JPH06253838A - ヒト・膵臓エラスターゼｉｉｉｂ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】配列表の配列番号：２に表される＋１位のVal
から＋242 位のHis までのアミノ酸配列で示されるヒト
・膵臓エラスターゼIII Ｂ。 【効果】本発明により、ヒト・膵臓エラスターゼIII Ｂ
を大量に得ることが可能になる。この遺伝子産物ヒト・
膵臓エラスターゼIII Ｂは、新規動脈硬化剤として有効
に使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒト・膵臓エラスター
ゼIII Ｂ（本発明によって明らかにされた新規ヒト・膵
臓エラスターゼをヒト・膵臓エラスターゼIII Ｂと命名
する。）、それをコードする塩基配列を含有するDNA 、
それで形質転換せしめた宿主および該宿主を用いるヒト
・膵臓エラスターゼIII Ｂの製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】エラスターゼは、セリン・プロテアーゼ
の１種であり、繊維状の不溶性蛋白質であるエラスチン
を加水分解する酵素である。エラスチンは、硬蛋白質の
１種で、高等動物の結合組織、腱、大動脈外皮、頸索を
構成しており、ペプシン、トリプシンによりわずかに分
解される。

【０００３】Balo' らは、動脈硬化症の研究途上で、血
管壁のエラスチン繊維の分解を認め、１９４９年、その
分解酵素の存在を推定した。〔 Balo' , J. and Banga,
I. : Schweiz Z. Pathol. Bacteriol., 12, 350 (194
9) 〕。つづいて、Banga は、１９５２年、エラスチン
を特異的に分解する酵素を、膵臓のなかに発見し、結晶
状に取り出し、エラスターゼと命名した。〔Banga, I.
: Acta Physiol. Acad. Sci. Hung., 3, 317 (1952)
〕。

【０００４】エラスターゼは、ヒト、猿、猫、兎等ほと
んどの動物の膵臓に存在することが確認されており、そ
の含量はヒトが3.1mg/膵臓g 、牛が2.2mg/g 、ラットが
10.2mg/g程度である。ヒトのエラスターゼ活性と、年令
との関係が認められており、男４０才以上、女６０才以
上では膵臓および血漿中のエラスターゼ活性が著しく低
下していた〔Loeven, W. A., and Maureen M. Baldwin.
: Gerontologia, 17,170 (1971) 〕。

【０００５】動脈硬化症の患者の場合、膵臓のエラスタ
ーゼの活性は、健常人のそれより著しく低下している
か、または消失していた〔 Balo' , J., and Banga,
I.: Nature, 178, 310 (1956) 〕。なお、エラスターゼ
はエラスチンを酵素的に分解するだけでなく、その生合
成をも促進することが、その後の研究で明らかとなって
きた。

【０００６】ラット、兎などを用いて、エラスターゼの
薬理作用が研究されており、以下のような効果が明らか
となった。

【０００７】１）動脈壁への脂質およびカルシウムの沈
着抑制作用 ２）動脈壁のコレステロールおよびカルシウムの除去作
用 ３）変性エラスチンに対する選択的分解作用 ４）動脈壁弾力線維の新生促進作用 ５）血清脂質低下作用 ６）リポ蛋白代謝改善作用 以上の研究をもとに行った臨床研究において、エラスタ
ーゼを経口投与した結果、以下のような効果が明らかと
なった。

【０００８】１）動脈壁の弾力性・伸展性の回復作用 ２）血清脂質異常の改善作用 ３）リポ蛋白代謝の改善作用 上記の研究には、ブタの膵臓より抽出精製したエラスタ
ーゼが用いられた。しかし、ブタエラスターゼをヒトに
投与した場合、それはヒトにとって異種タンパク質であ
るから、抗体産生が生じ、患者への再度の投与はアナフ
ィラキシーをおこす危険性がある（特開昭59−11180)。
従ってヒトに投与する場合は、ヒトエラスターゼを用い
るのが好ましい。しかし、ヒトエラスターゼを十分量入
手することは極めて困難であった。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明者らは
組換えDNA 技術を用いて、ヒトの膵臓のエラスターゼII
I Ｂ遺伝子をクローニングし、得られた組換えDNA 分子
を宿主に移入して、ヒト・膵臓エラスターゼIII Ｂ遺伝
子を発現せしめ、目的とするエラスターゼIII Ｂを得る
ことのできる技術の開発研究を行った結果、本発明を完
成するにいたった。

【００１０】現在、２種のヒト・膵臓エラスターゼの存
在は、すでに、知られているが、その特性付けは、いま
だ充分にはおこなわれておらず、そのうちの１種のアミ
ノ酸配列は、そのプロ部分の１２個および本体のわずか
４個が明らかにされている〔C. Largman et al; Biochi
m. Biophys. Acta, 623, 208 (1980) 〕のみで、その構
造は、現在までまったく不明であった。ところが、本発
明者らにより、これらのアミノ酸配列のすべておよびそ
のDNA 配列のすべてが明らかにされるに至った（特願昭
60−72308 号、同60−91986 号、同60−163964号) 。と
ころで、今回本発明により明らかとなったアミノ酸配列
は、上述の如く、わずかに明らかにされたアミノ酸配列
とは異なり、本発明がまったくの新規物質に係るもので
あることが明らかである。

【００１１】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、ヒ
ト・膵臓エラスターゼIII Ｂに関するものである。

【００１２】本発明は、配列表の配列番号：２に表され
る＋１位のVal から＋242 位のＨｉｓまでのアミノ酸配
列で示されるヒト・膵臓エラスターゼＩＩＩ Ｂに関す
る。そして、式中、(N) −末端には水素原子、Met 、あ
るいはプロ及びプレ部分として、配列表の配列番号：２
に表される−28位のMet から−１位のArg までのアミノ
酸配列の一部または全部を有していてもよい。

【００１３】特に、本発明のヒト・膵臓エラスターゼII
I Ｂは、配列表の配列番号：１の100 〜102 位のGTT か
ら823 〜825 位のCAC よりなる（ただし、826 〜828 位
のTAA は、TGA またはTAG でもありうる) 塩基配列(DNA
(II))またはそれと同効の塩基配列を含有するDNA 配列
でコードされる。

【００１４】上記DNA (II)は、その５’末端にＡＴＧ、
または配列表の配列番号：１の16〜18位のATG から97〜
99位のCGC よりなる塩基配列の一部または全部を有して
いてもよい。

【００１５】DNA (II)がＡＴＧを有するときには、配列
表の配列番号：２に表される＋１位のVal から＋242 位
のHis までのアミノ酸配列で示されるポリペプチド(II
I) に加えて、(III) のＮ末端にMet を有するポリペプ
チドをコードする。

