JPH06501024A - 皮膚腫瘍形成を予防し、存在する腫瘍の後退の原因になるための医薬組成物と方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 皮膚腫瘍形成を予防し、存在する腫瘍の後退の原因になるための医薬組成物と方 法発明の胃景 発明の分野 本発明は、皮膚腫瘍形成を予防し、存在する腫瘍の後退の原因になるための医薬 組成物と方法に関する。

更に特定すると、本発明は前ガン病変と皮膚ガンを治療するための方法に関して いて、その方法はインドールカルバゾール化合物の有効量を患者に投与すること 並びにインドールカルバゾール組成と医薬的に受容できる賦形剤を含有する医薬 的組成物に関する。

関連技術の記述 上皮ガンを予防し又は治療する今までの試みは二つの戦略に依存していた。その 一つでは、概してＤＮＡ合成を直接に妨害しそして正常細胞と腫瘍性の両方の細 胞を殺滅する毒性のある医薬を使用することである。殺滅の機構は直接の細胞毒 機構による。二番目の戦略は、以前から使用されていた方法であり、ビタミンＡ の類似のレチノイド類で治療することによる腫瘍の予防である。レチノイドの作 用機構は理解されていないが、その影響は治療的であるよりむしろ抑制的である 。終期の正常の分化過程の誘導はなく、レチノイドの使用を止めると、腫瘍は元 に戻る。従って、上皮ガンばかりでなく前ガン病変を治療するための方法であっ て、腫瘍細胞を標的とするように正常の生理的経路を利用する方法を発見するこ とが要望されている。更には、単に抑制的効果よりというよりは治療的効果を持 てるような、腫瘍細胞の終期分化の原因になる治療法を発見することが要望され ている。

マウス皮膚発癌モデルは、上皮新生物の発達における初期発生事実並びに腫瘍進 行を伴う後の変化における洞察を可能にした。ｉｎ　ｖｔｔｒｏでケラナノサイ トを生育できることは、皮膚新形成において重要である遺伝的及び機成の事実の 解析を更に容易にする。例えば、腫瘍プロモーターであるＴＰＡ”は、培養した 初期マウスケラナノサイトでは成熟の強力な誘導剤であるが、新生細胞ではそう ではない。この　ｆｎ　Ｖｉｔｒａ　における異なる応答は、ホルボールエステ ルはｉｎ　ｖｉｖｏにおける腫瘍形成を促進する機構への洞察を可能にする。発 生したマウスの皮膚への１２−０−テトラデカノイルホルボールアセテート（Ｔ 　Ｐ　Ａ）の繰り返しの適用は、分化−抵抗性発生細胞の乳頭腫中への純系膨張 を可能にする正常ケラナノサイトの成熟と剥離の促進を伴う。この観察に対する 重要な結論は、新生のケラナノサイトの分化する能力を復活させることは、それ らに非−発腫瘍性を与えるということである。

プロティンキナーゼＣ（ＰＫＣ）は、タンパク質をセリンとスレオニン残基にお いてリン酸化するリン脂質依存性のキナーゼの族からなる。ホルボールエステル は、ＰＫＣに結合しそしてＰＫＣを活性化するので、この酵素は、初Ｍのケラナ ノサイトにおける分化誘導マーカーのようなＴＰＡ−仲介応答に関係する。ＰＫ Ｃの機能を更によく理解するための試みで、阻害剤のある種のものが使用された ；しかし残念なことに、これらの全てが他のプロティンキナーゼも阻害し、それ が無傷の細胞を使用する結果の説明を複雑にする。

現在入手できる最も強力な阻害剤の一つは、スタウロスポリンであり（タマオキ 、Ｔ、他、［スタウロスポリン（Ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ）、リン脂質／Ｃ ａ３４′″依存性プロテインキナーゼの強力な阻害剤Ｊ　、　Ｂｉｏｃｈｅ！Ｉ １．　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍｕｎ、、　１３５：　３９７−４０２．１９８６）、それはＰＫＣの触 媒領域と相互作用することによりｉｎ　ＶｉｔｒＯ中　ナノモルの薬量でＰＫＣ を阻害する（ナカダテ、Ｔ、他、「阻害作用の機構を明瞭するためのプロティン キナーゼＣの機能検定の比較Ｊ　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、 、　３７：　１５４１−１５４５．１９８８；及び グロス、Ｊ、Ｌ、他「プロティンキナーゼＣへの［３Ｈ］ジメチルスタウロスポ リンの特異結合の特定ノ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、、　４０：　３４３−３５０．１９９ ０）。

スタウロスポリンは幾つかの非上皮細胞型におけるＴＰＡの効果を阻害するもの の（サコ、Ｔ、他、ｒプロティンキナーゼＣ阻害剤であるスタウロスポリンの、 ヒト好中球とマウス表皮初期細胞への作用の対比」。

Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　４８：　４６４６−４６５０．１９８８；エーデル フィーンＡ、Ｇ、Ｈ，他、「プロティンキナーゼＣ阻害剤ニスタウロスポリンと Ｈ−７，の、ウサギの膵臓小胞からのコレサイストキニン（ｃｈｏｌｅｃｙｓｔ ｏｋｉｎｉｎ）−誘導＃素分泌に対する非類似効果Ｊ　、　Ｂｕｒ、　Ｊ。

Ｂｊｏｃｈｅｍ、、　１９３：　２９１−２９５．１９９０；ヴエゲスナ、Ｒ， Ｖ、他、ｒスタウロスポリンは、プロティンキナーゼＣを阻害し、ＲＢＬ−１細 胞におけるホルボールエステル仲介−ロイコトリエンＤ４受容体不感化を予防す る。Ｊ　、　Ｍｏ１．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、、３３：　５３７−５４２．１９ ８８；及び ワトソン、ｓ、ｐ、他［プロティンキナーゼＣ阻害剤であるスタウロスポリンの 、ヒト血小板に対する作用。

トロンビンによるイノシトール＝トリホスペードの形成におけるプロティンキナ ーゼＣについての調節的役目に対する事実。Ｊ　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、、 　２４９：　３４５−５０．１９８８）、それはマウスの初期ケラナノサイトに おけるＴＰＡ−仲介成熟を阻害しモしてＴＰＡ露出のある種の応答の特徴を誘導 するのに成功しなかった（サコ、Ｔ、他、「プロティンキナーゼＣ阻害剤である スタウロスポリンの、ヒト好中球とマウス表皮初期細胞への作用の対比」。

Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、４８：　４６４６−４６５０．１９８８）。

以前には、ヒト膀胱ガン細胞で注射したマウスへのスタウロスポリンの全身投与 が、最大耐性薬量の１／１０又は１／２０で腫瘍の生育を約６０％抑制できたこ とが報告されている（マイヤー他、「スタウロスポリンの誘導体（ＣＧＰ　４１ 　２５１）は、プロティンキナーゼＣ抑制についての選択性とｆｎ　ｖｉｔｒｏ の抗−増殖活性並びにｉｎ　ｖｉｖｏの抗腫瘍活性を示すＪ　、Ｉｎｔ、　Ｊ、 　Ｃａｎｃｅｒ、　４３゜（１９８９）、　８５１−８５６頁）。

細胞培養検定を使用して、シュヴアルッ他（「侵入性ヒト膀胱ガン細胞の侵入の 阻害Ｊ　、　Ｊ、ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔ。

Ｃａｎｃｅｒ　ｒｎｓｔ、、８２巻、　Ｎｏ、２２．　１７５３−１７５６頁、 　（１９９０年１１月２１日発行））は、スタウロスポリンは膀胱ガン細胞のＩ ｌ瘍細胞の侵入を阻害しているかも知れないと示唆したがｉｎ　ｖｉｖｏではこ れは確認されなかった。

オンライアン他　扁集、（スタウロスポリン：腫瘍細胞侵入の阻害剤の新規類の 前駆型？　Ｊ　、　Ｊ、　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔ。

Ｃａｎｃｅｒ　ｒｎｓｔ、、８２　Ｓ、　Ｎｏ、２２．　１７３４−１７３５頁 、　（１９９０年１１月２１日発行））は、スタウロスポリンは、そのプロティ ンキナーゼを阻害する能力の故に抗膿瘍活性を持っているかも知れないと述べて いる。

マイヤー他、シュヴアルッ他とオンライアン他の全ては、皮膚のガン性又は前ガ ン性の状態を治療するのにスタウロスポリンを使用することを開示していない。

上述の記述を観ると、皮膚のガン性又は前ガン性の状態を治療するための有効且 つ治療的である方法を得ることが要望されている。

本発明の概要 従って、本発明の目的は、皮膚のガン性又は前ガン性の状態を予防且つ治療する 方法であって上述の問題を克服する方法を提供することである。

本発明の別の目的は、医薬的組成物と存在する皮膚の新生物的病変の退行の原因 になる方法を提供することである。

本発明の別の目的は、上皮ガンばかりでなく前ガン病変を治療する方法であって 、腫瘍細胞を標的とするように正常の生理的経路を利用する方法を提供すること である。

本発明の更に別の目的は、上皮ガンばかりでなく前ガン病変を治療する方法であ って、その方法が履瘍細胞の終期分化の原因になりそれにより治療効果が得られ る方法を提供することである。

本発明の更に又別の目的は、スタウロスポリンと他の強力なインドールカルバゾ ール化合物を局所適用する方法であって、皮膚腫瘍細胞の形成を予防しそして皮 膚腫瘍Ｊｌ［Ｉ胞における終期分化を誘導し、かくして腫瘍塊の永久的根絶の原 因になる方法を提供することである。

上述の目的地は、皮膚の前ガン性とガン性の状態を治療するための方法であって 、インドールカルバゾール化合物と医薬的に受容できる賦形剤を含有する組成物 の有効量を患者に投与することを包含する方法を提供することによる本発明に従 って達成される。

本発明の別の実施態様は、皮膚の前ガン性とガン性の状態を、インドールカルバ ゾール化合物と医薬的に受容できる賦形剤を含有する組成物を患者の皮膚に局部 的に投与することにより治療することである。

本発明の別の実施態様では、医薬的組成物が提供されることであって、その組成 物は次式のインドールカルバゾール化合物と組み合わせた医薬的に受容できる局 所的担体を含有する： （式中、Ｒ１は水素原子又はベンジル基を表し；Ｒ２は水素原子又はベンゾイル 基を表し；そしてＲ８は水素原子又はヒドロキシを表す。）。

ＯＲ。

式２ （式中、Ｒ＋（よ水素原子又は低級アルキル基を表し；Ｒ２はカルボキシル基又 は低級アルキル基でエステル化されたカルボキシレート基を表し； Ｒ３は水素原子又は低級アルコキシ基を表し；そしてＲ４とＲ６は水素原子を表 す。）。

本発明の適用性の別の観点は、下記の詳細な記述と図面から明瞭になる。しかし 、好ましい実施態様を示している詳細な記述と具体例は説明だけのために記載さ れたものであると理解されなければならない：というのは本発明の精神と範囲内 のいろいろの変化と改良はこの詳細な記述から当業者にとって明瞭になるからで ある。

図面の簡単な説明 本発明を下記の添付した図面の簡単な説明するニス１は、初期のケラナノサイト におけるスタウロスポリンとＴＰＡが誘導した形態的変化の位相差顕微鏡写真（ 倍率：Ｘ９０）を示す。

