JPH0625011A - ヒト尿性トリプシンインヒビター含有液状製剤及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明の目的は、保存時の安定性に優れたト
リプシンインヒビター含有液状製剤及びその製造方法を
提供することにある。 【構成】 本発明は、低イオン強度、かつｐＨ７以下で
あることを特徴とするヒト尿性トリプシンインヒビター
含有液状製剤である。ヒト尿性トリプシンインヒビター
含有溶液をｐＨ５〜７で６０〜１００℃に加熱後に、そ
の温度を維持しつつ、ｐＨを２〜５に下げて１〜３０分
間加熱処理することからなる前記液状製剤の製造方法。 【効果】 本発明は、トリプシンインヒビターの長期保
存時の安定性を改善すると共に特に、重合による高分子
体および分解による低分子体の生成を抑えた製剤を調製
することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はヒト尿性トリプシンイン
ヒビターの液状製剤及びその製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ヒト尿性トリプシンインヒビター（ヒト
尿由来トリプシンインヒビター、以下ＨＵＴＩ）は、Ｐ
ｒｏｋｓｃｈらによりヒト尿より初めてｉｎｔａｃｔな
形で分離・精製された（Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅ
ｄ．，７９，４９１，（１９７２））。同分子はシアル
酸及び中性ヘキソースを数十％含む、分子量約６７ｋｄ
（ゲル濾過分析）、等電点２〜３の糖タンパク質である
（Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，７９，４９１，
（１９７２）、日泌尿会誌、７４，１６２７，（１９８
３）、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，
１２，３８９，（１９８６）、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１０９，１２４
７，（１９８２））。

【０００３】このＨＵＴＩは、膵酵素のトリプシン及び
キモトリプシンを特に強く阻害するが、ＡＴ−III やＦ
ＯＹと異なり凝固・線溶系の酵素を全く或は弱くしか阻
害しない（日薬理会誌、８１，２３５，（１９８
３））。また、ライソゾーム膜の安定化効果を持つこと
からライソゾーム酵素の産生を抑制したり、心筋抑制因
子の産生抑制作用を有すると言われている（麻酔、３
３，１３７，（１９８４））。

【０００４】以上の活性・作用を有することから、急性
膵炎や急性循環不全への有用性が期待され、持田製薬
（株）により初めて製剤化され、１９８５年に商品名ミ
ラクリッドとして発売されるに到った（持田製薬
（株）、ミラクリッド添付文書（１９８５）） 本製剤は、臨床的に急性膵炎及び手術時やエンドトキシ
ンショック時に対処する重篤な副作用の見られない製剤
として使われており、近年の売上は１００億円に達して
いる。

【０００５】ところで、ＨＵＴＩを製剤化するに当た
り、液状製剤とすることが可能である。この際、添加剤
として、塩化ナトリウム、リン酸塩、リン脂質、マンニ
トール、アルブミン、ゼラチン等を用いることが従来よ
り知られている。（特開昭５５−１６０７２４号、同５
８−２２５０２６号、同６３−２６７７３０号）。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、保存
時の安定性に優れたトリプシンインヒビター含有液状製
剤を提供することにある。

【０００７】

【問題を解決するための手段】本発明者らはＨＵＴＩの
液状製剤について鋭意研究を行い、従来より公知の製剤
に比べて保存時の安定性に優れた製剤を調製できること
を見出して本発明を完成した。即ち、本発明は、低イオ
ン強度、かつｐＨ７以下であることを特徴とするヒト尿
性トリプシンインヒビター含有液状製剤である。

【０００８】また、本発明は、ヒト尿性トリプシンイン
ヒビター含有溶液をｐＨ５〜７で６０〜１００℃に加熱
後に、その温度を維持しつつ、ｐＨを２〜５に下げて１
〜３０分間加熱処理することからなる前記液状製剤の製
造方法である。 （１）ＨＵＴＩ 本発明のＨＵＴＩは、尿由来、細胞培養由来、遺伝子工
学由来のいずれにも限定されない。また、医薬品として
適用可能な程度まで精製されておればよい。

【０００９】ＨＵＴＩの精製法としては陰イオン交換体
処理、限外濾過、ゲル濾過、アフィニティクロマト、無
機吸着剤処理、塩析、等電点沈殿法、キトサン処理、不
溶性トリプシン処理等が知られている（特開昭５１−５
１５７９、同５１−１１８８１０、同５１−１２３８１
０、同５５−１６０７２４、同５６−９９４２７、同５
７−１４０７２８、同６０−２６０５１８、同６１−３
７７３６等）。

