JPH06269285A - 酵素の安定化方法及び修飾酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】本発明は、酵素の表面をイソプレノイド構造を
含有してなる脂溶性物質で被覆修飾することを特徴とす
る酵素の安定化方法、および酵素の表面をイソプレノイ
ド構造を含有してなる脂溶性物質で被覆修飾して得られ
る、耐熱性及び耐有機溶媒性を有する修飾酵素に関す
る。 【効果】本発明の酵素の安定化方法を用いると、得られ
る修飾酵素は特に８０℃という高温、且つ有機溶媒中に
おいても充分な酵素活性がみられ安定であるため、融点
の高い基質を用いる合成反応、無溶剤系でのエステル交
換反応等において従来にない優れた効果を有しており、
極めて有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、酵素の安定化方法及び
該方法により得られる修飾酵素に関する。更に詳しく
は、バイオリアクターを用いた各種産業、即ち医薬品工
業、食品工業、農水産業分野、化粧品工業及び有機中間
原料の製造分野等に使用する酵素の安定化方法及び該方
法により得られる修飾酵素に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、有機合成技術だけでは困難であっ
た有用物質の工業的生産は、いわゆるバイオリアクター
の研究の進歩により急速に進歩をとげている。その中
で、微生物により産生される酵素はその反応の特異性、
立体選択性、温和な反応条件での収率などの面から特に
重要な役割を果たしている。現在、工業的に利用されて
いる酵素はプロテアーゼ、リパーゼをはじめとする加水
分解酵素が主であるが、これらの酵素は本来水溶性であ
るため選択的な加水分解等の反応には良いがその逆反応
である脱水縮合反応を行うためにはある程度の制限を受
けざるを得ない。また温和な反応条件においては酵素本
来の機能を発揮するが、基質が高融点のものの場合であ
るとか、更に反応効率を上げるために比較的高い温度で
の反応を必要とする場合には、酵素は蛋白質であるため
熱変性を受け、失活してしまうという問題が生じる。

【０００３】これらの問題を解決するために、Ｋｌｉｂ
ａｎｏｖらは非水系の有機溶媒中で直接酵素を反応させ
ても酵素はある程度活性を保ち、更に用いる有機溶媒を
選択することで立体選択性などの反応制御も可能なこと
を示した（Ｚａｋｅｓ，Ａ．Ｍ．Ｋｌｉｂａｎｏｖ，Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ，２２４，１２４９（１９８４））。また
非水系の溶媒を用いるために耐熱性もかなり向上したと
されている。このことによりそれまでは不可能とされて
いた有機溶媒中での酵素反応も可能となり大きな進歩を
とげた。しかしながら、その方法では酵素が大量に必要
であり、また酵素の活性が向上しているわけではなく、
しかも不均一系で反応を行うため反応温度を上げても依
然として反応にかなりの時間を要するといった問題があ
る。

【０００４】有機溶媒中での酵素反応の効率化をはかる
ためのその他の試みもいくつかなされている。例えば、
反応溶媒系を工夫する試み、即ち逆ミセルを用いて有機
溶媒中での酵素の失活を抑える方法（Ｐ．Ｌ．Ｌｕｉ
ｓ，Ａｎｇｅｗ，Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇ
ｌ．，２４，４３９（１９８５））であるとか、酵素を
ポリエチレングリコールで修飾する方法（Ｙ．Ｉｎａｄ
ａ ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．
Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１２２，８４５（１９８
４））、水で膨潤した高分子ゲル中に酵素を包括する方
法（Ｓ．Ｆｕｋｕｉ ａｎｄ Ａ．Ｔａｎａｋａ，Ｅｎ
ｚ．Ｅｎｇ．，６，１９１（１９８２））、二鎖型の界
面活性剤で酵素表面を修飾する方法（Ｏｋａｈａｔａ
ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒ
ｓ，Ｖｏｌ．２９，ＮＯ．４０，ｐｐ−５１３３（１９
８８））等がある。しかしながら、それらの方法は微量
の水の存在のために合成が阻害されるとか、反応速度が
遅いとか、調製に技術を要するなどの問題点を残してお
り、さらには、これらの方法では大幅な耐熱性および反
応効率の向上が望めなかった。

