JPH0643164A - 歯周疾患に随伴する微生物類の分別ならびにそれに有用な製品およびキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】生物学的被検体中の歯周疾患に随伴する微生物
の分別方法を提供する。 【構成】微生物のいずれかまたはすべてからの抽出抗原
を少なくとも３個の免疫学的複合体化用の不連続な区画
１２、１３、１６を有する微孔質膜と接触する。各微生
物に由来する抗原は、オペレーターが特定区画の免疫複
合体を有することを観察することによって被検体中に微
生物が存在することを測定できるように特定区画で複合
体を形成する。複合体化は、抗原と適切な抗体が付着し
た水不溶性粒子からなる対応する水不溶性試薬との間で
起こる。この複合体の検出は個々の抗原に向けた標識抗
体を用いて行う。この方法で有用な製品およびキットも
提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、生物学的被検体にお
ける３種の微生物アクチノバシラス・アクチノマイセテ
ムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｔ
ｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）、バクテロイ
デス・ギンギバリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｇｉｎ
ｇｉｖａｌｉｓ）およびバクテロイデス・インターメデ
ィウス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉ
ｕｓ）のような歯周疾患に随伴する微生物間を分別する
ための方法に関する。また、この方法に有用な水不溶性
製品およびキットにも関する。この発明は歯科上の検査
および健康管理に有用である。

【０００２】

【従来の技術】医療、歯科および獣医学上の試験、研究
および診断法において、生物学的流体または被検体中に
存在する生物学的または化学的物質の迅速、かつ正確な
検出または定量に対する依然とした欲求が存在する。た
とえば、ヒトおよび動物の組織、流体および細胞におけ
る各種微生物の存在は、疾患の診断および有効な処置に
とって非常に有用である。

【０００３】特定の微生物は、ヒトや動物の各種歯周疾
患、例えば歯内炎および歯周炎に対する指標として関連
付けられてきた。これらの疾患の重要性は、特に長生き
している人々のような世代のヒトにとってますます重要
性が増してきたし、その予防は医療上および商業上著し
く重要性が増大してきた。その上、動物の適切な管理
（歯科上の医療を含む）は、われわれの文化における大
きな関心事である。

【０００４】歯周疾患に随伴する微生物の検出は、培養
技法（一般に時間がかかる）、ＤＮＡプローブ法および
各種の免疫学的な手法、例えば凝集アッセイ、エンザイ
ム・リンクト・イムノソルベント・アッセイ（ＥＬＩＳ
Ａ）、免疫蛍光法および免疫沈殿法を用いて行われてき
た。これらの免疫学的な手法は、微生物の抗原部位（そ
れらから抽出された成分上に存在してもよい）とそれに
特異的な対応する抗体との免疫反応を使用する。次に、
得られた免疫反応複合体を各種方法で検出することがで
きる。

【０００５】アクチノバシラス・アクチノマイセテムコ
ミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｔｉｎ
ｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）（以下、Ａ・アク
チノマイセテムコミタンスと称する）は、へモフィルス
（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）属微生物に近似する口内グ
ラム陰性の条件的生物である。この生物は、細菌性心内
膜炎、甲状腺膿瘍、尿路感染症、脳膿瘍および脊椎骨髄
炎を初めとする重篤なヒト感染症を引き起こす可能性が
ある。それは、一定のタイプの歯周疾患、特に局所幼年
性（ｊｕｖｅｎｉｌｅ）歯肉炎およびある種の成人の歯
肉炎の病原と密接に関連付けられた。Ａ・アクチノマイ
セテムコミタンスのヒト分離株は、血清型Ａ，Ｂおよび
Ｃと称される３つの主要な血清群に分類された。

【０００６】グラム陰性の黒色バクテロイデス（Ｂａｃ
ｔｅｒｏｉｄｅｓ）類は、通常、各種の歯周疾患、歯牙
形成部位の膿腫および歯内病変の病因となる嫌気性杆状
菌である。このような種にはバクテロイデス・インター
メディウス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｉｎｔｅｒｍｅ
ｄｉｕｓ）およびバクテロイデス・ギンギバリス（Ｂａ
ｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）が包含さ
れる。本明細書で定義される「歯周疾患」とは、口腔の
歯周で発生するヒトおよび動物の多種多様な疾患を称
し、結合組織、歯槽骨と歯肉の喪失に影響を及ぼす疾患
を包含する。それは、人生のいろいろな時期、例えば幼
児、青年時代、妊娠期間または老年期に発生しうる疾患
を包含する。Ｂ・インターメディウスおよびＢ・ギンギ
バリスは特定の歯周疾患に随伴する。

【０００７】歯肉間隙の流体および歯肉下の歯プラーク
における前記のような細菌に特異的な臨床上のアッセイ
は、歯周疾患の診断、歯周処置の選択および進捗状況の
評価ならびに時後の歯科上の検査によって患者の状態を
決定する上で有用である。このような生物を同定するの
に使用されている標準的な培養法は、時間および経費が
かかり、そして高水準の経験を持つオペレーターが必要
である。また、このような試験は搬入および搬出を通じ
て厳密な嫌気性条件が必要であるため低いレベルの生物
体の検出用としては十分な感度に欠けるきらいもある。

【０００８】上記各種のイムノアッセイが開発され、あ
る程度成功裏に使用されてきた。特に有用であるのは、
ラジオイムノ沈殿アッセイおよびＥＬＩＳＡ試験であ
る。米国特許第４，７４１，９９９号明細書は、Ａ・ア
クチノマイセテムコミタンスの抗原に対するモノクロー
ナル抗体とそれらのＥＬＩＳＡアッセイでの使用を記載
する。これらの試験は標準的な培養法を陵駕する改良を
示すものの、目的とする生物体に対するアッセイ感度を
向上させると共にヘモフィルス群のような類似する他の
生物体との交差反応性を低減させるためのさらなる改良
が必要であった。

【０００９】いろいろなバクテロイデス種に対するモノ
クローナル抗体およびポリクローナル抗体が類似のアッ
セイ用として調製されてきた〔例えば、Ｎａｋａｚａｗ
ａら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．， ５６（６），１
６４７〜１６５１ページ、１９８８、およびＺａｍｂｏ
ｎら、Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎ．，５６（上述）、３２〜
４０ページ、１９８５、参照〕。