【００１０】また、金属キレート樹脂処理、疎水性担体
処理、加熱処理等を組み合わせてもよい。こうして得ら
れるＨＵＴＩは分子量６万〜７万程度（好ましくは６７
０００）、等電点は２〜３程度、比活性は２０００〜３
５００単位／ｍｇ蛋白程度である。 （２）液状製剤 本発明の液状製剤におけるＨＵＴＩの濃度は、１０００
〜５００００単位／ｍＬ程度が例示される。本発明の特
徴は低イオン強度、ｐＨ７以下である。低イオン強度と
は、具体的にはｐＨ調整等に使用される物質の濃度が
０．１Ｍ（モル／Ｌ）以下であることを意味するが、好
ましくは０．０１Ｍ以下である。ｐＨは３〜７が例示さ
れるが、好ましくは３〜６程度である。ただし、酸性蛋
白質分解酵素が共存する場合はｐＨ４〜６程度、共存し
ない場合はｐＨ３〜６程度が好都合である。該ｐＨ調整
等に使用される物質としては、リン酸塩、塩化ナトリウ
ム、グリシン−塩酸等が挙げられるが、ＨＵＴＩの調製
過程で既に上記条件が満足されているならば、特になに
も添加しなくともよい。尚、本発明において酸性蛋白質
分解酵素とは以下の性質を有するものを指す。 （ｉ）酸性（ｐＨ２〜４付近）でＨＵＴＩを分解する。 （ii）アスパラギン酸プロテアーゼの阻害剤であるペプ
スタチンまたはアミノペプチダーゼの阻害剤であるベス
タチンによって阻害される。 （iii)１００℃３分間またはｐＨ２〜４程度での６０
℃、３０分間の加温処理により不活化される。

【００１１】また、当該酵素が共存しないようなＨＵＴ
Ｉの製法としては、 当該酵素の阻害剤を固定化した担体を用いて、酵素を
吸着除去する方法。 弱酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ５〜７程度）で６０〜１０
０℃に加温後に、ｐＨを下げて（例えば、ｐＨ２〜５程
度）、１〜３０分程度加温処理することにより、酵素を
不活化する方法等を用いることができる。

【００１２】本発明の液状製剤には公知の添加剤、二糖
類（例、ショ糖、マルトース）あるいは糖アルコール
（例、マンニトール、ソルビトール）を、例えば０．０
１〜１ｍｇ／ｍＬ程度用いてもよい。ＨＵＴＩ含有溶液
に必要に応じて添加剤を添加後、通常の方法により、除
菌濾過、分注、加熱処理等の操作を施して、液状製剤と
して供与できる。本製剤は注射剤、点眼剤、点鼻剤等と
して、患者に投与することができる。

【００１３】

【実施例】本発明をより詳細に説明するために実施例お
よび参考例を挙げるが、本発明はこれらによって、なん
ら限定されるものではない。 実施例１ ＨＵＴＩ（比活性 ２５００Ｕ／ｍｇ蛋白）１０ｍｇを
精製水１ｍＬ（ミリリットル）に溶解し、ｐＨを６に調
整して、本発明の液状製剤を得た。

【００１４】実施例２ ＨＵＴＩ（比活性 ２５００Ｕ／ｍｇ蛋白）１０ｍｇを
０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６）１ｍＬに溶解し、本
発明の液状製剤を得た。 実施例３ ＨＵＴＩ（比活性 ２５００Ｕ／ｍｇ蛋白）１０ｍｇを
精製水１ｍＬに溶解し、１００℃に加温した。温度を保
ちつつ、ｐＨ３〜４に調整して３分間置き、その後に温
度を下げることにより、本発明の液状製剤を得た。

【００１５】実施例４ ＨＵＴＩ（比活性 ２５００Ｕ／ｍｇ蛋白）１０ｍｇを
０．１５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）１ｍＬに溶解した後
に、ペプスタチンを固定化したセファロース６Ｂカラム
にアプライし、その非吸着画分を回収した。さらにｐＨ
を４に調整して、本発明の液状製剤を得た。

【００１６】実施例５ ＨＵＴＩ（比活性 ２５００Ｕ／ｍｇ蛋白）１０ｍｇを
精製水１ｍＬに溶解し、６０℃に加温した。温度を保ち
つつ、ｐＨ３〜４に調整して３０分間置き、その後に温
度を下げることにより、本発明の液状製剤を得た。 実施例６ ＨＵＴＩ（比活性 ２５００Ｕ／ｍｇ蛋白）１０ｍｇを
精製水１ｍＬに溶解し、６０℃で１０時間加熱処理後
に、温度を保ちつつ、グリシン−塩酸緩衝液でｐＨ３〜
４に調整して３０分間置き、その後に温度を下げること
により、本発明の液状製剤を得た。

