JPH06503171A - 顕微鏡的細胞の光学的スクリーニング方法及び装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 顕微鏡的細胞の光学的スクリーニング方法及び装置技術分野 本発明は一般に研究又は診断の目的のために、細胞を同定し又はスクリーニング する方法及び装置に関する。特に本発明は特異的表面分子が存在するか又は存在 しない細胞を光学的に同定し、例えば癌スクリーニングのためのような従来の染 色法を用いるＩｌ！胞の形態学りの特徴を検査することを目的とする。

背景技術 染色細胞は従来の細胞形態研究の基本である。典型的にこの細胞をスライドトに 置き、その後染色し７、そこで顕微鏡で光学的に又は視覚的に観察する。又、顕 微鏡の像から得られる光学的又は視覚的情報はイメージアナライザーのような自 動走査装置で使用できる。

１９世紀の末期に、Ｅｈｒｌｉｃｈ氏は血液細胞の形態学、生理学及び病理学に おいて報告し、白血病と貧血を検出し区別する確立法により血液学を新時代に進 めたａ　Ｅｈｒｌｉｃｈ氏は酸性、塩基性及び中性染料が白血球（ＷＢＣ）の顆 粒や核のような細胞成分と特異的に反応することを観察した。

Ｒｏｍａｎｏｗｓｋｙ氏は細胞に使用するために多色染色を発展させることによ り血液学のこれらの進歩を継続させた。近年、Ｒｏｓａｎｏｗｓｋｙ氏の染色の 改良であるＷｒｉｇｈｔ氏の染色が視覚的に細胞を検査するために一般に使用さ れる。周辺血液塗抹標本を染色し通常通りに異常な形態変化を視覚的に検査する 。細胞の型及び細胞分化の段階の区分は、病気プロセスと同定する際に重要な要 因となる。自動血液学アナライザーや、フローサイトメトリー装置の使用にもか かわらず、細胞の視覚的（顕微鏡的）評価を施す必要性が残る。

又、周辺血液塗抹標本に異型を発見した場合は免疫学的研究が重要となる。病気 に対するより良い治療法を選択するために、且つ患者にできる限り固有の予後を 提供するために、白血病の特異的なサブタイプを決定することが必要である。例 えば急性白血病では、周辺血液中にブラストが優勢である。分化がないので、こ れらの未成熟な細胞をリンパ球か又は顆粒球として区分するのは困難である。急 速に増殖しているブラスト副集団（ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）がＴｌｌレセ プター　ベアリングであるたとが判明した場合、白血病は急性リンパ芽球白血病 （ＡＬＬ）、Ｔ細胞タイプとして分類され得る。

一般に、王族ＡＬＬはＢ族Ａ　Ｌ　Ｌより予後が思わしくない。

又、これらの分化のレベルに応じたこれらの白血病の組分けが通例である。グル ープＩと■は早期に胸腺前駆体細胞に見い出される抗原を示し、グループ■に表 われるのは成熟Ｔ細胞に見い出される表面抗原に似ている。

先ず、免疫的実験がリンパ球サブセットを決定するために光Ｕ４ｖｌ！鏡を用い て進展した。ヒトリンパ球とヒツジ赤血球（ＲＢＣ）の間のロセノト形態がＣｏ ｏｍｂｓ氏その他によって１９７０年に観察された。

後に研究によって、適正な条件下で胸腺誘導リンパ球（Ｔ細胞）の全てか又は少 なくとも大部分がロセント形態現象を示すことがわかった。これらの研究はリン パ球を、単離されたＰｉｃｏｌｌを用い、光ミクロスフイアを用いて単離された リンパ球のサブセット分類に定型的にある期間用いられた。

現在では、リンパ球サブセントは蛍光ｔ［識モノクローナル抗体を有する試料中 で、細胞の蛍光標識により普通に決定される。

蛍光標識モノクローナル抗体は抗原を示す細胞の表面の関係ある抗原と結合する 。その後、細胞試料を蛍光顕微鏡又は高精能なフローサイトメトリー装置を用い て分析される。フローサイトメトリー装置を用いる場合、細胞試料調製、データ 収集及びデータ分析を特別に訓練した技術者により行う必要がある。フローサイ トメトり一装置はレーザ及び複素光学システム、高出力コンビュータ及び電気的 及び流体的システムを含む。フロー１す・イトメｉ・リー装買の成分システムは 適正に維持され、正常な普通の基本に修正される必要がある。フローナイトメト リー装置は今日では基準リンパ球づブセ７）決定又は癌免疫表現法であるが、方 法は高価な装置及びこのような装置を正しく走査するためにでする専門的技術を 包含するという幾つかの欠点がある。更（ζ、フローサ・イトメトリー法は、大 きな設備によってフローｌイ）メトリーの価格を正当化するのみであるから、一 般的な病理７粁には不利である。更に、フロ−９イトメトリー分析のために別の 設備に試料を送ることにより、有用な結果を得るのに３日又はそれ以上遅れるこ とがしばしば生し７る。故に、〒くて、安価で、簡単で且つ容易に利用できるス クリーニング法を用いるのが一般の病理学者には有利である。

又、リンパ球ザブセットは本出願の感受入であるクールターエレクトロニクスイ ンコーボレイテンドにより開発された自動装置及び方法を用いることを決定でき る。同様のものを用いる改良された簡単で自動の装置と方法を米国出願番号５８ ７，６４６．１９９０年９月２０日出願、ｒＡＵＴＯＭＡＴＥＤ　ＡＮＡＬＹＺ ＥＲＡＮＤ　ＭＥＴＨＯＤ　ＦＯＲ５ＣｌｉＥＥＮＩＮＧ　ＣＥＬＬＳ　ＯＲＦ ＯＲ阿ＥＤ　ＢＯＤＩＥＳ　ＦＯＲＥＮＵｌ’１ＥＲＡＴＩＯＮ　０ＦＰＯＰＵ Ｌ＾Ｔｌ０ＮＳ　ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧ　５ＥＬＥＣＴＥＤ　ＣＨＡＲＡＣＴＥ ＲＩＳＴＩＣ３Ｊに開示しており、これは、米国出願番号０２５，３４５．１９ ８７年３月１３日出願、同様の発明の名称のものの継続出願である。この出願は エレクトロニック　セイシング　アパーチャー原理の出願、即ち、細胞の限定さ れた集団又は形成体を同定及び／又は列挙するための選択された生物分子の特異 性及び顕微鏡的粒子技術、と結合する。

自動アナライザーを特別な溶菌試薬及び／又は顕微鏡的ミクロスフイアに結合す る抗体又は組成を変化させる支持体と共に使用できる。

第２の出願、米国出願番号２８５，８５６．１９８８年１２月１６日出願、発明 の名称「門ＥＴＨＯＤ　ＡＮＤ　ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ　ＦＯＲ５ＣＲＥＥＮＩＮ Ｇ　ＣＥＬＬＳ　ＯＲＦＯＲＭＥＤ　ＢＯＤＴＥＳ　ＷＩＴＨＰＯＰＵＬＡＴＩ ＯＮＳ　ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧ　５ＥＬＥＣＴＥＤ　Ｃ）ＩＲＡｃＴＥＲ［５Ｔ ＩＣ５Ｊは全血試料又はその部分から目的のサブセットのスクリーニングを開示 する。

第３の出願、米国出願番号３３９，１５６．１９８９年４月１４日出願、発明の 名称［門ＥＴＨＯＤ　ＡＮ口＾ＰＰＡＲＡＴＵＳ　Ｆｏｉｌ　５ＣＲＥＥＩＩＩ ＮＧ　ＣＩＬＳ　０１？ＦＯＲＭＥＤ　ＢＯＤＴＥＳ　ＷＩＴ）Ｉ　ＰＯＰＵＬ ＡＴＩＯＮＳ　ＥＸＰＲＥＳＳＴＮＧ　５ＥＬＥＣＴＥＤＣＦＩＡＲＡＣＴＥＲ ＩＳＴＩＣ３ＵＴＩＬＩＺＩＮＧ　ＡＴ　ＬＥＡＳＴ　ＯＮＥ　５ｐＮｓ＋Ｎｃ 　ＰＡＲＡ門ＥＴＥＲＪは多く又は５つに分けた白血球差、リンパ球サブセット 及び白血球試料から又は赤血球及び／又は集団及び／又はそのサブセットの脱離 によた除去された白血球の集団を有する試料から１つ又はそれ以上の先約又は電 気的パラメーターを有して形成された重複決定を開示する。

第４の出願、米国出願番号０７１５２５，２３１．１９９０年５月１７日出願、 発明の名称ｒＭＥＴＨＯＤ　ＡＮＤ　ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ　ＦＯＲ５ＣＲＥＥＮ ＩＮＧ　０ＢＳＣＩＩＲＥＤＯＲＰＡＲＴＩＡＬＬＹ　０ＢＳＣＵＲＥＤ　ＣＥ ＬＬＳ　Ｊは、特異的なモノクローナル抗体を有するミクロスフイアを用いるこ とにより不明瞭な細胞の解析を開示しており、互いに１つの細胞集団から不明瞭 な細胞の検出した特徴を移動する。上記４つの参照出願の各々は参照として本明 細書中に含まれる。

発明の具体化する方法及び装置は反応体及び形成体又は細胞を含む免疫学的反応 のような種々の免疫学的反応と共に用いられ得る。又、本発明は、特に幾つかの バクテリア及びウィルスのよう形成体サスペンションの解析に適用される０本明 細書では、細胞は、分離して又は集合体で同一であると照明できる細胞バクテリ ア、菌類を含む動物又は植物細胞として定義される。

