JPH06225760A - Ｈｉｖ−グループのレトロウイルスおよびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 Enropean Collection of Animal Cell Cultu
res（ECACC）にNo. V 920 92 318の下に寄託された、Ｍ
ＶＰ−５１８０／９１の呼称を有する新しい免疫不全ウ
イルスと、免疫不全症と結びついているレトロウイルス
に対する抗体の検出に適用できる前記ウイルスから得ら
れる特徴的な抗原、および該ウイルスのＤＮＡ配列およ
びアミノ酸配列。 【効果】 このウイルスは、ＨＩＶ群由来レトロウイル
スの検出のために有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、ＨＩＶ群由来の新規レトロウイ
ルスおよびそのウイルスの本質的性質を有する変異株ま
たはそれらの部分に関する。そのレトロウイルスの培養
方法も説明される。さらに本発明は、このレトロウイル
スの取得のほか、そのウイルス、その部分または抽出物
の、医学目的、診断のための、また接種素調製の際にお
ける使用にも関する。いわゆるＨＩＶ群に属すレトロウ
イルスはそれに感染した人間に免疫不全またはエイズ
（先天性免疫不全症候群）という集合概念で総括される
症状を招く。

【０００２】疫学的研究により、ヒト免疫不全ウイルス
（ＨＩＶ）がエイズ（先天性免疫不全症候群）症例の圧
倒的多数の病因であることが実証されている。１９８３
年にある患者から単離され特性評価されたレトロウイル
スにＨＩＶ−１という名称が与えられた（Barre-Sinous
si, F. et al., Science 220, 868-871〔1983〕）。Ｈ
ＩＶ−１の一変異株がＷＯ ８６／０２３８３に記載さ
れている。第２のヒト免疫不全ウイルス群は１９８５年
に西アフリカで同定され（Clavel, F. et al., Science
233, 343-346〔1986〕）、そしてヒト免疫不全ウイル
ス・タイプ２（ＨＩＶ−２）と名付けられている（ＥＰ
−Ａ−０ ２３９ ４２５）。ＨＩＶ−２レトロウイルス
は、明らかにＨＩＶ−１とは区別されるが、なおもサル
免疫不全ウイルス（ＳＩＶ−２）と近縁関係をも示す。
ＨＩＶ−１と同様、ＨＩＶ−２もエイズ症状を生じる。
免疫不全レトロウイルスのもう一つの変異株がＥＰ−Ａ
−０ ３４５ ３７５に記載されており、そこではＨＩＶ
−３レトロウイルスと名付けられている（ＡＮＴ ７
０）。

【０００３】Lancet Vol. 340, Sept. 1992, pp. 681-6
82には免疫不全ウイルスのもう一つの変異株の単離が記
載されている。高い変異性を示すことがヒト免疫不全ウ
イルスの一特徴であり、これが様々な単離物の比較の可
能性を明らかにめんどうにしている。様々なＨＩＶ−１
−単離物を比較すると、他のゲノム領域は比較的保存さ
れたままであるのに、いくつかのゲノム領域では高い変
異性が認められる（Benn, S. et al. Science 230, 949
-951〔1985〕）。本質的により大きい多形態性はＨＩＶ
−２についても観察することができた（Clavel, F. et
al., Nature 324, 691-695〔1986〕）。構造的および酵
素的に不可欠なタンパク質をコードしているgagおよびp
ol遺伝子は大きな遺伝安定性を有し；env遺伝子および
調節タンパク質をコードする遺伝子（vif、vpr、tat、r
ev、nef）は高い変異度を示す。さらにＨＩＶ−１に対
する抗血清がほんのわずかな配列相同性しかなくても、
ＨＩＶ−２のgagおよびpol遺伝子産生物とも交叉反応す
ることも示すことができた。同様に、あまり厳しくない
条件を用いなければ両ウイルス間のハイブリダイゼーシ
ョンはほとんど有意でなかった（Clavel, F. et al., N
ature 324, 691-695〔1986〕）。

【０００４】ＨＩＶ群由来レトロウイルスが広く伝播し
ていることから、そして感染時点と、病理学的変化の明
らかな徴候が認められるまでの時点との間に数年乃至多
年（２〜２０年）の間隔があることから、ＨＩＶ群レト
ロウイルスをできるだけ早くそしてとりわけ確実に測定
することは疫学的に極めて重要なことである。これは免
疫不全の徴候を示す患者の診断の際だけでなく供血者の
検査においても役割を果す。ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−
２タイプのレトロウイルスまたはそれらの構成部分をヒ
ト血清の検出系に用いた場合、それら血清が由来する患
者に免疫不全の徴候が現われているのに、抗体を全く検
出できないかあるいは弱い検出しかなされないことがわ
かっている。本発明によるＨＩＶ群由来レトロウイルス
を用いれば一定の場合にそのような検出が可能である。

【０００５】１９９１年に免疫不全の徴候を示した３４
才のカメルーンの女性患者の末梢リンパ球から単離され
た、以下ＭＶＰ−５１８０／９１と称する新規ヒト免疫
不全ウイルスの単離および特性評価を記述する。地理的
には、このレトロウイルスは、ＨＩＶ−２およびＨＩＶ
−１ウイルス感染の伝播を特色とする西アフリカと、ほ
ぼもっぱらにＨＩＶ−１が伝播している東中央アフリカ
との間に位置するアフリカの地域に由来している。さら
に本発明の対象は、ＭＶＰ−５１８０／９１と称される
ＨＩＶ群の新規レトロウイルスおよびその変異株のほ
か、それより導かれるＤＮＳ配列およびアミノ酸配列ま
たは部分配列、およびこれらを含むテストキットであ
る。レトロウイルスＭＶＰ−５１８０／９１はブダペス
ト条約の条件に従ってEuropean Collection of Animal
Cell Cultures（ECACC）にＶ９２０９２ ３１８の番号
の下に寄託された。

【０００６】ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２と同様に、本
発明によるＭＶＰ−５１８０／９１は次の細胞系統、Ｈ
ＵＴ７８、Jurkat−細胞、Ｃ８１６６−細胞およびＭＴ
−２−細胞で増殖する。ウイルスの単離および増殖は
“Viral Quantitation in HIVInfection（ＨＩＶ感染に
おけるウイルス定量）、Jean-Marie Andrien編、JohnLi
bbey Eurotext発行、1991年"、という本に詳述されてい
る。そこに記述されている操作方法を引用により本出願
の開示の一部とする。さらに、本発明ウイルスはマグネ
シウム依存性ではあるがマンガン依存性ではない逆転写
酵素を有する。このことは、ウイルスＨＩＶ−１および
ＨＩＶ−２とのもう一つの一致点である。

【０００７】本発明によるＭＶＰ−５１８０／９１ウイ
ルスとレトロウイルスＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の相
違をよく理解してもらうために、免疫不全の原因となる
レトロウイルスの構築をまず簡単に説明する。ウイルス
の内部には、ｐ２４（ｐはprotein（タンパク質）のｐ
である）の呼称を有するサブユニットより組成された円
錐状コアにＲＮＡが存在する。この内部コアは、タンパ
ク質ｐ１７で構築されたタンパク質外被（外部コア）で
囲まれ、そして宿主細胞に由来する脂質のほかにトラン
スメンブレン（transmembrane）タンパク質gp４１およ
び外被タンパク質１２０（gp１２０）を含む糖タンパク
質外被により囲まれている。このgp１２０は次いで宿主
細胞のＣＤ−４−レセプターと結合することができる。

【０００８】知られている限り、ＨＩＶ−ウイルスのＲ
ＮＡは（簡略化して記述した場合）次の遺伝子領域を示
す：両末端にいわゆるロングターミナルリピート、およ
び次の遺伝子領域、すなわちgag、pol、envおよびnef。
gag遺伝子はとりわけ中核（コア）−タンパク質である
ｐ24およびｐ17をコードし、pol遺伝子はとりわけ逆転
写酵素、ＲＮエース（リボヌクレアーゼ）Ｈおよびイン
テグラーゼをコードし、そしてenvはウイルス外被の糖
タンパク質であるgp４１およびgp１２０をコードする。
nef遺伝子は調整機能を有するタンパク質をコードす
る。ＨＩＶ型のレトロウイルスのゲノム配置の概略図を
図１に示す。

【０００９】レトロウイルスＨＩＶ−１とＨＩＶ−２と
の間の区別は、ウイルス抗原がAbbott社のテストキット
（ＨＩＶＡＧ−１ Monoclonal）として商業的に入手さ
れるモノクローナル抗体を用いてテストしそして（ＨＩ
Ｖ−１）ｐ２４に指向させることにより可能になる。ウ
イルス型ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２における逆転写酵
素含量が略等しいことは知られている。そこで可溶化さ
れたウイルスの希釈液について抗原抗体反応によって得
られる吸光度（Ｅ４９０nm）を逆転写酵素の活性に対し
てプロットすると大体図２に相当するグラフが得られ
る。ここでわかることは、ＨＩＶ−１における逆転写酵
素含量に比例して使用モノクローナル抗体にはｐ２４に
対する極めて高い結合親和性が存在することである。そ
れに対し、ＨＩＶ−２については、モノクローナル抗体
をこの場合も逆転写酵素含量に関係させて用いた場合極
めてわずかな対ｐ２４結合親和性しか認められない。こ
の測定をＭＶＰ−５１８０／９１について行うとかなり
正確にＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の曲線の中間にく
る、すなわちモノクローナル抗体の結合親和性はＨＩＶ
−１よりも低下している。図２はこれらの事実を図示し
たものであり、ここでＲＴは逆転写酵素を意味し、そし
て抗原（Ag）としては、Abbott社より購入されるテスト
キットに存在するモノクローナル抗体がそれに対して指
向するタンパク質ｐ２４が用いられる。

