逆 転写酵素または変異Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼのいずれかによるデオキシヌクレオ チド三リン酸を強制的に誤組み込みすることによって記載した。特異的プライマ ーおよび制限されたデオキシヌクレオシド三リン酸の混合では、これらのブルー フリーディング活性を欠くふたつの酵素が誤ったヌクレオチドをプライム配列に 導入して、一定配列中に不規則突然変異の広範なスペクトルを与える。好ましく は、グルカゴン類似体をコードするＤＮＡ配列のプールは不規則に突然変異した オリゴヌクレオチドの合成により生成され、それは例えば、Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏ ｎら（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８３　；７１０−７１ ４．１９８６）を使用する。好ましくは、グルカゴン類似体をコードするオリゴ ヌクレオチドは合成されて、ハイブリダイゼーションに際してグルカゴン類似体 をコードする配列が粘着末端により平滑になるようにアダプターを形成する０分 泌シグナル配列とグルカゴンコード配列との枠内融合を可能にする架橋領域をコ ードする配列を加えることは特に好ましくなるだろう＊　ｄｅｓ−Ｈｉｓ’−グ ルカゴン類似体（成熟グルカゴンの第一アミノ酸残基に対応するコドンを欠いて いる）をコードするＤＮＡ配列を合成することも特に好ましい、グルカゴン類似 体をコードするＤＮＡ配列は好ましくは、オリゴヌクレオチド合成機で、通常塩 基Ａ、Ｇ、Ｃ，およびＴに対応する純粋なフォスフォラアミダイドを他の塩基の それぞれを低レベルで含有する試薬ビンからの交互混入により合成される。試薬 ビンからの交互混入は１．０１％から１４％の間の各誤塩基を加えることにより 達成され、０．８％がら２％の間の交互混入が好ましく、そして１％が特に好ま しい、単−非一突然変異残基からのオリゴヌクレオチドの合成が特に好ましい、 各誤塩基での１％の交互混入は、分子あたり理論的に約２．５％の塩基変化を導 くだろう。

グルカゴン類似体をコードするオリゴヌクレオチドは、天然のまたはｄｅｓ−Ｈ ｉｓ’−グルカゴンのいずれかをコードする突然変異した、または非突然変異の オリゴヌクレオチドでアニールされる。グルカゴン類似体またはｄｅｓ−Ｈ１ｓ ’−グルカゴン類似体をコードするアニールしたオリゴヌクレオチドアダプター のプールは、適当な発現ベクター中に挿入され、これは次にトランスフェクシヨ ンまたは形質転換により真核生物宿主細胞に導入される０本発明を実施するため の発現ベクターは、クローン化ＤＮＡの転写および転写ターミネータ−を支配で きるプロモーターを含むだろう。

本発明のタンパク質を宿主細胞の分泌経路に向かわせるために、少なくともひと つの分泌シグナル配列が目的のＤＮＡ配列に操作可能に連結される。好ましい分 泌シグナルはグルカゴン分泌シグナル（プレープロ配列）、アルファ因子シグナ ル配列（プレープロ配列、ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、　Ｃｓ１ ｌ　３０　：９３３−９４３，１９８２：Ｋｕｒｊａｎら、米国特許第４．５４ ６，０８２号ＨＢｒａｋｅ、欧州特許第１１６．２０１）、ＰＦＩ０５シグナル 配列（Ｂｅｃｋら、国際特許出願第ＷＯ３６１００６３７）　、　ＢＡ■分泌シ グナル配列（ＭａｃＫｅｙら、米国特許第４．６１３，５７２；ＭａｃＫｅｙ　 、国際特許出１ｉＷＯ８？１００２６７０）　、５ＵＣ２シグナル配列（Ｃａｒ ｌｓｏｎら、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、３：　４３９−４４７．１９８３） 　、ａ　−１−アンチトリプシンシグナル配列（Ｋｕｒａｃｈｉら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７８：６８２６−６８３０）、α−２プ ラスミンインヒビタ−シグナル配列（Ｔｏｎｅら、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｃハ ｈ吐１０２　：１０３３−１０４２．１９８７）　、組織プラスミノーゲン活性 化シグナル配列（Ｐｅｎｎｉｃａら、Ｎａｔｕｒｅ　３０１：２１４−２２１． １９８３）、　Ｅ、Ｃｏ１１．　Ｐｈｏ　Ａシグナル配列（Ｙｕａｎら、Ｊ、　 Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６５：　１３５２８−１３５５２．１９９０）または総 説した任意の細菌シグナル配列、例えば０１ｉｖｅｒの（Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｍｉ ｃｒｏｂｉｏｌ、３９：　６１５−６４９．１９８５）　、別法として、分泌シ グナル配列は確立された法則にしたがって合成できる、例えばｖｏｎ　Ｈｅ１ｎ ｊｅら（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｓ　、　１３３：１７−２１，１９８３；　 Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　１８４＝９９−１０５．１９８５；Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄ ｓ、Ｒｅｓ、１４：４６８３−４６９０．１９８６）　。

分泌シグナル配列は単一または組み合わせて使用できる０例えば、第一分泌シグ ナル配列は単一、またはバリアー（Ｂａｒｒｉｅｒ）の第三ドメインをコードす る配列（係属中の共通に受託された米国特許出願第０７／２７０，９３３に記載 され、これはその全部を参照により本明細書に編入される）と組み合わせて使用 できる。バリアーの第三ドメインは、目的ＤＮＡ配列の正しい３′枠、またはＤ ＮＡの５′に位置し、ならびに分泌シグナル配列と目的ＤＮＡ配列の両方を正し い読み取り枠内に持つ。

本発明を実施するために使用される宿主細胞は、哺乳類、鳥類、植物、昆虫、細 菌および真菌細胞である。真菌細胞は、酵母〔例えば、サツカロミセス・セレビ シェ−（Ｓａｃｃｈａｒｏ肛ｃｅｓ　）ｓｐｐ、　、シゾサッカＯミセス（ＳＣ …赳ｎ匹ハ皿肚憇ｓ　）ｓｐｐ、　）　、または糸状菌〔例えば、アスペルギル ス（ル吐犯ＩＵユｕｓ　）Ｓｌ）ｐ、ニューロスポラ（旦肛匹匹ｒａ）ｓｐｐ、 　）を含むが、本発明の宿主細胞として使用できる。酵母、サツカロミセス・セ レビシェ−（鎖匹旦匹粒ａｓｓ　ｃｅｒｅ−ｖｉｓｉａｅ）株が特に好ましい。

本発明の使用に適当な酵母ベクターはＹＲｐ７　（Ｓｔｒｕｈｌら、Ｐｒｏｃ、 ＮａｔｌＡｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７６　：１０３５−１０３９．１９７８） 　、ＹＥｐ１３（Ｂｒｏａｃｈら、Ｇｅｎｅ　８：１２１−１３３．１９７９） 、　ＰＯＴベクター（Ｋａｗａｓａｋｉら、米国特許第４，９３１，３７３号、 これは参照により本明細書に編入される）、ｐＪＤＢ２４９およびｐＪＤＢ２１ ９（Ｂｅｇｇｓ、Ｎａｔｕｒｅ　２７５＝１０４−１０８．１９７８）およびそ れらの誘導体である。そのようなベクターは一般的に選択できるマーカーを含み 、それは多くの支配的表現型を表す遺伝子のひとつでよく、それによって形質転 換体が選択されるための表現型アッセイが存在する。好ましい選択マーカーは、 宿主細胞栄養要求性への補足、抗生物質の提供または細胞に特別な炭素源の利用 能力を付与することなどのようなものであり、ＬＥＵ２　（Ｂｒｏａｃｈら、皿 よ）　、ＵＲＡ３　（Ｂｏｔｓｔｅｉｎら、Ｇｅｎｅ　８：１７．１９７９）、 ＨＩＳ３　（Ｓｔｒｕｈｌら、皿よ）またはＰＯＴＩ　（Ｋａｗａｓａｋｉら、 皿上）がある、もうひとつの適当なマーカーはＣＡＴ遺伝子であり、これは酵母 細胞にクロラムフェニコール耐性を付与する。

酵母に使用する好ましいプロモーターは、酵母糖溶解遺伝子からのプロモーター （Ｈｉ　ｔｅ＋ｗａｎらＪ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ　２５５　：１２０７３−１２ ０８０．１９８０：ＡｌｂｅｒおよびＫａｗａｓａｋｉ、　Ｊ、Ｍｏ１．Ａｐｐ ｌ、Ｇｅｎｅｔ、１：４１９−４３４＋１９８２；Ｋａｗａｓａｋｉ。

米国特許第４．５９９，３１１）またはアルコール脱水素酵素遺伝子（Ｙｏｕｎ ｇら、　に　る　のゞ　−工　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎ　１ｎｅｅｒｉｎｏｆ　Ｍ ｉｃｒｏｏｒ　ａｎｉｓｌ’ｓ　ｆｏｒ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　）＋Ｈｏ１ｌａ ｅｎｄｅｒら（編集）　ｐ３５５ブレニウム（Ｐ１ｅｎｕ＊）ニューヨーク１９ ８２；Ａｍｍｅｒｅｒ、Ｍｅ田」且り旦、１０１：１９２−２０１．１９８３） である。この点に関して、特に好ましいプロモーターは、■旦プロモーター（Ｋ ａｗａｓａｋｆ、米国特許第４．５９９，３１１．１９８６）およびＡＤＨ２− ４Ｃプロモーター（Ｒｕｓｓｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ　３０虹：６５２−６５４ ゜１９８３；ＩｒａｎｉおよびＫｉｌｇｏｒｅ、米国特許出願第１８３．１３０ 号、これは参照により本明細書に編入される）である。発現ユニットは転写ター ミネータ−を含んでもよい、好ましい転写ターミネータ−はＴＰＩＩターミネー タ−（ＡｌｂｅｒおよびＫａｗａｓａｋｉ、　皿上）である。

酵母に加えて、本発明のタンパク質は糸状菌で発現でき、例えば真菌株−■且虹 ｌ■七組（Ｍ　ｃ　Ｋ　ｎ　ｉ　ｇ　ｈ　ｔら、米国特許第４．９３５，３４９ ．　これは参照により本明細書に編入される）０例えば有効なプロモーターはア スペルギルス・ニドランス（Ａｓ　ｅｒ　１ｌｌｕｓ　ｎ１ｄｕｌａｎｓ）　Ｗ 溶解遺伝子、たとえばＡＤｌ＋３プロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔらＥＭＢＯＪ 、４：２０９３−２０９９．１９８５）および皿プロモーターである。適当なタ ーミネータ−は観服ターミネータ−（ＭｃＫｎｉｇｈｔら、皿上、１９８５）で ある、そのような成分を利用する発現ユニットは、アスペルギルス（Ａｓ　ｅｒ 　１ｌｌｕｓ　）の染色体ＤＮＡ中に挿入できるベクター中にクローン化される 。

真菌の形質転換法は文献にて周知であり、例えばＢｅｇｇｓ　（同上）、Ｈｉｎ ｎｅｎら（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７５　：１９２９ −１９３３．１９７８）、Ｙａｌｔｏｎら、（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８１　：１７４０−１７４７．１９８４）およびＲｕ５ｓｅｌ ｌ（Ｎａｔｕｒｓ　３０１：１６７−１６９．１９８３）に記載された。宿主細 胞の表現型は、一般的に発現ベクターに存在する選択可能なマーカーで補足され る遺伝的欠損を含有するであろう、特定の宿主および選択マーカーの選択は当業 者の知識内である。ヘテロロガスなタンパク質の生産を至適化するために、宿主 株は突然変異（例えば、酵母匹己突然変異（Ｊｏｎｅｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　８ ５：２３−３３．１９７７）を持ち、これは減少したタンパク質溶解活性を生じ る。

真菌細胞に加えて、培養されだ哺乳類細胞も、本発明の宿主細胞として使用でき る０本発明の使用に好ましい培養宿主哺乳類細胞は、ＣＯ３−１（ＡＴＣＣＣＲ Ｌ　１６５０）、　ＢＨＫおよび２９３　（ＡＴＣＣＣＲＬ１５７３；Ｇｒａｂ ａｍら、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、３６：５９−７２．１９７７）細胞系である 。好ましいＢＨＫ細胞系はＢＨＫ５７０細胞系（アメリカンタイプカルチャーコ レクシ町ンに寄託番号第ＣＲＬ　１０３１４で寄託された）である、加えて、多 くの他の哺乳類細胞が本発明にて使用でき、例えばＲａｔ　Ｈａｐ　Ｉ　（ＡＴ ＣＣＣＲＬ　１６００）。

Ｒａｔ　ＨｅｐＨ（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５４８）　、ＴＣＭＫ（ＡＴＣＣＣＣＬ 　１３９）、ヒト肺（ＡＴＣＣＣＣＬ　７５．１）、ヒト肝腫瘍（ＡＴＣＣＨＴ Ｂ−５２）、Ｈｅｐ　Ｇ２（ＡＴＣＣＨＢ　８０６５）、マウス肝臓（ＡＴＣＣ ＣＣＬ　２９，１）、ＮＣＴＣ１４６９（ＡＴＣＣＣＣＬ　９．１）および［１ ＵＫＸ細胞（ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ　Ａｃａ ｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７７　：４２１６−４２２０゜１９８０）。

本発明を実施するための哺乳類発現ベクターは、クローン化遺伝子またはｃＤＮ Ａの転写を支配できるプロモーターを含むであろう、好ましいプロモーターはウ ィルスプロモーターまたは細胞プロモーターである。ウィルスプロモーターは極 めて初期のサイトメガウィルスプロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔら、釦旦　４１： ５２１−５３０．１９８５）およびＳＶ４０プロモーター（Ｓｕｂｒａｍａｎ　 ｔらＭｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、１：８５４−８６４．１９８１）である。

細胞プロモーターはマウスメタロチオネイン−１プロモーター（Ｐａｌ−ｍｉｔ ｅｒら、米国特許第４．５７９，８２１）　、マウスｖ１プロモーター（Ｂｅｒ ｇｓ＋ａｎら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８１ニア０ ４１−７０４５．１９８３；ＧｒａｎｔらＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ、ＵＳＡ１５：５４９６．１９８７）およびマウスＶＷプロモーター（Ｌｏｈ ら、皿３３：８５−９３．１９８３）である、特に好ましいプロモーターは、ア デノウィルス２由来の主要後期プロモーター（Ｋａｕｆ−ｓ＋ａｎおよび５ｈａ ｒｐ、　Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、２：１３０４−１３１９９．１９８２） である。そのような発現ベクターは、プロモーターの下流でかつ目的ペプチドま たはタンパク質をコードするＤＮＡ配列の上流に位置した一組のＲＮＡスプライ ス部位も含有できる。好ましいＲＮＡスプライス部位は、アデノウィルスおよび ／または免疫グロブリン遺伝子から得ることができる。また発現ベクター中には 目的コード配列の下流に位置したポリアゾニレ−ジョンシグナルを含有する。適 当なポリアブニレ−シランシグナルは、ＳＶ４０の初期または後期ポリアゾニレ −ジョンシグナル（Ｋａｕｆｓａｎおよび５ｈａｒｐ、ｆｉ上）、アデノウィル ス５ＥＩＢｆｉＩ域からのポリアデニシーシ式ンシグナル、およびヒト成長ホル モン遺伝子ターミネータ−（ＤｅＮｏｔｏら、Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ、Ｒｅｓ、９ ：３７１９−３７３０．１９８１）を含む０発現ベクターは非コードウィルスリ ーダー配列（例えばアデノウィルス２トリパタイトリーダー、これはプロモータ ーとＲＮＡスプライス部位との間に位置する）を含有できる。好ましいベクター はエンハンサ−配列（例えばＳＶ４０エンハンサ−およびマウスμエンハンサ− １（Ｇｉｌｌｉｅｓ、Ｃｅ１ｌ　３３　ニア１７−７２８．１９８３）を含有で きる０発現ベクターはアデノウィルスＶＡ　ＲＮＡ５をコードする配列も含有で きる。