細胞は、独立の単位として機能できる生物物質の最小の構造集合体である。例え ば、細胞は組織又は血試料からのヒトの赤血球（ＲＢＣ）及びＷＢＣ集団、癌又 は他の異常な細胞であり得る。形成体は幾つかのバクテリア及びウィルスとして 定義される。適正にタグ化又はラベル化された細胞及び形成体は理論的にヒトの 血細胞例と同じ方法で本発明の方法及び装置により工学的に同定されることを期 待できる。

「反応体」の言葉は上記出願中で用いられて、溶菌剤及びモノクローナル抗体を 定義するけれども、反応体は、細胞又は形成体の表面にある１つ又はそれ以上の 特異的な分子を検出しこれと反応する種々の試薬を含み得る。幾つかの例を以下 に示す二反庭体　称異夏ｉ子 抗体　抗原 薬物　薬物受容体 ホルモン　ホルモン受容体 成長因子　成長因子受容体 反応体は細胞上の特異の分子に結合する。これらの反応体は、化学反応の一部を 形成することは確かである；しかじ、反応体は必ずしも化学的に変化するとは限 らない。

リンパ球サブセット測定の１＃１１の従来の方法は、光学顕微鏡および抗体で標 識したミクロスフイアを用いる。この方法は、アメリカ合衆国カリフォルニア州 すソチモンド所在のバイオラッド　ラボラトリーズ（Ｂｉｏ　−Ｒａｄ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から入手できる。この方法は、Ｔおよび８９７８球を同定 するのに有用である。抗体で標識したミクロスフイアを用いて、関連する表面抗 原を示す細胞に結合させる。２種の異なる色に着色した抗体で標識したミクロス フイアを用いてＴおよびＢ細胞を識別する。

顕微鏡観察者は、特定の抗原に陽性である細胞を、細胞に結合した抗体で１識し たミクロスフイアの存在により同定する。抗体で標識したミクロスフイアが結合 していない細胞は、陰性の細胞集団を示し、関連する抗原を示さない。この方法 は、リンパ球を第１に全血試料から単離媒体例えばフィコールハイバック（Ｆｉ ｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）を用いて単離しなければならないという事実により 制限される。顆粒球汚染により、陽性でない細胞の値の誤った増加および食細胞 の数の誤った増加が発生しうる。

さらに、全血試料からの残りの細胞が第１に除去されるため、リンパ球サブセン トの測定のみが実施可能である。また、細胞の形態学的評価は、細胞が従来のロ マノウスキー（Ｒｏ＋Ｉｌａｎｏｗｓｋｙ）またはライト（Ｉｌｒｉｇｈｔ）型 染色により汚染されず、単に染色されて細胞生存率が測定されるため、制限され ている。形態学的評価は、細胞が懸濁液中で評価され、従来のようにスライド上 で評価されるのではないため、さらに制限される。

発明の開示 本発明は、細胞を光学的にスクリーニングして、細胞により表現された形態およ び選択された特性を同定する方法および装置を提供する。細胞は、１種または複 数種の異なるミクロスフイアのセントと結合し各セットには、１種以上の型の細 胞上に存在しうる特異の分子に結合する反応体が結合している。細胞およびミク ロスフイアをスライド上の塗抹標本として調製し、ライト型染色により染色する 。次に、細胞をオペレーターにより光学的におよび／または自動的に観察して、 所要に応して種々のミクロスフイアが結合した細胞の型を同定する。

試料は、例えば全血試料またはこの一部からの細胞の任意の懸濁液とすることが でき、ＲＢＣを除去するかまたは試料中に完全な状態で残すことができる。ミク ロスフイアのセントを同一のまたは異なる試料部中で個別にまたは同時に混合さ せて好ましくはこれらと混ぜ合わせることができる。異なるセントのミクロスフ イアは光学的に異なる光学特性を有する。セント間の異なる光学的特性は、色、 大きさ、形状またはこれらの組み合わせの場合がありうる。

血液試料が特異の抗原に陽性である細胞を多く含む個所において、細胞の凝集が 発生しうる。凝集は、急速なスクリーニング方法として、視覚的または光学的に 観察することができる。

凝集は混合容器内の凝集リムまたはスライド上の微細な凝集として観察される。

細胞はまた、１種以上の型の細胞上の特異の分子に結合する第１の反応体を用い て光学的にスクリーニングすることができる。１つの例として、第１の反応体を 、第１にセットのミクロスフイアを結合するのに不十分な濃度において得ること ができる。このような場合において、第１の反応体を、これが結合する細胞と混 合し、次に第２の反応体が結合したｌセントのミクロスフイアを第１の反応体細 胞混合物に加えることができる。

この場合において、第２の反応体は、第１の反応体に結合してミクロスフイアを 細胞に結合させる型のものである。ミクロスフイアに結合した第１の反応体およ び第２の反応体はまた、同時に細胞と混合することができる。また、ミクロスフ イアに結合した第２の反応体を第１の反応体と混合して、第１の反応体を第２の 反応体と結合させ、次に第１および第２の反応体が結合したミクロスフイアを細 胞と混合することができる。

特異の分子は試料中に存在する癌細胞のものとすることができる。癌細胞は、１ 種または複数種の異なるセントのミクロスフイアにより、１種以上の試料塗床標 本において同定することができる。これにより、病理学者が治療、予後に用いる 癌スクリーニング情報を得るかあるいは１種以上の他の塗抹標本または他のフロ ーサイトメトリー試験方法が不必要である単純かつ迅速な方法が提供される。

図面の簡単な説明 本発明の好適例を例により本明細書に添付した図面を参照して説明する： 図１は、本発明の１例の光学スクリーニング分析装置のブロック図式図である； 図２は、本発明の他の例の光学スクリーニング分析装置のブロック図式図である ； 図３は、本発明の特定の光学スクリーニング分析装置の例のブロック図である； 図４は、ミクロスフイアの特異の細胞抗原への結合を示す染色したスライドの光 学的画像の図である；図５は、ミクロスフイアの他の特異の細胞抗原への結合を 示ず染色したスライドの光学的画像の図である；回６は、ミクロスフイアの、Ｃ Ｌ　Ｌの型を示ず尚他の特異の細胞抗原への結合を示す染色したスライドの光学 的画像の図である； 図７は、ミクロスフイアの、さらにＣＬ　Ｌの型の識別する他の特異の細胞抗原 への非結合を示す染色したスライドの光学的画像の図である； 図８は、ミクロスフイアの、好中球上の特異の細胞抗原への結合を示す染色した スライドの光学的画像の図である；図９は、種々の色に着色したミクロスフイア の、好中球上の他の特異の細胞抗原への結合を示す光学的画像の図である；図１ ０は、種々のミクロスフイアの、好中球上の種々の細胞抗原への結合を示す、図 ８および９の種々の色に着色した、および種々のおおきさのミクロスフイアの光 学的画像の図である；図１１は、ミクロスフイアの、１つの型の細胞上の特異の 細胞抗原への結合および他の型の細胞上の抗原への非結合を示す光学的画像の図 である： 図１２は、ミクロスフイアの、１つの型の細胞−トの種々の特異の細胞抗原への 結合および他の型の細胞上の抗原への非結合を示す染色したスライドの光学的画 像の図である；図１３は、第２の反応体が結合したミクロスフイアの、細胞上の 特異の細胞抗原に結合した第１の反応体への結合を示す染色したスライドの光学 的画像の図である；図１４は、ミクロスフイアの、骨髄中の好中球Ｆの特異の細 胞抗原への結合を示す染色したスライドの光学的画像の図である：図１５は、ミ クロスフイアの、疑わしいＨＴ　Ｌ　Ｖ　−１試料中の第１の特異の細胞抗原へ の非結合を示す染色したスフ・イドの光学的画像の図である； 図１６は、ミクロスフイアの、図１５に示した疑わしいＨＴＬＶ−１試料中の第 ２の特異の細胞抗原への結合を示す染色したスライドの光学的画像の図である。

本発明を実施する形態 図１において、本発明の第１の光学的細胞スクリーニングの例を一般に参照符号 ｌＯにより示す、光学的細胞スクリーナーｌＯは生物試料１２を含み、これは少 なくとも例えば全血試料中またはこれからの第１の生物細胞の七ノド（図示せず ）を含む。

試料１２を、ライン１４を介して、ライン１８を介した少なくとも１種の反応体 １６と混合する。反応体１６は、抗凝血剤（ｂｌｏｏｄａｎｔｉｅｏａｇｕｌａ ｔｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）としておよび好中球（Ｎ）がミクロスフイアを吸着する のを防止するために試料１２に加えられるキレート剤例えば標準ＥＤＴＡを含む ことができる。

反応体１６はまた、少なくとも１つの型の細胞に結合して存在しうる特定の抗原 に特異的な抗体を有する複数の、または第１の七ノドのミクロスフイアを含む。

血液に関して、細胞は、特異の抗体が結合する抗原を表す。一般に、抗原はこれ に結合する抗体と同様に分子であり、従って、血液または他の生存可能な細胞に 間して、反応は、第２の型の分子と特異的に化学的に作用する第１の型の分子と して特定することができる。混合した試料１２および反応体１６を次に機能的に 示した混合ステーション２０により混合するのが好ましい。次に、混合物の一部 をスライド上に載置し、塗抹標本をこれから機能的に示した塗抹標本調製ステー シロン２２により調製する。次に、塗抹標本を機能的に示した染色ステージジン ２４において染色する。