【００１０】多面的に利用可能な遺伝子工学系はいわゆ
るＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）であり、その場合、
この方法の実施に必要な成分は購入することができる。
この方法を用いれば、増幅すべき配列のＤＮＡ領域が知
られていればＤＮＡ配列を増幅することができる。その
際、増幅すべき核酸配列の短い領域に付着する短い相補
ＤＮＡ断片（オリゴヌクレオチド＝プライマー）を合成
する必要がある。テストの実施には、そのほかにポリメ
ラーゼとヌクレオチドトリホスフェートを含有する反応
混合物中でＨＩＶ−核酸をそのプライマーと混合する。
重合（ＤＮＡ合成）を一定の時間行った後、核酸鎖を加
温により分離させる。冷却後、重合を改めて開示させ
る。従って本発明によるレトロウイルスにおいてＨＩＶ
−１またはＨＩＶ−２ウイルスが問題とされる場合に
は、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２ウイルスの既知配列内
で保存されたプライマーを用いて核酸を増幅し得たはず
であろう。そのようなプライマーは一部報告されている
（pol３およびpol４についてはLaure, F. et al., Lanc
et ii,（1988）538-541、またはｓｋ３８／３９、ｓｋ
６８／６９についてはOu C.Y. et al., Science 239（1
988）295-297）。

【００１１】今般次の配列を示す一定のプライマー対、
すなわち

【化１】

【００１２】またはpol３およびpol４と ＵＮＩ−１：ＧＴＧＣＴ ＴＣＣＡＣ ＡＧＧＧＡ Ｔ
ＧＧＡＡ ＵＮＩ−２：ＡＴＣＡＴ ＣＣＡＴＧ ＴＡＴＴＧ Ａ
ＴＡ （Donehower L.A. et al.（1990）J. Virol. Methods 2
8, 33-46） との組合せを用い、そしてネステッド・プライマー（ne
sted primer）を用いたＰＣＲを行うとＭＶＰ−５１８
０／９１−ＤＮＡの弱い増幅物が得られることがわかっ
た。

【００１３】次のプライマー配列

【化２】 を用いると、増幅物は全く得られなかったが、ＨＩＶ−
１に比べ弱い増幅物しか得られなかったが、これは場合
によっては汚染によるかもしれない。

【００１４】 gag c：TATCA CCTAG AACTT TAAAT GCATG GG gag d：AGTCC CTGAC ATGCT GTCAT CA env a：GTGGA GGGGA ATTTT TCTAC TG env d：CCTGC TGCTC CCAAG AACCC AAGG を用いるとＨＩＶ−１に比べ弱いが使用ＨＩＶ−２単離
物（ＭＶＰ−１１９７１／８７）と同じ強さを示す増幅
物が得られた。

【００１５】広く普及しているＨＩＶ−抗体の検出方法
は、いわゆるウエスターンブロット（免疫ブロット）で
ある。その場合、ウイルスタンパク質はゲル電気泳動的
に分離された後、膜に移される。その移されたタンパク
質を有する膜は次に検査すべき患者の血清を結合させ
る。ウイルスタンパク質に対する抗体が存在すれば、こ
れはそのタンパク質に結合する。洗浄後はウイルスタン
パク質に対する特異的抗体のみが残る。その抗体は次
に、呈色反応を触媒する酵素と規則的にカップリングさ
れた抗抗体により視認可能にできる。この方法により、
ウイルスタンパク質のバンドを可視化することとができ
る。

【００１６】本発明によるウイルスＭＶＰ−５１８０／
９１はウイルスＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２に対し、ウ
ェスターンブロットにおいて二つの著しい本質的相違点
を示す。ＨＩＶ−１は、タンパク質ｐ２４に対応する強
いバンドと、ｐ２３に対応する極めて弱い、しばしばほ
とんど視認できないバンドを規則的に示す。ＨＩＶ−２
はタンパク質ｐ２５に対応する強力なバンドを、そして
多くの場合にｐ２３に対応する弱いバンドを示す。これ
とは対照的に、本発明によるＭＶＰ−５１８０／９１ウ
イルスはタンパク質ｐ２４およびｐ２５に相当するほぼ
同じ強さの二本のバンドを示す。

【００１７】もう一つの著しい相違点は逆転写酵素に対
応するバンドに存在する。ＨＩＶ−１は逆転写酵素に相
当する一本のバンド（ｐ５３）とＲＮエースＨと結合し
た逆転写酵素に相当する一本のバンド（ｐ６６）を示
す。ＨＩＶ−２ではその逆転写酵素はタンパク質ｐ５５
に相当し、またそれがＲＮエースＨと結合している場合
はタンパク質ｐ６８に相当する。それに対し本発明によ
るＭＶＰ−５１８０／９１は、タンパク質ｐ４８のとこ
ろに逆転写酵素に相当する一本のバンド、およびタンパ
ク質ｐ６０のところにＲＮエースＨと結合した逆転写酵
素に相当する一本のバンドを示す。これらの結果から、
ＭＶＰ−５１８０／９１の逆転写酵素はＨＩＶ−１また
はＨＩＶ−２の逆転写酵素よりも約３〜約７キロダルト
ン小さい分子量を有すると結論することができる。ＭＶ
Ｐ−５１８０の逆転写酵素は従ってＨＩＶ−１またはＨ
ＩＶ−２の逆転写酵素よりも約４,５００〜約５,５００
ダルトン小さい分子量を示す。

【００１８】本発明によるウイルスＭＶＰ−５１８０／
９１を用いた場合、抗−env−抗体は免疫不全の徴候を
示すドイツの患者の血清中にはほんの弱くに検出され得
るにすぎないが、本発明によるウイルスに代えてＨＩＶ
−１ウイルスを用いるとそれらの血清が強く反応するこ
とが見出された。この強力な検出反応はとりわけｇｐ４
１タンパク質に局在した。それらの試験では、一方はド
イツの患者に由来し、そして他方は免疫不全の徴候を示
すアフリカの患者に由来する血清パネルを対比した。前
述の諸特徴が本発明によるＭＶＰ−５１８０／９１に相
当するようウイルス変異株を特徴付ける。従って、免疫
不全徴候を示しそして好ましくはアフリカに由来する人
々に由来するヘパリン加供血者血液から免疫不全ウイル
スが単離されれば、この方法により本発明によるウイル
スまたはその変異株を得ることができる。

【００１９】前述の性質を示すウイルスが単離されたの
でｃＤＮＡのクローニングを次の方法により行うことが
できる：そのウイルスを相応の量（約１リットル）の培
養液から沈殿させ、そしてホスフェート緩衝食塩水にと
る。次に（２０％）サッカロース−パッドを通してペレ
ット化を行う。そのウイルスペレットは、２０mMジチオ
トレイトールおよび０.５％Nonidet ｐ４０中の６Ｍグ
アニジニウムクロライド中に懸濁することができる。Ｃ
ｓＣｌを２Ｍ濃度になるまで添加しそしてその破砕され
たウイルスを含有する溶液を塩化セシウムパッドに適用
する。次いでウイルスＲＮＡを遠心分離によりペレット
化し、溶解し、フェノール抽出し、そしてエタノールお
よび塩化リチウムを用いて沈殿させる。オリゴ（Ｔ）−
プライマーを用いて第一ｃＤＮＡ鎖の合成をウイルスＲ
ＮＡまたはその一部で行う。逆転写酵素を添加しての合
成は購入により入手されるキットを用いて行うことがで
きる。第二鎖の合成にはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの
ＲＮＡ鎖をＲＮエースＨで希釈しそして大腸菌（E. col
i）ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて合成される。次いで
Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ平滑末端を作ることができ、
そしてこれを制限切断部位に適したリンカーと結合させ
る。適切な制限エンドヌクレアーゼによる制限消化の
後、ｃＤＮＡ断片をアガロースゲルから単離し、そして
予め適切な方法で切断されたベクターに結合する。ｃＤ
ＮＡ−インサートを有するそのベクターを次いでコンピ
テント大腸菌細胞の形質転換に用いることができる。得
られたコロニーを次いで膜に移動し、溶菌させそして変
性させ、そして最後にハイブリダイゼーションにより、
ジゴキシゲニンまたはビオチンで標識された核酸と結合
させる。相当するｃＤＮＡの遺伝子工学的調製後、レト
ロウイルスに由来する目的とするＤＮＡ断片の単離が可
能である。適切な発現ベクター中でこの断片を構築する
ことにより、次いで目的とするタンパク質またはタンパ
ク質断片を発現させ、そして診断テストに適用すること
ができる。

