JPH0646871A

JPH0646871A - タンパク質加水分解物の製造法

Info

Publication number: JPH0646871A
Application number: JP4202685A
Authority: JP
Inventors: Minao Asano; 皆夫浅野; Hiroshi Takagi; 博史高木
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1992-07-29
Filing date: 1992-07-29
Publication date: 1994-02-22

Abstract

(57)【要約】【構成】ケラチン含有タンパク質を中性−アルカリ性の
温和な条件下ケラチナーゼを用い、更にカルボキシペプ
チダーゼ及び/またはアミノペプチダーゼを用いて分解
し、グルタミン酸、アラニン、グリシン含有率の高い呈
味性に優れたタンパク質加水分解物を得る。【効果】グルタミン酸、アラニン、グリシン含有率の高
い呈味性に優れたタンパク質加水分解物を得ることがで
きる。また、同時に、廃棄物処理の問題、酸分解法に伴
う副生成物の問題も解決し得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は従来のプロテアーゼのみ
では分解の難しいケラチン含有タンパク質を分解し、そ
の加水分解物を製造する方法に関する。さらに詳細に
は、本発明は産業上多くが廃棄されている、鳥羽毛、獣
毛、人毛、などケラチンを含有するタンパク質をケラチ
ンの分解能力に優れている酵素であるケラチナーゼを用
いて消化し、さらにカルボキシペプチダーゼやアミノペ
プチダーゼを用いて消化することにより、天然調味料原
料として利用可能な旨味を呈するグルタミン酸、甘味を
呈するアラニン、グリシン、セリンの含有率が高いタン
パク質加水分解物を製造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ケラチン含有タンパク質の利用用途とし
ては、ブロイラー工場より発生するフェザーなどを加圧
加熱で加水分解することによる飼料（フェザーミール）
の製造法や（特公平4-3935号）、人毛などの酸加水分解
物よりシスチンの抽出（椎尾勇、現代化学1981年５月
号、p.63）が知られている。吸着剤の製造法（特公昭60ー
15382号）や、半透性膜状物の製造法（特公昭59-38804
号）、消臭・脱臭剤組成物（特公昭61ー48379号）にはケ
ラチンの酵素処理物の利用が記されている。

【０００３】一般にケラチンは動物組織のうち主として
脊椎動物の表皮、毛髪、羽毛、爪、角、蹄、鱗など体の
保護を目的とする部分の主成分であり、ほとんどの溶媒
に溶けない。いわゆる硬タンパク質のひとつである。ケ
ラチンのアミノ酸組成については表１に示す様に、羽毛
（鶏）にセリン、グルタミン酸、プロリンが多く含まれ
（B.S.Harrap et.al., Biochem. J., 92, 8 (1964)）、
人毛にグルタミン酸、セリン、アルギニンが多く含まれ
（W.G.Crewther et al., Biopolymers 4, 905(196
6)）、羊毛でシスチン、グルタミン酸、セリンの順に含
有量が多く含まれていることが知られている（I.J.O'Do
nnell et al., Aust. J. Biol. Sci., 15, 740 (196
2)）。全般的にいって、ケラチンの組成はグリシン、セ
リン、アラニンなど側鎖の短いアミノ酸の和が４０％を
示すものとなっている。

【０００４】

【表１】

【０００５】これまでに知られている天然調味料の製造
は、タンパク質の分解を経て行われるものが主流であっ
た。天然調味料と称されるもののうち、分解型天然調味
料は酸分解型と酵素分解型がある。酸分解型調味料に
は、大豆、小麦等の植物性タンパク質を原料として得ら
れる、Hydrolyzed Vegetable Protein (以下HVP) と、
ゼラチン、乳カゼイン等の動物性タンパク質を原料とし
て得られるHydrolyzed Animal Protein (以下HAP) があ
り、その主成分であるアミノ酸組成が原料により大きく
異なり、呈味、甘味等に影響を及ぼす。

