[go: up one dir, main page]

JPH06222058A - 三座共役体、その製造方法及びその使用方法 - Google Patents

三座共役体、その製造方法及びその使用方法

Info

Publication number
JPH06222058A
JPH06222058A JP4225325A JP22532592A JPH06222058A JP H06222058 A JPH06222058 A JP H06222058A JP 4225325 A JP4225325 A JP 4225325A JP 22532592 A JP22532592 A JP 22532592A JP H06222058 A JPH06222058 A JP H06222058A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
tridentate
conjugate
group
tridentate conjugate
analyte
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP4225325A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2627124B2 (ja
Inventor
Chan S Oh
エス オー チャン
James C Sternberg
シー スターンバーグ ジェイムズ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SmithKline Beecham Corp
Original Assignee
SmithKline Beecham Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SmithKline Beecham Corp filed Critical SmithKline Beecham Corp
Publication of JPH06222058A publication Critical patent/JPH06222058A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP2627124B2 publication Critical patent/JP2627124B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/537—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody
    • G01N33/539—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody involving precipitating reagent, e.g. ammonium sulfate
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/964—Chemistry: molecular biology and microbiology including enzyme-ligand conjugate production, e.g. reducing rate of nonproductive linkage
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/819—Multifunctional antigen or antibody
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
    • Y10S530/815—Carrier is a synthetic polymer
    • Y10S530/816—Attached to the carrier via a bridging agent

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Crystals, And After-Treatments Of Crystals (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ハプテン、薬剤等を簡便に検定することがで
き、化学的に安定な共役体、その製造方法及びそれを用
いた免疫検定方法を提供する。 【構成】 互いに適切なスペーサー基を通じて結合し
た、少なくとも２つは巨大分子と相互作用することがで
きる低分子である三座体メンバーを持つ三座共役体、そ
の製造方法及びその使用方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は免疫検定に用いる共役体
に関する。さらに詳しくは本発明は、競争免疫検定及び
モジュレート免疫検定などに用いる新規な三座共役体、
その製造方法及びそれを用いた検定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決使用とする課題】
１．特異結合検定 免疫化学的又はその他の形式の特異結合反応の測定方法
は近年医学試験の分野において広く受け入れられるよう
になってきた。一般的に言えば、免疫化学反応には少な
くとも一つの抗原と少なくとも一つの抗体の間の反応が
含まれる。抗原は通常動物又はヒトの体内へ取り入れら
れた時免疫応答、すなわち、抗体生成を誘発することが
できるタンパク質又は炭水化物などの物質である。免疫
応答の結果として生成する抗体は本質的に二価であり、
通常「Ｙ」として描写され、「Ｙ」の各々の腕（アー
ム）は抗体の生成を誘発した抗原と結合することができ
る。患者の試験試料中に特殊な抗原又は抗体が存在する
ことは或る病状又は肉体的な状態、例えば妊娠を示す。
免疫化学反応は特殊な結合反応の一形式である。抗体の
フラグメント(fragment)はしばしば免疫検定においてそ
のままの抗体に添加して使用されるか又はそれらの代り
に使用される。一般に抗体のフラグメントには異なった
３種のタイプがある。フラグメントの第１のタイプはＦ
ａｂ又はＦ（ａｂ）として示されるが、これは通常酵素
パパインによる消化によってそのままの抗体から直接開
裂された抗体の１本の腕である。各Ｆａｂフラグメント
は一価であり、その分子量はそのままの抗体が約１５
０，０００ダルトンであるのに対し約５０，０００ダル
トンである。フラグメントの第２のタイプはＦ（ａｂ
´）2 として示され、これはなお互いに連結した抗体の
両方の腕からなっているが尾部はペプシン消化によって
除去されて存在しない。二価のＦ（ａｂ´）2 フラグメ
ントは約１００，０００ダルトンの分子量を有してお
り、さらに２個の一価Ｆａｂ´フラグメント（抗体フラ
グメントの第３のタイプ）に開裂されることができる
が、それはまたそれぞれＦ（ａｂ´）として示され約５
０，０００ダルトンの分子量を有している。
【０００３】抗体の腕が結合する抗原の部位はエピトー
プ（抗体決定基）と呼ばれる。大部分の抗原は多エピト
ープ性であり、抗体に対する多重の、かつしばしば繰り
返しの結合部位を有している。免疫検定において、ほか
に免疫複合体として知られる大きさの異なった大きな抗
体ー抗原複合体の形成を可能ならしめるのは抗原の多エ
ピトープ性及びＦ（ａｂ´）2 を含めた抗体の二価性で
ある。この特徴の利点を用いた特殊な形式の免疫検定は
三成分免疫複合体が形成されるサンドイッチ免疫検定で
ある。最も一般的な形式のサンドイッチ免疫検定では通
常固体の支持体に結合させた第１の不溶化抗体及び第２
の標識抗体を用いる。各抗体は関心とする抗原（すなわ
ち、測定すべき被検出体(analyte) ）に対して特異的で
あり、抗原上の異ったエピトープと結合する。好ましく
は、第１の抗体は第２の抗体が結合するエピトープから
離れたエピトープと結合する。不溶性の抗体：抗原：標
識抗体の三成分複合体は関心とする抗原が第１及び第２
の抗体と接触した場所で形成される。各抗体はただ１個
の抗原と結合することが要求されるから、抗体の３タイ
プのフラグメント全てがこの種の方法において使用する
ことができよう。関心とする抗原の存否が固体支持体上
の標識抗体の存否によって示される。通常、反応の不溶
解化相は結合又は遊離の標識抗体のどちらかを定量する
ため液相から分離されねばならない。このような反応は
分離段階が必要とされるので不均質タイプの反応と称さ
れる。
【０００４】ネフェロ分析及びタービジティ分析は例え
ば抗体及び抗原の大凝集体の形成を必要とする。各抗体
は２種の異った抗原分子と結合しなければならないから
一価のＦａｂ及びＦａｂ´フラグメントは一般的にこの
方法には有効ではない。大凝集体は溶液の光散乱に変化
をもたらし、ネフェロ分析及びタービジティ分析の方法
によって測定することができる。これらの方法は形成さ
れた複合体を検知するのに酵素、放射性同位元素、蛍光
性又は化学発光性化合物のような従来の標識を必要とし
ない。むしろネフェロ分析法及びタービジティ分析法は
直接複合体の量を測定する。分離段階を必要としないか
らネフェロ分析及びタービジティ分析は均質免疫検定と
称される。抗原は多重エピトープ性であり、抗体は二価
であるので存在する抗原及び／又は抗体の量に応じて光
を散乱させるのに十分大きな抗原：抗体複合体の形成を
可能にする。通常、患者の血液、血清、脳脊髄液（ＣＳ
Ｆ）又は尿試料などから得られる所定量の抗原とともに
過剰量の抗体が使用される。このような場合、試料中に
存在する抗原の量は形成される抗原：抗体凝集体の量及
び大きさを決定する上での制限因子となるであろう。
【０００５】タービジティ分析においては粒子又は凝集
体の懸濁液を通過する光の減少程度を測定する。その減
少は凝集体による光の反射、散乱及び吸収により生じ
る。ネフェロ分析で測定されるのは光の直接的な通路で
ない場所に置かれた検知器に入る散乱光又は反射光であ
る。タービジティ分析及びネフェロ分析においてはとも
に光散乱の変化率（レート）はまた存在する抗原の量の
指示値として測定される。ネフェロ分析法は初期段階に
おける抗原：抗体反応を複合体が溶液から免疫沈殿物と
して分離する前に光を散乱させることができるものとし
て成長していく速度を検知することにより監視する簡便
な方法となってきた。これら複合体の生成は究極的には
「散乱センター」として機能するのに十分な大きさとな
る凝集体が作られることに始まる。ステーンベルグ ジ
ェー シー、「免疫沈殿反応による特異タンパク質測定
用速度ネフェロ分析」、クリニカル・ケミストリー２
３：８1456 - 1464 （１９７７）。散乱センターの形成
は水の多くの部分を排除することによってタンパク質ー
タンパク質の相互作用の確率を高めるデキストラン又は
ポリエチレングリコールのような親水性非イオン重合体
の使用により促進することができる。免疫ネフェロ分析
検定における重合体の使用はまた感度を高め抗血清消費
を少なくするという利点がある。
【０００６】２．ハプテン用ネフェロ分析阻害免疫検定 ハプテンは免疫検定において独特の問題を有している。
ハプテンは比較的小さい一価の分子であり、時には不完
全又はフラグメント化抗原とみなされる。ハプテンの共
通の分類は薬剤である。例えば、テオフィリンはこのハ
プテンのサブクラス(subclass)である。ハプテンはそれ
自身ではヒト又は動物の体内で免疫応答を誘発すること
はできないが、これはハプテンが一般的に小さすぎて体
内の免疫系によって認知されないからである。しかしな
がら、タンパク質のような担体と結合した時、ハプテ
ン：担体タンパク質共役体は抗体生成を誘発するのに十
分大きい抗原として作用する。この方法でハプテンに対
抗した抗体を作ることができる。しかし、小さいハプテ
ン分子は比較的大きい抗原と異なりそれ自身は多重エピ
トーク性ではない。このためハプテンはハプテンに対抗
して作られた抗体で大きい複合体ないし凝集体を形成す
ることはできない。従って、治療医薬監視用などのネフ
ェロ分析又はタービジティ分析でハプテン検定を遂行す
るためハプテンが複合体形成阻害剤として作用するネフ
ェロ分析阻害免疫検定法（ＮＩＩＡ）が開発された。伝
統的なＮＩＩＡにおいて「顕色剤抗原」(developer ant
igen) として知られる第２の共役体が検知可能な光散乱
を生じさせるのに十分な大きさの複合体を顕色するため
用いられる。顕色剤抗原はハプテン分子の多重性部に共
役した通常タンパク質である第２担体から形成される。
このようにして顕色剤抗原は１個以上の抗体分子ととも
に凝集して究極的に光散乱センターとなることができる
「多価ハプテン」として作用する。第２担体タンパク質
は時々「標識」と呼ばれる。患者の試験試料中に存在す
る一価の遊離ハプテンは抗体分子の腕の一方又は両方に
結合することによって顕色剤抗原：抗体複合体形成量を
阻害し、そのため複合体形成が減少し、光散乱量が低下
する。阻害免疫検定の本質上、光散乱において検知され
た増加量及び増加速度はともに患者の試料中に存在する
ハプテンの量に反比例する。
【０００７】タービジティ分析及びネフェロ分析阻害免
疫検定の従来技術においていくつかの問題点が生じてい
た。その一つの問題点は顕色剤抗原試薬に関連してい
る。伝統的な顕色剤抗原は一般に不安定で特殊な貯蔵条
件を必要とする。特殊な貯蔵条件の必要性は顕色剤抗原
の担体タンパク質が天然のタンパク質系物質であり、貯
蔵中同様製造中にも比較的迅速に分解するという事実か
ら生じている。室温において典型的な顕色剤抗原は約８
時間の寿命しか期待できない。冷凍温度においてさえも
大部分の顕色剤抗原は約６か月の貯蔵寿命しか示さな
い。このことは製造及び配送の問題に大きく関与し、こ
の種製品のコストを高める。さらに、顕色剤抗原用担体
タンパク質が天然資源から作られるものであるためこれ
らタンパク質の品質に相当の変動がある。伝統的な顕色
剤抗原試薬は均一な反応性を確保するため注意深く調製
し、精製し、特性化しなければならない。特性化工程は
従来技術の顕色剤抗原の製造に関し最も経費のかかるも
のである。
【０００８】従来技術のＮＩＩＡ法はサンドイッチ免疫
検定のような他の形式の免疫検定に比較して制限された
感度しか有していない。この感度制限は第一に血清試料
の他の成分によって生じる散乱の結果である。この理由
のため、試験試料はＮＩＩＡの反応媒質に添加する前に
相当希釈されねばならず、それによって反応媒質中の被
検出体の濃度が希釈される。サンドイッチ免疫検定のよ
うな他の形式の免疫検定においては、典型的に約１００
−２００μｌの試料が反応媒質へ添加される。これと対
象的に普通約１−３μｌの試料のみがＮＩＩＡ用反応媒
質中へ注入される。感度改善のために提案された方法と
して米国特許第４，６０４，３６５号に開示された顕色
剤抗原に対するハプテン：担体の比を最適化することが
ある。高い及び低いハプテン：担体比は中間の比におい
て感度改善が観察されるのに対し中程度の感度となるこ
とが報告されている。しかしながら、この方法は時間が
かかり、ＮＩＩＡ感度の顕著な上昇はもたらさない。従
来技術のＮＩＩＡ法において遭遇するもう一つの問題に
は「非生産結合」として知られる現象がある。非生産結
合は、例えば、同一抗原の２本の結合腕が同一顕色剤抗
原の２個のハブテン部分と結合する場合である。このよ
うな例の場合他の顕色剤抗原と結合する抗体上の遊離の
腕がなくなるから他の顕色剤抗原との架橋結合が存在し
なくなる。その結果高価な抗体及び顕色剤抗原試薬が十
分使用されないことになる。均質タービジ分析及びネフ
ェロ分析抑制免疫検定法は容易かつ簡便なものであるか
ら、一貫した特性を有するように容易に製造することが
でき、室温で長い貯蔵寿命を示す安定な顕色剤抗原を入
手することは有利である。また、ＮＩＩＡの感度を改善
し、非生産結合の発生を減少させることも有利であろ
う。
【０００９】３．従来技術の二官能共役体 従来技術には数種の低分子二官能共役体(bifunctional
conjugate)が存在する。ここで「低分子二官能共役体」
の意味することはスペーサー基(spacer moiety) を通じ
て連結している２個の低分子を有する共役体である。ス
ペーサー基はただ１つの化学結合（例えば、スペーサー
に１つの原子もない）からなるような非常に小さいもの
であってもよい。一般に、これらの分子の大きさは約
７，０００ダルトン以下である。両方の分子は低分子配
位子として作用し、それ自体がおのおの低分子に対し特
異結合親和性を有する物質、すなわち、それの特異結合
パートナーと相互作用することができる。この定義にお
いて１個以上の大分子を有する共役体及び／又は特異結
合パートナーを持たない１個以上の化学基を有する共役
体は含まれない。例えば、サンドイッチ免疫検定におけ
る典型的な酵素標識抗体は二つの理由、すなわち、抗体
部分が一般に約１５０，０００ダルトンを越える大きさ
の巨大分子であること及び酵素基が基質上に作用するけ
れども一般にその基質に対する特異結合パートナーであ
ると考えられていないことの理由により含まれない。ま
た、２個の低分子配位子というよりも２個の化学的反応
基を共役体の各末端に１個ずつ有するヘテロ二官能架橋
剤も含まれない。従来技術に存在する小分子二官能共役
体は２種類ある。その第一の種類の共役体はホモ二官能
共役体として知られており、共役体の各末端に同一の化
学基を有している。ホモ二官能共役体は一般におのおの
の化学基と相互作用する同一の特異結合パートナーと結
合するように設計されている。特異結合パートナーが多
価であれば巨大な凝集体が形成されよう。
【００１０】例えば、酵素の沈殿剤としてＢｉｓ−ＮＡ
Ｄホモ二官能共役体が提案されている。ラールソン ピ
ー、モスバック ケー「酵素の親和沈殿物」エルセビエ
ル／ノースオランダ・バイオメディカル・プレス、９８
（２）、３３３−３３０（１９７９）。１７Åのスペー
サー基で分離されている２個のＮＡＤからなるＢｉｓ−
ＮＡＤ共役体は乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）をそれぞれの
Ｂｉｓ−ＮＡＤ末端でＬＤＨの大分子と特に結合するこ
とによって溶液から沈殿させることができる。ＬＤＨの
大分子のそれぞれはＮＡＤに対する多数の結合部位を有
しているからネフェロ分析で形成されるのと同等の大凝
集体が得られる。これらの大凝集体は酵素を伴って溶液
から沈殿析出する。スペーサー基を変えたＢｉｓ−ヌク
レオチドの同様な使用も提案されている。従来技術にお
いて応用されているその他のホモ二官能共役体の例はア
ビジンの構造試験に使用されているＢｉｓ−ビオチン共
役体である。グリーン エヌ エム、コニズニイ エ
ル、トムスイー ジェー、バレンチン アール シー
「アビジン中のサブユニットの配列決定における二官能
ビオチン化合物の使用」バイオケミストリー１２５、７
８１−７９１（１９７１）。Ｂｉｓ−ビオチン共役体の
２個のビオチン基が約１．８Åのスペーサー基で接合さ
れた場合、強力な複合体ないし高分子が多価巨大分子ア
ビジンとの間で形成された。
【００１１】従来技術の低分子二官能共役体の第二の種
類はヘテロ二官能共役体である。ホモ二官能共役体と対
象的にヘテロ二官能共役体は共役体の各末端で異なった
化学基を有している。これらの各化学基は異なった特異
結合パートナーと相互作用することができる。これら従
来技術のヘテロ二官能共役体は特異結合パートナーの化
学基との結合が対応する特異結合パートナーが同時に他
の化学基と結合するのを阻害又は除外する場合のモジュ
レーターとして専ら使用されてきた。ヘテロ二官能共役
体の両方の末端での同時結合はホモ二官能共役体が上記
の様に使用されるところで所望の同時結合を行うために
必要とされるのよりも短いスペーサー基を使用すること
によって一般に生じる立体障害によって阻止される。換
言すれば巨大分子特異結合パートナーの共役体のモジュ
レーター基との結合が特異結合パートナーの信号発生原
因となる化学基との結合を立体的に阻害する。従来技術
のヘテロ二官能共役体は一般的にその共役体の化学基の
一つとして関心とする低分子配位子、通常被検出体を用
いる。この化学基はある限定量の被検出体の特異結合パ
ートナーに対し試料からのようなフリーの被検出体と競
争することができる。ヘテロ二官能共役体の他の化学基
は酵素モジュレーター又は酵素の補欠分子団又は他の補