図２は、ＴＰＡとスタウロスポリンの投与量に対する表皮のトランスグルタミナ ーゼの活性を示すグラフである。

図３は、スタウロスポリンとＴＰＡによる不溶性膜の誘導を示すグラフである。

図４は、新生ケラナノサイト細胞系におけるスタウロスポリンが誘導した形態的 分化の位相差顕微鏡写真（倍率：Ｘ９０）を示す。

図５は、ＴＰＡとスタウロスポリンの薬量に対する表皮のトランスグルタミナー ゼの活性を示すグラフである。

図６は、スタウロスポリンとＴＰＡによる不溶性膜のｍｓを示すグラフである。

図７は、スタウロスポリンに暴露した初期のケラナノサイトにおける不溶性膜形 成を部分的に阻害するＰＫＣの下方調節を示すグラフである。

図８は、初期ケラナノサイトにおけるオルニチン−デカルポジラーゼ活性のスタ ウロスポリンによる誘導を示すグラフである。

図９は、スタウロスポリンとＴＰＡによる　１ｌｌｌ　ＥＧＦの阻害を示すグラ フである。

図１０は、ＰＫＣの下方調節が、’！’Ｉ−ＥＧＦ結合のスタウロスポリン仲介 阻害を部分的に阻害していることを示すグラフである。

図１１は、スタウロスポリンとＴＰＡによるｃ−ｆｏｓｍ−ＲＮＡの誘導を示す プロット解析である。

１１１２は、４０ｋＤタンパク質のリン酸化を、ＴＰＡが誘導し、そしてスタウ ロスポリンが誘導しないことを示すプロット解析である。

図１３−１８は、実施何重ないし１６の各々の結果を示すプロット解析である。

発明の詳細な説明 本発明の目的は、末端分化の正常状態の誘導によって、上皮置型、及び他の上皮 に誘発された腫瘍（これは、同様な暴露に対して感受性であってよい）の生成を 阻止することである。腫瘍形成における初期の変化は、信号（これは通常、親組 繊細胞中の末端分化を誘導する）の抵抗である。それ故、腫瘍細胞は、前記組織 の正常細胞が末端的に分化するであろう条件下で成長する。培養液中及び生体内 における腫瘍性の皮膚細泡内では、本発明のスタウロスポリン及びインドールカ ルバゾール化合物は、各々、分化を誘発するための及び腫瘍生成を阻止するため の潜在的能力を有している。本発明のインドールカルバゾール化合物は、正常な 生理学的径路（これは、腫瘍細胞中で変更される）を侵害することにより作用を 示す、即ち、スタウロスポリン及び可能であれば他のインドールカルバゾール化 合物は、分化の正常なプログラムを促進させるための前記変換を逆転させ得る。

それ故、末端分化（これは明らかに、腫瘍細胞からなる治療された有機体から除 去する）は、治療における結果よりもむしろ治療における結果として生じる。

本発明者らは、スタウロスポリン及び可能であれば他のインドールカルバゾール 化合物は、とりわけ一定の投与量において、通常プロティンキナーゼＣの活性化 に寄与する変化を生じさせ得るということを発見した。ホルボールエステルは、 正常な皮膚細胞中でプロティンキナーゼＣを活性化するが、しかし皮膚腫瘍細胞 中では有効でない。しかしながら、スタウロスポリンは適当な投与量において、 皮ｌＩＩＭ！瘍細胞中で通常の本ルボールエステル様の効果を生じさせる。スタ ウロスポリンは、培養液中の皮膚腫瘍細胞に末端分化を生じさせ、酵素トランス グルタミナーゼを刺激し、細胞膜の架橋及び細胞死を生じさせる。スタウロスポ リン及びインドールカルバゾール化合物の前記活性は不可逆的であり、且つ幾つ かの種類の良性の及び悪性の皮膚腫瘍細胞に対して作用する。

良性の皮膚腫瘍細胞がマウスの皮膚に移植された場合には、それらは数週間以内 に腫瘍を形成する。しかしながら、スタウロスポリンを用いる移植部位の治療は 、不可逆的に腫瘍形成を完全に阻止する。皮膚の初期癌及び癌状態の局処的治療 のだめのスタウロスポリンを包含するインドールカルバゾール化合物は本発明に より包含されるので、前記化合物の全身的施薬は皮膚における癌の成長に影響を 及ぼし得る又は癌抑制治療剤として作用し得る。プロティンキナーゼＣは細胞中 の分化も調節するので、他の上皮的な標的部位、例えば結腸、膀胱及び肺も、本 発明の前記化合物を用いる治療によって影響を及ぼされ得る。

本発明の方法及び薬用組成物において有用なインドールカルバゾール化合物は、 下記式： Ｃ式中、Ｒ，は水素原子又はベンジル基を表わし；Ｒ１は水素原子又はベンジル 基を表わし；そしてＲ１は水素原子又はヒドロキシ基を表わす〕、 式２ 〔式中、Ｒ１は水素原子又は低級アルキル基を表わし；Ｒ８はカルボキシル基又 は低級アルキル基を用いてエステル化されたカルボキシレートを表わし；Ｒ，は 水素原子又は低級アルキル基を表わし：そしてＲ４及びＲ，は水素原子を表わす 〕で表わされる化合物を包含する。

好ましい化合物は、以下の表１．２及び３中に掲げられた化合物を包含する。

化合物　Ｒ，Ｒ，Ｒ。

Ｉ　ＨＨＨ ２Ｈベンジル基　Ｈ ３ベンジル基　ベンジル基　Ｈ ４ＨＨＯＨ Ｈ２ ＯＲ。

式２ ％式％ とりわけ好ましい化合物は、スタウロスポリンである。

式１及び２によって示される表１及び２中に掲げられたインドールカルバゾール 化合物は、全て従来技術において公知の化合物である。化合物１はスタウロスポ リンであり、そしてタカハシ（Ｔａｋａｈａｓｉ）他、”ＵＣＮ−Ｏｌ、ストレ プトミセスから得られたプロティンキナーゼＣの選択的阻害薬（ＵＣＮ−０１， ａ　５ｅｌｅｃｔｉｖｅ　１ｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｏｆｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａ ｓｅ　Ｃｆｒｏｍ　ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）　’　、　Ｊ、　Ａｎｔｉｂｉ 。

ている。化合物２及び３は、メイヤー（Ｍａｙｅｒ　）他、“スタウロスポリン 誘導体（ＣＧＰ　４１２５１）は、プロティンキナーゼＣ阻害のための選択性、 及び生体外における抗−増殖性、並びに生体内における抗−腫瘍活性を示す〔Ａ 　ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ　ｏｆ　５ｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ　（ＣＧＰ　４１ ２５１）　ｓｈｏｗｓ　５ｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｆｏｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋ ｉｎａｓｅ　Ｃ１ｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ａｎｄ　１ｎｖｉｔｒｏ　ａｎｔｉ−ｐ ｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ　ａｓ　ｗｅｌｌ　ａｓ　ｉｎ　ｖｉｖｏ　ａｎｔｉ −ｔｕｍｏｒａｃｔｉｖｉｔｙ）　’、４３　：８５１−８５６．　１９８９に 記載されている。化合物４は、タカハシ（Ｔａｋａｈａｓｉ）他、“プロティン キナーゼＣに対する７−０−メチルＵＣＮ−０１の有効な選択的阻害（Ｐｏｔｅ ｎｔ　５ｅｌｅｃｔｉｖｅ　１ｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　７−０−ｍｅｔｈｙ ｌ　ＵＣＮ−０１ａｇａｉｎｓｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅｃ）’、　Ｊ 、　Ａｎｔｊｂｉｏｔｉｃｓ、３９：１０５９−１０６５゜１９８８；及びヤス ザワ（Ｙａｓｕｚａｗａ）他、“新規プロティンキナーゼＣ阻害剤に一２５２ａ 、ｂ、Ｃ及びｄの構造（Ｔｈｅ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅｓ　ａｆ　ｔｈｅ　ｎａｖ ｅｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　Ｃｊｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　Ｋ−２５２ａ 、ｂ、ｃ、ａｎｄ　ｄ）　″、　Ｊ、　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ、３９：１０７ ２−１０７８．１９８６．及びナカニシ（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ　）他、”Ｋ−２ ５２ｂ、ｃ及びｄ、微生物源から得られたプロティンキナーゼＣの有効な選択的 阻害剤（Ｋ−２５２ｂ、ｃ　ａｎｄ　ｄ、ｐｏｔｅｎｔ　１ｎｈｉｂｉｔｏｒｓ 　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　Ｃｆｒｏｍ　ｍ１ｃｒｏｂｊａｌ　ｏ ｒｉｇｉｎ）　’　、　Ｊ、　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ、３工：１０６６ｉ０７ １，１９８６に記載されている。

化合物７は、ナカニシ（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ　）他、“ＫＴ５９２６、ミオシン ライトチェインキナーゼの有効な且つ選択的阻害剤（ＫＴ５９２６．ａ　ｐｏｔ ｅｎｔ　ａｎｄ　５ｅｌｅｃｔｉｖｅ　１ｎｈｆｂｉｔｏｒｓｏｆ　ｍｙｏｓｉ ｎ　Ｈｇｈｔ　ｃｈａｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　）　’　、Ｍｏ１．　Ｐｈａｒｍａ ｃｏｌ、、３７：４８２−４８８．１９９０に記載されている。

化合ｌ４Ｊ８及び９は、カセ（Ｋａｓｅ）他、“Ｋ−２５２化合物、プロティン キナーゼＣ及び環式ヌクレオチド−依存性プロティンキナーゼの新規な且つ有効 な阻害剤（Ｋ−２５２ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ、ｎｏｖｅｌ　ａｎｄ　ｐｏｔｅｎｔ 　１ｎｈｆｂｉｔｏｒｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ　Ｃａｎｄ　ｃｙ ｃｌｉｃ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｆｎｋｉｎ ａｓｅｓ　）　’　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏ ｏ＋ｍｕｎ、、１４−２：４３６−４４０．１９８７に記載されている。

本発明において用いられるインドールカルバゾール化合物は、角化練細胞腫、光 線性角化症、基底細胞腫、鱗細胞腫、ボークエン病（Ｂｏｗｅｎ’ｓ　ｄｉｓｅ ａｓｅ　）及びポルカニ（ｂａｒｒｕｃａｅ）を包含する種々の初期癌の病変及 び皮膚癌を治療するために使用される。本発明に基づ（治療方法の第一の態様は 、上皮腫瘍及び／又は初期癌の病変を治療するためにインドールカルバゾール化 合物及び薬学的に許容され得る賦形剤を含む薬用組成物の有効量を患者に施薬す ることを包含する。

本発明の第二の態様においては、皮膚の初期癌及び癌状態は、インドールカルバ ゾール化合物及び薬学的に許容され得る賦形剤を含む薬用組成物を患者の皮膚に 局処的に施薬することによって治療する方法が提供される。

局処的治療は、存在する病変に対する直接的な及び選択的な有効成分の塗布を行 い、それ故、病変が存在しない部位に対する可能な毒性を最小とする。

本発明により包含される薬用組成物は、薬学的に許容され得る賦形剤、例えば代 表的な担体を伴う上記インドールカルバゾール化合物を含む。

本発明において用いられるインドールカルバゾール化合物は、適当な薬学的に許 容され得る担体又は希釈剤と配合することによって薬用組成物に調製されてよ（ 、そして固体、半固体、液体又は気体の形態、例えばタブレット、カプセル、粉 剤、粒剤、軟膏、クリーム、ローション、溶液、座薬、注射薬、吸入剤、及びそ れらの個々の施薬経路のための通常の方法におけるエーロゾルの製剤に製剤化さ れてよい。