【００１６】DNA (II)の5'末端に配列表の配列番号：１
の16〜18位のATG から97〜99位のCGC よりなる塩基配列
を有するときには、ポリペプチド(III) に加えて、(II
I) のＮ末端に配列表の配列番号：２に表される−28位
のMet から−１位のArg までのアミノ酸配列のを有する
ポリペプチドをコードする。

【００１７】式(II)で表される塩基配列またはそれと同
効の塩基配列を含有する本発明のDNA は、たとえば以下
に示す（イ）〜（ニ）のステップにより製造することが
できる。

【００１８】(イ) ヒトの膵臓より、mRNAを分離する。

【００１９】(ロ) このmRNAおよび逆転写酵素を用いてc
DNAバンクを作製する。

【００２０】(ハ) 作製したcDNAバンクから、たとえ
ば、ブタエラスターゼI cDNAをプローブに用い、目的と
するヒトエラスターゼIII ＢをコードするcDNAを含有す
るプラスミドを単離する。

【００２１】(ニ) このプラスミドから目的とするクロ
ーン化DNA を切り出す。

【００２２】膵臓のRNA 抽出にあたっては、グアニジン
・チオシアネート・ホット・フェノール法、グアニジン
・チオシアネート・塩化セシウム法なども採用しうるが
グアニジン・チオシアネート−グアニジン・塩酸法が以
下の点で、上述の２法より優れている。(1) 操作が簡単
である。(2) 抽出・回収率が高い。(3) 比較的大量の臓
器からの抽出が可能である。(4) DNA が混入してこな
い。(5)RNAの分解が少ない。

【００２３】真核細胞の細胞質に存在するmRNAの多く
は、その3'末端にポリA 配列をもつことが知られている
ので、この特徴を利用して、オリゴ(dT)セルロースのカ
ラムにmRNAを吸着せしめて、つぎに、これを溶出して精
製する。

【００２４】得られたmRNAを鋳型として、逆転写酵素を
用いて相補的二重鎖DNA を合成するが、その方法として
はS1ヌクレアーゼ法〔Efstratiadis, A. et al. : Cel
l. 7,279 (1976) 〕、Land法〔Land. H. et al. : Nucl
eic Acids Res., 9, 2251 (1981)〕、Okayama-Berg法
〔Okayama, H. and P. Berg: Mol. Cell. Biol., 2, 16
1 (1982)〕、O. Joon yoo 法〔O. Joon Yoo, et al.: P
roc. Natl. Acad. Sci.USA. 79, 1049 (1982)〕など採
用しうるが、本発明の目的には、Okayama-Berg法が好適
であった。

【００２５】つぎに、得られた組換えプラスミドを大腸
菌、たとえばRR1 株に導入して形質転換させる。テトラ
サイクリン耐性あるいはアンピシリン耐性を、指標とし
て、組換え体を選択することができる。

【００２６】得られた組換え体のなかから、エラスター
ゼIII ＢをコードするDNA を含有するクローンを選択す
るためには、³²P でラベルしたブタエラスターゼI (特
開昭60−207583) cDNAをプローブに用いるコロニーハイ
ブリダイゼーション法を用いた。

【００２７】選択されたクローンに含有される塩基配列
の決定は、ファージM13 を用いたジデオキシヌクレオチ
ド合成鎖停止の方法〔Messing, J. ら: Nucleic Acids
Res., 9, 309 (1981) 〕およびMaxam-Gilbert 法〔Maxa
m, A.M. and Gilbert, W. :Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, 74, 560 (1977)〕で実施しうるが、本発明ではジデ
オキシヌクレオチド合成鎖停止の方法を採用し、ヒト・
膵臓エラスターゼIIIＢを完全にコードするDNA を有す
るクローンを決定した。

【００２８】つぎに、得られたクローンからエラスター
ゼIII Ｂ遺伝子を切り出し、これを適当な発現ベクター
につないで、適当な宿主に導入して発現せしめることが
できる。

【００２９】プロモーターとしては、大腸菌において
は、トリプトファン(trp) プロモーター、ラクトース(l
ac) プロモーター、トリプトファン・ラクトース(tac)
プロモーター、リポプロテイン(lpp) プロモーター、バ
クテリオファージ由来のラムダ(λ) P L プロモータ
ー、ポリペプチド鎖伸長因子Tu(tufB)プロモーターなど
を使用しうる。

【００３０】宿主としては、大腸菌、枯草菌などの細
菌、酵母などの微生物のほか、動物細胞を採用しうる。
本発明においては、大腸菌（LE392、YA21など）が宿主と
しては好適である。

【００３１】本発明のDNA を大腸菌の宿主に、形質転
換、導入する方法としては、Hanahanの方法〔Hanahan,
D.: J. Mol. Biol., 166, 557 (1983) 〕、塩化カルシ
ウム法〔Dagert, M. and S. D. Ehrlich: Gene, 6, 23
(1979)〕、低pH法〔高木康敬編著：遺伝子操作マニュア
ル，ｐ．４９，講談社サイエンティフィク(1982)〕等を
使用しうる。本発明においては、Hanahan の方法が好適
であった。

【００３２】このようにして得た宿主 (組換え体) を、
公知の培地で培養し、培養物の中に、配列表の配列番
号：２に表される＋１位のVal から＋242 位のHis まで
のアミノ酸配列で示されるペプチドまたはその同効物質
を生成蓄積せしめ、これを採取することにより本発明の
目的を達することができる。

【００３３】培地としては、グルコース、カザミノ酸な
どからなる培地、例えば、M9培地〔Miller, J. : Exper
iments in Molecular Genetics, 431 〜433 (Cold Spri
ng Harbor Lab., New York (1972))〕が挙げられる。組
換え体の培養は、通常、１５〜４３℃で、３〜２４時間
行い、必要に応じて、通気や攪拌を加えることができ
る。なお、動物細胞を宿主とする場合には、３〜１０日
間の培養を必要とする。

【００３４】培養後は、組換え体細胞を、公知の方法、
例えば遠心分離等で集める。宿主として、枯草菌、酵
母、動物細胞などを用いる場合、ベクターの選択によっ
ては、生産されたエラスターゼIII Ｂは細胞外に出て、
上澄液に含まれる。

【００３５】一方、大腸菌を宿主とした場合、生産され
たエラスターゼIII Ｂは、不溶性の蛋白として、その細
胞内のinclusion bodyに含まれる場合が多い。この場合
は、菌体を破壊して遠心分離することにより、生産され
たエラスターゼIII Ｂは沈澱物として得られる。

【００３６】菌体の破壊の方法としては、超音波処理、
リゾチーム処理、凍結融解処理等を採用することができ
る。該上澄液または沈澱物からのエラスターゼの単離
は、通常知られている蛋白質の精製方法により実施しう
る。

