JPH06317595A - 補足的な視覚シグナルイムノアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 これは分析物の検出のためのイムノアッセイ
に関する。 【構成】 本発明の方法は、同じサンプルの部分を受け
ることができる少なくとも１対の並置された第１及び第
２分析物検出領域を有する吸収性の強い膜を使用し；ア
ッセイ混合物を形成するために前記免疫試薬と前記サン
プルとを混合し；前記吸収性の強い膜に前記アッセイ混
合物を添加し；そして前記第１及び第２領域におけるシ
グナル強度を比較することによって前記サンプルにおけ
る分析物の量を決定することを含んで成る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】技術分野 本発明は分析物の検出のためのイムノアッセイに関す
る。背景 イムノアッセイは、広範囲の種類の分析物を検出するた
めに多くの異なった方法論に基づいて開発されて来た。
多くのこれらのアッセイ方法は、放射能、複雑な実験装
置及びアッセイを実施し、そして解釈するために高く訓
練された人々の使用を要する。従って、分析が複雑な装
置又は放射能の使用を伴わないで容易に行なわれ、そし
て評価され得る、分析物の検出のためのアッセイを開発
することがひじょうに所望される。

【０００２】酵素的にラベルされた免疫試薬を用いる異
種イムノアッセイは、複雑な装置又は放射能の使用を伴
わないで分析物を検出するために使用され得る。異種イ
ムノアッセイは通常、固体支持体に固定されたリガンド
又は抗体を包含する。対象の分析物及び他のアッセイ試
薬を含むサンプルは通常、固定された免疫試薬上に通さ
れ、そしてその支持体に付着する抗体−分析物複合体の
量が１つの免疫試薬に直接又は間接的に結合されたラベ
ルにより測定される。異種アッセイにおいて、必須な要
素は、固体支持体への特異的結合対の１つのメンバー結
合、及び支持体に結合されるラベルを直接的又は間接的
に検出するための手段を包含する。

【０００３】イムノアッセイの解釈の容易さは、常に重
要な考慮である。酵素ラベルにより生成される比色検出
シグナルを含む異種イムノアッセイは一般的に、サンプ
ルにおける分析物の濃度に対して直接的に又は逆比例し
て変化するシグナルを生成する。アッセイ結果の解釈
は、色の強度の変化の視覚的分析を要する。アッセイ結
果の視覚的分析は誤解を受けやすく、そして結果の半定
量分析はしばしばひじょうに、主観的であり；従って、
ひじょうに解釈しやすい視覚的シグナル産生イムノアッ
セイを創造することがひじょうに所望される。

【０００４】発明の要約 液体サンプルにおける分析物の検出のための非装置アッ
セイを行なうための方法及び装置が供給される。装置は
多くの分析物検出領域に分けられた吸収性の強い膜を含
んで成り、ここで第１組の領域は固定された分析物（又
は構造的に関連する類似体）を含み、そして他の領域は
対象の分析物に相補的な固定された特異的結合メンバー
を含む。固定された分析物（又は構造的に関連する類似
体）を含む領域は競争タイプ又は中和タイプのイムノア
ッセイを行なうために使用され、ここで分析のためにサ
ンプルに添加される分析物特異的免疫試薬は膜固定化分
析物又はサンプルにおける分析物のいづれかに結合する
ことができる。固定された相補的特異的結合対メンバー
を含む吸収性の強い膜の領域はサンドウィッチタイプの
イムノアッセイを行なうために使用され、ここでサンプ
ル中の分析物は、免疫試薬と吸収性の強い膜に固定され
た特異的結合対メンバーとの間の橋として作用する。

【０００５】本発明を用いる方法は、分析のためのサン
プルと対象の分析物に対して特異的な直接又は間接的に
ラベルされた免疫試薬を含んで成る溶液とを混合し、そ
して前記混合物及びいづれか他の試薬と前記装置とを適
切に接解せしめる段階を含んで成り、ここで装置上の複
数の視覚シグナルを同時に生成するために、少なくとも
１つのシグナルはサンプルにおける分析物の濃度に直接
比例し、そして他のシグナルはそれに反比例する。