【００２０】前述の方法とは別の選択肢として、免疫不
全ウイルスをＰＣＲ法を用いてクローン化でき、その際
前述のプライマーを用いることができる。様々なウイル
ス単離物の間の類似性を核酸またはタンパク質配列の相
同度により絞り出すことができる。例えば５０％相同性
は配列中の１００のヌクレオチド−またはアミノ酸−位
のうち５０が一致することを意味している。タンパク質
の相同性は配列分析により決定される。相同ＤＮＡ配列
はハイブリダイゼーション法によっても調べることがで
きる。

【００２１】本発明によれば、まず外被タンパク質の一
部について配列決定がされたところ、この配列がＨＩＶ
型のウイルスの相当する配列に対して比較的わずかな相
同性しか示さないことが確認された。特にgp４１領域に
関しては、データバンクを利用して行われたＨＩＶ−配
列との比較によって高々６６％（核酸配列）の相同性が
見出されたにすぎない。更に、gp４１をコードする領域
も配列決定された。この配列を第１表または第３表に示
す。

【００２２】従って本発明の主題は、第１表および／ま
たは第３表のヌクレオチド配列に関し、本発明によるＨ
ＩＶウイルス、ＭＶＰ ５１８０／９１に対して６６％
以上、好ましくは７５％以上、そして特に好ましくは８
５％以上の相同性を示すようなウイルスである。更に本
発明の主題は、少くとも５０、好ましくは１００、ヌク
レオチド長の第３表に記載の核酸配列の部分配列に対し
て６６％以上、好ましくは７５％以上、そして特に好ま
しくは８５％以上の相同性を示すようなウイルスであ
る。これは、少くとも１６、そして好ましくは３３、の
アミノ酸のアミノ酸長に相当する。

【００２３】本発明によるウイルスはその配列によって
従来より知られるウイルスとは区別される。従って本発
明の主題は、相同度により相違度を確認した場合に本発
明によるウイルスの配列に広範に対応するようなウイル
スおよび相当する核酸またはアミノ酸配列である。従っ
て例えば８５％以上の相同性は、１００のヌクレオチド
またはアミノ酸のうち少くとも８５において同じヌクレ
オチドまたはアミノ酸を示し残りは異なっていてもよい
ような配列が包含されることを意味する。相同性を確認
するにあたって、両配列はできるだけ多くの相互に対応
するヌクレオチドまたはアミノ酸が相互に一致するよう
に対応される。

【００２４】本発明によるウイルスのＤＮＡ配列として
記載された（ほぼ）完全な配列を第７表に示す。ここで
本発明の主題は第７表による配列を示すウイルス、およ
び第７表の配列に対し高い相同性を示すそれらの変異
株、およびそれらより導かれる、診断的に使用できるか
または接種素として通用できるタンパク質、ポリペプチ
ドおよびオリゴペプチドである。

【００２５】単離された配列に基づき免疫支配エピトー
プ（ペプチド）を調製し（konfektioniert）合成するこ
とができる。ウイルスの核酸配列がわかっているので当
業者はそれよりアミノ酸配列を導くことができる。アミ
ノ酸配列の部分領域を第３表に記述する。従って本発明
の主題は、第７表または第４表に開示された情報を用い
て調製することができる抗原、すなわちタンパク質、オ
リゴペプチドまたはポリペプチドでもある。これらの抗
原、タンパク質、ポリペプチドおよびオリゴペプチド
は、第７表から導き得る、または第３表に記載されてい
るアミノ酸配列を示す。それら抗原またはペプチドは第
３表に記載されているかまたは第７表より導き得るアミ
ノ酸配列の比較的短い部分配列を示すことができる。こ
のアミノ酸配列は、少くとも６アミノ酸長、好ましくは
少くとも１０アミノ酸長、そして特に好ましくは１５ア
ミノ酸長である。これらのペプチドは組換え法によるだ
けでなく合成法によって調製することもできる。適当な
調製方法の一つはMerrifield型の固相合成である。この
方法の更なる記述および他の従来技術として知られる方
法は文献、例えばM. Bodansky, et al., Peptide Synth
esis, John Weeley &Sons, 第二版，1976にみることが
できる。

【００２６】診断テストにおいては、検査すべき人の血
清検体をＭＶＰ−５１８０／９１に由来する一以上のタ
ンパク質または糖タンパク質（それらは真核細胞系統に
おいて発現させることができる）のタンパク鎖またはそ
の一部と混合する。好ましいテスト方法には免疫蛍光ま
たは免疫酵素テスト法（例えばＥＬＩＳＡ、イムノブロ
ット）が包含される。免疫酵素テスト（ＥＬＩＳＡ）に
おいては、例えばＭＶＰ−５１８０／９１またはその変
異株に由来する抗原をミクロタイタープレートの壁面に
結合することができる。その際に用いられる用量はテス
トシステムおよびミクロタイタープレートの操法に本質
的に依存する。次いで検査すべき人に由来する血清また
は血清希釈液をそのミクロタイタープレートの穴に添加
する。一定のインキュベーション時間の後、そのプレー
トを洗浄する。特異免疫複合体は、ヒト免疫グロブリン
に特異的に結合しそして予め酵素例えば西洋わさびペル
オキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼなどに結合し
ておいた抗体により、あるいは酵素標識抗原を用いて検
出される。この酵素は無色基質を強く発色した生成物に
変えることができ、次いでその色の強さで特異抗−ＨＩ
Ｖ−抗体の存在を読み取ることができる。テストシステ
ムにおける本発明ウイルス利用のもう一つの可能性はウ
ェスターンブロットへの利用である。

【００２７】たとえ、免疫不全疾患に対する接種素の調
製が極端に困難であるとわかっても、このウイルスまた
はその一部、すなわち免疫支配エピトープおよび細胞性
免疫のインデューサー、あるいは遺伝子工学的に調製さ
れた抗原は接種素の開発および調製に用いることができ
る。

【００２８】実施例１ 本発明による免疫不全ウイルスＭＶＰ−５１８０／９１
を免疫不全徴候を伴う女性患者の血液から単離した。そ
のために、ＨＩＶに感染していない供血者の血液からの
末梢リンパ球（peripheral blood lymphocytes, PBL）
および末梢単核細胞（末梢血リンパ球、PBL）を植物性
血球凝集素（フィトヘマグルチニン）で刺激しそして培
養液に保った。そのために、１０％牛胎仔血清含有の普
通培地ＲＰＭＩ １６４０を用いた。培養条件はLanday
A. et al., J. Inf. Dis., 161（1990）pp．706-710、
に記載されている。次いで巨細胞（Reisenzellen）の形
成を顕微鏡観察した。ＨＩＶウイルスの生産をAbbott社
から購入できるテストを用いたｐ２４−抗原の測定によ
り測定した。ウイルス増殖測定のためのもう一つのテス
トは粒子結合逆転写酵素を用いたテストであった（Eber
le J., Seibl R., J. Virol. Methods 40, 1992, pp. 3
47-356）。すなわち、ウイルス生産を監視するためにウ
イルス増殖を培養上清中の酵素活性に基づいて週１〜２
回測定した。１週間に１回新たな供血者リンパ球を添加
した。

【００２９】ＨＩＶウイルス増殖が確認できた後、ＨＩ
Ｖで感染されていない健常供血者の血液からの新鮮末梢
リンパ球（ＰＢＬ）を初代培養液上清で感染させた。こ
の段階を反復した後その上清でＨ９またはＨＵＴ７８細
胞を感染させた。この方法により免疫不全ウイルスの永
続的生産が可能であった。そのウイルスはＥＣＡＣＣに
No．V 920 92 318の番号で寄託された。

【００３０】実施例２ ＨＩＶ感染の検出には、現在のところいわゆるウェスタ
ーンブロットまたはイムノブロットが標準的方法であ
る。J. Virol. Meth. 15 (1987) pp. 11-23にGuertler
らが記載している手順に従って様々な血清を検査した。
その際に、ドイツの患者の血清をアフリカの患者から得
られた血清と対比させた。その際に得られた結果は次の
とおりであった。 ウイルス型：ドイツの患者から単離されたＨＩＶ−１ウ
イルス ドイツの血清 強い反応 アフリカの血清 ｇｐ４１と強い反応 ウイルス型：ＭＶＰ−５１８０／９１ ドイツの血清 ｇｐ４１と無反応乃至弱い反応 アフリカの血清 強い反応

【００３１】前述の結果は、ドイツの患者から単離され
たＨＩＶ−１型ウイルスをＨＩＶ−感染の検出に用いる
場合、患者が本発明によるＭＶＰ−５１８０／９１に相
当するウイルスに感染しているときは、一義的結果は多
分全く得られないことを示している。さらにそれによっ
て、本発明によるウイルスを用いればゲノム全体に関し
少くとも約８５％相同性を本発明ウイルスに対して示す
ようなウイルスを検出できると結論される。