因子のような「代理(surrogate)」標識である。代理標識
は指示標識、通常は酵素の活性をモジュレート(modulat
e)する。この種の従来技術ヘテロ二官能共役体は酵素の
活性度が直接抗原：抗体反応によって影響されるから一
般的に均質酵素免疫検定用のものである。フリーの酵素
に起因する活性度に対する結合酵素に起因する酵素活性
度の量を測定するには均質酵素免疫検定の場合同様分離
段階は必要でない。
【００１２】酵素モジュレート免疫検定は低分子配位
子：酵素モジュレーターヘテロ二官能共役体の指示酵素
の活性度に影響する能力に基くものである。例えば、大
型の代理標識つき共役体も開示している米国特許第４，
１３４，７９２号参照。この例においては配位子基と酵
素モジュレーター基との間のスペーサー基は比較的短
く、好ましくはその長さは炭素原子数又はヘテロ原子数
で１〜１０、すなわち、約１．３〜１４．０Åである。
低分子配位子：酵素モジュレーターヘテロ二官能共役体
は所定量の抗体に対し試料からの配位子と競争する。も
し低分子配位子：酵素モジュレーターヘテロ二官能共役
体が共役体の配位子基を通じ抗体と結合していれば、酵
素モジュレーターは指示酵素の活性度に作用することは
できない。指示酵素の酵素活性度を増大又は減少させる
モジュレーターを使用することができ、酵素活性度を減
少させるモジュレーター、すなわち、酵素阻害剤が最も
一般的に使用される。阻害モジュレーターを用いる検定
では観察される酵素活性度は被検出体の濃度に逆比例す
る。
【００１３】同様形式の均質酵素免疫検定は低分子配位
子：酵素モジュレーターヘテロ二官能共役体の使用に基
いている。広義では、酵素補因子は陽性酵素モジュレー
ター、すなわち、酵素活性度を増大させるモジュレータ
ーとして作動する。一般に酵素は２つのグループ、すな
わち、（１）酵素的活性が全くその酵素のタンパク質の
性質によるもの、（２）最適酵素活性度が補因子と呼ば
れる熱安定性の非タンパク質構造によるものに分けられ
る。この第２のグループの酵素を用いる免疫検定は低分
子配位子：酵素モジュレーターヘテロ二官能共役体の使
用を通じてそれ自身をモジュレートするものである。補
因子の本質は簡単な無機イオンからより複雑な有機物質
まで変化するが、その多くはビオチン及びフラビンアデ
ニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）のようなビタミン誘導体
である。有機補因子はしばしば補酵素と呼ばれる。或る
場合、典型的には補欠分子団(prosthetic group)を用い
る場合、補因子は親酵素（個別的にはアポ酵素として知
られる）のタンパク質基と通常は共有結合により固く結
合している。古典的な酵素学では完全な酵素的活性酵
素：補因子複合体はホロ酵素と呼ばれる。
【００１４】ＦＡＤ、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭ
Ｎ）又はヘムなどの或る種の補因子の残基は、例えば、
低分子配位子：酵素補欠分子団ヘテロ二官能共役体に用
いる特に良好な酵素補欠分子団となる。例えば、大型の
代理標識つき共役体も開示している米国特許第４，２３
８，５６５号参照。この例においては配位子基と酵素補
欠分子団基との間のスペーサー基の長さは炭素原子数１
４未満で、より一般的には炭素原子数１〜６又はヘテロ
原子数で０〜５、すなわち、約１．３〜１４．０Åであ
る。米国特許第４，２３８，５６５号によれば、配位
子：補欠分子団ヘテロ二官能共役体（例えば配位子：Ｆ
ＡＤ）は所定量の抗体に対し試料からの配位子と競争す
る。もし配位子：ＦＡＤ複合体が抗体によって結合して
いれば、アポ酵素と結合して酵素的に活性なホロ酵素を
形成することはもはやできない。観察される酵素活性度
は試験試料中に存在する被検出体の濃度に直接関連す
る。
【００１５】このヘテロ二官能共役体を用いるモジュレ
ーターの一つの例外はカラムクロマトグラフィー精製の
分野である。その物質を含有する溶液をクロマトグラフ
ィーカラムの中を２方のうち１方を通過させることによ
って物質を精製することができる。精製の一つの方法で
はカラムは溶液の特定の不純物と特異的結合もしくはそ
れを引き付ける基を付着含有している。別の精製方法で
は精製すべき物質と特異的結合する基をカラム上に固定
化している。これらの基は所望の物質を溶液から引き取
る。後者の場合、物質は後でカラムから溶出せねばなら
ない。一般の配位子親和性クロマトグラフィーは後者の
方式に準じ、単一の固定化配位子が脱水素酵素又はキナ
ーゼなどの酵素のファミリーを遊離酵素で吸収し、次い
で生物特定溶出に適した条件下で溶出することができる
という原理に基いている。一般的な配位子としてはしば
しば補因子又は補因子フラグメントが用いられる。
【００１６】不溶化低分子ヘテロ二官能共役体ＡＭＰ−
ＡＴＰが一般の配位子親和性クロマトグラフィー用に提
案されている。リー シーワイ、ラールソン ピー オ
ー、モスバック ケー「二官能ジヌクレオチドＡＭＰ−
ＡＴＰの合成及びその一般配位子親和性クロマトグラフ
ィーにおける応用」ジャーナル・オブ・ソリッドフェー
ス・バイオケミストリー、２（１）、３１−３９（１９
７７）。ＡＴＰ基（キナーゼに対し特異的）はセファロ
ース（商標）４Ｂ（架橋アガロースゲル、スェーデン、
ウプサラ、ファーマシア製）カラムに予め結合させたＡ
ＭＰ基（脱水素酵素に対し特異的）を通じて結合してあ
る。ＡＴＰ基及びＡＭＰ基は両者がＡＭＰ基を通じてセ
ファロースカラムに結合されていてもそれぞれキナーゼ
及び脱水素酵素に対する親和性挙動を保持していると報
告されている。溶解性のＡＭＰ−ＡＴＰジヌクレオチド
を調製する試みは不成功であった。Ｉｄ．これら従来技
術の二官能共役体のうちネフェロ分析及びタービジティ
分析検定法に応用されたものは一つもなかった。さら
に、これら従来技術の二官能共役体は例えば三官能共役
体で達成できるような融通性及び感度に欠けている。例
えば、低分子ヘテロ二官能共役体はそれ自体がそのよう
な共役体によってモジュレートされる或る種の検定にの
み応用が限定されているけれども、低分子ホモ二官能共
役体は同じ分子と結合するためにのみ有用である。多く
の種類の免疫検定においてモジュレーション機能を果た
すとともに同じでない高分子を凝集することができる三
官能共役体を入手することは有利であろう。
【００１７】 ４．アビジン及びビオチンの免疫検定における使用 アビジン及びビオチンはともに天然に存在する化合物で
ある。アビジンは比較的大きい巨大分子であり、卵白中
に見出される。アビジンは４種のサブユニットを含有し
ている。ビオチンは比較的小さく安定な水溶性ビタミン
である。アビジン分子の４種のサブユニットの各々はビ
オチンの分子に特異的に結合することができる。アビジ
ンとビオチンの結合反応は非常に強く、結合定数は約１
０15Ｌ／モルである。この結合は非常に強く、ビオチン
がそのカルボキシル基によって他の分子と共役した場合
又はアビジンが他の分子に付着結合した場合でさえも持
続することが発見された。ビオチンが他の分子と共役し
た場合、その結果の共役体は通常ビオチニル化化合物、
例えばビオチニル化タンパク質と呼ばれる。例えば、ビ
オチニル化タンパク質は迅速に対応するアビジン付着結
合分子と強力に結合することになる。このビオチニル化
化合物のアビジン共役体と結合する特徴は、成功度合い
に変動はあったが、主として不均質免疫検定に用いられ
てきた。そのような応用のうち２件がサンドイッチ免疫
検定に関係している。その１つの例においてアビジン：
ビオチン結合がサンドイッチの標識端で用いられる。こ
れは米国特許第４，２２８，２３７号に見られ、ここで
は測定すべき配位子の特異結合パートナーをビオチニル
化し、酵素標識アビジンとの共役に用いている。もう１
つの例においてはビオチン：アビジン結合がサンドイッ
チ免疫検定で形成されるサンドイッチの不溶化末端で使
用できる。例えば、米国特許第４，２９８，６８５号は
標識つきサンドイッチが溶液中で形成された後通常添加
される不溶化アビジンの使用を教示している。サンドイ
ッチの標識付けされない抗体が予めビオチンで標識付け
された場合、不溶化アビジンは溶液から標識つきサンド
イッチを捕獲することができる。これらの用途はネフェ
ロ分析又はタービジティ分析に応用できない。さらに、
試薬の調製に必要な追加共役段階はそのような方法を経
済的により魅力の無いものとする。
【００１８】アビジンはまた上述の低分子配位子：酵素
モジュレーターヘテロ二官能共役体と同様な方法で用い
られる大型の代理標識つき共役体の酵素モジュレーター
標識成分として均質免疫検定に用いられてきた。アビジ
ンはピルビン酸カルボキシラーゼのようなビオチン含有
酵素の天然阻害剤である。これら酵素のビオチン基がア
ビジンと連結、すなわち、複合化すると酵素活性は停止
ないし減少する。これはビオチンがこれら酵素に必要な
補因子であり、ビオチン基が補因子として機能出来なく
なる場合酵素活性が阻害されるからである。従ってアビ
ジンは基質上に作用させるとある種の均質免疫検定シス
テムにおいて測定し得る信号が得られるビオチン含有酵
素の活性をモジュレートないし制御できる能力によって
モジュレーター標識として使用することができる。米国
特許第４，５５０，０７５号は均質免疫検定に使用する
大型の標識つき共役体のモジュレーター標識成分として
のアビジンを開示している。米国特許第４，５５０，０
７５号の標識つき共役体は大部分のモジュレーター標
識、すなわち、酵素阻害剤よりもかなり大きい約６３，
０００ダルトンというアビジンの大分子サイズの利点を
利用している。このことはアビジンが大型代理標識つき
共役体について典型的に遭遇する立体障害問題を緩和す
ることを可能にする。例えば、低分子配位子：酵素モジ
ュレーターヘテロ二官能共役体が使用される場合、比較
的小型の典型的な低分子量酵素モジュレーターはその共
役体の配位子部分のそれに対比し得るものであり、それ
ゆえモジュレーターは検定において有効に機能すること
ができる。しかしながら、配位子が抗原でである場合の
ように配位子が通常の酵素モジュレーターよりも非常に
大きい場合、典型的な酵素モジュレーターは配位子の大
きさによって阻害され、モジュレーター標識の活性度は
配位子成分による特異結合パートナーとの結合が存在し
なくても立体的に阻害される。
【００１９】この立体障害問題は前述の米国特許第４，
２３８，５６５号で或る程度取り上げられており、配位
子が比較的分子量が大きい分子の場合若干長いスペーサ
ー基を用いることが提案されている。どの場合でもスペ
ーサー基はその長さが炭素原子数約１４及びヘテロ原子
数０−５を越えない。目標は立体障害が共役体の配位子
基がその特異結合パートナーと結合しているときにのみ
起き、その共役体の配位子基が遊離状態の時にのみ起き
ないことにある。これに反し、米国特許第４，５５０，
０７５号では単に抗原のような大配位子が巨大分子酵素
モジュレーターアビジンの活性を立体的に阻害すること
ができないという利点を取り上げている。立体障害は配
位子基がそれの特異結合パートナーと結合した時にのみ
発生する。アビジン：ビオチン結合は高度の特異性及び
結合強度がネフェロ分析及びタービジティ分析操作用と
して好ましく見えるけれどもそれらに使用されなかっ
た。複合体形成におけるアビジン：ビオチンの唯一の使
用は前述のアビジンを凝集させるためのＢｉｓ−ビオチ
ンの使用である。同様に、アビジンは所望の立体障害を
作り出すために使用されなかったが、その代りにモジュ
レート検定に使用される二官能共役体の被検出体のメン
バーが巨大分子抗原である場合に立体障害を避けるため
にも使用された。巨大分子の特異結合パートナーである
アビジンの立体障害誘発能力を、特にＮＩＩＡ検定及び
モジュレート検定に利用することは望ましいことであ
る。
【００２０】５．従来技術の接近検定 標識抗原の標識部分と標識抗体の標識部分が互いに密接
に接近した時両標識間に抗原と抗体間の特異結合反応に
準じた測定可能な相互作用が生じる免疫検定法には従来
技術として数種の方法が存在する。これらの免疫検定は
測定可能な反応を生じ得る前に標識が互いに接近するこ
とが必要であるから「接近検定」と称することができよ
う。接近が関心とする被検出体などの標識抗原又はハプ
テンと標識抗体の結合によって生じた場合、接近した標
識間の相互作用から得られる信号は試験試料中に存在す
る抗原又はハプテンの量に相関させることができる。接
近標識を用いる大部分の検定は発生した信号の量が試料
中に存在する被検出体の量に逆比例する競争検定であ
る。「酵素チャンネル」(enzyme channeling) 検定とし
て知られる接近検定の一つの方式は標識として多酵素複
合体からの酵素対を使用する。多酵素複合体はしばしば
天然に発生し、一連の反応に含まれる２種以上の酵素か
らなっている。換言すれば、一つの酵素生成品が第二の
酵素の基質となる。第二の酵素生成品が第三の酵素の基
質となり、これが続く。酵素チャンネル検定は多酵素複
合体中で次々と作動する２種の酵素を利用する。便宜
上、２種の酵素を第１酵素及び第２酵素と呼ぶことにす
るが、ここに第１酵素は第２酵素の基質として作用す
る。
【００２１】酵素チャンネル検定の１例ではヘキソキナ
ーゼ（ＨＫ）とグルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ
６ＰＤＨ）をそれぞれ第１酵素及び第２酵素として使用
する。リットマン ディー ジェー、ハンロン ティー
エム、ウルマン イー エフ 「酵素チャンネル免疫
検定：新均質酵素免疫検定技術」アナリティカル・バイ
オケミストリー１０６、２２３−２２９（１９８０）。
第１酵素（ＨＫ）は所定量の抗体と関心とする抗原に結
合される。第２酵素（Ｇ６ＰＤＨ）及び関心とする被検
出体と同じか又は類似の抗原はともに結合して細孔ビー
ズとなる。患者の試験試料によりもたらされる遊離抗原
が存在しない場合、抗体と結合したすべての第１酵素が
予め結合した抗原を通じてビーズに結合するような「チ
ャンネル系」が存在する。「未チャンネル系」では第１
酵素がすべて遊離のままで存在する。このことは試験試
料によりもたらされる遊離抗原が十分あって所定量の酵
素標識抗体と結合する抗原に対し非常に効果的に競争す
るので酵素標識抗体のいずれもビーズと結合することが
できない場合に生じる。ビーズと結合した酵素標識抗体
の量は試験試料中に存在する遊離抗原の量の直接関数で
あり、特殊な系で得られるチャンネル化度に相関させる
ことができる。チヤンネル化度もしくは「チャンネル効
率」は通常第２酵素により作られる生成物の量を測定す
ることにより検出される。この生成物は第２酵素がそれ
に密接接近した第１酵素によって作られた生成物に作用
し得る場合にのみ生成される。
【００２２】例えば、ＨＫが第１酵素である場合、その
反応生成物、グルコース−６−リン酸は結合した第２酵
素、Ｇ６ＰＤＨにより作用され、ＨＫ標識抗体もビーズ
に結合する。この例において、グルコース−６−リン酸
はそれが溶液中へ逸出する前にＧ６ＰＤＨがそれに作用
し得るほどＧ６ＰＤＨが部分的に高濃度である接近箇所
内で生成される。その系の「チャンネル効率」は第１酵
素生成物が溶液中へ逸出する前に第２酵素によって転換
された第１酵素生成物の量で、試験試料中に存在する被
検出体の量に逆比例する測定値である。もう１つの形式
の接近検定ではエネルギー転移として知られる現象を利
用する。エネルギー転移接近検定において測定される相
互作用は通常１つの標識から第２の接近配置標識への
光、すなわち、エネルギーの転移によって生じる発光の
変化乃至シフトである。エネルギーがそこから転移する
標識は「供与体標識」と呼ばれ、一方エネルギーそこへ
転移する標識は「受容体標識」と呼ばれる。ある特殊な
エネルギー転移検定は供与体標識として免疫グロブリン
Ｇ（ＩｇＧ）及び環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）などの化学発
光標識生物学的配位子を用い、受容体標識としてそれぞ
れ蛍光標識抗体を利用する。パテル エー、ダビース
シー ジェー、キャンペル エー ケー、マクキャプラ
エフ 「化学発光エネルギー転移：生体系における配
位子・配位子相互作用研究用新技術」、アナリティカル
・バイオケミストリー、１２９、１６２−１６９（１９
８３）。化学発光化合物は化学反応の結果として光を放
射する。この特殊なエネルギー転移検定は蛍光標識が化
学発光標識に密接接近状態にされた場合に化学発光標識
によって生成された光、すなわち、エネルギーの全部又
は一部がフルオレセインなどの蛍光標識に転移され得る
事実を利用している。接近は化学発光標識配位子とその
蛍光標識特定結合パートナーとの間の特異反応によって
もたらされる。
【００２３】化学発光標識によって生成されたエネルギ
ーの蛍光標識による吸収は一般に約４６０と４８７ｎｍ
の間の放射光の減少及び約５２５と５５５ｎｍとの間の
放射光の増加となる。Ｉｄ．シフトが観察される正確な
波長範囲は標識として選択された化学発光及び蛍光化合
物に依存する。典型的なこの形式の競争結合検定におい
て、試験試料からの遊離被検出体は化学発光標識被検出
体と有限量の蛍光標識抗体について競争する。シフトの
量は試験試料中に存在する遊離被検出体の量に逆比例す
る。試験試料中に存在する被検出体量に逆比例するので
なく直接正比例する競争接近検定用試薬を入手すること
は有利であろう。接近検定に用いる改善された安定特性
を示す試薬を入手することもまた有利であろう。化学発
光標識抗原は９か月間安定であると報告されているが、
この安定には−２０℃での貯蔵が必要である。Ｉｄ．こ
の種の試薬が室温において安定であることは望ましいこ
とである。
【００２４】６．従来技術の共役方法 大部分の特異結合検定は１形式又はもう１形式の共役体
の使用を必要とする。例えば、典型的なサンドイッチ免
疫検定は酵素又は蛍光化合物のような標識とサンドイッ
チの標識抗体として機能する抗原との共役体を必要とす
る。共役体はまた合成反応を含む他の方法にも使用され
る。共役体は単に２つの物質が互いに結合したものであ
る。通常その物質の少なくとも１つはタンパク質であ
る。酵素標識抗体を用いるようなある場合には両方の物
質がタンパク質である。大部分のタンパク質はある種の
他の物質と同様活性部位を有しており、そのうちのいく
つか又は全てがその共役体の究極的な所望の性能に重要
である。活性部位の例としては酵素の活性部位、抗体の
結合アーム及び抗原又はハプテンのエピトープが挙げら
れる。活性部位を有するタンパク質又は他の物質を複合
する場合共役、すなわち化学修飾を活性部位から離れて
行うことが重要である。
【００２５】共役方法は一般に必要なタンパク質の化学
修飾を行うために比較的過酷な条件を用いる。これはタ
ンパク質の変性及び／又は失活の原因となり得る。さら
に、これらの方法はタンパク質の活性部位の特殊な形式
をそのタンパク質の活性部位又はその近くで生じるか否
かに関係なく捜し出す無差別なものである。タンパク質
共役体においてもっとも一般的な反応性部位はアミノ基
及びカルボキシル基である。ただし表面スルフヒドリル
基もしばしば用いられる。これらの反応は本来無作為的
なものであり、タンパク質がこれらの特殊な反応基を活
性部位の近くに有するという問題を生じる。過酷な反応
条件による問題を緩和するため提案された方法の一つは
ヘテロ二官能架橋剤のメンバーにアジド（Ｎ3 ）を使用
することである。前述したように、ヘテロ二官能架橋剤
は２種の低分子配位子ではなく２種の化学的反応基を利
用するものであるから低分子ヘテロ二官能共役体とは区
別されるべきである。架橋剤のアジド基は紫外線露光に
より容易に活性化ナイトレンに転化する。その後活性化
ナイトレンは過酷な反応条件を用いなくても殆ど全ての
化学結合の中に挿入することができる。
【００２６】特に、１つの化学的反応基としてカルボン
酸残基のスクシンイミドエステル及び他の化学的反応基
としてアジド残基を使用するヘテロ二官能架橋剤が２種
タンパク質の共役に使用することが提案されている。ガ
イル ピー、フリガー ディー、ホグソン ジェー「酵
素の哺乳類細胞への光化学的共役」ファーマティカル・
リサーチ・コム９（２）、１３１−１４１（１９７
７）。第１タンパク質を含有する溶液にはじめ過剰の架