【０００６】特定の態様の記載 固相イムノアッセイ装置が供給され、ここで１対の異な
った関連視覚シグナルが、分析のための単一のシグナル
が装置に添加される場合、同じ分析物に応答して生成さ
れる。この装置は、サンプルにおける選択された分析物
の存在を測定するためにサンドウィッチタイプ及び中和
−又は競争タイプのイムノアッセイの実質的に同時に生
じる性能を提供する。（イムノアッセイとは、抗体以外
の受容体、たとえば血液タンパク質、レクチン及び表面
膜タンパク質を包含することを意図する。）サンドウィ
ッチタイプのアッセイにおいて、ポリエピトープ分析物
のためには、対象の分析物の存在と肯定的に（直接的
に）相互関係する視覚的シグナルが生成される。競争タ
イプのアッセイにおいては、ポリエピトープ分析物のた
めには、対象の分析物の存在と否定的に（反比例して）
相互関係する視覚的シグナルが生成される。イムノアッ
セイ装置は、サンドウィッチタイプのイムノアッセイ及
び競争タイプのイムノアッセイが実施され、そして２種
のイムノアッセイの結果の比較により実質的に一致して
分析され得るように構成される。２種のタイプのイムノ
アッセイ結果の比較は、サンプルに存在する分析物の特
定のレベルに応答して生成されるシグナルの間に対比を
提供することによってデータの半定量的解釈を促進す
る。

【０００７】本発明による検出のために適切な分析物
は、１又は複数の特異的結合対のメンバーである。特異
的結合対は、安定した複合体を形成するために溶液中に
おいてお互い特異的に非共有結合することができる２種
の非同一の分子として定義され、結合親和性は通常、約
１０⁸ ／Ｍ以上である。典型的には、一般的な種類の特
異的結合対の相互作用はまた、リガンド−受容体相互作
用であり、これは抗体−ヘプテン又は抗体−抗原の相互
作用により特に例示される。大部分、リガンド（分析
物）は、非タンパク質性であり、天然に存在し又は約１
２５〜５，０００ドルトンの合成有機分子、たとえばペ
プチド、タンパク質、脂質、オリゴメクレオチド、及び
サッカリドである。本発明により検出され得る受容体
は、大部分、タンパク質、たとえば免疫グロブリン、そ
のフラグメント、特に一価のフラグメント、たとえばＦ
ａｂ，ＦＶ、等、酵素、天然に存在する受容体、たとえ
ば表面膜タンパク質、たとえばＴ−細胞受容体、ホルモ
ン受容体、レクチン、血液タンパク質、たとえばＴＢ
Ｇ、等であろう。特異的結合対の他の例は、核酸、たと
えばＤＮＡ及びＲＮＡを包含する。特異的リガンド及び
結合対の開示のためには、アメリカ特許第３，９９６，
３４９号（１０〜１７欄)(引用により本明細書に組込ま
れる）を参照のこと。

【０００８】本発明の装置は、分析物の検出のために多
くの明確な領域を含んで成る強い吸収性膜を含んで成
り；個々の分析物検出領域は、視覚シグナルが生成され
るサンドウィッチタイプ又は競争タイプのイムノアッセ
イのいづれかを実施するために使用される。検出される
べきあらゆる分析物のためには、強い吸収性膜は少なく
とも１対のサンドウィッチタイプ及び競争タイプの分析
物検出領域を含んで成る。さらに、他の領域、たとえば
分析物又は同様のものの存在に関係なく、一定量のラベ
ルに結合する一定量のラベルを有する操作上の対照が存
在する。

【０００９】異なった領域はお互い別々である。個々の
分析物検出領域は、いづれか便利な手段、たとえば官能
化されていない強い吸収性の膜領域、強くない吸収性の
分離体、非多孔性接着剤テープ、プリントされたライ
ン、等によりお互いから分離される。本発明は、同一平
面上に連結された単一の強い吸収性の膜又は複数の強い
吸収性の膜を含むことができる。複数の同一平面上に連
結された強い吸収性の膜を含んで成る本発明の装置の態
様において、その膜は同じタイプ又は異なったタイプの
ものであって良い。複数の強い吸収性膜は種々の手段に
より連結され得；複数の膜を連結するための好ましい手
段は非多孔性接着剤タイプによる。