【００１０】一般的に、従来技術のアッセイは時間がか
かり、単一の生物に向けられてきた。多くの場合に、ア
ッセイは関連する菌種と強い交差反応を有するので有用
性が限定されていた。本出願と同時に係属する発明の名
称「歯周疾患に随伴する微生物のスクリーニングアッセ
イならびにそれに有用な製品およびキット」の出願（米
国特許願第４６８，０３４号に対応）は、微生物Ａ・ア
クチノマイセテムコミタンス、Ｂ・ギンギバリスおよび
Ｂ・インターメディウスのいずれかの存在を検出する方
法を開示する。このスクリーニング方法は、患者が歯科
上の処置を必要とする場合にそれらを初期の段階で決定
できるので開業医にとって非常に有用である。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、スクリ
ーニングが行われて結果が陽性であることがわかったな
らば、治療を具体的に処方できるように存在する微生物
を決定しうることが望まれるであろう。その後、このよ
うな治療が早期に始められる。現在のところ、どのよう
な分別も時間がかかるか、または上記の免疫学的方法を
使用して実施しなければならないであろう。

【００１２】

【課題を解決するための手段】上記課題は、次の工程を
含んでなる歯周疾患に随伴する微生物の分別方法によっ
て解決される。 Ａ．歯周疾患に随伴する複数の微生物類から抽出した抗
原を含むことが疑われる水性被検体を、微孔質膜であっ
て、その膜表面の複数の不連続で個別の区画の各々が、
その表面の総面積未満でありそして特定の微生物の１種
の存在を表示することができ、特定の微生物の抗原少な
くとも１種に向けた抗体を付着した水不溶性粒子を含ん
でなる水不溶性試薬を担持するものである前記膜と接触
して、前記各区画中で膜上のその区画の抗体と対応する
抽出抗原との間で水不溶性免疫複合体を形成する工程、 Ｂ．工程Ａにおける接触と同時またはその前後に、各抽
出抗原をそれに向けた検出可能に標識した水溶性抗体と
接触し、膜上のそれぞれの区画のそれぞれの抽出抗原と
前記標識抗体および水不溶性抗体の両方とから形成され
る前記微生物に特異的な標識水不溶性免疫複合体を形成
する工程、 Ｃ．工程Ｂの接触と同時またはその後に、前記微孔質膜
を通して未複合体化物質を洗浄することによってその未
複合体化物質から前記標識水不溶性複合体を分離する工
程、ならびに Ｄ．被検体中に前記微生物類の少なくとも１種が存在す
るか否かの指標として前記膜の不連続で個別の区画中の
前記標識水不溶性複合体を検出する工程。

【００１３】この発明はまた、微孔質膜であって、その
少なくとも１つの表面の複数の不連続で個別の区画の各
々に水不溶性試薬を担持し、そしてその試薬の各々が歯
周疾患に随伴する特定の微生物の抗原少なくとも１種に
向けた抗体を付着した水不溶性粒子を含んでなり、その
試薬の各々が前記表面上に実質的にすべて存在するよう
な微孔質膜を含む水不溶性製品も提供する。

【００１４】さらにまた、微孔質膜であって、その少な
くとも１つの表面の複数の不連続で個別の区画の各々に
水不溶性試薬を担持し、そしてその試薬の各々が歯周疾
患に随伴する特定の微生物の抗原少なくとも１種に向け
た抗体を付着した水不溶性粒子を含んでなり、その試薬
の各々が前記表面上に実質的にすべて存在するような微
孔質を含む水不溶性製品を含んでなる歯周疾患に随伴す
る複数微生物の分別用試験キットも提供する。

【００１５】バクテロイデス・ギンギバリスはポルフィ
ロモナス・ギンギバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ
ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）と同一の微生物として考慮さ
れており、またバクテロイデス（ポルフィロモナス）・
ギンギバリス〔Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｏｒｐｈｙ
ｒｏｍｏｎａｓ）ｇｉｎｇｉｖａｌｓ〕として当該技術
分野で知られている。

【００１６】この発明を使用して歯周疾患に随伴する１
種以上の微生物の存在を迅速かつ感度よくスクリーニン
グすることができる。とりわけ、微生物Ａ．アクチノマ
イセテムコミタンス、Ｂ・ギンギバリスおよびＢ・イン
ターメディウスがこの発明によって分別できる。しかし
ながら、歯周疾患に随伴することが予想される他の微生
物もこの発明によって検出および分別可能である。限定
されるものでないが、このような他の微生物としては、
ウォリネラ・レクタ（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｒｅｃｔ
ａ）、バクテロイデス・ホルシタス（Ｂａｃｔｅｒｏｉ
ｄｅｓ ｆｏｒｓｙｔｈｕｓ）、エイケネラ・コロデン
ス（Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ）、フゾ
バクテリウム・ヌクレオアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｎｕｃｌｅｏａｔｕｍ）およびトロポネーマ・
デンティコーラ（Ｔｒｏｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏ
ｌａ）が挙げられる。ある態様では、これらの微生物の
いずれかの血清型の存在とは無関係である。もう一つの
態様では、この方法は単一種の微生物の血清型の間を分
別するのに使用できる。一般的に、この方法は定性的で
あるが、検出法で観察される複合体の量が微生物の相対
量を示す。この方法で検出される抗原（リポ多糖類、莢
膜抗原または膜タンパク質）は細胞そのものの一部であ
ってもよいが、一般に、それらは生物学的被検体中に存
在する細胞から適当な方法で抽出される。限定されるも
のでないが、このような被検体としては、咽喉または口
に由来する粘液、涙液、ヒトまたは動物の組織抽出物、
歯のプラークおよび歯肉間隙の液体が挙げられる。一般
的に、前記生物体は歯のプラーク、唾液または歯肉間隙
の液体中に検出されている。

【００１７】上述のようにこの発明は分別法であり、患
者の予防管理または処置の試験にもそのまま使用できる
が、好ましくはどのような微生物が存在するかを測定す
る先立つスクリーニング後に使用される。スクリーニン
グ試験が陽性の場合、次にこの発明を使用して開業医の
適切な処置を施こすかまたはモニターすることに有利に
役立てることができる。

【００１８】目的とする微生物のいずれかからの抗原抽
出は、標準的な方法による洗剤（例えば、デオキシコー
ル酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウムまたはデシル
硫酸ナトリウム）の使用によって、物理的または化学的
手段で適当に達成される。場合によって、抗原物質はそ
のままの被検体から採取してもよいが、もとの被検体を
水または適当な緩衝液で希釈するか、あるいは濾過して
異物を除去しそしてアッセイにおける抗原と抗体の複合
体化を促進してもよい。