【００３２】実施例３ 実施例２に記載の手順に従ってさらなるウェスターンブ
ロットを行った。その結果を添付した図３に示す。この
テストでは、本発明による免疫不全ウイルスＭＶＰ−５
１８０／９１のウイルスタンパク質、およびＨＩＶ−１
型ウイルス（ＭＶＰ−８９９）のウイルスタンパク質を
それぞれ、ゲル電気泳動分離した後セルロースフィルタ
ーに移した。これらフィルター片を様々な患者の血清と
共にインキュベートした後特異抗体を呈色反応により視
認できるようにした。ＭＶＰ−５１８０の標題のある図
の左半分は本発明による免疫不全ウイルスを示す。図の
右半分は、ＨＩＶ−１ウイルスに関係する、ドイツの供
血者から単離されたウイルス（ＭＶＰ−８９９）を示
す。それら個々のフィルター片を今度は様々な患者の血
清と共にインキュベートした。図３からわかるように、
それぞれ同じ（ドイツの患者の）血清を各々２つのフィ
ルター片と反応させた。８と２６；９と２７；１０と２
８；１１と２９；１３と３０；１３と３１；１４と３
２；１５と３３および１６と３４の番号は同じ血清を表
示している。１７および１８番のウェスターンブロット
では、アフリカの患者の血清を適用した。右側余白の数
値は概ねの分子量を１０００（ＫＤ）単位で記述したも
のである。

【００３３】図３は、本発明による免疫不全ウイルスを
有するドイツの患者の血清がウェスターンブロットにお
いてｇｐ４１とは極めて弱くしか反応しないことを明ら
かに示している。これに対し、アフリカの患者の血清は
本発明による免疫不全ウイルスと極めて強く反応する。
従って図３は、本発明による免疫不全ウイルスを用いれ
ばＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２ウイルスを用いた場合に
は不確かな、すなわち一義的でない陽性結果しか得られ
ないような免疫不全感染を検出できることを明らかにし
ている。この検出可能性は遠大な診断上の意義を有し得
る。何故ならば、ウェスターンブロットで不確かな結果
しか得られない場合は、免疫不全ウイルスによる感染が
関係しているかどうかを明確な確実さをもって確認する
ことができないからである。しかしながら本発明による
免疫不全ウイルスを用いてかかる不確かな結果が本発明
によるタイプのウイルスによる感染と相関させることが
できるところ、これは診断上大変な進歩である。

【００３４】実施例４ ＨＩＶ−単離物ＭＶＰ−５１８０／９１のゲノム断片の
ＤＮＡ単離、増幅および構造的特徴評価 ＭＶＰ−５１８０／９１に感染させたＨＵＴ７８細胞よ
りのゲノムＤＮＡを標準的方法により単離した。単離物
ＭＶＰ−５１８０／９１のゲノム領域の特徴評価をする
ためにＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）実験を外被タン
パク質領域ｇｐ４１からのプライマー対を用いて行っ
た。そのＰＣＲ実験の実施は次の改変を加えたSaikiら
（Saiki etal., Science 239: 487-491, 1988）の方法
により行った：ＨＩＶ−特異的ＤＮＡ領域を増幅するた
めに、ＭＶＰ−５１８０／９１に感染させたＨＵＴ７８
細胞からの５μｌのゲノムＤＮＡを１００μｌの反応混
合物（０.２５mM ｄＮＴＰ、各１μＭのプライマー１お
よびプライマー２、１０mM Tris ＨＣｌ pH８.３、５０
mM ＫＣｌ、１.５mM ＭｇＣｌ₂、０.００１％ゼラチ
ン、２.５単位のＴａｑポリメラーゼ（Perkin Elmer
社））にピペットで取り、そして次の温度プログラムに
従って増幅した：１．初期変性：３分９５℃、２．増
幅：９０秒９４℃、６０秒５６℃、９０秒７２℃（３０
サイクル）。

【００３５】前記ＰＣＲおよびヌクレオチド配列決定に
用いたプライマーはBioresearch社のオリゴヌクレオチ
ド合成装置８７５０で合成された。 プライマー１：ＡＧＣ ＡＧＣ ＡＧＧ ＡＡＧ ＣＡＣ
ＴＡＴ ＧＧ （ＨＩＶ単離物Ｈ×Ｂ２からの座標（コーディネー
ト）：塩基７７９５−７８１４、プライマーｓｋ６８に
相当） プライマー２：ＧＡＧ ＴＴＴ ＴＣＣ ＡＧＡ ＧＣＡ
ＡＣＣ ＣＣ （ＨＩＶ１単離物Ｈ×Ｂ２からの座標：塩基８００３−
８０２２、プライマー env ｂに相当）。

【００３６】増幅したＤＮＡを３％“Nusieve”アガロ
ースゲル（Biozyme社）で分離し、増幅した断片を切り
取りそして等容の緩衝液（１×ＴＢＥ（０.０９Ｍ Tris
ボレート、０.００２Ｍ ＥＤＴＡ、pH８.０）と混合し
た。そのＤＮＡ−アガロースゲル混合物を７０℃で１０
分間インキュベートし、次いでフェノール抽出した後、
そのＤＮＡを水性相から1／10容の３Ｍ ＮａＡｃ（pH
５.５）および２容のエタノールを添加することにより
−２０℃で１５分間沈殿させ、次いで遠心分離機（Eppe
ndorf社）でペレット化した（１３０００rpm、１０分、
４℃）。ペレット化したＤＮＡを乾燥し、水にとり、そ
して分光光度計（Beckman社）において２６０nmでのＤ
ＮＡ濃度を光度計測定した後、Sanger（F. Sanger, Pro
c. Natl. Acad. Sci., 74：5463，1977）の方法により
配列決定した。Klenow ＤＮＡポリメラーゼを用いた配
列決定に代えてApplied Biosystems社のキット(“Taq D
ye DeoxyTerminator Cycle Sequencing”、注文番号（B
est.−Nr.）：401150）を用いて配列決定反応を行っ
た。プライマーとしては別々の配列決定反応にプライマ
ー１またはプライマー２（各１μＭ）を適用した。配列
決定反応系の分析はＤＮＡ配列決定装置３７３Ａ（Appl
ied Biosystems社）で、装置製造元の指示に従って行わ
れた。増幅されたＤＮＡ領域のヌクレオチド配列および
それより導かれたアミノ酸配列を第１表に示す。

【００３７】

【表１】

【００３８】実施例５ 確認された第１表記載のヌクレオチド配列の相同配列を
ＧＥＮＥＢＡＮＫデータバンク（リリース７２、１９９
２年６月）でＧＣＧ−コンピュータープログラム（Gene
tic Computer Group, Inc.社、米国ウイスコンシン州、
バージョン７.１、１９９２年３月）を用いて調べた。
このデータバンクには１９９２年７月までに知られた、
ヒト起源の免疫不全ウイルスのおよび霊長類からの単離
物のヌクレオチド配列のほとんどが含まれている。

【００３９】第１表のヌクレオチド配列は最良の場合に
はチンパンジーからの単離物に対し６６％の相同性を示
す。ＨＩＶ１単離物に対して、ＭＶＰ５１８０／９１は
調べたＤＮＡ配列において最良の場合に６４％相同であ
る。ＨＩＶ２単離物に対し第１表のＤＮＡは５６％相同
である。チンパンジーからの単離物の外には第１表のヌ
クレオチド配列と霊長類からの単離物（ＳＩＶ：サル免
疫不全ウイルス）からのＤＮＡ断片の間の最良の相同性
は、単離物ＳＩＶ（アフリカ産オナガザル）ＴＹＯ−１
の外被タンパク質の部分領域をコードするＤＮＡ配列に
存在する。その相同性は６１.５％である。

【００４０】実施例６ 確認された第１表に記載のアミノ酸配列の相同配列をＳ
ＷＩＳＳＰＲＯＴタンパク質データバンク（リリース２
２、１９９２年６月）においてＧＣＧ−コンピューター
プログラムを用いて調べた。このデータバンクには１９
９２年６月までに知られた、ヒト起源の免疫不全ウイル
スのおよび霊長類からの単離物のタンパク質配列のほと
んどが含まれている。

【００４１】第１表記載のアミノ酸配列は前述のチンパ
ンジーからの単離物の外被タンパク質断片に対し最良の
場合６２.５％相同である。ＨＩＶ１−外被タンパク質
の下では、第１表のアミノ酸配列との最良の相同性は単
離物ＨＩＶ１ Ｍａｌに認められる。その相同性は５９
％である。ＨＩＶ２−外被タンパク質に対しては第１表
のアミノ酸配列との相同性は最良の場合５２％（単離物
ＨＩＶ２ Ｒｏｄ）である。ＨＩＶ１およびＨＩＶ２−
単離物も最良の場合対応するタンパク質断片においてわ
ずか６４％が一致するに過ぎないことから、単離物ＭＶ
Ｐ−５１８０／９１の場合はＨＩＶ１およびＨＩＶ２と
は明らかに構造的に区別され従ってそれらから独立した
ＨＩＶウイルス群の代表であるＨＩＶ変異株が関係して
いると思われる。

【００４２】ＨＩＶ単離物ＭＶＰ−５１８０／９１の増
幅されたＤＮＡ領域のアミノ酸配列（第１表）は、ＨＩ
Ｖ１の外被タンパク質の免疫診断的に重要な領域（アミ
ノ酸５８４−６１８＊）とオーバーラップする（第２
表）(Gnann et al., J. Inf. Dis. 156：261-267, 198
7; Norrby et al., Nature, 329：248-250, 1987）。Ｈ
ＩＶ２およびＳＩＶの外被タンパク質の対応するアミノ
酸領域も同様に免疫診断的に保存されている（Gnann et
al., Science, pp. 1346-1349, 1987）。従ってＨＩＶ
１およびＨＩＶ２のこの外被タンパク質領域からのペプ
チドは多くの商業的に入手し得るＨＩＶ １／２抗体ス
クリーニングテストに固相抗原として適用される。それ
によって約９９％の抗ＨＩＶ１および抗ＨＩＶ２陽性血
清を捕捉することができる。