クローン化ＤＮ＾配列は、培養哺乳類細胞中に、例えばカルシウム−媒介トラン スフェクションにより導入できる（ｌｌｉｇｌｅｒら、Ｃｅ１ｌ　１４ニア２５ ．１９７８）；　ＣｏｒｓａｒｏおよびＰｅａｒｓｏｎ、　Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃ ｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　７：６０３゜１９８１）　；Ｇｒａｈａ−およびＶ ａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、　ＭΣ２　：４５６．１９７３）、クローン化ＤＮＡ配列 を哺乳類細胞中に導入するその他の方法はエレクトロポレーション（Ｎｅｕｍａ ｎｎら、ＥＭＢＯＪ、１：８４１−８４５．１９８２）、も使用できる。

クローン化ＯＮ＾が統合された細胞を同定するためには、一般的に選択できるマ ーカーを目的遺伝子またはｃＤＮＡと共に細胞中に導入する。

培養哺乳類細胞に使用するための好ましい選択マーカーは、薬剤耐性を付与する 遺伝子を含み、例えばそれはネオマイシン、ヒグロマイシン、およびメトトレキ セートである。選択マーカーは増幅しうる選択マーカーでもよい、好ましい増幅 しうる選択マーカーは、ＤＩＩＦＩｌ遺伝子である０選択マーカーに関する総説 はＴｈ１ｌｌｙによる（璽９　（Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｃｅ１ｌ　Ｔｅｃｈｎｏ ｌｏ　ブラタワース出版社・ストネーハム、マサチューセッツ州：Ｂｕｔｔｅｒ ｗｏｒｔｈ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　５ｔｏｎｅｈａ＋ｗ。

ＭＡ）　、これは参照により本明細書に編入される）０選択マーカーの選択は、 当業者には周知である。

選択マーカーを、細胞中の別個のプラスミドに同時に目的遺伝子を導入するか、 または同一プラスミドに導入することもできる。もし同一プラスミド上であれば 、選択マーカーおよび目的遺伝子は異なる、または同一プロモーターの制御下に あり、後者の配置はデイシストロニンク（ｄｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）なメツセー ジを生成する。このタイプの構造物は、当技術でよく知られている（例えば、Ｌ ｅｖｉｎｓｏｎおよびＳｉａ＋ｏｎｓｅｎ、米国特許第４，７１３．３３９）　 、さらに”キャリアーＤＮＡ”として知られている、さらなるＤＮＡを細胞に導 入する混合物に加えることが有利であるかもしれない。

トランスフェクトした哺乳類細胞を一定期間（典型的にはＩ−２日）増殖させ、 目的ＤＮＡ配列の発現を開始させる。安定した様式で選択マーカーを発現してい る細胞の増殖について選択するために、薬剤選択を通用する。増幅できる選択マ ーカーでトランスフェクトされた細胞について、薬剤濃度を段階的に上昇させて 、クローン化配列の増加したコピー数を選択し、これによって発現レベルが上昇 する。

本発明の実施に好ましい原核生物宿主細胞は、細菌Ｅｓｃｈｅｒｔｃｈｉａｃｏ ｌｉの株であるが、Ｂａｃｉｌｌｕｓおよび他の属も有用である。これらの宿主 の形質転換およびその中の外来ＤＮＡ配列の発現に関する方法は当業界に周知で ある（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、モレキュラークロ一二）１ａｒｂｏｒ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ＮＹ、１９８２；これは参照により本明細書に編入され る、またはＳａｍｂｒｏｏｋらＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：Ａ　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ　。

第二版、コールドスプリングハーバ−１ＮＹ、１９８９；　これは参照により本 明細書に編入される）、細菌細胞中でのクローン化ＤＮＡの発現に関するベクタ ーは、一般的に、選択マーカー、例えば抗生物質耐性のような遺伝子、そして宿 主細胞中で機能するプロモーターを含有するであろう、適当なプロモーターはｔ ｒｐ（ＮｉｃｈｏｓおよびＹａｎｏｆｓｋｙ＋Ｍａｔｈ、堕ｕμ山ユ０１：１５ ５−１６４．１９８３）、ｌａｃ　（Ｃａｓａｄａｂａｎら、Ｊ、３ａＣｔｅｒ ｉｏ１１４３　：　９７１−９８０．１９８０）およびファージλ（Ｑｕｅｅｎ 、Ｊ、ＭＯｌ、Ａ　１．Ｇｅｎｅｔ。

２　：１−１０．１９８３）プロモーター系である。細菌を形質転換するために 有用なプラスミドはｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖａｒら、Ｇｅｎｅ　２：９５−１ １３．１９７７）、ｐＵｃプラスミド（Ｍｅｓｓｉｎｇら、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚ　 ｍｏｌ、１０１：２０−７８．１９８３：ＶｉｅｉｒａおよびＭｅｓｓｔｎｇ、 Ｇｅｎｅ　１９：２５９−２６８．１９８２）、ｐＣＱＶ２（Ｑｕｅｅｎ、舅よ ）およびその誘導体である。プラスミドはウィルスおよび細菌の両方の要素を含 有できる。

本明細書中に与えられた教示、プロモーター、ターミネータ−１および本発明の グルカゴン類似体をコードする発現ベクターの植物、鳥類および昆虫細胞中への 導入は、当業者に明らかである０例えばバキュロウィルスは昆虫細胞中でヘテロ ロガスＤＮＡ配列を発現するベクターとして、＾ｔｋｉｎｓｏｎら（Ｐｅｓｔｉ ｃ、Ｓｃｉ、２８　：２１５−２２４．１９９０）により概説された。植物細胞 中で遺伝子を発現するためのベクターとしての一酊工劇す旦印工暉岬　拮■」肌 競１７）　使用ハ、５ｒｎｋａｒ；）　（Ｊ、Ｂｉｏｓｃｉ。

−Ωμｍ配μｍ）　１１：４７−５８．１９８７）に概説されている。

本発明のＤＮＡ構造物を含有する宿主細胞は、次に本発明のグルカゴン類似体を 生産するために生育される。細胞を標準法に従い、哺乳類または真菌宿主細胞の 成長に必要な栄養素を含有する成長培地中で成長させる０種々の適当な培地が当 技術において知られており、一般的に炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン 、無機物および成長因子を含有する。成長培地は、ＤＮＡ構造物を含有する細胞 を選択するであろう。これは例えばＤＮＡ構造物を選択マーカーで補足、または ＤＮＡ構造物での同時トランスフェクションにより補足される薬剤選択または必 須栄養の欠如による。

酵母細胞についての適当な生育条件は、例えば化学的に明確な培地であって窒素 源（これは、非アミノ酸窒素源または酵母エキス）、無機塩、ビタミン、および 必須アミノ酸補給物を含有する培地で、４℃から３７℃の間の温度（特に３０℃ が好ましい）で培養することから成る。培地のｐｉは好ましくは２より大きく、 ８より小さく、より好ましくはｐＨ５−６である。安定なｐＨを維持するための 方法は緩衝化と一定のｐＨＩ！御を含み、好ましくは水酸化ナトリウムの添加を 通じて行われる。好ましい緩衝化試薬には琥珀酸とＢ１５−Ｔｒｉｓ　（シグマ 化学社、セントルイス、ＭＯ）である。アスパラギン一連結グリコジル化に必要 な遺伝子を欠如している酵母細胞は、好ましくは浸透圧安定化剤を含有する培地 で生育される。このましい浸透圧安定化剤は、ソルビトールを培地に０．１Ｍお よび１．５Ｈの間で、好ましくは０．５Ｍまたは１．０Ｍで補給する。培養哺乳 類細胞は、一般的に市販されている血清−含有または血清−不含培地で培養され る。使用された特定細胞系に適する培地、および適当な生育条件は当業者の知識 の範囲にある。

グルカゴン類似体を発現している個々の形質転換体は本明細書に記載されたよう にクローン化またはプールされることができる。サツカロミセス・セレビシェ− （Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃ競　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）形質転換体の場合には、 個々の形質転換体を滅菌した楊枝を選択培地中に使用して取り出すことができる 。培養哺乳類細胞形質転換体の場合は、個々の形質転換体は、シリンダークロー ニングによりマルチ−ウェルカルチャープレート中に単離できる。これらのアッ セイは、（ａ）グルカゴン類似体の発現が安定な増殖条件下で、次の要素：転写 プロモーター、分泌シグナル配列、グルカゴン類似体をコードするＤＮＡ配列お よび転写ターミネータ−が作用可能に連結された構造物を含んで成るグルカゴン 類似体の発現を支配できるＤＮＡ構造物を含有する宿主細胞を増殖させ；　（ｂ ）宿主細胞からこのＩＩＮＡ配列によりコードされるグルカゴン類似体を単離し ：　（Ｃ）単離したグルカゴン類似体を、天然グルカゴンの存在下で、反応経路 に共役したグルカゴン受容体に、グルカゴン類似体の受容体への結合及び、経路 を通じた付随応答が可能な十分な時間暴露し：（ｄ）グルカゴン類似体の受容体 への結合から生じる応答経路の刺激の減少を、天然グルカゴンのみの存在による 応答経路の刺激と比較して検出し、そしてそれからグルカゴンアンタゴニストの 存在を決定する、ことから成る。グルカゴン類似体が受容体に結合する十分な条 件および時間は受容体の起源により変化するであろう；しかじ、この結合に適当 な条件は一般的に４℃から５５℃の間であり、緩衝液中に０と２Ｈの間のＮａＣ １、好ましくは０．１と０．９Ｍの間のＮａＣ１，特に好ましくは０、ＩＭ　Ｎ ａＣ１，５から９の間のｐＨ１好ましくは６．８から８の間である。

結合および応答に十分な時間は、暴露後５から１５分であるが、１２分が特に好 ましい。

上述したように、アンタゴニストは天然分子の細胞性受容体に結合できるが、応 答経路の刺激または応答経路の減少した刺激を表すことのいずれかを行うことは できない、ひとつの態様において、グルカゴンアンタゴニストは一般的にそれら の細胞性グルカゴン受容体に結合する能力、ならびにそれらのアデニル酸シクラ ーゼ応答経路を刺激できないことによりて同定される。グルカゴン受容体は、多 くの組繊細胞中で報告され、例えば多数の種（イヌ、ブタ、ヒトおよびラットを 含む）由来の肝臓、腎臓、心筋および脂肪組織である。アデニル酸シクラーゼ活 性アッセイは、例えばＬｊｎら（Ｂｉｏｃｈｅ−紅■■」Ｌ：１５５９−１５６ ３　、１９７５）に記載された方法により行うことができる。これらの方法は、 天然グルカゴンに比較したｃＡＭＰ生産の刺激のレベルを測定し、一般的にグル カゴン受容体を含有する組織からの膜をＡＴＰの存在下でグルカゴンとグルカゴ ン類似体との混合物に暴露することを含む、ラット肝臓からの膜調製物は一般的 にアデニル酸シクラーゼ活性アッセイに使用されるが、グルカゴン受容体を含有 する他の組織も使用できる。膜はＰｏｈｌ、（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｒｅｃｅ 　ｔａｒＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｂｌｅｃｈｅｒ、Ｍ、Ｗ集、ニューヨーク、ａｐ１ ６０−１６４．１９７６）により改良されたような、Ｎｅｖｉｌｌｅ（Ｂｉｏｃ ｈｉｗ、Ｂｉｏ　ｈ　ｓ　Ａｃｔａユ５４　：　５４０−５５２゜１９６８）に 記載された方法により調製できる。簡単に述べると、若いメスのＳｐｒａｇｕｅ −Ｄａｗｌｅｙラットを肝臓膜の調製に使用する；しかし他の研究用種でも可能 である。６０から１００グラムのラット肝臓を、まず組織を３−６ｍ５の小片に 細かく切ることによりバッチ処理した。

細断した組織を水冷した１１の重炭酸ナトリウムに、約３００ｇ／ｌで懸濁させ た＊Ｆｊ濁液をバッチ様式で組織ホモジナイザーでゆるやかに８回擦ることによ って処理する。ホモシネイトをさらに水冷した１■Ｈの重炭酸ナトリウムに、約 ４０−８０ｇ／ｌの最終濃度で混合する。希釈したホモシネイトを少なくとも３ 分間撹拌し、続いて二重のチーズクロス（ｃｈｅｅｓｅ　ｃｌｏｔｈ）で濾過す る。濾過物を再度四重のチーズクロスで濾過し、遠心管に移して、４℃で１５０ ０Ｘｇで３０分間遠心する。

遠心後、上澄みを注意深くデカントし捨てて、ベレｙ　）を残りの上澄み中で清 潔な組織ホモジナイザー中にてゆるやかに３回擦って再懸濁する。再懸濁の上澄 みの容量は、全部で１６５ｍ１であり、４４％シュクロースの最終濃度である。

混合後、シュクロース濃度屈折計で測定されて、水または６９％シュクロース溶 液で４３．９％から４４．１％シュクロース（対応する屈折指数は１．４０７６ から１．４０８０）の間に調整される　ｉｌｌ整された懸濁液は６つの１’　Ｘ ３．５’硝酸セルロース管に分割され、管を満たし、そして管はすでに濃度を４ ２．２％から４２．４％シュクロース（対応する屈折指数は１．４０４２から１ ．４０４６）に調整された新しいシュクロース溶液を上層して平衡を保たれる。

試料を、使用した管に適するスイングパケット超遠心ローター中（例えばベンク マン５９２８または５Ｗ２５．２；　ベックマンインストウルメント社、フラー トン、ＣＡ）で４℃にて２５．００Ｏｒｐｍで１５０分間遠心する。

精製した膜を管の上部メニスカスで漂う層として、スプーン−形をしたスパチュ ラでスコービング（ｓｃｏｏｐｉｎｇ）するか、または１８ゲイジの針を通して シリンジ中に取り出す、膜を吸入し１８ゲイジから２０ゲイジの計を通して１０ −２５−１のシリンジに放出することにより１０ｍ１の１ｍＭ重炭酸に再懸濁す る。再懸濁に続き、６０６０−８Ｏの重炭酸を加えることにより膜を洗浄し、高 速遠心で１５．０００ｒｐ−にて遠心する。

懸濁液を捨てて、ベレットを１１の重炭酸に再懸濁し、プールして約５　１０＋ ＊ｌの濃縮された肝腫瘍膜を得る。この膜調製物をアリコートに分けて一８０℃ で６ケ月まで保存する。

膜調製物のタンパク質濃度を、１０−２０μｌの膜調製物をＬＭ　ＮａＣ１゜０ ．１７Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ？、ｏ）緩衝液で１００−倍に希釈することに より測定する。この溶液の緩衝液と比較した吸光度は、ｌ　−ａｓの石英キュベ ツト中で、ＵＶ分光光度計の２２４ｎ■と２３６．５Ｈｍの波長で測定する。タ ンパク質濃度は次の式： ％式％（１００） に従い計算される。

アデニレートシクラーゼ活性アッセイは始めに溶液Ａ１溶液Ｂ１１００×グルカ ゴン保存液、および停止混合液の溶液を調製する。溶液Ａは、５０ｄと２０抛Ｈ の間のＴｒｉｓ　ＨＣＩ、　ｐＨは７．４から７．８の間、２０１から１００ｍ Ｍの間のＭｇＣ１，および０．２％から０．４％の間のウシ血清アルブミン（Ｂ ＳＡ）を含有する。２と８■／ｍｌの間のクレアチンフオスフォキナーゼ（シグ マ化学社、セントルス、ＭＯ）を加えてもよし１゜最も好ましくは、溶液Ａは、 　１００５Ｍ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ　ｐＨ７，６，２０ｗＭ　ＭｇＣ１ｇ、０．４ ％ＢＳＡ　、　４■／■ｌクレアチンフオスフオキナーゼを含有する。