【００３７】

【作用】本発明により製造されるヒト・膵臓エラスター
ゼIII Ｂは、ヒト膵液より抽出精製したエラスターゼと
同等の生物学的活性を示し、これと同様の目的に、同様
の用法により使用することができる。

【００３８】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に
説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものでは
ない。

【００３９】(1) ヒト膵臓よりのmRNAの分離 5.5 g のヒト膵臓 (剖検試料) をグアニジンチオシアネ
ート溶液 (4Mのグアニジンチオシアネート, 1 ％のサル
コシル, 20mMのエチレンジアミン四酢酸 (EDTA), 25 mM
のクエン酸ナトリウム (pH 7.0), 100mMの2-メルカプト
エタノール, 0.1 ％のアンチフォームA)中でポリトロン
によって破壊、変性した後、遠心して上澄みを得た。こ
れに0.025 倍量の１Ｍ酢酸および0.75倍量のエタノール
を加え、−20℃で数時間冷却した後、遠心処理によって
沈澱を得た。次にこの沈澱をグアニジンハイドロクロラ
イド溶液 (7.5Mのグアニジンハイドロクロライド・25mM
のクエン酸ナトリウム (pH7.0), 5 mMのジチオスレイト
ール (DTT)に懸濁し、0.02５倍量の1 M 酢酸および0.5
倍量のエタノールを加え、−20℃で数時間冷却した後、
遠心処理を行った。ここで得られた沈澱をグアニジンハ
イドロクロライド溶液に再懸濁し、酢酸、エタノールを
加え、−20℃に冷却した後、遠心処理で沈澱を集めた。
次に、この沈澱をエタノールで数回洗い、混在している
グアニジンハイドロクロライドを除き、蒸留水に溶かし
た後にエタノールでRNA を沈澱させた。遠心分離により
沈澱を集め、53.9mgのRNA を得た。

【００４０】こうして得たRNA を高塩溶液 (0.5MのNaC
l, 20mMのTris-HCl (pH7.5), 1mM のEDTA, 0.1 ％のド
デシル硫酸ナトリウム(SDS))中でオリゴ(dT)セルロース
カラムに吸着させた後、ポリ(A) を含むmRNAを溶出溶液
(10mMのTris-HCl (pH 7.5), 1mMのEDTA, 0.05％のSDS)
で溶出させ、255 μg のmRNAを得た。

【００４１】(2)cDNA バンクの作製 cDNAバンクの作製は、 Okayama-Berg 法に従って行っ
た。すなわち、5 μg のmRNA及び24ユニットの逆転写酵
素を20μl の反応液〔50mMのTris-HCl(pH8.3) 、8mM の
MgCl₂ 、30mMのKCl 、0.3mM のDTT 、2mM のdATP、2mM
のdGTP、2mM のdCTP、2mM のdTTP、10μCiのα−³²P dC
TP、1.4 μg のベクター・プライマーDNA(PL-Pharmacia
より購入) 〕中で、42℃, 60分反応させた。

【００４２】2 μl の0.25M EDTAと1 μl の10％ SDSを
加えた反応を止めた後、20μl のフェノールクロロフォ
ルムで除蛋白を行った。遠心した後、水層をとり、20μ
l の4 M 酢酸アンモニウムと80μl のエタノールを加
え、−70℃、15分間冷却した。次いで、遠心して沈澱を
集め75％エタノールで沈澱を洗った後、減圧乾燥した。

【００４３】沈澱を15μl のターミナルトランスフェラ
ーゼ反応液 (140mM のカコジル酸カリウム、30mMのTris
-HCl(pH 6.8)、1mM の塩化コバルト、0.5mM のDTT 、0.
2 μg のpoly A、100 mMのdCTP) に溶かした。

【００４４】37℃で 3分間反応液をあたためた後、18ユ
ニットのターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフ
ェラーゼを加え、５分間反応させた。次に、 1μl の0.
25MEDTA及び0.5 μl の10％SDS を加え反応をとめた
後、フェノール・クロロフォルムで除蛋白を行った。反
応液を遠心後、水層をとり、15μl の4 M 酢酸アンモニ
ウム、60μl のエタノールを加えよく混合した。−70℃
に15分間おいた後、遠心して沈澱を集めた。

【００４５】沈澱を10μl の制限酵素用緩衝液 (50mMの
NaCl、10mMのTris-HCl pH 7.5 、10mMのMgCl₂ 、1mM の
DTT)に溶かし、2.5 ユニットの制限酵素Hind IIIを加
え、37℃で約 1時間消化した。つぎに、フェノール・ク
ロロフォルムで除蛋白後、エタノール沈澱を行った。−
70℃で15分間冷却した後、遠心によって沈澱を集め、10
μl のTE (10mMのTris-HCl pH 7.5 、1mM のEDTA) に溶
かした。

【００４６】次に、上記試料の1 μl をオリゴdG付きリ
ンカー (PL-Pharmaciaより購入) 10ngを加えた反応液
(10mMのTris-HCl pH 7.5 、1mM のEDTA、10mMのNaCl)
に加え、65℃で５分間加熱し、次いで42℃で30分間保温
した。

【００４７】氷中で反応液を冷却した後、10μl の10倍
リガーゼ緩衝液(10mM のATP 、660mM のTris-HCl pH 7.
5 、66mMのMgCl₂ 、100mM のDTT)、78μl の蒸留水、8
ユニットのT4 DNAリガーゼを加え、12℃で一晩保温し
た。

【００４８】次に、10μl の1MのKCl 、1 ユニットのリ
ボヌクレアーゼH 、33ユニットのDNA ポリメラーゼI 、
４ユニットのT4 DNAリガーゼ、0.5 μl のヌクレオチド
溶液(20mMのdATP、20mMのdGTP、20mMのdCTP、20mMのdTT
P) 、0.1 μl の50μg/μl牛血清アルブミン(BSA) を加
え、12℃で１時間、ついで25℃で１時間保温した。

【００４９】この反応液を、５倍に希釈した後、ただち
にHanahan の方法〔Hanahan. D. :J. Mol. Biol., 166,
557 (1983)〕によって、大腸菌RR1 株を形質転換し、
ヒト膵臓cDNAバンクを作製した。

【００５０】(3) ヒト・膵臓エラスターゼIII Ｂ cDNA
を含有する組換え菌の分離 上述のヒト・膵臓cDNAバンクのうち4700株の組換え菌の
DNA を、Grunstein. M. and Hogness, D.S. の方法〔Pr
oc. Natl. Acad. Sci., USA,72, 3961 (1975)〕によっ
てニトロセルロースフィルター上に固着した。