染色は、組織学的染色の群の１つとするのがよく、これを用いて種々の細胞の特 性を識別する。血液細胞に関して、染色は、前記したようにいわゆる「ライト」 型染色とするのが好ましく、染色により、細胞の形態を、従来の方法において顕 微鏡下で識別することができる。本発明の方法において有用である他の若干の型 の組織学的染色の例は、ヘマトキシリン、ゼネチアンハイオレｙ　ト（Ｇｅｎｅ ｔｉａｎ　Ｖｉｏｌｅｔ）およびギームザ血液染色である。

ヘマトキシリンは、動物組織構造の一般的組織染色として、核を示すために用い られる。ゼネチアンハイオレノトは、細菌染色として、被膜を示すために用いら れる。ギームザ血液染色は、白血球、リケノ千ア族、細菌および封入体の型の識 別を示すために用いられる。次に、染色したスライドを、光学的アナライＪ（’ −２６において光学的に観察する。スライド上の細胞を光学的にスクリーニング して、いずれの型の細胞にミクロスフイアが結合しているかを決定覆る。これに より、細胞−トの特定の受容体または抗体の存在または不存在および従って試料 の状態を同定することができ、これを以下にさらに記載する。

光学的スクリーニング装置１０において、試料１２は全血試料であり赤血球細胞 （ＲＢＣ）がここに残るかまたは試料１２は、血小板またはＲＩ（（”、および すべてのＷＢＣ集団を含み得るかまたは含み得ない全血試料の一部のみである。

図２において、本発明の第２の光学的細胞スクリーナーの例を一般に符号２８に より示す。光学的細胞スクリーナー２８は生物試料３０を含み、これは全血試料 または少なくともＷＢＣを含む血液試料とすることができる。生物試料３０はま た、他の体液または組織、骨髄、尿、を髄または胸膜の流体あるいはリンパ節か ら誘導されることができる。ＲＢＣは、所要に応して、混合物から、機能的に示 したＲＢＣ除去ステーション３２により除去することができる。ＲＢＣは、混合 物から、多くの方法でステーション３２により除去することができる。ＲＢＣは 溶解剤により溶解することができる。ここで用いることができるこのような選択 的溶解剤およびクエンチ剤を以下に記載する。ＲＢＣはまた、ＲＢＣに特異的な 抗体がミクロスフイア（図示せず）に結合した複数の磁性ミクロスフイアを用い て除去することができる。結合したＲＢＣを磁場中に保持し、この間残りの試料 を除去してＲＢＣを除去する。例えば、用いることができる１種の特定のＲＢＣ 特異抗体は、［米国特許第４．７５２，５６３号明細書、題名ＭＯＮＯＣＬＯＮ ＡＬＡＮＴＩＢＯＤＹ　ＦＯＲｌ？ＥｃＯＶＥＲＹ　ＯＦ　ＬＥＵＫＯＣＹＴＥ Ｓ　ＩＮ　）ＩＵＭＡＮ　ＰＥＲＩＰＨＥＲＡＬＲＬＯＯＤ　ＡＮＤＭＥＴＨＯ Ｄ　ＯＦ　ＲＥＣＯＶＥＲＹ　ＥＭＰＬＯＹ［ＮＧ　５ＡＩＤ　？ｌ０ＮＯＣＬ ＯＮ　ＬＡＮＴＩＢＯＤＹ　Ｊに開示されており、これをここに参考として包含 する。緩衝液を、試料緩衝液に加えて、またはこの代わりに含むことができる０ 選択的ＲＢＣ溶解剤とＲＢＣ特異的ミクロスフイアとの組み合わせもまた用いる ことができる。ＲＢＣ除去の詳細は、明細書第３頁および第４頁に引用した本発 明の出願人の４つの包含した装置の出願において見出することができる。

次に、試料３０を、ライン３８を介した反応体３６と、ライン３４を介して混合 する。混合された試料３０および反応体３２を混ぜ合わせるのが好ましい。ここ で用いることができる適切な混合装置の特定的な詳細は、［出願第５１７，３０ ９号、１９９０年５月１日出願、おり、これは１９８７年３月１３日出願の同一 の題名の出願第０２５．３３７号の継続出願であり、これをここに参考として包 含する。所要に応して、混合器を用いることにより、反応の速度を、細胞の関連 する性質を顕著に損うことなく増加させることができる。

６１台器２０は同−ｎ型の混合菌：Ｗを用いることができるが、反応速度が・シ パシ″１−も臨界的で・ｋいため、他の型の温和な混合装置、例えば単純なＬｌ −ラーロソノ＋−（ｒｏ目ｅｒ　ｒｏｅｋｅｒ）　とｒるごとができる。

次Ｕ７、Ｒｆ３　（：芝、−除去した混合物の−へ部を、スライドトの塗沫涜本 として、スライド調製ステーノ５ン４０により′ａ縮する。スライドを、例えば スライド遠心分離により関連する細胞を濃縮し７、過剰の水分を除去することに より調製した後、スライドを前記のように染色ステーシゴン４２において染色す る。次に染色したスライドを再び分析装置４９により分析し、これは分析装置２ ６と同一とすることができる。

光学的細胞スクリーナー２８は、反応体３６との混合の前のＲＢＣの除去に関し て記載した。一般に、これは、ＲＢＣを磁性ミクロスフイアにより除去する際に 用いるのが好ましい。ＲＢＣは除去されて、ミクロスフイアの結合に影響するこ とがあり得ないため、このためにまたより少ない関連するミクロスフイアを用い ることができる。溶解剤を用いる際には、ＲＢＣを、反応体３６および試料３０ を混合した後に除去して、細胞が溶解剤に、より少ない時間にわたり曝露される ようにするのが好ましい。

自動または半自動光学的細胞スクーナーの例を図３に示し、これを一般に参照符 号４６により示す。光学的細胞スクリーナー４６は試料調製器４８を有し、これ は所要に応じてＲＢＣまたは血小板を除去し、種々の抗体が結合した１種以上の 種々のセントのミクロスフイアを加え、これは、試料中の１種以上の型の細胞上 に存在しうる種々の抗原に特異的である。試料調製器４８はまた、試料とミクロ スフイアとを混合し、好ましくはこれらを混ぜ合わせて細胞とミクロスフイアと を急速に結合させるのが好よしい。

次に、調製１．た試料のアリコ−＋・または一部をスフ・イド調ｉｖ器５叶二よ り塗抹標本とし一〇形成する。スライド調製器５ｏば４．ＲＩ３　Ｃを含むスラ イドの従来のスライ）′調製器またはＲＢ　Ｃを除去した試料用のスライドスピ ナーのい４′れかとする、−とができる。

次？、こ、スライドを染色器５２１．１；いて染色す゛る３、スライドを染色し た後、試料を光学顕微鏡５４を用いて光学的に観察または分析することができる 。光学顕微鏡５４は多くの出方、使用者の眼のための映像出力５６、細胞および ミクロスフイアの写真を逼影するだめのカメラ出力５８、映像出力５６の使用者 以外の使用者が観察することができ、走査テープを作製することができるビデオ 出力６０並びに細胞の形態およびミクロスフイアの色および／または大きさの両 方を自動的に走査し、同定することができる画像分析器出力６２を有することが できる。多くの型の従来の画像分析器、例えばアメリカ合衆国ノースカロライナ 州所在のイノビジョン・コープ・リサーチ・トライアングル・パーク（Ｉｎｏｖ ｉｓｉｏｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｔｒｉａｎｇｌｅ　Ｐａｒｋ）から発売されて いるものおよびアメリカ合衆国テネシー州ノンクスビル所在のバーセブティノク ス・コーポレーシヲン（Ｐｅｒｃｅｐｔｉｃｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から 発売されているバイオ・ビジョン・ワークステーション（Ｂｉ。

Ｖｉｓｉｏｎ　ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ）を用いることができる。

血液試料に関して、各生物試料は少なくとも第１のセットの生物細胞（図示せず ）を含み、例えば全血試料中またはこれがらの少なくとも１つの定義可能なサブ セントを有する少なくとも１つの白血球細胞集団を含む。ここで用いるように、 ＷＢＣ集団は、特異のモノクローナル抗体が結合することができるＷＢＣＩ団で ある。モノクローナル抗体に関する命令法は現在、ワールド・ヘルス・オーガニ ゼーション（Ｗｏｒｌｄ　ＨｅａｌｔｈＯｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）およびイン ターナショナル・イムノロジー・ソサイエテＩ　（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ 　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　５ｏｃｉｅｔｙ）により与えられている。モノクロー ナル抗体は、細胞または細胞群およびクラスター表示（ＣＤ）群に特異なモノク ローナル抗体に特定の特異性を与えるＣＤ命令法により与えられている０例のみ のために、あるＣＤ群は以下の例において用いられている。ＣＤ命令法、特異性 およびモノクローナル抗体の若干の商業的な源を表Ｉに示す。

表■ 創肛ｖｉ捜上　川（１１作【±　」ｂ ＣＤ２　（ｇｐ５０）　”　Ｔｌｌ　（クールター）ｂ　ＥロセノトＯＫＴ　１ １　（オルト）；　受容体 Ｌｅｕ５ａ　（Ｂ　Ｄ　） ＣＤ４　（ｇｐ５６）　Ｔ４　（クールター）　ヘルパー／誘導０に４ａ　（オ ルト）−物質Ｔ Ｌｅｕ３ａ　（Ｂ　Ｄ　） ＣＤ５　（ｇｐ６７）　ＴＩ　（クールター）　すべての完全に発達したＴ細胞 発達した胸腺リ ンパ球； Ｂ細胞サブセット ＣＤ７　（ｇｐ４０）　３ＡＩ　（クールター）　Ｔ細胞、はとんど−ＡＬＬ ＣＤ　８　（ｇｐ３２〜３３）　Ｔ８（クールター）　細胞障害性１０１ｆＴ８ 　（オルト）；　サプレッサーＴＬｅｕ２ａ　（Ｂ　Ｄ　） ＣＤＩＯ（ｇｐｌｏＯ）　Ｊ　５　（クールター）　共通急性リンパ芽球＾ｎｔ ｉ　−ＣＡＬＬ八　白血球抗原 （ＢＤ）　前Ｂ細胞、顆粒球 ＣＤ１３　（ｇｐ１５０）　ＭＹ７　（クールター）　単球、顆粒球、ＣＦＩＩ −６ ＣＤ１４　（ｇｐ５５）　ＭＯ２，ＭＹ４　単球、わずかな（クールター）　顆 粒球 ＣＤ１９　（ｇｐ９５）　Ｂ　４　（クールター）　パンＢ細胞。