下記の方法及び賦形剤は単なる何示であり、そして全（限定的なものではない。

薬剤の投与形態においては、本発明において用いられるインドールカルバゾール 化合物は、それらの薬学的に許容され得る塩の形態で使用されてよ（、そして単 独で又は適当に組み合わせて、並びに他の薬剤的な有効成分と配合して使用され てよい。

経口製剤の場合には、インドールカルバゾール化合物は、タブレット、粉剤、粒 剤又はカプセルを調製するために、単独で又は適当な添加剤と配合して、例えば 慣用の添Ｉａ剤例えばラクトース、マンニトール、コーンスターチ又はポテトス ターチと共に；結合剤例えば結晶性セルロース、セルロース誘導体、アカシア、 コーンスターチ又はゼラチンと共に；砕解剤例えばコーンスターチ、ポテトスタ ーチ又はカルボキシメチルセルロースナトリウムと共に；潤滑剤例えばタルク又 はステアリン酸マグネシウムと共に；並びに所望により、希釈剤、緩衝剤、湿潤 剤、防腐剤及び風味剤と共に、使用されてよい。

更に、本発明において用いられるインドールカルバゾール化合物は、種々の基剤 例えば乳化性基剤剤又は水溶性基剤と共に混合することにより、座薬に調製され てよ本発明において用いられるインドールカルバゾール化合物は、それらを水性 又は非水性溶媒、例えば植物油、合成脂肪酸グリセリド、高級慶肪酸のエステル 又はプロピレングリコール中に；及び所望により、慣用の添加剤何えば可溶化剤 、等張剤、懸濁剤、乳化剤、安定剤及び防腐剤と共に、溶解、懸濁又は乳化する ことにより、注射のための製剤に製剤化され得る。

吸入剤又はエーロゾル製剤の場合には、液体又は微細粉末の形態にある本発明に おいて用いられるインドールカルバゾール化合物は、ガス状又は液体状噴霧剤と 共に、及び所望により、慣用の助剤例えば給湿剤と一緒に、エーロゾル容器内に 充填されてよい。それらは非加圧製剤のための薬剤として、例えばネブライザー 又はアトマイザ−に関して製剤化されてもよい。

本発明において用いられるスタウロスポリン又はインドールカルバゾール化合物 の使用すべき量は、遭遇した病気の程度及び病気の段階に従って変化する。標的 にされた初期癌又は癌細胞に対して局部的に塗布される適当な局外的投与量は、 ６．２５−０．００６２５ナノモル／ｃｍ”、更に好ましくは０．６２５−０． ００６２５ナノモル／ｃｍ”である。この投与は、施薬、溶媒、毒性又は疼痛の 過程により表わされ得る。

経口施薬のための単位投与形態例えばシロップ、エリキシル、及び懸濁液（この 場合、各投与単位例えば茶さじ一杯、テーブルスプーン一杯は、本発明において 用いられるインドールカルバゾール化合物の予め決定された量を含む）は、薬学 的に許容され得る担体例えば注射用無菌水、ＵＳＰによるもの、又は通常の食塩 水によるものであってよい。

本発明において用いられるインドールカルバゾール化合物は、座薬を経由して直 腸的に施薬され得る。座薬は賦形剤例えばココアバター、カルボワックス及びポ リエチレングリコール（これらは体温で溶解するが、室温ではまだ固化されてい る）を含んでいてよい。

本発明において用いられるインドールカルバゾール化合物は、吸入剤を経由して 施薬すべきエーロゾル製剤として眉いられてよい。本発明において眉いられるイ ンドールカルバゾール化合物は、加圧された許容され得る推進体例えばジクロロ ジフルオロメタン、プロパン、窒素及び同種のもの中に製剤化されてよい。

本文中で使用される用語“単位投与形態″は、ヒト及び動物対象のための単位的 な投与として適当な物理的に分離している単位（各単位は、薬学的に許容され得 る希釈剤、担体又は運搬体と組み合わせて望ましい効果を得るために充分な量と して計算されたインドールカルバゾール化合物の予め決定された量を含んでいる ）を表わす。

本発明の新規単位投与形態のための取り扱いは、用いられる特定の化合物及び得 られる効果、並びにホスト内の各化合物と一緒になった薬理学に依存する。

薬学的に許容され得る賦形剤、例えば運搬体、助剤、担体又は希釈剤は、一般の 人々が容易に利用可能である。

投与における如何なる必要な助剤も、病理学の厳格さに合致させて容易に調製さ れ且つ当業者によって容易に調整され得る。

プロティンキナーゼＣ作用薬のスタウロスポリンによる誘導 正常の及び癌のマウスの効果及び成熟 生体外におけるケラナノサイト スタウロスポリンは、カリホルニア州、ラ　ジタラＣＬａ　Ｊｏｌｌ＆）のカル ビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）社から購入した：ＴＰＡは、マサチューセッ ツ州、ヲーボーン（ＷＯｂｕｒｎ）のエルシー　サービセス（ＬＣ５ｅｒｖｉｃ ｅｓ　）社から購入した。　ｓＨ−プトレシン、′４Ｃ−才ルニチン、　１″′ Ｉ−ＥＧＦ　（表皮成長因子）、及びγ”Ｐ−ＡＴＰは、マサチューセッツ州、 ボストン（Ｂｏｓｔｏｎ）のエヌイーエヌ（ＮＢＮ　）社から購入した。ＥＧＦ （受容体グレード）は、マサチューセッツ州、ベッドフｔ−ド（Ｂｅｄｆｏｔｄ 　）のコラボラティブ　リサーチ（ｅｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒ ｃｈ）社から購入した；そしてジギトニン（〜５０％粉末）は、ミズーリ州、セ ントルイス（Ｓｔ、　Ｌｏｕｔｓ　）のジグｖ（Ｓｉｇｍａ　）社から購入した 。ブリオスタチン（ブリオスタチン１）は、アリシナ州、テンペ（Ｔｅｍｐｅ　 ）　ｒ　アリシナ州立大学（Ａｒｉｚｏｎａ　５ｔａｔｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔ ｙ）のジー、アール。

ベティット博士（ＤＲ，Ｇ、　Ｒ，Ｐｅｔｔｉｔ）により、多量に提供された。

細胞培養： 主な上皮ケラナノサイトは、記載された如（〔ヘニングス、エッチ、（Ｈｅｎｎ ｉｎｇｓ、Ｈ，）他、“培養液中のマウス上皮細胞の成長及び分化のカルシウム 調節（ＱＢｌｃｉｕｍｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　ｄ ｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｏｕｓｅｅｐｆｄｅｒｍａｌ　ｃｅｌ ｌｓ　ｉｎ　ｃｕｌｔｕｒｅ＞　”　、　Ｃｅ１ｌ、１９　：　２４５−２５４ ．１９８０）、新生Ｂａ１ｂ／ｃマウスから単離された。癌ケラナノサイト細胞 ライン３０８は、生体内において７，１２−ジメチルベンズ［ａ］チアンラセン を用いて教示されたＢａ１ｂ／ｃマウス皮膚から確立され、ｓｐ−ｉ細胞ライン は、７．１２−ジメチルベンズ［ａ］チアンラセン及び１２−Ｏ−テトラデカノ イルポルボール（ＴＰＡ）促進〔ストリックランド、ジエイ。

イー、（５ｔｒｉｃｋｌａｎｄ、　Ｊ、　Ｂ、　）他、“活性化されたｒａｓＨ ａ厘瘍ゲン腫瘍み且つ無胸腺症のヌードマウスホストに関する皮膚移植において 乳頭腫を形成するネズミの上皮細胞ラインの発現（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏ ｆ　ｍｕｒｉｎｅ　ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｃｅｌｌ　１ｉｎｅｓ　ｗｈｉｃｈ　 ｃｏｎｔａｉｎ　ａｎ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｒａｓＨａ　ｏｎｃｏｇｅｎｅａ ｎｄ　ｆｏｒｍ　ｐａｐｉｌｌｏｍａｓ　ｉｎ　５ｋｉｎ　ｇｒａｆｔｓ　ｏｎ 　ａｔｈｙｍｉｃ　ｎｕｄｅ　ｍｏｕｓｅ　ｈｏｓｔｓ　）　’　、　Ｃａｎｃ ｅｒ　Ｒｅｓ、、　４　Ｂ　＋　１８５−１８９．１９８８）を用いた教示によ ってセンカーマウス（Ｓｅｎｃａｒ　ｍ１ｃｅ　）に関して産生された乳頭腫か ら確立された。３０８及びＳＰ−１細胞の両方は、免疫欠損症のマウスの背に移 植された場合には、良性の乳頭腫を形成する〔ストリックランド、ジェイ、イー 、（Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ、Ｊ、Ｂ、）他、“活性化されたｒａｓＨａ腫瘍ゲン を含み且つ無胸腺症のヌードマウスホストに関する皮膚移植において乳頭腫を形 成するネズミの上皮細胞ラインの発現（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｍｕｒ ｉｎｅ　ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｃｅｌｌ　１ｉｎｅｓ　ｗｈｉｃｈ　ｃｏｎｔａ ｉｎ　ａｎ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｒａｓＨａ　ｏｎｃｏｇｅｎｅ　ａｎｄ　ｆ ａｒｍ　ｐａｐｉｌｌａｔｎａｓｉｎ　５ｋｊｎ　ｇｒａｆｔｓ　ｏｎ　ａｔｈ ｙｍｉｃ　ｎｕｄｅ　ｍｏｕｓｅ　ｈｏｓｔｓ　）″。

ＣａｎｃｅｒＲｅｓ、、４８：　１６５−１６９．１９８８）＋＋主な並びに癌 のケラナノサイトは、８％混合（ｃｈｅｌｅｘｅｄ）胎児子牛血清及び１％抗生 ／抗真菌溶液を含むイーグルの最小基本媒体（Ｅａｇｌｅ’ｓ　ｍ１ｎｉａ＋ｕ ｍ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｔｎｅｄｉｕｍ）中で培養された〔ヘニングス、エッ チ、（Ｈｅｎｎｉｎｇｓ、Ｈ，）他、“培養液中のマウス上皮細胞の成長及び分 化のカルシウムｍｍ　（ＣａｌｃｉｕＬｌｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｒ ｏｗｔｈ　ａｎｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｏｕｓｅ　ｅｐ ｉｄｅｒｍａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｃｕｌｔｕｒｅ）　”　。

Ｃａ１ｌ、±９：２４５−２５４．１９８０）、特記しない限り、前記媒体中の Ｃａ　”″の濃度は、非分化！Ｂ胞の基準細胞様母集団を保持するために０　、 　０５　ｍＭｌ：ＴｌＩｎされた〔ユスパ、ニス、エッチ、（Ｙｕｓｐａ、Ｓ、 　Ｈ，）他、“ネズミの上皮分化マーカの発現は、生体外における限定された細 胞外のカルシウム濃度によって厳密に調節される（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ 　ｍｕｒｉｎｅ　ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｍａ ｒｋｅｒｓ　ｉｓ　ｔｉｇｈｔｌｙ　ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｂｙ　ｒｅｓｔｒｉ ｃｔｅｄ　ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｅａｌｃｉｕｍ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａ ｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　）　’　、　Ｊ、　Ｃｅ１ＩＢｉｏ１．．１０ ９：１２０７−１２１７．１９８９）。