【０００５】一方、火山地帯などの高温環境に成育する
耐熱性菌から酵素を抽出精製してそれを利用しようとす
る試みも数多くなされているが、このようなスクリーニ
ング方法では多大な労力を要する上に必ずしも目的とす
る酵素が得られる保証はない。また、耐熱性酵素の構造
と耐熱性の要因を明らかにして一般化しようとする試み
も多くなされているが、個々の耐熱性酵素に於ける構造
と耐熱性の関係が明らかになりつつあるものの、まだ一
般化されるまでには至っておらず、工業的に実用化され
るにはさらなる検討が必要である。

【０００６】これらの問題点を解決する方策として、酵
素表面を界面活性剤などの両性物質、望ましくは極限環
境微生物の細胞膜構成両性物質で被覆修飾することによ
って耐熱性及び反応効率の向上が可能となった（特願平
４−２９２２７５号）。しかしながら、この方法におい
てもかなりの耐熱性の向上はみられたものの、６０℃以
上の高温においては酵素の失活がある程度みられ、また
リパーゼによるエステル交換反応において、無溶剤系で
８０℃程度あるいはそれ以上の条件では反応が進行する
程の耐熱性は得られていない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】前記のように、耐有機
溶媒性又は耐熱性において、従来よりそれぞれ個別に対
策が講じられてきてはいるものの、耐熱性および耐有機
溶媒性の両面から酵素を高度に安定化する方法はほとん
ど知られていない。したがって、本発明の目的は有機溶
媒中でしかも６０℃以上の高温においても耐熱性を示
し、酵素の失活がほとんど無く、酵素反応により有用物
質を効率良く安定生産出来るように高度に酵素を安定化
させる方法及び該方法により得られる修飾酵素を提供す
ることにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記課題
を解決するために種々検討を重ねた。即ち、本発明者ら
は酵素の熱変性には酵素表面における水分の関与が大き
いと考え、酵素の表面を高度に疎水性化した場合、酵素
自身の耐熱性、耐有機溶媒性が向上し、反応効率が同時
に大幅に向上すると考えた。さらに修飾する素材を脂溶
性物質とした場合、酵素の表面を完全に被覆できるなら
ば親水性を有した両性物質よりもはるかに耐熱性が向上
するのではないかと考えた。このような考えのもとに鋭
意研究の結果、イソプレノイド構造を含有してなる脂溶
性物質が酵素の表面を被覆修飾する能力をもち、得られ
た修飾酵素が高度に耐熱性及び耐有機溶媒性に優れ、反
応効率が同時に大幅に向上し、特にリパーゼによるエス
テル交換反応においては８０℃における無溶剤系でも酵
素が失活することなく反応が進行することを見出し、本
発明を完成させるに至った。

【０００９】即ち、本発明の要旨は、（１）酵素の表面
をイソプレノイド構造を含有してなる脂溶性物質で被覆
修飾することを特徴とする酵素の安定化方法、および
（２）酵素の表面をイソプレノイド構造を含有してなる
脂溶性物質で被覆修飾して得られる、耐熱性及び耐有機
溶媒性を有する修飾酵素に関する。

【００１０】本発明で使用されるイソプレノイド構造を
含有してなる脂溶性物質としては、特に限定されるもの
ではないが、例えば脂溶性ビタミン類、ステロール類、
カロテノイド類、ドリコール類、天然ゴム、精油等の各
種のものが挙げられる。脂溶性ビタミン類としては、特
に限定されることはなく、例えばレチノール、コレシカ
シフェロール、トコフェロール、フィチルメナジオン等
が挙げられる。また、ステロール類、カロテノイド類と
しては、特に限定されることはないが、例えば、コレス
テロール、シトステロール、ラノステロール、エルゴス
テロール、β−カロテンなどが挙げられる。また、ドリ
コール類としてはウンデカプレニルリン酸、ドリコール
リン酸、天然ゴムとしてはＴＳＲ（technical specifie
d rubber) 、純化ゴム（PPクレープ）、粉末ゴム、変性
天然ゴム、精油としてはショウノウ油、カユプテ油、ネ
ロリ油、ヒバ油、ベイ油等が挙げられる。これらの脂溶
性物質は単独でも２種以上を併用して用いてもよい。本
発明においては、なかでも脂溶性ビタミン類、ステロー
ル類が好適に用いられる。