【００４３】ＭＶＰ−５１８０／９１−外被タンパク質
のアミノ酸領域（第１表）は、ｇｐ４１の免疫診断的に
重要な領域とオーバーラップしていることから、血清診
断的に重要であり得る。特に、ＨＩＶ感染した患者の抗
血清が商業的に入手される抗体スクリーニングテストの
いずれとも陽性に反応しない場合にはそうである。これ
らの場合には、ＭＶＰ−５１８０／９１と密接な関係に
あるウイルスによる感染が存在し得る。

【００４４】

【表２】

【００４５】実施例７ （ｇｐ４１をコードする）ＨＩＶ単離物ＭＶＰ−５１８
０／９１のゲノム診断のＤＮＡ単離、増幅および構造的
特徴評価 ＭＶＰ−５１８０／９１に感染したＨＵＴ７８細胞から
のゲノムＤＮＡを前述の如く単離した。単離物ＭＶＰ−
５１８０／９１のゲノム領域の特徴評価を行うために、
外被タンパク質領域ｇｐ４１からのプライマー対を用い
てＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）実験を行った。ＰＣ
Ｒ（Saiki et al., Science 239：487-491, 1988）およ
び逆ＰＣＲ（Triglia et al., Nucl. Asids, Res. 16：
8186, 1988）は次の改変を加えて行われた：

【００４６】１．ＰＣＲ ＨＩＶ−特異的ＤＮＡ領域を増幅するために、ＭＶＰ−
５１８０／９１に感染させたＨＵＴ７８細胞からの５μ
ｌ（２１８μｇ／ml）のゲノムＤＮＡを１００μｌの反
応混合物（０.２５mM ｄＮＴＰ、各１μＭのプライマー
１６３envおよびプライマーenvend、 １０mM Tris ＨＣ
ｌ（pH８.３)、５０mM ＫＣｌ、１.５mMＭｇＣｌ₂、０.
００１％ゼラチン、２.５単位のＴａｑポリメラーゼ（P
erkin Elmer社））にピペットでとりそして次の温度プ
ログラムに従って増殖した：１．初期変性：３分間９５
℃、２．増幅：９０秒間９４℃、６０秒間５６℃、９０
秒間７２℃（３０サイクル）。

【００４７】２．ｇｐ４１の５′領域（Ｎ−末端）およ
びｇｐ１２０の３′配列を“逆ＰＣＲ”により増幅し
た。そのために、ＭＶＰ−５１８０／９１に感染させた
ＨＵＴ７８細胞からの１００μｌのゲノムＤＮＡ調製物
（２１８μｇ／ml）を１０単位の制限エンドヌクレアー
ゼSau3aを含む２００μｌの最終容量中３７℃で１時間
消化した。そのＤＮＡを次にフェノール処理し、そして
酢酸ナトリウム（最終濃度３００mM）および２.５容エ
タノールを用いて−７０℃で１０分間沈殿させ、エッペ
ンドルフ遠心分離機で遠心分離し、そしてそのペレット
を乾燥しそして８９０μｌの蒸留水に再懸濁した。１０
０μｌのリガーゼ緩衝液（５０mM Tris ＨＣｌ、pH７.
８、１０mM ＭｇＣｌ₂、１０mM ＤＴＴ、１mM ＡＴＰ、
２５μｇ／ml牛血清アルブミン）および１０μｌのＴ４
ＤＮＡ−リガーゼ（Boehringer社、マンハイム）を添
加した後、それらＤＮＡ断片を室温で３時間結合し、改
めてフェノール処理し、そして前述の如く酢酸ナトリウ
ムおよびエタノールを用いて沈殿させた。遠心分離およ
び乾燥後、そのＤＮＡを４０μｌの蒸留水に再懸濁し、
そして１０単位の制限エンドヌクレアーゼSacＩ（Boehr
inger社、マンハイム）を用いて１時間消化した。次に
５μｌのこの混合物を“１．ＰＣＲ”に記載の如くＰＣ
Ｒ実験に適用した。プライマー１６３envおよびenvend
に代えてプライマー１６８；および１６９；を逆ＰＣＲ
に用いた。

【００４８】それらプライマー１６３env、１６８；お
よび１６９；は、ＨＩＶ−単離物ＭＶＰ−５１８０のす
でに確認されている部分配列から選択した（実施例
４）。ＰＣＲ／逆ＰＣＲおよびヌクレオチド配列決定に
用いられたプライマーはBioresearch社のオリゴヌクレ
オチド合成装置８７５０で合成したところ、該プライマ
ーは次の配列を示す： プライマー１６３env： 5′CAG AAT CAG CAA CGC CTA A
AC C 3′ プライマーenvend： 5′GCC CTG TCT TAT TCT TCT A
GG 3′ （ＨＩＶ１単離物ＢＨ１０での位置：塩基８１２９−８
１０９） プライマー １６８ｉ： 5′GCC TGC AAG CCT TAG AAA C
C 3′ プライマー１６９ｉ： 5′GCA CTA TAC CCT TCA GTA C
AC TG 3′

【００４９】増幅されたＤＮＡを３％“Nusieve”−ア
ガロースゲル（Biozyme社）で分離し、増幅された断片
を切り取りそして等容の緩衝液（１×ＴＢＥ（０.０９
Ｍ Trisボレート、０.００２Ｍ ＥＤＴＡ、pH８.０）と
混合した。そのＤＮＡ−アガロースゲル混合物を７０℃
で１０分間インキュベーションし次いでフェノール抽出
した後、ＤＮＡを水性相から1／10容の３Ｍ ＮａＡｃ、
pH５.５および２容のエタノールを用いて−２０℃で１
５分間沈殿させ、次いでエッペンドルフ遠心分離機でペ
レット化した（１３０００rpm、１０分間、４℃）。そ
のペレット化されたＤＮＡを乾燥し、水にとり、そして
分光光度計（Beckman社）により２６０nmでのＤＮＡ濃
度を光度計測定した後、Sanger（F. Sanger, Proc. Nat
l. Acad. Sci., 74：5463，1977）の方法に従って配列
決定した。Klenow ＤＮＡポリメラーゼを用いた配列決
定に代えてApplied Biosystems社のキット(“Taq Dye D
eoxy Terminator Cycle Sequencing”、注文番号：４０
１１５０）を用いて配列決定反応を行った。プライマー
としては別々の配列決定反応にプライマー１６３envま
たはプライマーenvend（各１μＭ）を適用した。この逆
ＰＣＲ実験で増幅されたＤＮＡをプライマー１６８；お
よび１６９；を用いて配列決定した。配列決定反応の分
析はＤＮＡ配列決定装置３７３Ａ（Applied Biosystems
社）で装置製造元の指示に従って行われた。増幅された
ＤＮＡ領域のヌクレオチド配列およびそれより導かれた
アミノ酸配列を第３表に示す。

【００５０】

【表３】

【００５１】

【表４】

【００５２】実施例８ 確認された第３表記載のヌクレオチド配列の相同配列を
ＧＥＮＥＢＡＮＫ−データーバンク（リリース７２、１
９９２年６月）においてＧＣＧ−コンピュータープログ
ラム（Genetic Computer Group, Inc.社、米国ウイスコ
ンシン州、バージョン７.１、１９９２年３月）を用い
て調べた。このデータバンクには１９９２年７月までに
知られた、ヒト起源の免疫不全ウイルスのおよび霊長類
からの単離物のヌクレオチド配列のほとんどが含まれて
いる。第３表記載のヌクレオチド配列はＨＩＶ１−単離
物に対して最良の場合６２％相同性を示す。ＨＩＶ２単
離物に対して第５表記載のＤＮＡは５０％相同である。
第３表のヌクレオチド配列から導かれるアミノ酸配列の
相同配列をＳＷＩＳＳＰＲＯＴタンパク質データバンク
（リリース２２、１９９２年６月）においてＧＣＧ−コ
ンピュータープログラムを用いて調べた。このデータバ
ンクには１９９２年６月までに知られた、ヒト起源の免
疫不全ウイルスのおよび霊長類からの単離物のタンパク
質配列のほとんどが含まれている。

【００５３】第３表記載のアミノ酸配列はチンパンジー
からの単離物ＣＩＶ（SIVcpz）の相当する外被タンパク
質断片に対し最良の場合５４％相同であり、そしてＨＩ
Ｖ１単離物Ｍａｌに対して５４.５％相同である。ＨＩ
Ｖ２−外被タンパク質に対する第３表記載のアミノ酸配
列の相同性は最良の場合３４％（単離物ＨＩＶ２ Ｄ１
９４）である。それに対し、ＨＩＶ１のｇｐ４１−アミ
ノ酸配列をSWISSRPOT−データバンクに存在するＨＩＶ
１ ｇｐ−４１配列と比較すると期待されたとおり最良
の場合ほぼ１００％の相同性、そして最悪の場合に７８
％の相同性が得られる。第３表記載の配列領域とＨＩＶ
１およびＨＩＶ２の対応する断片との間にこのような明
らかな構造的相違があることから、単離物ＭＶＰ−５１
８０／９１の場合は、ＨＩＶ１およびＨＩＶ２とは明ら
かに構造的に区別されるＨＩＶ変異株が関係していると
思われる。おそらくＭＶＰ−５１８０／９１はＨＩＶ１
およびＨＩＶ２とは区別される特別なＨＩＶウイルス群
に帰属すると思われる。