【００１０】本発明の装置のための適切な強い吸収性膜
は、特異的結合対メンバーの特異的結合性質を保持しな
がら、特異的結合対が固定され得る多孔性層である。そ
の膜は、特異的結合対メンバーの共有固定化を付与する
ために官能化され得る。その強い吸収性膜は紙、セルロ
ース、ガラス繊維、ナイロン、ＰＶＤＦ、ニトロセルロ
ース又は同様のものから構成され得る。好ましい強い吸
収性膜材料はナイロン及びニトロセルロースである。そ
のようなフィルターの市販例は、Immobilon(Millipor
e), Memtest 膜(Memtek), Biodyne(Pall), Immunodyne
(Pall) 及びUltrabind(Gelman Sciences)を包含する。
その強い吸収性膜中の孔は通常、０．１μ〜１０．０
μ、普通約０．４５μ〜７μの範囲の平均直径を有す
る。

【００１１】本発明の競争タイプのイムノアッセイ分析
物検出領域は、本発明の装置の強い吸収性膜成分に固定
されている、分析物又はその分析物の構造的類似体であ
る特異的結合対メンバーを含んで成る。分析物の構造的
類似体とは、分析物に化学的に同一ではないが、しかし
分析物を含んで成る少なくとも１種の特異的結合対の相
互作用において分析物を置換することができる分子を意
味する。たとえば、ＨＩＶ糖タンパク質ｇｐ１２０のア
ミノ酸２０−３５から成るポリペプチドは、２０−３５
のフラグメントがモノクローナル抗体と天然のｇｐ１２
０との間の結合により競争的に妨害することができる場
合、ｇｐ１２０とｇｐ１２０特異的モノクローナル抗体
との間の結合相互作用に対してｇｐ１２０のための構造
的類似体として作用することができる。一般的に、イン
ビトロ又はインビボのいづれかで生成される交差反応性
ポリペプチドフラグメントは、ポリペプチド分析物のた
めの適切な構造的類似体である。競争タイプのイムノア
ッセイ分析物検出領域に使用するための適切な分析物又
はその構造的類似体は、モノクローナル抗体及び天然の
ｇｐ１２０に限定されない。一般的に、インビトロ又は
インビボのいづれかで生成されるポリペプチド交差反応
性フラグメントがポリペプチド分析物のための適切な構
造的類似体である。競争タイプのイムノアッセイ分析物
検出領域に使用するための適切な分析物又はその構造的
類似体は、ペプチドに限定されず、そして炭水化物、核
酸、約５０００ドルトン以下の小さな有機分子及び同様
のものを包含する。

【００１２】本発明のサンドウィッチタイプイムノアッ
セイ分析物検出領域は、本発明の強い吸収性の膜成分に
固定されている、分析物に対して特異的な相補的特異的
結合対メンバーを含んで成る。その膜に固定されている
特異的結合対メンバーは、分析物がまた、分析物に対し
て特異的な免疫試薬に結合される場合、サンプル中の分
析物に結合することができる。

【００１３】サンドウィッチタイプのアッセイ分析物検
出領域の特異的結合対メンバー成分及び競争タイプのア
ッセイ分析物検出領域の分析物（又はその類似体）は、
使用される特異的膜のために適切な一般的に利用できる
技法のいづれかにより強い吸収性の膜に固定される。膜
に固定されるべき特異的結合対メンバーは、その特異的
結合対メンバーが特異的に結合するそれらの能力を保持
するような態様で固定される。固定化技法は、当業界に
おいて広く知られており、そしてたとえば下記文献に見
出され得る：Tijssen(１９８５）によるPractice and T
heory of Enzyme Immunoassay , Elusier Science Publ
ishers, 及びHarlow and Lane(１９８８）によるAntibo
dies：A Labaratong Manual , Coldspring Harbor Labo
ratories. 好ましい固定化技法は、強い吸収性膜への特
異的結合対メンバーの共有結合を包含する。適切な固定
化技法はまた、その膜への特異的結合対メンバーの非共
有結合を包含する。