酵素分析： 上皮のトランスグルタミナーゼの活性は、ジメチルカゼイン（２０）に対するｓ Ｈ−プトレシンの架橋を測定することによって決定された。細胞溶解産物は、組 織トランスグルタミナーゼを不活性化するために１ｏ分間３７℃でインキュベー トされた。細胞溶解産物のオルニチンデカルボキシラーゼ活性は、”Ｃ−オルニ チンからの”　ＣＯ＊の放出を定量することによって決定された（サコ、ティー 、（Ｓａｋｏ、Ｔ、　）他、“主なマウス上皮細胞に間するホルボールエステル 腫瘍促進剤の効果のブリオスタチンｌによる部分的な並行現象及び部分的な遮断 （Ｐａｒｔｉａｌ　ｐａｒａｌｌｅｌｉｓｍ　ａｎｄ　ｐａｒｔｉａｌ　ｂｌｏ ｃｋａｄｅ　ｂｙ　ｂｒｙｏｓｔａｔｉｎ　１　ｏｆ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　 ｐｈｏｒｂｏｌ　ｅｓｔｅｒ　ｔｕｍｏｒ　ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ　。

ｎ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｍｏｕｓｅ　ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｃｅｌｌｓ　）　’　 、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、。

角質化された膜の定量： ケラナノサイトは、僅かな変法を用いて、記載の如（〔ナガエ、ニス、（Ｎａｇ ａｅ、　Ｓ、　）他、“角質化された膜生成に関するレチン酸の効果：生体内及 び生体外における自発的膜生成の間の相違、及び膜受容能力の発現（Ｅｆｆｅｃ ｔ　ｏｆ　ｒｅｔｉｎｏｉｃ　ａｃｊｄ　ｏｎ　ｃｏｒｎｉｆｉｅｄ　ｅｎｖｅ ｌｏｐｅ　ｆｏｒｍａｔｉ。

ａ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｂｅｔｙｔｅｅｎ　５ｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ　ｅｎ ｖｅｌｏｐｅ　ｆｏｒｍａｔｉ。

ｎ　ｉｌｌ　ＶｉＶｏ　０ｒ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ａｎｄ　ｅＸｐｒｅｓｓｉＯ ｎ　ｏｆ　ｅｎＶｅｌｏｐｅ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ　）　’　、　Ｊ、　Ｉｎ ｖｅｓｔ、　Ｄｅｒｍａｔｏｌ、、８９　：　５１−５８．１９８７）、角質化 された膜生成のために分析された。移動性細胞は、Ｃａ　”及びＭｇ■を含まな いホスフェート緩衝化食塩水（ＰＢＳ）を使用する２回洗浄を伴う、各々の６０ ｍｍ皿からの培養媒体の捕集及び混合によって取り込まれた。細胞は、ベンチト ップ医療用遠心分離機内で１１００Ｏｒｐで５分間ペレット化し、次いで溶解緩 衝液（ＰＢＳ中の２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及び２０ｍＭジチオト レイトール１００μｍ中に再懸濁された。付加された細胞は２５０μｍ溶解緩衝 液中に取り込まれ、移動性細胞からなる組成物と混合され、次いで１０分間９５ ℃でインキュベートされた。

非可剪化された、そのままの角質化された！！！（末端的に分化されたケラナノ サイトが特徴）は、血球針を使用して計数されたＣナガエ、ニス、（Ｎａｇａｅ 、　Ｓ、　）他、“角質化された膜生成に関するレチン酸の効果：生体内及び生 体外における自発的膜生成の間の相違、及び膜受容能力の発現（Ｅｆｆｅｃｔ　 ｏｆ　ｒｅｔｉｎｏｉｃ　ａｃｉｄ　ｏｎ　ｃｏｒｎｉｆｉｅｄ　ｅｎｖｅｌａ ｐｅ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｂｅｔｗｅｅｎ　５ｐｏｎ ｔａｎｅｏｕｓ　ｅｎｖｅｌａｐｅ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｖｉｖｏ　Ｏ ｒ　ｉｎ　ＶｉｔｒＯａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　。

ｆ　ｅｎｖｅｌｏｐｅ　ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ　）　”　、Ｊ、Ｉｎｖｅｓｔ、 Ｄｅｒｍａｔｏｌ、。

８９：５１−５８．１９８７）。

Ｉ″Ｊ−上皮成長因子（ＥＧＦ）結合：ＥＧＦ結合は、２．５Ｘ１０”細胞／穴 の細胞密度に作られた６−大組織培養皿で観察された〔ストリックランド、ジェ イ、イー、（Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ、Ｊ、Ｅ、　）他、″上皮成長因子と、発癌 に対して抵抗性及び感受性であるマウスの基準の及び分化された上皮細胞との干 渉（Ｉｎｔｅｒａｃｔｆａｎ　ｏｆ　ｅｐｆｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａ ｃｔｏｒ　ｗｉｔｈ　ｂａｓａｌ　ａｎｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ　 ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｏｆ　ｍ１ｃｅ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ａｎ ｄｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｔｏ　ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ　）　’　、　Ｃ ａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ。

旦ニア３５−７４０．１９８４）。処理後、培養物は４℃で結合性緩衝液（５０ ｍＭ　Ｎ、Ｎ−ビス−（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノスルホン酸（ｐＨ ６，８）及び１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンを含むズルベツコの最小基本媒体 （Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｉｎｉｍｕｍ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｍｅｄｉｕｍ 　）　）を用いて２回洗浄され、次いで氷床上で４−６時間、　■″Ｉ−ＥＧＦ 　（１，４Ｘ１０’　ｄｐｍ）を含む１ｍｌ結合性緩衝液を用いてインキュベー トした〔ストリックランド、ジエイ、イー、（Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ、Ｊ、Ｅ、 　）他。

“上皮成長因子と、発癌に対して抵抗性及び感受性であるマウスの基準の及び分 化された上皮細胞との干渉（Ｉｎｔｅｒａｃｔｉａｎ　ａｆ　ｅｐｉｄｅｒｍａ ｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｗｉｔｈ　ｂａｓａｌ　ａｎｄ　ｄｉｆｆｅ ｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ　ｅｐｉｄｅｒＩｎａｌ　ｃｅｌｌｓ　ａｆ　ｍ１ｃｅ　 ｒｅｓｊｓｔａｎｔ　ａｎｄ　５ｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｔｏ　ｃａｒｃｉｎｏｇｅ ｏｅｓｉｓ　）　”　、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｊｓ、５ニア３５−７４０． １９８４）６培養物の第二のセットは、放射性配位子の非特異的結合性を観察す るために、更に、１μｇ／ｍｌ非標識化ＥＧＦを受け入れた。インキュベーショ ン期間に続いて、培養物は氷冷した結合性緩衝液を用いて４回洗浄され、１．５ ｍｌ溶解緩衝液（０，ＩＭ　Ｆリス（ｐＨ７，４）、０．５％ＳＤＳ、１ｍＭ　 ＥＤＴＡ）中に取り込まれ、次イテシンチレーション計数によって放射能決定さ れた。

ＲＮＡ単腫およびノーザンプロット分析ＲＮＡは、５．７Ｍ塩化セシウムグラジ ェントを用いるグアニジンイソチオシアネート溶１液の超遠心分離により単離さ れた（　Ｃｈｉｒｇｗｊｎ、　Ｊ、　Ｍ、等、「リボヌクレアーゼを増やした供 給源から生物学的に活性なリボ核酸の単離Ｊ　、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 　１８　：　５２９４−５２９９．１９７９）。

全ＲＮＡ２０ｕｇが列あたり注入され、そして０．６６Ｍホルマルアルデヒドを 含有する１％アガロースゲル中で電気泳動を行った（Ｄａｖｊｓ等、「分子生物 学における基本的方法Ｊ、ニューヨーク：エルゼビア、１９８６）。ＲＮＡは強 化されたニトロセルロースＭ　（ＢＡ−３ＮＣ；シュライヒャー・アンド・シュ ーエル。

キーン、ニューハンプシャー）にプロブトされ、そして真空オーブン内で２時間 焼き付けた。フィルターを以前記載されたように（Ｙｕｓｐａ、　Ｓ、　Ｈ，等 、「マウス表皮分化マーカーの発現は制限された細胞外カルシウム濃度により試 験管内で強く制御されるＪ　、　Ｊ、　ＣεＬＬ、ＢｉｏＬ、、　１０９：　１ ２０７−１２１７．１９８９　）　５０　％＊Ｊｋム７ミド含有緩衝液中、４２ ℃で一晩前もってハイブリッド形成させ；プローブ約２０Ｘ１０＠ｄｐｍを添加 し、そしてハイブリッド形成が一晩行われた。最後の洗浄が０．１％ＳＯＳを含 む０．２ＸＳＳＣを眉いて６５℃で行われた。フィルターがコダックＸ−Ｏｍａ ｔＡＲフィルムにスクリーンを補強しながら一７０℃で暴露された。マウスｃ− ｆｏｓ転写物がフィンケルービスキスージンキレス（ＦＢＪ）マウス肉腫ウィル ス配列（Ｃｕ構造：関連ヘルパーウィルスの分子クローニングおよびマウスとヒ ト細胞からのｖ−ｆｏｓ遺伝子の細胞相同性」。

Ｍａｔ、　Ｃｅ１１．　ＩＪｉｏＬ、、　３　：　９１４−９２１．１９８３　 ）からの１２２ｋｂ＃ｇｌｌ［ないしＳａｔ　Ｉフラグメントを用いて検出され た。オートラジオグラフィーに続いて、残りのプローブが脱イオン水中の１％グ リセロール中、８０℃で２分間の洗浄により除去され（Ｄａｖｉｓ、　Ｌ、Ｇ、 等、「分子生物学における基本的方法」、ニューヨーク：エルゼビア、　１９８ ６）　、そしてフィルターは、ｐＵｃ１８ベクター内の全長ラットグリセルアル デヒドホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｃＤＮＡに再びハイブリッ ド形成させた（Ｆｏｒｔ、　Ｐ、等、「種々のラット成熟組織はグリセルアルデ ヒド−３−ホスフェート−デヒドロゲナーゼマルチ遺伝子ファミリーからの１つ の主なｍＲＮＡ種のみを発現するＪ　、　ＮｕｃＬｅｉｃ、　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒ ｔｓ、、　１３：　１４３１−１４４２．１９８５　）　、プローブは５×１０ ”ｃｐｍ／μｇＤＮＡの比活性までランダムプライムにより標識された。

細胞透過性およびｔｔｐ標識化リンすンパク質分析第−次マウス角化細胞が実質 的に記載されたように（８ｒｕｓａｌｉｍｓｋｙ、　Ｊ、Ｄ、等、「ジアシルグ リセロール。

およびホルボルエステルは透過性にされた３Ｔ３細胞においてＭｒ＝８００００ タンパク質キナーゼＣ基質のリン酸化を急激に刺激するＪ　、　Ｊ、　Ｂｉａｓ 、　Ｃｈｅｒｔ、、　２θ３　：１９１８８−１９１９４．１９８８）　”Ｐ− 人ＴＰの取込みを促進するためにジギトニンで透過性にされた。異なるジキトニ ン濃度で透過性の効果をまず評価するため１こ、ＤＮＡ結合性フルオロクロムプ ロビデイウムヨーダイト５−１０　μｇ／ｍ　１　（Ｊｏｎｅｓ、　Ｋ、Ｈ，等 、「フルオレセインジアセテートーブロビデイウムヨーダイドでの同時染色によ り細胞の生存を検出するための改良方法」。