橋剤を添加する。カルボン酸残基のスクシンイミドエス
テルは無差別に第１タンパク質のどれかのアミノ官能基
と結合する。この反応はアジド残基の反応性により暗所
で行われる。スクシンイミドエステルとアミノ基の間の
反応が生じ、過剰の架橋剤を除去した後第２タンパク質
を添加し、反応混合物を紫外線露光してアジド残基をナ
イトレンに転化する。ナイトレンは極度に反応性であ
り、この反応形式で、第２タンパク質のどれかの化学結
合中に挿入され、架橋剤の活性ナイトレン末端に容易に
利用される。この複合化の第２段では比較的緩和な反応
条件が用いられるが、第１タンパク質がその活性部位に
臨界的な反応性の遊離アミノ基を有していない場合にの
み比較的良好な回収が達成される。どの場合もナイトレ
ン挿入の無差別性によって優れた回収はできない。
【００２７】もう１つの共役方法は部位特異性の問題を
取り上げているが、過酷な条件問題を緩和するに至って
いない。この方法ではタンパク質の多糖基を複合部位と
して使用することに的を置いている。大部分のタンパク
質はその活性部位から離れた部位に位置した表面多糖基
を含有し、多糖基の位置は変性用に理想的な配置となっ
ている。タンパク質の活性部位にはこれらの多糖基は含
まれていない。従って、活性部位を化学修飾するには危
険はない。多糖基の変性は一般的にシス−ジオール基の
反応性を含んでいる。しかしながら、伝統的にこれには
（１）シス−ジオール基の過ヨウ素酸塩酸化とこれに続
く（２）還元性アミノ化を必要とする比較的過酷な反応
条件が課されている。比較的緩和な条件で進行するばか
りでなく、タンパク質の活性部位が未変性で残るような
差別的な方式で行われるタンパク質共役方法を持つこと
が望ましい。
【００２８】
【課題を解決するための手段】本発明は一般的に種々の
目的の試薬の調製とともに分析方法用として使用するこ
とができる新規な三座共役体、その製造方法及びそれを
用いた免疫検定方法を提供する。この三座共役体は互い
に適切なスペーサー基を通じて結合した３種の化学基す
なわち、三座体メンバーを持つ三官能共役体である。三
座体メンバーのうち少なくとも２つは低分子である。三
座体メンバーのうち１つ以上が低分子配位子：特定パー
トナー対の配位子部分であってよい。１実施態様とし
て、三座体メンバー及びスペーサー基は巨大分子の三座
体メンバーの１つとの結合が他の巨大分子の残余の三座
体メンバーの１つとの結合を立体的に阻害するように選
択及び調整される。もう１つの実施態様では三座体メン
バーの１つがガイド（案内）として作用する、換言すれ
ば、巨大分子の第１位置に結合しその間残余の三座体メ
ンバーの１員が第１位置に近接した同じ巨大分子の第２
位置に結合するように選択される。後者の三座体メンバ
ーの結合に続いて前者、すなわち、ガイド三座体メンバ
ーの結合は解消されてもよい。
【００２９】本開示の文中において次の用語は特に示さ
ない限り次のように定義される： 配位子：複合体又は共役体中のより小さい分子で、特異
的により大きい分子又は物質と結合するもの。この配位
子は天然に存在するものであってもよいし、人工的に処
理したものであってもよい。 特異結合パートナー：複合体又は共役体中のより大きい
分子又は物質で特異的により小さい分子と結合するも
の。特異結合パートナーは他の物質を除いて配位子と特
異的に結合する親和力を有している。特異結合パートナ
ーは天然に存在するものであってもよいし、人工的に処
理したものであってもよい。例えば、抗体フラグメント
はこの定義に含まれる。 配位子類似体：配位子と殆ど同じ方法でその配位子の特
異結合パートナーと結合することができる配位子分子の
類似体。ここで用いる「配位子」は全般的に配位子類似
体及び免疫化学的に均等の物質を含むものである。 低分子配位子：大きさが約７，０００ダルトン未満の配
位子。低分子配位子は抗原のようなより大きい配位子の
一片ないしフラグメントであってもよい。低分子配位子
が抗原の砕片である場合、そのフラグメントはまるごと
の抗原に対して抗体が有しているのと同じ又は同程度の
親和性で抗体に抗原として認知されるものでなければな
らない。 低分子：大きさが約７，０００ダルトン未満の化学基(c
hemical moiety) 。 化学反応基：他の化学基と共有結合を形成することがで
きる化学基。 接近標識：互いに接近して配位したとき信号を発生する
ことができる２以上の分子のうちの１分子。 巨大分子：大きさが約１０，０００ダルトンを越える大
きい分子又は物質。 同時結合：同じ三座共役体の二つ以上の三座メンバーが
同時に巨大分子と結合する能力。一方の巨大分子との結
合が事実上他の巨大分子の結合前に生じてもよい。
【００３０】本発明によれば新規な三座共役体ないし三
座体が、その製造方法及びその使用方法とともに提供さ
れる。三座共役体の意味するものは適切なスペーサー基
を通じて付着結合した(attached)３個の化学基、すなわ
ち、三座体メンバーを有する三官能共役体である。一般
に三座体メンバーの２つ以上は巨大分子と相互作用する
ことができる低分子である。これらの低分子メンバーは
同じ巨大分子と相互作用してもよいし、又は異った巨大
分子と相互作用してもよい。三座体メンバーの３つとも
に低分子配位子であってもよい。本発明の三座体に使用
することができる低分子配位子の特定例には、インシュ
リン、ステロイドホルモン、甲状腺ホルモンなどのホル
モン類、Ｂ12、葉酸、ビオチンなどのビタミン類、１−
置換−２，４−ジニトロベンゼン（ジニトロフェノール
又はＤＮＰとして知られる）、薬剤などのハプテン類、
抗原フラグメントなどのポリペプチド類が含まれる。代
表的な低分子配位子：特異結合パートナーはホルモン：
レセプター、ハプテン：抗体、ポリペプチド：抗体、オ
リゴヌクレオチド：相補的ＤＮＡ又はＲＮＡ、ビオチ
ン：アビジン、ビタミンＢ12：内因子、葉酸塩：葉酸塩
結合タンパク質、インシュリン：抗インシュリンであ
る。三座体メンバーは選択されて、三座共役体上に選択
されたスペーサー基を通じて配列される。このことによ
り三座体メンバーは選択されたそのスペーサー基によっ
て三座体に付与された所定の立体的性質に従って作動す
ることができるようになる。明瞭化のために、三座体メ
ンバーはしばしば第１三座体メンバー、第２三座体メン
バー、第３三座体メンバーと呼ぶことにする。第２三座
体メンバーは第１三座体メンバーと第３三座体メンバー
の間に位置する。スペーサー基は一般に「Ｙ」で示さ
れ、「Ｙ」のそれぞれの腕と三座体メンバーの１員と結
合した尾部を有している。換言すれば、第１及び第２三
座体メンバーを連結するスペーサーの区分の一部は第１
及び第３三座体メンバーを連結するスペーサーの区分の
一部と共通である。例えば、図７参照。従って、第１三
座体メンバーはまた第２と第３三座体メンバーの「間」
に位置し、第３三座体メンバーは第１と第２三座体メン
バーの「間」に位置する。
【００３１】好ましい実施態様 １．立体障害 本発明の１実施態様において、三座体は立体障害、もし
くは立体阻害の現象を利用するよう設計される。この実
施態様は立体障害実施態様と呼ぶことができよう。この
第１実施態様において好ましくは三座体メンバーの少な
くとも２つがそれぞれ異った巨大分子特異結合パートナ
ーと結合する低分子配位子である。三座体メンバーはそ
の三座体メンバーの特異結合パートナーとの結合がもう
１つの三座体メンバーがその対応する特異結合パートナ
ーとの結合を立体的に阻害するように選定され、配置さ
れる。便宜上第２三座体メンバーを「モジュレート(mod
ulating)」 メンバーと呼ぶことにするが、これは巨大分
子と結合した時立体障害を生じるべき三座体メンバーで
ある。巨大分子の三座体の第２（モジュレート）メンバ
ーとの結合は三座体の第１及び／又は第３メンバーが通
常それぞれの特異結合パートナーである対応する巨大分
子との同時結合を阻害する。本発明の立体障害実施態様
を実際に適用する例は特に競争モジュレート免疫検定(c
ompetitivelymodulated immunoassay) の分野において
いくつかある。三座体メンバーのすべてが巨大分子特異
結合パートナーと結合する低分子配位子である場合、第
１及び第３の三座体メンバーを連結するスペーサー基の
区画はモジュレート第２三座体メンバーのその特異結合
パートナーとの結合が存在しない時に第１及び第３の三
座体メンバーがそれぞれの特異結合パートナーと同時結
合することができるのに十分な長さでなければならな
い。
【００３２】第２メンバーのスペーサー基上の位置も同
様に臨界的なものである。第１及び第２三座体メンバー
を連結するスペーサー基の区画及び／又は第２及び第３
三座体メンバーを連結するスペーサー基の区画は第２メ
ンバーがその特異結合パートナーと結合した時モジュレ
ーションをもたらすのに十分な短さでなければならな
い。巨大分子の第２三座体メンバーとの結合は第２三座
体メンバーが残余の三座体メンバーのいずれかと如何に
接近した位置にいるかに応じて第１三座体メンバー、第
３三座体メンバー又はそれら両方のそれぞれの結合を立
体的に阻害する。モジュケーションが生じるには巨大分
子の残余三座体メンバーの少なくとも１つとの結合が阻
害されねばならない。３種の低分子配位子が三座体メン
バーとして用いられた場合、本発明の立体障害実施態様
は一般に競争モジュレート免疫検定において普遍的に使
用することができる。それゆえこの実施態様は汎用（普
遍的）三座体と呼ぶことができる。第１及び第３三座体
メンバーに対応する特異結合パートナーが多価体である
場合、この種の免疫検定はＮＩＩＡ法を含む分野まで拡
大することができる。この三座体は関心とする被検出体
が分子量約１００〜１５００ダルトンのハプテン又はそ
の類似体である場合の競争モジュレート検定に特に有用
である。三座体がモジュレーション検定の競争形式で一
般に使用することを意図するものである場合、第２三座
体メンバーは関心とする被検出体と同じになるよう又は
類似するように選定される。第２三座体メンバーは特異
結合パートナー（通常抗体）が同じである遊離被検出体
に対し競争し得ることが必要である。この抗体、いわば
被検出体−特異抗体は所定量存在する。第１及び第３三
座体メンバーは好ましくは関心とする被検出体とは異る
小分子配位子：特異結合パートナー対の配位子部になる
よう選定される。第１及び第３三座体メンバーは同じ低
分子配位子であってもよいし、異った低分子配位子であ
ってもよい。好ましい１実施態様において第１及び第３
三座体メンバーはともにビオチン基である。
【００３３】Ａ．ネフェロ分析検定 前述のように、三座体の立体障害実施態様は各第１及び
第３三座体メンバーの特異結合パートナーが多価体であ
るモジュレートＮＩＩＡに適用することができる。この
ような多価特異結合パートナーのおのおのはそれが結合
する各三座共役体の対応する低分子配位子メンバーを通
じて少なくとも２個の三座体と結合することができる。
このようにして、モジュレーション（高分子の第２メン
バーとの結合）が存在しないと光散乱センター中に保持
されるのに十分な長さの大凝集体を形成することができ
る。通常被検出体−特異抗体又は巨大分子抗体フラグメ
ントである特異結合パートナーが三座共役体の第２メン
バー位置と結合することが第１及び／又は第３三座体メ
ンバーのそれぞれの特異結合パートナーとの同時結合を
阻害することによって複合体化をモジュレートする。試
験試料に由来する遊離被検出体の存在は適用し得る被検
出体−特異抗体と結びつき、それによりモジュレーショ
ンは低減し、複合体形成が増える。本発明のこの好まし
い三座体を用いるＮＩＩＡを図１に示す。この提示にお
いて、巨大分子の第２メンバーとの結合は第１及び第３
三座体メンバーのそれぞれの特異結合パートナーとの結
合をともに阻害する。第１三座体メンバーはビオチンで
ある。ビオチンは６３，０００ダルトン前後の分子量を
有する多価アビジン分子と特異的に結合する。第２三座
体メンバーは関心とする被検出体と同一のテオフィリン
などの第１ハプテンである。第３三座体メンバーは関心
とする被検出体とは異なったＤＮＰのような第２ハプテ
ンである。第２及び第３メンバーはそれぞれ約１５０，
０００ダルトンの分子量を有するそれらの多価抗体と特
異的に結合する。これらの抗体は図１Ａに示すように複
数の第１又は第２ハプテン分子と共役した担体タンパク
質を動物に注射することによって作られる。
【００３４】三座体が第２ハプテンの抗体及びアビジン
とのみ接触する場合には第１及び第３メンバーの同時結
合が生じる。しかし、第１ハプテンの抗体（被検出体）
も反応混合物中へ添加されると、この抗体の三座体のモ
ジュレート第２メンバー位置との結合によって複合体化
は阻害される。この場合、図１Ｂに示すように、被検出
体−特異抗体の第２三座体メンバーとの結合が対応する
特異結合メンバーの第１及び第３メンバー両方への同時
結合が立体的に阻害される。試験試料からの遊離被検出
体（第１ハプテン）が存在すると、図１Ｃに示すよう
に、被検出体−特異抗体は遊離被検出体によって三座体
の第２メンバー位置から遠ざけられ、それによりモジュ
レーションは低減し複合体形成が増える。これにより信
号すなわち複合体形成の増加が遊離ハプテンの濃度増加
と正比例する結果となる。ここに提案したビオチン−テ
オフィリン−ＤＮＰ三座体に加えてビオチン−テオフィ
リン−ビオチンを含む他の三座体はテオフィリンがまた
三座体の第２（モジュレート）メンバーであるテオフィ
リン又はテオフィリン−アミン用のＮＩＩＡにおいて同
等によく作用する。本発明の三座体を用いるＮＩＩＡな
どの競走モジュレート検定において効果的に検定できる
その他の薬剤の例にはジゴキシン、ジソピラミド、ライ
ドカイン、プロカインアミド、プロパノロール、キニジ
ン、アミカマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマ
イシン、カナマイシン、ネチルマイシン、トブラマイシ
ン、三環抗うつ剤、エソスクシミド、フェノバルビター
ル、フェニトイン、ブリミドン、バルプロイン酸、アセ
トミノフェン、アセチルサリチル酸、メトトレキセート
などの治療薬及びモルフィネ、コデイン、ヘロインなど
の悪習薬及びそれらの代謝生成物が含まれる。三座共役
体を用いて検定することができる他のハプテンの例には
ＤＮＰ、１−置換−４−ヒドロキシ−２−ニトロベンセ
ン及び４−置換−２−ニトロ−トリアルキルアニリニウ
ム塩が含まれる。従来技術の顕色剤抗原とは異り、この
三座体は延長された貯蔵寿命を享受でき、かつ従来技術
の共役体固有の経費のかかる精製及び特性化操作を必要
としない安定で化学的に一定の有機化合物である。また
本発明の三座体は複合体化が典型的な従来技術の顕色剤
抗原に共役した複数のハプテン部分の競争ではなく三座
体のただ１つの部分、すなわち、第２（モジュレート）
メンバーの遊離被検出体との競争という事実によるため
感度が改善されている。従来技術の非生産的結合の問題
もまた排除されている。
【００３５】Ｂ．接近検定 この同じ汎用三座体が接近標識を用いる方法を含む他の
形式の競争モジュレート検定に一般的に用いることがで
きる。これらの検定は前述の同じ群の被検出体を検出す
るのに特に有効である。これらの検定において、第２三
座体メンバーは再びモジュレーターとして作用する。１
つの接近標識は三座共役体の第１三座体メンバーの特異
結合パートナー巨大分子に付着結合され、その他の接近
標識は三座共役体の第３三座体メンバーの特異結合パー
トナー巨大分子に付着結合される。２つの巨大分子が第
１及び第３三座体メンバーと同時結合する場合、測定し
得る反応が２つの接近標識間に生じる。第２三座体メン
バーの特異結合パートナー、すなわち、被検出体−特異
抗体はモジュレート第２三座体メンバーと結合する場合
少なくとも１つの標識巨大分子は第１又は第３三座体メ
ンバーのいずれかと同時結合するのを阻害される。汎用
三座体の第１及び第３三座体メンバーを連結するスペン
サー基の区画は標識巨大分子の同時結合を許容するのに
十分な長さでなければならない。しかしながら、同時
に、このスペーサーの区画の長さは標識が測定し得る反
応をなし得るのに十分密接接近させられるのに満足な短
さでなければならない。所要の接近をするために必要と
される長さは選定された接近検定法の形式そのものによ
り或る程度変るが、一般に比較的長い。例えば、接近標
識間のエネルギー転移は７０Åの長さで発生する。
【００３６】酵素チャンネル検定では第１酵素は好まし
くは第１又は第３三座体メンバーのどちらかの特異結合
パートナーと付着結合され、第２酵素は残余の第１又は
第３三座体メンバーに対応する特異結合パートナーに付
着結合される。酵素チャンネル検定用の良好な酵素対に
はグルコースオキシダーゼとペルオキシダーゼ及びヘキ
ソキナーゼとグルコース−６−リン酸脱水素酵素の対が
含まれる。第２三座体メンバーは関心とする被検出体と
同じか又は類似体であり、試験試料からの遊離被検出体
に対し所定量の被検出体抗体について競争する。被検出
体−特異抗体の第２三座体メンバーとの結合が存在しな
ければ第１及び第２酵素を担持する巨大分子は第１及び
第３三座体メンバーと同時結合することができ、第１酵
素の生成物はそれが溶液中へ逸出する前に第２酵素によ
って転化されることができる。しかしながら、試験試料
からもたらされる遊離被検出体が僅か又は皆無であれ
ば、被検出体−特異抗体は第２三座体メンバーと結合す
ることができ、酵素標識つき巨大分子がそれぞれ第１及
び／又は第３三座体メンバーとの結合を立体障害し、そ
れによって酵素チャンネルをモジュレート、すなわち、
信号低減が生じる。試験試料からの遊離被検出体の量が
多ければ多いほど、抗体の三座体との結合は少なくな
る。モジュレートは減少し、酵素チャンネルは発生する
信号量同様増加する。
【００３７】エネルギー転移検定においても、同様に、
供与体（ドナー）標識は好ましくは第１又は第３三座体
メンバーのどちらかの特異結合パートナーに付着結合さ
れ、受容体（アクセプター）標識は残余の第１又は第３
三座体メンバーに対応する特異結合パートナーに付着結
合される。ＮＩＩＡ及び酵素チャンネル法の場合のよう
に、第２三座体メンバーは関心とする被検出体と同じか
又は類似体である。第２三座体メンバーは試験試料から
の遊離被検出体に対し所定量の被検出体抗体について競
争する。試験試料からの遊離被検出体の量が多ければ多
いほど、第２三座体メンバーと結合しているモジュレー
ト位置からの被検出体−特異抗体の転換する量は増加す
る。被検出体量が少ないとエネルギー転移、従って信号
量が減少する結果となる。本発明の三座体を用いるエネ
ルギー転移検定に数種の供与体−受容体対を適用するこ
とができる。供与体標識は一般に外部エネルギーを吸収
して光エネルギーを放射するものでなければならない。
良好な供与体標識の例には蛍光性化合物、シンチレーシ
ョン染料及びイソルミノール、アクリジンエステルなど
の化学発光化合物が含まれる。受容体標識は通常供与体
から放射されたエネルギーを吸収しその供与体放射光エ
ネルギーの波長よりも長波長の蛍光を放射することがで
きる蛍光化合物である。好ましくは受容体は良好な蛍光
効率を有するべきである。良好な受容体標識にはフルオ
レセイン、ローダミン、蛍光ランタニドキレート及びプ
ロトポルフィリンの蛍光スズ又は亜鉛誘導体が含まれ
る。ローダミンは供与体によって放射される広範囲の波
長スペクトルエネルギーを吸収することができるので、
特に良好な受容体標識である。良好な供与体：受容体対
の例はイソルミノール：フルオレセイン、アクリジンエ
ステル：フルオレセイン及びフルオレセイン：ローダミ
ンである。
【００３８】さらに本発明のもう１つの好ましい立体障
害実施態様において、汎用三座体以外の三座体が接近標
識を用いる競争モジュレート検定に利用される。これら
の検定においては２つの三座体メンバーのみが低分子配
位子である三座体が使用される。これらの低分子配位子
のうちの１つは遊離被検出体と所定量の被検出体−特異
抗体について典型的に競争する第２、すなわち、モジュ
レート三座体メンバーであることが好ましい。他の低分
子配位子は第１接近標識と共役されている巨大分子特異
結合パートナーと結合する。被検出体−特異抗体が第２
メンバー位置と結合していると標識巨大分子は同じ三座
体の結合から立体阻害される。第２メンバーによるモジ
ュレーションが存在しないと、第１接近標識は次のうち