【００１４】モノ−エピトープ又はハプテン分析物に関
して、使用される方法及び試薬のいくらかの改良が、競
争アッセイと非競争アッセイとの間の逆関係を得るため
に必要とされる。たとえば、競争アッセイにおいては、
分析物のポリエピトープ類似体が調製され、たとえば複
数の分析物又はその類似体分子が一結に連結される。分
析物は、免疫試薬のためにポリエピトープ成分と競争す
る。ポリエピトープ成分は膜への免疫試薬の結合を高
め、その結果、分析物を高めることにより、シグナルを
減じる。非競争アッセイにおいては、膜に結合される受
容体は、分析物−免疫試薬複合体に特異的に結合し、そ
して分析物又は免疫試薬には単独で有意に結合しない。
Ｓ．アウレウス（S.aureus）プロテインＡ又は好ましく
は特異的抗体、たとえば免疫複合体に結合するが、しか
しその成分、抗体及びヘプテンには結合しない抗体が使
用される。分析物を高めることにより、シグナルが高ま
り、その結果、２種のアッセイ間の逆関係が提供され
る。

【００１５】個々の分析物検出領域の特異的結合対メン
バー成分は、種々の固定化パターンで強い吸収性膜に固
定され得る。固定化パターンとは、対象装置の強い吸収
性膜に固定される特異的結合対メンバーの形状及び濃度
形態の両者を意味する。必須ではないが、対象の装置の
一定の態様に基づく分析物検出領域のすべては、同じパ
ターンで固定される特異的結合対メンバーを含む。異な
った分析物を検出することができる分析物検出領域は同
じ強い吸収性フィルター上に存在する場合、個々の分析
物のために異なった特異的結合対固定化パターンを有す
ることが所望され；しかしながら同じ分析物に対して特
異的な競争タイプの分析物検出領域及びサンドウィッチ
タイプの分析物検出領域は好ましくは、同じパターンで
存在する。一般的に、特異的結合対メンバーは円形スポ
ットとして固定され；しかしながら、そのスポットの形
状は円形以外の形でも良い。

【００１６】スポットを形成する特異的結合対メンバー
は、均等な又は種々の濃度のものである。特定の対象の
装置の態様は、特異的結合対メンバーが、非線状放射状
濃度グラジェント（ここでその濃度はスポットの中心か
らの距離を増すにつれて低下する）で配置されるよう
に、その特異的結合対メンバーが環状又は円状スポット
で膜に固定される分析物検出領域を包含する。この特定
の特異的結合対メンバー固定化パターンの利点は、試験
結果の解釈の容易さを包含し；その利点は、アメリカ特
許出願第０７／４４４，８１４号（引用により本明細書
に組込まれる）に詳細に説明される。

【００１７】分析物検出領域を含む強い吸収性膜は、必
須ではないが、好ましくはイムノアッセイの性能を促進
するように企画された装置の成分（この後、イムノアッ
セイカートリッジと呼ぶ）である。そのようなカートリ
ッジは、多くのイムノアッセイで通常使用される洗浄、
測定及び分析のための複雑な機械の必要性を排除するよ
うに作用する。典型的には、そのようなイムノアッセイ
カートリッジは、アメリカ特許出願第０７／４４４，８
１４号（引用により本明細書に組込まれる）に記載され
るイムノアッセイ装置であるが、但しこれだけには限定
されない。

【００１８】その装置は、便利にはプラスチックで成形
されるホルダーを含んで成る。底部層は流体を受け入れ
るために吸着剤層であり得る。流れ制限層は、吸着剤層
により支持され得、それは膜層も支持する。ホルダー
は、サンプルが添加され得る膜のまわりにウェルを供給
する。

【００１９】他の形態、たとえばクロマトグラフィー又
は強い吸収性ストリップ、ディスク又は同様のものも使
用され得、ここでサンプルは一端で適用され得、そして
ストリップとの接触の部位から移動し、すべての領域が
同じ濃度の分析物に暴露される限り、その領域を通して
延びる。サンプル適用部位から放散するスポーク、多く
の平行なストリップ、等が供給される。