Ｊ、　ＨＩｓｔｉｃｈｅｔｘ、　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、、　３３　：　７７−７９ ．１９８５　）が標識ＡＴＰの代わりに透過緩衝液に添加された。３７℃で１− ３分間の保温後、緩衝液が除去され、そして細胞は蛍光Ｒ微鍍の前にＰＢＳで３ −４回洗浄された。

プロビデイウムヨーダイトは無傷の細胞には浸透しないので、透過性は核蛍光を 示す細胞の出現により確認された。＊ｓｐＨ朧に続いて、細胞はすぐに集められ 、そして溶菌液をＳＤＳ／８．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。

概略の分子量が予め染色されたマーカー（アマルシャム、アーリントン・）Ａイ ツ。

イリノイ）を用いて決定された。乾燥ゲルをコダックＸ−ＯｍａｔＡＲフィルム に一７０℃で現像前に暴露した。

種々のアブセイ 細胞毒性はトリバンブルー排除を生存細胞のマーカーとして用いて決定された。

８０ｍｍ培養皿中番；成長する細胞をＰＢＳで１回洗浄し、通常の食塩水（ギブ コ、ロブクビイル、メリーランド）中の０．４％トリバンブルー１ｍｌと室温で 保温し、ＰＢＳで２回洗浄し、次いで細胞を数えるまで氷上に置いた。細胞溶菌 液中のタンパク質は市販の比色定量法（パイオーラド・ラボラトリーズ、リッチ モンド、カリフォルニア）を用いて決定された。

結果 ＴＰＡおよびスタウロスポリンの両方は第一次角化細胞の成熟を試験管内で誘導 する。

０．０５ｍＭＣａ”培地中で成長した第一次角化細胞は十分に規定された細胞間 空間を有する基本的細胞様表現型および特徴的な丸石様の外観を示す。図１は、 スタウロスポリンおよびＴＰＡが第一次角化細胞における同様の形態学的変化を 誘導することを示す。０゜１％ＤＭＳＯ１１０ｎＭスタウロスポリンまたは１６ ０ｎＭ　ＴＰＡを含存するＷｒ＃な培地を５日齢の第一次角化細胞培養物に添加 した。位相差顕微鏡写真が処理語始後の示された時間で撮影された。同様の結果 が３回の追加の実験で得られた。倍率はｘ９０だった。

１０ｎＭスタウロスポリンまたは１８０ｎＭＴＰＡの添加により、２０分後に最 初に検出可能である細胞形態の急速な変更が結果として生じた。両方の薬剤が伸 長された形態を３時間までに誘導する間に、ＴＰＡに暴露した細胞はより強く変 更され、そして先細の樹脂状突起様変化をしばしば示す（図１）。２４時間後、 ＴＰＡ処理培養物中の細胞の約５０％がよせ集められ、そして基質から分離され た（ｉｌｌ）：これは、ｏ、０５ｍＭＣａ”を育する培地において分化を薬学的 に誘導されず、そして非特異的細胞毒性を反映しない角化細胞における特徴的応 答である。ＴＰＡと異なり、スタウロスポリンに２４時間暴露された培養物中の ほぼ全ての細胞は、い（つかの小さい２極性細胞をあとに残して基質から分離さ れた（図１）。ＴＰＡ処理培養物中の多くの残りの細胞はケラチン１４に対して 免疫反応性であり、一方、スタウロスポリン処理培養物には何も陽性ではなく　 （データは示されていない）、スタウロスポリンは基質から実質的に全ての角化 細胞の分離を誘導することを示す。１０ｎＭスタウロスポリンへの形態学的応答 が直接細胞毒性により引き起こされるか否かを決定するために、スタウロスポリ ンに暴露された第一次角化細胞がトリバンブルー排除により追跡された。ＤＭＳ Ｏ対照および≦１０ｎＭスタウロスポリンと処理された培養物おいて、細胞のく ５％がトリパンブルーを取り込んだ。しかし、予期しなかったわけではないが、 実質的な細胞損傷がより高いスタウロスポリン投与量の際に、１μＭスタウロス ポリンへの７．５時間暴露後にトリバンブルー「陽性」の細胞７４％でもって得 られ辱る（データは示していない）。

これらの発見は、１０ｎＭスタウロスポリンに対する形態学的応答が大きな細胞 毒性なしに生じることを示す。

表皮トランスグルタミナーゼ活性は生体内および試験管内の両方で角化細胞の最 終的な分化において高められる。８ＥＩ齢の第一次角化細胞へのスタウロスポリ ンまたはＴＰＡのいずれかの添加は、表皮トランスグルタミナーゼの投与量依存 性誘導を結果として生じる。

図２は、スタウロスポリンおよびＴＰＡの両方が第一次角化細胞において表皮ト ランスグルタミナーゼを投与量に依存した様式で活性化することを示す。８日齢 の培養物は示された投与量でスタウロスポリンまたはＴＰＡを含む１．４ｍＭＣ ａ”培地の添ｍ９時間後に集められた。対照培養物（ＯｎＭ投与量）は０．１％ ＤＭＳＯと処理された。各点は誤差の範囲が示された２つの皿の平均である。ス タウロスポリンは１０ｎＭで酵素活性が４倍の増加を示し：ＴＰＡは１００およ び１１０００ｎで５倍の増加を示した（図２）。スタウロスポリンによるトラン スグルタミナーゼ活性の誘導はｌＱｎＭの投与量まで強く制限されており、一方 、ＴＰＡ関与活性は１０ｎＭないル１０μＭの範囲の投与量で生じる。より高い スタウロスポリン投与量でのトランスグルタミナーゼの誘導の不在は１１００ｎ 以上の濃度での毒性作用と一致するが、一方、１０ｎＭ投与量はプログラムされ た応答を引き出す。

表皮トランスグルタミナーゼの活性化は、最終的に分化した角化細胞の特徴的な 硬質の界面活性剤不溶性の不溶性膜の集合を結果として生じる。角化細胞の成熟 を誘導するスタウロスポリンの能力をさらに評価するために、不溶性膜形成が０ ，１％ＤＭＳＯ１１０ｎＭスタウロスポリンまたは１６（］ｎＭ　ＴＰＡを育す る培地に２４時間暴露した７日齢の第一次角化細胞培養物において調べられた。

スタウロスポリンが対照培養物に対して不溶性族において５倍の増加を誘導し： ＴＰＡが４倍の増加を誘導する。ｒｇＪ３は、スタウロスポリンおよびＴＰＡの 両方が第一次角化細胞において不溶性膜を誘導することを示す。７日齢の第一次 角化細胞培養物を、０．１％ＤＭＳＯ１１０ｎＭスタウロスポリンまたは１６０ ｎＭ　ＴＰＡに２４時間暴露した。浮遊および付着した細胞集合体が集められ、 そして不溶性族が単離された。データは３回の別々の皿に対する平均値±該平均 値の１種の実験からの標準誤差である。同様の結果が追加の実験で得られた。Ｔ ＰＡおよびスタウロスポリンによる表皮トランスグルタミナーゼ活性および不溶 性膜形成の両方の誘導は、両薬剤が培養された第一次マウス角化細胞の成熟を誘 導することを示す。

ＴＰＡではな（スタウロスポリンが新生角化細胞の成熟を試験管内で誘導する。

新生角化細胞の基本的欠点は、それらに正常細胞よりも存利な強力な成長を供給 する、ＴＰＡまたは高められた細胞外Ｃａ　”のいずれかに応答して分化できな いことである。スタウロスポリンはこの薬Ｍに暴露された第一次マウス角化細胞 のほぼ全体の集合体に分化を誘導するから、我々は同様の応答が新生細胞に誘導 され得るか否かの決定に興味をもった。分析のために選択された３０８およびＳ Ｐ−１と表記される２つの細胞系は、試験管内で最終的に分化するように誘導さ れ得ず、そしてヌードマウスの背中に移植された場合に良性の乳頭腫を生じる。

スタウロスポリンへの２４時間の暴露後、３０８およびＳＰ−１の両方の細胞は 第一次細胞に見られたものと同様の形態学的変化を示し、一方、ＴＰＡへの暴露 は、ＤＭＳＯ処理対照と比較した場合、いずれの細胞系の外観を明確には変えな い。図４は、スタウロスポリンが新生角化細胞系において形態学的分化を誘導す ることを示す。３０８およびＳＰ−１角化細胞系を、０．１％ＤＭＳＯ１１６Ｃ １ｎＭ　ＴＰＡまたは１０ｎＭスタウロスポリンに２４時間暴露した。ＴＰＡに 対する応答がなかったことに注意せよ。同様の結果が各細胞系に対する３回の追 加の実験で得られた。倍率は×９０だった。ＴＰＡは１．６ｎＭないし１６ｕＭ に及ぶ投与量で形態学的分化等に無効だった（データは示していない）、スタウ ロスポリンに対する全体の応答パターンは、３０８およびＳＰ−１細胞において 第一次角化ａｍにおけるのと同様であるけれども、この作用の動力学は異なって おり：少なくとも４８時間の処理は第一次角化細胞に対する２４時間と比べ、こ の細胞系において最大の応答に要求される。

スタウロスポリンが第一次細胞において示すように新生角化細胞においてこの分 化マーカーを誘導するか否かを決定するために、表皮トランスグルタミナーゼが アブセイされた。スタウロスポリンへの５Ｐ−ＩＡＩ胞の暴露は、酵素活性にお いて１１００ｎで最大の５０倍誘導する、投与量に依存した増加を生じた。図５ は、スタウロスポリンが新生角化細胞において表皮トランスグルタミナーゼを投 与量に依存した様式で誘導することを示す。表皮トランスグルタミナーゼ活性は 示された濃度のスタウロスポリンまたはＴＰＡに２４時間暴露した５日齢のＳＰ −１細胞の培養物中で決定された。対Ｍ培養物（ＯｎＭ投与量）は０．１％ＤＭ ＳＯと処理された。各データポイントは誤差のＷ１囲が示された２つの皿の平均 である。ＩＯｎＭスタウロスポリンおよび１６０ｎＭ　ＴＰＡを用いる追加の実 験では同様の結果を得た。第一次角化細胞と同様に、より高い投与量は無効だっ た。スタウロスポリンとは異なり、ＴＰＡはＩＯＥ）Ｍないし１０μＭに及ぶあ らゆる投与量で表皮トランスグルタミナーゼ活性への検出可能な作用を示さなか った（図５）。

不溶性膜形成もまた、スタウロスポリン処理新生細胞の培養物において決定され た。スタウロスポリンには暴露されたが、ＴＰＡに暴露されなかった場合に、両 方の細胞系が不溶性膜を形成した。５ｐ−ｉ細胞ではスタウロスポリンにより不 溶性膜の１０倍の誘導があり、３０８細胞では６０倍の誘導があった。図６は、 スタウロスポリンが新生角化細胞において不溶性膜を誘導することを示す。３０ ８およびＳＰ−１細胞を、１．４ｍＭＣａ”培地中の０．１％０ＭＳ０，１８０ ｎＭ　ＴＰＡまたは１０ｎＭスタウロスポリンに暴露した。３日後、細胞を集め 、そして不溶性膜を単離した。表皮トランスグルタミナーゼ活性に対する結果と 一致して、不溶性膜形成はＴＰＡ処理培養物において誘導されなかった。これら のデータは、スタウロスポリンが分化の誘導物質としてＴＰＡまたはＣａ！◆の いずれかに対する応答において全体的に無効である新生角化細胞系において成熟 の効力のある誘導物質であることを示す。