前Ｂ　ＡＬＬ ＣＤ２０（ｇρ３５）　Ｂｌ（クールター）　形質細胞以外はＬｅｕ１６　（Ｂ 　Ｄ　）　すべてＢ細胞、骨Ｉａｍ以外は種瘍、 若干の非Ｔ　ＡＬＬ 細胞 ＣＤ　ｗ２９　（ｇｐ１３５）　４　Ｂ　４　（クールター）　ヘルパー／誘導 物１ｔＴＣＤ３３　（ｇｐ６７）　Ｍ　Ｙ　９　（クールター）　初期骨髄前駆 細胞 骨髄細胞、ＡＭＬ ＣＤ３４　（ｇｐＨ５）　ＨＰＣＡ　−１（ＢＤ）　骨髄前駆細胞 ＣＤ４１　（ｐ１３０．１１５）ｃＰ　Ｌ　Ｔ　−１血小板オヨヒ（クールター ）　巨核球 ａｇｐ：に！タンパク質、分子量（キロダルトン）ｂクールター：クールター・ コーポレーソぢンのクールター免疫部（アメリカ合衆国フロリダ州ハイアレア所 在） ＢＤ：へクトンーディキンソン・イムノサイトメトリー・システムズ（Ｂｅｃｔ ｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　［ｍｍｕｎｏｃｙｔｏ＋＋＋ｅｔｒｙＳｙｓ　ｔｅ ａｓ） オルト：オルト　ダイアグノスティック　システムズ（Ｏｒｔｈｏ　Ｄｉａｇｎ ｏｓｔｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）　（アメリカ合衆国ニューシャーシー州ラリタン 所在） ｃＰ：タンパク質、分子量（キロダルトン）さらに、例示のための３つの他の抗 体を用い、これは、未だＣＤ命令法を有しない。１つの抗体は、「米国特許第４ ，９３１，３９５号明細書、題名ＭＯＮＯＣＩ、０ＮＡＬ時月ＢＯＤＹ　５ＰＥ ＣＩＦＩＣＴｏ　ＮＥＵＴＲＯＰＨＩＬＥＳＪに開示されているＮ特異的抗体で ある。第２の抗体は、「米国に開示されているＮおよびＥ特異的抗体（ＫＣ−４ ８）であり、これら両方をここに参考として包含する。第３の抗体はいわゆるＨ ＬＡ−ＤＲ（ｐ２９／３４）　、例えばＭ　ＨＣクラスＩＩＨＩ−Ａ−［）Ｒ， 単球マクロファージ、Ｂ細胞および活性化されたＴ細胞に対して特異性を有する クールターにより供給されるＴ３である。

ＣＤの例がすべて列挙した商業的源を１種以上有するとはかぎらないが、事実上 すべてのＣＤの例を、上記に列挙したかまたは他の容易に確認可能な商業的源か ら得ることができる。

用いる磁性ミクロスフイアは任意の適切な型とすることができ、例えば直径０． ７〜１．３μであり、重量対容量で１０％固体であり、アメリカ合衆国インディ アナ州カーメル所在のハングズ・ラボラトリーズ（Ｂａｎｇｓ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｉｅｓ）から発売されているポリスチレン磁性ミクロスフイアである。再び 、非磁性ミクロスフイアは任意の適切な型とすることができ、例えば直径１．０ ５．２．１７および３．０６μであり、重量対容量で８％固体であり、アメリカ 合衆国オレゴン州ボートランド所在のインターフエーシャル・グイナミクス（Ｉ ｎｔｅｒｆａｃｔａｌ　Ｄｙｎａｓｉｃｓ）からＩＤＣミクロスフイアとして発 売されている界面活性剤を含まない硫酸化ポリスチレンラテックスミクロスフイ アである。

これらの特異のミクロスフイアを例のために用いるが、他の従来の源からの他の 型および大きさのミクロスフイアもまた用いることができる。一般に、複数のミ クロスフイアが各細胞に結合することが好ましいため、直径５μ以下のミクロス フイアを用いるのが好ましい、また、細胞のスライドおよび形態は、より大きさ が小さいミクロスフイアにより良好に維持される。

しかし、より大きい直径のミクロスフイアを用いることができ、直径が１０μで ある非磁性ミクロスフイアが用いられている。しかし、この場合には、逆よ゛り むしろ複数の細胞が各ミクロスフイアに結合する。

本発明の方法の特異性は十分であるため、単一のミクロスフイアが、抗原／受容 体が細胞上に存在することを示すことができると考えられる。しかし、一致によ る潜在的な誤った読み取りを除去するため、２個以上のミクロスフイアに結合し た細胞のみが、受容体が存在することを示すと考えられる。一般に、ミクロスフ イアの数ｌｆＡ度に依存して、１個より多いミクロスフイアが、各細胞に結合し て、特定の抗原／受容体を示す。

一般に、手順は以下の通りである： １、ＥＤＴＡ中に採集されていない場合には、十分混合した全血をＥＤＴＡ管（ すなわちすてにＥＤＴＡを含む管）に加える。

血液をＥＤＴＡ中に採集するのが好ましい。

２、ＥＤＴＡ管からの血液１００μｍを試験管に加える。

３、適切なミクロスフイア容量１を血液に加えて、混合物を約２〜３秒かきまぜ る。

４、試験管の上部を覆い、細胞がミクロスフイアに結合するのに十分な時間温和 に混合する。約１０分程度の時間が十分であると見出された。

５、混合に続いて、アリコートを取り出し、血液塗抹標本を作製する。塗抹標本 は、差異を計数するのに一般的に用いられる周囲の血液塗抹標本に類似している のがよい。

６、スライドを完全に乾燥した際に、従来の識別スライドに用いる方法と同一の 方法を用いてライトまたはライト／ギームザ染色により染色する。

７、スライドを４０ｘまたは１００ｘ対物レンズを用いて油浸レンズにより観察 し、ミクロスフイアが結合した細胞を記録する。

８、特異の細胞の型が２個以上のミクロスフイアに一致してタグ化した際に定性 的陽性結果を観察する。特定の抗原に対する細胞集団の陽性の程度は、ミクロス フイアが結合したこの集団の細胞の数を示しうる。

■全白血球細胞係数により提案されたミクロスフイア対全血の比率は以下のとお りである： ＷＢＣカウント　ビーズ容量 ■±（１−１７のミクロスフイアの１０ρ′）０〜２０．０００　１０　μｍ ２０．００１〜７５．０００　２０　μｍ７５．０００以上　３０　μｌ 血小板を除去することが所望される場合、その際次の方法を用いて血小板を除去 して前記段階２で試験管に血液を添加する。

１．２００μＩのＥＤＴＡ抗凝固全血を試験管に添加する。

２．２０μｍの磁性ＰＬＴ−１ミクロスフイアを添加する。

３、細胞がミクロスフイアに結合するのに十分な時間混合する。１５秒〜２分の 時間が十分であると考えられた。

４、磁場に５分間置く。

５、上清を除去する（接着した血小板を有するミクロスフイアのない全血）。

６、前記段階２の方法に用いる。

本発明の方法を用いて、リンパ球に対するＣＤ２の特異性を図４に示した。Ｔｌ ｌ特異的抗体を結合した多数の非磁性ミクロスフイア６４がＲＢＣ’ｓ　６８が 除去されていないスライド上のリンパ細胞６６に結合することを示す。若干の遊 ＃！（非結合）Ｔ１１　ミクロスフイア６４′が存在する。Ｔｌｌ　ミクロスフ イア６４が好中球７０に結合しないため、好中球７０はＴｌｌ　ミクロスフイア ６４の特異性を証明する。

図面は標準製図法（ｓｔａｎｄａｒｄ　ｄｒａｗｉｎｇ　ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ ）により黒色および白色で描いている、しかし、実際の染色スライドは着色して いる。このことについては、従来のように、種々の細胞は次のような色である： 好中球：細胞質は淡いピンクで小さな、多数の顆粒は淡いピンクから青みを帯び た黒色を有する。核は濃い青みを帯びた紫色である。

芽細胞：青みを帯びた細胞質は均質に染色されてらす核は紫色である。

リンパ球：細胞質は青色で、さらに核は濃い青みを帯びた紫色である。

好酸球：細胞質は赤らんだオレンジ色に着色する大型球形顆粒により覆われる。

核は濃い青みを帯びた紫色である。

単球：細胞質は灰青色（ｇｒｅｙ−ｂｌｕｅ）であり核は濃い青みを帯びた紫色 である。

好塩基球：顆粒は濃い紫色で核はわずかに一層薄い色である。

顆粒は細胞質を覆う。

赤血球：細胞は赤色であるが色調は中程度の濃さである。

血小板：細胞は小さな青みを帯びた顆粒を有する淡い青色である。

さらに、磁性型ミクロスフイアは赤らんだ褐色であり非磁性ミクロスフイアは白 色である。これは細胞およびミクロスフイアが相互から識別されるのを容易にし 得る。またミクロスフイアは必要に応じて、識別を与えるために他の色調、寸法 および形でもよい。