【００１９】この発明の実施に際して使用される抗体
は、モノクローナルまたはポリクローナルであることが
できる。一般に、抗体が単離されると、それらは保存
し、１種以上の適当な緩衝剤および必要によって防腐剤
を含有する緩衝溶液として使用することができる。それ
らは凍結状態で保存することが好ましい。緩衝液は、一
般にｐＨ６〜９、好ましくはｐＨ６．５〜８．５に維持
される。有用な緩衝剤は、当業者に自明であろう。

【００２０】各抗原に対する抗体類は、アッセイまたは
キットで個別に保存して供給することができるが、それ
らは、使用するまで一緒に混合して保存してもよい。被
検体は複数の微生物（好ましくは、少なくとも３種の微
生物）の存在について評価するので、それぞれ唯一の微
生物に特異的な複数の別々の抗体類が使用される。微生
物の各々は１種以上の血清型が存在するので、ある種の
各血清型に対する抗体類を混合して使用することが可能
である。当業者は、使用する抗体の数および分別に適す
るそれぞれの相対的な濃度を容易に決定できるであろ
う。

【００２１】この発明のサンドイッチアッセイの実施に
際して、有機体、ポリマー、ガラス、セラミック、天然
もしくは合成樹脂、珪藻土または磁性粒子から形成した
粒状キャリア材料の水不溶性粒子上へ適当な様式で抗体
を固定する。これらの粒子は、好ましくは球形で平均径
０．０１〜１０μｍ、好ましくは０．１〜１０μｍ、最
も好ましくは１〜３μｍであるが、構造および空間配置
はそれらが膜内に埋没しない限り（後述する）限定され
ない。平均径は粒子が膜表面上に残存するように（後述
のように）設計される。得られる抗体と粒子の水不溶性
試薬がこの発明の方法で使用される。

【００２２】抗体類は、前記材料表面への吸着またはそ
の表面の反応性基との共有結合を初めとする物理的また
は化学的手段によって粒状キャリア材料に付着すること
ができる。共有結合が好ましい。好ましいポリマー粒子
は、それに抗体分子を共有結合するための適当な表面反
応性基を有する。キャリア材料上の抗体分子の密度は、
前記材料の組成、それらのサイズおよび抗体の性質に応
じて変動しうるが、アッセイに適する感度に要する十分
な密度は当業者によって容易に決定できる。場合によっ
て抗体を結合に適するように変性してもよい。

【００２３】抗体の共有結合は、通常抗体の遊離アミ
ン、糖質またはスルフヒドリル基と直接または間接的に
（すなわち、タンパク質またはアビジン−ビオチンのよ
うな連結を介して）反応しうる表面反応性基を使用して
達成される。限定されるものでないが、このような表面
反応性基としては、カルボキシル基、エポキシ基、アル
デヒド基、活性ハロ原子、活性２−置換エチルスルホニ
ル基、ビニルスルホニル基および当該技術分野で既知の
他の基が挙げられる。粒子の好ましい態様に関する以下
の説明は、単に例示を目的とするものであって限定する
ことを意味しない。

【００２４】特に有用なポリマー粒子としてはヨーロッ
パ特許公開第３２３６９２号公報に記載されるものが挙
げられる。これらの粒子は、一般に、平均粒子サイズが
０．０１μｍを越える水不溶性ラテックス粒子である。
それらは、少なくとも１つの活性ハロ原子、活性２−置
換エチルスルホニル基または活性ビニルスルホニル基を
有する１種以上のエチレン系不飽和重合性モノマーから
製造されるポリマー類から構成される。反応性カルボキ
シル基を有するモノマー類が非常に有用である。

【００２５】これらのモノマー類の１種以上を、個別に
または組み合わせて重合してホモポリマーまたはコポリ
マーを形成することができる。また、それらの１種以上
が少なくとも１種の他のエチレン系不飽和重合性モノマ
ーと共重合される。一般的にこれらのモノマー類は、疎
水性、分散性または他の特質のような様々な好ましい特
性を提供する。

【００２６】代表的な有用ポリマー類としては次のもの
が挙げられる：ポリ（ｍ＆ｐ−クロロメチルスチレ
ン）、ポリ（スチレン−コ−ｍ＆ｐ−クロロメチルスチ
レン−コ−２−ヒドロキシエチルアクリレート）（モル
比、６７：３０：３）、ポリ〔スチレン−コ−ｍ＆ｐ−
（２−クロロエチルスルホニルメチル）−スチレン〕
（モル比、９６：４）、ポリ｛スチレン−コ−Ｎ−〔ｍ
＆ｐ−（２−クロロエチルスルホニルメチル）フェニ
ル〕アクリルアミド｝（モル比、９９．３：０．７）、
ポリ（ｍ＆ｐ−クロロメチルスチレン−コ−メタクリル
酸）（モル比、９５：５，９８：２および９９．８：
０．２）、ポリ〔スチレン−コ−ｍ＆ｐ−（２−クロロ
エチルスルホニルメチル）スチレン−コ−メタクリル
酸〕（モル比、９３．５：４．５：２）、ポリ｛スチレ
ン−コ−Ｎ−〔ｍ＆ｐ−（２−クロロエチルスルホニル
メチル）フェニル〕アクリルアミド−コ−メタクリル
酸｝（モル比、９７．３：０．７：２）およびポリ（ス
チレン−コ−ｍ＆ｐ−クロロメチルスチレン）（モル
比、７０：３０）。

【００２７】この発明の重要な態様は、微孔質膜上の不
連続で個別の区画で抽出された抗原とそれらの抗体の免
疫複合体の形成にある。各区画を使用して特定の微生物
または特定微生物の特定の血清型を検出する。個々の抗
原とそれらに対応する抗体との間のすべての複合体化が
ほぼ同時に起こるようにこれらの抗原とすべての抗体の
接触が、ほぼ同時に行われる。室温またはより高温でほ
んの短時間のインキュベーションにより検出に十分な複
合体化が可能である。