【００１１】本発明に使用できる酵素としては、特に限
定されるものではない。例えば、ペプチダーゼ、プロテ
アーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、インベルターゼ、ホス
ファターゼ等の加水分解酵素、デヒドロゲナーゼ、ヒド
ロキシラーゼ、デオキシゲナーゼ、オキシゲナーゼ、レ
ダクターゼ等の酸化還元酵素、トランスグルコシダー
ゼ、トランスペプチダーゼ、トランスアミダーゼ、トラ
ンスグルタミナーゼ等の転移酵素、イソメラーゼ等の異
性化酵素、およびその他の脱離酵素、合成酵素等が挙げ
られる。

【００１２】酵素の表面を上記の脂溶性物質で被覆する
方法としては、例えば、まず対象となる酵素を至適ｐＨ
の緩衝液に溶解させ、０〜５℃において脂溶性物質を酵
素重量に対して０．５〜１００倍、エタノール、アセト
ン等の水溶性溶媒、またはクロロフォルム、ヘキサン等
の有機溶媒に溶解させたものを徐々に添加し、０〜５℃
で１２〜７２時間ゆっくりと撹拌する。撹拌方法として
は撹拌羽根やマグネチックスターラー等の撹拌装置を用
いればよい。析出した沈澱を遠心分離又は濾過などの方
法により分離し、緩衝液、水等で洗浄した後、凍結乾燥
あるいはスプレー乾燥することにより目的とする茶白色
粉体あるいは油状物質の修飾酵素を得ることができる。
酵素の濃度、脂溶性物質の量、濃度等は上記に限られた
わけではなく、用いる酵素、脂溶性物質の種類でそれぞ
れ収率の最適値があり、適宜、任意の量で行えばよい。

【００１３】このようにして得られる本発明の修飾酵素
は、酵素の表面がイソプレノイド構造を含有してなる脂
溶性物質で被覆修飾されており、未修飾の酵素に比べ大
幅に耐熱性及び耐有機溶媒性を有するので、高温かつ有
機溶媒中での酵素の反応効率の増大を示す。また、これ
らの修飾酵素は、ＩＲ、元素分析、紫外吸収測定等の分
析手段によって修飾酵素中の酵素量を測定することがで
きる。通常、本発明の方法で処理されたものは、得られ
た修飾酵素中に５〜３０重量％の酵素成分を含んでいる
のが好ましい。酵素成分が５重量％未満では酵素活性が
低く、複合体が不安定であり、酵素の保護効果が低くな
る。３０重量％を越えると脂質成分による保護効果が低
くなる。得られた修飾酵素は水に不溶であり、有機溶媒
（クロロフォルム、ヘキサン、四塩化炭素、テトラヒド
ロフラン、ジエチルエーテル、ジメチルフォルムアミ
ド、ジメチルスルホキシド等）には溶解する。更に、耐
熱性、耐有機溶媒性が大幅に向上しており、高融点物質
等の合成にも適用できる。ここで、本発明の修飾酵素に
おける耐熱性とは、少なくとも８０℃においても酵素の
活性が実質的に保持されている程度に熱に対して安定で
あることを意味する。また耐有機溶媒性とは、ヘキサ
ン、ピリジン、ジメチルフォルムアミド、ジメチルスル
ホキシド、テトラヒドロフラン等の各種の有機溶媒に対
して安定であることを意味する。

【００１４】

【実施例】以下、実施例および試験例により本発明をさ
らに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例等によ
りなんら限定されるものではない。