図５には、４Ｂ４特異的抗体を結合した多数の非磁性ミクロスフイア７２が多数 の血小板７４に結合することを示し、これはミクロスフイア７２により相互に凝 集したように考えられる。４Ｂ４特異的抗体が図示したように血小板に結合しさ らに若干のＬ’ｓに結合するため、血小板をまず除去して４Ｂ４型Ｌ’ｓ用の試 料を分析する。

図６はＢ細胞Ｃ１凡の存在を示すリンパ球７８に結合したＢ１特異的抗体を結合 した多数のミクロスフイア７６を示す。ミクロスフイア７６は３ミクロンミクロ スフイアであるが、ミクロスフイア６４および７２は２ミクロンミクロスフイア である。正常血において極めて少ない１．’ｓがＢｌ型リンパ球であるため、ミ クロスフイア７６を結合する多数のリンパ球７８を示すこのパターンはＢ細胞Ｃ ＬＬを暗示する。

図７では、リンパ球７８を他の試料部分中でＪ５特異的抗体を結合した多数のミ クロスフイア８０とさらに混合した。ミクロスフイア８０を若干の型のＣＬＬに 結合し従って非結合のミクロスフイア８０　（近接した１種のＲＢＣ６８を示す ２つの遊離物）は、リンパ球７８がＪ５を結合するＣＡＬＬＡの欠損を現すこと を示す。

図８は前に参照したような、３つの好中球８２、それぞれがＮおよびＥ特異的抗 体を結合した多数のミクロスフイア８４を有していることを示す。これはＮおよ びＥミクロスフイアの好中球８２に対する特異性を示す。各側において、すべて のスライドまたはその主要部分を旋回してミクロスフイアが、それらが特異的で あるもの以外の任意の他のＷＢＣ’ｓに結合しないことを確かめた。

図９は２つの好中球８６を示し、それぞれは多数のミクロスフイア８８を結合し ている。さらにミクロスフイア８８はＮおよびＥ特異的抗体を結合している。こ の場合、ミクロスフイアは１ミクロン直径の程度の磁性体であるが非磁性ミクロ スフイアはスライド上で白色を示し、磁性ミクロスフイア８８は茶色がかった色 を示して非磁性ミクロスフイアから色ならびに寸法で識別することができる。

この識別は図１０に最も適当に示しており、そこでは多数の２ミクロン非磁性白 色ミクロスフイア９２を結合した単一の好中球９０を示し、ミクロスフイア９４ は前に参照したような、ＮおよびＥ特異的抗体を結合していた。また好中球９０ は多数の１ミクロンの磁性の茶色がかった色のミクロスフイア９４を結合し、ミ クロスフイア９４はＮおよびＥ特異的抗体を結合していた。これにより興味ある ２以上の抗原を同時に確認するものとして特異的細胞を確認し得る。

一般にＲＢＣ’ｓは図４〜１０に示すように除去されない。図４〜１０に示され た塗抹標本は血球細胞を観察する通常の方法で存在するすべての細胞を用いて、 調製する。さらに、細胞遠心分離（ｃｙｔｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）は 細胞の形態、特に異常細胞に損傷を与える場合があり従って好ましくない。しか し、約１　、０００〜２，０００の−ＢＣ’ｓ／μｍの程度またはそれ以下の極 めて低い数の−ＢＣＬか存在しない場合ＭＢＣ’ｓを除去することが最も都合の よい場合がある。−ＢＣ’ｓの濃縮は主としてこれらの観察を容易にする。ＲＢ Ｃ’ｓは残留細胞の形態にほとんど影響を与えないように最小の損傷法で除去す る必要がある。

ＲＢＣ’ｓを除去する１つの好ましい方法は試料に溶解剤を添加し次いで冷却す ることである。溶解剤は約０．２１％（ｗ／ｖ）の濃度のクエン酸−水塩と約０ ．０２％（ｗ／ｖ）の濃度のサポニンとの混合物であるのが好ましい。クエンチ 剤は約２．９％（ｗ／ｖ）の濃度の塩化ナトリウムおよび約０．５９％（ｗ／ｖ ）の濃度の重炭酸ナトリウムであるのが好ましい。細菌発育阻止剤、例えば、約 ０．０１％（ｗ／ν）の濃度のアジ化ナトリウムが堆奨されるが、溶解剤および クエンチ剤のいずれの実施にも必要でない。

一般に、前記溶解剤およびクエンチ剤を用いる方法は次のようである： １、　１００μｍのＥＤＴ＾全血を試験管に添加する。

２、適当なミクロスフイアの容積を血液に添加する、例えば４０μｌの２Ｘ１０ ’個／清１　ミクロスフイア。

３、細胞がミクロスフイアに結合するのに十分な時間、例えば１０〜３０分の程 度の間暖徐に混合する。

４．３５μｌの混合物を除去して１２　Ｘ　７５ｍ＋ｗの管に添加する。

５、　５００μｍの溶解剤を添加してわずかにかき混ぜる。

６、直ちに２５０μｍのクエンチ剤を添加する。

７、約１分間インキユヘーションする。

８、所望の場合、ＰＢＳ中に５％ＢＳ＾を含む１００μｍの緩衝液を添加する。

９、　４００μｌの混合物を細胞遠心分離装置中に添加して５００ｒｐｍで５分 間回転して細胞をスライド上に分離する。

１０、段階１０は前記１９ページに示した方法の段階６〜８と同一である。

またＭＢＣ’ｓは前に記載したように磁性ミクロスフイアを用いて除去すること ができる。

図１１はＷＢＣ’ｓ以外のすべての細胞を除去した細胞遠心分離スライドを示す 。ＲＢＣ’ｓおよび所望により他の細胞を除去する場合その後残留する細胞をス ライド上にスピンダウンして細胞を濃縮し過剰の水分を除去する。これにより興 味ある細胞の観察を容易にすることができ、細胞は全血試料中に比較的少数であ り従って配置が困難である場合がある。図１１はＴｌｌ特異的抗体を結合した多 数のミクロスフイア９６を示し、ミクロスフイア９６が３つのリンパ球９日に結 合している。ミクロスフイア９６は好中球１００または単球１０２に結合せず、 さらにミクロスフイア９６に曝した。

図１２は他の細胞遠心分＋ｍｔＷ製スライドであり、これはＮおよびＥ特異的抗 体を結合した多数のミクロスフイア１０４を示し、ミクロスフイア１０４は種々 の好中球１０６に結合し単球ｌＯ８には結合しない。

特異的な例は寸法および色調により区別されるミクロスフイアを用いて示された が、さらにミクロスフイアは異なる形態であることにより区別することができる 。

本発明の実施において２つの他の現象が観察された。これらはリミング（ｒｉｍ ｍｉｎｇ）およびスライド凝集であり、ともに細胞＃集と称される場合がある。

リムを作ることは特異的抗体に陽性な多数の細胞を有する若干の全血試料におい て発生する。この現象は全血を反応容器、例えば試験管中でミクロスフイアと混 合またはインキュベーションする間に観察された。陽性細胞およびミクロスフイ アは試験管上の微細なリムを形成する全血の外面に沿って凝集する傾向がある。

このリムは陽性を示す試料で見出されるにすぎない、また同様の凝集現象が微細 なグラススライド上で観察された。全血の１滴をスライド上に配置し１滴の抗体 被覆ラテックスビーズとスライドを緩徐に振動させて混合することにより、微細 な凝集が対応する特異的な抗原に陽性な多数の細胞を有する試料中で見出される 場合がある。この凝集はスライド上で赤血背景Ｃｒｅｄ　ｂｌｏｏｄ　ｂａｃｋ ｇｒｏｕｎｄ）を有する白色凝集（ｃｌｕｍｐ）として、肉眼で目に見えるよう に現れる。

これらの凝集は適当な条件下に多数の−ＢＣのために迅速なスクリーニング法を 提供することができる。これらの現象を１μｌ当たり４〜Ｉ　１　、０００個の 細胞の正常−ＢＧ細胞範囲に対し１〃１当たり４０〜５０，０００個の細胞板ト の程度のすべての−ＢＣ細胞数で観察した。細胞凝集は援助なしで視覚によって 観察される場合があるが、手動もしくは自動で操作される顕微鏡観察の機器また は他の光学装置を用いることができる。さらに、リミングはリミングが発生する 際に回折パターンを生じる光ビームを用いて混合容器を操作することにより手動 もしくは自動で光学的に視覚によって観察される場合がある。

図１３は第２反応体を結合した多数のミクロスフイア１１０を示し、第２反応体 は第１反応体に結合し、また第１反応体は細胞１１２上の特異的分子に結合する 。この場合細胞はＣＤ３４抗原を発現し、これに第１反応体が結合する。第１反 応体、例えばＨＰＣＡ−１は、適当な濃度で容易に入手してミクロスフイア１１ ０に直接結合することができない。従って、第２反応体、ここではヤギ抗マウス 抗体をミクロスフイアに結合する。第２反応体は任意のマウス抗体と結合し従っ てミクロスフイア１１０は細胞１１２土でミクロスフイアに結合した第１反応体 に結合する。また第１反応体および第２反応体に結合したミクロスフイア１１０ を試料と同時に結合させることができる。あるいはまた、第１反応体をミクロス フイア１１０上で第２反応体に結合させその際第２反応体を結合しさらに第１反 応体を結合したミクロスフイア１１０を第１反応体を介してその後試料と混合す る。細胞１１２に単独で結合した、ミクロスフイア１１０を有しない第１反応体 は視覚によってまたは顕微鏡観察により区別することができない。