【００２８】微孔質膜は水不溶性であり、いずれの化学
的または生物学的反応に不活性である。それは反応また
は形状もしくは機能を喪失することなく試薬を十分に付
着させる保全性を示す１種以上の天然または合成物質か
ら構成される。それは、膜上に形成された複合体類から
実質的にすべての未複合体化物質を除去するのに必要な
濾過に十分な多孔度である。限定されるものでないが、
有用な膜材料としては、多孔性天然または合成ポリマ
ー、焼結ガラス、ガラスもしくはポリマーフィルムもし
くは繊維の膜、セラミック材料、セルロース系材料およ
び粘着剤もしくはバインダー材料と共にバインディング
したビーズからなる粒状構造体が挙げられる。膜は、ほ
ぼ平坦であるが、表面のある程度の不規則は許容され、
さらに場合によって一定の曲率を有していてもよい。当
業者は、市販されているかまたは既知方法で調製した他
の有用な材料を選ぶことができるであろう。特に有用な
材料は、処置または未処置ポリアミド微孔質膜、例えば
Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．から市販されているものが挙げら
れる。

【００２９】微孔質膜は、一般的に０．５〜１０μｍの
平均細孔サイズを有するが、形成された複合体が外面に
残存しそして排液が不必要に長くならない限り、より小
さな細孔であってもより大きな細孔であってもよい。こ
の微孔質膜は、アッセイ中に遭遇する流体および未複合
化物質を排出するのに十分な多孔度を有するように設計
される。このような未複合体化物質には、未複合体化抗
原、抗体類、細胞残屑、および生物学的被検体由来の他
の非粒子状の異物が包含される。したがって、微孔質膜
の細孔サイズは、上記物質がその多孔質支持体を通過す
るようなものでなければならない。

【００３０】この抗体−粒子試薬は膜の表面に実質的に
存在し、試薬が膜内に埋没するのは５重量％未満、好ま
しくは１重量％未満であることを意味する。「埋没す
る」とは、試薬粒子の全体が膜の細孔内に存在すること
を意味する。このことは、試薬粒子が部分的にでも細孔
内または外面付近に埋没できないことを意味しない。場
合によって、微孔質膜はある程度の試薬部分をその表面
細孔内に埋没させてもよいが、ヨーロッパ特許公開第２
００，３８１号および国際公開第８７／０３６９０号公
報が教示するような相当量でない。

【００３１】場合によって、微孔質膜は非特異的な相互
作用を低下させることが当該技術分野で知られているよ
うなタンパク質（例えば、カゼインまたはスクシニル化
カゼイン）で被覆してもよく、あるいは迅速な濾過に寄
与する界面活性剤またはアッセイを促進する他の任意の
物質で被覆してもよい。

【００３２】微生物に対する特異的な抗体類を担持する
個々の粒状試薬は、その抗体類が接触する抗原と反応で
きる限りいずれか適当な態様で膜表面に付着される。一
般的に、試薬は製造および処理を通じてゆるやかな機械
的撹拌でそれらを損失しないように付着される。さら
に、試薬類はアッセイ中に膜から漏れ出さない。例え
ば、これらの試薬類は、塗布、スポットまたはスプレー
によって機械的に付着することができ、分子間ならびに
分子と膜間の疎水バインディングによって膜上に保持さ
れる。また、適当な化学反応によって共有結合してもよ
い。一般的に、試薬類は使用前に膜上に塗布し乾燥され
るが乾燥は必ずしも必要でない。

【００３３】各試薬は、疎水性、中性または正荷電バイ
ンダー材料と混合して膜上に固定されることが特に有用
である。バインダー材料の量は試薬の総重量当たり２０
重量％未満である。限定されるものでないが、特に有用
なバインダーとしては、ビニルピロリドンポリマー類、
アクリルアミドポリマー類、ならびに第四級塩類および
当該技術分野で既知の電荷が中性であるかもしくは正に
荷電した他の基を含有するポリマー類が挙げられる。
「電荷が中性」とは、ポリマー類が電荷をもたないか、
または分子中に比較的小さなネット負電荷もしくは正電
荷を有することを意味する。これらのポリマー類は、ホ
モポリマー類またはコポリマー類であることができ、単
一または組み合わせて使用することができる。アクリル
アミドポリマー類は、メタクリルアミドポリマーを含め
たものを意味する。

【００３４】有用な正荷電ポリマーバインダー類として
は米国特許第４，０６９，０１７号明細書に記載される
媒染剤が挙げられ、この媒染剤は十分な水溶性を示す。
十分な水溶性は、一般にポリマーの少なくとも５０重量
％が正荷電基を含有するモノマー類から構成される。好
ましい態様では、試験デバイスは被検体の分別の結果を
提供しそして正対照および負対照を提供するように設計
された３つの試験ウェルを有する。各試験ウェルには微
孔質膜が固定される。有用な試験デバイスの他の変型も
当業者が予見可能な範囲内であろう。好ましい態様で
は、１つの試験ウェルは、水不溶性試薬類が複数微生物
の各々を個別に検出するための所定区画に付着されてい
る膜を有する。

【００３５】アッセイは、膜上の複数の不連続で個別の
区画で実施され、各区画は膜表面の総面積未満を占め
る。このような区画は、抗体類を膜の少なくとも１つの
表面の一定領域に付着する（後述するように）ことによ
って提供されるが、抗体を持たない領域で囲まれる。好
ましくは、各不連続な個別の区画は円形のスポットであ
るが、他の形状は当業者の予期する範囲内にある。好ま
しくは、膜上に３個の不連続で個別の区画が存在する。

【００３６】図１は、円形膜１０が３個の個別の円形区
画１２，１４および１６を含んでなる上面１１を有する
好ましい態様の平面図である。各区画には、上述したよ
うな水不溶性試薬が堆積されている。例えば、区画１２
は、Ａ・アクチノマイセテムコミタンスに向けた抗体類
を伴う試薬を有することができ、区画１４はＢ・ギンギ
バリスに向けた抗体類を伴う試薬を有することができ、
そして区画１６はＢ・インターメディウスに向けた抗体
類を伴う試薬を有することができる。

【００３７】図２は、膜２０のデザインが図１の膜１０
と異なる以外は同様の略図である。膜２０は表面２１の
上部に９個の不連続の円形区画２２，２４，２６，２
８，３０，３２，３４，３６および３８を有し、それら
の各々は、特定の微生物または微生物の血清型に特異的
な抗体を有する試薬を堆積している。例えば、区画２
２，２４および２６はそれぞれＡ・アクチノマイセテム
コミタンスの血清型Ａ，ＢおよびＣを検出するための試
薬を有することができ、各２８，３０および３２はそれ
ぞれＢ・ギンギバリスの血清型Ａ，ＢおよびＣを検出す
るための試薬を有することができ、そして３４，３６お
よび３８はそれぞれＢ・インターメディウスの血清型
Ａ，ＢおよびＣを検出するための試薬を有することがで
きる。