【００２０】対象の装置は、与えられたサンプルにおい
て１又は複数の分析物を検出することができる。与えら
れたサンプルにおいて検出されるべき個々の分析物に関
して、対象の装置の態様は、少なくとも１対の分析物検
出領域、サンドウィッチタイプの分析物検出領域及び競
争タイプの分析物検出領域を含む。同じ分析物の検出の
ための複数分析物検出領域対は、対象装置の与えられた
態様上に存在し、ここでそのような対は通常、個々の分
析物検出領域における特異的結合対メンバーの濃度によ
りお互いに対して異なるであろう。種々の異なった特異
的結合対メンバー濃度を分析物検出領域に供給すること
によって、対象装置の与えられた態様が、１対の分析物
検出領域により達成され得るよりも広範囲の濃度にわた
ってサンプル中に存在する分析物の量を測定することが
できる。

【００２１】本発明はさらに、本発明のイムノアッセイ
装置を用いるための方法を含んで成る。対処理を受ける
サンプルが、試薬溶液と共に混合され、続いて本発明の
装置にその混合物が適用される。サンプル溶液は、膜と
接触する流体においてその膜及び吸着剤層により吸収さ
れる。種々のラベルが使用され得、ここでラベル、たと
えばフルオレセイン、染色された微小ビーズ又は粒子、
フロイド状金属、たとえば金が直接観察され得；又は追
加の段階の後、酵素が基質及び酵素反応のいづれかの補
因子又は他の成分の添加により観察される。酵素に関し
ては、次にシグナル進行溶液が添加される。シグナル進
行溶液の添加は、分析物検出領域に色の進行の形成を開
始せしめる。分析物検出領域に形成されるシグナルが、
お互いと、及び決定されるサンプルにおける分析物濃度
と比較される。

【００２２】本発明のシステムを用い及び種々のレベル
の分析物に種々のレベルのシグナルを供給する多くの領
域を有することによって、通常、５〜２０μｇ／ml以内
の分析物の濃度の相当に正確な測定を得ることができ
る。従って、分析物が０〜５０μｇ／mlの範囲で変化す
るであろうシステムを想像することができる。個々のタ
イプのアッセイのために５個のウェルが供給され、ここ
で試薬の濃度は、次の濃度で種々のシグナルを提供する
ように選択される：＜５μｇ／mL；５〜１０μｇ／mL；
１０〜２０μｇ／mL；２０〜４０μｇ／mL及び＞４０μ
ｇ／mL．１０〜２０μｇ／mLの範囲での分析物に関して
は、競争アッセイのために、暗い；暗い；明るい；ナ
シ；ナシが予測され；非競争アッセイのためには、ナ
シ；明るい；暗い；暗い；暗いが予測される。従って、
同じ濃度レベルの並置に、ストリップを横切ってタンデ
ムに又は並行して存在するウェルと直接比較することに
よって、その濃度を容易に読み取ることができる。

【００２３】ポリエピトープ分析物のためには、ラベル
された特異的結合対メンバー又は免疫試薬は、競争及び
非競争アッセイにおいて同じである。従って、リガンド
分析物、たとえば抗原のためには、免疫試薬は便利に
は、ラベル、たとえば受容体、たとえば抗体に接合され
る酵素である。領域がリガンド又は固定された受容体を
有するかに依存して、逆の結果を得るために単一濃度で
の単一の試薬溶液を使用することができる。

【００２４】イムノアッセイに今まで適用されて来た酵
素は、本発明にも適用できる。酵素は、安定すべきであ
り、高い回転率を有し、不溶性の強い着色又は黒の生成
物を供給する基質を有し、そして活性の有意な損失を伴
わないで容易に接合されるべきである。

【００２５】標識として使用するための適切な酵素は、
アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ホー
スラディシュペルオキシダーゼ、β−グルクロニダー
ゼ、β−グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナー
ゼ及びβ−アミラーゼであるが、但しこれだけには限定
されない。