の１つの方式で第２接近標識と好ましく接近する：
（１）第２接近標識が三座体メンバーとして直接三座体
に共役される、又は（２）複数の第２接近標識が三座体
メンバーとして直接三座体に共役されている大きい巨大
分子ないし固体支持体に結合する。後者の場合、特に三
座体メンバーの１つが固体支持体である場合には、図１
１に示すように、多数の三座体が同じ固体支持体を共有
する。第１接近標識を含有する特異結合パートナーがど
の程度三座体メンバーと結合できるかが発生する信号の
量を制御する。試験試料からの遊離は被検出体は被検出
体−特異抗体をその三座体上のモジュレート位置から離
して転換することにより信号を増加する。本発明の三座
体は接近検定においてネフェロ検定の場合と同様全般的
な利点を提供する。合成有機三座体であり一定の化学性
質によって大部分の従来技術試薬の基礎となっている天
然由来のタンパク質系物質を利用する際典型的に遭遇す
る問題の多くを緩和する。この三座体は従来技術試薬の
ような経費のかかる単離や特性化操作を必要としない。
抗原の場合のようにモジュレート三座体メンバーとして
抗原フラグメントを有効に使用することができるこれら
の方法を用い同じハプテンや薬剤を簡便に検定すること
ができる。
【００３９】２．ターゲット標識 本発明のもう１つの実施態様は領域特異標識(region-sp
ecific labelling) 又はターゲット標識と呼ぶことがで
きる他の立体現象を利用するよう設計された三座体を使
用する。この三座体の少なくとも２つのメンバーは低分
子である。これら２つの低分子メンバーは同じ巨大分子
と結合することができ、これら２つの低分子メンバーの
うち少なくとも１つは化学的活性基である。第３三座体
メンバーは低分子配位子でもよく、低分子配位子以外の
低分子であってもよく、巨大分子であってもよい。三座
体のターゲット標識実施態様はある特定の巨大分子の１
つ又は複数のターゲット部位に低分子配位子又は他の三
座体メンバー結合することが望まれる場合に有利に使用
することができる。この第３三座体メンバーは標識、ト
レーサー又はリポーター基として作動してよい。また第
３三座体メンバーが高分子である場合のように固体支持
体として作動してよい。例えば、ビオチンは低分子配位
子標識として用いることができる。Ｉ125 のような放射
性物質は低分子トレーサーとして良好な例である。酵素
は良好な巨大分子標識である。一般原理的に、第１低分
子三座体メンバーの結合は化学反応性の第２低分子が同
じ巨大分子の特殊な領域に結合するのを制止する。巨大
分子上のターゲット部位に配置して最初にそれと結合す
べき低分子三座体メンバーは化学的反応性の基であって
もも低分子配位子であってもよく、ガイド三座体メンバ
ーと呼ばれる。このようにガイドメンバーが結合した同
じ巨大分子上の近辺もしくは領域での結合が抑止される
低分子三座体メンバーは反応性三座体メンバーと呼ばれ
る。反応性メンバーは化学的反応基でなければならな
い。第３三座体メンバーはたとえそれが事実上固体支持
体であっても便宜上「意図標識(intended label)」と呼
ばれる。ガイドメンバーと反応性メンバーを連結するス
ペーサー基の区画の長さは好ましくは比較的短く、一方
反応性メンバーと意図標識を連結するそれは比較的長
い。
【００４０】本発明のターゲット標識実施態様は特に意
図標識をプロテオグリカン、リポタンパク質、酵素、抗
体及びレセプターなどのタンパク質と複合させて用いら
れる。前述したように、大部分のタンパク質はその分子
の活性部位から離れた位置に多糖基又は糖基を含んでい
る。このような多糖基又は糖基を含有するタンパク質は
グリコシル化タンパク質と呼ぶことができる。従来技術
の方法と異り、この三座体はタンパク質を変性しかねな
い過激な反応条件や非特異結合を招くことなくタンパク
質の多糖基にターゲットモディフィケーションすること
ができる。例えば、三座体をタンパク質のターゲット標
識つけに使用する場合、三座体メンバーは好ましくは次
のものから選ばれる：（１）ガイドメンバーはフェニル
ボロン酸残基、（２）反応性メンバーはニトロフェニル
アジド残基、（３）残りの三座体メンバーはビオチンな
どの意図標識。ガイドメンバーの置換ボロン酸基はタン
パク質の糖基のシス−ドール基を捜し出しこれと反応し
て比較的弱いボロン酸エステル複合体ないし結合を形成
する。この反応は暗所で行われる。過剰の三座体を除去
した後、反応混合物は紫外線露光され、反応性メンバー
のアジド基を活性化してナイトレンにする。次いでナイ
トレンは予め結合したガイドメンバーの近辺内のどれか
の化学結合中に挿入される。これによりタンパク質の活
性部位から離れた永久結合が確立される。続いてｐＨ変
化によるボロン酸エステルの加水分解などによるガイド
メンバーの脱離が行われるが、これは三座複合体の機能
的有用性を損なわない。第３メンバーが永久結合を通じ
てタンパク質に結合される。この反応は特異的で、条件
は緩和である。
【００４１】三座共役体の合成 １．一般論 三座体の合成はその最終的な用途が決定され、三座体メ
ンバーが選定されれば比較的容易である。次にこれらの
決定によりスペーサー基の大きさ及び構造が決まる。そ
の三座体がＮＩＩＡ、酵素チャンネル又はエネルギー転
移検定などのモジュレート検定での使用を意図するもの
であれば、三座体メンバーは好ましくは上記に示唆した
ように選定される。その他のモジュレート検定法での使
用を意図するものであれば、三座体メンバーは同様な方
法で選定されよう。換言すれば、第２三座体メンバーは
好ましくは関心とする被検出体と同じか又はその類似体
であり、第１及び第３メンバーの少なくとも１つは好ま
しくは低分子配位子：特異結合パートナー対のなかから
選ばれる異った配位子である。残余のメンバーは通常そ
の他の低分子配位子、接近標識又は巨大分子や固体支持
体である。巨大分子の特異修飾の場合のようなターゲッ
ト標識態様を意図するならば、ガイドメンバーは低分子
配位子又は指定の巨大分子上の単数もしくは複数のター
ゲット部位と選択的に結合できる化学的反応基のどちら
かから選ばれる。反応性メンバーはガイドメンバーが結
合した位置に接近して同じ巨大分子上の位置に永久結合
することができる化学的反応性基から選定される。第３
三座体メンバーは通常標識、トレーサー又はリポーター
基となるように選定されるが、それは低分子、低分子配
位子、又は巨大分子あるいは典型的には巨大分子である
固体支持体であってよい。
【００４２】三座複合体は一般的に出発スペーサー基の
まわりに各三座体メンバーが互いにスペーサー基上への
付着結合により作りあげられる。スペーサー基を通じて
二官能共役体のメンバーを付着結合させるには当業者公
知の多くの方法がある。例えば、米国特許第４，１３
４，７９２号、米国特許第４，２３８，５６５号及びグ
リーン エヌ エム、コニーツニイ エル、トムス イ
ー ジェー、バレンチンアール シー「アビジン中のサ
ブユニット配列決定における二官能性ビオチン化合物の
使用」バイオケミカル・ジャーナル １２５ ７８１−
７９１（１９７１）を参照。これらの方法は一般に複合
化前に活性化されたり、されなかったりする２種の異な
った有機化合物の反応基間の典型的な縮合、付加、置換
反応を用いている。同様もしくは同等の方法が、例え
ば、特に後述の例４に示すように、選定されたスペーサ
ー基へ三座体メンバーを付着結合させるのに用いられ
る。スペーサー基の化学的組成そのものはそれに付着結
合させるそれぞれの三座体メンバーに適用される化学部
位の性質にある程度左右される。また、出発スペーサー
基として使用される有機物質の有用性にも依存する。炭
素原子に加えて窒素、酸素、イオウ、リンなどのヘテロ
原子がスペーサー基の中に使用される。スペーサー基は
芳香族基も含まれるが、一般に脂肪族基である。炭素、
窒素又は酸素がスペーサー基に取り込まれる典型的な二
価鎖においては、これらの各原子はスペーサー基の長さ
を約１．２〜約１．５Å増加すると考えることができ
る。スペーサー基を通じて三座体メンバーを互いに連結
するのに用いられる精密な方法は臨界的なものではな
い。重要なことは三座体メンバーがその三座体の合成後
に意図された最終用途において効果的に機能する能力を
保持していることである。例えば、低分子配位子メンバ
ーはそれの特異結合パートナーと結合する能力を保持し
ていなければならない。この考え方はスペーサー基との
連結用の化学的部位を正確に選定するのににも影響す
る。通常はその三座体メンバーの活性部位を例えば特異
結合反応が生じ得るよう最大限露出することが望まれ
る。
【００４３】２．所要スペーサー長の決定 各三座体メンバーを他の各三座体メンバーと連結するの
に必要とされるスペーサー基の長さはその三座体が合成
される前に決定されねばならない。例えば、３つの低分
子配位子を使用する三座体がモジュレート検定用として
意図された場合、第１及び第３三座体メンバー間の最小
限スペーサー長は通常初期段階で決定されねばならな
い。この最小限スペーサー長はモジュレーシヨンが行わ
れなかった場合、第１及び第３三座体メンバーのそれぞ
れの特異結合パートナーとの同時結合が達成され得るよ
うな点で決められる。この点以下では同時結合はなんら
生じない。２つのホモ二官能性共役体メンバーがそれら
それぞれの特異結合パートナーと同時結合し得るのに必
要な最小限スペーサー長を決定するには当業者公知の多
数の方法がある。例えば、ラルソン ピーオー、モスバ
ック ケー「酵素の親和性沈殿」エルシビエル／ノース
オランダ・バイオメディカル・プレス、９８（２）、３
３３−３３８（１９７９）及びグリーン エヌ エム、
コニエツニイ エル、トムス イー ジェー、バレンチ
ン アール シー「二価性ビオチン化合物のアビジン中
のサブユニットの配列決定における使用」バイオケミカ
ル・ジャーナル、１２５、７８１−７９１（１９７１）
を参照。同じ方法は第１及び第３三座体メンバーが同じ
形式の同時結合をするのに必要な最小限スペーサー長の
決定に用いることができる。特に、一般に第１及び第３
三座体メンバー体のみを含有する種々のスペーサー長を
有する一連の二官能性共役体類似体が合成され、次いで
同時結合が最初に観察されるスペーサー長が決定され
る。
【００４４】同時結合の発生はその同時結合反応によっ
て発生する測定可能な信号の生成を通常検出する。最小
限スペーサー長を決定する簡便な１つの方法は同時結合
の測定として光散乱複合体を検出する標準ネフェロ分析
又はタービジティ分析の方法を通じて行うことである。
これらの方法は二官能共役体の各メンバーと結合する多
価巨大分子を利用することが必要であり、散乱センター
を形成するのに十分な長さの複合体の形成がその三座体
の意図する最終的用途でない場合でさえも有用である。
特に、スペーサー長に関してのみ変る二官能共役体（同
族体として知られている）が各メンバーについてそれぞ
れの多価特異結合パートナートと接触させられる。例え
ば、２つの共役体メンバーとしてビオチンとテオフィリ
ンを有する二官能共役体は最小限スペーサー長を検出す
る研究に用いられる。ビオチンは生物学的に活性な脂環
式環及び短い炭素原子数５の脂肪族末端を含有してい
る。この場合スペーサー長は便宜上脂肪族末端をスペー
サー中へ取り込んだ生物学的に活性な環構造から測定さ
れる。二官能共役体の同族体を調製しアビジン及び抗−
テオフィリン抗体に接触させる。次いでネフェロ分析測
定によりもし存在すれば複合体の量を検出する。最小限
スペーサー長は測定可能な信号が初めて観測される点で
ある。最適最小限スペーサー長は通常結合鎖数本の長さ
である。複合体形成量は最小限スペーサー長の炭素原子
数又はヘテロ原子数で数個内で平衡に達する。スペーサ
ー長は一般にこの平衡に達する点近くを選ぶのが望まし
い。
【００４５】最適最小限スペーサー長は二官能共役体、
アビジン、抗体の比率を変えても大きくは変らない。さ
らに、同じ最小限スペーサー長データは若干の変動は観
察されるけれども、ハプテン−ビオチン二官能共役体の
１つのメンバーとしてテオフィリン以外のハプテンを使
用する場合にも一般に適用される。ビオチン以外の低分
子配位子が二官能共役体メンバーの１つに組み入れられ
た場合、アビジンに比較してこれらの配位子に対する種
々の特異結合パートナーのサイズや形状の大きな変動に
より若干大きい変動が予期される。従って、或る場合に
は最小限スペーサー長を最適化するため別の同族体研究
が要求されよう。さもなければ、テオフィリン−ビオチ
ン共役体又は同様な低分子二官能共役体の研究は立体障
害態様の何個かの三座共役体を成功裡に合成する少なく
とも出発点を確保するのに十分な最適最小限スペーサー
長データを提供する。最小限スペーサー長を決定するの
に用いる二官能共役体は、前述したように、公知の従来
技術方法の何れかの１つで合成することができる。これ
に選ばれた方法はその合成しょうとする化合物の一連の
同族体の１つである化合物の挿入工程が含まれる。例え
ば、アルカンジアミン（ＮＨ2 −（ＣＨ2 ）N −ＮＨ
2 ）級の化合物にはエタンジアミン（Ｎ＝２）、プロパ
ンジアミン（Ｎ＝３）、ブタンジアミン（Ｎ＝４）、ペ
ンタンジアミン（Ｎ＝５）以下が含まれる。合成工程に
これら同族体の１つを挿入することが含まれる場合、二
官能共役体の２つのメンバーを連結するスペーサーの鎖
長を変えるため他の同族体を容易に置換することができ
る。
【００４６】例えば、２種の異ったテオフィリン−ビオ
チン二官能共役体をこの方法で調製することができる。
説明の明解化のため、これら２種の二官能共役体をここ
では二官能共役体Ｉ及び二官能共役体IIと呼ぶことにす
る。二官能共役体IIは二官能共役体Ｉではテオフィリン
基に隣接して窒素原子が位置しているのに対しテオフィ
リン基に隣接して炭素原子が位置している点で二官能共
役体Ｉと相違する。最初に、合成工程の第１段階として
テオフィリンの第一級アミン誘導体を市販の出発テオフ
ィリン誘導体から調製する。他のハプテンの第一級アミ
ン誘導体を調製するのに他の方法を用いることができ
る。二官能共役体Ｉを調製する場合、過剰量のジアミン
を出発誘導体８−ブロモテオフィリンとともに還流す
る。これは一般に窒素気流下で、選定されたジアミン及
び得られる生成物Ｉに応じて、２〜７２時間行われる。
二官能共役体IIは出発テオフィリン誘導体としてテオフ
ィリン−８−酪酸から調製されるが、所望の縮合反応を
行う前に活性化が必要である。特に、カルボニルジイミ
ダゾール（ＣＤＩ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド
（ＮＨＳ）が選定されたジアミンの挿入前に出発誘導体
テオフィリン−８−酪酸のカルボキシル基を活性化する
ために使用される。活性化はテオフィリン−８−酪酸を
無水ジメチルフォルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、約７
０℃に加熱しながら順次ＣＤＩを添加する。通常約１５
分間反応温度を約７０℃に保持する必要があり、その後
冷却して室温までもどす。次にＮＨＳを冷却反応混合物
に添加し一晩中室温で撹拌する。その後過剰量のジアミ
ンを活性化された反応混合物に添加する。この結果が生
成物IIである。所望の第一級アミン誘導体を生成する反
応の完了はそれぞれの反応混合物Ｉ又はIIを薄層クロマ
トグラフィー（ＴＬＣ）によりシリカゲルを塗布したＴ
ＬＣガラス板及び紫外線指示計を用いて決定することが
できる。
【００４７】次に反応混合物は小容量になるまで減圧下
で蒸発させ、この濃縮反応混合物をこう配クロロホル
ム：メタノール混合液を用いる標準シリカゲルカラムク
ロマトグラフィーで精製せねばならない。精製テオフィ
リン第一級アミン誘導体を含有する溶出留分は一括して
回転乾燥器中で蒸発乾固する。蒸発により得られた白黄
色結晶固体はさらに精製することなく次の反応に使用す
る。テオフィリンのモノアミン誘導体はメタノール中２
９５ｎｍで約１．９ｘ１０3 の分子吸光率を有してい
る。ビオチン−テオフィリン共役体Ｉは、図２に模式的
に示すように、反応混合物Ｉからのテオフィリンの第一
級アミン誘導体を含有する結晶固体を無水ＤＭＦ中に溶
解し、活性化したカプロアミドビオチンのＮ−ヒドロキ
シスクシンイミドエステル（ビオチン−Ｘ−ＮＨＳ）中
で撹拌する。他のハプテンの第一級アミン誘導体も同様
にビオチン−Ｘ−ＮＨＳ又は活性化カルボキシル基を含
有する他の化学基を用いて縮合することができる。この
溶液もまた室温で一晩中撹拌する。ビオチン−テオフィ
リン共役体IIは、図３に示すように、反応混合物IIから
のテオフィリンの第一級アミン誘導体を含有する結晶固
体をビオチンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
（ビオチン−ＮＨＳ）で混合する以外は同様にして調製
する。どちらの場合も、所望の生成物は通常ＤＭＦから
白色綿状固体として分離する。生成物はろ紙上に集め、
分取薄層クロマトグラフィー又はカラムクロマトグラフ
ィーのどちらかによりＴＬＣ試験で単一スポットとなる
まで精製する。
【００４８】同様に最小限スペーサー長を決定するのに
用いることができるその他の方法には酵素チャンネル及
びエネルギー転移法がある。ＮＩＩＡ分析に用いられた
のと同じ一連の二官能共役体の同族体が各第１及び第３
メンバーに対するそれぞれの標識つき特異結合パートナ
ーと接触させられる。これらの研究は遊離被検出体及び
モジュレーターガ存在しないことを除いて典型的なモジ
ュレート検定法と同じである。接近標識により発生され
る信号は標識巨大分子の同時結合を許容する最小限スペ
ーサー長において観測され始める。最適最小限スペーサ
ー長は最小限スペーサー長よりも若干長い。第１及び第
３メンバーが特異結合パートナーを有さない場合、これ
らの２メンバー間の同時結合の必要がないから第１及び
第３メンバー間のスペーサー長は臨界的なことではな
い。例えば、これらメンバーの１つが第２接近標識であ
る場合、第１接近標識に複合した特異結合パートナーは
第２接近標識（三座体メンバー）の分子サイズが小さい
ことによりそれの対応する三座体メンバーに容易に結合
することができる。第１及び第３三座体メンバーの１つ
が複数の第２接近標識と複合した高分子である場合、通
常その標識特異結合パートナーがそれの対応する低分子
配位子メンバーと結合できるようにするためある程度の
最小限スペーサー長要求が存在するが、その最小限スペ
ーサー長は２つの特異結合パートナーが同時結合するの
に要求されるのよりも短い。二官能共役体同族体の１つ
が意図巨大分子三座体メンバーであるような例におい
て、同様な同族体研究を行うことができる。
【００４９】２つの三座体メンバーを連結するスペーサ
ー基の区間は普通２つの二官能共役体メンバーを連結す
るスペーサー基のように真直ないし剛直ではないことを
指摘せねばならない。これは、一部、通常スペーサーの
中心点に位置する炭素原子の４つの結合の４面体空間配
列によっている。図７参照。この理由により意図第１及
び第３三座体メンバーを用いる二官能共役体が三座体の
同じメンバーの同時結合作用を促進するために使用され
る場合に観察される最適最小限スペーサー長に約１０〜
２０％程度スペーサー長を増さねばならない。汎用三座
体の２つの低分子配位子メンバー間の同時結合発生の最
小限スペーサー長を確定するために得られた同じデータ
は競争モジュレート免疫検定での使用を意図した三座体
の第２三座体メンバーの相対位置の決定に用いることが
できる。第２メンバーとモジュレーションの所望される
残余の三座体メンバーとを連結するスペーサー基の区間
は同時結合を許容する最小限スペーサー長より短くしな
ければならない。三座体メンバーが全て低分子配位子で
ある場合、第１及び第３三座体メンバー間の距離は第２
（モジュレート）メンバーと第１及び／又は第３三座体
メンバー（モジュレートされることが所望の残余メンバ
ーに応じる）間の距離よりも長くなるであろう。
【００５０】ターゲット標識態様においては最小限スペ
ーサー長は意図標識とターゲット巨大分子の間で要求さ
れる。このメンバーが低分子配位子である場合、意図標
識を反応性メンバーと連結するスペーサー基の区画の長
さは結合された意図標識が標識巨大分子からの立体障害
を招くことなくそのとくい結合パートナーと結合できる
のに十分な長さでなければならない。一般に２つの低分