−船に、第１の方法は次のとおりである：■１段階１は前記の１８〜１９ページ の方法に記載した段階１および２と同様である。

２．１０μＩの第１反応体を添加し混合物に約２〜３秒間渦を作る。

３、混合物を約１０分間インキュベージぢンする。

４、第２反応体を結合した１０μｌのミクロスフイアを添加する。

５、段階５は前記１９ページの方法に記載した段階４〜８と同様である。

図５〜１２に関して示した他の種類の方法をさらに図１３に関して記載した種類 の反応体結合で用いることができる。種々の反応体を有する他の組み合わせのミ クロスフイアを第２試料部分に添加したが、上記ミクロスフイアは相互に種々の 寸法および／または色調として区別される。また種々の反応体を有する１種以上 の種々のセントのミクロスフイアを第１試料部分中で第１および第２反応体と混 合することができる。しかし、この方法では、他の反応体は第２反応体とは異な る他の種類である必要があるが、さらにミクロスフイアは第２反応体に結合する 。

例えば第２反応体が抗マウス抗体である場合、他の反応体はブタ、ラビットまた は他の異なる種類の抗体である場合がある。

図１３に間して記載したような種々の方法を試験して種々の方法の作用を確認し た。第１の例として、５μｌのＴ４抗体を緩徐に渦を作ってｌＯＯμｌの全血に 添加した。混合物を静置あるいは１０分間インキュベーションした。インキュベ ーション後、１０μｍのミクロスフイアを添加し、緩徐に渦を作りローラーロッ カー上で１０分間混合し、しかる後上述したように塗抹標本を作成した。これに よりミクロスフイアがＬ’ｓに対して通常の結合を起こし、２つの例は３７％お よび４４％となった。

第２の例においてミクロスフイアおよびＴ４抗体を同時に添加しスライドを調製 する前に１０分間ローラーで振動させた。これにより、２つの例についてやや減 少した２８％および３１％が得られた。

第３の例として、ミクロスフイアを添加し混合前に、抗体を加えずに混合してス ライドを作成する。この例では、予期されたように、ミクロスフイアの細胞への 結合が見出されなかった。

他の例では、Ｔ４抗体を試料と１０分間ローラーで振動させ、次いでミクロスフ イアを添加してさらに１０分間混合し、その後スライドを調製した。これにより 通常の３６％が得られた。

最後の例として、ミクロスフイアおよびＴ４抗体を相互に混合し１０分間静置し た。次いでこの混合物を試料部分に添加して１０分間混合しスライドを調製した 。得られた２３％および２７％は多少低かった。１つの解釈は若干の抗体が混合 物中に遊離して残留しミクロスフイアが結合する若干の部位をプロ・ンクしたこ とである。

図１４は骨ＩＩ試料中の種々の好中球１１４を示し、それぞれは多数のミクロス フイア１１６を結合している。ミクロスフイア１１６はＮ特異的抗体を結合して いる。この例は血液に他ならない他の種類の流体、ここでは骨髄においてこの方 法の有効性を示している。

次に図１５および１６には、本発明の他の例を示す。観通用の方法論はそこで参 照したようなしかも以下に一層明確で詳細に記載したように癌細胞のスクリーニ ングに等しく適用し得る。種々の種類の癌細胞は種々の特異的分子を発現し、特 異的モノクローナル抗体の利用により種々の種類の癌の間の識別を援助し得る。

時間が絶対的である場合があり種々の種類の癌が種々の治療を必要とするため、 この識別は極めて決定的である場合がある。

さらに、細胞を単に染色し細胞の形態を調査することは特定の癌の種類を決定す るのに十分でない場合がある。あるいはまた、病理学者はさらに情報を要求して 形態学的評価を確実にする場合がある。かかる情報が所望される場合、一般に蛍 光モノクローナル抗体を用いたフローサイトメトリー機器が用いられて情報が提 供される。

１種のかかるフローサイトメトリーモノクローナル抗体パネル（ｐａｎｅｌ）を 表Ｈに示す。

表ＩＩ 白血病／リンパ種免疫表現型（Ｉｍ＋ｗｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）パネル 関連性（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）　／制限（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）崖−旦 豊腹　１鞭ｍ　萱ｌ単球 −＋１ ＣＩ）１４　− ”ｍ腺後（ｐｏｓｔ−ｔｈｙｍｉｃ）　Ｔ細胞悪性腫瘍は通常肛＾−ＤＲ”であ るが急性Ｔ細胞白血病およびリンパ腫はほとんど常に）ＩＬＡ−ＯＲ−である。

ｂＨｌ、Ａ−ＤＲは骨髄芽球細胞上に偏在するが前顆粒球には存在しない。従っ て、単芽球およびその子孫は常に肛Ａ−ＤＲ”であり；急性骨髄性白血病（ｈ３ ）はほとんど常に）ＩＬＡ−ＤＲ−である。

１著し２くしばしば、ＣＤｌ０は濾胞性リンパ腫において陽性である。

’　ＣＤ２０は急性白血病におけるＣＤ１９と比較して固体発生中の後期に現れ るＣＤ２０のようにほとんど偏在して発現しない。しかし、これはＢ細胞リンパ 腫上にほとんど常に存在する。

”　ＣＤ５は正常循環Ｂ細胞の小側集団（ｓｍａｌｌ　５ｕｂｐｏｐｕｌａｔｉ ｏｎ）上に共発現する。これは悪性腫瘍Ｂ細胞上に共発現する慢性リンパ球性白 血病を確認するのに有用なマーカーである。

’　ＣＤ７は少ないパーセントの他の点では代表的な急性骨髄性白血病に存在す る。これは胸腺後Ｔ細胞悪性腫瘍においてしばしば陰性であり従ってその欠損は 初期Ｔ細胞悪性腫瘍の検出に有用である。

’　ＣＤ１４は事実上成熟単球制限される。従って、通常ＨＬ＾−ＯＲが陽性で ＣＤ１４が陰性の芽球または単球前駆体から単球を分離するのに有用である。

表ＩＩはランディ、ニー、エル、　（Ｌａｎｄａｙ、　Ａ、Ｌ、）およびダグ− 。

アール、イー、（Ｄｕｇｕｅ、Ｒ，Ｅ、）の印刷中の、１９９１年の’Ｈｅｍａ ｔｏｐｏｉｅｔｉＮｅｏｐｌａｓｓａｓ、Ｍａｎｕａｌ　ｏｒ　Ｃ１１ｎｉｃａ ｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｆｍｕｎｏｌｏｇｙ」　＋ワシントンＤ、Ｃ，所在 の米国微生物学会（＾＊ｅｒｉｃａｎ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒＭｉｃｒｏｂｉ ｏｌｏｇｙ）による発表から採用している０表はフローサイトメトリーモノクロ ーナル抗体蛍光色素の利用について示しているが、前に述べたようにかかるフロ ーサイトメトリー機器は常に有用ではなく、有意な時間の遅延を生じる場合があ る。

本田１人らは情報決定が本発明のミクロスフイアの利用にフローサイトメトリー 機器を用いることなく等しく適用し得る、ことを見出した。種々のモノクローナ ル抗体を結合した種々の七ノドのミクロスフイアのパネルを用いて試料中に存在 する癌の種類に対する迅速なスクリーニング情報を提供することができる。例え ば、１種以上の塗抹標本における光学的に区別し得る七ノドかまたは各塗抹標本 における異なるセットのミクロスフイアかあるいはその組み合わせの多数を利用 することにより、迅速なスクリーニング情報を提供することができる。複数また はパネルのミクロスフイアは種々のセットのミクロスフイア上に次のモノクロー ナル抗体を含む場合がある：Ｈ１，Ａ−ＤＲ−限定されないが例えば■３Ｂリン パ球　−限定されないが例えばＣＤ１９Ｔ細胞　−限定されないが例えばＣＤ　 ２単球の　−限定されないが例えばＣＤ１４骨髄の　−限定されないが例えばＣ Ｄ３３また本出願人らはさらにＫＣ−４８が骨髄性白血病の情報を提供するらし いことを見出した。

本発明を用いて、病理学者から得た急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）型の癌であると して示された試料を情報のためにスクリーニングしてこれが実際にＡＭＬ癌であ ることを確かめた。ＡＭＬはわずかな成−細胞を有する初期癌であり、従ってミ クロスフイアに結合したモノクリローナル抗体が未成熟細胞に結合して癌細胞の 種類を識別する必要がある。この予測を■３およびＫＣ４８モノクローナル抗体 がわずか乃至適度に陽性で、すなわち適当な数の各細胞上に適当な数の細胞で結 合する別個の塗抹標本を用いた迅速なスクリーニングパネルにより確かめた。Ｔ ｌｌモノクローナル抗体ミクロスフイアは試料中のわずかの成熟Ｌ’ｓに結合し た。骨髄性（ここではＣＤ３４　）モノクローナル抗体ミクロスフイアは極めて わずかに陽性であったにずぎないが、ＭＹ４およびＢ４モノクローナル抗体ミク ロスフイアは陰性、すなわち、どの細胞にも結合しなかった。

迅速なスクリーニングパネルが決定的である場合、次いで病理学者はさらに情報 を得ることな（治療管理（ｒｅｇｉｍｅｎ）を決定する場合がある。迅速なスク リーニングパネルが決定的でない場合次いで病理学者はさらなる情報、例えばフ ローサイトメトリー機器からの情報を得ることができる。