【００２６】分析物／抗−分析物に対して相補的である
特異的結合対メンバーは、いづれか便利な結合メンバー
により酵素ラベルに共有結合され得、非酵素ラベルに共
有結合され得、ここで酵素に共有結合される非酵素ラベ
ルのための受容体を含んで成る試薬が供給され、又はラ
ベルされなくても良く、ここで酵素に接合される抗−分
析物のための抗体が供給される。従って、免疫試薬は、
酵素基質の他に１又は複数の成分を有する。第２及び第
３情況において、抗−分析物は、間接的にラベルされる
ものとして言及されるであろう。

【００２７】別々の試薬を有することによって、強い吸
収性膜から非特異的に結合された抗−分析物を除去する
ためにずくの洗浄を可能にするアッセイが追加の段階に
拡張され得る。他方、試薬はアッセイ媒体に予備混合又
は混合され得る。２種の試薬を有することによって、個
々の分析物分子のために存在するか又は不在である酵素
のレベルを高め、接合性を単純化し、そして同様のこと
を実施することができる。

【００２８】酵素標識により間接的にラベルするために
適切な特異的結合対は典型的にはビオチン／アビジン
（又はビオチン／ストレプトアビジン）対である。本発
明の好ましい態様において、ビオチンは分析物特異的モ
ノクローナル抗体（抗−分析物−ビオチン）に共有結合
され、そしてストレプトアビジンはアルカリホスファタ
ーゼに共有結合される。

【００２９】本発明の装置が与えられたサンプルに存在
する１つ以上の分析物の量を測定するために適切な分析
物検出領域を含む場合、本発明の装置と共にアッセイに
おいて使用される試薬溶液は、好ましくは、測定される
べき個々の分析物に対して特異的な複数の免疫試薬を含
むであろう。種々の免疫試薬上の酵素ラベルは同じであ
っても又は異なっていても良い。複数の免疫試薬が存在
する場合、それらは直接的に又は間接的にラベルされ得
る。複数の免疫試薬の間接的なラベリングが使用される
場合、同じ酵素ラベルが通常、試薬溶液におけるすべて
の免疫試薬のために使用される。

【００３０】免疫試薬及び酵素ラベルの他に、サンプル
に添加される試薬溶液はまた、特異的結合対相互反応及
び酵素ラベルの活性を促進する塩、緩衝液及びタンパク
質を含むことができる。最終段階において、通常、強い
吸収性膜を洗浄した後、シグナル検出溶液が添加され
る。そのシグナル検出溶液は、試薬溶液において個々の
酵素ラベルに対して特異的な色素基質を含む。好ましい
色素基質は、それらの同種酵素と相互反応する前、無色
であるロイコ染料であり、そして安定し、不溶性で且つ
着色された反応生成物を生成する。

【００３１】本発明の方法に使用される試薬溶液は、分
析のためにサンプルを集め、そのサンプルと試薬溶液と
を混合し、そして本発明の装置にサンプル−試薬溶液混
合物を分散するように作用する装置に貯蔵され得る。そ
のような装置の好ましい態様は、アメリカ特許出願第０
７／４４４，８１４号に記載されるコレクタ−希釈器−
分散器である。

【００３２】本発明は、免疫試薬の濃度及び／又は体
積、及び／又は競争タイプの分析物検出領域及びサンド
ウィッチタイプの分析物検出領域に固定される特異的結
合対メンバーの単位面積当たりの量を変えることによっ
て、広範囲の濃度にわたって分析物濃度を測定すること
ができる。種々の段階のインキュベーション時間はま
た、アッセイの動的範囲に影響を及ぼすであろう。同じ
特異的結合対メンバー（但し種々の濃度で）を用いる分
析物検出領域は通常、同じ強い吸収性膜上に存在する。

【００３３】免疫試薬及び特異的結合対メンバーの好ま
しい濃度は、導入される分析物濃度範囲にわたって分析
物検出領域における視覚シグナルの形成をもたらすアッ
セイ試験結果を生成し、その結果、明確な視覚対照を得
ることができ、ここで分析物濃度は個々の検出領域の特
定の濃度範囲に落いる。免疫試薬及び固定された特異的
結合対メンバーの好ましい濃度及び体積は、通常の最適
化実験により見出され得る。