【００１５】実施例１ トコフェロールで被覆修飾された修飾リパーゼの作成 リパーゼ（天野製薬製、リパーゼＭ）５ｇを３０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．５）２００ｍｌに溶かし、５℃に
てマグネチックスターラーで撹拌した。これにＤＬ−α
−トコフェロール（ナカライテスク製）１０ｇをエタノ
ール５０ｍｌに溶かし、上記溶液に添加した。２４時間
５℃で撹拌を続けた後、遠心分離（１０００×ｇ，１５
ｍｉｎ）にて残渣を採取し、これを３０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７．５）で洗浄した後、蒸留水で洗浄し、凍結
乾燥により目的とする修飾リパーゼの粉体を得た。本粉
体は、元素分析、紫外吸収（２１４ｎｍ）、および赤外
吸収スペクトル測定の結果、粉体中に１０．６重量％の
酵素を含んでいることがわかった。

【００１６】実施例２ コレステロールで被覆修飾された修飾リパーゼの作成 リパーゼ（天野製薬製、リパーゼＭ）５ｇを３０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．５）２００ｍｌに溶かし、５℃に
てマグネチックスターラーで撹拌した。これにコレステ
ロール（和光純薬製）１０ｇをクロロフォルム５０ｍｌ
に溶かし、上記溶液に添加した。２４時間５℃で撹拌を
続けた後、遠心分離（１０００×ｇ，１５ｍｉｎ）にて
残渣を採取し、これを３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
５）で洗浄した後、蒸留水で洗浄し、凍結乾燥により目
的とする修飾リパーゼの粉体を得た。本粉体は、元素分
析、紫外吸収（２１４ｎｍ）、および赤外吸収スペクト
ル測定の結果、粉体中に９．２重量％の酵素を含んでい
ることがわかった。

【００１７】実施例３ トコフェロールで被覆修飾された修飾キモトリプシンの
作成 キモトリプシン（シグマ製）５ｇを３０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７．９）２００ｍｌに溶かし、５℃にてマグネ
チックスターラーで撹拌した。これにＤＬ−α−トコフ
ェロール（ナカライテスク製）１０ｇをエタノール５０
ｍｌに溶かし、上記溶液に添加した。２４時間５℃で撹
拌を続けた後、遠心分離（１０００×ｇ，１５ｍｉｎ）
にて残渣を採取し、これを３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．５）で洗浄した後、蒸留水で洗浄し、凍結乾燥によ
り目的とする修飾キモトリプシンの粉体を得た。本粉体
は、元素分析、紫外吸収（２１４ｎｍ）、および赤外吸
収スペクトル測定の結果、粉体中に１５．９重量％の酵
素を含んでいることがわかった。

【００１８】実施例４ トコフェロールで被覆修飾された修飾β−アミラーゼの
作成 β−アミラーゼ（ナガセバイオケミカル製）５ｇを５０
ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）２００ｍｌに溶かし、５
℃にてマグネチックスターラーで撹拌した。これにＤＬ
−α−トコフェロール（ナカライテスク製）１０ｇをエ
タノール５０ｍｌに溶かし、上記溶液に添加した。２４
時間５℃で撹拌を続けた後、遠心分離（１０００×ｇ，
１５ｍｉｎ）にて残渣を採取し、これを５０ｍＭ酢酸緩
衝液（ｐＨ６．０）で洗浄した後、蒸留水で洗浄し、凍
結乾燥により目的とする修飾β−アミラーゼの粉体を得
た。本粉体は、元素分析、紫外吸収（２１４ｎｍ）、お
よび赤外吸収スペクトル測定の結果、粉体中に１３．４
重量％の酵素を含んでいることがわかった。

【００１９】実施例５〜７ 実施例１においてＤＬ−α−トコフェロールの代わり
に、シトステロール（ナカライテスク製）、ラノステロ
ール（ナカライテスク製）、またはエルゴステロール
（ナカライテスク製）を用いる以外は同様にして修飾リ
パーゼの粉体を得た。粉体中にそれぞれ９．５、１３．
１、１４．９重量％の酵素を含んでいた。