スタウロスポリンはＰＫＣアゴニストの特有のある種のその他の応答を誘導する 。

第一次角化細胞において表皮トランスグルタミナーゼおよび不溶性膜形成を誘導 するＴＰＡおよびその他のホルボルエステルの能力はＰＫＣ活性化がこの作用に 包含されることを示愛する。スタウロスポリン、ＰＫＣ阻害剤による同様の応答 の誘導はそのためにＭ待されなかった。我々は角化細胞中でのスタウロスポリン 関与応答におけるＰＫＣの潜在的包含をさらに調べるための２つの試みを行った ：　１）ＰＫＣを欠くようにした細胞がスタウロスポリンに応答するそれらの能 力に対して分析された；　ＴＰＡの作用をＷｉ認する同様の研究からの結果はホ ルボルエステルに対する種々の応答にＰＫＣを強く関与させた；　２）ＰＫＣ活 性と関連した種々のその他の応答を引き出すスタウロスポリンの能力が試験され た二オルニチンデカルボキシラーゼの誘導、　ロ’Ｉ−ＥＧＦ結合の阻害、Ｃ− ７０５ｍ　ＲＮへの発現、およびタンパク質リン酸化。

スタウロスポリン関与不溶化はＰＫＣ欠如第一次角化細胞において特にブロック される。

プリコスタチンは、角化細胞におけるＰＫＣのホルボルエステル結合邦位と相互 作用し、そして多くのＰＫＣ関与応答をブロックする非常に強力なＰＫＣモジュ レータ−であり（５ａｋｏ、　Ｔ等、「第一次マウス表皮細胞へのホルボルエス テル腫瘍プロモーターの作用のプリコスタチン１による部分的類似性および部分 的封Ａ［Ｊ　、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｚｓ、、　４７　：　５４４５−５４５０． １９８７；　Ｊｅｔｔｅｎ。

Ａ、　Ｍ、等、「ホルボルエステル、プリコスタチンおよびレチノイン酸のコレ ステロールスルフェート合成への作用：ヒト表皮角化細胞における分化の多段階 作用との関係Ｊ　、　Ｊ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　ＤｅｒｗａｔｏＬ、、　９３：　 １０８−１１５．１９８９；およびＧｓｃｈｗｅｎｄｔ、　Ｍ等、　「プロティ ンキナーゼＣの活性化因子は生体内および試験管内でホルボルエステルＴＰＡの 生物学的作用をまねし、ならびに阻害するＪ　、　Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉ ｓ、　９　：　５５５−５６２．１９８８　）　、そしてその他の細胞型におけ る上記のような非常に強力なＰＫＣ％シュレータ−である（ＤｅｌｌｏＡｑｕｉ ｌａ、　Ｍ、Ｌ、等。

ｒヘギサメチレンビスアセトアミドー処理フリエントエリスロロイケミア細胞に おける分化のホルボルエステル誘導ブロックのプリコスタチン１による阻害Ｊ。

Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　４７　：　８００６−６００９．１９８７；　Ｊｅ ｔｔｅｎ、　Ａ、Ｍ。

等、「ヒト気管支表皮細胞におけるホルボルエステルーおよびジアシルグリセロ ール誘導鱗状分化へのプリコスタチンおよびレチノイン酸の影響Ｊ＋Ｃａπｃａ ｒ　Ｉ？ｔｓ、。

４９　：　３９９０−３９９５．　１９８９；　Ｋｒａｆｔ、　Ａ、Ｓ、等、　 ［リンｆｉｔ質依存タンパク質キナーゼの活性化因子はヒト前骨髄球白血球ＨＬ −６０のホルボルエステル誘導分化をブロックする）　、　ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ Ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪｓＡ、　８３：　１３３４−１３３８．１９ ８６．およびＭｃＢａｆｎ、　Ｊ、Ａ、等、ｒプ’）ｙス９チン１はヒト結腸が ん細胞において１２−〇−テトラデカノイルー１３−アセテートの最終的分化作 用と拮抗するＪ　、　Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｔｓｉｓ、９：　１２３−１２９． １９８８　）　ｃ＋スタウロスポリン関与不溶性膜形成は、ＴＰ人処理培養物の 場合のように、プリコスタチン前処理によりブロックされる。図７は、ＰＫＣの 低下へのｆｌＩＩｌＩがスタウロスポリンに暴露された第一次角化細胞における 不溶性膜形成を部分的に阻害することを示す。７日齢の第一次角化細胞を８０ｎ Ｍブリョスタチンと、またはそれなしに１５時Ｗ！Ｉ′ｊ＃養した。１０ｎＭス タウロスポリンまたは１６０ｎＭ　ＴＰＡ士ブリタスタチンを存する新鮮な培地 がさらに４６時間添加され、そして不溶性膜が単離された。各データのバーは誤 差のバーにより示された範囲を有する２つの皿の平均値である。追加の実験にお いて、ブリ３スタチン前処理はスタウロスポリンおよびＴＰＡ処理培養物におい て７０％まで不溶性膜形成を低下させた。これらのデータはスタウロスポリンに 対するこの応答においてＰＫＣの包含を示す。

スタウロスポリンおよびＴＰＡの両方は第一次角化細胞においてオルニチンデカ ルボキシラーゼ活性を誘導する。

ＴＰＡと同様に（Ｙｕｓｐａ、　Ｓ、　Ｈ，等、「ホルボルエステルはマウス表 皮細胞培養物においてＤＮＡ合成およびオルニチンデカルボキシラーゼ活性を刺 激する」。

Ｎａｔｕｒｅ、　２６２　：　４０２−４０４．１９７６　）　、７．タウロス ポリンへの暴露は培養された第一次マウス角化細胞においてオルニチンデカルボ キシラーゼ活性の誘導を結果として生じる。図８は、スタウロスポリンが第一次 角化細胞においてオルニチンデカルボキシラーゼ活性を誘導することを示す。示 された濃度のスタウロスポリンに５時間暴露された第一次マウス角化細胞培養物 はオルニチンデカルボキシラーゼ活性の分析のために集められた。各点は４つの 皿に対する平均値士該平均値の１種の実験からの標準誤差である。同様の結果が 追加の実験で得られた。トランスグルタミナーゼのスタウロスポリン関与誘導の 場合のように、この応答は５と１０ｎＭの狭い投与量ｍｇに制限されている。

スタウロスポリンおよびＴＰＡの両方は第一次角化細胞において”’Ｉ−ＥＧＦ 結合性を阻害する。

種々の培養細胞型の７２人への暴露は、ＥＧＦ受容体のＰＫＣＩｌ［与すン醗化 によると考えられるＥＧＦ結合性の阻害を結果として生じる（Ｄｉａｍａｎｄ、 　Ｌ、、　ｒ腫瘍プロモーターおよび細胞形質転換Ｊ　、　Ｄ、　Ｇｒｕｎｂｅ ｒｇｅｒおよびＳ、　Ｐ、　Ｇａｆｆ！ｉ、　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｏｆ　Ｃ ｔＬＬｕＬａｒ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｒｚａｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｃａγｃｉｎｏｇｔ ｎｉｃ　Ａｇεｎｔｓ所収、　ｐｐ、７３−１３３゜ニューヨーク：ベルガモン プレス、　１９８７）。ＴＰＡおよびスタウロスポリンは第一次角化細胞への１ １１−ＥＣＦの結合性を迅速に阻害する：１６０ｎＭ　７２人への暴露は対照に 比べ９４％低下を生じ、１０ｎＭスタウロスポリンは７２％の低下を生じる。図 ９は、スタウロスポリンおよびＴＰＡが”Ｉ−ＥＧＦ結合性を投与量に依存した 様式で阻害することを示す。７Ｂ齢の第一次角化細胞が異なる投与量のスタウロ スポリンまたはＴＰＡと２．５時間処理された。各データポイントは３つの皿に 対する平均１ｚ″Ｉ−ＥＧＦ結合性士その平均値の標準誤差である。その他のパ ラメータに対して上記したように、１μＭスタウロスポリンに対する応答がない のはこの高い投与量での細胞毒性を反映し得る。

第一次角化細胞での　”’Ｉ−ＥＧＦの結合性の阻害におけるＰＫＣの役割を確 認するために、ＰＫＣ欠如細胞が培養物を６０ｎＭブリョスタチンに１日暴露す ることにより生成された。　１！″Ｉ−ＥＧＦ結合性の７２人およびスタウロス ポリン関与阻害の両方は４時間にわたり阻害された：プリコスタチン前処理はＴ ＰＡに対する応答を完全にブロックしたが、それはスタウロスポリンに対する応 答を平均５０％までブロックした。図１０は、ＰＫＣの低下制御がＣズ’Ｉ−Ｅ ＧＦ結合性のスタウロスポリン関与阻害を部分的に阻害することを示す。６Ｂ齢 の第一次角化細胞を６０ｎＭブリョスタチンと、またはそれなしに１日培養し、 次にスタウロスポリンまたはＴＰＡ士ブリョスタチンが示されるように添加され た。培養物が”’Ｉ−ＥＧＦの結合性の分析のために１．２および４時間後に集 められた。各点は３回の皿の平均上該平均の標準誤差である。

これらの発見は、ＰＫＣがＴＰＡおよびスタウロスポリンの両方に応答して　” ’Ｉ−ＥＧＦ結合性の阻害に包含されることを示咳する。

ＴＰＡおよびスタウロスポリンはｒ−ｆｏｓ　ｍ　ＲＮ八を誘導する。

７２人は、種々の細胞におけるＰＫＣ活性化のための宵月なマーカーであるがん 原遺伝子ｃ−ｆｏｓの転写物を迅速に誘導する（Ｃｕｒｒａｏ、　Ｔ、、ｒ　ｆ 　ｏ　ｓがん遺伝子」Ｅ、　Ｐ、　Ｒｅｄｄｙ、　Ａ、　Ｍ、　５ｋａｌｋａお よびＴ、　Ｃｕｒｒａｏ編、　Ｔｈｔ　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ所 収、　ＩＩＰ、　３０７−３２５．アムステルダムニエルゼビエル、　１９８８ ）。第一次マウス角化細胞において、ＴＰＡは８時間の処理の間に６時間で最大 発現となり、安定状態のｃ−ｆｏｓ　ｍ　ＲＮ　Ａの持続された増加を引き起こ す。図１１は、７２人およびスタウロスポリンがｃ−ｆｏｓ　ｍ　ＲＮ　Ａを誘 導することを示す。

６−７Ｂ齢の第一次角化細胞を０．５％血清含有完全培地中で１日成長させた。

試薬が培養培地に直接添加され、そしてＲＮＡ単離のために細胞が示された時間 に集められた。スタウロスポリン（ＳＴＳＰ）は７２人の直前に、これらの薬剤 が合わされる時、添加された。各列は全ＲＮＡ２（１３ｇを含有し；臭化エチジ ウムでの染色またはＧＡＰＤＨ対照ブコーブへのハイブリッド形成により全列に おける注入の均一さを確認した。Ｃ−１０５ｍＲＮ　Ａは１．２ｋｂ”Ｐ標識マ ウスｃ−ｆａｘ　ＤＮＡプローブを用いて同定された。示された結果は２つの別 々の実験からＲＮＡを用いて得られた。スタウロスポリンに暴露された培養物に おいて、ｃ−ｆｏｓはまた誘導されるが、ことなる動力学により、そして７２人 より程度が低かった。最大の誘導は１および６時間では非常に低いレベルである スタウロスポリン処１！８時間においてである（図１１）。スタウロスポリンお よびＴＰＡへの合併暴露は、ＴＰＡ単独に比べより高いＣ−ｆＯｓ　ｍ　ＲＮ人 の発現を誘導する（図１１）。