【００５４】ＨＩＶ１−外被タンパク質領域のアミノ酸
５８４−６１８のペプチドは血清診断的に特に重要であ
る（番号付けは次による：Wain Hobson et al., Cell 4
0：9-17，1985, Gnann et al., J. Inf. Dis. 156：261
-267, 1987; Norrby et al.,Nature, 329: 248-250, 19
87）。ＨＩＶ２およびＳＩＶの外被タンパク質の相当す
るアミノ酸領域も同じく免疫診断的に保存されている
（Gnann et al., Science, pp. 1346-1349, 1987）。従
ってＨＩＶ１およびＨＩＶ２のこの外被タンパク質領域
からのペプチドは多くの商業的に入手し得るＨＩＶ 1/2
抗体スクリーニングテストに固相抗原として適用され
る。それによって約９９％の抗−ＨＩＶ１および抗−Ｈ
ＩＶ２陽性血清を捕捉することができる。ＭＶＰ−５１
８０／９１外被タンパク質の相当するアミノ酸領域（第
４表）およびこの単離物のｇｐ４１全体は、ＨＩＶ感染
患者の抗血清が商業的に入手される抗体スクリーニング
テストにおいてほんの弱くしかあるいはそもそも全く反
応しない場合に特に血清診断的に重要であり得る。これ
らの場合には、ＭＶＰ−５１８０／９１と密接な関係に
あるウイルスによる感染が存在し得る。

【００５５】

【表５】

【００５６】ＭＶＰ５１８０に由来する情報を用いて確
認されたペプチドは従って次のアミノ酸配列を有する：
ＲＬＱＡＬＥＴＬＩＱＮＱＱＲＬＮＬＷＧＣＫＧＫＬＩ
ＣＹＴＳＶＫＷＮＴＳ。従って本発明の主題は、組換え
または合成により調製することかでき、そして前述の配
列または、少くとも６個の連続するアミノ酸、好ましく
は９個そして特に好ましくは１２個の連続するアミノ酸
を示す部分配列を示すペプチドである。

【００５７】実施例９ ＨＩＶ単離物ＭＶＰ５１８０の全ゲノムのクローニング ａ） ゲノムライブラリーの調製 ＭＶＰ５１８０感染ＨＵＴ７８細胞由来のゲノムＤＮＡ
を前述の如く単離した。３００μｇのこのＤＮＡを７７
０μｌの容量として０.２４Ｕの制限酵素Sau3Aと共に４
５分間インキュベートした。それによって部分的にのみ
切断されたＤＮＡを次いで０.７％アガロース（低融点
アガロース、Nusieve）でサイズ分画し、そして１０kb
と２１kbの間の断片を切り取った。そのアガロースを７
０℃で１０分間溶融し、そして等容の緩衝液（１×ＴＢ
Ｅ、０.２Ｍ ＮａＣｌ）と混合した。次いでフェノール
で２回、そしてクロロホルムで１回抽出した後、1／10
容の３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（pH５.９）および２.５容
のエタノールの添加により−７０℃で１０分間ＤＮＡを
沈殿させた。沈殿したＤＮＡを遠心分離し、乾燥しそし
て１μｇ／μｌ濃度で水に溶解した。

【００５８】サイズ分画されたＤＮＡの収量は約６０μ
ｇであった。５μｇのこのＤＮＡを１Ｕアルカリ性ホス
ファターゼと共に相当する緩衝液中、３７℃で２０分間
インキュベートした。５′−末端ホスフェート残基を分
離することによってサイズ分画されたＤＮＡの過度の多
重な挿入を減少させた。そのホスファターゼ処理をフェ
ノール処理により停止し、ＤＮＡを前述の如く沈殿さ
せ、１μｇのベクター（２ ＤＡＳＨ、ＢａｍＨＩ切断S
tratagene No.：247611）と、全容量を６μｌとして２W
eiss単位のラムダＴ４リガーゼを用いて１５℃で１２時
間結合した。結合が行われた後、そのＤＮＡをパッキン
グキット（Gigapack II Gold, Stratagene No.：24761
1）を用いて製造元の指示に正しく従ってファージ外被
にパッキングした。

【００５９】ｂ） ＤＮＡプローブの放射性標識 標識にはBoehringer Mannheim社の“ラムダ・プライム
ド・ＤＮＡ・ラベリング・キット（Random Primed DNA
Labeling Kit）”（No.：713 023）を適用した。実施例
３に記載の如くプライマー sk６８およびenvbを用いて
得られたＰＣＲ生成物を標識した。１μｇのこのＤＮＡ
を２×５分間煮沸した後氷水中で冷却することにより変
性した。標識のために５０mCi〔α−³²Ｐ〕−ｄＣＴＰ
（ＮＥＮ，No.：ＮＥＸ−０５３Ｈ）を添加した。その
他の添加物質を製造元の指示に従ってピペットで添加し
た。３７℃で３０分間インキュベーションした後、放射
性標識済みのＤＮＡを沈殿させた。

【００６０】 ｃ） ファージ−ライブラリーのスクリーニング ２００μｌの３０℃で一夜培養した培養液（１０mM Ｍ
ｇＳＯ₄のほか０.２％マルトースを含有するＬＢ培地中
のＳＲＢ（Ｐ２）株〔Stratagene, No.：247611〕）
に、１００μｌのＳＭ緩衝液（５.８ｇのＮａＣｌ、２
ｇのＭｇＳＯ₄、５０mlの１Ｍ Tris、pH７.５、および
５mlの２％ゼラチン溶液を１リットルのＨ₂Ｏに溶解）
中の２００００pfu（プラーク形成単位）のライブラリ
ーを添加し、ファージを２０分間３７℃で細菌に吸着さ
せ、７.５mlの５５℃に冷却したTop−アガロースと混合
しそして予め加温した直径１４cmのＬｂ−寒天プレート
で分別した。約８時間後にプラークが全面に及んだ。そ
こでプレートにニトロセルロースフィルターを数分間重
ねそして非対称的マーキングを設けた。注意深く取り除
いた後そのフィルターを２分間変性し（０.５Ｍ ＮａＯ
Ｈ、１.５Ｍ ＮａＣｌ）そして次に５分間中和した
（０.５Ｍ Tris、 pH８、１.５Ｍ ＮａＣｌ）。そのフィ
ルターを次に８０℃で６０分間ベーキング後プローブと
ハイブリダイズさせることができた。

【００６１】プレハイブリダイゼーションを行うべき、
そのフィルターをフィルター１枚あたり１５mlのハイブ
リダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、０.５％
ＳＤＳ、５×ＳＳＰＥ、５×Denhardt溶液および０.１m
g／mlサケ精子ＤＮＡ）中、４２℃で振盪しながら２〜
３時間インキュベートした。〔³²Ｐ〕標識ＤＮＡプロー
ブを２〜５分間１００℃で変性し、氷冷し、プレハイブ
リダイゼーション溶液を添加しそして１２時間４２℃で
ハイブリダイズした。次にそのフィルターを６０℃で、
まず２×ＳＳＣ／０.１％ＳＤＳで、次に０.２×ＳＳＣ
／０.１％ＳＤＳで洗浄した。そのフィルターを乾燥
後、ハイブリダイゼーションシグナルをレントゲンフィ
ルムＸ−ＯＭＡＴ^THＡＲ（Kodak社）を用いて検出し
た。あるシグナルを帰属させることができたプラークを
ＳＭ緩衝液で溶出後さらなる希釈段階で分離した。２×
１０⁶プラークのスクリーニング後、下記のクローンを
確認することができた。

【００６２】 ｄ） ファージＤＮＡの単離およびサブクローニング ＳＭ緩衝液中のファージ溶出液１０μｌを用いて宿主株
ＳＲＢ（Ｐ２）の一夜培養物を、培養物の最初の濃密な
増殖の後、約６〜８時間後に溶解（Lyse）が行われるよ
うに感染させた。その溶解培養物から、９０００ｇで２
回１０分間遠心分離することにより細胞残渣を分離し
た。次にファージを遠心分離（３５０００ｇ、１時間）
によりペレット化し、７００μｌの１０mM ＭｇＳＯ₄に
とり、そしてタンパク質中間相（インターフェーズ）が
もはやみられなくなるまでフェノール処理した。そこで
ファージＤＮＡを沈殿させ、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断
し、そしてそれによって得られたＥｃｏＲＩ断片をベク
ターBluescript KS^-（Strategene，No.：212208）にサ
ブクローン化した。全部で４つのクローンが得られた：