【００５１】一方、ブタ膵臓エラスターゼI cDNA断片を
制限酵素Pst I によって切り出し、ニックトランスレー
ション法〔Rigby. P.W. et al. J. Mol. Biol., 113, 2
37(1977)〕によって³²P で標識した。このDNA 断片をプ
ローブとして、40％のホルムアミド、５倍濃度の0.15M
塩化ナトリウムおよび0.015Mクエン酸ナトリウム溶液(S
SC)、0.1 ％ BSA、0.1 ％フイコール、0.1 ％ポリビニ
ルピロリドン、0.5 ％のSDS 、10mMのリン酸ナトリウ
ム、100 μg/mlのサケ精子DNA の溶液中で、35℃にて、
フィルター上に固着させたDNA と会合させた。その後、
オートラジオグラフィーを行い、上記プローブと反応す
る10株の菌株を得た。

【００５２】これら10株のうち１株に含有されるプラス
ミドのcDNA領域の塩基配列を決定したところ、先に明ら
かにされたヒト・膵臓エラスターゼをコードするcDNAの
塩基配列（特願昭60−72308 号、同60−91986 号、同60
−163964号) とは異なる塩基配列が得られた。このcDNA
をCL1 と命名した。

【００５３】(4) CL1 のコードするアミノ酸配列とヒト
・膵臓エラスターゼIII Ｂ CL1 には、270 アミノ酸をコードしうる唯一のオープン
リーデイングフレームが存在していた。その塩基配列か
ら確定したアミノ酸配列は、トリプシン、キモトリプシ
ンとは30％程度の相同性しか示さないが、ブタ膵臓エラ
スターゼＩとは50％の高い相同性を示した。また、トリ
プシン、キモトリプシン等のセリンプロテアーゼに共通
して見出される活性中心付近のアミノ酸配列(Gly-Asp-S
er-Gly-Gly-Pro) が、同一の領域に存在していた。ま
た、セリンプロテアーゼに特徴的な電化リレーに関与す
る45番目のヒスチジン残基、95番目のアスパラギン酸残
基、189 番目のセリン残基も存在していた。

【００５４】さらに、エラスターゼにおいて基質と結合
するポケットを形成するカルボキシル末端付近のアミノ
酸配列は、CL1 がコードするそれとブタエラスターゼＩ
との間でよく似ており、基質結合ポケットに特徴的な２
１１番目のバリン残基、２２３番目のトレオニン残基
が、CL1 がコードするアミノ酸配列にも存在していた。
CL1 の塩基配列およびそれがコードするアミノ酸配列は
配列表の配列番号：１に示されている。

【００５５】CL1 によってコードされる蛋白質のアミノ
酸組成は、Largman らによって報告されているヒト膵臓
エラスターゼI のアミノ酸組成〔Largman. C. et al. B
iochemistry 15, 2491 (1976）〕と一見類似している
が、詳細な点においては明らかに異なり、また分子量も
異なっていた。

【００５６】CL1 によってコードされるヒト・プレプロ
エラスターゼIII Ｂは、Ｎ末から28番目のアルギニン残
基のＣ末端側がトリプシンにより切断され、活性型のヒ
ト・エラスターゼIII Ｂが生じる。

【００５７】CL1 によってコードされるヒト・プレプロ
エラスターゼIII Ｂと、先に見出されたCL2(特願昭60−
72308 号) にこーど されるヒト・プレプロエラスター
ゼとのアミノ酸配列の相同性は93.3％、両者のコーディ
ングフレーム内での塩基配列の相同性は95.3％、たがい
に近遠の蛋白質が、明らかに異なる。CL1 に対応するmR
NAの発現量は、ヒト膵臓においては、CL2 に対応するmR
NAの発現量の約10％である。

【００５８】CL1 は、ヒトエラスターゼIII ＢmRNAから
逆転写酵素によって合成された完全長のcDNAであるの
で、このcDNA配列を適当な発現ベクターに移すことで、
大腸菌、枯草菌、酵母、動物細胞などを宿主として、ヒ
ト・膵臓エラスターゼIII Ｂを大量生産できる。

【００５９】(5) 動物細胞を用いたヒト・膵臓エラスタ
ーゼIII Ｂの生産発現プラスミドpSV2-CL2の構築 動物細胞を宿主にしてヒトエラスターゼIII ＢcDNAを発
現させるため、図１に示す手順によってcDNAと発現用ベ
クターとを連結した。

【００６０】図１は、pSV2-CL2プラスミド構築の手順を
示す。pSV2- βグロビンはpSV2ベクターにβ−グロビン
のcDNAが挿入されているプラスミドであり、pCL2はOkay
ama-BergベクターにヒトエラスターゼIII Ｂ cDNA が挿
入されているプラスミドである。S1ヌクレアーゼ等の反
応は“モレキュラークローニング”〔Maniatis, T. et
al. (ed) Molecular cloning" Cold Spring Harbor La
b(1982) 〕に記載の方法に従った。太矢印はSV40由来の
プロモーターを示し、細矢印は転写の方向を示す。H は
HindII、B はBg1 II、P はPst I を示す。

【００６１】発現用ベクターには、SV40のプロモータ
ー、エンハンサー、ポリＡシグナル、small T antigen
遺伝子の介在配列 (イントロン) を含むpSV2プラスミド
を使用した。

【００６２】ベクターとcDNAが転写方向に関して順の向
きに連結したクローンを、各種の制限酵素の切断パター
ンにより選択し、動物細胞(COS1 細胞) へリン酸カルシ
ウム法により導入 (トランスフェクション) した。

【００６３】COS1細胞への発現プラスミドpSV2-CL2の導
入 リン酸カルシウム法によるトランスフェクションはGrah
amとVan Der Ebの方法に従った〔Virology 52, 456(197
3)〕。

【００６４】トランスフェクションに使用するCOS1細胞
は直径10cmのシャーレに１×10⁶ 細胞をまき、10％牛胎
児血清を含むダルベッコ変法イーグル培地で一晩培養し
た。次に、 300μg のpSV2-CL2プラスミドを12.55ml の
滅菌蒸留水に懸濁し、0.75mlの2.5MCaCl₂ を加えよく混
合した後に、ピペットを用いて溶液中に泡をたてなが
ら、1.5ml の10×HeBS溶液 (210mM のHEPES 、1.37M の
NaCl、4.7mM のKCl 、10.6M のNa₂HPO₄ 、55.5mMのブド
ウ糖pH 7.05)を滴下してDNA とリン酸カルシウムの沈澱
を形成させた。30分間室温で放置して沈澱を熟成させた
後、この1 mlを、予め10％牛胎児血清を含む新鮮な培地
に置換したCOS1細胞へシャーレ1 枚あたりに加え、つづ
いてこれを37℃、５％CO₂ 存在下にて12時間培養した
後、培養液を捨て、牛胎児血清を含まない新しいダルベ
ッコ変法イーグル培地にて置換し、更に37℃、５％CO₂
存在下にて、48時間培養した。なお、ここで得られた、
トランスフェクションしたCOS1細胞は、ヒトエラスター
ゼIIIAmRNAが発現していることの確認、及び培養上清中
のエラスターゼ活性の測定に供される。