これらの結果は、ある種のＴＰＡ５１与応答をブロックするスタウロスポリンの 無効性およびそれが誘導し得るＴＰＡの類似性の両方を再び示す。

スタウロスポリンではなくＴＰＡがジギトニン透過角化細胞において〜４０ｋＤ タンパク質のリン酸化を誘導する。

これまで提示したデータはスタウロスポリンが以下の発見：１）スタウロスポリ ンに対する多くの応答のパターンがＴＰＡｌｌ露で見られるものと著しく類似し ていること、および２）これらの応答のいくつかがＰＫＣを欠如するようにした 細胞において少なくとも部分的にはブロックされることに基づいて角化細胞にお けるＰＫＣアゴニストとして作用するという仮説と一致する。キナーゼ活性に影 響を与えるスタウロスポリンの能力を直！ＩＩＩ認するために、ジギトニン透過 第一次角化細胞をγ”Ｐ−ＡＴＰと保温し、そして標識リンタンパク質をＳＤＳ ／ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより分析した。第一次角化ｌ１ＩＩ ａの１６０ｎＭ　ＴＰＡへの暴露により約４ｏｋＤ（ｐｐ４０）に泳動するバン ドの高められたリン酸化を生じた。図１２は、スタウロスポリンではなくＴＰＡ が４０ｋＤタンパク質のリン酸化を誘導することを示す。５日齢の第一次角化細 胞培養物を、０．１または０．２％ＤＭＳＯ１１６０ｎＭ　ＴＰＡ、１０ｎＭス タウロスポリン（ＳＴＳＰ）またはＴＰＡおよびスタウロスポリンを含有する透 過緩衝液（３０μＭジギトニン、１０μＭγ”Ｐ−ＡＴＰ　（比活性ＩＣｉ／ミ リモル〕）に３分間暴露した。細胞をすぐに集め、そしてタンパク囃　質をＳＤ Ｓ／ＰＡＧＥにより分離した。乾燥ゲルをコｔ　ダックＸ−ＯｍａｔＡＲフィル ムに−７０”Ｃで１２−２４時間現像前に暴露した。このバンドは、対照培養物 に比べ全体的にタンパク質リン酸化の低下を示したスタウロスポリンに暴露した 培養物中には検出されなかった（図１２）。０．１ないし５ｎＭに及ぶスタウ、 　ロスポリンのその他の投与量もまた、ｐｐ４０のリン酸化を誘導には無効だっ た（データは示されていない）。

ＴＰＡとスタウロスポリンとの併合暴露はｐｐ４０のＴＰＡ関与リン酸化をブロ ックした（［１２）。これらのデータは、この実験のために使用された条件下で は、スタウロスポリンが推定のＰＫＣ基質をリン酸化しないだけでなく、このタ ンパク質のＴＰＡ＠与リン酸化を阻害することを示す。

叉−」Ｌ−泗 スタウロスポリンは、培養されたマウス乳頭腫細胞ライン３０８および５Ｐ−１ において末端分化を誘起することが示され、これらラインはポルボールエステル 右よびＣａ”によりこの誘起に対し耐性がある。移植のために、ＢＡＬＢ／ｃ− 誘導された裸マウス、およそ２月令のものが宿主として使用された。動物はＮｅ ｍｂｕｔａｌにより麻酔されそして無菌外科技術が用いられた＃　０．５Ｘ１０ ’個の５Ｐ−１および３０８細胞が６−８Ｘ　１０’個の初期５ＥＮＣＡＲマウ ス皮膚線維芽細胞を伴って移植されたｅ　５ｔｒｉｃｋｌａｎｄ　ｅｔ　ａｌ、 　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　４８：　１６５−１６９（１９８８１に記載され るように、細胞ベレットはシリコーン室の中で移植ベッドに当て付けられた。細 胞は０．２５％トリプシン−０，０１％ＥＤＴＡを用いた３６℃でのおよそ１０ 分間の処理により培養皿から除去されそして培地により洗浄された。乳頭腫細胞 乞よび初期の皮膚線維芽細胞の懸濁液は１１０００ｒｐ、にて５分間遠心分離さ れ、培地は吸引され、そして無菌プラスチック転移ピペットを使用して細胞ベレ ットは移植ベッドに当で付けられた。カリパスを使用して、移植腫瘍は、週ごと に、移植後３週間目から始めそしてその後少なくともさらに５週間の間１寸法測 定をされた。およその腫瘍体積として、高さと最小および最大の横寸法とが乗じ られた。データはおよその腫瘍体積の平均値上平均の標？Ｓ誤差としてｍｍ”で 表現される。無胸腺の裸マウス宿主への３０８および５Ｐ−１細胞の移植は鱗状 乳頭腫な産生し、これは悪性の鱗状細胞癌の良性ｔｒＪ躯体である。これら乳頭 腫の成長はスタウロスポリンを用いた問題の処理により投与量依存の！ｇ様で阻 害され、これは移植後２遍間目から始まる。アセトン中の０．０２５ナノモルの スタウロスポリンに２週間ごとに曝すことは、阻害のために最適である。より高 い投与量（６，２５ナノモル／処理）は乳頭腫の成長を刺激するようである。移 植後２遍間目の１回の低投与量の処理もまた腫瘍の生成を減じ、このことは阻害 が永久的であることを示している。

衷１」■。

スタウロスポリンを用いた問題の処理はｌｔ、Ｈされた５Ｐ−１マウス乳頭腫細 胞からの腫瘍の生成を阻害する。

およその腫瘍体積は８週間の間２つの群について比較された。：アセトン（溶媒 ）対照群およびスタウロスポリン処理群、各群における５匹のマウスは、０．５ Ｘ１０’　（［ＤＳ　Ｐ　−１細胞＋６　Ｘ　Ｉ　Ｏ’　個）初期５ＥＮ（：Ａ Ｒ７ウス皮膚線維芽細胞により２／２８／９０移植された。

ＳＰ−１細胞は５ＥＮＣＡＲマウスにて、７，１２−ジメチルベンズアントラセ ン（ＤＭＢＡ）を用いた開始および１２−ｏ−テトラデカノイルホルボール−１ ３−アセテート（ＴＰＡ）を用いた促進により産生された鱗状乳頭腫から誘導さ れた良性の腫瘍ラインである。５Ｐ−１細胞は、この方法により無胸腺の裸マウ ス宿主に移植したとき、良性の表皮腫瘍（鱗状乳頭ｌｌ１）を形成する。

移植サイトは遍に一度、２５μｍアセトン中の２．５ナノモルのスタウロスポリ ンによりまたは２５μｍアセトンにより処理され、これは移植後２週間目から始 めそして実験の終期まで続けられた。腫瘍の寸法測定は、移植後３Ｎ間目から始 められ、そして８週間の間続けられた。スタウロスポリンによる腫瘍サイズの阻 害は、図１３における結果により示されるように、移植後４週間目（スタウロス ポリンによる処理を始めた後２週間目）の早くに明らかであった。

！五亘ニ スタウロスポリンによる、移植された５Ｐ−１マウス乳頭腫細胞からの腫瘍生成 の阻害 およその腫瘍体積は、８週間の間６つの群について比較された。：アセトン（溶 媒）対照群および６つのスタウロスポリン投与群、各群における１０匹のマウス は、０．５ｘｌＯ’個（ＤＳＰ−１細胞＋６Ｘ１０’個の初期５ＥＮＣＡＲマウ ス皮膚＃！維芽細胞１ｃｍＪ：　ｌ）　３／２２／９０移植された。

５Ｐ−１細胞は５ＥＮＣＡＲマウスにて、７，１２−ジメチルベンズアントラセ ン（ＤＭＢＡ）を用いた開始およ頭腫から誘導された良性の腫瘍ラインである。

５Ｐ−１細胞は、この方法により無胸腺の裸マウス宿主に移植し５　なとき、良 性の表皮腫瘍（鱗状乳頭腫）を形成する。

移植サイトは遍当り２回、２５μｌアセトン中の所定量のスタウロスポリンによ りまたは２５μｌアセトンにし　より処理され、これは移植後２週間目から始め そして実Ｌ　験の終期まで続けられた。腫瘍の寸法測定は、移植後３週間目から 始められそして８週間の間続けられた。０゜１　１２５ナノモルのスタウロスポ リンが最適投与量である）　ことは、図１４の結果において示されるように、最 初の腫瘍の寸法測定（３Ｐ間目）から明らかである。このことは、早期に十分で ある１回の投与は大変効果的であることをまず示唆するものである。試験された 最も低い投与量、処理当り０．１２５ナノモルが最も効果的であるので、最適の 投与量を見い出すためにより低い投与量の試験をなすことが必要とされた。

１五±ニ スタウロスポリンによる、移植された５Ｐ−１マウス乳頭腫細胞からの腫瘍生成 の阻害 およその腫瘍体積は、８週間の間６つの群について比較された。：アセトン（溶 媒）対照群および６つのスタウロスポリン投与群、各群における１０匹のマウス は。

０．５ｘｌＯ’個の５ｐ−ｉ細胞＋６Ｘ１０”個の初期５ＥＮＣＡＲマウス皮膚 線維芽細胞により５／１７／９０移植された。これは最も高い投与量（６，２５ ナノモル）および３番目に高い投与量（１，２５ナノモル）が除かれそして、実 施例３にて使用された従来の最も低い投与量よりもより低い、２つの別の投与量 （０，０２５ナノモルおよび０．００６２５ナノモル）が加えられたことを除い て実施例２の繰り返しである。

５Ｐ−１細胞は５ＥＮＣＡＲマウスにて、７，１２−ジメチルベンズアントラセ ン（ＤＭＢＡ）を用いた開始および１２−０−テトラデカノイルホルボール−１ ３−アセテート（ＴＰＡ）を用いた促進により産生された鱗状乳頭腫から誘導さ れた良性の腫瘍ラインである。５ｐ−ｉ細胞は、この方法により無胸腺の裸マウ ス宿主に移植したとき、良性の表皮腫瘍（鱗状乳頭腫）を形成する。

＃植すイトは週当９２回、２５μｍアセトン中の所定量のスタウロスポリンによ りまたは２５μｍアセトンにより処理され、これは移植後２週間目から始めそし て実験の終期まで続けられた。腫瘍の寸法測定は、移植後３週間目から始められ そして７週間の間続けられた。０゜０２５ナノモルのスタウロスポリンが最適投 与量であることは、図１５の結果において示されるように、最初の腫瘍の寸法測 定（３週間目）から明らかである。実施例３において効果的な投与量（０，６２ ５ナノモルおよび０．１２５ナノモル）もまたこの実施例において有効でありそ して効果的な投与量は腫瘍の寸法測定の最初の週から明らかである。

叉Ｊｌ豆 スタウロスポリンによる、移植された３０８マウス乳頭踵細胞からの腫瘍生成の 阻害 およその腫瘍体積は、８遍間の間６つの群について比較された。：アセトン（溶 媒）対照群および６つのスタウロスポリン投与群、各群における１０匹のマウス は。