【００３８】図３は、さらにもう一つの態様であり、水
不溶性試薬の３種の個別区画が「プラス」の形状で堆積
されている場合、被検体中に特定の微生物が存在すると
アッセイ中にプラスが表示される。微生物が存在しない
場合には、「プラス」の標識の一部だけが可視化される
（例えば、横棒もしくは縦棒だけ）か、あるいは特定領
域には何も示されない。円形膜４０は、微生物を分別す
るための３個の個別区画４４，４６および４８を含む上
面４２を有する。この態様に対する別のデザインは、各
区画が別々の形状を有する場合であろう。

【００３９】膜の別のデザイン（図示していない）で
は、表面が微生物の負の測定結果を検出可能なシグナル
（例えば色素）を与え、そして微生物の正の測定結果に
ついての別の検出可能なシグナルを与えうる試薬を堆積
した複数（例えば、３個）の個別区画をそれぞれに有す
る。この別のシグナルは、別の色を提供する相違する色
素または別のもしくは同一領域中に同一の色素の相違す
る形状に由来するものであってよい。

【００４０】図１〜３の略図は、この発明の実施用とし
て工夫されうる区画を有する膜の各種のデザインおよび
フォーマットの代表的なものと考えられるが限定される
ものでない。この発明の方法は、抗体と存在する対応す
る抗原との間で免疫複合体が形成されるように被検体中
の微生物から抽出された抗原を膜上の抗体と接触させる
どのような様式でも実施される。接触はいずれか適当な
方法で行うことができるが、抽出した抗原を含有する被
検体を膜上に滴下するかもしくは流し込むことが好まし
く、そして使い捨て試験デバイス中で行ってもよい。

【００４１】抗原と対応する粒状試薬の抗体との間での
１種以上の複合体の形成と同時またはその前後のアッセ
イのある時点で、それに向けた抗原は第二の抗体とも免
疫複合体を形成する。この第二の抗体は水溶性で検出可
能に標識されている。「検出可能に標識」とは、抗体が
それに共有結合または組み合わさった部分を有し、そし
てそれが視覚的または分光光度計、もしくは放射線測定
装置もしくは他の適当な装置と操作によって直接的また
は間接的に検出できることを意味する。間接的な検出
は、抗体上の部分を１倍以上の適当な試薬と反応させて
直接検出できる生成物をもたらすことによって行うこと
ができる。

【００４２】有用な標識は、周知であり、酵素、放射性
同位体ならびにビオチン、アビジン、レクチンおよび糖
のような特異的なバインディング材料、ならびにある方
法で検出することができる当業者に自明な他の材料が挙
げられる。標識は、ビオチン、酵素または放射性同位体
が好ましい。第二の抗体との接触は、不溶化抗体との複
合体が膜上に形成された後に起こることが好ましい。従
って、各区画で得られたバインディングサンドイッチ複
合体は、特定の抗原とその相違するエピトープ部位に向
けた２種の抗体（１つの抗体は不溶化されており、第二
の抗体は検出のために標識されている）とから形成され
る。

【００４３】標識抗体の調製方法は周知である。酵素、
例えばペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ア
ルカリホスファターゼ、ウレアーゼ、β−ガラクトシダ
ーゼおよびグルコシダーゼが特に有用な標識である。ペ
ルオキシダーゼが最も好ましい標識である。

【００４４】抗原と標識抗体の接触と同時またはその後
に、未複合体化物質は、膜上にバインディングしたサン
ドイッチ複合体からその未複合体化物質を膜を介して洗
浄することによって分離される。膜を介して前記物質を
洗浄するためには生物学的被検体の流体で十分である
が、一般的に１種以上の別の洗液を使用して分離が行わ
れる。洗液は当該技術分野で既知であり、蒸留水または
非イオン界面活性剤の緩衝液が挙げられる。特に有用な
洗液はデシル硫酸ナトリウムまたはドデシル硫酸ナトリ
ウムを含む。

【００４５】膜上のサンドイッチ複合体の検出は、標準
的な検出装置および検出方法を用いて行われる。それら
は当業者が容易に予見するように個々の標識によって変
動しうる。標識が酵素である場合、バインディングした
複合体は、その酵素の存在下で色素（発色源または蛍光
源）を生成しうる組成物とさらに接触される。このよう
な組成物は、一般的に酵素に対する基質などの１種以上
の試薬類を含む。このような試薬類は当業者に知られて
いる。

【００４６】ペルオキシダーゼが標識である場合、基質
または基質生成反応体ならびに色素生成反応体を含む各
種の適当な色素生成組成物が知られている。水不溶性複
合体の存在下で色素が生成されると、それを視覚的また
は分光光度計を用いて評価してアッセイが被検体中の抗
原の存在を示すか否かを決定することができる。正対照
試験および負対照試験の両者を被検体試験と共に行うこ
とが望ましい。各対照試験について適切な試薬類を使用
して所定の結果を与えることができる。

【００４７】ある態様では、標識がビオチンまたはアビ
ジンである場合、標識を対応する受容体（すなわち、ア
ビジンと反応する標識としてのビオチン）と反応させる
ことによって検出を行うことができる。対応する受容体
を放射性同位体または酵素で適当に標識して検出可能な
複合体をもたらすことができる。例えば、ビオチンであ
る場合には、それを酵素とアビジンの結合物と反応する
ことができる。酵素は適当な試薬類の存在下で検出可能
な色素を生じうる。