【００３４】図１及び２に示されるように、本発明のア
ッセイ装置は、ハウジング２に多くの層を有する。降順
に、主要層は、多孔性反応性フィルター３（テープ９に
より領域に分けられ、個々の領域は特異的結合対のメン
バを含み、それはアッセイにおける陽性又は陰性結果と
して環１０を形成する）、多孔性分離層４、流速制御層
５及び廃棄流体を受けるパッド６である。多孔性反応性
フィルター３は、約０．１〜１０μの範囲の孔を有する
であろう。多孔性反応性フィルター３の個々の領域８
は、分析物に対して逆に応答する異なった特異的結合メ
ンバーを提供する２つのサブ領域中に領域８を分けるた
めに、多孔性反応性フィルター３に含浸された疎水性バ
ンド、たとえばワックス、ポリエチレン又は同様のもの
により半分に分けられ得る。

【００３５】本発明の装置、その装置を用いるために必
要とされるすべての試薬及びその装置を用いるための追
加の適切な用具を含む標準化されたキットの形で本発明
の装置を供給することが所望される。キットを供給する
ことによって、本発明の装置を用いて行なわれるアッセ
イは、より急速且つ再生可能的に実施され得る。

【００３６】

【実施例】実験 マイクロアルブミン尿症試験 本発明を用いてのマイクロアルブミン尿症のための診断
試験を供給する。その試験は、尿検体におけるヒトアル
ブミンの濃度を測定する。試験装置は、ヒトアルブミン
が環状のスポットでニトロセルロースフィルター膜に固
定されている競争タイプの分析物検出領域を含んで成
る。試験装置はまた、ヒトアルブミンに対して特異的な
第１モノクローナル抗体が環状のスポットでフィルター
に固定されているサンドウィッチタイプの分析物検出領
域を含んで成る。２種の分析物検出領域を含むニトロセ
ルロースフィルターは、アメリカ特許出願第０７／４４
４，８１４号に記載されるタイプのイムノアッセイ診断
領域の成分である。分析のために調製されるサンプルが
フィルター上に直接添加されるようにカートリッジが形
成され、そしてその試験結果は、カートリッジを分解し
ないでフィルターを観察することによってモニターされ
る。

【００３７】１）マイクロアルブミン尿症ＳＴＡＴ−試
験：ＳＴＡＴカートリッジの第１ミニウェルにおいて
は、ヒトアルブミンが環状パターンを用いて膜上に被覆
され；ヒトアルブミン（Ｓｉｇｍａからの）がpH７．４
の０．２ＭのＰＢＳ中において１mg／mLの濃度で被覆さ
れる。第２ミニウェルにおいては、ヤギ抗−ヒトアルブ
ミン抗体（American Qualex)が環状パターンで膜上に被
覆され；その抗体は０．２ＭのＰＢＳ（pH７．４）中、
０．１mg／mLの濃度で被覆される。３７℃で３０分間の
乾燥の後、膜は、１％（Ｗ／Ｗ）のカゼイン（Ｓｉｇｍ
ａ）及び０．１％のＴｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ）を含
む０．１ＭのＰＢＳ（pH７．４）中に１５分間ソーク
し、そして３７℃で３０分間、乾燥することによってブ
ロックされる。

【００３８】アッセイ方法：尿サンプルをジペット（Ｄ
ｉｐｅｔｔｅ）を用い集める。ジペットのニブは、２μ
ｇの抗−ヒトアルブミンビオチン抗体接合体（ビオチン
／抗体のモル比は２５である）を乾燥形で含む。尿サン
プルが吸収された後、ジペットを破壊し、ニブは、１％
（Ｗ／Ｗ）カゼイン及び0.１％のＴｗｅｅｎ２０（Ｓｉ
ｇｍａ）を含む０．１Ｍのカーボネート−バイカーボネ
ート緩衝液（pH９．５）に１：２００で希釈されたアル
カリホスファターゼストレプトアビジン接合体（Ｔａｇ
ｏ）の溶液中に入れる。軽く攪伴しながら３０秒後、５
滴（約２５０μＬ）の尿サンプル／抗−アルブミン−ビ
オチン接合体／アルカリホスファターゼストレプトアビ
ジン接合体溶液をＳＴＡＴカートリッジに分散する。完
全に排水した後、１mLの洗浄溶液（Ｈ₂ Ｏ）をＳＴＡＴ
カートリッジに添加する。