０．５Ｘ１０”個の３０８細胞＋６Ｘ１０’個の初期５ＥＮＣＡＲマウス皮膚線 維芽細胞により８／８／９０移植された。これは、スタウロスポリン阻害効果が ５Ｐ−１細胞に制限されるものかまたはネズミの良性の表皮細胞腫瘍ラインにつ いてより一般に有効なものであるかを決定するために３０８細胞が５Ｐ−１細胞 に代えて使用されたことを除いて実施例３の繰り返しである。

３０８細胞は開始投与量の７，１２−ジメチルベンズアントラセン（ＤＭＢＡ） により処理されたＢＡＬＢ／ｃマウスの皮膚から誘導された良性の腫瘍ラインで ある。開始細胞は、培養において、培地中のＣａ’″濃度の増大による末端分化 の誘起に対する耐性によって選別される。

Ｃａ″誘起の末端分化に対するこの耐性は、開始された細胞の特性であり、これ は結果として腫瘍促進を生ずる良性の鱗状乳頭腫の前躯体である。５Ｐ−１細胞 のように、３０８細胞は、無胸腺の裸マウス宿主に移植したとき、鱗状乳頭腫を 形成する。

移植サイトは週当９２回、２５μｍアセトン中の所定量のスタウロスポリンによ りまたは２５ＬＬｌアセトンにより処理され、これは移植後２週間口から始めそ して実験の終期まで続けられた。１ｍ瘍の寸法測定は、移植後３週間口から始め られそして８遍間の間続けられた。

０．０２５ナノモルのスタウロスポリンが最適投与量であることは、図１６の結 果において示されるように、最初の腫瘍の寸法測定（３週間口）から明らかであ りそして実施例４におけるＳＰ−１細胞についてみられたのと同じ最適投与量で あった。０．６２５ナノモルおよび０１１２５ナノモルの投与量もまた、５Ｐ− １細胞を用いたそれらと同様、この実施例において有効であったゆ１五五１ 移植された５ｐ−ｉマウス乳頭腫細胞について、移植後２週間口のスタウロスポ リンによる１回の処理は、それ以降の８週間にわたって腫瘍生成を阻害するのに 有効である。

およその腫瘍体積は、８週間の間６つの群について比較された。；アセトン（溶 媒）対照群および６つのスタウロスポリン投与群、各群における１０匹のマウス は、０．５ｘｌＯ’個の５ｐ−ｉ細胞＋６Ｘ１０’個の初期５ＥＮＣＡＲマウス 皮膚線維芽細胞により９／１３／９０移植された。これは、２５μｍアセトン中 のスタウロスポリンによりまたは２５μｍアセトンによりたった１回のみ問題の 処理がなされたことを除いて同量のスタウロスポリン投与量を用いた実施例３の 繰り返しである。

５Ｐ−１細胞は５ＥＮＣＡＲマウスにて、７，１２−ジメチルベンズアントラセ ン（ＤＭＢＡ）を用いた開始および１２−ｏ−テトラデカノイルホルボール−１ ３−アセテート（ＴＰＡ）を用いた促進により産生された鱗状乳頭腫から誘導さ れた良性の腫瘍ラインである。ｓｐ−を細胞は、この方法により無胸腺の裸マウ ス宿主に移植したとき、良性の表皮腸瘍（鱗状乳頭腫）を形成する。

移植サイトは、移植後２週間口にて、１回、２５μｍアセトン中の所定量のスタ ウロスポリンによりまたは２５μｍアセトンにより処理された。腫瘍の寸法測定 は、移植後３週間口から始められそして８Ｍ間の間続けられた。

最も阻害的な投与量％０．１２５ナノモルは、５Ｐ−１細胞および３０８細胞を 用いた。先の全ての実験において有効であった０図１７に示される結果よりわか るように、腫瘍の成長はこの実施例において、以前の実施例におけるものよりも より速いと思われる。処理の時間に存在する腫瘍の数がおそらくは増大している ことは、繰り返しの処理でみられたものよりもより高い最適投与量へのシフトで あると説明することができる。

！五五玉 移植された３０８マウス乳頭腫細胞について、移植後２週間口のスタウロスポリ ンによる１回の処理は、それ以降の８週間にわたって腫瘍生成を阻害するのに有 効である。

およその腫瘍体積は、８週間の間６つの群について比較された。：アセトン（溶 媒）対照群および６つのスタウロスポリン投与群、各群における１０匹のマウス は。

０．５ｘ１０’個の３０８細胞＋６Ｘ１０’個の初期５ＥＮＣＡＲマウス皮膚線 維芽細胞により９／１９／９０移植された。これは、２５μｍアセトン中のスタ ウロスポリンによりまたは２５μｍアセトンによりたった１回のみ問題の処理が なされたことを除いて同量のスタウロスポリン投与量を用いた実施例４の繰り返 しである。

３０８細胞は、開始投与量の７，１２−ジメチルベンズアントラセン（ＤＭＢＡ ）により処理されたＢＡＬＢ／ｃマウスの皮膚から誘導された良性の腫瘍ライン である。

開始細胞は、培養において、培地中のＣａ”２１度の増大による末端分化の誘起 に対する耐性により選別される。

Ｃａ”誘起の末端分化に対するこの耐性は、開始された細胞の特性であり、これ は結果として腫瘍促進を生ずる良性の鱗状乳頭腫の前躯体である。５Ｐ−１細胞 のように、３０８細胞は、無胸腺の裸マウス宿主に移植したとき、鱗状乳頭腫を 形成する。

移植サイトは、移植後２週間口にで、１回、２５μｌアセトン中の所定量のスタ ウロスポリンによりまたは２５μｍアセトンにより処理された。腫瘍の寸法測定 は、移Ｍ後３：ｓ間目から始められそして８週間の間続けられた。

阻害的な投与量、０．１２５．０．０２５および０゜００６２５ナノモルは、５ Ｐ−１細胞および３０８細胞を用いた、先の全ての実験において有効であった。

結果は図１８に示される。

移植研究の結果は、低投与量（０，０２５ナノモル）のスタウロスポリンを用い た処理は少なくとも２種の移植された良性の皮膚腫瘍細胞からの腫瘍形成を阻害 するのに有効であることを示している。問題の処理は、医薬の配給の効果的な様 式であり、そしてアセトンは有効な溶媒である。医薬を用いた１回の処理は、仮 に病変の発達後に早期に十分に与えられるならば、繰り返しの処理と同等に有効 なものとなりつる。

位って本発明は記載されているが、同等物は多くの方法により変更し得ることは 、明らかである。かかる変法は、本発明の精神および範囲からの逸脱として認め られるべきではなく、そして、当業者にとって自明であるところの全ての変形は 、特許請求の範囲の記載事項内に含まれるものと意図されでいる。

５ＴＳＰ　ＴＰＡ ＦＩＧ、７ 日Ｇ、８　“′°°“′リバ°“ゝ １Ｇ、９　投与量０す ＦＩＧ　１１ ＦＩＧ、　７２Ａ １時間　６時間　８時間 ２時間　６時間 ＦＩＧ、７２Ｂ ＦＩＧ、１５Ｅ　ＦＩＧ、１５Ｆ スタウＵスポリン（すＩモ＃／処１り スタウロスポリン（？／七ル／処理）　スタウｔｅ２ｇリン（ｔノモ＃／処理） ＦＩＧ、１８Ａ　ＦＩＧ、１８８ ＦＩＧ、１８ＣＦＩＧ、１８Ｄ スタウロスポリン（ナノモ＃／処理） ＦＩＧ、１８Ｇ 補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成５年９月２９日園

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. １．下記式１、２および３： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は順次；ベンジル基、ベンゾイル基および水素原 子を表すか；または水素原子、水素原子およびヒドロキシ基を表す。）；▲数式 、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は順次；水素原子、−ＣＯＯＣＨ２および水素原 子を表すか；水素原子、−ＣＯＯＨおよび水素原子を表すか；水素原子、−ＣＯ ＯＣＨ３および−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３を表すか；水素原子、−ＣＯＯ（ＣＨ２ ）６ＣＨ３および水素原子を表すか；またはメチル基、−ＣＯＯＣＨ３および水 素原子を表す。〕；および ▲数式、化学式、表等があります▼式３（式中、Ｒは水素原子、または ▲数式、化学式、表等があります▼ を表す。）で表される化合物から選択されたインドールカルバゾール化合物と素 合せて医薬的に許容される賦形剤を含む組成物の有効量を患者に投与する段階か らなる癌を治療する方法。
2. ２．下記式１、２および３： ▲数式、化学式、表等があります▼式１（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は順次； ベンジル基、ベンゾイル基および水素原子を表すか；または水素原子、水素原子 およびヒドロキシ基を表す。）；▲数式、化学式、表等があります▼式２〔式中 、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は順次；水素原子、−ＣＯＯＣＨ３および水素原子を表 すか；水素原子、−ＣＯＯＨおよび水素原子を表すか；水素原子、−ＣＯＯＣＨ ３および−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３を表すか；水素原子、−ＣＯＯ（ＣＨ２）５Ｃ Ｈ３および水素原子を表すか；またはメチル基、−ＣＯＯＣＨ２および水素原子 を表す。〕；および ▲数式、化学式、表等があります▼ 式３ （式中、Ｒは水素原子、または ▲数式、化学式、表等があります▼ を表す。）で表される化合物から選択されたインドールカルバゾール化合物と組 合せて医薬的に許容される担体からなる医薬組成物。
3. ３．下記式１、２および３： ▲数式、化学式、表等があります▼式１（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は順次； 全て水素原子を表すか；水素原子、ベンゾイル基および水素原子を表すか；ベン ジル基、ベンゾイル基および水素原子を表すか；または水素原子、水素原子およ びヒドロキシ基を表す。）； ▲数式、化学式、表等があります▼式２〔式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は順次； 水素原子、−ＣＯＯＣＨ３および水素原子を表すか；水素原子、−ＣＯＯＨおよ び水素原子を表すか；水素原子、−ＣＯＯＣＨ３および−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３ を表すか；水素原子、−ＣＯＯ（ＣＨ２）５ＣＨ３および水素原子を表すか；ま たはメチル基、−ＣＯＯＣＨ３および水素原子を表す。〕；および ▲数式、化学式、表等があります▼ 式３ （式中、Ｒは水素原子、または ▲数式、化学式、表等があります▼ を表す。）で表される化合物から選択されたインドールカルバゾール化合物と組 合せて医薬的に許容される賦形剤からなる医薬組成物を患者の皮膚に局所的に投 与することからなる皮膚の前癌のおよび癌の状態を治療する方法。
4. ４．下記式１、２および３： ▲数式、化学式、表等があります▼式１（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は順次； 全て水素原子を表すか；水素原子、ベンゾイル基および水素原子を表すか；ベン ジル基、ベンゾイル基および水素原子を表すか；または水素原子、水素原子およ びヒドロキシ基を表す。）； ▲数式、化学式、表等があります▼式２〔式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は順次； 水素原子、−ＣＯＯＣＨ３および水素原子を表すか；水素原子、−ＣＯＯＨおよ び水素原子を表すか；水素原子、−ＣＯＯＣＨ３および−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３ を表すか；水素原子、−ＣＯＯ（ＣＨ２）■ＣＨ３および水素原子を表すか；ま たはメチル基、−ＣＯＯＣＨ３および水素原子を表す。〕；および ▲数式、化学式、表等があります▼ 式３ （式中、Ｒは水素原子、または ▲数式、化学式、表等があります▼ を表す。）で表される化合物から選択されたインドールカルバゾール化合物と組 合せて医薬的に許容される局所賦形剤からなる医薬組成物。