溶液Ｂは、０．４から２０ｓ＋Ｍの間の＾ＴＰ、　１．６μＨと２５ｍＭの間の ＧＴＰ　、　０から４ｓ＋Ｈの間のイソブチル−１−メチル−キサンチン（ＩＢ ＭＸ）および２から８＋ＨのＨＤＴＡを含有する。６０から２４０ｍＭの間のク レアチンフォスフォキナーゼ（シグマ化学社）を加える事もできる。最も好まし くは、溶液Ｂは４ｍＭ　ＡＴＰ、　２０．ｃｒＭ　ＧＴＰ、　４ｍＭ　ＩＢＭＸ 　、４ｍＭ　ＥＤＴＡおよび１２０ｎＭのクレアチンリン酸を含有する。　１０ ０ｘグルカゴン溶液は１μＨグルカゴンを含有する。停止混合液は１００＋ｓＭ 酢酸、５（ｌｓＭＥＤＴＡを含有する。別法として、反応は沸騰湯浴中で５分間 反応を加熱することにより停止できる。グルカゴン受容体−含有膜調製物はＰｏ ｈｌら（同上）の方法で調製でき、これは上記に記載される。

アデニル酸シクラーゼ反応は、ＡＴＰをｃＡＭＰに転換するものであるが、単離 したグルカゴン類似体をマイクロタイタープレートのウェルにマイクロモル濃度 で添加することにより行われる０等量の溶液Ａおよび溶液Ｂは混合されて、５０ μｌの混合物が各陰性対照ウェルに加えられる。グルカゴンを残る溶液Ａ十溶液 Ｂ混合物に加えて、最終濃度がＩ　Ｘｌ０−’Ｍから１００Ｘグルカゴン保存溶 液となり、この溶液の５０μｌをグルカゴン類似体を含有する各ウェルに加える 。膜調製物を水で０．２から１０■／　ｍ　ｌの間に希釈して、好ましくは２■ ／■ｌタンパク質であり、そして４５μｍの希釈した膜を各ウェルに加えて反応 を開始する０反応混合物を室温で１２分間インキュベージ５ンし、１００μｌの 停止溶液を各ウェルに加えて反応を停止する。その反応物は遠心で清澄化されて 、４℃で保存される。

一般的に、ｃＡＭＰ生産は”Ｐ−ＡＴＰのｃＡＭＰへの転換により測定される。

サイクリックＡＭＰの生産は、ＳａＩｏｍｏｎらの方法（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈ ｅｌｌ。

５８：５４１−５４８．１９７６）またはＫｒ１ｓｈｎａら（Ｊ、Ｐｈａｒ＋ｗ ａｃｏ１．Ｅｘ　、Ｔｈｅｒ、１６３：３７９、１９６８）または市販されてい るキット（例えばアマジャムから：へｓ＋ｅｒｓｈａｍ）を使用して測定できる 。しかし、ｃＡＭＰ産生の測定はアマジャムで作られた５ｃｉｎｔｉｌｌａｔｔ ｏｎ　Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙアッセイを使用して測定することが好ましい、製造元 の処方を使用して、アマジャムの５ｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｘｉｍｉ ｔｙアッセイキットはｃＡＭＰの産生をヨウ素化−ｃＡＭＰと抗−ｃＡＭＰ抗体 との競合により測定して使用される。好ましくはアデニル酸シクラーゼ反応の各 ウェルからの１０μｌを別個のベータプレートウェルに加えて、各試料を６５μ Ｉの酢酸ナトリウムで希釈する。標準はアマジャムキットから補足される非−ア セチル化標準からの１　、６ｐＭと６．４ｐＭでｔＪｊ製され、そして７５ａｌ の各標準が三重の試料ウェルに加えられる。１５０マイクロリツトルの緩衝液（ アマジャム）を三重のウェルに、非特異的結合対照のために加える。

７５マイクロリツトルの”’　Ｉ−ｃＡＭＰを各ウェルに加える。７５マイクロ リツトルの希釈したラビット抗−サクシニルｃＡＭＰを各ウェルに加える、但し 非特異的結合対照は除り、７５マイクロリツトルの希釈した抗−ラピッ）　ＳＰ Ａ試薬を各ウェルに加え、プレートを密閉して一晩、室温で振盪しながらインキ ュベーションする。−晩のインキュベージぢン後、この反応物をベータプレート カウンターで計算する（ファルマシア、ウプサラ、スウェーデン）。

このａｍにおいて、グルカゴンアンタゴニストは、グルカゴンによるラット肝臓 膜アデニル酸シクラーゼの刺激活性を阻害するものとして同定される。応答百分 率は以下の式により測定できる：％Ｒｘ＝（ＣＰＭ　ＣＰＭＮＩｍ　）　／（Ｃ ＰＭｏ、ｓ　−ＣＰＭ、ｌｓｍ　）ここで ％Ｒｘ−与えられた試料または標準についての応答百分率ＣＰＭ　＝試料の計数 ＣＰＭＮ□＝　ＮＳＢ対照カウントの平均ＣＰＭＯ，。＝０．０Ｍ標準カウント の平均与えられた試料についてのｃＡＭＰの相対濃度は以下の式を使用して測定 できる： （ｃＡＭＰ）　ｘ　＝１．６ｅＩ１１”％ＲＷ−％ｌｌ−６１／　（％１１に− ４−％覧１・６）ここで （ｃＡＭＰ）　ｘ　＝与えられた試料の相対濃度％Ｒｘ−与えられた試料の応答 百分率 ％ＲＬ、６＝　１．６Ｘ１０−’？Ｉ標準での応答百分率％Ｒ６，４＝　６．４ ｘｌＯ−”Ｍ標準での応答百分率したがって、平均よりも有意に低いｃＡＭＰを 含有するアッセイウェルは、グルカゴンアンタゴニストを含有するとして同定さ れることができる。

本発明のグルカゴンアンタゴニストは、イオン交換および分配クロマトグラフィ ーとして、例えばＣｏｙら（ペプチド構造および機能、ピアス化学社、ロックホ ールドＩＬ、ｐｐ３６９−３７２．１９８３：Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　５ｔｒｕ−ｃ ｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ ｍｐａｎｙ）　、＾ｎｄｒｅｕおよびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄによる逆相クロマト グラフィー　（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１６４　：５８５−５９０．１９ ８７）または例えばＫｏｆｏｄらによるＨＰＬＣ（Ｉｎｔ、Ｊ、Ｐｅ　ｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ、３２：４３６−４４０．１９８８）に記載されるよう に精製されることができる。さらなる精製法は、液体クロマトグラフィー、勾配 遠心のような従来の化学的精製手段、およびゲル電気泳動、その他による手段で 達成できる。タンパク質精製法は当業界にて周知であり（一般的に、５ｃｏｐｅ ｓＳＰｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌ ａｇ、ＮＹ。

（１９８２）を参照、これは参照により本明細書に編入される）そして本明細書 の組換えグルカゴン類似体の精製に適用できる。別法として、グルカゴン類似体 はＢａｒａｎｙおよびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄの固相法（ｉｎ　Ｔｈｅムロ旦且　 第２Ａ巻、ＧｒｏｓｓおよびＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ＋　Ｗ集、アカデミツク出版 、ＮＹ、ｐｐｌ−２８４，１９７９）または自動ペプチド合成機を使用して合成 できる。

本明細書に開示された突然変異またはヌクレオチド誤導入法を通して生成された グルカゴンアンタゴニストから得た情報は、さらなるグルカゴンアンタゴニスト を設計するために使用できる０例えば、以下に提示されるデータはアミノ酸残基 １−５．９．１１．２１および２９がグルカゴン活性に重要であることを指示す る。これらの位置での変更は、組み合わせて種々のグルカゴンアンタゴニストを 与えることができ、それにはｄｅｓ−Ｈｉｓ’−グルカゴンが含まれ、これは遺 伝子工学または従来の化学合成を通じて生成できる。特に好ましい変更は、１１ 位のアラニン残基、２１位のグルタミン残基および２９位のセリン残基である。

少なくとも約５０％の実質的に純粋な岨換えグルカゴンアンタゴニストが好まし く、より好ましくは少な（とも約７０−８０％、特に医薬使用については９５− ９９％またはそれより高い均一性が最も好ましい。

所望するように、一旦部分的または均一に精製されたら、組換えグルカゴン類似 体は治療の目的に使用できる。一般的に、本発明のアンタゴニストは非経口的ま たは点滴により投与される０本発明のアンタゴニストは遊離塩基または酸塩とし て存在できる。適当な塩は医薬的に受容でき、および金属塩、アルカリおよび、 カリウムまたはナトリウム塩のようなアルカリ土類金属塩を含む、他の医薬的に 受容できる塩は、クエン酸、琥珀酸、乳酸、塩酸および臭化水素塩である。非経 口的組成物はｐＨが５．６と７．４の間の等張溶液に配合できる、適当な等張溶 液は塩化ナトリウム、デキストロース、硼酸酒石酸ナトリウムおよびプロピレン グリコール溶液である。本発明のアンタゴニストの治療投与は、同一組成物中ま たは別個の組成物中のインスリンと同時に投与されることができる。

以下の実施例は説明の目的で与えられたものであり、制限するものではない。

１隻斑 実施例１−酵母発現ベクターｐＢ５１１４の構築酵母ベクターＹＩｐ５とｐＪＤ Ｂ２０７の一部分を含有するプラスミドｐＥＡｓ１０２を下記のようにして構築 した。プラスミドｐＪＤＢ２０７　（Ｂｅｇｇｓ　。

Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　Ａｌｆｒｅｄ　Ｂｅｎｚｏｎ　Ｓｙｓｐｏｓｉ ｕｍ＋　１６巻：３８３−３８９頁−Ｍｏｌａ−ｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ 　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ’コペンハーゲン、デンマーク、　１９８１年）すなわちｐ ＪＤＢ２１９（Ｂｅｇｇｌ、前記文献、　１９７８年）の誘導体を、ＢａｍＨＩ とＰｓｔＩで消化して、１ｅｕ２−　ｄ遺伝子、２ミクロンのプラスミドおよび ｐＢＲ３２２の配列を含有する４、４Ｋｂのフラグメントを単離した。プラスミ ドＹＩｐ５　（Ｓｔｒｕｈｌら前記文献）を、ＰｓｔＩで部分消化を行い次いで Ｂａ＋ｓＨＩで完全消化を行って、［ＩＲＡ　３遺伝子とｐＢＲ３２２配列を含 有する４、３にｂのフラグメントを単離した。これら２つのフラグメントを連結 し、得られたプラスミドをｐＥＡｓ１０２と命名した。

プラスミドｐＥＡｓ１０２中の旧ｎｄＤ１部位を、まずｐＥＡｓ１０２をＨｉｎ ｄｎｌで完全に消化することによって破壊した。その線状になったプラスミドを 、ヌクレオチド三リン酸の存在下、ＤＮＡポリメラーゼＩ　（フレノウフラグメ ント）とともにインキュベートし、Ｔ４　ＯＮＡリガーゼで処理することによっ て、再び環状にし、次いでこのプラスミドでイー・コリ（Ｅ、Ｃｏ１１）菌株１ １８１０１を形質転換した。得られた形質転換細胞から製造したＤＮＡを、旧ｎ ｄｌｌ［による消化でもはや線状にならないプラスミドについてスクリーニング した。

酵母発現ベクターを構築するために、サツカロミセスセレビシェ（Ｓａｃｃｈａ ｒｏ＊ｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　ＴＰＩＩ由来のプロモーターとター ミネータ−の領域を、α因子（ＭＦα１）プレプロ配列とともに、上記のｐｌｉ Ａｓ１０２誘導体に挿入した。

上記のＴＰＩＩのプロモーターおよびα因子プレプロ配列はプラスミドｐＴＧＦ ｏｃａ　（図１）から得られ、このプラスミドｐＴＧＦｃＡ、はプラスミドｐＢ １２から誘導され、このプラスミドｐＢ１２は、　ＴＰＩＩプロモーター、ＭＰ □プレプロ配列、ｐＤＧＦ　−ＢＢ配列、↑ｐＨターミネーターおよびｐｒｃ１ ９Ｒベクターの配列を含有していた。　ｐＢ１２の構築については、Ｍｕｒｒａ ｙらが報告している（米国特許第４，７６６．０７３号、これは本願に採用する ものとする）　、　ＭＰ、（＋プレプロ配列とＰＤＧＦ　−ＢＢ配列は、Ｅｃｏ ＲＩ　−Ｘｂａ　１フラグメントとしてＭ１３ρにサブクローン化した。肝メ１ プレプロ配列中に存在する５ｓｔ１部位を、ＫｕｎｌＴｅｌらが発表している方 法（米国特許第４．８７３．１９２号）とオリゴヌクレオチドＺＣ１１５９（表 １、配列１ＯＮｏ、３）とを用い、生体外突然変異誘発法によってＨｉｎｄｌ［ ［部位に変化させた。　５ｓｔ１部位の代りにＨｉｎｄｌＩ［部位を有するクロ ーンを同定した。ＭＦｇ＋プレプロ配列を含有するフラグメントを、ＥｃｏＲＩ 　−Ｈｌｎｄｌ［［フラグメントとして単離した。