【００６５】COS1細胞からのmRNA抽出 トランスフェクションしたCOS1細胞中に発現プラスミド
から転写されたヒトエラスターゼIIIAmRNAが存在してい
ることを確認するため、以下のように、COS1細胞からmR
NAを抽出してノーザンブロット ハイブリダイゼーショ
ンを行った。

【００６６】48時間培養後のCOS1細胞に、シャーレ１枚
あたり、１mlのグアニジンチオシアネート溶液 (4Mのグ
アニジンチオシアネート、１％のサルコシル、20mMのエ
チレンジアミン四酢酸、25 mM のクエン酸ナトリウム
(pH 7.0) 、 100mMの2-メルカプトエタノール、0.1 ％
のアンチフォームA)を加え、細胞を融解した。次に、こ
の溶液を、21ゲージの注射針に数回通して高分子DNA を
低分子化した後、5.7Mの塩化セシウム、0.1Mのエチレン
ジアミン四酢酸溶液の上に重層し、日立RPS40 スウイン
グローターを用いて、30000rpm、20℃、17時間遠心し
た。ここで得られたRNA 沈澱を少量のエタノールで洗
い、300 μl の蒸留水に溶解した。

【００６７】次に、分離した全RNA をAvivとLeder の方
法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA69, 1408 (1972) 〕に
従ってオリゴｄＴセルロースカラムにかけ、数μg のmR
NAを精製した。精製したmRNAの半量を使用してThomasの
方法を〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5201(1980)
〕を用いてノーザンブロットハイブリダイゼーション
をおこなった。プローブには、ニックトランスレーショ
ン法〔Rigby, P.W. etal. J. Mol. Biol. 113, 237(197
7) 〕によって³²P 標識したヒトエラスターゼIII Ｂ cD
NA を用いた。ハイブリダイゼーションの結果、pSV2-CL
1をトランスフェクションしたCOS1細胞のmRNAのみにプ
ローブとハイブリダイズする大きさ1.8kb の強いバンド
と、大きさ1.0kb の弱いバンドが検出された。pSV2-CL1
が転写された場合、ベクターに含まれるポリＡシグナル
で転写が終結すると1.8kb の大きさのmRNAが生じ、cDNA
に含まれるポリＡシグナルで転写が終結すると1.0kb の
mRNAが生じると推定される。ノーザンブロットハイブリ
ダイゼーションによって得られた結果はそれらの推定値
と一致した。したがって、COS1細胞中でpSV2-CL1はSV40
のプロモーターを使用して多量に発現し、転写された大
部分のmRNAはcDNAに含まれているポリA シグナルでは終
結せずにベクターに含まれているポリＡシグナルで終結
していることが明らかとなった。

【００６８】培地上清中のエラスターゼ活性 pSV2に組み込んだヒトエラスターゼIII Ｂ cDNA はシグ
ナルペプチド領域を保持しているので、発現されるエラ
スターゼは培地中へプロエラスターゼとして分泌される
ことが期待される。そこで、４８時間培養後の培養液中
のエラスターゼ活性を測定したエラスターゼ活性の測定
は、Bieth らの合成基質を用いた方法〔Front. Matrix.
Biol. 6, 1 (1978)〕に従った。

【００６９】１mlの培養上清に200 μl の1MのTris-HCl
(pH 8.5) と50μl の10mg/ml のトリプシンを加え、25
℃で15分間保温することによってプロエラスターゼの活
性化処理を行った後、50μl のダイズトリプシンインヒ
ビター溶液 (10mg/ml)および10.4μl のN-メチルピロリ
ドンに溶解した125mM スクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−
アラニル−Ｌ−アラニン−ｐ−ニトロアニリド (Suc-Al
a-Ala-Ala-pNA)を加えた。この反応液を37℃に１時間保
温した後、その410nm の吸光度を測定した。

【００７０】pSV2-CL1をトランスフェクションしたCOS1
細胞の培養液を用いてエラスターゼ活性を測定した結
果、トリプシンによる活性化処理をした場合にのみ、培
養液中にエラスターゼ活性が認められ、COS1細胞によっ
てヒトエラスターゼIII Ｂが生産されたことが示され
た。

【００７１】pSV2-CL1をCOS1細胞へ導入した本実施例に
おいては、ヒトエラスターゼIII Ｂの生産は短期的(tra
nsient expression)であるが、pSV2-CL1プラスミドに適
当な選択マーカー (例えばneo 遺伝子、dihydrofolate
reductase 遺伝子など) を連結してCHO 細胞等に導入す
れば長期間にわたりヒトエラスターゼIII Ｂを生産可能
な細胞株を得ることができる。

【００７２】(6) 枯草菌を用いたヒト膵臓エラスターゼ
III Ｂの生産発現ベクターの構築 発現ベクターの構築法は図２に示した。

【００７３】図２は、pHAM001 プラスミド構築の手順を
示す。pTUB218 は、枯草菌の複製開始点をもったベクタ
ーに、枯草菌のα−アミラーゼ遺伝子が挿入されたプラ
スミドである。斜線の領域は、ヒト・エラスターゼIII
ＢcDNAを示し、太矢印はα−アミラーセのプロモーター
を示す。

【００７４】すなわち、ヒトエラスターゼIII ＢのcDNA
がクローン化されているプラスミドを、制限酵素HindII
I とBg1 IIで切断し、ヒトエラスターゼIII Ｂ cDNA の
一部を含む712 塩基対のDNA 断片をアガロースゲル電気
泳動によて単離した。本DNA断片に、枯草菌α−アミラ
ーゼのシグナルペプチドの一部ならびにエラスターゼII
I Ｂのアミノ末端側の24個のアミノ酸をコードする、85
塩基対からなる、合成オリゴヌクレオチド (図３) をT4
DNA リガーゼにて結合させた後、アガロースゲル電気泳
動にて、797 塩基対のDNA 断片を分離した。

【００７５】図３は、枯草菌α−アミラーゼ遺伝子のプ
ロモーター領域、シグナルペプチド領域、および成熟ヒ
ト・エラスターゼIII Ｂ cDNA のアミノ末端側を含む85
塩基対の合成DNA を示す（配列番号：３参照）。