【０００６】しかし、近年では原料の風味を有効に生か
すためにプロテアーゼなどの酵素を利用した製造法も考
案されている。酵素分解型調味料としてはこれまでに、
卵白分解物の製造法（特開昭48ー68773号）、脱脂大豆よ
り得る調味液の製造法（特開昭51ー70852号）、チーズホ
エーを原料とする調味料の製造法（特開昭62ー151155
号）、コーングルテンミール加水分解物の製造法（特公
平2ー295437号）などが報告されている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、従来か
ら分解しにくいために利用価値の低いケラチン含有タン
パク質、即ち、鳥羽毛、獣毛、人毛、などが温和な条件
で分解できれば、廃棄物の減少や加工副産物による環境
汚染等も解決され、同時に旨味、甘味を呈するアミノ酸
を多く含有する分解物を得ることができると考えた。

【０００８】しかしながら、ケラチン含有タンパク質は
それがもつ難分解性という性質のためにこれまで天然調
味料の原料として注目されることはなかった。また、ケ
ラチン含有タンパク質を効率的にアミノ酸にまで分解す
る方法も知られていなかった。

【０００９】一般に酸加水分解によりHAPを得る場合、
反応条件は100℃、１−２日間かかり、高温、長時間の
反応はエネルギー消費量が大きい。さらに、酸によるタ
ンパク質の加水分解法は簡便である一方、異臭の発生や
アミノ酸の過剰（破壊）分解、副反応による有害物質の
形成、中和のために高塩分となることなどの欠点があ
る。

【００１０】一方、本発明に用いられるケラチン含有タ
ンパク質は全般的にグルタミン酸、やグリシン、セリ
ン、アラニンなど側鎖の短いアミノ酸が多い。即ち旨
味、甘味を呈するアミノ酸を多く含有し天然調味料素材
として好ましい。しかしながらその構造上多数のＳ−Ｓ
架橋構造をペプチド鎖間につくり、繊維状のもの、無定
型のもの、あるいはその混合であり、酵素分解を行う場
合、従来のフィシン、パパインなど通常のプロテアーゼ
では分解されにくいという欠点がある。

【００１１】したがって、中性あるいはアルカリ性の温
和な条件下でケラチン含有タンパク質を分解する方法が
待ち望まれているのが現状である。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記問題点
であるケラチン含有タンパク質の分解を温和な条件で行
うべく鋭意研究を行ったところ、目的に応じて適切な酵
素を選択することにより上記課題を解決し、本発明を完
成に至らしめた。即ち、本発明は、ケラチン含有タンパ
ク質をケラチナーゼで消化し、続いてカルボキシペプチ
ダーゼ及び/またはアミノペプチダーゼを用いて消化す
ることを特徴とするグルタミン酸、アラニン、グリシ
ン、セリン含有率の高いタンパク質加水分解物の製造法
であり、また、ケラチナーゼがBacillus licheniformis
PWD-1由来のものである前記タンパク質加水分解物の製
造法である。

【００１３】本発明で用いられるケラチン含有タンパク
質とは鳥羽毛、獣毛、人毛、のいずれか１、もしくは２
種類以上のケラチン含有タンパク質を示し、好ましくは
界面活性剤等で脱脂を行ったものが良い。その他のタン
パク質や血液などの混合物の場合も除外しない。

【００１４】次に、本発明で用いられるケラチナーゼは
特にその起源は問わない。従って、ケラチンを特異的に
分解する活性（ケラチナーゼ活性）を持つ限り、動物、
植物、微生物由来のものが用いられる。しかし、好まし
くは、Bacillus licheniformisPWD-1により生産された
ケラチナーゼが良い。Bacillus licheniformis PWD-1は
米国ノースカロライナ州立大学の J.C.H.Shih 教授らが
養鶏場の羽毛廃棄物中より発見した菌である（C.M.Will
iams et al., Appl. Environ.Microbiol., 56,1509 (19
90)）。本菌はすでに寄託されており（ATCC No.5375
7）、 US Patent4,908,220 に記載されている。本菌を
利用して羽毛を含んだ家禽廃棄物の分解（C.M.Williams
et al.,J. Appl. Bacteriol., 67, 25(1989)）や、フ
ェザーミールの消化率向上（C.M.Williams et al.,Poul
try Science,70, 85(1991)）といった研究がなされてい
る。