ｌ土 第１ゴヌクレオチドの　５′→３′ ＺＣ１１５９（配列ＩＯＮｏ、　３　）ＴＴＧ　ＴＣＣＡＡＧ　ＣＴＴ　ＡＣＡ 　ＣＣＴ　ＴＣＺＣ１１９７（配列１０　Ｎｏ、　４　）ＡＧＣＴＴＧ　ＧＡＣ ＡＡＧ　ＡＧＡ　ＧＴＴ　ＧＴＴ　ＴＣＴ　ＣＡＣＴＴＣＡＡＣＧＡＣＴＧＴ　 ＣＣＡＧＡＣＣＣＴ　ＣＡＣＡＣＣＣＡＡ　ＴＴＣＴＧＴ　ＴＴＣＣＡＣＧＧＴ 　ＡＣＣＴＧＴ　ＡＣＡ　ＴＺＣ１１９Ｂ　（配列ＩＤＮｏ、５） ＴＣＴ　ＴＧＧ　ＴＴＣＡＡＧ　ＡＡＧ　ＡＣＡ　ＡＧＣＣＡＧ　ＣＡＴ　ＧＣ Ｇ　ＴＴＴ　ＧＴＣＡＣＴ　ＣＴＧＧＴＴ　ＡＣＧ　ＴＴＧ　ＧＴＧ　ＣＴＡ　 ＧＡＴ　ＧＴＧ　ＡＡＣＡＣＧ　ＣＴＧ　ＴＧＴ　ＴＧＧ　ＣＴＴ　ＡＡＡ　Ｔ ＺＣ１１９９（配列１０　Ｎｏ、　６　）ＣＣＡ　ＡＣＡ　ＡＴＧ　ＴＡＣＡＧ Ｇ　ＴＡＣＣＧＴ　ＧＧＡ　ＡＡＣＡＧＡ　ＡＴＴ　ＧＧＧ　ＴＧＴ　ＧＡＧＡ ＧＴ　ＣＴＧ　ＧＡＣＡＧＴ　ＣＧＴ　ＴＧＡ　ＡＧＴ　ＧＡＧ　ＡＡＡ　ＣＡ Ａ　ＣＴＣＴＣＴ　ＴＧＴ　ＣＣＡＺＣ１２００（配列ＩＯＮｏ、　７　）ＣＴ Ａ　ＧＡＴ　ＴＴＡ　ＡＧＣＣＡＡ　ＣＡＡ　ＧＴＣＡＧＣＧＴＧ　ＴＴＣＡＣ Ａ　ＴＣＴ　ＡＧＣＡＣＣＡＡＣＧＴＡ　ＡＣＣ：　ＡＧＡ　ＧＴＧ　ＡＣＡ　 ＡＡＣＧＣＡ　ＴＧＣＴＧＧ　ＣＴＴ　ＧＴＣＴＴＣＴＴＧ　ＡＡＺＣ３０２０ （配列ＩＯＮｏ、　８　）ＡＧＣＴＴＡ　ＧＡＴ　ＡＡＧ　ＡＧＡ　ＣＡＣＴＣ Ｔ　ＣＡＡ　ＧＧＴ　ＡＣＣＴＴＴ　ＡＣＣＴＣＴ　ＧＡＣＴＡＣＴＣＴ　ＡＡ Ｇ　ＴＡＴ　ＣＴＡ　ＧＡＣＴＣＧ　ＡＧＧ　ＣＧＴ　ＧＣＴ　ＣＡＡ　ＧＡＣ ＴＴＴ　ＧＴＴＣＡＡ　ＴＧＧ　ＴＴＧ　ＡＴＧ　ＡＡＴ　ＡＣＣＴＧＡ　ＡＴ Ｔ　ＣＡＺＣ３０２１（配列１０　Ｎｏ、　９　）ＧＡＴ　ＣＴＧ　ＡＡＴ　Ｔ ＣＡ　ＧＧＴ　ＡＴＴ　ＣＡＴ　ＣＡＡ　ＣＣＡ　ＴＴＧ　ＡＡＣＡＡＡ　ＧＴ ＣＴＴＧＡＧＣＡＣＧ　ＣＣＴ　ＣＧＡ　ＧＴＣＴＡＧ　ＡＴＡ　ＣＴＴ　ＡＧ Ａ　ＧＴＡ　ＧＴＣＡＧＡ　ＧＧＴ　ＡＡＡＧＧＴ　ＡＣＣＴＴＧ　ＡＧＡ　Ｇ ＴＧ　ＴＣＴ　ＣＴＴ　ＡＴＣＴＡＺＣ３３７８（配列１０　Ｎｏ、１０）ＡＧ ＣＴＴＡ　ＧＡＴ　ＡＡＧ　ＡＧＡ　ＴＣＴ　ＣＡＡ　ＧＧＴ　ＡＣＣＴＴＴ　 ＡＣＣＴＣＴ　ＧＡＣＴＡＣＴＣＴ　ＡＡＧ　ＴＡＴ　ＣＴＡ　ＧＡＣＴＣＧ　 ＡＧＧ　ＣＧＴ　ＧＣＴ　ＣＡＡ　ＧＡＣＴＴＴ　ＧＴＴ　ＣＡＡＴＧＧ　ＴＴ Ｇ　ＡＴＧ　ＡＡＴ　ＡＣＣＴＧＡ　ＡＴＴ　ＣＡＺＣ３４４３（配列１０　Ｎ ｏ、１１）ＧＡＴ　ＣＴＧ　ＡＡＴ　ＴＣＡ　ＧＧＴ　ＡＴＴ　ＣＡＴ　ＣＡＡ 　ＣＣＡ　ＴＴＧ　ＡＡＣＡＡＡ　ＧＴＣＴＴＧＡＧＣＡＣ；Ｇ　ＣＣＴ　ＣＧ Ａ　ＧＴＣＴＡＧ　ＡＴＡ　ＣＴＴ　ＡＧＡ　ＧＴＡ　ＴＴＣＡＧＡ　ＧＧＴ　 ＡＡＡＧＧＴ　ＡＣＣＴＴＧ　ＡＧＡ　ＴＣＴ　ＣＴＴ　ＡＴＣＴＡ形質転換増 殖因子α（ＴＧＦ、、：）配列を１セツトの４個のオリゴヌクレオチドを用いて 合成したが、これらのオリゴヌクレオチドは、アニールしたときに、５′末端に Ｈｉｎｄｌ［［付着末端が連結され、かつ３′末端にＸｂａ　Ｉ付着末端が連結 されたアダプターを形成するように設計し合成した。オリゴヌクレオチドＺＣ１ １９７、ＺＣ１１９Ｂ、ＺＣ１１９９オよびＺＣ１２００（それぞれ表１に示す 配列ＩＤＮａ４．５．６および７）をキナーゼで処理し、アニールし、次いでＸ ｂａ　Ｉ−旧ｎｄＩＩＩで線状にしたＭ１３ｍｐ１８に連結した。得られたクロ ーン由来の一本＠　［ｌＮＡの配列決定を行って、挿入断片がＴＧＦ＝＋をコー ドすることを確認した。そのＴＧＦａ挿入断片を旧ｎｄ　Ｉ［［−Ｘｂａ　Ｉフ ラグメントとして単離した。

図１に示すように、ＭＦ〆、プレプロ配列を含有するＥｃｏＲＩ　−Ｈｌｎｄｌ ［Ｉフラグメントと、ＴＧＦＫ配列を含有する旧ｎｄｌ［［−ＸｂａＩフラグメ ントとを、ＥｃｏＲＩ　Ｘｂａ　Ｉで線状にしたｐＵｃ１３と連結した。得られ たプラスミド（ａｆＴＧＦｃｘ　／ｐＵｃ１３と命名）をＥｃｏＲＩとＸｂａ　 Ｉで消化して、？ｌＦ　１−ＴＧＦ〆挿入断片を単離して８１７０ＣＢ／ｐＢＲ 中にクローン化した。

プラスミド８１７０ＣＢ／ｐＢＲは、Ｍｕｒｒａｙが報告しているが（米国特許 願第０７１５５７．２１９号、この出願は本願に援用するものとする）　、ＴＰ ＩＩプロモーター、ＭＦ−ｏプレプロ配列、ＰＤＧＦ　−ＢＢのコーディング配 列、↑Ｐ■１ターミネーターおよびｐＢＲ３２２ベクター配列を含有している。

プラスミドｐＢ１７０ｃＢ／ｐＢＲをＥｃｏＲＩ　−Ｘｂａ　Ｉで消化して、Ｔ ＰＩＩプロモーター、ｐＢＩ？３２２ベクター配列およびＴＰＩＩターミネータ −を含有するフラグメントを単離した。そのＥｃｏＲＩ　−Ｘｂａ　Ｉ　ｐＢ１ ７０ｃＢ／ｐＢＲフラグメントとＥｃｏＲＩ　−Ｘｂａ　Ｉ　ＭＦｏｃ＋−ＴＧ Ｐｗフラグメントを連結した。得られたプラスミド（ＴＧＦ、ＫＧＢと命名）を Ｃ１ａｌとＢａｍＨＩで消化して発現ユニットを単離し、そのユニットを酵母発 現ベクターｐＭＰＯＴ２　（酵母の２ミクロンベースのプラスミドであり、酵母 と細菌の複製起点、アンピシリン耐性遺伝子およびＰＯＴＩ選択性マーカーを含 有し、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎに 、イー・コリＩＩＢＩＯＩ形質転換細胞として受託番号６７７８８で寄託され、 Ｍｕｒｒａｙらの米国特許第４．７６６．０７３号に開示されている。なおこの 特許は本願に援用するものとする）中にサブクローン化して、ｐＴＧＦａａ　（ 図１）を構築した。

プラスミドｐｒＧｐ〆、をＢｇｌＩ［・と旧ｎｄＩ［Ｉで消化して、ＴＰＩＩプ ロモーターとＭＰＦＣ＋プレプロ配列を含有する１２３６個の塩基対からなるフ ラグメントを単離した。

サツカロミセス・セレビシェＴＰＩＩのターミネータ−フラグメントをプラスミ ドｐＦＧＩ（ＡｌｂｅｒおよびＫａｗａｓａｋｉの前記文献）から得た。そのフ ラグメントは、ＴＰＩＩ遺伝子の末端前アミノ酸コドンから、約７００塩基対下 流のＥｃｏＲ１部位までの領域を含有していた。まずプラスミドｐＦＧ１をＥｃ ｏＲＩで消化し、次いでその付着末端をＤＮＡポリメラーゼ■　（フレノウフラ グメント）で平滑化し、合成のＢａ１ｉＨｒリンカ−（ＣＧＧＡＴＣＣＡ）を添 加し、次いで再連結してプラスミドｐ１３６を生成することによって、ｐＦＧｌ のユニークＥｃｏＲ１部位をＢａ■ＨＩ部位で置換した。そのＴＰＩＩターミネ ータ−を、Ｘｂａ　ｌ−Ｂａ■ＩＩフラグメントとしてｐ１３６から切取った。

このフラグメントを、Ｘｂａ　ＩとＢａｗＢＩで予め線状にしたＹＥｐ１３　（ Ｂｒｏａｃｈらの前記文献）に連結した。得られたプラスミドをｐ２１３と命名 した０次に、このプラスミドをＨｉｎｄＩ［［で消化し、生成した末端をＤＮＡ ポリメラーゼＩ　（フレノウフラグメント）で平滑化し、次に７４ＤＮＡリガー ゼを用いてその線状分子を再び環状にすることによって、プラスミドｐ２１３の ＴＰＩＩターミネータ−領域かあるいは、ｐ２７０は、プラスミドｐＭ２２０（ Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎにイー・コ リＲＲＩの形質転換細胞として、受託番号３９８５３で寄託されている）を、Ｘ ｂａ　ＩとＢａｓ＋ＨＩで消化し、そのＴＰＩＩターミネータ−フラグメント（ 約７００ｂｐ）を精製し、次にこのフラグメントを、Ｘｂａ　Ｉ　−ＢａｍＨＩ で消化されたＹＥｐ１３に挿入することによって構築することができる。

そのＴＰＩＩターミネータ−を、Ｘｂａ　ｌ−Ｂａ■Ｈｌフラグメントとしてプ ラスミドｐ２７０から取出した。このフラグメントを、ＣＡＴ　（クロラムフェ ニコールアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子に結合されたＴＰＩＩプロモータ ーを含有するもう１つのフラグメントとともにｐＵｃｌＱ中にクローン化して、 ＥｃｏＲＶ末端を有するＴＰＩＩターミネータ−フラグメントを得た。得られた プラスミドをｐＣＡＴと命名した０次にそのＴＰＩＩターミネータ−を、Ｅｃｏ ＲＶ　−ＢａｍＨＩフラグメントとしてｐＣＡＴから取出して、同じ酵素で予め 線状にしてあったｐＩｃ１９［１（Ｍａｒｓｈらの前記文献）中にクローン化し てプラスミドｐＴＴＩを得た０次にプラスミドｐＴＴＩを旧ｎｄｌｌＩと５ａｉ ｌで消化して７１８個のｂｐからなるＴＰＩＩターミネータ−フラグメントを単 離した。

１２３６個の塩基対からなるＢｇｌｎ−旧ｎｄＤＩ　ＴＰＩＩプロモーター−Ｍ Ｆ＝−＋フラグメントと、７１８個の塩基対からなる旧ｎｄｌｌＩ　−Ｓａｔ　 Ｉ　ＴＰＩＩターミネータ−フラグメントとを、Ｂａ■ＨＩとＳａｌ　Ｉで消化 して線状にされたｐＥＡｓ１０２誘導体に連結した。得られた連結混合物でイー ・コリ菌株）ＩＢＩＯＩを形質転換し、次いで選択された形質転換細胞で製造さ れたプラスミドＤＮＡを、制限分析法でスクリーニングして、正しい構造のプラ スミドを有するクローンを同定した。陽性のクローンをｐＢｓ１１４と命名した （図２）。

実施例２−野生型グルカゴンとデスー旧ｓ’　−（ＧＬＵ”）−グルカゴンをコ ードするＤＮＡ配列を含有する対照の発現ベクターの構築 Ａ、　ｐＢ３１１７の構築 野生型グルカゴンのコーディング配列をコードする対照の発現プラスミドを構築 した。上記のグルカゴンのコーディング配列は、高度に発現される酵母遺伝子中 に見出されるコドンを利用するよう設計したが、このようにしたため、連鎖終止 コドンＵＡＡＳＵＡＧおよびＵＧＡから１個の塩基が変化したコドンを除いて、 単一の塩基の変化によって最も多種類のアミノ酸置換が得られるであろう。さら に、３つの制限部位が、突然変異誘発を確認することが可能でかつ次の操作を容 易に行えるようにする配列に設計された。このコーディング配列（図３；配列Ｉ Ｄｋｌ）は、グルカゴン類似体のオリゴヌクレオチドライブラリーと、デス−Ｈ ４ｓ’−グルカゴンオリゴヌクレオチドライブラリーとの両者を構築するのに用 いる基材として使用した。

グルカゴンコーディング配列を２つの合成オリゴヌクレオチドで製造したが、こ れらのオリゴヌクレオチドは、グルカゴンコーディング配列の５′末端が、ＫＥ Ｘ２開裂部位をコードするＤＮＡセグメントを介してα因子プレプロ配列にイン フレームで（ｉｎ　ｆｒａａ＋ｅ）結合されるように、発現ベクターに指向性挿 入を可能にする配列が両端に結合された上記のグルカゴンコーディング配列を含 有するＤＮＡ配列を、アニールしたときに提供するように設計した。オリゴヌク レオチＩ’　ＺＣ３０２０とＺＣ３０２１（表１の配列ＩＤＮａ３と９）は、ア ニールしたときに、前記の野生型グルカゴンのアミノ酸配列をコードするアダプ ターを形成するように設計した。すなわちそのアダプターには、５′末端に旧ｎ ｄｎｌ付着末端が連結され、これに続いてこのＨｉｎｄ［［部位とＫＥＸ２開裂 部位との間に１５個の塩基からなる架橋配列が連結され、一方３′末端には、グ ルカゴン配列の末端の終止コドンが連結され、これに続いてＥｃｏＲ１部位と８ ｇｌ　ｆｆ付着末端が連結されている。オリゴヌクレオチドのＺＣ３０２０とＺ Ｃ３０２１をアニールし、次いで予めＩ（ｉｎｄｌ［［とＢｇｌｆｆで消化して 線状にしておいたｐｓＢ１１４と連結した。得られたプラスミドをｐＢｓ１１７ と命名した。このプラスミドｐＢ５１１７で、サツカロミセス・セレビシェ菌株 ＺＹ１００（ａｄｅ２−１０１１ｅｕ２−３１ｅｕ２−１１２ｕｒａ３−５２　 ５ｕｃ２−０９　Ｓａｌ２　ｐｅｐ４：：　ＴＰｌｌｐ−ＣＡＴ）を形質転換し て菌株ＺＢ２１０を作った。プラスミドｐＢｓ１１４を用いて苗株ＺＹ１００を 形質転換して負の対照として菌株ＺＢ２１３を作った。形質転換細胞を最初に− ｔｌＲＡＤｓプレート上でシーした（表２）、個々の形質転換細胞のコロニーを 、−ＬＥＵＤプレートシー画線塗布することによって、クローンを利用して精製 した（表２）。

紅 ５ｇ　Ｌ−アスパラギン酸 ２ｇ　Ｌ−ヒスチジン遊離塩基 ６ｇ　Ｌ−イソロイシン ４ｇ　Ｌ−リシン−モノ塩酸塩 全成分を混合し、次に乳鉢と乳棒を使って混合物が微細に粉砕されるまで粉砕す る。

５ｇ　Ｌ−アスパラギン酸 ２ｇ　Ｌ−ヒスチジン遊離塩基 ６ｇ　Ｌ−イソロイシン ６ｇ　Ｌ−ロイシン ４ｇ　Ｌ−リシン−モノ塩酸塩 ２ｇ　Ｌ−メチオニン ６ｇ　Ｌ−フェニルアラニン 全成分を混合し、次に乳鉢と乳棒を用いて混合物が微細に粉砕されるまで粉砕す る。