【００３９】完全に排水した後、２５０μＬのＢＣＩＰ
／ＮＰＴ（ＫＰＬ）溶液を添加する。結果は、３分後に
読み取られる（表１）：

【表１】

【００４０】本明細書に言及されるすべての出版物及び
特許出願は、本発明が関与する当業者の熟練のレベルの
表示である。この発明の好ましい態様を詳細に示し、そ
して記載したが、これによってこの発明の範囲を限定す
るものではない。

【図面の簡単な説明】

【図１】これは斜めに配置されたアッセイ装置の透視図
である。

【図２】これは、多孔性反応性フィルターの平面図であ
る。

【符号の説明】

２…ハウジング ３…多孔性反応性フィルター ４…多孔性分離層 ５…流速制御層 ６…パッド

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 サンプルにおける分析物（該分析物は特
   異的結合対のメンバーである）の検出方法であって、同
   じサンプルの部分を受けることができる少なくとも１対
   の並置された第１及び第２分析物検出領域を有する吸収
   性の強い膜を使用し、ここで前記第１及び第２領域は第
   １及び第２試薬をそれぞれ含んで成り、そして検出可能
   なシグナル及び前記分析物に相補的な特異的結合対メン
   バーを供給することができるラベルを含んで成る免疫試
   薬を使用し、ここで前記第１及び第２領域に結合する前
   記免疫試薬の量が前記第１領域において前記サンプル存
   在する分析物の量に直接比例し、そして前記第２領域に
   おいてその量に反比例し、その結果、前記領域に生成さ
   れる視覚シグナルのシグナル強度が前記サンプルにおけ
   る前記分析物の量に依存して同じか又は異なるであろう
   し；アッセイ混合物を形成するために前記免疫試薬と前
   記サンプルとを混合し；前記吸収性の強い膜に前記アッ
   セイ混合物を添加し；そして前記第１及び第２領域にお
   けるシグナル強度を比較することによって前記サンプル
   における分析物の量を決定することを含んで成る方法。
2. 【請求項２】 前記免疫試薬が前記ラベルとして酵素を
   含んで成る請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 前記吸収性の強い膜が多くの第１及び第
   ２領域を含んで成り、ここで前記第１領域は前記分析物
   に相補的な一連の異なった濃度の特異的結合対メンバー
   を含んで成り、そして前記第２領域は前記分析物と交差
   反応性の一連の異なった濃度の特異的結合対メンバーを
   含んで成り、前記個々の領域が分析物濃度のためにほぼ
   同じ動的範囲を提供する請求項１記載の方法。
4. 【請求項４】 特異的結合対のメンバーである分析物を
   測定するための診断装置であって、ここで前記装置が、
   検出可能なシグナルを供給することができるラベルに連
   結される前記特異的結合対メンバーを含んで成る免疫試
   薬を用いる方法と一緒に使用され、ここで前記免疫試薬
   が前記サンプルと混合され、そして次に前記装置に適用
   され；同じサンプルの部分を受けることができる少なく
   とも１対の並置された第１及び第２分析物検出領域を有
   する吸収性の強い膜を含んで成り、ここで前記第１及び
   第２領域は第１及び第２試薬をそれぞれ含んで成り、こ
   こで前記第１及び第２領域に結合する前記免疫試薬の量
   が前記第１領域において前記サンプル存在する分析物の
   量に直接比例し、そして前記第２領域においてその量に
   反比例することを特徴とする装置。
5. 【請求項５】 前記第１領域が前記分析物に相補的な特
   異的結合対メンバーを含んで成り、そして前記第２領域
   が前記分析物と交着反応する特異的結合メンバーを含ん
   で成る請求項５記載の装置。
6. 【請求項６】 前記吸収性の強い膜が少なくとも３種の
   領域対を含んで成り、そしてこれらが予定された範囲で
   の分析物濃度での異なった色の強度をもたらす請求項４
   記載の装置。
7. 【請求項７】 前記吸収性の強い膜に対して流体受け入
   れ関係で流体吸収層を含んで成る請求項４記載の装置。