【００１５】本発明に用いられるカルボキシペプチダー
ゼ、アミノペプチダーゼは具体的には植物、動物、微生
物界に広く分布するロイシンアミノペプチダーゼ、アミ
ノペプチダーゼＭ、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボ
キシペプチダーゼＹなどペプチド鎖のいずれかの末端か
ら順次アミノ酸を１個ずつ遊離するエキソペプチダーゼ
である。一般的に食品タンパク質をプロテアーゼで分解
処理するとロイシンが末端に存在するような苦味ペプチ
ドが生成し、風味が著しく低下することが知られてい
る。そこで、この苦味ペプチドを各種のペプチダーゼで
分解することによりアミノ末端やカルボキシル末端から
アミノ酸を遊離させて呈味性を向上させる試みがなされ
ている（石田ら、食品工誌、23、524-530 (1976)）。本
発明においてはケラチナーゼでケラチン含有タンパク質
をペプチドにまで分解し、続いて上記ペプチダーゼの作
用でアミノ酸にまで分解する。従って本来ケラチンに多
く含有する、旨味を呈するグルタミン酸、甘味を呈する
グリシン、アラニンなどのアミノ酸を遊離させることに
よって、著しい呈味向上が期待できる。

【００１６】本発明に関わる酵素の生産は、以下の実施
例で記載されているような、微生物の菌体や培養液、ま
たは動物や、植物の組織から調製する方法に限定される
わけではなく、発現ベクターに接続された該酵素の遺伝
子が導入された大腸菌、枯草菌や酵母などより組換えＤ
ＮＡ法によって生産することも可能であり、また野生型
遺伝子に代えて変異した遺伝子を染色体に相同組換えを
利用して導入した細胞より調製することも可能である。
いずれの方法を用いて生産された酵素も同程度の効果が
期待できる。また、酵素の精製法も特に限定しない。

【００１７】また本発明に関わる原料のケラチン含有タ
ンパク質は酵素処理前の調製を特に限定しないが、好ま
しくは0.5〜5％の界面活性剤水溶液などで脱脂されたも
のが望ましい。

【００１８】分解反応の条件は例えば原料の羽毛を蒸留
水で洗浄したのち120℃、20分加圧滅菌し、常温に戻し
た羽毛に対しBacillus licheniformis PWD-1により生産
されたケラチナーゼを0.1〜10％の酵素溶液として2〜48
時間、37℃〜45℃で振盪し反応させる。この時、酵素溶
液は緩衝液でpH6〜9に調製にするのが望ましい。また精
製された酵素を用いてもよく、また粗精製品を用いても
よい。続いて、羽毛に対しシグマ社のロイシンアミノペ
プチダーゼ（ブタ腎臓由来）などのアミノペプチダーゼ
及び/あるいは同じくシグマ社のカルボキシペプチダー
ゼＹ（パン酵母由来）などのカルボキシペプチダーゼを
反応溶液に0.1〜10％添加し、2〜48時間、37℃で振盪し
反応させ、加水分解物を得る。未反応の原料等の不溶物
は遠心分離や濾過など従来の分離法を用いて除去すれば
よい。以下実施例をもって、Bacillus licheniformis
PWD-1由来のケラチナーゼの調製方法、酵素化学的性
質、さらにはケラチン含有タンパク質加水分解物の製造
法について示す。