６．７ｇ　アミノ酸なしのＹｅａｓｔ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　Ｂａ５ｅ（ＤＩＦＣ ＯＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、米国、ミシガン州、デトロイト） ０．６　ｇ　−ＬｅｕＴｈｒＴｒｐアミノ酸混合物１８　ｇ　寒天 全成分を蒸留水中で混合する。蒸留水を添加して最終容積をＩＬにする。１５分 間オートクレーブ処理を行う、オートクレーブ処理の後１５０ｍ１ｇのＬ−）レ オニンと４０１１ｇのＬ−）リプトファンを添加する。

プレートに注ぎ凝固させる。

−ＬｅｕＴｒ　Ｔｈｒ　？土 ２０　ｇ　グルコース ６．７ｇ　アミノ酸なしのＹｅａｓｔ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　Ｂａ５ｅ（ＤＩＦＣ ＯＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、米国、ミシガン州、デトロイト） ０．６　ｇ　−ＬｅｕＴｈｒＴｒｐアミノ酸混合物全成分を蒸留水中で混合する 。蒸留水を加えて最終容積をＩＬにする。　１５分間オートクレーブ処理を行う 、オートクレーブ処理を行った後１５０１ｇのＬ−１−レオニンと４０ａのＬ− ）リブトファンを添加する。

６．７ｇ　アミノ酸なしのＹｅａｓｔ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　Ｂａ５ｅ（ＤＩＦＣ ＯＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、米国、ミシガン州、デトロイト） ０．６　ｇ　−ＵｒａＴｈｒＴｒｐアミノ酸混合物１８２．２　ｇソルビトール １８　ｇ　寒天 全成分を蒸留水中で混合する。蒸留水を添加して最終容積をＩＬにする。１５分 間オートクレーブ処理を行う、オートクレーブ処理の後１５０［のＬ−）レオニ ンと４０■のＬ−）リプトファンを添加する。

プレートに注ぎ凝固させる。

菌株ＺＢ２１０とＺＢ２１３を−ＬｅｕＴｒｐＴｈｒ液体培地中で３０℃にて４ ０時間増殖させた。培養物を５分間遠心分離して使用培地を透明にした。

その使用培地を実施例５に記載したのと同様にして検定した。　ＺＢ２１０由来 の培地は、中位の細胞密度（２〜６ｇ／ｌ乾燥重量）まで増殖した場合、放射線 免疫検定法で測定すると、５〜２０■／■ｌのグルカゴンの当量を含有している ことが見出された。

Ｂ、プラスミドｐＢｓ１２０の構築 デス−旧ｓ’−（ｃｔｕｑ］グルカゴンのコーディング配列をコードする対照の 発現プラスミド（Ｍｅｒｒｉｆｔｅｌｄらの前記文献に記載されている）を合成 オリゴヌクレオチドで構築した。オリゴヌクレオチドのＺＣ３３７８とＺＣ３４ ４３（表１に示す配列ＩＤ　ＮｔｘｌＯと１１）を、５′末端にＢｉｎｄ　ｍ付 着末端が連結され、これに続いてそのＨｋｎｄ’ｆ１部位とＫＦｉＸ２開裂部位 配列との間に１５個の塩基からなる架橋配列が連結され、かつ３′末端にはグル カゴン配列の末端の終止コドンが連結され続いてＥｃｏＲＩ部位とＢｇｌｌＩ付 着末端が連結された、酵母コドン最適化デスＨｉｓ’　（Ｇｌｕ”）グルカゴン コーディング配列を含有するＤＮＡ配列を形成するように設計した。ＺＣ３３７ ８は、未置換のデスー旧ｓ＋−グルカゴンと適切な架橋配列のコーディング配列 を含有する１０７個の塩基からなるオリゴマーである。ＺＣ３４４３は、旧ｎｄ Ｉ［［とＢｇｌｌｌのオーバーハングと、通常グルカゴンの９位に見られるアス パラギン酸残基のコドン中に単一塩基の変化があることを除いてＺＣ３３７８に 対して相補的である。この塩基の変化を導入すれば、デス−Ｈ１ｓ’　（Ｇｌｕ ’）グルカゴンのコーディング配列になるはずである。オリゴヌクレオチドノＺ Ｃ３３７８とＺＣ３４４３をアニールし、ＨｉｎｄＩ［［−ＢｇｌＩＩで線状に されたｐＢ５１１４と連結させた。　ＺＣ３３７８、ＺＣ３４４３、およびｐＢ ｓ１１４（７）連結混合物でイー・コリＨＢＩＯＩを形質転換すると、プラスミ ドクローンの混合物が得られ、そのいくらかはデスー旧ｓｌ−グルカゴンをコー ドし、いくらかはデスー旧ａ’　−［Ｇｌｕ”）グルカゴンをコードする。後者 の１つはＤＮＡ配列決定法が同定し、ｐＢｓ１２０と命名した。

プラスミドｐＢｓ１２０を用いて、サツカロミセス・セレビシェ菌株ＺＹ１００ を形質転換して菌株ＺＢ２１６を作った。

実施例３−グルカゴン類似体のオリゴヌクレオチドライブラリーの構築 グルカゴン類似体のオリゴヌクレオチドライブラリーは、Ｈｕｔｃｈ−ｉｎｓｏ ｎら（前記文献）が報告した方法の改変法を用いて構築した。

要約すると、通常は塩基Ａ、Ｇ、ＣおよびＴに対応する純粋の４種のホスホルア ミダイト溶液を含有する溶液が各々、上記の全塩基に対応するホスホルアミダイ トの少量で汚染されるように故意に交差汚染されたホスホルアミダイト溶液を用 いて、オリゴヌクレオチドを合成した。この交差汚染は、下記の量の乾燥アセト ニトリルを密閉びんに添加することによって、前記４種の各ホスホルアミダイト の１．０ｇを０．１３Ｍの濃度で再懸濁させて行った（Ａ、　１１．８＋ｓｌ　 ；Ｇ、　１２．１ｍｌ；Ｃ，１２，２ｇ＋１；およびＴ、１３．７ｍ１）　、各 びんから続はテｏ、１７−１づつを３回取出して、他の３種の各試薬に添加した 。このプロセスが順次行われることから起こる少量の逆汚染（ｂａｃｋ　ｃｏｎ ｔａｍｉｎａｔｉｏｎ）を起こさないようにして（上記のびんは、上記の現象を 最少限にするために、すべての移しかえを行った後にしか撹拌しない）、溶液は 、ホスホルアミダイトの全濃度を０．１３Ｍに計算した。その組成を表３に示す 。

麦ｌ Ａ”　、Ｇ”　、Ｃ”およびＴ０ホスホルアミダイト溶液の組成。

Ａ”　Ａが９５．７％ならびにＣ，ＣおよびＴが各々１．４３％Ｇ“　Ｇが９５ ．８％ならびにＡ、ＣおよびＴが各々１．４％Ｃ”　Ｇが９５．８％ならびにＡ 、ＧおよびＴが各々１．４％Ｔ”　Ｔが９６．３％ならびにＡ、、ＧおよびＣが 各々１．２３％グルカゴンｉ４Ｒ体のオリゴヌクレオチドライブラリーは、類似 体のコーディング配列の５′末端が、ＫＥＸ２部位をコードする配列を介してα 因子プレプロ配列にインフレームで連結されるように、挿入断片を発現ベクター に指向的に挿入可能にする配列を両端に連結された、一連のグルカゴン類似体を コードする一セットのＤＮＡセグメントを、アニールしたときに形成するように 設計した。グルカゴン類似体のライブラリーのセンス鎖は、−セットの２つのオ リゴヌクレオチドのプールとして合成した。第一のオリゴヌクレオチドプールは 、５６のヌクレオチドからなるオリゴマーを含有していたが、このオリゴマーは 、５′末端に、Ｈｉｎｄｌ［［付着末端；およびそのｔｌｉｎｄ１部位とα因子 プレプロ因子配列のＫＥχ２開裂部位との間の架橋配列をコードする１５のヌク レオチドからなる突然変異が誘発されていない配列を有し、続いて天然のグルカ ゴン配列に対して前記の比率の正しいホスホルアミダイトと正しくないホスホル アミダイトの混合物で合成した４１のヌクレオチド〔図２のヌクレオチド１から ヌクレオチド４１まで（配列ＩＤｋｌ））を有するように合成した。

第２のオリゴヌクレオチドプールは、５４のヌクレオチドからなるオリゴマーを 含有していたが、このオリゴマーは、３′末端に、突然変異を誘発されていない １つの塩基と、これに続いて天然のグルカゴン配列に対して前記の比率を用いる 正しいホスホルアミダイトと正しくないホスホルアミドの混合物で合成された４ ５のヌクレオチド〔図３のヌクレオチド４３〜８７（配列ＩＤＮＩＩＬＩ））を 有し、さらに５′末端には、終止コドンとこれに続＜　ＥｃｏＲＩとＢｇｌｌｌ の制限部位をコードする配列をコードする８個のヌクレオチドからなる突然変異 が誘発されていない配列が続いている。Ａ、Ｇ、ＣおよびＴの残基の数と、上記 の計算された汚染レベルが与えられると、その凝集塩基の置換率は４．１％と計 算され、１コーディング配列当り平均３．５２の塩基が置換されている。

上記オリゴヌクレオチドを通常の方法で脱保護し精製した後、第２のオリゴヌク レオチドプールをＡＴＰと丁４ポリヌクレオチドキナーゼで処理して、そのオリ ゴマーの５′末端にリン酸基を付加した。

次に両オリゴヌクレオチドブールの等モル量を混合し、アニールしてアンチセン スオリゴヌクレオチドＺＣ３０２１にしく表１の配列１０　Ｎ１１９）とし、次 いで得られたアダプターを単離した。プラスミドｐＢｓ１１４をＨｉｎｄｎ［と Ｂｇｌ　ＩＩで消化して線状にし次いでゲルで精製した。上記の単離したオリゴ ヌクレオチドのアダプターを線状にされたｐＢ３１１４に連結し、ＢｆｏＲａｄ エレクトロポレーションユニット（ＢｉｏＲａｄ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｉｅｓ 社、米国、カリフォルニア州、リッチモンド）を使用して、上記連結混合物で、 エレクトロポレーション怒応性イー・コリ菌株ＤＨＩＯＢ細胞（ＧＩＢＣＯＢＲ Ｌ社、米国、メリーランド州、ゲイサーズバーグ）を形質転換した。形質転換細 胞はアンピシリンを含有するＬＢプレシー上で選択した。

５０個の形質転換細胞から製造したプラスミドＤＮＡを、制限酵素消化法で分析 して、挿入断片を有するクローンの比率を測定して突然変異頻度を推定した。５ ０個のプラスミドはすべて挿入断片を含有していた。突然変異頻度は、Ａｓｐ７ １ＢまたはＰｓｔｌとＸｈｏ　Ｉの混合物で消化することによって推定した。そ の突然変異を誘発されていない配列はＡｓｐ７１８とＸｈｏ　Ｉの部位の両方を 含有していたので、そのプールに見られる突然変異のサブセットは、プラスミド ＤＮＡの消化パターンのシフトとして検出することができた。５０のクローンの うち７つは野生型配列中に存在するＸｈｏ　Ｉ部位を欠いており、かつ３つのク ローンがＡｓｐ７１８部位を欠いていた。各塩基の汚染レベル、Ａｓｐ７１Ｂと Ｘｈｏ　Ｅの部位の塩基の分布、およびプール中の塩基の置換は、イー・コリに クローン化されたときに除去修復によって修正されねばならないこと（各塩基の 置換は野生型塩基と対になっている）が与えられたとき、Ａｓｐ７１８部位を欠 いている６つのクローンとＸｈｏ　Ｉを欠いている６つのクローンが試験された ５０のクローン中に存在すると予測された。観察された数値は上記の予測と有意 差はないが、突然変異の全頻度は予想よりわずかに低かった。

また突然変異の頻度は、無作為に選択した１２のクローンのグルカゴンコーディ ング領域のＤＮＡ配列を決定することによって測定した。

したがって合計１０３２　（８６Ｘ１２）の突然変異誘発塩基を突然変異につい て試験した。２８の塩基の変化が見出されたがこれは全体に対して２．７％の比 率である。この数値は、塩基置換率と、除去修復の５０：５０の可能性が与えら れたときに予想される数値（２，１％）より幾分高いが恐らく統計的に有意では ないであろう、１２の配列中の突然変異の分布は、配列中の２つは野生型で、３ つの配列は１つの塩基が変化し、４つの配列は３つの突然変異を有し、２つの配 列は４つの突然変異を有し、１つの配列は５つの突然変異を有するという分布で あった。ポアソン分布と、１コーディング配列当りの突然変異数の実測平均値２ ．３とを用いて、０．１．２．３．４および５の突然変異を有するコーディング 配列がそれぞれ９．７％、２２．５％、２６．７％、２４．２％、１３．３％お よび６．３％の頻度で起こると予想することができる。その実測数値は、突然変 異がＯもしくは〉２のクローンが過度に示されている場合があることを除いて、 上記の予測値とかなりよく一致している。このことは、除去修復プロセスでは個 々のミスマツチ塩基を修正するのではなくて、ＤＮＡのセグメントに対する鋳型 として１つのストランドを使うことを反映している。

残りのＤＨ１０８（登録商標）形質転換細胞（合計約１０，０００のコロニー） を、形質転換プレートから洗い出してプールした。得られた細胞懸濁液の一部を 使って、ＬＢ＋アンピシリン２５０ｍ１に接種し、空気浴振とう機で３７℃にて 一夜インキユベートした。上記の一夜培養物からプラスミドＤＮＡを製造し、そ のＤＮＡを使用して、前記のニス・セレビシェＺＹ１００を形質転換した。コロ ニーを一〇ＲＡＤＲ（表２）中で選択した０個々のＵＲＡ＋コロニーを−ＬＥＵ Ｄプレート（表２）上に画線塗布した。１つの単離したコロニーを各画線部から 選択し、貯蔵用に１プレート当り９６のセットで、第２の−ＬＥＵＤプレートに バッチした。

各々はソ９６のコロニーを保持する合計２２枚のプレートを収集した。

−ＬＥＵ　ＴＲＰ　Ｔ１（１？液体培地（表２）２００〜３００μｌを、滅菌状 態で、９６ウエルの微量滴定プレートの各ウェルに移し入れた。各ウェルに、前 記−ＬＥＵＤプレートからのパッチ物の１つから得た酵母を接種し、次にその微 量滴定プレートを３０℃にて４０〜４８時間インキュベートして前記酵母を増殖 させた。インキュベートした後、そのプレートを５分間遠心分離して、酵母ブロ スを透明にした。その透明化ブロスを実施例５に記載されているのと同様にして 検定した。

ｃＡＭＰの産生量が最も低かった約５％の菌株を、再試験するのに選択した。こ の再試験は、実施例５に記載されているように、外因性グルカゴンがある場合と ない場合について、２回づつ、アデニル酸シクラーゼの活性に対する培養物ブロ スの作用を検定する試験である０例えばＺＢ２１０のような、活性グルカゴンを 作る菌株由来のブロスは外因性グルカゴンが存在しない場合でもアデニル酸シク ラーゼの活性を刺激するが、アンタゴニストまたは不活性のグルカゴン類似体を 作る菌株由来のブロスはバックグランド以上に刺激を与えることはない、再テス トを行ったところ、Ｐ２Ｏと命名された１つの菌株だけが一貫してＺＢ２１３の 対照よりもｃＡＭＰの産生量が少なかった。