子配位子間又は低分子配位子と巨大分子間の同時結合に
必要な最小限スペーサー長を確定するするのと同じデー
タをここに用いることができる。ただし結果を完全に最
適化するために同族体を用いる若干の実験が必要になろ
う。ターゲット巨大分子のように第３三座体メンバーが
また巨大分子である場合、スペーサー長は一般に臨界的
なものではない。このことは本発明がターゲット共役を
例えば酵素の活性部位が特異的に例えば固体支持体への
共役部位から離れて位置するようにすることを可能なら
しめるから真実である。
【００５１】３．三座共役体の調製 ３つの三座体メンバーは一般に当業者に公知の伝統的有
機合成技術を用いて互いに複合することができる。しか
しながら、本発明の三座体は三座体の機能的特質を制御
するために注意深く選定されたスペーサー基を取り込む
必要がある。従って三座体の合成を出発スペーサー基か
ら初めてそのまわりに残余の三座体を造りあげていくの
が好ましいことが見出された。出発スペーサー基の種々
の部分は上述のように合成工程の間に延長されていく。
出発スペーサー基は適切かつ個々に誘導体化され得る３
種の化学的官能基を有する有機分子であることが好まし
い。さらに好ましくは３種の化学基は全て異なった官能
基である。化学基の２つ以上が同じ官能基である場合、
これらおなじ化学基の１つ以上は（１）他の同じ基が誘
導体化されている間に保護され、（２）つづいて部分的
に合成された三座体の残余の部分又は保護された官能基
自体に対し化学的変性をもたらすことなく処理され得る
べきである。適切に誘導体化され得る典型的な官能基に
はアミノ基（−ＮＨ2 ）、カルボキシル基（−ＣＯＯ
Ｈ）及びメルカプト基（−ＳＨ）が含まれる。アミノ基
及びカルボキシル基は典型的な縮合反応において互いに
反応し２つの分子を連結する。通常の場合カルボキシル
基は縮合反応の前に活性化されねばならない。メルカプ
ト基はマレイドイミジル基同様他のメルカプト基と反応
して最終的に共有結合により２分子を互いに結合する。
【００５２】出発スペーサー基は合成分子であってもよ
いし、天然に見出される分子であってもよい。天然由来
のアミノ酸は一般に三座体合成用の良好な出発スペーサ
ー基を備えている。天然由来のアミノ酸の殆ど全てがα
−アミノ酸、すなわち、定義によれば、そのアミノ酸の
α−炭素位置にアミノ基及びカルボキシル官能をともに
含有している。これらのアミノ酸のいくつかはそのアミ
ノ酸のω−位置、すなわち、末端炭素に付加官能基を有
している。例えば、リシンはそのω−位置に第２のアミ
ノ基を有している。これに対し、グルタミン酸のω−位
置には第２のカルボキシル官能はない。システインなど
のメルカプトアミノ酸は３つの異った化学的官能基、す
なわち、アミノ、カルボキシル及びメネカプト基を有し
ているから特に出発スペーサー基用として適している。
リシンもまた入手し易さ及び比較的廉価のため出発スペ
ーサー基用の好ましいアミノ酸である。その他の好まし
いアミノ酸にはチロシン及びセリンなどのその他の天然
由来アミノ酸とともにグルタミン酸が含まれる。
【００５３】前述したように、リシン及びグルタミン酸
にはともに２つの同じ官能基が含まれている。２つの同
じ官能基を有するこれら及びその他の出発スペーサー基
の化学基個々に誘導体化するためには、これら官能基の
一方は他方が誘導体化されている間に保護されていなけ
ればならない。カルボキシル官能用の保護基には、例え
ば、ベンジルエステル及び第三級ブチルエステル基が含
まれる。アミノ基の保護が必要な場合には、例えば、カ
ルボベンゾイルエステル、ベンゾイロキシカルボニルフ
タリル又は９−フルオレニル−メチロキシカルボニルが
用いられる。これら及びその他の官能の保護基は基本合
成技術で公知である。保護基はその官能基又は三座体の
残余を害することなく除去（すなわち保護解除）し得る
ものでなければならない。意図した三座体メンバーを出
発スペーサー基に結合する順序は普通臨界的なものでは
ない。これらの例において結合の順序は一般に便宜を考
慮して考えられよう。しかし、三座体メンバーの１つが
複数の接近標識に共役される固体支持体であるような例
においては固体支持体メンバーは最後に付着結合すべき
である。例えば、図１１に示す三座体の合成において部
分的に合成のすんだ三座体（テオフィリン及びＤＮＰ基
をすでに結合）はイソルミノール接近標識と同時に固体
支持体と共役させられる。三座体／接近標識の比率は反
応媒質中に添加されるこれら化合物のそれぞれの量によ
って一般に制御することができる。
【００５４】 Ａ．出発スペーサー基としての環状酸無水物 環状酸無水物はこれら出発スペーサー基に三座体メンバ
ーを付着結合するのに一般に使用される２つのカルボキ
シル官能のうち１つが「自己保護」能力を有しているこ
とにより特に良好な出発スペーサー基を提供する。例え
ば、グルタミン酸の２つのカルボキシル官能基はピログ
ルタミン酸の無水機能のようである。意図された第１メ
ンバーの第一級アミノ基は、図４に示すように、ピログ
ルタミン酸の無水機能と反応して共役化グルタミン酸と
なることができる。無水機能の１つのカルボキシル基の
みが第一級アミノ基に加わり残りのカルボキシル基を遊
離のカルボキシル官能として放出する。遊離のカルボキ
シル基は後にもう１つの意図されたメンバーの第一級ア
ミノ基と縮合反応により別に誘導体化されることができ
る。縮合反応は第１メンバーの付着結合後直ちに行うか
又は、例えば図４に示すように、第２三座体メンバーの
グルタミン酸のアミノ官能への付着結合につづいて行う
ことができる。ピログルタミン酸のアミノ官能は遊離し
たカルボキシル官能とピログルタミン酸のアミノ基が重
合するのを防止するためカルボベンゾキシ（ＣＢＺ）基
などの保護基と好ましく複合する。通常無水官能の２つ
のカルボキシル基のうちどちらが第一級アミンと反応す
るかを制御するのは困難である。これは一般に、図４に
第１三座体メンバーの添加につづいて示すように、２つ
の異った異性体が形成される結果となる。第１メンバー
と残りの三座体メンバーを連結するスペーサー基の区画
は１つの異性体との方他の方よりも１結合分長い。この
逆が遊離したカルボキシル官能、この場合は第３三座体
メンバーに結合する三座体メンバーについていえる。例
えば、図４に示す完成した三座体において第１メンバー
と第２メンバーを連結するスペーサー基の区画は１つの
異性体の中で結合数７であり、他の異性体の中で結合数
６である。この反対が第３メンバーと第２メンバーを連
結するスペーサー基の区画に関してはいえ、すなわち、
１つの異性体の中で結合数６の長さで、他方で結合数７
の長さである。
【００５５】もう１つの有用な環状無水化合物はＳ−ア
セチル−コハク酸無水物である。第一級アミノ基はＳ−
アセチル−コハク酸無水物の酸無水物と反応することが
でき、それによって置換されたＳ−保護コハク酸が得ら
れ意図される第１メンバーの第一級アミノ基が無水物の
カルボキシル基の１つに加わる。図５参照。このことが
残りのカルボキシル基を開放して遊離のカルボキシル基
の形にし、これが残りの三座体メンバーの１つと比較的
容易に結合することができる。保護解除につづいて、図
５に示すように、メルカプト基がなおもう１つの三座体
メンバーに付着結合されることができる。ピログルタミ
ン酸、他の酸無水物の場合のように２つの異性体つき三
座体が最終的に形成される。結果として、カルボキシル
基を通じて付着結合した２つのメンバーのおのおのを連
結するスペーサー基の区画は１結合分ごと変っている。
通常このようなスペーサー長の僅かな変化は三座体の性
能に影響を与えない。ただ１つの特殊な異性体の使用が
望まれる異常な場合、所望の異性体は初期段階で最初の
付加反応につづいて標準的な分離工程で混合物から分離
することができる。スペーサー基の種々の区画長さは２
つの二官能共役体メンバーを連結するスペーサー長を変
えることについて前に述べたのと同じ方法を用い容易に
制御すなわち変更することができる。例えば、一連のジ
アミン同族体は第一級アミンが出発スペーサー基へ結合
するのに必要な意図される三座体メンバーへスペーサー
長を加えるのに特に有用である。スペーサー区画の長さ
の調整は通常出発スペーサー基へ結合する前に行われ
る。
【００５６】 Ｂ．出発スペーサー基としてのカルボベンゾキシリシン ２つの同じ官能基の１つの保護を必要とする出発スペー
サー基の良好な例はリシンである。市販のω−カルボベ
ンゾキシリシン（ω−ＣＢＺ−リシン）は種々の三座体
合成用の良好な「事前保護」出発スペーサー基を提供す
る。カルボベンゾキシ保護基はリシン分子のω−位置で
第２アミノ官能へ結合され、α−アミノ官能が誘導体化
された後にはじめて除去される。意図された第１メンバ
ーをω−ＣＢＺ−リシンのα−アミノ基へ付着結合する
ことは便利ではあるが、必要ではない。事前保護ω−Ｃ
ＢＺ−リシンは本発明の立体障害態様を用いる三座体の
合成並びにターゲット標識態様を用いる三座体の合成に
おける出発スペーサー基として使用することができる。
例えば、図１に示す前述のＮＩＩＡのようなテオフィリ
ン用競争モジュレート検定に有用な汎用ビオチン−テオ
フィリン−ＤＮＰ三座体はω−ＣＢＺ−リシンから簡便
に合成することができる。この三座体の合成は図６に模
式的に示す。
【００５７】第１三座体メンバー、ビオチンは市販の活
性化ビオチン、ビオチン−ＮＨＳを利用してω−ＣＢＺ
−リシン（スぺーサー）のα−アミノ基へ結合すること
ができる。（例えば、ビオチン−Ｘ−ＮＨＳは長いスペ
ーサーが必要とされる場合に使用することができる。）
ω−ＣＢＺ−リシンを先ず炭酸水素塩溶液中に溶解し、
完全に溶解させるため沸騰加熱する。冷却して室温にも
どしてからろ過し、ビオチン−ＮＨＳ（活性化第１メン
バー）を溶液に加え、図６に示すように、ここでビオチ
ンの活性化カルボキシル基をリシンのα−アミノ基と縮
合させる。次いで誘導されたビオチニル−ＣＢＺ−リシ
ン（第１メンバー−スペーサー）を標準ろ過方法により
集める。ビオチニル−ＣＢＺ−リシンは通常第２メンバ
ー結合処理を行う前にさらに精製する必要はない。第２
三座体メンバー、テオフィリンを第一級アミンの形で誘
導体化リシンの活性化α−カルボキシル基へ付着結合さ
せる。テオフィリンの付着結合は保護されたω−アミノ
基の共役の前でも後でも行うことができる。テオフィリ
ンの所望の第一級アミン誘導体は前述の二官能共役体Ｉ
合成の第１段階で示したように８−ブロモテオフィリン
から調製することができる。テオフィリンを他の２つの
三座体メンバーと連結するスペーサー基の区画はテオフ
ィリンの第一級アミン誘導体の調製に使用するジアミン
そのものの選定により制御することができる。例えば、
エチレンジアミンをテオフィリン−エチレンジアミンの
調製に使用することができる。このようにして調製され
たテオフィリンの所望の第一級アミン誘導体は出発スペ
ーサー基との複合体調製のため無水ＤＭＦに溶解する。
【００５８】リシンスペーサーのα−アミノ基の誘導体
化から得られたビオチニル−ＣＢＺ−リシン（第１メン
バー−スペーサー）の固体は無水ＤＭＦに溶解し、約７
０℃に加熱してリシンスペーサーのα−カルボキシル基
をＣＤＩの添加により活性化する。冷却して室温に戻し
た後、予め溶解させたテオフィリンの選定第一級アミン
誘導体（第２メンバー）、すなわち、テオフィリン−エ
チレンジアミンを溶液中へ添加する。リシンスペーサー
の活性化されたα−カルボキシル基は、図６に示すよう
に、テオフィリンの第一級アミン誘導体と容易に縮合し
ビオチン−テオフィリン−ＣＢＺ−リシン誘導体（第１
メンバー−第２メンバー−スペーサー）を含有する沈殿
物を形成する。次いでこの沈殿物を集め乾燥したものを
こう配クロロホルム：メタノール混合液を用いるシリカ
ゲルカラム上での分離クロマトグラフィーにかけること
によりビオチン−テオフィリン−ＣＢＺ−リシン共役体
の精製を行うことができる。カルボベンゾキシ保護基は
二度誘導体化されたリシンスペーサーのω−アミノ基か
ら除去してω−アミノ基が第３メンバーと複合できるよ
うにしなければならない。カルボベンゾキシ保護基の除
去は多くの方法で行うことができる。１つの簡便な方法
は単離したビオチン−テオフィリン−ＣＢＺ−リシン
（第１メンバー−第２メンバー−スペーサー）を市販の
臭化水素酸の酢酸３０％（重量％、比重１．２６２）混
合液中に溶解することである。次に酸混合液を脱イオン
水で希釈した後固体炭酸水素ナトリウムを用い中和す
る。このように保護解除されたビオチン−テオフィリン
−ＣＢＺ−リシン複合体（第１メンバー−第２メンバ
ー、スペーサー）のω−アミノ基は意図された第３メン
バーの末端の活性化カルボキシル基を使用して誘導体化
することができる。
【００５９】末端カルボキシル基は意図された第３メン
バー、ＤＮＰと、ビス−アミノカプロン酸を２，４−ジ
ニトロ−フルオロベンゼン（サンガー試薬として知られ
るＤＮＰ前駆物質）と反応させてＤＮＰ−ビス−アミノ
カプロン酸を形成させることにより付着結合させること
ができる。この反応は室温において約２時間で完了す
る。図６に示すように、ビス−アミノカプロン酸はＤＮ
Ｐと他の三座体メンバーとを連結するスペーサー基の共
通区画に１４個の原子を与えている。スペーサーのこの
区画の長さはビス−アミノカプロン酸以外の代りのω−
アミノ酸を用いることによって容易に制御できる。例え
ば、５−アミノペンタノン酸を６−アミノカプロン酸と
縮合させて原子数１３のスペーサー挿入部を形成させる
ことができる。ＤＮＰ−ビス−アミノカプロン酸（第３
メンバー−スペーサー挿入部）は単離し、反応混合物を
蒸発乾固により精製し、残留物を脱イオン水に溶解し、
その溶液を塩酸で酸性にした後エチル酢酸を用い抽出し
てＤＮＰ−ビス−アミノカプロン酸（第３メンバー−ス
ペーサー挿入部）とすることができる。次にエチル酢酸
を除去し、標準シリカゲルカラムクロマトグラフィー法
を用いＤＮＰ−ビス−アミノカプロン酸をさらに精製す
ることができる。ＣＤＩ及びＮＨＳは酸の反応性ＮＨＳ
エステルを形成させることによりＤＮＰ−ビス−アミノ
カプロン酸（第３メンバー−スペーサー挿入部）の末端
カルボキシル基を活性化するのに使用する。この反応は
無水クロロホルム中で比較的急速に行われる。クロロホ
ルム溶液は乾燥近くまで蒸発させた後容積を無水ＤＭＦ
でもとに戻し、これを予め別に調製した保護解除ビオチ
ン−テオフィリン−リシン（第１メンバー−第２メンバ
ー−スペーサー）を含有する溶液に添加する。リシンス
ペーサー基の露出ω−アミノ基とＤＮＰ−ビス−アミノ
カプロン酸の活性化カルボキシル基（活性化第３メンバ
ー−スペーサー挿入部）との間の縮合反応は全く容易に
行われ、ビオチン−テオフィリン−ＤＮＰ三座体（第１
メンバー−第２メンバー−第３メンバー）の第３メンバ
ー結合が得られる。
【００６０】同じ市販の事前保護ω−ＣＢＺ−リシンも
また本発明のターゲット標識態様に用いる三座体用の出
発スペーサー基として使用することができる。例えば、
フェニルボロン酸−ニトロフェニルアジド−ビオチン複
合体の合成を図８に示す。ビオチン−テオフィリン−Ｄ
ＮＰ三座体合成の場合のように、カルボベンゾキシ保護
基はＣＢＺ−リシンのα−アミノ官能が誘導された後初
めて除去される。反応性アジド基は、図８に示したよう
に、３−ニトロ−４−フルオロフェニルアジドをＣＢＺ
−リシンのα−アミノ基と反応させることによって最初
にＣＢＺ−リシンに結合させる。アジド基は容易にＣＢ
Ｚ−リシンスペーサーに結合してアジド−ＣＢＺ−リシ
ン（反応性メンバー−スペーサー）が生成される。誘導
ＣＢＺ−リシンのα−カルボキシル官能は一般にＣＤＩ
及びＮＨＳを用いα−カルボキシル位置でさらに誘導が
行われる前に活性化される。共役体化に利用できる第一
級アミンを有するボロン酸基（ガイドメンバー）を次に
標準縮合反応により誘導アジド−ＣＢＺ−リシンの活性
化α−カルボキシル官能結合することができる。図８参
照。
【００６１】第３の三座体メンバーはカルボベンゾキシ
保護基が除去された後に初めて二度誘導体化されたボロ
ン酸−アジド−ＣＢＺ−リシン（ガイドメンバー−反応
性メンバー−スペーサー）に付着結合される。これは前
述のようにボロン酸−アジド−ＣＢＺ−リシン（ガイド
メンバー−反応性メンバー−スペーサー）を市販の臭化
水素酸の酢酸３０％（重量％、比重１．２６２）混合液
中に溶解することによって行うことができる。この酸混
合液を脱イオン水で希釈した後固体炭酸水素ナトリウム
を用い中和する。このように保護解除されたボロン酸−
アジド−リシン複合体（ガイドメンバー−反応性メンバ
ー−スペーサー）のω−アミノ基は意図された第３メン
バーの末端の活性化カルボキシル基を使用して誘導体化
することができるビオチンが意図された第３メンバーで
ある場合、市販のビオチン−ＮＨＳ（スペーサーに５原
子添加）又はビオチン−Ｘ−ＮＨＳ（スペーサーに１２
原子添加）を用いることができる。代りにビス−カプロ
アミドビオチン（ビオチン−Ｘ−Ｘ−ＮＨＳ）がスペー
サーに１２個の原子の添加が望まれる場合に簡便に使用
することができる。これら全ての「事前活性化」ビオチ
ン誘導体はリシン出発スペーサー基のω−アミノ基と容
易に縮合し、所望のボロン酸−アジド−ビオチン（ガイ
ドメンバー−反応性メンバー−意図された標識）三座共
役体が得られる。図９に示す三座共役体はビオチン−Ｘ
−Ｘ−ＮＨＳを最終誘導体化段階で使用して得られたも
のである。
【００６２】Ｃ．その他の三座体 本発明のその他の三座体はなおＣＢＺ−リシン、環状酸
アジド無水物、又はその他の適切な出発スペーサー基を
用いて合成することができる。例えば、図１０に示す本
発明の立体障害態様を用いる第１又は第３三座体メンバ
ーの１つが接近標識であるエネルギー転移検定用三座体
は容易に合成することができる。種々のエネルギー供与
体接近標識は三座体メンバーとして簡単に結合させるこ
とができる。これらおよびその他の三座共役体の作り方
は上記の説明に照らして当業者には明白であろう。
【００６３】
【実施例】例１ 二官能共役体Ｉの合成 スペーサー中へ挿入する変数としてヘキサンジアミン
（Ｎ＝６）を用いる二官能共役体Ｉの合成を図２に模式
的に示す。二官能共役体のＮ＝６同族体は下記の方法で
調製した。過剰量のヘキサンジアミン（ＮＨ2 −（ＣＨ
2 ）6 −ＮＨ2 ）を８−ブロモテオフィリンとともに窒
素気流下で２４時間還流した。還流反応終点は反応混合
物をＴＬＣ分析でシリカゲルを塗布したガラスＴＬＣ板
及び紫外線指示器を用いて決定した。反応混合物は次い
で減圧下で小容積になるまで蒸発させた。濃縮反応混合
物を少量のシリカゲルと混合し、熱板上で乾燥し、次い
でそのシリカゲル−試料混合物を開始溶離剤としてのク
ロロホルムを用いて注意深くシリカゲルカラムの頂部に
載せた。カラムはメタノールの量を変えたクロロホルム
を含有する溶媒で溶出処理した。こう配組成がクロロホ
ルム中メタノール２０％に達した時カラムをメタノール
２０％、アンモニア４％、クロロホルム７６％を含有す
る混合液で溶出処理した。純粋なＮ−（８−テオフィリ
ン）−６−アミノヘキサミンを含有する留分は一括して
回転蒸発器中で蒸発乾固した。白黄色の結晶固体はさら
に精製することなく次の反応に使用した。等モル量のＮ
−（８´−テオフィリン）−６−アミノヘキサミンを無
水ＤＭＦに溶解し、次いで対応するモル量のビオチン−
Ｘ−ＮＨＳと混合し室温で２４時間撹拌放置した。所望
の生成物をＤＭＦから白色の綿状固体として分離し、ろ
紙上に集め、カラムクロマトグラフィーよりＴＬＣ試験
で単一スポットとなるまで精製した。スペーサー基鎖長
は二座体の合成に用いるジアミン（ＮＨ2 −（ＣＨ2 ）
N −ＮＨ2 ）を選定することにより制御される。例え
ば、最初の合成段階でヘキサンジアミンを選定した場合
は、図２に示すように、６個の炭素原子がスペーサー基
鎖長に寄与する。この場合スペーサー基の近似的な長さ
は２６．０Åである。二官能共役体Ｉのスペーサー中へ
種々のジアミンをＮ−６同族体の調製に用いたのと同じ
操作を用い挿入することにより得られた鎖長を表１に示
す。
【００６４】
【表１】
【００６５】例２ 最小限スペーサー長の測定 最小限スペーサー長を抗テオフィリン抗体及びアビジン
の存在下で表１に示した各共役体により発生される信号
の量（レート）を検出することにより測定した。この測