【００７６】一方、枯草菌のα−アミラーゼ遺伝子がク
ローニングされているプラスミドpTUB228 (K. Ohmura,
T. shiroza, K. Nakamura, A. Nakayama, K. Yamane,
K. Yoda, M. Yamasaki, and G. Tamura: J. Biochem.9
5, 87 - 93 (1984))を制限酵素HindIII で切断して、α
−アミラーゼのプロモーターおよびシグナルペプチドの
一部含む428 塩基対のDNA 断片、および複製開始点を含
む5100塩基対のDNA 断片を、それぞれ1.2 ％のアガロー
スげる電気泳動にて単離した。428 塩基対のDNA断片は
さらに制限酵素Hpa IIにて、また、5100塩基対のDNA 断
片は制限酵素BclIにて切断した後、1.2 ％のアガロース
ゲル電気泳動にてそれぞれ385 塩基対、およ4173塩基対
のDNA 断片を単離した。上記の３種のDNA 断片をT4 DNA
リガーゼにて結合させたのち、常法により枯草菌207 −
25 株(m^- ₁₆₃ hsrM recE4 amyE07 aroI906 leuA8 lys2
1; Marburg 株由来) のプロトプラスト中に取り込ま
せ、再生を行ったのち、カナマイシン10μg/ml含有培地
にて培養し、本培地上にて生育可能な形質転換株を得
た。目的の組換え体は、図３に示す93塩基対のDNA をプ
ローブに用いたコロニーハイブリダイゼーション法にて
得られた陽性のクローンよりプラスミドを分離し、その
DNA の塩基配列を調べる事により分離した。こうして取
得したクローンの一つをpHAM001 と命名した。

【００７７】生成物の確認 前述のエラスターゼIII Ｂの発現ベクター、pHEX010 を
導入した枯草菌207 −25 株は、50μg/mlのカナマイシ
ンを含むLG培地１リットル（１リットルあたり、Bacto
Tryptone (Difco) 10g, Bato Yeast Extract (difco) 5
g, NaCl 5 g,Glucose 2 g, pH7.0) にて、35℃で48時
間往復振とう培養した。

【００７８】培養終了後、培養液は４℃に冷却したの
ち、3000×g/5 分の遠心分離にて菌体を除いた後、55％
飽和となるように硫酸アンモニウムを加え、４℃で12時
間攪拌した。本操作によって生じた不溶物を8000×g/20
分の遠心操作にて沈澱させたのち、上清を除き、沈澱物
を20 ml の50mM Tris - HCl (pH 8.0)に溶解した。本溶
液を、500 mlの50mMTris - HCl (pH 8.0) に対して16時
間透析し、不溶性物質を8000g ×20分の遠心分離にて除
いた。この透析内液を粗エラスターゼIII Ｂ液として以
下の検定に用いた。

【００７９】試料のエラスターゼ活性は、下記の方法に
て測定した。すなわち、合成基質 N-carbobenzoxy - L
- alanine-p-nitrophenyl ester(Sigma)を50 mM Tris-H
Cl(pH8.0) に溶解して0.1mM 溶液とする。この基質液0.
25mlに対して、エラスターゼ試料液0.25mlを添加し、37
℃にて30分間反応させたのち、410nm の吸光度を測定し
た。同時に、試料液にエラスターゼの阻害剤であるエラ
スタチナールもしくはα-1- アンチトリプシンを終濃度
0.1mg/m1となるように加えて、その活性に対する阻害度
を測定した。プロモーター部と正しく結合したプラスミ
ドを導入した207 −25株では、その吸光度が、対照液と
比較して、0.24上昇し、エラスターゼ活性を検出しえ
た。本エラスターゼ活性は上述の２種の阻害剤によって
抑えられることも同時に確認された。

【００８０】なお、本実施例にて使用した制限酵素や他
の酵素の反応は、酵素購入時に添付されている説明書に
記載された緩衝液および反応条件に従った。

【００８１】(7) 大腸菌を用いたヒト膵臓エラスターゼ
III Ｂの生産 ヒトエラスターゼIII ＢのcDNAがクローン化されている
プラスミドCL1 を制限酵素EcoRI 及びBglII で切断し、
ヒト・エラスターゼIII ＢのcDNAを含む1640 bp のDNA
断片を分離した。これを制限酵素Fnu4HIで部分切断し、
つづいてS1ヌクレアーゼで処理して１本鎖部分を平滑末
端として788bp のDNA 断片を得た。別に、プラスミドPU
C 8 を制限酵素Sma1で切断し、ホスファターゼ処理し
て、ラクトースオペロンのプロモーター、オペレーター
領域と、β−ガラクトシダーゼの一部を含むDNA 断片を
分離した。

【００８２】上記二種類のDNA 断片をT4リガーゼを含む
30μl の溶液 (66mMのTris-HCl) pH7.6), 6.6mM のMgCl
₂, 10mM のDTT, 1mMのATP, 2.5ユニットのT4リガーゼ)
中で６℃、72時間保温し、両DNA 断片を連結させた (
[図４] ）。

【００８３】こうして、構築したヒトエラスターゼ発現
プラスミドをpHEX102 と命名した。各種大腸菌をpHEX10
2 にて形質転換して、ヒトエラスターゼを生産しうる菌
株を得た。

【００８４】この方法によって発現されるヒトエラスタ
ーゼは、下記の如く成熟ヒトエラスターゼのＮ末端に８
個のβ−ガラトシダーゼ由来のアミノ酸が結合した融合
蛋白になる。

【００８５】ヒトエラスターゼ発現プラスミドpHEX102
中のエラスターゼ遺伝子の5'末端付近のDNA 塩基配列と
アミノ酸配列を下に示す。

【００８６】

【化１】

【００８７】（配列番号：４参照）。

【００８８】以上のようにして得たエラスターゼ発現プ
ラスミドを含む菌株を、２×ＴＹ−アンピシリン培地
(1.6 ％のバクトトリプトン、1 ％のイーストエキスト
ラクト、0.5 ％のNaCl、50μg/mlのアンピシリン) に接
種し、37℃、15時間培養した。培養後、培養液を遠心し
て菌体を集め、2.4 ×10⁸ 細胞相当量の菌体を15μl の
SDS 溶液 (2 ％のSDS 、5 ％の2 - メルカプトエタノー
ル、10％のグリセリン、60mMのTris-HCl(pH6.8) 〕に懸
濁し、100 ℃３分間加熱した後、Laemmli らの方法〔 N
ature, 227 680 (1970) 〕に従ってSDS-ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動し、生産されている蛋白を解析した。

【００８９】結果はYA21株において多量にエラスターゼ
融合蛋白が生産されていた。エラスターゼ融合蛋白の生
産高はＹＡ２１株が生産している全蛋白の30％に相当し
ていた。X984株においても比較的多量のエラスターゼ融
合蛋白が生産されていたが、生産高はYA21株の半分以下
であった。その他２株の大腸菌 (HB101 株およびMC4100
株) におけるエラスターゼ融合蛋白の生産量は著しく低
かった。