図３は、Ｐ６０由来の培養ブロス、およびデス−Ｈ１ｓ’−グルカゴンとデスー 旧ｓ’　−（Ｇｌｕ”）グルカゴンを作る対照菌株由来の培養ブロスの存在下で の、３種の濃度のグルカゴンに対するラット肝臓膜のｃＡＭＰ応答を示す０図３ は、Ｐ２Ｏが、実験誤差の範囲内で、デスー旧ｓｌ−グルカゴンと同等の優れた アンタゴニストであることを示している。この酵母菌株からプラスミドを回収し てそのＤＮＡ配列を分析したところ、この菌株が発現した類似体が（Ｓｅｔ’） −グルカゴンであることが分かった。また上記酵母の形質転換体から製造したプ ラスミドＤＮＡを用いてニス・セレビシェ菌株ＺＹ１００を形質転換して、公知 の配列の類似体をコードするプラスミドを含有する形質転換体を得た。　（Ｓｅ ｒ’）−グルカゴンをコードするプラスミドを含有するＺＹｌｏｏの形質転換体 （Ｐ２Ｏ）には単離番号ＺＢ３１２が与えられた。

第２ラウンドのスクリーニングを、グルカゴン類似体を産生ずる酵母菌株のライ ブラリーに対して実施した。各々９６のコロニーを有する１０枚の追加のプレー トを集めて、先に述べたのと同様にしてスクリーニングした。異なる試験で得た 測定値は、対照菌株（ＺＢ２１０およびＺＢ２１３）について観察された応答に したがって正規化した。

９６０個のクローンはすべて、アンタゴニストの活性にしたがって格付けし、Ｚ Ｂ２１３よりｃＡＭＰ値が小さいクローンを再スクリーニングするために選択し た。再スクリーニングは、新しい培養物を増殖させ、その培養プロスを、５ｎＭ のグルカゴンの存在下、アデニル酸シクラーゼの活性について２回づつ検定する ことによって行った。２回の検定の試験結果を平均してＺＢ２１３で得た値と再 び比較した。このとき１４個の菌株しか対照に比べて改善された活性をもってい なかった。

次にこれら１４個の菌株は、Ｐ２Ｏについて先に述べたのと類似の試験で検定し た。すなわち菌株由来の培養ブロスは０．４および８ｎＭのグルカゴンの存在下 で検定した。４個の菌株がＺＢ２１３で得たのと有意差がない値を与えたのでそ れ以上検討しなかった。プラスミドを残りの菌株から回収して、ＤＮＡ配列分析 を行った。配列分析のために作ったプラスミドＤＮＡで菌株ＺＹ１００を形質転 換した。これらの形質転換細胞には、−認識番号を与えて、それらが公知の配列 を有する、グルカゴンアンタゴニストをコードするプラスミドＤＮＡを含有する ことを示した。この配列分析の結果は、２つの菌株が同一の突然変異体のグＢｖ 力’：ｆ７を含有し、ＢＢ２５、ＢＢ６４、ＢＢ６５、ＦＦ２１、ＦＦ３０．　 ＦＦ９３．０８３３、ＣＣ２９およびＦＩＨ６３それぞれに対応する追加の９つ の独立のクロー７：　ＺＢ３１５、ＺＢ３１６、ＺＢ３１７、ＺＢ３１８、ＺＢ ３１９、ＺＢ３２０．　ＺＢ３２１、ＺＢ３２２およびＺＢ３２３を出すことを 示した（表４）。

ｌエ グルカゴンアン　ゴニスト ”　ＺＢ３０７が産生ずるグルカゴンアンタゴニストはＢ６が産生するアンタゴ ニストと同一である。

”　ＺＢ３１４が産生ずるグルカゴンアンタゴニストはＤ４５が産生ずるアンタ ゴニストと同一である。

””　ＺＢ３２３が産生ずるグルカゴンアンタゴニストは、Ｃ末端エクステンシ ゴン：　Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−５ｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ− Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−１１ｅ−Ａｓｎ−１１ｅ−１１ｅ−１１ｅを含有している。

実施例４−デスーＨ１ｓ’−グルカゴン類似体のオリゴヌクレオチドライブラリ ーの構築 両方のストランドが突然変異誘発されることを除いて、実施例３に記載のグルカ ゴン類似体オリゴヌクレオチドライブラリーと同様にして、デスー旧ｓ１−グル カゴン類似体オリゴヌクレオチドライブラリーを構築した。デスー旧ｓｌ−グル カゴン類似体をコードするＤＮＡ配列の５′末端がにＥＸ２の開裂部位の配列を 介してα因子プレプロ配列にインフレームで連結されるように、発現ベクターに 指間性挿入を行える配列を両端に連結された上記類似体をコードする一連のＤＮ Ａ配列を提供するために、−セットの４つの合成オリゴヌクレオチドのプールを 設計した。

デスー旧ｓｌ−グルカゴン類似体ライブラリーのアンチセンスストランドは、オ リゴヌクレオチドの２つのプールの１セツトとして製造した。第１のオリゴヌク レオチドのプールは、６１個のヌクレオチドからなるオリゴマーを含有し、この オリゴマーは、３′末端から、α因子プレプロ配列のＨｉｎｄｌｆｆ部位と、Ｋ ＥＸ２開裂部位の配列とを架橋する配列に相補性の１１個のヌクレオチドからな る突然変異が誘発されていない配列と、これに続いて、天然のグルカゴンの配列 のアンチセンス鎖に対して９７：１：１：１の比率の正しいホスホルアミダイト と正しくないホスホルアミダイトの混合物で合成された５０個のヌクレオチドＣ 図２のヌクレオチド４〜ヌクレオチド５３までのヌクレオチド（配列ＩＤＮｃｉ ｌと２）〕を含有するよう合成した。

第２のオリゴヌクレオチドブールは、４６個のヌクレオチドからなるオリゴマー を含有し、このオリゴマーは、末端に突然変異を誘発されていない１つの塩基を 育し、これに続いて、天然のグルカゴン配列のアンチセンス鎖に対して９７：１ ：１：ｌの比率の正しいホスホルアミダイトと正しくないホスホルアミダイトの 混合物で合成した３３個のヌクレオチドＣ図３のヌクレオチド５５からヌクレオ チド８７までのヌクレオチド（配列ｒｏｍｌ））を有し、さらに５′末端に、１ ２のヌクレオチドからなる突然変異を誘発されていない配列が続き、その配列が 、ＥｃｏＲＩとＢｇＩｌｌの制限部位を含有する配列が続く終止コドンと相補性 の配列を含有するように合成した。

またデスーＨ１ｓ’−グルカゴン類似体ライブラリーのセンス饋はオリゴヌクレ オチド配列の２つのプールの一セットとして製造した。

第１のオリゴヌクレオチドプールは５４個のヌクレオチドからなるオリゴマーを 含有し、このオリゴマーは、５　’　Ｈｉｎｄｕ付着末端と、これに続く、Ｈｆ ｎｄｌｌｒ部位と、α因子プレプロ配列のＫＦｉＸ２開裂部位の配列との間の配 列を含む２０のヌクレオチドからなる突ｐ８Ｒ異が誘発されていない配列、さら に天然のグルカゴン配列に対して９７＝１＝１：１の比率の正しいホスホルアミ ダイトと正しくないホスホルアミダイトの混合物で合成した３８個のヌクレオチ ド〔図３のヌクレオチド４〜ヌクレオチド４１（配列ＩＤＮＩＩＩ））が続く配 列を含有するように合成した。

第２のオリゴヌクレオチドブールは４６個のヌクレオチドからなるオリゴマーを 含有し、そのオリゴマーは、３′末端に突然変異を誘発されていない１つの塩基 を有し、これに続（、天然のグルカゴンの配列に対して９７：１：１：１の比率 の正しいホスホルアミダイトと正しくないホスホルアミダイトの混合物で合成し た４５個のヌクレオチド〔図３のヌクレオチド４３〜８７（配列ＩＤＮ［Ｌｌ） ）、さらに続いてＥｃｏＲＩとＢｇｌＩＩの制限部位が続く終止コドンを含有す る５′末端における８個のヌクレオチドからなる突然変異が誘発されていない配 列を含有するように合成した。

上記の４種のオリゴヌクレオチドブールは、実施例３に記載されているようにし て、アニールし、連結し、次いで形質転換するのに用いた。得られたデス−Ｈｓ １−グルカゴン類似体オリゴヌクレオチドライブラリーでサツカロミセス・セレ ビシェ菌株ＺＹ１００を形質転換して、サツカロミセス・セレビシェのライブラ リーを上記のようにして製造した。

デスー旧ｓ１−グルカゴンブールからの１つの単離体の配列を決定して、デスー 旧３１−グルカゴンをコードすることを確認した。このプラスミドを用いてサツ カロミセス・セレビシェ苗株ＺＹ１００を形質転換して菌株ＺＢ１１７を作った 。ｌＩ株ＺＢ１１７は未修飾のデス−Ｈｓｌ−グルカゴンを製造するのに用いる 対照菌株として利用した。

デスー旧３′−グルカゴンオリゴヌクレオチドライブラリーからプールしたプラ スミドＤＮＡで形質転換した約９００個の個々の酵母クローンを実施例３に記載 したようにしてスクリーニングした。これらの酵母クローンの約３５％から得た ブロスは、ＺＢ２１３　（グルカゴンなし）対照に比べてｃＡＭＰの産生が少な （なった、しかし、デス−Ｈ１ｓ’−グルカゴンはそれ自体が弱いアンタゴニス トなので、より厳格なスクリーニング基準を使用した。平均量より１標準偏差以 上にｃＡＭＰの産生量を減少させたデスー旧ｓｌ−グルカゴン類似体を産生じた クローン（全合計の約２０％）を選択して再スクリーニングを行った。この再ス クリーニングを行ったブロスは２回づつ検定してその試験結果を平均した。これ らの再スクーリングを行ったクローンの約１／４は、デス−Ｈｓｌ−グルカゴン を産生ずる対照菌株のＺＢ２１７よりアデニル酸シクラーゼ活性を刺激する作用 が低いデスーＨ１ｓ’−グルカゴン類似体を一貫して産生じたが、これをさらに 分析するために選択した。上記のさらに分析するために選択した酵母菌株からプ ラスミドＤＮＡを製造した。このプラスミドＤＮＡをＤＮＡ配列分析に付してニ ス・セレビシェ菌株ＺＹ１００を形質転換するのに使用した。グルカゴンアンタ ゴニストをコードする、公知配列のプラスミドを含有する形質転換細胞には単離 番号を与えた（表４）。

第２ラウンドのスクリーニングを、上記の変異体デス−旧３＋−グルカゴン類似 体ライブラリーに実施した。単離番号ＺＢ３２４〜ＺＢ３２８（表４）を与えら れた５つの追加のクローンは、デス−Ｈｓｌ−グルカゴンを産生ずる対照菌株Ｚ Ｂ２１？よりもアデニル酸シクラーゼを刺激する作用が低いグルカゴン類似体を 産生ずることが確認された。

その外に実施例５に記載した応答曲線のタイプに関する試験を行ったが、この試 験では、３種の濃度のグルカゴンに対する肝細胞膜のアデニル酸シクラーゼの応 答を阻害するのに用いた。デス−Ｈ１ｓ’−グルカゴンより一層有効なアンタゴ ニストであるグルカゴン誘導体を産生ずる少なくとも１０種の酵母クローンをこ れらの試験で同定した。使用した酵母のブロスの量を、グルカゴンの放射線免疫 検定法でその免疫反応性に対して正規化したところ、いくつかのクローンは、Ｚ Ｂ２１６で製造したデスー旧ｓ’　−（Ｇｌｕ’）−グルカゴン類似体より一層 有効なアンタゴニストを作るようである。これらのアンタゴニストを表５に示す ０図４は、Ｂ６とＪ１５由来の培養ブロス、およびデス−Ｈ１ｓ’−グルカゴン とデスー旧ｓ’　−（Ｇｌｕ”）グルカゴンを作る対照菌株由来の培養ブロスの 存在下、３種の濃度のグルカゴンに対するラットの肝臓膜のｃＡＭＰ応答を示す ０図４は、Ｂ６とＪ１５が、デス−Ｈ１ｓ’−グルカゴンとデスー旧ｓ　＋　− （Ｇ　１　ｕ”　）グルカゴンの両方に比べてより優れたアンタゴニストである ことを示している。

表５ デス−Ｈ１ｓ’　−［Ｇｌｕ”　）グルカゴンデス−旧ｓ’　−（Ａｌａ”　） グルカゴンデス−旧ｓ’　−（Ｐｒｏ’−５ｅｒ”　）グルカゴンデス−旧ｓ’ −（Ｉｌｅ’）グルカゴンデス−旧ｓ’　−（Ｇｌｕ”−Ｐｈｅ”　）グルカゴ ンデス−Ｈ１ｓ’　−（Ｓｅｔ”　）グルカゴンデス−旧ｓ’　−（Ａｓｎ”− Ｐｈｅ”　）グルカゴンデス−）Ｉｔｓ’　−（Ａｌａ”）グルカゴンデス−Ｈ １ｓ’　−（Ｇｌｕ”　−３ｅｔ”　）グルカゴンデス−Ｈ１ｓ’　−（Ａｓｎ ’）グルカゴンデス−Ｈ１ｓ’　−（Ｓｅｔ’）グルカゴンデス−Ｆｉｔｓ’　 −（Ｔｈｒ”）グルカゴン実施例５−グルカゴンアンタゴニストのスクリーニン グ検定。

Ａ、ラット肝臓膜の調製 若い雌のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを用い、特にＮｅｖｉｌｌｅ（前 記文献）によって報告されてＰｏｈｌら（前記文献）が改変した方法を用し）て 肝ｉＩ膜を調製した。６０〜１００　ｇの肝臓を与える１０〜１５頭のラットを １バッチ当り処理した。これらのラットを頚部脱臼によって安楽死させた後、そ の肝臓を外科手術で取出して、できるだけ速く、氷で冷却したビーカーに移した 。はさみを用いて肝臓の組織を、大きさが約３〜６ｍの断片に切り刻んだ、存在 している結合組織を除去した。

約３００ｇ／ｌの濃度の水冷した１蒙阿の炭酸水素ナトリウム溶液中に、上記の 切り刻んだ組織を懸濁させた。この懸濁液を、組織ホモジナイザーにて８ストロ ークのルーズペストル（ｌｏｏｓｅ　ｐｅｓｔｌｅ）でバッチ式で処理した。得 られたホモジネートに、氷冷した１１炭酸水素ナトリウム溶液を追加して混合し 、最終濃度を約４０〜８０ｇ／ｌにした。得られた希釈ホモジネートを少なくと も３分間撹拌した後、２重層のチーズクロスで濾過した。濾液を４層のチーズク ロスで再濾過して遠心分離びんに移し、４℃にて３０分間１５００Ｘｇで遠心分 離した。

遠心分離を行った後、できるだけ多量の上澄み液を注意深くデカントして廃棄し 、ペレットを、清浄な組織ホモジナイザー中、３ストロークのルーズベストルで 残りの上澄み液中にゆるやかに再懸濁させた。再懸濁上澄み液の容積を水を用い て７２−１に調節し、次いで６９％（Ｗ／Ｗ）スクロース溶液９３■１を添加し て、４４％スクロース溶液の膜！！ｉ！濁液１６５ｍ１を得た。充分混合した後 、スクロースの濃度を屈折計で測定し、６９％のスクロース溶液または水で、４ ３．９％〜４４．１％のスクロース濃度（１，４０７６〜１．４０８０の屈折率 に対応する）に調節した。

この調節した懸濁液を６つの１　’　Ｘ　３．５’の硝酸セルロースチューブに 分配し、次に４２．２％〜４２．４％のスクロースの濃度（１，４０４２〜１． ４０４６の屈折率に対応する）に予め調節した新しいスクロース溶液で上面を覆 って満たし平衡状態にした。その試料を、Ｂｅｃｋｍａｎ　５Ｗ２Ｂスイングパ ケット超遠心分離ローターで、２５　、０００ｒｐ−にて４℃で１５０分間遠心 分離した。