【００１９】

【実施例】

【００２０】＜実施例１．Bacillus licheniformis PW
D-1由来のケラチナーゼの調製法＞ケラチン含有寒天培
地（塩化アンモニウム 0.05%、塩化ナトリウム 0.05%、
リン酸水素二カリウム0.03%、リン酸二水素カリウム 0.
04%、塩化マグネシウム 0.01%、酵母エキス 0.01% フェ
ザーミール 1%、寒天 1.5%)で生育させた Bacillus lic
heniformis PWD-1株をケラチン含有液体培地（塩化ア
ンモニウム 0.05%、塩化ナトリウム 0.05%、リン酸水素
二カリウム0.03%、リン酸二水素カリウム0.04%、塩化マ
グネシウム 0.01%、酵母エキス 0.01% フェザーミール
1%）に接種し、坂口フラスコでpH 7.5, 50℃にて24時
間振とう培養を行った。

【００２１】本培養で得た培養上清から以下の方法でケ
ラチナーゼを精製した。

【００２２】1.硫安塩析：まず、培養液遠心上清（200m
l）を氷冷下、70%飽和硫安溶液となるように徐々に飽和
硫安溶液を添加し、4℃で一晩放置した。生じた沈澱を
遠心分離し、回収した。

【００２３】2.透析：続いて、沈澱を少量の（10ml）の
20mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.8）に溶かし、同緩衝液に
て透析を行った。透析は氷冷下、酵素溶液の約200倍量
の緩衝液を4回交換（2hr×2、14hr、2hr）して行った。

【００２４】3.陰イオン交換：次に、DEAE sephadex A-
25（ファルマシアLKB社製）を用いる陰イオン交換樹脂
で処理した。すなわち、試料（13ml）に約5ml のDEAE s
ephadex A-25 を懸濁させ、氷冷下ゆっくりと撹拌し
た。4hr後、グラスフィルターで樹脂を濾過して除い
た。またはDEAE Mem-Sep（ミリポア社製）に繰り返し素
通りさせることによって、さらに効率よく処理が行え
た。この結果、薄茶色に着色していた試料が無色になっ
た。

【００２５】4.緩衝液の置換：DEAE処理後、試料（17m
l）をsephadex G-25のカラム（PD-10）（ファルマシアL
KB社製）を用いて、７回に分けて 20mM ナトリウム-リ
ン酸緩衝液（pH 6.2）へと、塩の交換を行った。

【００２６】5.陽イオン交換：さらにこの試料をSep-Pa
k Accell CM （ミリポア社製）あるいはCM Mem-Sep（ミ
リポア社製）とFPLCを用いた陽イオン交換クロマトグラ
フィーに付した。pH 6.2 の 20mM ナトリウム-リン酸
緩衝液でカラムを洗浄した後、溶出はSep-Pak Accell C
Mでは pH6.2 20mM ナトリウム-リン酸緩衝液 20mMNaC
l、pH 6.8 20mM ナトリウム-リン酸緩衝液 20mM NaC
l、pH 6.8 20mM ナトリウム-リン酸緩衝液 200mM NaC
l、pH6.8 20mM ナトリウム-リン酸緩衝液 1M NaClで段
階的に溶出した。FPLCを用いる方法では直線グラジエン
トでpH 6.8 20mMナトリウム-リン酸緩衝液のNaCl濃度を
20mMから1M まで変化させて溶出した。ケラチン分解活
性はSep-Pak Accell CMを用いたときpH 6.8 20mM ナト
リウム-リン酸緩衝液200mM NaCl、およびpH 6.8 20mM
ナトリウム-リン酸緩衝液 1M NaCl画分に溶出され、CM
Mem-Sepを用いた場合では、直線グラジエントでpH 6.8
20mMナトリウム-リン酸緩衝液のNaCl濃度が 20mM から8
0mMの間に溶出された。SDS-ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により精製度を確認を行った結果、分子量約30、0
00の位置に１本のバンドが検出された。これを精製酵素
として以後の実験に供した。また硫安沈澱物も粗酵素と
して適宜使用した。本酵素の製造は上記方法に限定され
ているわけではなく、例えば、培養液を限外濾過膜など
を用いて菌体を除去、濃縮後、アルコール沈澱したもの
を凍結乾燥することによっても得られる。