【００２０】試験例１ 実施例１および２で得られた修飾リパーゼと、対照とし
て通常のリパーゼ（天野製薬製、リパーゼＭ）、および
実施例と同様の方法で修飾する素材を乳化剤であるＤＫ
Ｆ−９０（第一工業製薬製、ＨＬＢ９．５）を用いて得
られた修飾酵素をそれぞれ０．１ｇを３０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ７．５）２５ｍｌ中で３０〜６０℃の範囲で
３０分熱処理した後、ヘキサン２０ｍｌおよびトリオレ
イン（シグマ製）１ｇを加え、３０℃に於いて加水分解
反応を行った。反応の進行はガスクロマトグラフィーに
てオレイン酸、モノオレイン、ジオレイン、及びトリオ
レインの増減により確認し、熱処理を施していないもの
の３０℃における反応率を１００として比較した。結果
を図１に示すが、図１で明らかなように実施例１、２で
得られた修飾リパーゼは通常のリパーゼに比べ有機溶媒
中での耐熱性が各温度で大幅に向上しており、さらにＤ
ＫＦ−９０で修飾したものに比べても耐熱性が向上して
いた。

【００２１】試験例２ 実施例１および２で得られた修飾リパーゼと、対照とし
て通常のリパーゼ（天野製薬製、リパーゼＭ）および実
施例と同様の方法で修飾する素材を乳化剤であるＤＫＦ
−９０（第一工業製薬製、ＨＬＢ９．５）を用いて得ら
れた修飾酵素をそれぞれ０．１ｇをヘキサン２０ｍｌ中
で６０℃で１時間〜２４時間熱処理した後、３０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．５）２５ｍｌおよびトリオレイン
（シグマ製）１ｇを加え、３０℃に於いて加水分解反応
を行った。反応の進行はガスクロマトグラフィーにてオ
レイン酸、モノオレイン、ジオレイン、及びトリオレイ
ンの増減により確認し、熱処理を施していないものの３
０℃における反応率を１００として比較した。結果を図
２に示すが、図２で明らかなように通常のリパーゼは有
機溶媒中での熱処理による活性の低下が大きく２４時間
処理すると活性は半分以下に低下している。一方、ＤＫ
Ｆ−９０を修飾素材として用いて得られた修飾酵素は活
性の低下がある程度押さえられているが、実施例１、２
で得られた修飾リパーゼにおいては活性の低下がさらに
大幅に押さえられていた。なお、本試験において有機溶
媒をヘキサンに代えて、ジメチルフォルムアミド、ジメ
チルスルホキシド、またはピリジンを用いて同様の試験
を行ったところ、同様の結果が得られた。

【００２２】試験例３ トリオレイン０．７５ｇ（０．８５ｍｍｏｌ、シグマ
製）、ステアリン酸１．５ｇ（５．２７ｍｍｏｌ、シグ
マ製）、をヘキサン３０ｍｌに溶解し３５℃で実施例１
に示した方法により処理した修飾リパーゼ０．５ｇを添
加し、エステル交換反応の触媒活性を測定した。同様に
６０℃、８０℃に於いても上記修飾リパーゼを用いてエ
ステル交換反応を行った。なお、８０℃に於いてはヘキ
サンを加えない無溶剤系で反応を行った。対照として、
処理していない通常のリパーゼ（天野製薬製、リパーゼ
Ｍ）を用いて３５℃において同様にエステル交換反応を
行った。反応の進行は、経時的に反応液を採取し高速液
体クロマトグラフィーにより油脂組成を分析することに
よって把握した。結果を図３に示すが、図３で明らかな
ように、通常のリパーゼそのままではエステル交換能は
ほとんど無いためＳＯＳ（１，３−ジスレアロイル−２
−オレオイル−ｒａｃ−グリセロール）含有量は微量で
あるのに対して、本発明の方法で処理した修飾リパーゼ
ではヘキサン中で３５℃においても、６０℃において
も、また８０℃という高温においても、いずれの温度で
も飛躍的にエステル交換能が増大している。