【００６３】

【表６】

【００６４】不足している塩基７４１６と７６５９の間
の断片はプライマー１５７（ＣＣＡＴＡＡ ＴＡＴ ＴＣ
Ａ ＧＣＡ ＧＡＡ ＣＴＡ Ｇ)および２２６(ＧＣＴ Ｇ
ＡＴＴＣＴ ＧＴＡ ＴＡＡ ＧＧＧ）を用いたＰＣＲに
より得た。ＤＮＡ鋳型としてはクローンのファージＤＮ
Ａを用いた。ＰＣＲの条件は次のとおりとした：１）初
期変性：９４℃、３分間、２）増幅：１.５分間９４
℃、１分間５６℃および１分間７２℃（３０サイク
ル）。ＤＮＡの配列決定は実施例４に記載の如く行っ
た。全ゲノムからその鎖のほかに対向鎖も配列決定し
た。すべてのＥｃｏＲＩ切断部位の場合に、クローンの
ファージＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲによって、サ
ブクローン移行時点で各々単一のＥｃｏＲＩ切断部位が
関係していることが確認された。

【００６５】

【表７】 ＭｖＰ５１８０／９１の全配列は次の第７表に示されて
いる。

【００６６】

【表８】

【００６７】

【表９】

【００６８】

【表１０】

【００６９】

【表１１】

【００７０】

【表１２】

【００７１】

【表１３】

【００７２】

【表１４】

【００７３】実施例１０ ＭｖＰ５１８０／９１の全配列の他のＨＩＶ１単離物か
らの区別 以下の配列比較の基礎は、遺伝子バンク・リリース７５
（１９９３年２月）、ＥＭＢＬ３３（１９９２年１２
月）およびSwissprot ２４（１９９３年１月）といった
データバンクであった。相同性比較はＧＣＧソフトウエ
ア（バージョン７.２、１９９２年１０月、Genetics-Co
mputer Group. ウイスコンシン）を用いて行われた。

【００７４】まずアミノ酸レベルでＧＡＧ、ＰＯＬおよ
びＥＮＶの配列をプログラム“Wordsearch”を用いてデ
ータバンクと比較した。５０の最良の相同性をプログラ
ム“Pileup”を用いて各々相互比較した。その結果、Ｍ
ｖＰ５１８０／９１がＨＩＶ１系統に属するが極めて早
い時期に、それどころか更にチンパンジーウイルスＳＩ
Ｖｃｐｚより前に分岐し、ＨＩＶ１の新しい亜科（サブ
ファミリー）を代表していることが明らかにわかる。相
同性の数値を得るためにプログラム“Ｇａｐ”を用いて
ＭｖＰ５１８０を各々最も適切なＨＩＶ１、ＨＩＶ２お
よびＳＩＶ配列そして更にＳＩＶｃｐｚ配列と比較し
た。

【００７５】

【表１５】

【００７６】上側の数値は両配列の同一性を、下側は類
似性を示す。更に、そのデータバンクを“Wordsearch”
および“Gap”を用いてヌクレオチドレベルで徹底的に
調べた。各々最良の“符合（matches）”についての相
同性値を第９表にまとめる。

【００７７】

【表１６】

【００７８】実施例１１ ＨＩＶ５１８０単離物のｇａｇ遺伝子のＰＣＲ増幅、ク
ローニングおよび配列決定の概要説明 ウイルス増幅の過程で生じる自然突然変異を明示するた
めにウイルスゲノムの一部をＰＣＲ法によりクローン化
しそしてそのように得られたＤＮＡ配列を第７表による
配列と比較した。ｇａｇ配列をＭｖＰ５１８０ゲノムの
左端のＬＴＲ（“ロング・ターミナル・リピート”、Ｌ
ＴＲ１プライマー）からpol（ポリメラーゼ遺伝子、pol
１３.５；プライマー）まで内部をオーバーラップさせ
ながらクローン化した。クローニング手法は図４に概略
図で示されている。それらＰＣＲ反応は、ＨＩＶ−１コ
ンセンサス配列から導かれた配列を有する下記のＤＮＡ
プライマーを用いて行われた。配列決定はジデオキシ連
鎖中断法を用いて行われた。ＭｖＰ５１８０ｇａｇ遺伝
子をコードする配列は、ヌクレオチド８１７（ＡＴＧ開
始コドンのＡ）からヌクレオチド２３００（最後のコド
ンのＡ）まで延びる。

【００７９】 LTR1： 5′-CTA GCA GTG GCG CCC GAA CAG G -3′ gag3.5： 5′-AAT GAG GAA GCU GCA GAU TGG GA -3′
(U＝A／T) gag3.5i： 5′-TCC CAU TCT GCU GCT TCC TCA TT -3′
(U＝A／T) gag5： 5′-CCA AGG GGA AGT GAC ATA GCA GGA AC
-3′ gag959： 5′-CGT TGT TCA GAA TTC AAA CCC -3′ gag11i： 5′-TCC CTA AAA AAT TAG CCT GTC -3′ pol3.5i： 5′ -AAA CCT CCA ATT CCC CCT A -3′

【００８０】ＰＣＲ法により得られたＤＮＡ配列を第７
表に示されたＤＮＡ配列と対比した。両ＤＮＡ配列の比
較を図５〜７に示す。その際、同じウイルスを問題とし
ているのにヌクレオチドが約２％相互に違っていること
が確認された。図５〜７において各々上列は第７表に示
されているＤＮＡ配列を表わし、そして下列はＰＣＲ法
で得られたＤＮＡ配列を表わしている。更に、ＰＣＲ法
により調査されたタンパク質ｇａｇのアミノ酸配列を第
７表から導かれる相当するタンパク質のアミノ酸配列と
対比した。その際約２.２％のアミノ酸相違が認められ
た。その比較を図８に示すが、図において下列は各々Ｐ
ＣＲ法により得られた配列から導かれたアミノ酸配列を
表わす。

【００８１】実施例１２ 本発明によるウイルスＭｖＰ５１８０の配列をＨＩＶ１
およびＨＩＶ２と、そして知られている限りＡＮＴ−７
０（ＷＯ８９／１２０９４）の配列と比較した。その際
に次の結果が得られた：

【表１７】

【００８２】前記の表において、“ＨＩＶ−１”はＨＩ
Ｖ−１ウイルスのコンセンサス配列を意味し；“ＨＩＶ
−２”はＨＩＶ−２ウイルスのコンセンサス配列を意味
し；ＡＮＴ−７０はＷＯ８９／１２０９４より知られた
ＨＩＶ−３と表示されるウイルスの部分配列を意味す
る。

【００８３】従って本発明の主題は、遺伝子座（Genor
t）に関し第７表に示された配列に対し、％値で表わし
た場合、高々第１１表に記載の割合が異なるような相同
性を示すウイルス、ＤＮＡ配列、アミノ酸配列およびそ
れらの部分配列である。

【００８４】

【表１８】

【００８５】第１１表に記載の％単位の相同性値は、第
７表による配列を別のウイルスの配列と比較した場合に
高々前述の％値に相当する配列割合だけ異なっていても
よいことを意味している。

【００８６】実施例１３ Ｖ３−ループ／Ｖ３−シュラウフェ（Schlaufe） このシュラウフェはＨＩＶにおける主に中和性の領域で
あり、そしてその領域の免疫特異性を示したものが図９
に要約してある。これはPeter Nara（1990）の研究によ
るエイズからのコピーである。次にＶ３−シュラウフェ
をアミノ酸レベルで記述し、そしてIIIＢウイルス（現
在のＬＡＩ）および最初のＨＩＶ−２単離物（ＲＯＤ）
と比較した。シスチン架橋の個々のアミノ酸は保存され
ている。ＨＩＶ−１のクローンはＧＰＧＲまたはＧＰＧ
Ｑであり、そしてＨＩＶ−２のクローンはＧＨＶＦであ
るのに対し、ＭｖＰ５１８０／９１のクローンはアミノ
酸ＧＰＭＲから形成されている。メチオニンを用いたモ
チーフはこれまで報告されてなく、ＭｖＰ５１８０／９
１の個性を強めている。

【００８７】ウイルスの核酸配列を調べた後、そのＶ３
−ループ領域を適切なプライマーを用いたＰＣＲ法によ
り増幅した。その際に、突然変異、特にメチオニンコド
ン（ＡＴＧ）からロイシンコドン（ＣＴＧ）への変化を
みることができた。

【００８８】次いでクローン化された核酸から導かれた
アミノ酸配列とＰＣＲ法を用いた増幅により得られた配
列とを比較した： ＭｖＰ５１８０（クローン化）：ＣＩＲＥＧＩＡＥＶＱ
ＤＩＹＴＧＰＭＲＷＲＳＭＴＬＫＲＳＮＮＴＳＰＲＳＲ
ＶＡＹＣ

【００８９】ＭｖＰ５１８０（ＰＣＲ法）：ＣＩＲＥＧ
ＩＡＥＶＱＤＬＨＴＧＰＬＲＷＲＳＭＴＬＫＫＳＳＮＳ
ＨＴＱＰＲＳＫＶＡＹＣ

【００９０】実施例１４ 本発明によるウイルスＭｖＰ５１８０またはそれにより
導かれる抗原を用いれば、通常のＨＩＶ−１＋２スクリ
ーニングテストを用いたのでは把握できないような血清
もＨＩＶ−１として陽性に検出できることを示すため
に、カメルーンからの患者の様々な血清を検査した。

【００９１】カメルーンでの研究において１５６の抗−
ＨＩＶ−１−陽性血清が検査された。二つのこれらの血
清において、相当な、診断上重要な相違が認められた。
次の第１２表に吸光度測定値を記す。ＣＡＭ−Ａまたは
ＣＡＭ−Ｂは異なる患者の血清を表わしている。