【００２７】酵素活性は基質にケラチン（牛蹄、角由
来、ICN BIOMEDICALS, INC.）、あるいはカゼイン（牛
乳由来、純正化学）を用い、基質20mgに対して各酵素試
料溶液1mlを加え、37℃、約130rpmで振とうした。各酵
素試料溶液1mlに含まれる酵素タンパク質の質量はBio r
ad社プロテインアッセイキットおよびWarburgらの方法
（A.Warburg et.al.,Biochem.Z.,310,384(1941)）によ
り測定した。振とう1時間後、2mlトリクロロ酢酸溶液
（0.11M TCA、0.22M CH3COONa、0.33M CH3COOH）を加え
酵素反応を停止させた（このとき未反応の基質及び酵素
タンパク質は沈澱される）。15分間室温で放置した後1
5,000rpm、10分遠心分離を行い沈澱を除去した後、上清
の275nmにおける吸光度を測定した。この275nmの吸収は
遊離ペプチドあるいはアミノ酸によるものであるので吸
光度が大きいものほど酵素の活性が高いこととなる。反
応液中に含まれていた酵素タンパク質1mg当りの吸光度
を各タンパク質分解活性とした（A₂₇₅/mg）。以上、こ
の方法を活性測定法Ａとする。

【００２８】また、萩原らの方法（B. Hagihara, H. Ma
tubara, M. Nakai, and K. Okunuki, J. Biochem., 45,
(3), 185 (1958)）は、プロテアーゼの分解活性の測定
方法として当業界でオーソライズされたものであるが、
この方法ではカゼインが基質として用いられる。この方
法によっても、本酵素の分解活性を測定した（Caseinol
ytic act.(U/mg/min)）。

【００２９】上記２種類の方法によって測定した各精製
段階の酵素活性を表２に示す。

【００３０】

【表２】

【００３１】＜実施例２．Bacillus licheniformis PWD
-1由来のケラチナーゼの酵素化学的諸性質の特定＞Baci
llus licheniformis PWD-1由来のケラチナーゼの酵素化
学的諸性質を表３にまとめた。

【００３２】このとき基質にはケラチン（牛蹄、角由
来）を用いた。分解活性の評価は、実施例１の活性測定
法Ａ同様に行った。

【００３３】Bacillus licheniformis PWD-1由来のケラ
チナーゼの１次構造をアミノ基末端側21残基まで決定し
た。すなわち、Laemmli緩衝液を用いたSDS-ポリアクリ
ルアミド電気泳動（10-20%グラジェントゲル：第一化学
薬品（株）SDS-PAGEプレート10/20）にて泳動した約30
μgの精製酵素をタンパク質をPVDF膜（BIO-RAD社）に転
写した。続いて、PVDF膜をクマーシーブリリアントブル
ー染色後、目的のタンパク質のバンド（分子量約３０,
０００）を切り出し、プロテインシーケンサー（ABI社4
30A）にてアミノ基末端側１次配列を決定した。結果を
配列表配列番号１に示す。

【００３４】至適pHの測定は各pHの緩衝液中、基質に牛
蹄、角ケラチンを用い活性測定法Ａに準じて（酵素タン
パク濃度0.025mg/ml）行った。測定結果のグラフを図
１、図２に示す。