精製された膜を、チューブの頂部メニスカスに浮いている層として回収した。そ の膜を、スプーン形のスバチラですくいとるか、または１Ｂゲージの針を通じて シリンジ中に吸引によって取出した。上記の膜を、１８ゲージもしくは２０ゲー ジの針を通じて１０〜２５ｍ１シリンジへ吸引し該シリンジから排出することに よって、１腸−炭酸水素ナトリウム溶液１０■ｌ中に再懸濁させた。再懸濁させ た後、膜を、１ｍＭ炭酸水素ナトリウム溶液６０〜８０■ｌを添加することによ って洗浄し、次いで高速遠心分離器で１５．００Ｏｒｐｍにて遠心分離した。上 澄み液を廃棄し、次いでペレットを１層Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液中に再懸濁さ せ、プールして、約５〜１０−１の濃縮肝細胞膜液を得た。この膜製剤を等分し て一８０℃で凍結し６か月間まで貯蔵した。

この膜製剤のタンパク質濃度は、膜製剤１０〜２０ｕｌを、ＬＭ　ＮａＣ１，０ ，１７Ｍ　リン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）緩衝液で１００倍に希釈することに よって測定した。この溶液の緩衝液に対する吸光度を、ＩＣ１１の石英製キュベ ツト中で２２４１−と２３６．５ｎ−の波長光で、ＵＶ分光光度計を用いて測定 した。タンパク質の濃度は、下記の式：％式％（１００） にしたがうて計算した。

Ｂ、アデニル酸シクラーゼ反応： アデニル酸シクラーゼ検定は、最初に、マイクロモルの濃度で阻害剤を含有して いる可能性がある試料（例えば酵母ブロス）５μＩを、９６ウ工ル微量滴定プレ ートの各ウェルに添加して行った。溶液Ａ（表６　）　２．５ｍｌを溶液Ｂ（表 ６　）　２．５ｍｌと混合することによってＡ＋Ｂ溶液を作製した。Ａ＋Ｂ溶液 ５０μｌを“グルカゴンなし”の各対照ウェルに添加した。グルカゴンを、“Ｇ ”溶液から残りのＡ＋Ｂ溶液へ、ｌ×１Ｏ−１Ｈの濃度まで添加した（その結果 、最終検定濃度は５Ｘ１０−”になる）、Ａ＋Ｂ＋グルカゴン溶液５０μｌを、 “グルカゴンなし”の対照を除く各ウェルに添加した。膜製剤を、水を用いて、 約２■／ｍｌタンパク質の濃度まで希釈した０反応は、希釈膜製剤４５−１を各 ウェルに添加することによって適切に開始された。得られた被検定物を室温で１ ２分間インキュベートし、希釈膜製剤を添加したのと同様にして、５ｔｏｐ　Ｍ ｉＸ　１００μ夏を各ウェルに添加して反応を停止させた。検定混合物を遠心分 離によって透明にし、得られた被検定物を４℃で貯蔵した。

ｌ旦 試薬の処方 痘丘人 １００ｍＭ　）リスＨＣＩ　ｐｉ＋’７．６２０ｍＭ　Ｍｇ（：ｂ ０．４％Ｂ５Ａ ４＠／ｍｌ　タレアチンホスホキナーゼ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ ｍｐａｎｙ）望瓜旦 ４ｍＭ　ＡＴρ ２０＋ｗＭ　ＧＴρ ４ｍＭ　イソブチル−１−メチル−キサンチン（ＩＢＸ；Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍ ｉｃａｌＣｏ、） ４　ｍＭ　ＥＤＴＡ １２０　ｍＭ　クレアチンリン酸 ″Ｇ″ １■Ｈグルカゴン 釘並」ハ　゛ １００５Ｍ酢酸 ５０鴎Ｍ　［ＥＤＴＡ Ｃ，サイクリックＡＭＰの検定 サイクリックＡＭＰの濃度を、Ａｍｅｒｓｈａｍ　５ｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ 　ＰｒｏｘｉｍｉｔｙＡｓｓａｙ　Ｋｆｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、米国、イリノ イ州、アーリントン・ハイツ）を用いて測定した。要約すると、各アデニル酸シ クラーゼ反応物から採取した１０μｌを別々のベータプレートウェルに添加した 。各試料を５０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液６５μｌで希釈した。サイクリックＡＭ Ｐ標準液を０．０．１．６Ｘ１０−”オヨび６．４Ｘ１０−’Ｍ　’？’調製し たが、あるいはＡ■ｅｒｓｈａｓキットで提供される“非アセチル化標準物”か ら調製してもよい。各標準液７５μｌの３つの標準液を個々のベータプレートウ ェルに添加した。非特異的結合（ＮＳＢ）の対照を、３つのベータプレートウェ ルに５０■阿酢酸ナトリウム溶液１５０μｌを添加することによって調製したｅ 　’　”　ｒ　−ｃＡＭＰ　（約０．４５ｓＣｔ／ｍｌ）　７５μｌを各ウェル に添加し、続いて、希釈したウサギ抗スクシニルｃＡＭＰ抗血清（メーカーの指 示にしたがって５（１＋＋Ｍ酢酸ナトリウム溶液で希釈した）７５μｌを、ＮＳ Ｂ対照を除く各ウェルに添加した０次に希釈した抗つサギＳＰＡ試薬７５μｌを 各ウェルに添加し、そのプレートをシールし、振とうしながら室温で一夜インキ ユベートした。そのプレートを、ベータプレートカウンターで１試料当り１分間 カウントした。　ＮＳＢ対照と標準液について平均カウント数を計算した。標準 液と試料についての応答百分率を下記式を用いて決定した。

％Ｒｘ　＝　（ＣＰＭ　ＣＰＴｏｓｍ　）　／　（ＣＰＭｏ、　ｔｒ　ＣＰＭｓ ｓ＊）こ−で％Ｒｘ−与えられた試料もしくは標準液の応答百分率。

ＣＰＭ　＝試料のカウント数 ＣＰＭＮｓｍ　＝　ＮＳＢ対照の平均カウント数ＣＰＭ。、。＝Ｏ，ＯＭ標準液 の平均カウント数与えられた試料に対するｃＡＭＰの相対濃度は下記式を用いて 決定した。

（ｃＡＭＰ）　ｘ　＝１．６ｅ”４（％貢ト％１１．６１／（％ｌ＆、４−％１ １．６）ニーで（ｃＡＭＰ）　ｘ−与えられた試料の相対濃度％Ｒｘ＝与えられ た試料の応答百分率 ％Ｒ１，＆＝　１．６Ｘ１０−’Ｍ標準液の応答百分率％Ｒｈ、ａ−６，４Ｘ１ ０−”Ｍ標準液の応答百分率潜在アンタゴニストは、ラットの肝臓膜のアデニル 酸シクラーゼをグルカゴンが刺激するのを阻害するアンタゴニストとして同定し た。したがって、グルカゴンを産生じない対照菌株（ＺＢ２１３）由来のブロス が入っているウェルより存意に少ないｃＡＭＰが入っている検定ウェルは、アン タゴニスト活性を有するグルカゴン類似体を産生ずる酵母菌株に対応しているは ずである。対照と変異体菌株について得られる値の変動度は比較的高いので、所 定のプレート上のすべての試料について、ｃＡＭＰの平均値を計算し、この平均 値より有意に小さい値に対応する酵母菌株をさらに試験するために選択した。

実施例６−合成ペプチドのグルカゴンアンタゴニスト。

ペプチドの、（Ｓｅｔ’　］グルカゴン、デス−Ｈ１ｓ’　（Ｓｅｔ’）グルカ ゴン、デスー旧ｓ’　−（Ｇｌｕ”　）グルカゴン、デス−Ｈ１ｓ’　−（Ｓｅ ｔ”雫〕グルカゴン、デスー旧ｓ”　−（Ａｌａ”　）グルカゴンおよび（Ａｓ ｐ’　−Ａｌａ”−Ｔｉｅ’）グルカゴンを、メーカーが指示する標準サイクル と、特にＣａｒｐｉｎｏａ　Ｒａｎが報告している（Ｊ、Ａｍｅｒ、Ｃｈｅｍ、 Ｓｏｃ、７２巻：　５７４８〜５７４９頁１９７０年；　Ｊ、Ｏｒｇ、Ｃｈｅｓ 、　３７巻：　３４０４〜３４０９頁１９７２年）　Ｆｍｏｃ化学を利用し、Ａ ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｓｓ社（米国、カリフォルニア州、ホスター・ シティ）のＭｏｄｅｌ　４３１Ａペプチド合成器を用いて合成した。

未充填のＨＭＰ（ｐ−アルキルオキシベンジルアルコール）樹脂を使用した。最 初のアミノ酸は、この樹脂に対称形の酸無水物として結合した。その次のアミノ 酸はＨＯＢｔ活性エステルとして結合した。各結合の後、無水酢酸によるキャッ ピングサイクル（ｃａｐｐｉｎｇ　ｃｙｃｌｅ）を行って欠失ペプチドが生成す るのを最少にした０合成が完了したとき、最後のＦｍｏｃ保護基を除去し樹脂を 乾燥させた０合成中、上記の各結合の後に樹脂の試料を採取した。試料を、メー カーが指示しているとおりにして検定した。最初の試料は樹脂充填の効率を試験 するのに使用した。結合の効率はニンヒドリン検定法を用いて検定した。ペプチ ドは、９５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）溶液を使って樹脂から解離させ、ジエ チルエーテルで沈澱させ、次いで１０％酢酸溶液に再溶解した。ペプチドは、Ｈ ３０／アセトニトリル（両者ともに０．１％ＴＦＡを含有している）勾配液で溶 離するＶｙｄａｃ　Ｃ−４カラム（ＴｈｅＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓ　Ｇｒｏｕｐ 、米国、カリフォルニア州、ヘスバリア）を使用する逆相ＨＰＬＣで精製した。

各ペプチドについて、主要ピーク部分を集め、アミノ酸分析用に試料を採取し、 次いでペプチドを凍結乾燥した。

そのペプチドを、２７８ｎａの波長光でモル吸光係数が８２９０であることに基 づいて１＋＊Ｍの濃度で水に溶解した０次に水で段階希釈することによって、実 施例５に記載したようにしてアデニル酸シクラーゼ活性に対する作用について試 験できる濃度範囲を得た。ペプチドは、単独もしくは２０ｎｍのグルカゴンの存 在下で試験した＊　（Ｓｅｒ’）グルカゴンだけが、グルカゴンを添加しなかっ た場合に、アデニル酸シクラーゼ活性を刺激する作用を示したが、その刺激作用 はわずかであり被検定物の濃度が最高の場合（反応混合物中の最終濃度１０μＭ ）にのみ起こった。合成類似体（［Ｓｅｒ’）グルカゴンを含む）はすべて、グ ルカゴンに対する応答を投与量依存方式で有効に阻害することができた。これら の試験から得たデータはこれらの各類似体の阻害係数（１／Ａ、。）を概算する のに使用し、その係数の値を表７に示した。　■／ａ５゜は、前記応答がアゴニ スト単独によって測定された応答の１／２まで減少するときの阻害剤／アゴニス トの濃度の比率と定義する。

１ＪＬ遵　ル久司 （Ｓｅｒ’）グルカゴン　３５ デス−旧ｓ’　（Ｓｅｒ’）グルカゴン　２５デス−旧”−ＣＡｔａ目）グルカ ゴン　１８デス−旧ｓ’−（Ｇｌｕ”　）グルカゴン　２２デス−旧ｓ’　−（ Ｓｅｒ”　）グルカゴン　３゜（Ａｓｐ’　−Ａｌａ”−１１ｅ’）グルカゴン 　２５配列表 （１）一般情報： （ｉ）出願人ニスミス、ロバート　エイピゴット、ジエイムズ　アール （ｉｉ）発明の名称：グルカゴンアンタゴニストの検出方法（ｉｉｉ）配列の数 ：１１ （ｉｖ）通信住所： （Ａ）受信人：　５ｅｅｄ　ａｎｄ　Ｂｅｒｒｙ（Ｂ）ストリート：　６３００ 　コロンビア・センター（Ｃ）市：シアトル （Ｄ）州：ワシントン州 （Ｅ）国：アメリカ合衆国 （Ｆ　）　ＺＩＰ　：　９８０１４−７０９２（Ｖ）コンピュータが跣取り可能 な形Ｓ：（Ａ）媒体のタイプ：フロッピーディスク（Ｂ）コンビエータ：　ＩＢ ？Ｉ　ＰＣコンパチブル（Ｃ）操作シＸ　チムニ　ＰＣ−００５／　ＭＳ−００ ５（Ｄ）ソフトウェア：　Ｐａｔｅｎｔ　Ｉｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ　１１１．２４ （ｖｉ）本出願のデータ： （Ａ）出願番号：ＵＳ （Ｂ）出願臼： （Ｃ）分類： （ｖｉ）弁護士／弁理士の情報： （Ａ）姓名：マキ、ダビット　ジェイ （Ｂ）登録番号：３１，３９２ （Ｃ）参照／摘要番号：　９９０００８．４１３（＃ｘ）！気通信の情報： （Ａ）電話：　６２２−４９００ （Ｂ）テレファックス：　６８３−６０３１（２）配列１０阻１の情報： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ＝８７個の塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ス、トランデッドネス（Ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）　：二本鎖〔Ｄ）ト ポロジー：ＩＩ状 （ｉｉ　）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ （ｆｊ）仮説（ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ）　：　Ｎ（ｔｖ）アンチ−センス： Ｎ （ｉｘ）特＠： （Ａ）名称／キー：　ＣＤ５ （Ｂ）位置：ｌ・・８７ （Ｄ）他の情報： （ｘｉ）配列の種類：　ＳＥＱ　１＋）　Ｎｌ１ｌ　：（２）　ＳＥＱ　Ｉｎ　 ＮｃＬ２の情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝２９個のアミノ酸 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー−線状 （ｉｉ　）分子のタイプ：タンパク質 （ｘｉ　）配列の種［：　ＳＥＱ　１０８［Ｌ２　：Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｌａ　 Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　Ａｓｎ　 Ｔｈｒ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ麹３の情報 （１）配列の特＠： （Ａ）長さ：２０個の塩基 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ストランデッドネス：−水銀 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｉｉ）分子のタイプ：他の核酸 （ｉｉｉ）仮説二Ｎ （ｔｖ）アンチ−センス：Ｎ （ｖｉ）中間起源： （Ｂ）　りＯ−７：ＺＣ１１５９ （ｘｉ　）配列の種［：　ＳＥＱ　１０１’ｋＬ３　：ＴＴＧＴＣＣＡＡＧＣＴ ＴＡＣＡＣＣＴＴＣ２０（２）　ＳＥＱ　Ｉｌｌ　Ｎｌ１４の情報：（ｉ）配列 の特徴： （Ａ）長さ８８２個の塩基 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ストランデッドネス：−重鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｊ）分子のタイプ：他の核酸 （ｉｊ）仮説：Ｎ （ｉｖ）アンチーセンス二Ｎ （ｖｉ）中間起源： （Ｂ）クローン：　ＺＣ１１９７ （ｘｉ　）配列の種Ｍ：　ＳＥＱ　１０　Ｎｔｘ４　：（２）ＳＥＱＩＤ阻５の 情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝８５個の塩基 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ストランデッドネス二−重鎖 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｉｉ）分子のタイプ：他の核酸 （ｉｉｉ）仮説：Ｎ （ｔｖ）アンチ−センス：Ｎ （ｖｉ）中間起源： （Ｂ）りｏ　−７：　ＺＣ１１９８ （ｘｉ　）配列の種１［：　ＳＥＱ　Ｉｌｌ　Ｎ［Ｌ５　：（２）ＳＥＱＩＤ阻 ６の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ二８４個の塩基 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ストランデッドネス二−重鎖 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｉｉ）分子のタイプ：他の核酸 （ｉｔｉ）仮説：Ｎ （ｉｖ）アンチ−センス：Ｎ （ｖｉ）中間起源： （Ｂ）　’）ｏ−７：ＺＣ１１９９ （ｘｉ）配列の種ＩＩ：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ１１６　：（２）ＳＥＱＩＤ阻７の 情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝８６個の塩基 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ストランデッドネス二−重鎖 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｉｉ　）分子のタイプ：他の核酸 （ｉｉｉ）仮説二Ｎ （ｉｖ）アンチ−センス：Ｎ （ｖｉ）中間起源： （Ｂ）りｏ　−７：　ＺＣ１２００ （ｘｉ　）配列の種ｖ４：　ＳＥＱ　ｒＤ　Ｎ１１７　：（２）ＳＥＱＩＤ阻８ の情報： （１）配列の特徴： （Ａ）長さ８１１０個の塩基 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ストランデッドネス二−重鎖 （Ｄ）トポロジーニー重鎖 （ｉｉ　）分子のタイプ：他の核酸 （ｉｉｉ）仮説二Ｎ （ｔｖ）アンチ−センス：Ｎ （ｖｉ）中間起源： （Ａ）、ライブラリー：　ＺＣ３０２０（ｘｉ　）配列の種＠：　ＳＥＱ　ＩＩ Ｉ　ＮＣＬ８　：（２）ＳＥＱＩＤ阻９の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝１１０個の塩基 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ストランデッドネス：−重鎖 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｉｉ）分子のタイプ：他の核酸 （ｉｊ）仮説：Ｎ （ｉｖ）アンチーセンス二Ｎ （ｖｉ）中間起源： （Ｂ　）　クロー７　：　ＺＣ３０２１（ｘｉ　）配列の種類：　ＳＥＱ　１０ 　Ｎ１１Ｌ９　：（２）ＳＥＱＩＤ阻１０の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ８１０７個の塩基 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ストランデッドネス二−重鎖 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｉｉ　）分子のタイプ：他の核酸 （ｉｉｉ）仮説：Ｎ （ｉｖ　）アンチ−センス：Ｎ （ｖｉ）中間起ｆｌ： （Ｂ　）　りＯ−ン：　ＺＣ３３７Ｂ （ｘｉ）配列の種類：　ＳＥＱ　１０　ＮｃｌＯ：（２）　ＳＥＱ　Ｉｎ　Ｎ［ Ｌｌｌの情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ８１０７個の塩基 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）ストランデッドネス：−重鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ　）分子のタイプ：他の核酸 （ｉｉ）仮説二Ｎ （ｉｖ）アンチ−センス：Ｎ （ｖｉ）中間起源： （Ｂ）クローン：　ＺＣ３４４３ （ｘｉ）配列の種１［：　ＳＥＱ　ＩＤ　１ｔｌｌ　：ＧＡＴＣＴＧＡＡＴ’ｒ 　ＣＡＧＧＴＡＴＴＣＡ　ＴＣＡＡＣＣＡＴＴＧ　ＡＡＣＡＡＡＧＴＣＴ　ＴＧ ＡＧＣＡＣＧＣＣＴＣＧＡＧＴＣＴ`［；　６０ ＡＴＡＣＴＴＡＧＡＧ　ＴＡＴＴＣＡＧＡＧＧ　ＴＡＡＡ（、ＧＴＡＣＣＴＴＧ ＡＧＡＴＣＴＣＴＴＡＴＣＴＡ　１０７浄書（内容に変更なし） Ｆｉｇｕｒｅ　２ 浄書（内容に変更なし） ［グルカゴン］　Ｘ　４０−９　Ｍ 対照　変異体 −一ベトーーＮｏ−類似体　−−→−Ｐ６０＋　ｄｏｓ−ＨＩＳＩ−グルカゴン 　Ｊ１５−−４−ｍ−ｄｏｓ−ＨＩＳＩ−［ＧＬＬＩｇ］−グルカコ′ン　−− ヘトーー日６Ｆｉｇｕｒｅ　４ 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ９２１０　Ｏ３４６ λ　発明の名称 グルカゴンアンタゴニストの検出方法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　ザイモジェネティクス。