定の目的は二官能共役体、抗体及びアビジンの化学量論
的比率における最適結合のための最小限スペーサー長を
単に求めることにあった。試薬は次のようにして調製し
た。テオフィリンに対するモノクロナール抗体をＩＣＳ
（商標）希釈液（ベックマン・インスツルメンツ、商標
ＩＣＳ試薬）中に１：１３．３に希釈した。ボーリンガ
ーマンハイムから購入したアビジンをＩＣＳ希釈液中に
０．１３ｍｇ／ｍｌの濃度になるよう溶解した。表１に
示した各二座共役体を種々の希釈率でｐＨ５．５の０．
１モルリン酸緩衝液に溶解した。ネフェロ分析測定はＩ
ＣＳ（商標）ネフェロメーター（ベックマン・インスツ
ルメンツ）にＩＣＳ（商標）ガラスびん（ベックマン・
インスツルメンツ）に入れた６００μｌのＩＣＳ緩衝液
（ベックマン・インスツルメンツ、商標ＩＣＳ試薬）を
置き、抗体溶液４２μｌ及びアビジン溶液４２μｌを注
入した。一時的な注入がおさまり、基線が得られた後、
４２μｌの二座共役体を添加し計器のピークレート信号
記録を開始させた。
【００６６】Ｎ＝２からＮ＝８までの結果を図１２に示
す。図１２において、水平軸の単位は２９５ｎｍでの吸
光度に基く二座体濃度を表わす。垂直軸の単位はＩＣＳ
（商標）マニュアルモードカードＭ３３（ベックマン・
インスツルメンツ）を用いて得たＩＣＳ（商標）レート
ユニットである。約２０００ユニット以上の高レート信
号の場合はＩＣＳ（商標）ローゲインカードを用い、そ
の結果はＭ３３ゲインに換算した。図１２の結果からわ
かるように、テオフィリン環炭素とビオチンの脂環炭素
の間に１７結合（１６原子）を有する二官能共役体Ｉの
最低級同族体（Ｎ＝２）は測定可能な複合体形成を得る
に至らなかった。その次の級の同族体（二座共役体Ｉ、
Ｎ＝３）から測定可能な複合体形成を示し始めた。それ
より高級な同族体（Ｎ＝４からＮ＝８）は相当した高さ
の信号を発し、Ｎ＝８で天井に達した。この研究はテオ
フィリンを第１二座体メンバーとして用い、ビオチンを
第２二座体メンバーとしてを用いた場合、信号を生成す
るためには約２２．２Åの最小限スペーサー長が必要で
あることを示している。最適としては、スペーサー長は
少なくとも約２３．５Å（二官能共役体Ｉ、Ｎ＝４）、
より好ましくは約２６．０から約２８．５Å（二官能共
役体Ｉ、Ｎ＝６からＮ＝８、すなわち、スペーサー中の
原子数２０から２２）である。
【００６７】例４ 二官能共役体IIの合成 二官能共役体Ｉで得られた結果を確認し、別の合成法を
実証するため第２の二官能共役体を調製した。スペーサ
ー中へ挿入する変数としてヘキサンジアミンを用いる二
官能共役体IIの合成を図５に模式的に示す。二官能共役
体IIのＮ＝６同族体は下記の方法で調製した。テオフィ
リン−８−酪酸を無水ＤＭＦに溶解し、約７０℃に約１
５分間保持し、次いで室温に冷却するまで放置した。冷
却した反応混合物に等モル量のＮＥＳを添加し、室温で
一晩中撹拌放置した。反応混合物に約３〜６モル過剰の
ヘキサンジアミン（Ｈ2 Ｎ−（ＣＨ2 ）6 −ＮＨ2 ）を
添加した。反応の完了は反応混合物をＴＬＣ分析でシリ
カゲルを塗布したガラスＴＬＣ板及び紫外線指示器を用
いて決定した。反応混合物は次いで減圧下で小容積にな
るまで蒸発させた。濃縮反応混合物を少量のシリカゲル
と混合し、熱板上で乾燥し、次いでそのシリカゲル−試
料混合物を開始溶離剤としてのシロロホルムを用いて注
意深くシリカゲルカラムの頂部に載せた。カラムはメタ
ノールの量を変えたクロロホルムを含有する溶媒で溶出
処理した。こう配組成がクロロホルム中メタノール２０
％に達した時カラムをメタノール２０％、アンモニア４
％、クロロホルム７６％を含有する混合液で溶出処理し
た。純粋な６−（８´−テオフィリン酪酸−カルボキサ
ミド）−ヘキシルアミンを含有する留分は一括して回転
蒸発器中で蒸発乾固した。白黄色の結晶固体はさらに精
製することなく次の反応に使用した。等モル量の６−
（８´−テオフィリン酪酸−カルボキサミド）−ヘキシ
ルアミンを無水ＤＭＦに溶解し、次いで対応するモル量
のビオチン−ＮＨＳと混合し室温で２４時間撹拌放置し
た。所望の生成物をＤＭＦから白色の綿状固体として分
離し、ろ紙上に集め、カラムクロマトグラフィーよりＴ
ＬＣ試験で単一スポットとなるまで精製した。二官能共
役体IIのＮ＝５の同族体をヘキサンジアミンの代りにペ
ンタンジアミンを用いた以外同じ操作により調製した。
これら２種の同族体のスペーサー長は表２に示す。
【００６８】
【表２】
【００６９】二官能共役体ＩのＮ＝２同族体は二官能共
役体IIのＮ＝５同族体と同等である（２１．０Å）。二
官能共役体Ｉ及びIIのそれぞれＮ＝３及びＮ＝６同族体
もまた同等である（２２．２Å）。第２シリーズのＮ＝
５同族体は第１シリーズのＮ＝２同族体同様測定し得る
複合体形成を作ることができなかった。しかしながら、
二官能共役体IIのＮ＝６同族体及び二官能共役体ＩのＮ
＝３同族体からは対比し得る信号が得られた。このこと
はテオフィリンとビオチン又は同様のハプテン及び／又
は低分子が第１及び第３三座体メンバーとして選定され
た場合、第１及び第３三座体メンバーのそれぞれの特異
結合パートナーとの同時結合が達成されるためには少な
くとも２２．２Åのスペーサー基が必要とされることを
確認している。
【００７０】例４ ビオチン−テオフィリン−ＤＮＰ三座体の合成 テオフィリンの競争モジュレート免疫検定に使用するビ
オチン−テオフィリン−ＤＮＰ三座体を出発スペーサー
基としてＣＢＺ−リシンを用い合成した。ビオチン−テ
オフィリン二官能共役体Ｉ同族体研究から得た最適最小
限スペーサー長データをビオチン−テオフィリン−ＤＮ
Ｐ三座体を設計する出発点として使用した。特に、約２
６．０から２８．５Å、すなわち、スペーサー中２０か
ら２２原子数の最適最小限スペーサー長を二官能共役体
のビオチンとテオフィリンメンバーの同時結合用として
認定した。（例２参照）。その１０〜２０％増、すなわ
ち、約２２から２６原子数がモジュレーションが存在し
ない場合の三座体のビオチン及びＤＮＰ（第１及び第
３）メンバーの同時結合を得るのに最適であると考え
た。ビオチンをモジュレートされるメンバーに選定し、
ビオチンとテオフィリン（モジュレートメンバー）を連
結するスペーサー基の区画を１２原子数というかなり短
いスペーサー長に選んだ。
【００７１】第１三座体メンバーの結合 出発スペーサー基、ω−カルボベンゾキシ−リシン（Ｃ
ＢＺ−リシン）を炭酸水素塩溶液中に添加し、完全に溶
解させるため沸騰加熱した後冷却して室温にもどした。
冷却溶液を溝つきろ紙を用いろ過した。意図する第１メ
ンバービオチンを含有する等モル量のビオチン−ＮＨＳ
を溶液に加え、室温で約２４時間撹拌した。白色固体の
ビオチニル−ＣＢＺ−リシンが形成されたが、これを標
準ろ過方法により集めた。このビオチニル−ＣＢＺ−リ
シンの粗生成物はその後の精製段階に付すことなく次の
三座体調製段階に使用した。
【００７２】第２三座体メンバーの結合 ビオチニル−ＣＢＺ−リシンを無水ＤＭＦに溶解し、そ
の混合物を約７０℃に加熱し、ＣＤＩの添加によってリ
シンのカルボキシル基を活性化した。活性化工程を約１
５分間行ってから冷却して室温に戻した。冷却した混合
物は室温で約３０分間さらに撹拌した。等モル量のテオ
フィリン−エチレンジアミンを先ずＤＭＦに溶解した後
冷却溶液に添加し、これを室温で一晩撹拌放置した。ビ
オチン−テオフィリン−ＣＢＺ−リシンを含有する白色
沈殿が一晩で形成され、これを標準ろ過方法で集め、乾
燥した。沈殿物は比較的少量の未同定不純物を含有した
がこれをこう配クロロホルム：メタノール混合液を使用
してシリカゲルカラム上で分離した。沈殿物は少量のシ
リカゲルと混合し、これを出発溶出液としてのクロロホ
ルムを用い注意深くシレカゲルカラムの頂部に載せた。
カラムはメタノールの比率を変えながらクロロホルム溶
媒でこう配組成がクロロホルム中メタノール２０％とな
るまで溶出した。カラムから溶出した最初の化合物はビ
オチン−テオフィリン−ＣＢＺ−リシンであったが、こ
れを集めて蒸発乾固により白色粉末結晶を得た。この白
色粉末結晶の紫外線吸収及びＴＬＣ分析により生成品が
ビオチン基及びテオフィリン基の両方を含有しているこ
とを確認した。
【００７３】第３三座体メンバーの結合 第３三座体メンバーを結合させるためには次の３段階が
必要であった。（１）リシン基の第３メンバー位置のω
−アミノ基をＣＢＺ基の除去によって保護解除しなけれ
ばならない、（２）カルボキシル基を意図される第３メ
ンバーの端部に結合させねばならない、（３）結合した
カルボキシル基をリシン基の第３メンバー位置の遊離ア
ミノ基と反応させるために活性化せねばならない。カル
ボベンゾキシ保護基のリシン基のω−アミノ基からの除
去は白色粉末結晶を市販の臭化水素酸の酢酸３０％（重
量％、比重１．２６２）混合液中に溶解することにより
行った。この酸混合液は脱イオン水でもとの容量の約５
０倍に希釈した後固体炭酸水素ナトリウムを用いて溶液
ｐＨが約８〜９になるまで中和した。この中和溶液は意
図される第３メンバーを結合用に調製する間脇に置いて
おいた。末端カルボキシル基を意図された第３三座体メ
ンバー（ＤＮＰ）にビス−アミノカプロン酸の２，４−
ジニトロフルオロベンゼン（サンガー試薬）との反応に
よって結合させた。特に、過剰量の２，４−ジニトロフ
ルオロベンゼンを予め炭酸水素ナトリウムの１Ｍ溶液に
溶解させておいたビス−アミノカプロン酸に添加し、室
温において約２時間反応させた。反応混合物を回転乾燥
機中減圧下で蒸発乾固した。残留物を脱イオン水に溶解
し、２８％（重量％）塩酸を用いｐＨ約１に酸性化し
た。ＤＮＰ−ビス−アミノカプロン酸を含有する黄色沈
殿物が形成され、これをエチル酢酸で抽出し、次にエチ
ル酢酸を回転蒸発器で除去し、黄色固体を得た。この固
体は上述のビオチン−テオフィリン−ＣＢＺ−リシン精
製と同じ標準シリカゲルカラムクロマトグラフィー法を
用いさらに精製した。
【００７４】ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ
Ｉ）及びＮＨＳをＤＮＰ−ビス−アミノカプロン酸の末
端カルボキシル基を酸の反応性エステルを形成させるこ
とによって活性化した。精製したＤＮＰ−ビス−アミノ
カプロン酸をまず無水クロロホルムに溶解し、これにＮ
ＨＳを徐々に添加した。ＤＮＰ−ビス−アミノカプロン
酸のＮＨＳエステルが約６０分以内で迅速に形成され
た。ＴＬＣ分析はこれが純粋なエステルであることを示
したが、それにもかかわらず、結晶化は困難であった。
従って、溶液を乾燥近くまで蒸発させた後容積を無水Ｄ
ＭＦでもとに戻した。ＤＮＰ−ビス−アミノカプロン酸
の活性化ＮＨＳエステルを含有するＤＭＦ溶液を予め別
に調製した保護解除ビオチン−テオフィリン−リシンを
含有する溶液に添加した。リシンスペーサー基の露出ω
−アミノ基とＤＮＰ−ビス−アミノカプロン酸の活性化
カルボキシル基との間の縮合反応は室温で全く容易に生
じ、三座体への第３メンバーの結合が得られた。完成し
た三座体の構造を図７に示す。
【００７５】例５ テオフィリン−アミン用ＮＩＩＡの二座複合体 テオフィリン−アミン用ＮＩＩＡ形式の検定は例４から
のビオチン−テオフィリン−ＤＮＰ三座体を用いて成功
裡に運転された。標準化した溶液からのテオフィリン−
アミンを所定量の抗テオフィリン抗体について第２三座
体メンバーと競争させた。テオフィリン−アミンの濃度
増加はモジュレーションの減少及びネフェロ分析信号の
増加を招いた。同じ三座体及び検定条件がテオフィリン
についても使用することができる。試薬は次のようにし
て調製した。テオフィリンに対するモノクロナール抗体
をＩＣＳ（商標）希釈液（ベックマン・インスツルメン
ツ、商標ＩＣＳ試薬）中に１：２０に希釈した。マイル
スラボラトリーズから購入した兎の抗−ＤＮＰ抗血清を
使用前にＩＣＳ希釈液中で透析した。ボーリンガーマン
ハイムから購入したアビジンをＩＣＳ希釈液に０．２５
ｍｇ／ｍｌの濃度になるよう溶解した。三座共役体をＩ
ＣＳ希釈液に２．０６×１０-8モル／ｍｌの濃度になる
よう溶解した。テオフィリン−アミンをＩＣＳ希釈液に
２．８×１０-8モル／ｍｌの濃度になるよう希釈した。
同様溶液を最終濃度がそれぞれ１．４×１０-8及び０．
５６×１０-8モル／ｍｌの濃度になるように調製した。
【００７６】モノクロナール抗テオフィリン抗体溶液１
３８μｌを試験管に入れ、次いでこれに２．８×１０-8
モル／ｍｌのテオフィリン−アミン１８．４μｌを添加
した。得られた混合液を室温で２分間撹拌した。次に三
座共役体溶液３０μｌを試験管に加え、混合後約２分間
放置した。ネフェロ分析測定はＩＣＳ（商標）ネフェロ
メーター（ベックマン・インスツルメンツ）にＩＣＳ
（商標）ガラスびん（ベックマン・インスツルメンツ）
に入れた６００μｌのＩＣＳ緩衝液（ベックマン・イン
スツルメンツ、商標ＩＣＳ試薬）を置き、上記混合液３
１μｌ及び抗ＤＮＰ抗血清５０μｌを注入した。マニュ
アルモードＭ３３の装置ゲイン設定を用いた。一時的な
注入がおさまり、基線が得られた後、１０μｌのアビジ
ン溶液を添加し計器のピークレート信号記録を開始させ
た。次に１．４ｘ１０-8及び０．５６ｘ１０-8モル／ｍ
ｌのテオフィリン−アミン溶液１８．４μｌ及びＩＣＳ
希釈液１８．４μｌ（ゼロ点試験）を用い同じ操作を繰
りかえした。結果を表３に示す。
【００７７】
【表３】
【００７８】例６ 汎用三座体を用いる酵素チャンネル法 同じビオチン−テオフィリン−ＤＮＰ三座体を競争モジ
ュレート酵素チャンネル検定を行うのに使用することが
できる。例えば、ヘキソキナーゼなどの第一酵素をアビ
ジン又は抗ＤＮＰ抗体のどちらかに付着結合させる。Ｇ
６ＰＤＨなどの第二酵素を他の特異結合パートナーに付
着結合させる。試験試料に由来するか校正標準のテオフ
ィリン又はテオフィリン−アミンが抗テオフィリン抗体
を三座体の第２（モジュレート）メンバーからそらせる
ことによって酵素のチャンネルをモジュレートする。
【００７９】ＨＫ−アビジン共役体の調製 ヘキソキナーゼのチオール化をＨＫ酵素をＤＭＦ２０％
(v/v) 含有ｐＨ７．５の０．１モルのリン酸塩緩衝液中
に懸濁し、この懸濁液をＳ−アセチルメルカプトコハク
酸無水物と温置することによって行う。反応が完了する
まで放置した後、混合物をｐＨ７．５の１．０モルヒド
ロキシルアミンで処理することによってヘキソキナーゼ
のチオール基を保護解除する。チオール化ヘキソキナー
ゼはこの混合物をセファレックス（商標）Ｇ−５０（ビ
ーズ状架橋デキストラン、スエーデンウプサラのファー
マシア製）カラムを通すか標準透析法よって単離するこ
とができる。アビジンもまたＤＭＦ２０％（ｖ／ｖ）含
有ｐＨ７．５の０．１モルのリン酸塩緩衝液中に懸濁
し、次いでメタ−マレイイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミド（ＭＢＳ−ＮＨＳ）で処理する。反
応混合物を次にセファレックス（商標）Ｇ−５０カラム
に通してＭＢＳ標識アビジンを単離することができる。
次に、等モル量のチオール化ヘキソキナーゼ及びＭＢＳ
標識アビジンを温置することによってＨＫ−アビジン複
合体を得る。
【００８０】Ｇ６ＰＤＨ−抗ＤＮＰ抗体の調製 Ｇ６ＰＤＨ−標識抗ＤＮＰ抗体はアビジン−ＨＫ複合体
の場合と殆ど同じ方法によって調製する。酵素は最初に
ＤＭＦ２０％(v/v) 含有ｐＨ７．５の０．１モルのリン
酸塩緩衝液中に懸濁し、この懸濁液をＳ−アセチルメル
カプトコハク酸無水物と温置することによってチオール
化する。反応が完了するまで放置した後、混合物をｐＨ
７．５の１．０モルヒドロキシルアミンで処理すること
によってＧ６ＰＤＨのチオール基を保護解除する。チオ
ール化Ｇ６ＰＤＨはこの混合物をセファレックス（商
標）Ｇ−５０カラムを通すか標準透析法よって単離する
ことができる。抗ＤＮＰ抗体もまたＤＭＦ２０％(v/v)
含有ｐＨ７．５の０．１モルのリン酸塩緩衝液中に懸濁
し、次いでＭＢＳ−ＮＨＳで処理する。反応混合物を次
にセファレックス（商標）Ｇ−５０カラムに通してＭＢ
Ｓ標識抗ＤＮＰ抗体を単離することができる。次に、等
モル量のチオール化Ｇ６ＰＤＨ及びＭＢＳ標識Ｇ６ＰＤ
Ｈを温置することによってＧ６ＰＤＨ−アビジン複合体
を得る。
【００８１】酵素チャンネル法用最適試薬濃度の決定 通常、信号生成の最適試薬濃度を決定することが望まれ
る。これは（１）モジュレーションがない場合最大限信
号が、（２）高価な試薬の最小限使用量でえられる点で
ある。次の試薬を使用する。 温置緩衝液：５０ミリモル・ビシン、ｐＨ８．４、１０
０ミリモル・ＫＣｌ、０．２％牛血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）、０．０５％アジ化ナトリウム 三座体溶液：約１μｇ／ｍｌテオフィリン当量濃度の三
座共役体の温置緩衝液溶液 接近標識溶液：等モル量のＨＫ−アビジンとＧ６ＰＤＨ
−抗ＤＮＰ抗体の温置緩衝液懸濁液、種々の濃度で調製 抗体溶液：抗テオフィリン抗体の温置緩衝液懸濁液、種
々の濃度で調製 基質混合液：５０ミリモル・ビシン、ｐＨ８．４、１０
０ミリモル・ＫＣｌ、６ミリモル・ＭｇＣｌ2 、３ミリ
モル・ＡＴＰ、３ミリモル・ＮＡＤ＋、４０ミリモル・
グルコース、４０％グリセロール
【００８２】初めに１００μｌの三座体溶液と１００μ
ｌの接近標識溶液を８００μｌの基質混合液中に添加す
る。ＮＡＤＨ生成のレート（速度）は溶液中へ逸出する
前にＧ６ＰＤＨによって作用されたＨＫにより発生する
グルコース−６−リン酸塩の量の測定値、すなわち、酵
素チャンネル化のレートである。この反応は４５０ｎｍ
の検出波長及び３４０ｎｍの励起波長設定の適切な蛍光
光度計を使用して測定することができる。測定は接近標
識溶液の希釈度を高めながらＮＡＤＨ生成レートが減少
し始めるまで繰り返す。これにより最大限の信号発生に
必要な接近標識溶液の最小限濃度が確定される。接近標
識溶液の最小限濃度が設定された後に、最大限の立体障
害が生じるのに必要な抗テオフィリン抗体の最適量が決
定される。この決定を行うために１００μｌの三座体溶
液を１００μｌの抗体溶液に混合し、約５〜１５分間温
置する。（抗原：抗体反応の安定状態の平衡は抗原、抗
体のどちらかが固体表面に結合する系の場合とは対象的
に非常に早く到達する。）次に、１００μｌの最適化し
た接近標識溶液を加え、全体の反応混合液をさらに５〜
１５分間温置する。７００μｌの基質溶液を最終的に加
え、ＮＡＤＨ生成レートを上述した蛍光光度計を使用し
て監視する。この検定は抗体溶液の濃度を高め（希釈度
を低め）ながらＮＡＤＨ生成レートが最小限値、すなわ
ち、抗体溶液の濃度を高めてもレートが下がらなくなる
まで繰り返す。これが最大限の立体障害を生じるのに必
要な抗体溶液の最小限濃度である。
【００８３】被検出体の検定 はじめに１００μｌアリコートの患者の試験試料を１０
０μｌアリコートの三座体溶液と混合する。次にこの混
合液を１００μｌの最適化抗体溶液とともに約５〜１５
分間温置する。つぎにこの温置溶液に１００μｌアリコ
ートの最適化接近標識溶液を加え、その混合液をさらに
５〜１５分間温置する。その点で、６００μｌの基質溶
液を加えてＮＡＤＨ形成レートを適当な蛍光光度計を使
用して監視する。次に、同じ操作を種々の希釈度のテオ
フィリン又はテオフィリン−アミン溶液について繰り返
し、それらから標準曲線を得る。標準曲線からテオフィ
リン又はテオフィリン−アミンの濃度を内挿することが
できる。
【００８４】例７ 汎用三座体を使用するエネルギー転移法 同じビオチン−テオフィリン−ＤＮＰ三座体を競争モジ
ュレート化エネルギー転移検定に使用することができ
る。例えば、化学発光分子イソルミノールなどのエネル
ギー供与体をアビジン又は抗ＤＮＰ抗体に付着結合させ
る。フルオレセインイソチオシアネートなどのエネルギ
ー受容体を他の特異結合パートナーに付着結合させる。
試験試料由来又は校正標準の遊離テオフィリン又はテオ
フィリン−アミンが抗テオフィリン抗体を三座体の第２
（モジュレート）メンバーからそらせておくことにより
エネルギー転移をモジュレートする。
【００８５】イソルミノール−アビジン三座体の調製 過剰量のアミノブチルエチルアミノ−イソルミナールの
イソチオシアネート誘導体をＤＭＦに溶解する。次にア
ビジンをｐＨ９．５の０．１モル炭酸ナトリウム／炭酸
水素ナトリウム緩衝液に懸濁させてアビジン溶液を作成