【００３５】至適温度の測定は活性測定法Ａに準じて
（酵素タンパク濃度0.025mg/ml）各測定温度で行った。
測定結果のグラフを図３、図４に示す。

【００３６】pH安定性は酵素溶液（酵素タンパク濃度0.
2mg/ml）を各測定pHで調製し、4℃、1時間インキュベー
トした。その後、pH8.0の緩衝液中で活性測定法Ａに準
じて（酵素タンパク濃度0.025mg/ml）活性を測定した。
測定結果のグラフを図５、図６に示す。

【００３７】温度安定性はpH8.0の緩衝液中の酵素溶液
（酵素タンパク濃度0.2mg/ml）を各温度でインキュベー
ト後、活性測定法Ａに準じて（酵素タンパク濃度0.025m
g/ml）活性を測定した。測定結果のグラフを図７、図８
に示す。

【００３８】溶液中での保存安定性はpH6.0、4℃で酵素
溶液（タンパク濃度精製酵素で0.1mg/ml,粗酵素で0.2mg
/ml）を静置、各時間ごとに活性測定法Ａに準じて（タ
ンパク濃度0.025mg/ml）活性を測定した。測定結果のグ
ラフを図９に示す。

【００３９】

【表３】

【００４０】＜実施例３．Bacillus licheniformis PWD
-1由来のケラチナーゼの分解活性の検定＞本発明者らは
今回調製した精製酵素、または硫安沈澱後の粗酵素を用
いて本酵素のケラチン分解能を他の酵素と比較し、評価
した。すなわち、以下に述べるように、ケラチン/カゼ
インの相対活性の比較や各種ケラチン酵素処理液のアミ
ノ酸組成の比較などを調べた。

【００４１】まず、実施例１で述べた方法に従って調製
したBacillus licheniformis PWD-1由来のケラチナーゼ
と５種類の酵素（サチライシン Carlsberg(シグマ社)、
パパイン(シグマ社)、Clostridium コラゲナーゼ(シグ
マ社)、プロテアーゼ N(天野製薬(株))、プロテイナー
ゼ K(和光純薬(株)）についてケラチンとカゼインに対
する分解活性を比較した。各酵素の反応条件は、実施例
１で採用した条件と同じである。ただし各酵素試料溶液
は、基質20mgに対して各酵素0.050mg添加し評価した。

【００４２】それぞれの分解活性は酵素反応上清の275n
mにおける吸光度を酵素mgタンパク質あたり求め比較し
た。結果を表４に示した。この結果より本酵素はカゼイ
ンの分解能も有しているが、カゼインに対するケラチン
の相対的分解能の活性は最も高く、ケラチン分解能が優
れていると考えられる。次いで、サチライシン Carlsbe
rgのカゼインに対するケラチンの相対的分解能の活性が
高かった。

【００４３】

【表４】

【００４４】さらに、各種ケラチン含有タンパク質に対
するケラチナーゼの効果を他酵素と比較する方法を以下
のように行った。

【００４５】ケラチン含有タンパク質として、羽毛、人
毛ケラチンパウダー、ケラチン（牛蹄、角由来）の３
種を選択し、これらに対してケラチナーゼ、エラスター
ゼ、サチライシン Carlsberg、プロテアーゼ N、それぞ
れを37℃、24時間反応させた。なお、ケラチナーゼは実
施例１で述べた方法に従って、Bacillus licheniformis
PWD-1により調製したものであり、エラスターゼはアル
カリ性バチルス属細菌Ya-B株の培養上清液の硫安沈澱物
から調製したものである（特開平3ー224465号）。どの酵
素の反応も至適に近いpHで行った。即ち、ケラチナー
ゼ、サチライシン Carlsberg、protease NはpH8.0、エ
ラスターゼはpH10.5で処理を行った。また、基質50mgに
対して、酵素溶液はタンパク濃度でケラチナーゼ0.010m
g/2ml、サチライシン Carlsberg 0.0025mg/2ml、protea
se N 0.050mg/2ml、荻原らによる方法に準じたカゼイン
分解活性でいずれも5 Unit/minの酵素を添加した。酵素
処理上清を20%塩酸（定沸点塩酸）でアンプル中110℃、
24時間加水分解を行い、アミノ酸分析を行った。