【００２３】試験例４ トリオレイン０．７５ｇ（０．８５ｍｍｏｌ、シグマ
製）、ステアリン酸１．５ｇ（５．２７ｍｍｏｌ、シグ
マ製）、をヘキサン３０ｍｌに溶解し３５℃で実施例２
に示した方法により処理した修飾リパーゼ０．５ｇを添
加し、エステル交換反応の触媒活性を測定した。同様に
６０℃、８０℃に於いても上記修飾リパーゼを用いてエ
ステル交換反応を行った。なお、８０℃に於いてはヘキ
サンを加えない無溶剤系で反応を行った。対照として、
処理していない通常のリパーゼ（天野製薬製、リパーゼ
Ｍ）を用いて３５℃において同様にエステル交換反応を
行った。反応の進行は、経時的に反応液を採取し高速液
体クロマトグラフィーにより油脂組成を分析することに
よって把握した。結果を図４に示すが、図４で明らかな
ように、通常のリパーゼそのままではエステル交換能は
ほとんど無いためＳＯＳ（１，３−ジスレアロイル−２
−オレオイル−ｒａｃ−グリセロール）含有量は微量で
あるのに対して、本発明の方法で処理した修飾リパーゼ
ではヘキサン中で３５℃においても、６０℃において
も、また８０℃という高温においても、いずれの温度で
も飛躍的にエステル交換能が増大している。

【００２４】試験例５ 実施例１で示した本発明の方法で処理した修飾リパーゼ
を３０ｍｌのヘキサンに溶かし６０℃にそれぞれ１時
間、４時間、１２時間おいた後、３０℃に温度を下げ、
トリオレイン０．７５ｇ（０．８５ｍｍｏｌ、シグマ
製）、ステアリン酸１．５ｇ（５．２７ｍｍｏｌ、シグ
マ製）、を添加して、エステル交換能が残っているかど
うかを試験例３と同様の方法で確認した。結果を図５に
示すが、図５で明らかなように、本発明の方法で処理し
た修飾リパーゼはヘキサン中で、６０℃に於いても１２
時間以上ほとんど活性を維持したままであることがわか
った。なお、本試験において有機溶媒をヘキサンに代え
て、ジメチルフォルムアミド、ジメチルスルホキシド、
またはピリジンを用いて同様の試験を行ったところ、同
様の結果が得られた。

【００２５】試験例６ 実施例２で示した本発明の方法で処理した修飾リパーゼ
を３０ｍｌのヘキサンに溶かし６０℃にそれぞれ１時
間、４時間、１２時間おいた後、３０℃に温度を下げ、
トリオレイン０．７５ｇ（０．８５ｍｍｏｌ、シグマ
製）、ステアリン酸１．５ｇ（５．２７ｍｍｏｌ、シグ
マ製）、を添加して、エステル交換能が残っているかど
うかを試験例３と同様の方法で確認した。結果を図６に
示すが、図６で明らかなように、本発明の方法で処理し
た修飾リパーゼはヘキサン中で、６０℃に於いても１２
時間以上ほとんど活性を維持したままであることがわか
った。なお、本試験において有機溶媒をヘキサンに代え
て、ジメチルフォルムアミド、ジメチルスルホキシド、
またはピリジンを用いて同様の試験を行ったところ、同
様の結果が得られた。

【００２６】試験例７ 実施例３で得られた修飾キモトリプシン２０ｍｇを９０
％ヘキサン水溶液（水相として０．１５Ｍリン酸緩衝液
を用いた）に加え、Ａｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ（ナカライテス
ク製）２．１ｍｇ（１０μｍｏｌ）およびリジン塩酸塩
（ペプチド研究所製）１．８ｍｇ（１０μｍｏｌ）を添
加し３５℃および６０℃で２４時間撹拌しペプチド合成
反応を行った。生成するＡｃ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＯＨの
検出は１−ブタノール：酢酸：ピリジン：水＝４：１：
１：２（ｗ／ｗ）の展開溶媒における薄層クロマトグラ
フィー（メルク製、Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ Ｇ ｎａｃｈ
Ｓｔａｈｌ，Ｔｙｐｅ ６０）により大まかな収量を求
めた。対照として処理を行っていないキモトリプシン
（シグマ製）を用いて上記と同様のペプチド合成反応を
行った。結果を表１に示す。表１から明らかなように未
処理のキモトリプシンはいずれの温度においても９０％
ヘキサン水溶液中ではペプチド合成反応を示さないのに
対して、本発明の処理を行った修飾キモトリプシンは３
５℃においてペプチド合成反応を触媒し、しかも６０℃
においても熱変性を起こさず３５℃とほぼ同様の活性を
示した。