する。次にイソルミナール含有ＤＭＦ溶液をアビジン溶
液に添加して約４℃で約１２時間温置する。その後過剰
のイソルミナール標識を示量透析により除去し、次いで
セファレックス（商標）Ｇ−５０カラムを用いるゲルろ
過処理する。
【００８６】フルオレセイン−抗ＤＮＰ抗体三座体の調製 フルオレセイン−標識つき抗体は同様な方法で調製する
ことができる。過剰量のフルオレセインイソチオシアネ
ートをｐ−ジオキサンに溶解する。次に兎の抗ＤＮＰ抗
体をｐＨ９．５の０．１モル炭酸ナトリウム／炭酸水素
ナトリウム緩衝液に懸濁させて抗体溶液を作成する。次
にフルオレセイン含有ｐ−ジオキサン溶液を抗体溶液に
添加して約４℃で約１２時間温置する。その後過剰のフ
ルオレセイン標識を示量透析により除去し、次いでセフ
ァレックス（商標）Ｇ−５０カラムを用いるゲルろ過処
理する。
【００８７】エネルギー転移法用最適試薬濃度の決定 次の試薬を使用する。 温置緩衝液：５０ミリモル・リン酸塩緩衝液、ｐＨ７．
４ 三座体溶液：約１μｇ／ｍｌテオフィリン当量濃度の三
座共役体の温置緩衝液溶液 接近標識溶液：等モル量のイソルミノール−アビジンと
フルオレセイン−抗ＤＮＰ抗体の温置緩衝液懸濁液、種
々の濃度で調製 抗体溶液：抗テオフィリン抗体の温置緩衝液懸濁液、種
々の濃度で調製 化学発光トリッガー試薬：１００ミリモル・バルビトン
緩衝液中５ミリモル・ミクロペルオキシダーゼ（シグマ
・ケミカルス）、ｐＨ９、０．０１％ＢＳＡ及び０．１
７５モル・Ｈ2 Ｏ2
【００８８】三座共役体の与えられた濃度において得ら
れる最大限化学発光エネルギー転移を最初に評価する。
初めに１００μｌの三座体溶液と１００μｌの未希釈接
近標識溶液を室温で約５〜１５分間温置する。次にこの
混合物のアリコートを２個の光電子増倍管の前の４６０
ｎｍ（フルオレセインの励起波長）と５２５ｎｍ（フル
オレセインの発光波長）の２種のバンド通過フィルター
を有する発光光度計にいれる。次いで適切量の化学発光
トリッガー試薬を添加し、存在するイソルミノール分子
による発光を誘発する。イソルミノール分子は約４６０
ｎｍで光を放射する。イソルミノールがフルオレセイン
標識と密接接近する場合、フルオレセインは５２５ｎｍ
での蛍光エネルギーの共存発光で４６０ｎｍにおいて放
射された光を吸収する。光レベルの５２５／４６０ｎｍ
の比率はエネルギー転移の増加とともに増大する。これ
らの測定は接近標識溶液の希釈度を高めながら光レベル
の比率が減少し始めるまで繰り返す。これにより最大限
の信号発生に必要な接近標識溶液の最小限濃度が確定さ
れる。接近標識溶液の最小限濃度が設定された後に、最
大限の立体障害が生じるのに必要な抗テオフィリン抗体
の最適量が決定される。この決定を行うために抗テオフ
ィリン抗体を化学発光トリッガーの添加前に温置混合液
に添加する。抗テオフィリン抗体の量を増加させながら
添加し、抗体溶液の濃度を高めても測定可能なエネルギ
ー転移をさらに低下できなくなるまで順次測定する。こ
れが最大限の立体障害を生じるのに必要な抗体溶液の最
小限濃度である。
【００８９】被検出体の検定 はじめに１００μｌアリコートの患者の試験試料を１０
０μｌアリコートの最適化抗体溶液と混合する。次にこ
の混合液を１００μｌアリコートの三座体溶液及び接近
標識溶液を加え、その混合液をさらに５〜１５分間温置
する。この混合液のアリコートを発光光度計にいれ、信
号が測定されるまで適量の化学発光トリガー試薬を添加
する。次に、同じ操作を種々の希釈度のテオフィリン又
はテオフィリン−アミン溶液について繰り返し、それら
から標準曲線を得る。標準曲線から試料中のテオフィリ
ン又はテオフィリン−アミンの濃度を内挿することがで
きる。
【００９０】例７ 三座体メンバーの１つが接近標識であるエネルギー転移 例６で述べたのと同じ一般操作を三座体メンバーの１つ
として接近標識を有する三座体が用いられる場合に用い
ることができる。例えば、図１０Ａに示す三座体を使用
することができる。この例では接近標識溶液はフルオレ
セイン−抗ＤＮＰ抗体のみを含有している。その他の全
てに関しては例６で述べたのと同じ最適化及び検定操作
が用いられる。
【００９１】例８ 三座体メンバーの１つが固体支持体であるエネルギー転
移 例６で述べたのと同じ一般操作を三座体メンバーの１つ
として複数の接近標識と共役した巨大分子を有する三座
体が用いられる場合にもまた用いることができる。巨大
分子は図１１に示すような固体支持体であってよい。図
１１に示す三座体を使用する場合も接近標識溶液はフル
オレセイン−抗ＤＮＰ抗体のみを含有している。その他
の全てに関しては固体支持体を使用する系の反応速度が
遅いことを考慮して温置時間を延長する以外例６で述べ
たのと同じ最適化及び検定操作が用いられる。
【００９２】例９ グリコシル化タンパク質へのビオチン標識の付着結合 図９に示すボロン酸−アジド−ビオチン三座体がグリコ
シル化タンパク質の指示位置、すなわち、糖基へビオチ
ン標識を付着結合するのに用いられる。この操作は抗
体、酵素又は抗原のビオチニル化に特に有用である。
【００９３】ガイドメンバーのターゲット結合 次の試薬を使用する。 グリコシル化タンパク質溶液：抗体溶液、腹水液、抗原
溶液及び酵素標本のようなどのグリコシル化タンパク質
溶液も用いることができる。これら溶液の多くは市販さ
れている。 緩衝剤溶液：５０ミリモル・Ｎ−メチルモルホリン塩化
物、ｐＨ７．２、１００ミリモル・塩化マグネシウム 三座体溶液：図９に示す三座体を１０％（ｗ／ｖ）Ｎａ
ＯＨに溶解し三座体のボロン酸基（ガイドメンバー）の
保護解除をする。 グリコシル化タンパク質溶液を緩衝剤溶液中で透析し、
脇に置いておく。次に三座体溶液を同じ緩衝剤溶液で希
釈する。グリコシル化タンパク質溶液に対し約１０〜１
００倍の三座体に相当する希釈三座体溶液のアリコート
を取り出し、このアリコートを透析したグリコシル化タ
ンパク質溶液に添加し、全体の混合物を室温、暗所で約
２時間温置する。温置に続いて反応混合物を暗所でセフ
ァレックス（商標）Ｇ−５０カラム上でクロマトグラフ
ィー処理すればタンパク質留分を単離することができ
る。このタンパク質留分はボロン酸複合体（ガイドメン
バー結合）を含有する。
【００９４】反応性メンバーの付着結合 次に単離生成物をマツダ１２５Ｗ・ＭＢ／Ｖパールガラ
スランプのような適当な紫外線光源を照射する。照射は
０℃で照射器から約５から約２０ｃｍの距離のところで
行う。アジドからナイトレンへの完全な転化を行わせる
ため照射は数時間続けられる。三座体のグリヒシル化タ
ンパク質への光カップリングはアジド残基のナイトレン
への転化後殆ど直後に生じる。光カップリングに続いて
反応混合物は標準の透析技術を使用して殆どの標準緩衝
剤溶液のうちどれか溶液中で透析し、残留する光化学カ
ップリング未了三座体を除去することができる。本発明
の範囲内にあると考えられるその他の形式の三座共役体
及びそれらの使用方法は当業者には明白であろう。本発
明の本質的な精神から離れることなく本発明をいくつか
の形式で具体化することができるから、本発明は上記の
記載に対照させて別記の特許請求の範囲により明確にさ
れるべきものである。
【００９５】
【発明の効果】本発明の三座共役体は、従来の顕色剤抗
原とは異なり、長期にわたり貯蔵でき、かつ経費のかか
る精製及び特性化操作を必要としない安定で化学的に一
定の有機化合物である。また、本発明の三座体は、従来
の顕色剤抗原に共役した複数のハプテン部分の競争によ
る複合体化ではなく、三座体のただ１つの部分、すなわ
ち、第２（モジュレート）メンバーの遊離被検出体との
競争を利用することによって感度が改善されているた
め、立体障害を利用した免疫検定に用いるのに好適であ
る。
【００９６】本発明の三座体を用いた免疫検定方法は、
従来の方法と異なり、タンパク質を変性しかねない過激
な反応条件や非特異結合生成を招くことなく、タンパク
質の多糖基にターゲットモディフィケーションすること
ができる。さらに、本発明の三座体を用いた免疫検定方
法は、モジュレート三座体メンバーとして抗原フラグメ
ントを有効に使用することができる方法を用いて、ハプ
テンや薬剤を簡便に検定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の特定の実施態様を用いるネフェロ分析
免疫検定の説明図ある。
【図２】二座共役体Ｉ類似体の合成の模式図である。
【図３】二座共役体II類似体の合成の模式図である。
【図４】出発スペーサー基としてピログルタミン酸を用
いる三座共役体の一般的な合成の模式図である。
【図５】出発スペーサー基としてＳ−アセチル−メルカ
プトコハク酸を用いる三座共役体の一般的な合成の模式
図である。
【図６】出発スペーサー基としてカルボベンゾキシリシ
ンを用いるビオチン−テオフィリン−ＤＮＰ三座共役体
の合成の模式図である。
【図７】本発明の立体障害実施態様での使用を目途とす
るビオチン−テオフィリン−ＤＮＰ三座共役体の立体配
置の説明図である。
【図８】出発スペーサー基としてカルボベンゾキシリシ
ンを用いるフェニルホウ酸−ニトロェニルアジド−ビオ
チン三座共役体の合成の模式図である。
【図９】本発明のターゲット標識実施態様での使用を目
途とするフェニルボロン酸−ニトロフェニルアジド−ビ
オチン三座体の立体配置の説明図である。
【図１０】三座体メンバーの１つが接近標識である本発
明の立体障害実施態様を用いるエネルギー転移検定での
使用を目途とする３種の異なった三座共役体の立体配置
の説明図である。
【図１１】三座体メンバーの１つが複数の標識と共役し
た固体支持体である本発明の立体障害実施態様を用いる
エネルギー転移検定での使用を目途とする一連の同一三
座共役体の模式図である。
【図１２】モジュレーションなしの状態でそれぞれの巨
大分子特異結合パートナーと同時に結合する三座共役体
の第１及び第３メンバーの性能に対するスペーサ長の効
果を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/536 Ａ 8310−2Ｊ (72)発明者 ジェイムズ シー スターンバーグ アメリカ合衆国 92635 カリフォルニア 州 フラートン キャタリーナ ロード 201

Claims (142)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 適当なスペーサー基を通じて互いに結合
    した３つの三座体メンバーを有し、該三座体メンバーの
    少なくとも２つが低分子である三座共役体。
  2. 【請求項２】 該三座体メンバーの少なくとも１つが低
    分子配位子である請求項１記載の三座共役体。
  3. 【請求項３】 該スペーサー基が巨大分子特異結合パー
    トナーの低分子配位子メンバーに対する結合が異なった
    巨大分子の少なくとも１つの他の三座メンバーとの結合
    を立体的に阻害するように選択される請求項２記載の三
    座共役体。
  4. 【請求項４】 該低分子配位子メンバーが関心とする被
    検出体と同一又は類似である請求項３記載の三座共役
    体。
  5. 【請求項５】 該関心とする被検出体がハプテン、ホル
    モン、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド及びビタミン
    からなる群から選ばれる請求項４記載の三座共役体。
  6. 【請求項６】 該被検出体が約１００及び１５００ダル
    トンの間の分子量を有するハプテンである請求項５記載
    の三座共役体。
  7. 【請求項７】 第１三座体メンバー及び第２三座体メン
    バーが同じ巨大分子と結合可能である請求項１記載の三
    座共役体。
  8. 【請求項８】 該第１三座体メンバーが該巨大分子上の
    １つ又は複数の位置を探索し結合することができる請求
    項７記載の三座共役体。
  9. 【請求項９】 該第２三座体メンバーが該第１三座体メ
    ンバーが結合する該位置の近接部で該巨大分子と永久結
    合できるものである請求項８記載の三座共役体。
  10. 【請求項１０】 第３三座体メンバーが標識、トレーサ
    ー、リポーター基、固体支持体からなる群から選ばれる
    請求項９記載の三座共役体。
  11. 【請求項１１】 該第１三座体メンバーが化学的活性基
    である請求項１０記載の三座共役体。
  12. 【請求項１２】 該第１三座体メンバーがフェニルボロ
    ン酸である請求項１１記載の三座共役体。
  13. 【請求項１３】 該第１三座体メンバーが低分子配位子
    である請求項１０記載の三座共役体。
  14. 【請求項１４】 該第２三座体メンバーが化学的活性基
    である請求項１０記載の三座共役体。
  15. 【請求項１５】 該第２三座体メンバーがアジド残基で
    ある請求項１４記載の三座共役体。
  16. 【請求項１６】 該第１及び第２三座体メンバーが化学
    的活性基である請求項１４記載の三座共役体。
  17. 【請求項１７】 該第１三座体メンバーがフェニルボロ
    ン酸であり、該第２三座体メンバーがアジド残基である
    請求項１６記載の三座共役体。
  18. 【請求項１８】 該第３三座体メンバーがアがビオチン
    である請求項１７記載の三座共役体。
  19. 【請求項１９】 該第１三座体メンバーが低分子配位子
    であり、該第２三座体メンバーが化学的活性基である請
    求項１４記載の三座共役体。
  20. 【請求項２０】 該第１三座体メンバーが低分子配位子
    であり、該第２三座体メンバーがアジド残基である請求
    項１９記載の三座共役体。
  21. 【請求項２１】 該三座体メンバーの少なくとも２つが
    低分子配位子である請求項１記載の三座共役体。
  22. 【請求項２２】 該スペーサー基が第１巨大分子特異結
    合パートナーの第１低分子配位子メンバーに対する結合
    が第２巨大分子特異結合パートナーの第２低分子配位子
    メンバーとの結合によって立体的に阻害されるように選
    択される請求項２１記載の三座共役体。
  23. 【請求項２３】 該第２低分子配位子メンバーが関心の
    被検出体と同一又は類似である請求項２２記載の三座共
    役体。
  24. 【請求項２４】 該関心とする被検出体がハプテン、ホ
    ルモン、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド及びビタミ
    ンからなる群から選ばれる請求項２３記載の三座共役
    体。
  25. 【請求項２５】 該被検出体が約１００及び１５００ダ
    ルトンの間の分子量を有するハプテンである請求項２４
    記載の三座共役体。
  26. 【請求項２６】 該被検出体がテオフィリン、テオフィ
    リン−アミン、ジゴキシン、ジソピラミド、ライドカイ
    ン、プロカインアミド、プロパノロール、キニジン、ア
    ミカマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシ
    ン、カナマイシン、ネチルマイシン、トブラマイシン、
    三環抗うつ剤、エソスクシミド、フェノバルビタール、
    フェニトイン、プリミドン、バルプロイン酸、アセトミ
    ノフェン、アセチルサリチル酸、メソトレキセート、及
    びモルフィネ、コデイン、ヘロインなどの悪習薬並びに
    それらの代謝生成物、ＤＮＰ、１−置換−４−ヒドロキ
    シ−２−ニトロベンゼン及び４−置換−２−ニトロ−ト
    リアルキルアニリニウム塩からなる群から選ばれる請求
    項２５記載の三座共役体。
  27. 【請求項２７】 該被検出体がテオフィリン及びテオフ
    ィリン−アミンからなる群から選ばれる請求項２６記載
    の三座共役体。
  28. 【請求項２８】 該第１低分子配位子がビオチン及びＤ
    ＮＰからなる群から選ばれる請求項２７記載の三座共役
    体。
  29. 【請求項２９】 該第１巨大分子特異結合パートナーが
    第１接近標識に複合している請求項２３記載の三座共役
    体。
  30. 【請求項３０】 該関心とする被検出体がハプテン、ホ
    ルモン、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド及びビタミ
    ンからなる群から選ばれる請求項２９記載の三座共役
    体。
  31. 【請求項３１】 該被検出体が約１００及び１５００ダ
    ルトンの間の分子量を有するハプテンである請求項３０
    記載の三座共役体。
  32. 【請求項３２】 該被検出体がテオフィリン、テオフィ
    リン−アミン、ジゴキシン、ジソピラミド、ライドカイ
    ン、プロカインアミド、プロパノロール、キニジン、ア
    ミカマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシ
    ン、カナマイシン、ネチルマイシン、トブラマイシン、
    三環抗うつ剤、エソスクシミド、フェノバルビタール、
    フェニトイン、プリミドン、バルプロイン酸、アセトミ
    ノフェン、アセチルサリチル酸、メソトレキセート、及
    びモルフィネ、コデイン、ヘロインなどの悪習薬並びに
    それらの代謝生成物、ＤＮＰ、１−置換−４−ヒドロキ
    シ−２−ニトロベンゼン及び４−置換−２−ニトロ−ト
    リアルキルアニリニウム塩からなる群から選ばれる請求
    項３１記載の三座共役体。
  33. 【請求項３３】 該被検出体がテオフィリン及びテオフ
    ィリン−アミンからなる群から選ばれる請求項３２記載
    の三座共役体。
  34. 【請求項３４】 該第１低分子配位子がビオチン及びＤ
    ＮＰからなる群から選ばれる請求項３３記載の三座共役
    体。
  35. 【請求項３５】 該三座体メンバーの１つが第２接近標
    識である請求項２９記載の三座共役体。
  36. 【請求項３６】 該関心とする被検出体がハプテン、ホ
    ルモン、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド及びビタミ
    ンからなる群から選ばれる請求項３５記載の三座共役
    体。
  37. 【請求項３７】 該被検出体が約１００及び１５００ダ
    ルトンの間の分子量を有するハプテンである請求項３６
    記載の三座共役体。
  38. 【請求項３８】 該被検出体がテオフィリン、テオフィ
    リン−アミン、ジゴキシン、ジソピラミド、ライドカイ
    ン、プロカインアミド、プロパノロール、キニジン、ア
    ミカマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシ
    ン、カナマイシン、ネチルマイシン、トブラマイシン、
    三環抗うつ剤、エソスクシミド、フェノバルビタール、
    フェニトイン、プリミドン、バルプロイン酸、アセトミ
    ノフェン、アセチルサリチル酸、メソトレキセート、及
    びモルフィネ、コデイン、ヘロインなどの悪習薬並びに
    それらの代謝生成物、ＤＮＰ、１−置換−４−ヒドロキ
    シ−２−ニトロベンゼン及び４−置換−２−ニトロ−ト
    リアルキルアニリニウム塩からなる群から選ばれる請求
    項３７記載の三座共役体。
  39. 【請求項３９】 該被検出体がテオフィリン及びテオフ
    ィリン−アミンからなる群から選ばれる請求項３８記載
    の三座共役体。
  40. 【請求項４０】 該第１低分子配位子がビオチン及びＤ
    ＮＰからなる群から選ばれる請求項３９記載の三座共役
    体。
  41. 【請求項４１】 該三座体メンバーの１つが複数の第２
    接近標識と共役された巨大分子である請求項２９記載の
    三座共役体。
  42. 【請求項４２】 該関心とする被検出体がハプテン、ホ
    ルモン、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド及びビタミ
    ンからなる群から選ばれる請求項４１記載の三座共役
    体。
  43. 【請求項４３】 該被検出体が約１００及び１５００ダ