【００４６】結果を比較するために、各アミノ酸につい
てプロテアーゼ Nのアミノ酸分析値との比をとった。図
１０〜１２にその結果を示す。この結果より本ケラチナ
ーゼは羽毛ケラチンに対する分解能が他酵素と比べて著
しいと考えられる。

【００４７】＜実施例４．ケラチナーゼによる羽毛の分
解＞本実施例ではケラチナーゼを用いた羽毛の分解を遊
離アミノ酸の定量で調べた。実施例３同様、ケラチナー
ゼは実施例１で述べた方法に従って、Bacillus licheni
formis PWD-1により調製したものである。また、ペプチ
ダーゼはシグマ社のロイシンアミノペプチダーゼ及びシ
グマ社のカルボキシペプチダーゼＹを用いた。さらに比
較としてシグマ社のパパイン（パパイヤ由来）も用い
た。

【００４８】まず、鶏羽毛を蒸留水で洗浄したのち120
℃、20分加圧滅菌した羽毛を原料に用いた。この羽毛50
mg に対しBacillus licheniformis PWD-1により生産さ
れたケラチナーゼ100μg（45Unit/min）、シグマ社のパ
パイン（パパイヤ由来）100μg（90Unit/min）のいずれ
かを2mlの蒸留水中２時間、37℃で振盪し反応させる。
続いて、ペプチダーゼを添加する場合はシグマ社のロイ
シンアミノペプチダーゼ（ブタ腎臓由来）300μg（60Un
it）あるいはシグマ社のカルボキシペプチダーゼＹ（パ
ン酵母由来）300μg（32Unit）を反応溶液に添加し、２
時間、37℃で振盪し反応させた。4mlのトリクロロ酢酸
溶液（0.11M TCA、0.22M CH3COONa、0.33M CH3COOH）を
加え反応を停止させ、遠心分離により未分解の基質や、
酵素タンパク質を除去して、上清のアミノ酸を分析定量
した。表５に特徴的なアミノ酸の結果を示した。なお、
上記酵素の単位はケラチナーゼ、パパインは実施例１に
挙げた萩原らによるカゼイン分解活性単位を、ロイシン
アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼYでは各
酵素で定められた活性単位を示した。

【００４９】

【表５】

【００５０】ケラチナーゼ単独処理では無処理に比べる
と各遊離アミノ酸の量に大きな変化は無かったが、ペプ
チダーゼとの混合処理により甘味系アミノ酸であるアラ
ニン、グリシン、セリン、スレオニンが明らかに増加し
ていた。特にロイシンアミノペプチダーゼとの混合使用
がケラチナーゼにおいて優れていた。また、旨味を呈す
るグルタミン酸も増加していた。いずれの場合もパパイ
ンより優れたアミノ酸遊離を示した。

【００５１】

【発明の効果】以上示した様に本発明は利用価値が低く
従来の酵素では分解されにくいケラチン含有タンパク質
を中性−アルカリ性の温和な条件下ケラチナーゼを用
い、更にカルボキシペプチダーゼ及び/またはアミノペ
プチダーゼを用いて分解し、グルタミン酸、アラニン、
グリシン含有率の高い呈味性に優れたタンパク質加水分
解物を得ることができる。また、同時に、廃棄物処理の
問題、酸分解法に伴う副生成物の問題も解決し得る。