【００４８】好ましい態様では、微生物アクチノバシラ
ス・アクチノマイセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔ
ａｎｓ）、バクテロイデス・ギンギバリス（Ｂａｃｔｅ
ｒｏｉｄｅｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）およびバクテロ
イデス・インターメディウス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ
ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）の分別方法が次の工程を含
んでなる。 Ａ．生物学的被検体中に存在するアクチノバシラス・ア
クチノマイセテムコミタンス、バクテロイデス・ギンギ
バリスおよびバクテロイデス・インターメディウスの各
々の血清型１種以上から抗原を抽出する工程、 Ｂ．使い捨て試験デバイス中の微孔質膜であって、各区
画が総表面積未満でありそして前記微生物の１種の存在
を表示しうるものである膜表面の不連続で個別の区画少
なくとも３個の各々に前記特定の微生物の抗原少なくと
も１種に向けた抗体を付着した水不溶性粒子を含む水不
溶性試薬を表面に担持する膜を工程Ａで抽出した抗原の
すべてと接触させて前記区画の各々でその区画中の抗体
と対応する抽出抗原間の水不溶性免疫複合体を前記膜上
に形成する工程、 Ｃ．膜上の各水不溶性複合体を各複合体の抗原に向けた
酵素標識水溶性抗体と接触させて膜上のそれぞれの区画
中でそれぞれの抽出抗原と前記標識抗体および水不溶性
抗体の両者の酵素標識水不溶性免疫複合体を形成する工
程、 Ｄ．前記膜を通して未複合体化物質を洗浄する工程、な
らびに Ｅ．前記膜上の各酵素標識複合体を被検体中の各微生物
の存在または不存在を表示するものとして酵素の存在下
で色素を生成する組成物と接触させる工程。

【００４９】この発明の診断試験キットは、この発明の
製品ならびに製品を検出するように設計した前記微生物
の各々に向けた検出可能に標識した抗体を含む。これら
のキットの成分は、適当な方法で包装することができ、
前記製品（単独または試験デバイス中に）および試薬類
のバイアルまたはボトルを区分けして保持できるある型
のキャリア中に含めることができる。それに加えて、場
合によりこのスクリーニング法を実施するのに有用な色
素生成組成物、抽出試薬、洗液、希釈剤および与えられ
たアッセイフォーマットに関して当業者に既知の他の試
薬類１種以上も含めることができる。試薬類は乾燥状態
または適当な溶液状態で供給することができる。キット
の無反応性成分としては説明書、混合容器、撹拌手段お
よびピペットなどを挙げることができる。

【００５０】ポリクローナル抗体の次の調製法がそれら
の調製にとって好ましい方法である。前記細菌種は、Ｈ
ｏｍｅｒ Ｓ．Ｒｅｙｎｏｌｄｓ（ＳＵＮＹ Ｂｕｆｆ
ａｌｏ，Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｄｅｎｔｉｓｔｒｙ）に
よって生きた培養物として供給された。分離株をヘミン
（５μｇ／ｍｌ）およびメナジオン（０．５μｇ／ｍ
ｌ）で強化したＣＤＣ嫌気性プレート（ＢＢＬ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．）で
嫌気的に培養した。

【００５１】次に、これらのプレートを嫌気性チャンバ
ー中３７℃で２４〜４８時間インキュベーションした。
各菌株に対する凍結保存試料は、白金耳で細胞コロニー
を採取し、スキムミルクで細胞懸濁液を調製し、次いで
この懸濁液を−７０℃で凍結することによって調製し
た。凍結保存試料の生存性は、凍結保存試料の一部をＣ
ＤＣ嫌気性プレート上に置き、そして上記のようにイン
キュベーションすることによって試験した。生存性が確
認されると、各菌株に対する新鮮な分離株を同様にして
得た。細胞懸濁液は、白金耳でコロニーを採取し、リン
酸緩衝溶液（ｐＨ７．５，１ｍｌ）にその白金耳を置
き、次いで約１分間激しく撹拌することによって調製し
た。

【００５２】細胞懸濁液の濃度は、６２０ｎｍにおける
濁度を測定することによって分光測光的に測定した。適
当な希釈物を調製して光学濃度範囲を０．１〜１にし
た。濃度は１マクファーランド（ＭｃＦａｒｌａｎｄ）
標準（ＯＤ_６２０＝０．１８０で、約３×１０^８細胞／
ｍｌに相当する）を用いて測定した。

【００５３】ニュージーランド白ウサギに、１ｍｌ当た
り総生細胞約５×１０^８個を含有するそれぞれの免疫原
のリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．３）０．５ｍｌを静脈内注
射した。これらの注射は、ＭｃＣａｒｔｙおよびＬａｎ
ｃｅｆｉｅｌｄ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１０２，１〜
２８ページ、１９５５）に示される方法に準じて行っ
た。２度のブースター注射は次のように行った：最初の
注射１週間して各ウサギに再度同量の免疫原を注射し、
さらに１週間後同様な注射を各ウサギにした。

【００５４】最初の注射後１５日目に開始し、さらに合
計１１週間各ウサギに対し、１週当たり３度の免疫原
（５×１０^８細胞／ｍｌ）１ｍｌのブースター注射をし
た。ブースター注射は各７日間を通じて１日おきに間隔
をとった。これらのウサギから数度抗血清（各血清型に
対する）試料を集め、その都度抗体の性質を調べた。例
えば、抗血清試料は最初の免疫原注射から３週間、６週
間および９週間間隔で採取した。次に、最初の注射から
１３週目にウサギを殺し、抗血清を集めた（ウサギ１ワ
当たり約１００ｍｌ）。

【００５５】次に、最後の血清を硫酸アンモニウム沈殿
によって精製した。４５％飽和が達成されるまで、飽和
硫酸アンモニウム溶液を氷で冷却した各血清試料に撹拌
しながら滴下した。添加後、混合物をさらに１０分間撹
拌し、遠心し、次いで上澄を廃棄した。このペレットを
もとの精製された試料の量に等しい容量のリン酸緩衝溶
液（ｐＨ７．３）に再懸濁した。次に、混合物を透析バ
ッグに移し、リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．３）に対して４
℃で撹拌しながら約１５時間透析した。約２００〜１
０，０００倍を越える透析緩衝液を使用した。さらに６
時間新鮮な緩衝液で透析を繰り返した。透析バッグから
溶液を取り出し、０．２２μｍのフィルターを通して濾
過した。濾液の一部をリン酸緩衝溶液で１：１０〜１：
１００の範囲内に希釈し、２８０ｎｍにおける吸光度を
読み取った。抗体濃度は次の式により決定した： Ａ_２８０÷〔１．４×（希釈）〕＝抗体濃度（ｍｇ／ｍ
ｌ）。 次に抗体溶液をリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．３）およびマ
ーシオレート（０．０１重量％）で２〜４ｍｇ／ｍｌに
希釈し、次いで４℃で保存した（少量は４℃で、一方多
量の試料は−７０℃で保存）。