また本発明を用いて他の情報を得ることができ、例えば、最初の迅速なスクリー ニングパネルがＴ細胞陽性癌（Ｔ−ｃｅｌｌｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃａｎｃｅｒ） を示す場合、次いで付加的スライドを用いて他の情報を提供することができる。

例えば、その後ＣＤ４　、ＣＤ８およびＣＤｌ０を用いて癌の種類をさらに特定 することができる。

若干の種々の種類の癌は上述したＡＬＬおよびＡＭＬ　、慢性リンパ球性白血病 （ＣＬＬ）　、ならびにヒ）Ｔ細胞リンパ栄養性（Ｉｙｗｐｈｏｔｒｏｐｈｉｃ ）　ウィルス−１（ＨＴＬＶ−１）白血病である。ＨＴＬシー１染色細胞はＢ細 胞癌と形態学的に識別することができないが、この違いは掻めて絶対的である。

２種の別個の染色試料部分中のミクロスフイアまたは１枚の染色スライド中の２ 種の識別し得る七ノドのミクロスフイアを用いることにより、２種の癌を識別す ることができる。１つの例として、２種のセットのミクロスフイアの１つはＴ４ モノクローナル抗体を結合し第２の七ノドのミクロスフイアはＴ８モノクローナ ル抗体を結合することができる。Ｔ４セットのミクロスフイアが細胞に結合する にすぎない場合、その際癌は恐ら＜　ＨＴＬシー１である。またＴ８セントのミ クロスフイアが大多数の細胞に結合する場合、その際癌は恐ら＜ＨＴＬシー１で なく一層情報を得るために試料をさらに分析する。病理学者はＨＴＬＶ−１型白 血病を確認するため）ＩＴＬＶ−１ウイルスの存在について血清試料をさらに分 析することができる。

図１５には、疑わしいＨＴＬＶ−１癌試料を１対の癌細胞１２０とともに示し、 ＣＤ８特異的抗抗体結合したミクロスフイアをこれに添加したウ　１つの遊離ミ クロスフィ’７’　１２２を示し細胞１２０はミクロスフイアへの結合をはっき りとは示さなかった。

図１６は図１５に示した疑わしいＨＴＬシー１癌試料の異なる試料部分中の１対 の癌細胞１２０を示す。この試料部分では、ＣＤ４特異的抗抗体結合した多数の ミクロスフイア１２４は、細胞１２０に明かに結合した。細胞１２０に結合する ＣＤ８特異的抗抗体欠損およびＣＤ４特異的抗抗体存在は細胞１２０がＨＴＬＶ −１白血病細胞であるという強力な指摘を提供する。

病理学者が癌をリンパ腫型の癌と認める場合、その際迅速なスクリーニングパネ ルの必要性はＢ細胞およびＴ細胞型リンパ挿間の情報を提供するにすぎない。

迅速な癌スクリーニング情報を提供する他の方法は磁性ミクロスフイアをその後 結合さて用い、結合した細胞を磁気を用いて除去することである。この例では、 標準塗抹標本をまずミクロスフイアを用いずに対照塗抹標本として作成する。次 いで第２の磁気除去塗抹標本を対照塗抹標本と比較する。興味あるまたはそのか なりの部分の形態学上の細胞を除去した場合、その後癌または若干の細胞はミク ロスフイアとともに用いた種類のモノクローナル抗体に対して陽性である。この 場合、別個の除去塗抹標本を所望の各モノクローナル抗体に対して用いてスクリ ーニングする。

ＦＩＧ、６ ＦＩＧ、７ ＦＩＧ、ｌ○ ＦＩＧ、１３ ＦＩＧ、ｌ４ ＦＩＧ、　１５ 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号ＧＯＩＮ　３３１５３　 Ｋ　８３１０−２ＪＹ　８３１０−２Ｊ ３３１５７４　Ｄ　９０１５−２Ｊ （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ 、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ）、Ａ Ｕ、ＢＲ、ＣＡ、ＦＩ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，Ｎｏ、ＳＵＩ

Claims (44)