【図面の簡単な説明】

【図１】各pHで精製酵素の活性を測定したものである。
1mM塩化カルシウムの有無も比較した。最も活性の高い
点を100として相対比較で表した。

【図２】各pHで粗酵素（硫安沈澱物）の活性を測定した
ものである。1mM塩化カルシウムの有無も比較した。最
も活性の高い点を100として相対比較で表した。

【図３】各温度で精製酵素の活性を測定したものであ
る。1mM塩化カルシウムの有無も比較した。最も活性の
高い点を100として相対比較で表した。

【図４】各温度で粗酵素（硫安沈澱物）の活性を測定し
たものである。1mM塩化カルシウムの有無も比較した。
最も活性の高い点を100として相対比較で表した。

【図５】各pHで保存後の精製酵素の活性を測定したもの
である。1mM塩化カルシウムの有無も比較した。最も活
性の高い点を100として相対比較で表した。

【図６】各pHで保存後の粗酵素（硫安沈澱物）の活性を
測定したものである。1mM塩化カルシウムの有無も比較
した。最も活性の高い点を100として相対比較で表し
た。

【図７】各温度で保存後の精製酵素の活性を測定したも
のである。1mM塩化カルシウムの有無も比較した。最も
活性の高い点を100として相対比較で表した。

【図８】各温度で保存後の粗酵素（硫安沈澱物）の活性
を測定したものである。1mM塩化カルシウムの有無も比
較した。最も活性の高い点を100として相対比較で表し
た。

【図９】酵素溶液の保存性を活性を追ってみたグラフで
ある。精製酵素と粗酵素（硫安沈澱物）を比較した。

【図１０】ケラチナーゼ、エラスターゼ、サチライシン
Carlsbergそれぞれで羽毛を処理した上清の酸加水分解
物のアミノ酸組成を、プロテアーゼ Nで処理した上清の
酸加水分解物のアミノ酸組成を基準にして比較したグラ
フである。図中のアルファベットはアミノ酸の略語であ
る。以下にその対応を示す（図１１、１２において同
じ）。 D アスパラギン酸＋アスパラギン T スレオニン S セリン E グルタミン酸＋グルタミン P プロリン G グリシン A アラニン V バリン C シスチン M メチオニン I イソロイシン L ロイシン Y チロシン F フェニルアラニン K リジン H ヒスチジン R アルギニン

【図１１】ケラチナーゼ、エラスターゼ、サチライシン
Carlsbergそれぞれでケラチン（牛角、蹄由来）を処理
した上清の酸加水分解物のアミノ酸組成をプロテアーゼ
Nで分解したものを基準にして比較したグラフである。

【図１２】ケラチナーゼ、エラスターゼ、サチライシン
Carlsbergそれぞれで人毛を処理した上清の酸加水分解
物のアミノ酸組成をプロテアーゼ Nで分解したものを基
準にして比較したグラフである。

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：21 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源生物名：Bacillus licheniformis PWD-1（ATCC No.5375
7）配列ＡｌａＧｌｎＴｈｒＶａｌＰｒｏＴｙｒＧｌｙＩｌｅＰｒｏ
ＬｅｕＩｌｅＬｙｓＡｌａＡｓｐＬｙｓ１５
１０１５ＶａｌＧｌｎＡｌａＧｌｎＧｌｙＰｈｅ２０

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ 8931−4ＢＤ 8931−4Ｂ 13/14 Ａ 8931−4Ｂ // Ｃ１２Ｎ 9/56 ＺＮＡ 9161−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 13/00 Ｃ１２Ｒ 1:10） (Ｃ１２Ｐ 13/04 Ｃ１２Ｒ 1:10） (Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｃ１２Ｒ 1:10） (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｒ 1:10） (Ｃ１２Ｐ 13/14 Ｃ１２Ｒ 1:10）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ケラチン含有タンパク質をケラチナーゼ
で消化し、続いてカルボキシペプチダーゼ及び/または
アミノペプチダーゼを用いて消化することを特徴とする
グルタミン酸、アラニン、グリシン、セリン含有率の高
いタンパク質加水分解物の製造法。
【請求項２】ケラチナーゼがBacillus licheniformis
PWD-1由来のものである特許請求の範囲第１項記載のタ
ンパク質加水分解物の製造法。