【００９０】エラスターゼ融合蛋白は菌体内でinclusio
n bodyを形成しているので比較的容易に精製することが
できた。すなわち、YA21/pHEX002の培養液１リットルよ
り、inclusion bodyを形成している菌体が6.6g得られ
た。得られた菌体6.6gを、Lysozyme 0.2mg/ml およびデ
オキシコール酸１mg/ml を含む50mMのトリス-HCl緩衝液
(pH8.0) 中で処理して溶菌させた。未破壊の菌体を、低
速遠心分離(1500 ×g, 10 分間) にて除いた後、高速遠
心分離(11000 ×g, 20 分間) にてinclusion bodyを沈
澱として得た。このinclusion bodyにはまだ菌体断片が
多量に含まれているのでトライトンX-100 5 mg/ml を含
む 50mM トリスHCl 緩衝液に懸濁した後、高速遠心分離
(11000×g, 20 分間）により洗浄した。洗浄後、inclus
ion bodyは少量のトリス-HCl緩衝液中に懸濁して４℃で
保存した。

【００９１】この様にして精製することにより350mg の
inclusion body が得られ、これは約50％のエラスター
ゼIII Ｂ融合蛋白を含有している。またYA21/pHEX102で
生産されたinclusion bodyがエラスターゼ融合蛋白であ
ることは、immuno-blotting法にて確認した。

【００９２】上述のように大腸菌にて生産されたエラス
ターゼの大部分は、inclusion bodyとなり菌体の不溶性
画分に存在しているが、一部は可溶性であり、酵素活性
をも保持した状態で存在している。本酵素活性の検出は
以下のようにして行った。エラスターゼIII Ｂ発現プラ
スミドを導入した大腸菌Χ９８４株を2 ×TY- アンピシ
リン培地１リットルにて37℃で15時間振とう培養した。
培養終了後、菌体を3000 ×g/5 分の遠心分離にて集め
20mlの緩衝液Ａ(50mM Tris- HCl, 1mM EDTA, 50mM NaCl
pH 8.0)に懸濁し、リゾチームを10mg加えたのち５℃で
20分間保温した。

【００９３】その後、デオキシコール酸を最終濃度１mg
/ml となるように加えたのちポリトロンホモジエナイザ
ー処理にて菌体を破砕した。こうして得た溶菌液を8000
0 ×g/40分の遠心分離にかけ、菌体断片を除いたのち、
セファデックスG-75カラムクロマトグラフィーにかけ
た。エラスターゼ活性画分はさらに抗体アフィニティク
ロマトグラフィーにて精製した。その後、0.1mg/mlとな
るようにトリプシンを加えて25℃で５分間保温し、次い
で0.1mg/mlとなるようにダイズトリプシンインヒビター
を加えてプロエステラーゼを活性化したものを粗エラス
ターゼIII Ｂ試料液として以下の検定に用いた。

【００９４】試料のエラスターゼ活性は、下記の方法に
て測定した。すなわち、合成基質N-carbobenzoxy-L-ala
nine-p-nitrophenyl ester(Sigma) を50mM Tris-HCl(pH
8.0)に溶解して0.1mM 溶液とする。この基質液0.25mlに
対して、エラスーゼ試料液0.25mlを添加し、37℃にて30
分間反応させたのち、410nm の吸光度を測定したとこ
ろ、その吸光度が0.36上昇し、エラスターゼ活性を検出
しえた。同時に、試料液に、エラスターゼの阻害剤であ
るエラスタチナールもしくはα−１−アンチトリプシン
を、終濃度0.1mg/mlとなるように加えたところ、その活
性が、これらにより阻害されることを確認した。

【００９５】(8) 酵母を用いたヒト膵臓エラスターゼII
I Ｂの生産 酵母を宿主とする場合も大腸菌、枯草菌および動物細胞
の場合と同様に、ヒト膵臓エラスターゼIII ＢのcDNA
を、常法にて、適当なる発現ベクターに連結して、宿主
細胞に移入し、それを発現させることができ、その培養
物中にエラスターゼ活性の存在を確認することができ
た。「組換えDNA 実験指針」に記載さているS. cerevis
iae を宿主とすることができるが、具体的には同S288C
株などが好適であった。一方ベクターとしては、YEp13
などが好適であった。またプロモーターとしては、アル
コール脱水素酵素遺伝子をコードするADH1遺伝子などが
好適であった。

【００９６】

【発明の効果】本発明により、ヒト・膵臓・エラスター
ゼIII B を大量に得ることが可能になる。この遺伝子産
物ヒト・膵臓エラスターゼIII B は、新規動脈硬化剤と
して有効に使用できる。