【００５６】

【実施例】下記の例はこの発明を具体的に説明する目的
で提供するものであって、いずれかの態様にこの発明を
限定することを意図するものでない。すべてのパーセン
テージは、別に指摘しない限り重量基準である。 例１〜３ サンドイッチ分別アッセイ これらの例は、生物学的被検体中の微生物Ａ・アクチノ
マイセテムコミタンス、Ｂ・ギンギバリスおよびＢ・イ
ンターメディウスのいずれかの存在を検出するのに単一
の試験デバイスによるこの発明の使用を具体的に説明す
る。

【００５７】材料および方法 Ｓｕｒｅｃｅｌｌ（商標）使い捨て試験デバイス（Ｅａ
ｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．）は、その試験ウェル
中にＬｏＰｒｏｄｙｎｅ（商標）ナイロン微孔質膜（５
μｍ，Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．）を組み込んで使用した。
これらの膜はＦｌｕｏｒａｄ（商標）ＦＣ １３５非イ
オン界面活性剤（０．０５ｇ／ｍ^２，３Ｍ Ｃｏ．）で
処理した。これらの膜を、それぞれ個別領域について適
切な表面積を提供するために各試験ウェルの底部が直径
９ｍｍとなるようにそれぞれの試験ウェル中に設置し
た。

【００５８】色素生成組成物は、２−（４−ヒドロキシ
−３，５−ジメトキシフェニル）−４，５−ビス（４−
メトキシフェニル）イミダゾール（０．００８％）、ポ
リ（ビニルピロリドン）（１％）、リン酸ナトリウム緩
衝剤（１０ミリモル濃度、ｐＨ６．８）、過酸化水素
（１０ミリモル濃度）、４′−ヒドロキシアセタニリド
電子移動剤（２ミリモル濃度）およびジエチレントリア
ミン五酢酸キレート剤（１０マイクロモル濃度）を含む
ように調製した。

【００５９】３種の微生物Ａ・アクチノマイセテムコミ
タンス、Ｂ・ギンギバリスおよびＢ・インターメディウ
スの各々に向けたポリクローナル抗体は、上述したよう
にウサギの静脈内注射によって得た。ＩｇＧ画分を硫酸
アンモニウム沈殿で調製し、リン酸緩衝溶液（０．３〜
０．４％溶液）中４℃で保存した。抗血清を産生するの
に使用した細菌株は、生存培養物としてＨ．Ｓ．Ｒｅｙ
ｎｏｌｄｓ（ＳＵＮＹ，Ｂａｆｆａｌｏ Ｓｃｈｏｏｌ
ｏｆ Ｄｅｎｔｉｓｔｒｙ）より提供された。分離株
を上記のような嫌気性プレート上で二次培養した。これ
らの微生物は、アクチノバシラス・アクチノマイセテム
コミタンス（血清型Ａ）についてＡＴＣＣ ４３７１
７、バクテロイデス・ギンギバリス（血清型Ｂ）につい
てＡＴＣＣ５３９７８およびバクテロイデス・インター
メディウス（血清型Ａ）についてＡＴＣＣ ２５６１１
の寄託番号で同定されるものである。

【００６０】ポリマー−抗体試薬は、Ａ・アクチノマイ
セテムコミタンス〔等濃度の血清型Ａ（ＡＴＣＣ ４３
７１７）および血清型Ｂ（ＡＴＣＣ ４３７１８）〕に
向けた同量の抗体類を、ヨーロッパ特許公開第３２３，
６９２号公報の教示に従って製造したポリ〔スチレン−
コ−ｍ＆ｐ−（２−クロロエチルスルホニルメチル）ス
チレン〕（モル比、９６：４）のポリマー粒子に共有結
合させて調製した。共有結合は、試験中のホウ酸緩衝液
（６５９μｌ，０．０５モル濃度、ｐＨ８．５）に前記
抗体（リン酸緩衝溶液６７μｌ中５６．５μｇ）を加
え、よく混合して行った。ポリマー粒子（固体１３．１
５％含有懸濁液２２８μｌ）を抗体組成物に加え、得ら
れた懸濁液を室温で１４〜２４時間回転させて粒子への
抗体の共有結合を行った。次いで、この懸濁液を１０分
間２８００ｒｐｍで遠心した。上清を廃棄し、ペレット
をマーシオレート（０．０１％）含有グリシン緩衝液
（１ｍｌ，０．０１モル濃度、ｐＨ８．５）に懸濁し
た。この操作を２度繰り返した。

【００６１】同様な方法で、Ｂ．インターメディウス
〔等濃度の血清型Ａ（ＡＴＣＣ ２５６１１）、血清型
Ｂ（ＮＣＴＣ ９３３６）および血清型Ｃ（ＡＴＣＣ
４９０４６）〕に対する抗体類を同じタイプのポリマー
粒子に共有結合した。さらに、Ｂ・ギンギバリス〔等濃
度の血清型Ａ（ＡＴＣＣ ３３２７７）、血清型Ｂ（Ａ
ＴＣＣ ５３９７８）および血清型Ｃ（ＡＴＣＣ ５３
９７７）〕に対する抗体類を同じタイプのポリマー粒子
に同様に共有結合した。

【００６２】各微生物に対する最終的な抗体−粒子試薬
組成物は、グリシン緩衝液（０．１モル濃度、ｐＨ８．
５）中に抗体−粒子試薬（１％）、ポリアクリルアミド
バインダー（５％）を含めた。次に、各試薬組成物（２
μｌ）を試験デバイスのＬｏＰｒｏｄｙｎｅ（商標）ナ
イロン微孔質膜上面の個別の区画にのせ、次いで乾燥し
てこの発明の製品を作成した。こうして、膜は３つの個
別の抗体−粒子試薬区画を有し、各区画は特定の微生物
に対して特異的な試薬を担持していた。

【００６３】酵素−抗体結合物は、各微生物に向けた
（対する）抗体を用いて調製し、この抗体をＹｏｓｈｉ
ｔａｋｅら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，
３９５ページ、１９７９）の方法に準じてワサビペルオ
キシダーゼへ結合した。各結合組成物は、３−（Ｎ−モ
ルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝液（０．１モル濃
度、ｐＨ７．５）中に前記結合物（１ｍｌ当り各５μ
ｇ）、カゼイン（０．５％）およびマーシオレート
（０．０１％）を含めた。