【００１７】実験例１ 実施例１で調製した液状製剤を用いて、ｐＨ６、イオン
強度０〜１Ｍの条件で６０℃、７日間保存し、その効果
を確認した。ＨＵＴＩの凝集による高分子体およびＨＵ
ＴＩの分解による低分子体の各々の含有率はゲル濾過法
により測定した。結果を表１に示す。

【００１８】

【表１】

【００１９】実験例２ 実施例１で調製した液状製剤を用いて、イオン強度０．
０１、ｐＨ１〜１０の条件下で６０℃１０時間保存し、
その効果を確認した。ＨＵＴＩの高分子体および低分子
体の各々の含有率はゲル濾過法により測定した。ＨＵＴ
Ｉ活性はカッセルらの方法（メソッド・イン・エンザイ
モロジー、１９巻、８４４頁、１９７０年）に準じて測
定した。結果を表２に示す。

【００２０】

【表２】

【００２１】実験例３ 実施例３で調製した液状製剤を用いて、ｐＨ５、イオン
強度０〜１Ｍの条件で６０℃、６日間保存し、その効果
を確認した。ＨＵＴＩの凝集による高分子体および低分
子体の各々の含有率はゲル濾過法により測定した。結果
を表３に示す。

【００２２】

【表３】

【００２３】実験例４ 実施例３および５で調製した液状製剤中の、酸性蛋白質
分解酵素が不活化されたかどうかを確認した。その効果
は、液状製剤をｐＨ２．５で３７℃１５分間処理して生
じたＨＵＴＩの低分子体の生成度から判断した。結果を
表４に示す。

【００２４】

【表４】

【００２５】実験例５ 実施例６で得た液状製剤をイオン強度０．０１Ｍ、ｐＨ
４〜５．５に調整した上で４０℃で２月間保存し、安定
性を確認した。また、安定化剤としてソルビトールを
０．２ｍｇ／ｍＬ添加した場合の効果も確認した。ＨＵ
ＴＩの高分子体および低分子体の含有率、ＨＵＴＩ活性
は、実験例１または２に準じて測定した。結果を表５に
示す。

【００２６】

【表５】

【００２７】参考例 人尿を特開昭６２−９３２３８の方法に準じて調製した
ものを本実施例に使用されるＨＵＴＩの出発原料とし
た。出発原料４２０ｍＬをｐＨ６．４に調整後、０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．４）で平衡化したＱＡＥ−ア
ガロースゲル（商品名Ｑ−セファロース ファストフロ
ー、ファルマシア社）にアプライした。その後、０．５
Ｍ塩化ナトリウム加０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．
４）で溶出しＨＵＴＩ含有画分を回収した。

【００２８】溶出画分８００ｍＬをｐＨ８に調整後、
０．５Ｍ塩化ナトリウム加０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
８）で平衡化したＣｕ²⁺キレートアガロースゲル（商品
名キレートセファロース ファスト フロー、 ファル
マシア社）にアプライし、非吸着画分を回収した。非吸
着画分２６０ｍＬに酢酸緩衝液（ｐＨ５）を加えて、最
終５０ｍＭに調整し、６０℃、１０時間加熱処理した。
さらに２Ｍ硫酸アンモニウムを添加して濃度０．８Ｍに
調整後、０．８Ｍ硫酸アンモニウムで平衡化したフェニ
ル−アガロースゲル（商品名フェニル セファロース４
Ｂ、ファルマシア社）にアプライし、非吸着画分を回収
した。

【００２９】非吸着画分６１０ｍＬにＥＤＴＡを１ｍＭ
となるように添加後に限外濾過膜（商品名ＵＦメンブラ
ン、フィルトロン社、分子量１万以下の画分をカット）
で処理し、濃縮画分を回収した。濃縮画分２８ｍＬを
０．１５Ｍ塩化ナトリウム加５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ
６．２）で平衡化したポリアクリルアミドゲル（商品名
セファクリルＳ−２００ＨＰ、ファルマシア社）にアプ
ライし、同緩衝液で溶出しＨＵＴＩ画分を回収した。最
後に精製水で透析した。

【００３０】

【発明の効果】本発明によれば、ＨＵＴＩの長期保存時
の安定性が改善される。特に、重合による高分子体およ
び分解による低分子体の生成を抑えた製剤を調製するこ
とができる。

フロントページの続き (72)発明者 広瀬 正明 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 真崎 厚司 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 低イオン強度、かつｐＨ７以下であるこ
   とを特徴とするヒト尿性トリプシンインヒビター含有液
   状製剤。
2. 【請求項２】 ヒト尿性トリプシンインヒビター含有溶
   液をｐＨ５〜７で６０〜１００℃に加熱後に、その温度
   を維持しつつ、ｐＨを２〜５に下げて１〜３０分間加熱
   処理することからなる請求項１記載の液状製剤の製造方
   法。