【００２７】

【表１】

【００２８】試験例８ ２％可溶性澱粉（ナカライテスク製）溶液３ｍｌおよび
５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）２ｍｌを加え３０℃
で撹拌する。これに１０％（重量％）β−アミラーゼ
（ナガセバイオケミカル製）／酢酸緩衝液溶液（ｐＨ
６．０）１ｍｌを添加した。１０分間撹拌後０．１Ｎ水
酸化ナトリウム溶液５ｍｌを添加し反応を停止させ、フ
ェーリング・レーマン・ショール法に従って生成還元糖
を測定し、グルコースとして算出した。３０℃における
値を活性１００％として残存活性を算出した。同様の反
応を４０℃〜８０℃において行って残存活性を測定し
た。これに対して同様の方法によりβ−アミラーゼのか
わりに、実施例４で得られた修飾β−アミラーゼを重量
で１０倍量用い、同様に各温度における残存活性を測定
した。なお、修飾β−アミラーゼにおける残存活性は、
修飾β−アミラーゼ中のタンパク質（１３．４％）を基
準に補正を行っている。

【００２９】結果を図７に示すが、通常のβ−アミラー
ゼは６０℃付近で活性が最大になるが、それ以上の温度
では急激に活性の低下が見られ８０℃においては活性は
半分程度に低下しているのに対して、本発明で得られた
修飾β−アミラーゼは３０℃における反応性は本来のア
ミラーゼの１割程度に低下するものの、図７に見られる
ように温度が上昇しても活性の低下は見られず、むしろ
分散性が向上し、見かけ上の活性の増大が見られた。即
ち、本発明の処理の行うことにより熱に対する安定性が
大きく向上していた。

【００３０】以上の試験例より明らかなように、本発明
の方法により修飾された酵素は、高温、且つ有機溶媒中
においても十分な酵素活性がみられ安定であり、本発明
の方法は酵素の安定化方法として特に８０℃という高温
において今までにない効果を示した。

【００３１】

【発明の効果】本発明の酵素の安定化方法を用いると、
得られる修飾酵素は特に８０℃という高温、且つ有機溶
媒中においても充分な酵素活性がみられ安定であるた
め、融点の高い基質を用いる合成反応、無溶剤系でのエ
ステル交換反応等において従来にない優れた効果を有し
ており、極めて有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は試験例１における酵素の残存活性と温度
との関係を示した図である。

【図２】図２は試験例２における酵素の残存活性と熱処
理時間との関係を示した図である。

【図３】図３は試験例３におけるＳＯＳ（１，３−ジス
レアロイル−２−オレオイル−ｒａｃ−グリセロール）
含有量と時間との関係を示した図である。

【図４】図４は試験例４におけるＳＯＳ（１，３−ジス
レアロイル−２−オレオイル−ｒａｃ−グリセロール）
含有量と時間との関係を示した図である。

【図５】図５は試験例５におけるＳＯＳ（１，３−ジス
レアロイル−２−オレオイル−ｒａｃ−グリセロール）
含有量と時間との関係を示した図である。

【図６】図６は試験例６におけるＳＯＳ（１，３−ジス
レアロイル−２−オレオイル−ｒａｃ−グリセロール）
含有量と時間との関係を示した図である。

【図７】図７は試験例８における酵素の残存活性と温度
との関係を示した図である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 酵素の表面をイソプレノイド構造を含有
   してなる脂溶性物質で被覆修飾することを特徴とする酵
   素の安定化方法。
2. 【請求項２】 酵素の表面をイソプレノイド構造を含有
   してなる脂溶性物質で被覆修飾して得られる、耐熱性及
   び耐有機溶媒性を有する修飾酵素。
3. 【請求項３】 修飾酵素中の酵素成分が５〜３０重量％
   である請求項２記載の修飾酵素。