【００９７】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ： 897 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：cDNA 起源: 生物名 ヒト 配列: ATCATCACAA AACTC ATG ATG CTC CGG CTG CTC AGT TCC CTC CTC CTT GTG 51 Met Met Leu Arg Leu Leu Ser Ser Leu Leu Leu Val -25 -20 GCC GTT GCC TCA GGC TAT GGC CCA CCT TCC TCT CGC CCT TCC AGC CGC 99 Ala Val Ala Ser Gly Tyr Gly Pro Pro Ser Ser Arg Pro Ser Ser Arg -15 -10 -5 -1 GTT GTC AAT GGT GAG GAT GCG GTC CCC TAC AGC TGG CCC TGG CAG GTT 147 Val Val Asn Gly Glu Asp Ala Val Pro Tyr Ser Trp Pro Trp Gln Val 1 5 10 15 TCC CTG CAG TAT GAG AAA AGC GGA AGC TTC TAC CAC ACC TGT GGC GGT 195 Ser Leu Gln Tyr Glu Lys Ser Gly Ser Phe Tyr His Thr Cys Gly Gly 20 25 30 AGC CTC ATC GCC CCC GAC TGG GTT GTG ACT GCC GGC CAC TGC ATC TCG 243 Ser Leu Ile Ala Pro Asp Trp Val Val Thr Ala Gly His Cys Ile Ser 35 40 45 AGC TCC CGG ACC TAC CAG GTG GTG TTG GGC GAG TAC GAC CGT GCT GTG 291 Ser Ser Arg Thr Tyr Gln Val Val Leu Gly Glu Tyr Asp Arg Ala Val 50 55 60 AAG GAG GGC CCC GAG CAG GTG ATC CCC ATC AAC TCT GGG GAC CTC TTT 339 Lys Glu Gly Pro Glu Gln Val Ile Pro Ile Asn Ser Gly Asp Leu Phe 65 70 75 80 GTG CAT CCA CTC TGG AAC CGC TCG TGT GTG GCC TGT GGC AAT GAC ATC 387 Val His Pro Leu Trp Asn Arg Ser Cys Val Ala Cys Gly Asn Asp Ile 85 90 95 GCC CTC ATC AAG CTC TCA CGC AGC GCC CAG CTG GGA GAC GCC GTC CAG 435 Ala Leu Ile Lys Leu Ser Arg Ser Ala Gln Leu Gly Asp Ala Val Gln 100 105 110 CTC GCC TCA CTC CCT CCG GCT GGT GAC ATC CTT CCC AAC GAG ACA CCC 483 Leu Ala Ser Leu Pro Pro Ala Gly Asp Ile Leu Pro Asn Glu Thr Pro 115 120 125 TGC TAC ATC ACC GGC TGG GGC CGT CTC TAT ACC AAC GGG CCA CTC CCA 531 Cys Tyr Ile Thr Gly Trp Gly Arg Leu Tyr Thr Asn Gly Pro Leu Pro 130 135 140 GAC AAG CTG CAG GAG GCC CTG CTG CCA GTG GTG GAC TAT GAA CAC TGC 579 Asp Lys Leu Gln Glu Ala Leu Leu Pro Val Val Asp Tyr Glu His Cys 145 150 155 160 TCC AGG TGG AAC TGG TGG GGT TCC TCC GTG AAG AAG ACC ATG GTG TGT 627 Ser Arg Trp Asn Trp Trp Gly Ser Ser Val Lys Lys Thr Met Val Cys 165 170 175 GCT GGA GGG GAC ATC CGC TCC GGC TGC AAT GGT GAC TCT GGA GGA CCC 675 Ala Gly Gly Asp Ile Arg Ser Gly Cys Asn Gly Asp Ser Gly Gly Pro 180 185 190 CTC AAC TGC CCC ACA GAG GAT GGT GGC TGG CAG GTC CAT GGC GTG ACC 723 Leu Asn Cys Pro Thr Glu Asp Gly Gly Trp Gln Val His Gly Val Thr 195 200 205 AGC TTT GTT TCT GCC TTT GGC TGC AAC ACC CGC AGG AAG CCC ACG GTG 771 Ser Phe Val Ser Ala Phe Gly Cys Asn Thr Arg Arg Lys Pro Thr Val 210 215 220 TTC ACT CGA GTC TCC GCC TTC ATT GAC TGG ATT GAG GAG ACC ATA GCA 819 Phe Thr Arg Val Ser Ala Phe Ile Asp Trp Ile Glu Glu Thr Ile Ala 225 230 235 240 AGC CAC TAG AAC CAA GGC CCA GCT GGC AGT GCT GAT CGA TCC CAC ATC 867 Ser His CTG AAT AAA GAA TAA AGA TCT CTC AGA AAA 897 配列番号：2 配列の長さ： 242 配列の型：アミノ酸 配列の種類：タンパク質 起源： 生物名：ヒト 配列： Met Met Leu Arg Leu Leu Ser Ser Leu Leu Leu Val -25 -20 Ala Val Ala Ser Gly Tyr Gly Pro Pro Ser Ser Arg Pro Ser Ser Arg -15 -10 -5 -1 Val Val Asn Gly Glu Asp Ala Val Pro Tyr Ser Trp Pro Trp Gln Val 1 5 10 15 Ser Leu Gln Tyr Glu Lys Ser Gly Ser Phe Tyr His Thr Cys Gly Gly 20 25 30 Ser Leu Ile Ala Pro Asp Trp Val Val Thr Ala Gly His Cys Ile Ser 35 40 45 Ser Ser Arg Thr Tyr Gln Val Val Leu Gly Glu Tyr Asp Arg Ala Val 50 55 60 Lys Glu Gly Pro Glu Gln Val Ile Pro Ile Asn Ser Gly Asp Leu Phe 65 70 75 80 Val His Pro Leu Trp Asn Arg Ser Cys Val Ala Cys Gly Asn Asp Ile 85 90 95 Ala Leu Ile Lys Leu Ser Arg Ser Ala Gln Leu Gly Asp Ala Val Gln 100 105 110 Leu Ala Ser Leu Pro Pro Ala Gly Asp Ile Leu Pro Asn Glu Thr Pro 115 120 125 Cys Tyr Ile Thr Gly Trp Gly Arg Leu Tyr Thr Asn Gly Pro Leu Pro 130 135 140 Asp Lys Leu Gln Glu Ala Leu Leu Pro Val Val Asp Tyr Glu His Cys 145 150 155 160 Ser Arg Trp Asn Trp Trp Gly Ser Ser Val Lys Lys Thr Met Val Cys 165 170 175 Ala Gly Gly Asp Ile Arg Ser Gly Cys Asn Gly Asp Ser Gly Gly Pro 180 185 190 Leu Asn Cys Pro Thr Glu Asp Gly Gly Trp Gln Val His Gly Val Thr 195 200 205 Ser Phe Val Ser Ala Phe Gly Cys Asn Thr Arg Arg Lys Pro Thr Val 210 215 220 Phe Thr Arg Val Ser Ala Phe Ile Asp Trp Ile Glu Glu Thr Ile Ala 225 230 235 240 Ser His 配列番号：３ 配列の長さ： 89 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：cDNA 配列: CG GCG GCT GCG AGT GCT GTT GTC CAT GGT GAG GAT GCT GTC CCC TAC 47 Ala Ala Ser Ala Ala Val Val His Gly Glu Asp Ala Val Pro Tyr AGC TGG CCC TGG CAG GTT TCC CTG CAG TAT GAG AAA AGT GGA 89 Ser Trp Pro Trp Glu Val Ser Leu Gln Tyr Glu Lys Ser Gly 配列番号：４ 配列の長さ： 30 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：cDNA 配列: ATG ACC ATG ATT ACG AAT TCC CGC GTT GTC 30 Met Thr Met Ile Thr Asn Ser Arg Val Val

【図面の簡単な説明】

【図１】pSV2-CL2プラスミド構築図。

【図２】pHAM001 プラスミド構築図。

【図３】枯草菌α−アミラーゼ遺伝子のプロモーター領
域、シグナルペプチド領域、および成熟ヒト・エラスタ
ーゼIII Ｂ cDNA のアミノ末端側を含む85塩基対の合成
DNA 図。

【図４】pHEX102 プラスミド構築図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/66 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/66 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 9/66 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 古川 秀比古 東京都品川区広町１丁目２番58号 三共株 式会社内 (72)発明者 大峰 寿典 東京都品川区広町１丁目２番58号 三共株 式会社内

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列表の配列番号：２に表される＋１位の
   Val から＋242 位のHisまでのアミノ酸配列で示される
   ヒト・膵臓エラスターゼIII Ｂ。
2. 【請求項２】(N) −末端が水素原子、Met 、あるいはプ
   レおよびプロ部分として配列表の配列番号：２に表され
   る−28位のMet から−１位のArg までのアミノ酸配列の
   一部または全部を有する請求項１記載のアミノ酸配列で
   示されるヒト・膵臓エラスターゼIII Ｂ。