【００６４】抗原は、室温中約１分間でドデシル硫酸ナ
トリウムを用いて微生物から抽出した。洗浄は、水中デ
シル硫酸ナトリウム（１８ｇ／ｌ）を含めた。アッセイ ２種の濃度で各微生物から抽出した抗原を、上記試験デ
バイスの２組（セット）に加えた。各試験ウェルの負対
照として使用する膜表面は抗体−粒子試薬を担持してい
ない。

【００６５】結合組成物（５０μｌ）を加え、次いで試
験デバイスを５分間室温でインキュベーションした。洗
液（約５００μｌ）を各試験ウェルに１度に滴下した。
色素生成組成物（５０μｌ）を加え、この試験ウェルを
２分間室温でインキュベーションした。膜上に形成した
色素を視覚的に読み取り、反射濃度値を示す検量カラー
チャートと比較し、次いでＷｉｌｌｉａｍｓ−Ｃｌａｐ
ｐｅｒ変換（Ｊ．Ｏｐｔ．Ｓｏｃ．Ａｍｅｒ．， ４
３，５９５ページ、１９５３）で透過率濃度（Ｄ_Ｔ）に
変換した。

【００６６】アッセイの結果を下記の表に示す。例１を
使用して膜上のＡ・アクチノマイセテムコミタンスに向
けた抗体を担持する抗体−粒子試薬でその微生物の検出
が確認できる。例２は膜上のＢ・ギンギバリスに特異的
な試薬を用いてその微生物の検出が確認できる。例３は
膜上のＢ・インターメディウスに特異的な試薬を用いて
その微生物の検出が確認できる。結果は各微生物が単一
の試験ウェルでサンドイッチアッセイを行うことにより
他の微生物から分別されること示す。

【００６７】

【表１】

【００６８】上記表１中、^＊アクチノバシラス・アクチ
ノマイセテムコミタンスの細胞同定数、^＠バクテロイデ
ス・ギンギバリスの細胞同定数および^＃バクテロイデス
・インターメディウスの細胞同定数。

【００６９】

【発明の効果】この発明の方法は、歯科上の被検体中に
存在する歯周疾患に随伴する複数の微生物の測定のため
の有効で、迅速かつ比較的安価な手段である。従って、
特定の歯周疾患が初期の段階でかなり容易に同定できる
ので、早期療法に適する処置を施すことができる。従来
では、このような測定が当該技術分野で既知の時間がか
かるか、あるいは感度のよくない免疫学的方法で行われ
ていた。

【００７０】この方法は、同時係属中の発明の名称「歯
周疾患に随伴する微生物のスクリーニングアッセイなら
びにそれに有用な製品およびキット」の出願明細書（米
国特許出願第４６８，０３４号に対応）に開示されるス
クリーニング試験後に有利に使用することができる。す
なわち、開業医が被検体中に少なくとも１種の微生物が
存在することを迅速に測定した後、この発明を用いて微
生物類が存在すること見い出すことができる。ある態様
では、試験をどのような微生物の血清型が存在するかを
見分けることができる。

【００７１】上記の利点は、個々の微生物またはその血
清型の免疫複合体を捕捉するための不連続な区画を有す
る微孔質膜によって達成される。各区画は、そこに特定
の微生物に対する適当な抗体を担持することによってそ
の微生物だけを検出するように設計されている。抗原と
抗体の複合体化は膜上で迅速に起こり、未複合体化物質
は適当な標識抗体と接触後に検出可能な複合体を残した
まま排出できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】膜の３個の不連続な円形区画によって３種の特
定の微生物の検出を概述するこの発明の一態様の平面図
である。

【図２】数種の微生物または同一もしくは異なる微生物
の数種の血清型を検出するために設計された９個の不連
続な円形区画を膜表面が有するこの発明のもう一つの態
様の平面図である。

【図３】膜が「プラス」の形の表示をそれぞれ３個の不
連続な区画で示すこの発明のさらにもう一つの態様の平
面図である。

【符号の説明】

１０…円形膜 １２…円形区画 １４…円形区画 １６…円形区画

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 歯周疾患に随伴する微生物類の分別方法
   であって、 Ａ．歯周疾患に随伴する複数の微生物類から抽出した抗
   原を含むことが疑われる水性被検体を、微孔質膜であっ
   て、その膜表面の複数の不連続で個別の区画の各々が、
   その表面の総面積未満でありそして特定の微生物の１種
   の存在を表示することができ、特定の微生物の抗原少な
   くとも１種に向けた抗体を付着した水不溶性粒子を含ん
   でなる水不溶性試薬を担持するものである前記膜と接触
   して、各区画においてその区画中の抗体と膜上の対応す
   る抗原との間で水不溶性免疫複合体を形成する工程、 Ｂ．工程Ａにおける接触と同時またはその前後に、各抽
   出抗原をそれに向けた検出可能に標識した水溶性抗体と
   接触し、膜上のそれぞれの区画のそれぞれの抽出抗原と
   前記標識抗体および水不溶性抗体の両方とから形成され
   る前記微生物に特異的な標識水不溶性免疫複合体を形成
   する工程、 Ｃ．工程Ｂの接触と同時またはその後に、前記微孔質膜
   を通して未複合体化物質を洗浄することによってその未
   複合体化物質から前記標識水不溶性複合体を分離する工
   程、ならびに Ｄ．被検体中に前記微生物類少なくとも１種が存在する
   か否かの指標として前記膜の不連続で個別の区画中の前
   記標識水不溶性複合体を検出する工程、を含んでなる方
   法。
2. 【請求項２】 水不溶性試薬であって、その試薬の各々
   が歯周疾患に随伴する特定の微生物の抗原少なくとも１
   種に向けた抗体を付着した水不溶性粒子から構成したも
   のであり、かつその試薬の各々が実質的にすべて表面に
   存在するような試薬を、少なくとも１つの表面の複数の
   不連続で個別の区画の各々に付着した微孔質膜を含んで
   なる水不溶性製品。
3. 【請求項３】 水不溶性試薬であって、その試薬の各々
   が歯周疾患に随伴する特定の微生物の抗原少なくとも１
   種に向けた抗体を付着した水不溶性粒子から構成したも
   のであり、かつその試薬の各々が表面上に実質的にすべ
   て存在するような試薬を、少なくとも１つの表面の不連
   続で個別の区画少なくとも３個に付着した微孔質膜を含
   む水不溶性製品からなる歯周疾患に随伴する複数の微生
   物の分別用試験キット。