インコーホレイティド ４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号（外４名） ６、補正の対象 （１）明細書、請求の範囲及び要約書の翻訳文（２）図面の翻訳文 ７、補正の内容 （１）明細書、請求の範囲及び要約書の翻訳文の浄書（内容に変更なし） （２）図面の翻訳文の浄書（内容に変更なし）８、添付書類の目録 （１）明細書、請求の範囲及び要約書の翻訳文各１通 （２）図面の翻訳文　１通 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号／／　Ｃ１２Ｎ　１／１ ９　７２３６−４Ｂ（Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：８６５） （Ｃ１２Ｎ　１／１９ Ｃ１２Ｒ１：８６５） ＣＯ７Ｋ　９９：３４　８３１８−４Ｈ９９：３６ （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＦＩ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ。

ＫＲ，ＬＫ、　ＭＧ、　ＭＷ、　Ｎｏ、　ＰＬ、　ＲＯ，ＲＵ、　ＳＦＩ （７２）発明者　ピゴット、ジェームズ　アール。

アメリカ合衆国、ワシントン　９８０２１．ボセル、メリディアン　ブレイス　 ウェスト

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．グルカゴンアンタゴニストの存在を検出する方法であって；下記のステップ ： ａ）以下の作用可能に連結した要素：転写プロモーター、分泌シグナル配列、グ ルカゴン類似体をコードするＤＮＡ配列および転写ターミネーターを含んでなり 、かつグルカゴン類似体を発現させることができるＤＮＡ構造体を含有する宿主 細胞を、グルカゴン類似体を発現するのに適した増殖条件下で増殖させ；ｂ）前 記ＤＮＡ配列によってコードされたグルカゴン類似体を前記宿主細胞から単離し ； ｃ）上記の単離されたグルカゴン類似体を、応答経路に連結されたグルカゴン受 容体に結合してその経路を通じて関連する応答を行うことが可能になるのに充分 な条件下と時間で、天然グルカゴンの存在下上記グルカゴン受容体に対して暴露 し；次いでｄ）グルカゴン類似体がグルカゴン受容体に結合することが原因で、 応答経路に対する刺激が、天然グルカゴン単独による応答経路に対する刺激に比 べて低下するのを検出し、その結果からグルカゴンアンタゴニストが存在するこ とを測定する；ステップを含んでなる方法。
2. ２．宿主細胞が、複数のグルカゴン類似体を発現させることができる宿主細胞の プールである請求項１記載の方法。
3. ３．応答経路が、膜結合アデニル酸シクラーゼ応答経路である請求項１記載の方 法。
4. ４．検出するステップが、膜結合アデニル酸シクラーゼ応答経路によるサイクリ ックＡＭＰの産生が減少するのを測定することからなる請求項３記載の方法。
5. ５．グルカゴン受容体が無細胞抽出液中もしくは全細胞中に保持されている膜で ある請求項１記載の方法。
6. ６．宿主細胞が酵母宿主細胞である請求項１記載の方法。
7. ７．グルカゴンアンタゴニストの存在をスクリーニングする方法であって；下記 のステップ： ａ）グルカゴン類似体を発現させることが可能でかつ下記の作動可能に連結され た要素：転写プロモーター、分泌シグナル配列、グルカゴン類似体をコードする ＤＮＡ配列および転写ターミネーターを含んでなるＤＮＡ構造体を各々がもって いる宿主細胞のプールを、グルカゴン類似体が発現するのに適切な増殖条件下で 増殖させ；ｂ）上記ＤＮＡ配列でコードされたグルカゴン類似体を宿主細胞から 単離し； ｃ）上記の単離されたグルカゴン類似体を、応答経路に連結されたグルカゴン受 容体に結合してその経路を通じて関連する応答を行うことが可能になるのに充分 な条件下と時間で、天然グルカゴンの存在下上記グルカゴン受容体に対して暴露 し；次いでｄ）グルカゴン類似体がグルカゴン受容体に結合することが原因で、 応答経路に対する刺激が、天然グルカゴン単独による応答経路に対する刺激に比 べて低下するのを検出し、その結果からグルカゴンアンタゴニストが存在するこ とを測定する；ステップを含んでなる方法。
8. ８．応答経路が、膜結合アデニル酸シクラーゼ応答経路である請求項７記載の方 法。
9. ９．検出するステップが、膜結合アデニル酸シクラーゼ応答経路によるサイクリ ックＡＭＰの産生が減少するのを測定することからなる請求項８記載の方法。
10. １０．グルカゴン受容体が、無細胞抽出液中もしくは全細胞中に保持されている 膜である請求項７記載の方法。
11. １１．宿主細胞が酵母宿主細胞である請求項７記載の方法。
12. １２．グルカゴンアンタゴニストを発現させることが可能でかつ下記の作動可能 に連結された要素：転写プロモーター、分泌シグナル配列、グルカゴンアンタゴ ニストをコードするＤＮＡ配列であって天然グルカゴンの対応するアミノ酸残基 と異なる１つ以上のアミノ酸残基をコードする配列、および転写ターミネーター を有するＤＮＡ構造体を含有する宿主細胞から産生されるグルカゴンアンタゴニ スト。
13. １３．グルカゴンアンタゴニストが、デス−Ｈｉｓ１−〔Ｇｌｕ２１〕グルカゴ ン、デス−Ｈｉｓ１−〔Ｇｌｕ２１−Ｓｅｒ２９〕グルカゴン、デス−Ｈｉｓ１ −〔Ｇｌｕ９−Ｐｈｅ１３〕グルカゴン、デス−Ｈｉｓ１−〔Ｓｅｒ２９〕グル カゴン、デス−Ｈｉｓ１−〔Ｔｈｒ２〕グルカゴン、デス−Ｈｉｓ１−〔Ａｌａ １１〕グルカゴン、デス−Ｈｉｓ−〔ＡＳｎ９−Ｐｈｅ１３〕グルカゴン、デス −Ｈｉｓ１−〔Ｐｒｏ３−Ｓｅｒ２９〕グルカゴン、〔Ｓｅｒ２４〕−グルカゴ ン、デス−Ｈｉｓ１−〔Ａｌａ９〕グルカゴン、〔Ｃｙｓ２〕グルカゴン、デス −２６−２９−〔Ｌｅｕ１６−Ｇｌｙ２１−Ｓｅｒ２２−Ａｒｇ２３〕グルカゴ ン、〔Ｇｌｙ２３〕グルカゴン、デス−Ｈｉｓ１−〔Ｇｌｕ９−Ｈｉｓ２４〕グ ルカゴン、デス−Ｈｉｓ１−〔Ｓｅｒ５〕グルカゴン、デス−Ｈｉｓ１−〔Ａｓ ｎ９−Ｌｅｕ２７〕グルカゴン、デス−Ｈｉｓ１−〔Ｓｅｒ４−Ａｌａ２９〕グ ルカゴン、〔Ｈｉｓ３−Ｓｅｒ４〕グルカゴン、〔Ａｓｐ１−Ａｌａ２−Ｉｌｅ ７〕グルカゴン、〔Ｐｒｏ２〕グルカゴン、〔Ａｓｐ４−Ｓｅｒ５〕グルカゴン 、〔Ａｓｎ１０−Ｔｙｒ２１〕グルカゴン、デス−Ａｒｇ１８，１９−〔Ｌｅｕ １−Ｌｅｕ６−Ａｓｎ１３−Ｔｈｒ１６〕グルカゴン、デス−Ｈｉｓ１−〔Ａｌ ａ４〕グルカゴン、デス−Ｈｉｓ１−〔Ｓｅｒ４〕グルカゴン、デス−Ｈｉｓ１ −〔Ａｓｎ９〕グルカゴン、デス−Ｈｉｓ１−〔Ａｌａ２〕グルカゴン、および デス−Ｈｉｓ１−〔Ｇｌｕ９−Ａｌａ１１〕グルカゴンからなる群から選択され る、請求項１２にしたがって産生されるグルカゴンアンタゴニスト。
14. １４．デス−Ｈｉｓ１−〔Ｇ１ｕ２１〕グルカゴン、デス−Ｈｉｓ１−〔Ｇｌｕ ２１−Ｓｅｒ２９〕グルカゴン、デス−Ｈｉｓ１−〔Ｇｌｕ９−Ｐｈｅ１３〕グ ルカゴン、デス−Ｈｉｓ１−〔Ｓｅｒ２９〕グルカゴン、デス−Ｈｉｓ１−〔Ｔ ｈｒ２〕グルカゴン、デス−Ｈｉｓ１−〔Ａｌａ１１〕グルカゴン、デス−Ｈｉ ｓ１−〔Ａｓｎ９−Ｐｈｅ１３〕グルカゴン、デス−Ｈｉｓ１−〔Ｐｒｏ３−Ｓ ｅｒ２９〕グルカゴン、〔Ｓｅｒ４〕−グルカゴン、デス−Ｈｉｓ１−〔Ａｌａ ９〕グルカゴン、〔Ｃｙｓ２〕グルカゴン、デス−２６−２９−〔Ｌｅｕ１６− Ｇｌｙ２１−Ｓｅｒ２２−Ａｒｇ２３〕グルカゴン、〔Ｇｌｙ２３〕グルカゴン 、デス−Ｈｉｓ１−〔Ｇｌｕ９−Ｈｉｓ２４〕グルカゴン、デス−Ｈｉｓ１−〔 Ｓｅｒ５〕グルカゴン、デス−Ｈｉｓ１−〔Ａｓｎ９−Ｌｅｕ２７〕グルカゴン 、デス−Ｈｉｓ１−〔Ｓｅｒ４−Ａｌａ２９〕グルカゴン、デス−Ｈｉｓ１−〔 Ａｌａ４〕グルカゴン、デス−Ｈｉｓ１−〔Ｓｅｒ４〕グルカゴン、デス−Ｈｉ ｓ１−〔ＩＬｅ７〕グルカゴン、デス−Ｈｉｓ１−〔Ａｓｎ９〕グルカゴン、デ ス−Ｈｉｓ１−〔Ａｌａ２〕グルカゴン、〔Ｈｉｓ３−Ｓｅｒ４〕グルカゴン、 〔Ａｓｐ１−Ａｌａ２−Ｉｌｅ７〕グルカゴン、〔Ｐｒｏ２〕グルカゴン、〔Ａ ｓｐ４−Ｓｅｒ５〕グルカゴン、〔Ａｓｎ１０−Ｔｙｒ２１〕グルカゴン、デス −Ａｒｇ１８・１９−〔Ｌｅｕ１−Ｌｅｕ６−Ａｓｎ１３−Ｔｈｒ１６〕グルカ ゴン、およびデス−Ｈｉｓ１−〔Ｇｌｕ９−Ａ１ａ１１〕グルカゴンからなる群 から選択されるグルカゴンアンタゴニスト。
15. １５．デス−Ｈｉｓ１−〔Ｇｌｕ２１〕グルカゴン、デス−Ｈｉｓ１−〔Ａｌａ １１〕グルカゴン、デス−Ｈｉｓ１−〔Ｐｒｏ３−Ｓｅｒ２９〕グルカゴン、デ ス−Ｈｉｓ１−〔Ｉｌ７〕グルカゴン、デス−Ｈｉｓ１−〔Ｇｌｕ９−Ｐｈｅ１ ３〕グルカゴン、デス−Ｈｉｓ１−〔Ｓｅｒ２９〕グルカゴン、デス−Ｈｉｓ１ −〔Ａｓｎ９−Ｐｈｅ１３〕グルカゴン、デス−Ｈｉｓ１−〔Ａｌａ９〕グルカ ゴン、デス−Ｈｉｓ１−〔Ｇｌｕ２１−Ｓｅｒ２９〕グルカゴン、デス−Ｈｉｓ １−〔Ａｓｎ９〕グルカゴン、デス−Ｈｉｓ１−〔Ｓｅｒ４〕グルカゴンおよび デス−Ｈｉｓ１−〔Ｔｙｒ２〕グルカゴンからなる群から選択されるグルカゴン アンタゴニスト。