【特許請求の範囲】
1. １．癌に対する顕微鏡的細胞を光学的にスクリーニングする方法において、 癌細胞であると思われる少なくとも幾つかの細胞を有する多数の細胞を含む試料 を形成し； 前記細胞の少なくとも第１の部分を、少なくとも１つの型の癌細胞に存在し得る 少なくとも第１の特異的な分子に特異的に結合される少なくとも第１の反応体を 有するミクロスフィアの少なくとも第１のセットに混合し；前記ミクロスフィア を含むスライド上に前記細胞の塗沫標本を調製し； 前記塗沫榛木を組織学的タイプの染色にて染色し；及び顕微鏡を用いて前記細胞 の少なくとも幾つかを光学的に観察し、ミクロスフィアの前記第１のセットが結 合される細胞の存否を少なくとも同定し、癌スクリーニング情報を提供すること を特徴とする癌に対する顕微鏡的細胞の光学的スクリーニング方法。
2. ２．全血試料又はその一部分を形成し且つライトタイプ（Ｗｒｉｇｈｔ−ｔｙｐ ｅ）染色にて前記塗沫標本を染色することを更に特徴とする請求項１記載の方法 。
3. ３．前記第１の反応体が、第１の細胞抗原である少なくとも前記第１の特異的な 分子に特異的な抗体であることを更に特徴とする請求項２記載の方法。
4. ４．前記試料にキレート化剤を添加して、好中球集団が前記ミクロスフィアを取 り込むのを防止することを更に特徴とする請求項２記載の方法。
5. ５．前記塗沫標本を像解析することを更に特徴とする請求項２記載の方法。
6. ６．前記細胞の少なくとも幾つかを形態学的に特徴付け且つ前記特徴付けられた 細胞における結合されたミクロスフィアの存在を同定することを含むことを更に 特徴とする請求項２記載の方法。
7. ７．前記塗沫標木を像解析することを更に特徴とする請求項１記載の方法。
8. ８．前記細胞の前記第１の部分を、少なくとも１つの型の細胞の存在し得る少な くとも第２の特異的な分子に特異的に結合される少なくとも第２の反応体を有す る、ミクロスフィアの前記第１のセットと異なる光学的な特徴を有する、ミクロ スフィアの少なくとも第２のセットに混合し、且つ顕微鏡にて前記細胞の少なく とも幾つかを光学的に観察してミクロスフィアの前記第２のセットが結合する細 胞の存否を少なくとも同定することを特徴とする請求項１記載の方法。
9. ９．前記細胞の前記第１の部分を、ミクロスフィアの少なくとも前記第１及び第 ２のセットに同時に混合することを更に特徴とする請求項８記載の方法。
10. １０．前記ミクロスフィアの前記第１及び第２のセットがサイズにおいて物理的 に異なることを更に特徴とする請求項８記載の方法。
11. １１．前記ミクロスフィアの第１及び第２のセットが色において光学的に異なる ことを更に特徴とする請求項８記載の方法。
12. １２．前記細胞の少なくとも第２の部分を、少なくとも第２の型の癌細胞に存在 すると思われる少なくとも第２の特異的な分子に特異的に結合される少なくとも 第２の反応体を有するミクロスフィアの少なくとも第２のセットに混合し；前記 ミクロスフィア含むスライド上に前記細胞の塗沫標本を調製し； 前記塗沫標本を細胞学的タイプの染色にて染色し；及び 顕微鏡にて前記細胞の少なくとも幾つかを光学的に観察して、ミクロスフィアの 前記第２のセットが結合する細胞の存否を少なくとも同定することを更に特徴と する請求項１記載の方法。
13. １３．前記ミクロスフィアの前記第１及び第２のセットがサイズにおいて物理的 に異なることを更に特徴とする請求項１２記載の方法。
14. １４．前記ミクロスフィアの第１及び第２のセットが色において光学的に異なる ことを更に特徴とする請求項１２記載の方法。
15. １５．前記第１の能体がＣＤ４モノクローナル抗体であり、前記第２の反応体が ＣＤ８モノクローナル抗体であり、前記ＣＤ４及びＣＤ８モノクローナル抗体ミ クロスフィアが結合する細胞の存否がＨＴＬＶ−１白血病の指標であることを更 に特徴とする請求項１２記載の方法。
16. １６．前記細胞の多数の異なる部分を、異なる型の癌細胞に存在すると思われる 異なる特異的な分子に特異的に結合する異なる反応体を有する、ミクロスフィア の異なる核セットに混合し； 前記ミクロスフィアを含む分離したスライドに前記異なる細胞の部分の分離した 塗沫標本を調製し；組織学的なタイプの染色にて核前記塗沫標木を染色し；及び 顕微鏡にて核前記塗沫標本における前記細胞の少なくとも幾つかを光学的に観察 して、ミクロスフィアの前記セットが結合する細胞の存否を少なくとも同定し、 早い癌スクリーニングパネルを形成することを更に特徴とする請求項１記載の方 法。
17. １７．前記細胞の前記第１の部分を、各セットが少なくとも１つの型の癌細胞に 存在し得る異なる特異的な分子に特異的に結合する異なる反応体を有し、ミクロ スフィアのセットの各々が互いに異なる光学的特徴を有する、ミクロスフィアの 多数のセットに混合し、及び顕微鏡にて前記細胞の少なくとも幾つかを光学的に 観察し、ミクロスフィアの前記異なるセットに結合する細胞の存否を少なくとも 同定することを更に特徴とする請求項１記載の方法。
18. １８．前記細胞の前記第１の部分を、ミクロスフィアの前記多数のセットに同時 に混合することを更に特徴とする請求項１７記載の方法。
19. １９．ミクロスフィアの前記セットの各々がサイズ又は色において物理的に異な ることを更に特徴とする請求項１７記載の方法。
20. ２０．全血試料又はその一部分を形成し、且つ、前記細胞の少なくとも幾つかを 形態学的に特徴付け、前記特徴付けられた細胞における多数の結合したミクロス フィアの存在を同定することを含むことを更に特徴とする請求項１記載の方法。
21. ２１．前記細胞の前記第１の部分を、ミクロスフィアの前記第１のセットと混合 することを更に特徴とする請求項１記載の方法。
22. ２２．癌に対する顕微鏡的細胞を光学的にスクリーニングする方法において、 癌細胞であると思われる少なくとも幾つかの細胞を有する多数の細胞を含む試料 を形成し； スライド上に前記細胞の第１の部分の第１の塗沫標本を調製し； 組織学的なタイプの染色にて前記第１の塗沫標木を染色し；顕微鏡にて前記細胞 の少なくとも幾つかを光学的に観察して、潜在的な癌細胞の存在を少なくとも同 定し；前記細胞の少なくとも第２の部分を、少なくとも１つの型の癌細胞に存在 し得る少なくとも１つの特異的な分子に特異的に結合する少なくとも第１の反応 体を有するミクロスフィアの少なくとも１つのセットに混合し；ミクロスフィア の前記セットを、前記ミクロスフィアに結合するどんな細胞と共にでも、前記第 ２の部分から除去し；前記ミクロスフィアを含むスライド上に前記細胞の第２の 塗沫標本を調製し、 組織学的なタイプの染色にて前記第２の塗沫標本を染色し；及び 前記第２の塗沫標本における前記第２の部分の細胞の少なくとも幾つかを光学的 に観察し、及び前記第２の塗沫標本を前記第１の塗沫標本と比較して癌細胞の前 記潜在的な型の存否を同定することを特徴とする癌細胞に対する顕微鏡的細胞の 光学的スクリーニング方法。
23. ２３．癌細胞であると思われる少なくとも幾つかの細胞と共に多数の細胞を含む 試料について癌に対する顕微鏡的細胞の光学的スクリーニングのための装置にお いて、前記細胞の少なくとも第１の部分を、好くなとも１つの型の癌細胞に存在 し得る少なくとも第１の特異的な分子に特異的に結合する少なくとも第１の反応 体を有するミクロスフィアの少なくとも第１のセットに混合する装置；前記ミク ロスフィア含むスライド上に、前記細胞の塗沫標本を調製する装置； 組織学的なタイプの染色にて前記塗沫標本を染色する装置；及び 顕微鏡にて前記細胞の少なくとも幾つかを工学的に観察して、ミクロスフィアの 前記第１のセットに結合する細胞の存否を少なくとも同定し、癌スクリーニング 情報を提供す装置；からなることを特徴とする癌に対する顕微鏡的細胞の光学的 スクリーニングのための装置。
24. ２４．前記試料が全血試料又はその一部であり、且つライトタイプ染色にて前記 塗沫標本を染色する装置を有することを更に特徴とする請求項２３記載の装置。
25. ２５．前記第１の反応体が、第１の細胞抗原である少なくとも前記第１の特異的 な分子に特異的な抗体であることを更に特徴とする請求項２４記載の装置。
26. ２６．キレート化剤を前記試料に添加して、好中球集団が前記ミクロスフィアを 取り込むことを防止する装置を有することを更に特徴とする請求項２４記載の装 置。
27. ２７．前記塗沫標本を像解析する装置を有することを更に特徴とする請求項２４ 記載の装置。
28. ２８．前記細胞の少なくとも幾つかを形態学的に特徴付ける装置及び前記特徴付 けられた細胞における結合されたミクロスフィアの存否を同定する装置を含むこ とを更に特徴とする請求項２４記載の装置。
29. ２９．前記塗沫標本を像解析する装置を有することを更に特徴とする請求項２３ 記載の装置。
30. ３０．前記細胞の前記第１の部分を、少なくとも１つの型の細胞に存在し得る少 なくとも第２の特異的な分子に特異的に結合する少なくとも第２の反応体を有す るミクロスフィアの前記第１のセットとは異なる光学的特徴を有する、ミクロス フィアの少なくとも第２のセットに混合する装置及び顕微鏡にて前記細胞の少な くとも幾つかを光学的に観察し、ミクロスフィアの前記第２のセットに結合する 細胞の存否を少なくとも同定する装置を有することを更に特徴とする請求項２３ 記載の装置。
31. ３１．前記細胞の前記第１の部分を、ミクロスフィアの少なくとも前記第１及び 第２のセットを同時に混合する装置を有することを更に特徴とする請求項３０記 載の装置。
32. ３２．前記ミクロスフィアの前記第１及び第２のセットがサイズにおいて物理的 に異なることを更に特徴とする請求項３０記載の装置。
33. ３３．前記ミクロスフィアの前記第１及び第２のセットが色において光学的に異 なることを更に特徴とする請求項３０記載の装置。
34. ３４．前記細胞の少なくとも第２の部分を、少なくとも第２の型の癌細胞に存在 すると思われる少なくとも第２の特異的な分子に特異的に結合する少なくとも第 ２の反応体を有するミクロスフィアの少なくとも第２のセットに混合する装置； 前記ミクロスフィアを含むスライド上に、前記細胞の塗沫標本を調製する装置； 組織学的なタイプの染色にて前記塗沫標本を染色するそう装置；及び 顕微鏡にて前記細胞の少なくとも幾つかを光学的に観察して、ミケロスフイアの 前記第２のセットが結合する細胞の存否を少なくとも同定する装置を有すること を更に特徴とする請求項２３記載の装置。
35. ３５．前記ミクロスフィアの前記第１及び第２のセットがサイズにおいて物理的 に異なることを更に特徴とする請求項３４記載の装置。
36. ３６．前記ミクロスフィアの第１及び第２のセットが色において光学的に異なる ことを更に特徴とする請求項３４記載の装置。
37. ３７．前記第１の反応体がＣＤ４モノクローナル抗体であり、前記第２の反応体 がＣＤ８モノクローナル抗体であり、前記ＣＤ４及びＣＤ８モノクローナル抗体 ミクロスフィアが結合する細胞の存否がＨＴＬＶ−１白血病の指標であることを 更に特徴とする請求項３４記載の装置。
38. ３８．前記細胞の多数の異なる部分を、異なる型の癌細胞が存在すると思われる 異なる特異的な分子に特異的に結合する異なる反応体を有するミクロスフィアの 各々異なるセットに混合する装置； 前記ミクロスフィア含む分離したスライド上に、前記異なる細胞部分の分離した 塗沫標本を調製する装置；組織学的なタイプの染色にて前記塗沫標本を染色する そう装置；及び 顕微鏡にて前記各塗沫標本における前記細胞の少なくとも幾つかを光学的に観察 して、ミクロスフィアの前記セットが結合ずる細胞の存否を少なくとも同定して 、早い癌スクリーニングパネルを提供する装置を有することを更に特徴とする請 求項２３記載の装置。
39. ３９．前記細胞の前記第１の部分を、各セットが少なくとも１つの型の癌細胞に 存在し得る異なる特異的な分子に特異的に結合する異なる反応体を有し、ミクロ スフィアの各セットが互いに異なる光学的特徴を有する、ミクロスフィアの多数 のセットに混合する装置；及び 顕微鏡にて前記細胞の少なくとも幾つかを光学的に観察して、ミクロスフィアの 前記異なるセットが結合する細胞の存否を少なくとも同定する装置を有すること を更に特徴とする請求項２３記載の装置。
40. ４０．前記細胞の前記第１の部分を、ミクロスフィアの前記多数のセットに同時 に混合する装置を有することを更に特徴とする請求項３９記載の装置。
41. ４１．ミクロスフィアの各前記セットがサイズ又は色において物理的に異なるこ とを更に特徴とする請求項３９記載の装置。
42. ４２．前記試料が全血試料又はその一部分であり、前記細胞の少なくとも幾つか を形態学的に特徴付け、前記特徴付けられた細胞における多数の結合されたミク ロスフィアの存在を同定することを含む装置を有することを更に特徴とする請求 項２３記載の装置。
43. ４３．前記細胞の前記第１の部分を、ミクロスフィアの前記第１のセットと混合 する装置を有することを更に特徴とする請求項２３記載の装置。
44. ４４．癌細胞であると思われる少なくとも幾つかの細胞と共に、多数の細胞を含 む試料について癌に対する顕微鏡的細胞の光学的スクリーニングのための装置に おいて、スライド上に前記細胞の第１の部分の第１の塗沫標木を調製する装置； 組織学的なタイプの染色にて前記第１の塗沫標本を染色する装置； 顕微鏡にて前記細胞少なくとも幾つかを光学的に観察して潜在的な癌細胞の存在 を少なくとも同定する装置；前記細胞の少なくとも第２の部分を、少なくとも１ つの型の癌細胞に存在し得る少なくとも１つの特異的な分子に特異的に結合する 少なくとも第１の反応体を有するミクロスフィアの少なくとも１つのセットに混 合する装置；前記第２の部分から、前記ミクロスフィアに結合するどんな細胞と 共にでもミクロスフィアの前記セットを除去する装置； 前記ミクロスフィアを含むスライド上に細胞の前記第２の部分の第２を調製する 装置； 組織学的なタイプの染色にて前記第２の塗沫標木を染色する装置；及び 前記第２の塗沫標本における前記第２の部分の細胞の少なくとも幾つかを光学的 に観察する装置及び前記第２の塗沫標本前記第１の塗沫標本と比較して前記潜在 的なタイプの癌細胞の存否を同定する装置を有することを特徴とする癌に対する 顕微鏡的細胞の光学的スクリーニングのための装置。