【００９２】

【表１９】

【００９３】両テストのカットオフ値は０.３００であ
った。カメルーンからの４７の抗−ＨＩＶ−１陽性血清
を用いたもう一つの研究において二つの血清が特に目立
った。そのうちの一つ（９３−１０００）はわずかに症
候を示す患者、もう一つ（９３−１００１）はエイズ病
患者に由来する。次の第１３表において、両ＥＩＡテス
トの吸光度値を相互に比較する：

【００９４】

【表２０】

【００９５】この場合にもカットオフ値は０.３であっ
た。患者９３−１００１の吸光度値は、通常のＨＩＶ−
１＋ＨＩＶ−２ ＥＩＡでは失敗し得るのに対し本発明
による抗原を適用することにより明瞭な検出が可能であ
ることを示している。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＨＩＶ型レトロウイルスのゲノム配置概略図。

【図２】ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＭＶＰ−５１８０ウ
イルスの希釈液について市販テストキットを用いた抗原
抗体反応により得られる吸光度と逆転写酵素活性の関係
図。

【図３】ＭＶＰ−５１８０およびＭＶＰ−８９９ウイル
スのウェスターンブロット図。

【図４】ＨＩＶ５１８０の遺伝子のＰＣＲ増幅、クロー
ニングおよび配列決定の手法図。

【図５】ＰＣＲ法により得られたＭＶＰ−５１８０のＤ
ＮＡ配列と第７表に示されたＤＮＡ配列の比較図。

【図６】ＰＣＲ法により得られたＭＶＰ−５１８０のＤ
ＮＡ配列と第７表に示されたＤＮＡ配列の図５に続く比
較図。

【図７】ＰＣＲ法により得られたＭＶＰ−５１８０のＤ
ＮＡ配列と第７表に示されたＤＮＡ配列の図６に続く比
較図。

【図８】ｇａｇタンパク質の比較図（一つは第７表に従
って（各々上列）、一つはＰＣＲ法で（各々下列）確
認）。

【図９】ＨＩＶ−１（ＬＡＩ）、ＨＩＶ５１８０および
ＨＩＶ−２（ＲＯＤ）のＶ３−シュラウフェを示す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/49 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｈ 9015−2Ｊ // Ｃ０７Ｋ 7/10 8318−4Ｈ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ Ｃ０７Ｋ 99:00 (31)優先権主張番号 Ｐ４３１８１８６：４ (32)優先日 1993年６月１日 (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (72)発明者 ヨーゼフ・エーベルレ ドイツ連邦共和国85356フライジング．ゾ ネンシユトラーセ７ツエー (72)発明者 アルブレヒト・フアウ・ブルン ドイツ連邦共和国86154アウクスブルク. シユーマンシユトラーセ17 (72)発明者 シユテフアン・クナプ ドイツ連邦共和国35041マルブルク−ヴエ ールスハウゼン．ヴエールスホイザーシユ トラーセ６ (72)発明者 ハンス−ペーター・ハウザー ドイツ連邦共和国35037マルブルク．ヴア ンコプフシユトラーセ12

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 European Collection of Animal Cell C
   ultures（ECACC）にNo．Ｖ ９２０ ９２ ３１８の番号
   で寄託されたＭＶＰ−５１８０／９１なる呼称を有する
   レトロウイルスの本質的な形態学的および免疫学的性質
   を示すＨＩＶグループの免疫不全ウイルスまたはこのウ
   イルスの変異株。
2. 【請求項２】 ウェスターンブロットにおいて、ＨＩＶ
   −１および／またはＨＩＶ−２の相当するバンドよりも
   ３〜７キロダルトン小さい逆転写酵素に相当するタンパ
   ク質バンドを示すことを特徴とする請求項１記載の免疫
   不全ウイルス。
3. 【請求項３】 このレトロウイルスがタンパク質ｐ２４
   に対して指向されたモノクローナル抗体に対し、逆転写
   酵素活性に関してＨＩＶ−１ウイルスよりも低い反応性
   を、また逆転写酵素活性に関してＨＩＶ−２ウイルスよ
   りも高い活性を示すことを特徴とする請求項１または２
   記載の免疫不全ウイルス。
4. 【請求項４】 そのトランスメンブレンタンパク質ｇｐ
   ４１により、アフリカに由来する患者の血清に対し抗原
   抗体反応を十分検出できること、そしてそのｇｐ４１に
   より、ドイツに由来する患者の血清に対し抗原抗体反応
   をほんのわずかしかあるいは全く検出できないことを特
   徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の免疫不全ウイ
   ルス。
5. 【請求項５】 寄託されたウイルスのＲＮＡに対し、全
   ゲノム基準で約７５％またはそれ以上相同であるＲＮＡ
   配列を示すことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに
   記載の免疫不全ウイルス。
6. 【請求項６】 第１表のＲＮＡ配列に対し少なくとも７
   ５％相同するＲＮＡ配列を示すことを特徴とする請求項
   １〜５のいずれかに記載の免疫不全ウイルス。
7. 【請求項７】 第３表の配列またはその部分に対し少な
   くとも７５％相同であるヌクレオチド配列を示すことを
   特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の免疫不全ウ
   イルス。
8. 【請求項８】 配列の部分が少なくとも５０ヌクレオチ
   ド長であることを特徴とする請求項７記載の免疫不全ウ
   イルス。
9. 【請求項９】 第７表に相当するまたはこの配列に相同
   である配列または部分配列を示し、その際第７表に記載
   の配列に対する相違が遺伝子座基準で高々次のとおり、
   すなわち ＬＴＲ：１７％；ＧＡＧ：２９％；ＰＯＬ：２５％； ＶＩＦ：３１％；ＥＮＶ：４６％；ＮＥＦ：１６％ であることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載
   の免疫不全ウイルス。
10. 【請求項１０】 第７表に相当するまたはこの配列に相
    同である配列または部分配列を示し、その際第７表に記
    載の配列に対する相違が遺伝子座基準で高々次のとお
    り、すなわち ＬＴＲ：１０％；ＧＡＧ：１４％；ＰＯＬ：１２％； ＶＩＦ：１５％；ＥＮＶ：２２％；ＮＥＦ：１０％ であることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載
    の免疫不全ウイルス。
11. 【請求項１１】 European Collection of Animal Cell
    Cultures（ECACC）にNo. Ｖ９２０ ９２ ３１８の番号
    で寄託された免疫不全ウイルスＭＶＰ−５１８０／９１
    または請求項１〜１０のいずれかに記載のウイルスのＲ
    ＮＡまたはその部分に対し相補的であるｃＤＮＡ。
12. 【請求項１２】 請求項１１記載のｃＤＮＡを含むこと
    を特徴とする組換えＤＮＡ。
13. 【請求項１３】 請求項１１記載のｃＤＮＡまたは請求
    項１２記載の組換えＤＮＡを用いて調製された、または
    そのｃＤＮＡから導くことができるアミノ酸構造を用い
    て調製された抗原。
14. 【請求項１４】 タンパク質またはペプチドであること
    を特徴とする請求項１３記載の抗原。
15. 【請求項１５】 第３表またはその部分配列に相当する
    アミノ酸配列を示すことを特徴とする請求項１３または
    １４記載の抗原。
16. 【請求項１６】 部分配列が少なくとも１０個のアミノ
    酸を示すことを特徴とする請求項１５記載の抗原。
17. 【請求項１７】 アミノ酸配列ＲＬＱＡＬＥＴＬＩＱＮ
    ＱＱＲＬＮＬＷＧＣＫＧＫＬＩＣＹＴＳＶＫＷＮＴＳま
    たは少なくとも６個の連続するアミノ酸を有するその部
    分配列を示すことを特徴とする請求項１５記載の抗原。
18. 【請求項１８】 請求項１〜１０のいずれかに記載の免
    疫不全ウイルスから調製された抗原。
19. 【請求項１９】 組換えにより調製されたことを特徴と
    する請求項１３〜１８のいずれかに記載の抗原。
20. 【請求項２０】 合成により調製されたことを特徴とす
    る請求項１３〜１７のいずれかに記載の抗原。
21. 【請求項２１】 請求項１３〜２０のいずれかに記載の
    抗原が適用されることを特徴とする免疫不全病因ウイル
    スに対する抗体を検出するためのテストキット。
22. 【請求項２２】 ウェスターンブロットであることを特
    徴とする請求項２１記載のテストキット。
23. 【請求項２３】 ＥＬＩＳＡテストであるかまたは蛍光
    抗体検出テストであることを特徴とする請求項２１記載
    のテストキット。
24. 【請求項２４】 請求項１〜１０のいずれかに記載の免
    疫不全ウイルスおよび／または請求項１１または１２記
    載のｃＤＮＡおよび／または請求項１３〜２０のいずれ
    かに記載の抗原の、免疫不全の原因となるレトロウイル
    スの検出のための使用方法。
25. 【請求項２５】 請求項１〜１０のいずれかに記載のレ
    トロウイルス、または請求項１１または１２記載のｃＤ
    ＮＡおよび／または請求項１３〜２０のいずれかに記載
    の抗原の、接種素の調製のための使用方法。
26. 【請求項２６】 請求項１〜１０のいずれかに記載の免
    疫不全ウイルスをコードすることを特徴とするリボ核
    酸。