    ルトンの間の分子量を有するハプテンである請求項４２
    記載の三座共役体。
  44. 【請求項４４】 該被検出体がテオフィリン、テオフィ
    リン−アミン、ジゴキシン、ジソピラミド、ライドカイ
    ン、プロカインアミド、プロパノロール、キニジン、ア
    ミカマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシ
    ン、カナマイシン、ネチルマイシン、トブラマイシン、
    三環抗うつ剤、エソスクシミド、フェノバルビタール、
    フェニトイン、プリミドン、バルプロイン酸、アセトミ
    ノフェン、アセチルサリチル酸、メソトレキセート、及
    びモルフィネ、コデイン、ヘロインなどの悪習薬並びに
    それらの代謝生成物、ＤＮＰ、１−置換−４−ヒドロキ
    シ−２−ニトロベンゼン及び４−置換−２−ニトロ−ト
    リアルキルアニリニウム塩からなる群から選ばれる請求
    項４３記載の三座共役体。
  45. 【請求項４５】 該被検出体がテオフィリン及びテオフ
    ィリン−アミンからなる群から選ばれる請求項４４記載
    の三座共役体。
  46. 【請求項４６】 該第１低分子配位子がビオチン及びＤ
    ＮＰからなる群から選ばれる請求項４５記載の三座共役
    体。
  47. 【請求項４７】 該第１及び第２接近標識がエネルギー
    供与体及びエネルギー受容体からなる群から選ばれる請
    求項３５記載の三座共役体。
  48. 【請求項４８】 該エネルギー供与体が蛍光化合物、シ
    ンチレーション染料及び化学発光化合物からなる群から
    選ばれる請求項４７記載の三座共役体。
  49. 【請求項４９】 該エネルギー受容体がフルオレセイ
    ン、ローダミン、蛍光ランタニドキレート剤及びプロト
    ポルフィリンの蛍光性スズ又は亜鉛誘導体からなる群か
    ら選ばれる請求項４７記載の三座共役体。
  50. 【請求項５０】 該エネルギー供与体がイソルミノール
    である請求項４８記載の三座共役体。
  51. 【請求項５１】 該エネルギー供与体がアクリジンエス
    テルである請求項４８記載の三座共役体。
  52. 【請求項５２】 該エネルギー受容体がフルオレセイン
    である請求項４９記載の三座共役体。
  53. 【請求項５３】 該エネルギー受容体がローダミンであ
    る請求項４９記載の三座共役体。
  54. 【請求項５４】 該エネルギー供与体がイソルミナール
    であり、かつ該エネルギー受容体がフルオレセンである
    請求項５２記載の三座共役体。
  55. 【請求項５５】 該エネルギー供与体がアクリジンエス
    テルであり、かつ該ネルギー受容体がフルオレセインで
    ある請求項５２記載の三座共役体。
  56. 【請求項５６】 該エネルギー供与体がフルオレセイン
    であり、該エネルギー受容体がローダミンである請求項
    ５３記載の三座共役体。
  57. 【請求項５７】 該第１及び第２接近標識が酵素である
    請求項３５記載の三座共役体。
  58. 【請求項５８】 該酵素がグルコースオキシダーゼ及び
    ペルオキシダーゼからなる群から選ばれる請求項５７記
    載の三座共役体。
  59. 【請求項５９】 該第１及び第２酵素がヘキソナーゼ及
    びグルコース−６−リン酸塩デヒドロキシナーゼからな
    る群から選ばれる請求項５７記載の三座共役体。
  60. 【請求項６０】 該第１及び第２接近標識がエネルギー
    供与体及びエネルギー受容体からなる群から選ばれる請
    求項４１記載の三座共役体。
  61. 【請求項６１】 該エネルギー供与体が蛍光化合物、シ
    ンチレーション染料及び化学発光化合物からなる群から
    選ばれる請求項６０記載の三座共役体。
  62. 【請求項６２】 該エネルギー受容体がフルオレセイ
    ン、ローダミン、蛍光ランタニドキレート及びプロトポ
    ルフィリンの蛍光スズ及び亜鉛誘導体からなる群から選
    ばれる請求項６０記載の三座共役体。
  63. 【請求項６３】 該エネルギー供与体がイソルミノール
    である請求項６１記載の三座共役体。
  64. 【請求項６４】 該エネルギー供与体がアクリジンエス
    テルである請求項６１記載の三座共役体。
  65. 【請求項６５】 該エネルギー受容体がフルオレセイン
    である請求項６２記載の三座共役体。
  66. 【請求項６６】 該エネルギー受容体がローダミンであ
    る請求項６２記載の三座共役体。
  67. 【請求項６７】 該エネルギー供与体がイソルミナール
    であり、かつ該エネルギー受容体がフルオレセンである
    請求項６５記載の三座共役体。
  68. 【請求項６８】 該エネルギー供与体がアクリジンエス
    テルであり、かつ該ネルギー受容体がフルオレセインで
    ある請求項６５記載の三座共役体。
  69. 【請求項６９】 該エネルギー供与体がフルオレセイン
    であり、該エネルギー受容体がローダミンである請求項
    ６６記載の三座共役体。
  70. 【請求項７０】 該第１及び第２接近標識が酵素である
    請求項４１記載の三座共役体。
  71. 【請求項７１】 該酵素がグルコースオキシダーゼ及び
    ペルオキシダーゼからなる群から選ばれる請求項７０記
    載の三座共役体。
  72. 【請求項７２】 該第１及び第２酵素がヘキソナーゼ及
    びグルコース−６−リン酸塩デヒドロキシナーゼからな
    る群から選ばれる請求項７０記載の三座共役体。
  73. 【請求項７３】 第１三座体メンバーおよび第２三座体
    メンバーが同じ巨大分子と結合可能である請求項２１記
    載の三座共役体。
  74. 【請求項７４】 該第１三座体メンバーが該巨大分子上
    の１つ又は複数の位置を探索し結合することができる請
    求項７３記載の三座共役体。
  75. 【請求項７５】 該第２三座体メンバーが該第１三座体
    メンバーが結合する該位置の近接部で該巨大分子と永久
    結合できるものである請求項７４記載の三座共役体。
  76. 【請求項７６】 第３三座体メンバーが標識、トレーサ
    ー、リポーター基、固体支持体からなる群から選ばれる
    請求項７５記載の三座共役体。
  77. 【請求項７７】 該第１三座体メンバーが低分子配位子
    であり、該第２三座体メンバーが化学的活性基である請
    求項７６記載の三座共役体。
  78. 【請求項７８】 該第１三座体メンバーが低分子配位子
    であり、該第２三座体メンバーがアジド残基である請求
    項７７記載の三座共役体。
  79. 【請求項７９】 該三座体メンバーのすべての３つが低
    分子配位子である請求項１記載の三座共役体。
  80. 【請求項８０】 該スペーサー基が第１巨大分子特異結
    合パートナーの第１低分子配位子メンバーに対する結合
    が第２巨大分子特異結合パートナーの第２低分子配位子
    メンバーとの結合によって立体的に阻害されるように選
    択される請求項７９記載の三座共役体。
  81. 【請求項８１】 該第２低分子配位子メンバーが関心と
    する被検出体と同一又は類似である請求項８０記載の三
    座共役体。
  82. 【請求項８２】 該関心とする被検出体がハプテン、ホ
    ルモン、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド及びビタミ
    ンからなる群から選ばれる請求項８１記載の三座共役
    体。
  83. 【請求項８３】 該被検出体が約１００及び１５００ダ
    ルトンの間の分子量を有するハプテンである請求項８２
    記載の三座共役体。
  84. 【請求項８４】 該被検出体がテオフィリン、テオフィ
    リン−アミン、ジゴキシン、ジソピラミド、ライドカイ
    ン、プロカインアミド、プロパノロール、キニジン、ア
    ミカマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシ
    ン、カナマイシン、ネチルマイシン、トブラマイシン、
    三環抗うつ剤、エソスクシミド、フェノバルビタール、
    フェニトイン、プリミドン、バルプロイン酸、アセトミ
    ノフェン、アセチルサリチル酸、メソトレキセート、及
    びモルフィネ、コデイン、ヘロインなどの悪習薬並びに
    それらの代謝生成物、ＤＮＰ、１−置換−４−ヒドロキ
    シ−２−ニトロベンゼン及び４−置換−２−ニトロ−ト
    リアルキルアニリニウム塩からなる群から選ばれる請求
    項８３記載の三座共役体。
  85. 【請求項８５】 該被検出体がテオフィリン及びテオフ
    ィリン−アミンからなる群から選ばれる請求項８４記載
    の三座共役体。
  86. 【請求項８６】 該第１低分子配位子がビオチン及びＤ
    ＮＰからなる群から選ばれる請求項８５記載の三座共役
    体。
  87. 【請求項８７】 第３高分子特異結合パートナーが第３
    低分子配位子メンバーと特異結合し得るものである請求
    項８０記載の三座共役体。
  88. 【請求項８８】 該第１高分子特異結合パートナー及び
    該第３巨大分子特異結合パートナーが多価である請求項
    ８７記載の三座共役体。
  89. 【請求項８９】 該第２低分子配位子メンバーが関心の
    被検出体と同一又は類似である請求項８８記載の三座共
    役体。
  90. 【請求項９０】 該関心とする被検出体がハプテン、ホ
    ルモン、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド及びビタミ
    ンからなる群から選ばれる請求項８９記載の三座共役
    体。
  91. 【請求項９１】 該被検出体が約１００及び１５００ダ
    ルトンの間の分子量を有するハプテンである請求項９０
    記載の三座共役体。
  92. 【請求項９２】 該被検出体がテオフィリン、テオフィ
    リン−アミン、ジゴキシン、ジソピラミド、ライドカイ
    ン、プロカインアミド、プロパノロール、キニジン、ア
    ミカマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシ
    ン、カナマイシン、ネチルマイシン、トブラマイシン、
    三環抗うつ剤、エソスクシミド、フェノバルビタール、
    フェニトイン、プリミドン、バルプロイン酸、アセトミ
    ノフェン、アセチルサリチル酸、メソトレキセート、及
    びモルフィネ、コデイン、ヘロインなどの悪習薬並びに
    それらの代謝生成物、ＤＮＰ、１−置換−４−ヒドロキ
    シ−２−ニトロベンゼン及び４−置換−２−ニトロ−ト
    リアルキルアニリニウム塩からなる群から選ばれる請求
    項９１記載の三座共役体。
  93. 【請求項９３】 該被検出体がテオフィリン及びテオフ
    ィリン−アミンからなる群から選ばれる請求項９２記載
    の三座共役体。
  94. 【請求項９４】 該第１及び第３低分子配位子がビオチ
    ン及びＤＮＰからなる群から選ばれる請求項９３記載の
    三座共役体。
  95. 【請求項９５】 該第１巨大分子特異結合パートナーが
    第１接近標識と複合化し、該第２巨大分子特異結合パー
    トナーが第２接近標識と複合化している請求項８７記載
    の三座共役体。
  96. 【請求項９６】 該第１及び第２接近標識がエネルギー
    供与体及びエネルギー受容体からなる群から選ばれる請
    求項９５記載の三座共役体。
  97. 【請求項９７】 該エネルギー供与体が蛍光化合物、シ
    ンチレーション染料及び化学発光化合物からなる群から
    選ばれる請求項９６記載の三座共役体。
  98. 【請求項９８】 該エネルギー受容体がフルオレセイ
    ン、ローダミン、蛍光ランタニド・キレート剤及びフォ
    トポルフィリンの蛍光スズ及び亜鉛誘導体からなる群か
    ら選ばれる請求項９６記載の三座共役体。
  99. 【請求項９９】 該エネルギー供与体がイソルミノール
    である請求項９７記載の三座共役体。
  100. 【請求項１００】 該エネルギー供与体がアクリジンエ
    ステルである請求項９７記載の三座共役体。
  101. 【請求項１０１】 該エネルギー受容体がフルオレセイ
    ンである請求項９８記載の三座共役体。
  102. 【請求項１０２】 該エネルギー受容体がローダミンで
    ある請求項９８記載の三座共役体。
  103. 【請求項１０３】 該エネルギー供与体がイソルミノー
    ルであり、該エネルギー受容体がフルオレセインである
    請求項１０１記載の三座共役体。
  104. 【請求項１０４】 該エネルギー供与体がアクリジンエ
    ステルであり、該エネルギー受容体がフルオレセインで
    ある請求項１０１記載の三座共役体。
  105. 【請求項１０５】 該エネルギー供与体がフルオレセイ
    ンであり、該エネルギー受容体がローダミンである請求
    項１０２記載の三座共役体。
  106. 【請求項１０６】 該第１及び第２接近標識が酵素であ
    る請求項９５記載の三座共役体。
  107. 【請求項１０７】 該酵素がグルコースオキシダーゼ及
    びペルオキシダーゼからなる群から選ばれる請求項１０
    ６記載の三座共役体。
  108. 【請求項１０８】 該酵素がヘキソキナーゼ及びグルコ
    ース−６−リン酸デヒドロゲナーゼからなる群から選ば
    れる請求項１０６記載の三座共役体。
  109. 【請求項１０９】 （ａ）関心とする被検出体を含有し
    ていてもしていなくてもよい試験試料を（１）所定量の
    該関心とする被検出体の巨大分子特異結合パートナー、
    （２）請求項４記載の三座共役体及び（３）該三座体に
    該関心とする被検出体の該巨大分子特異結合パートナー
    が結合していない時に該三座体と結合することが可能な
    過剰量の異った巨大分子と接触させること、及び （ｂ）該三座体から脇へそらされている該関心とする被
    検出体の該巨大分子特異結合パートナーの量を検出して
    該試験試料中の該関心とする被検出体の存在を測定する
    ことからなる競争免疫検定方法。
  110. 【請求項１１０】 該三座共役体が請求項２３記載の三
    座共役体である請求項１０９記載の方法。
  111. 【請求項１１１】 該関心とする被検出体がハプテン、
    ホルモン、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド及びビタ
    ミンからなる群から選ばれ、該三座共役体が請求項２４
    記載の三座共役体である請求項１１０記載の方法。
  112. 【請求項１１２】 該被検出体が約１００及び１５００
    ダルトンの間の分子量を有するハプテンであり、該三座
    共役体が請求項２５記載の三座共役体であり、該関心と
    する被検出体の該巨大分子特異結合パートナーが抗体で
    ある請求項１１１記載の方法。
  113. 【請求項１１３】 （ａ）関心とする被検出体を含有し
    ていてもしていなくてもよい試験試料を（１）請求項２
    ３記載の三座共役体、（２）過剰量の該三座体の該第１
    低分子配位子メンバーの巨大分子特異結合パートナー及
    び（３）所定量の該関心とする被検出体の巨大分子特異
    結合パートナーと接触させること、及び （ｂ）該三座体から脇へそらされている該関心とする被
    検出体の該巨大分子特異結合パートナーの量を検出して
    該試験試料中の該関心とする被検出体の存在を測定する
    ことからなる競争免疫検定方法。
  114. 【請求項１１４】 該関心とする被検出体がハプテン、
    ホルモン、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド及びビタ
    ミンからなる群から選ばれ、該三座共役体が請求項２４
    記載の三座共役体である請求項１１３記載の方法。
  115. 【請求項１１５】 該被検出体が約１００及び１５００
    ダルトンの間の分子量を有するハプテンであり、該三座
    共役体が請求項２５記載の三座共役体であり、該関心の
    被検出体の該巨大分子特異結合パートナーが抗体である
    請求項１１４記載の方法。
  116. 【請求項１１６】 該三座共役体が請求項３５記載の三
    座共役体である請求項１１３記載の方法。
  117. 【請求項１１７】 該関心の被検出体がハプテン、ホル
    モン、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド及びビタミン
    からなる群から選ばれ、該三座共役体が請求項３６記載
    の三座共役体である請求項１１６記載の方法。
  118. 【請求項１１８】 該被検出体が約１００及び１５００
    ダルトンの間の分子量を有するハプテンであり、該三座
    共役体が請求項３７記載の三座共役体であり、該関心と
    する被検出体の該巨大分子特異結合パートナーが抗体で
    ある請求項１１７記載の方法。
  119. 【請求項１１９】 該三座共役体が請求項４１記載の三
    座共役体である請求項１１３記載の方法。
  120. 【請求項１２０】 該関心とする被検出体がハプテン、
    ホルモン、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド及びビタ
    ミンからなる群から選ばれ、該三座共役体が請求項４２
    記載の三座共役体である請求項１１９記載の方法。
  121. 【請求項１２１】 該被検出体が約１００及び１５００
    ダルトンの間の分子量を有するハプテンであり、該三座
    共役体が請求項４３記載の三座共役体であり、該関心と
    する被検出体の該巨大分子特異結合パートナーが抗体で
    ある請求項１２０記載の方法。
  122. 【請求項１２２】 該三座共役体が請求項８７記載の三
    座共役体であり、該試験試料がさらに過剰量の該三座共
    役体の該第３低分子配位子の第３巨大分子特異結合パー
    トナーを含有する請求項１１３記載の方法。
  123. 【請求項１２３】 該第１巨大分子特異結合パートナー
    及び該第３巨大分子特異結合パートナーが多価であり、
    該三座共役体が請求項８８記載の三座共役体である請求
    項１２２記載の方法。
  124. 【請求項１２４】 該関心とする被検出体がハプテン、
    ホルモン、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド及びビタ
    ミンからなる群から選ばれ、該三座共役体が請求項９０
    記載の三座共役体である請求項１２３記載の方法。
  125. 【請求項１２５】 該被検出体が約１００及び１５００
    ダルトンの間の分子量を有するハプテンであり、該三座
    共役体が請求項９１記載の三座共役体であり、該関心と
    する被検出体の該巨大分子特異結合パートナーが抗体で
    ある請求項１２４記載の方法。
  126. 【請求項１２６】 該被検出体がテオフィリン、テオフ
    ィリン−アミン、ジゴキシン、ジソピラミド、ライドカ
    イン、プロカインアミド、プロパノロール、キニジン、
    アミカマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシ
    ン、カナマイシン、ネチルマイシン、トブラマイシン、
    三環抗うつ剤、エソスクシミド、フェノバルビタール、
    フェニトイン、プリミドン、バルプロイン酸、アセトミ
    ノフェン、アセチルサリチル酸、メソトレキセート、及
    びモルフィネ、コデイン、ヘロインなどの悪習薬及びそ
    れらの代謝生成物、ＤＮＰ、１−置換−４−ヒドロキシ
    −２−ニトロベンゼン及び４−置換−２−ニトロ−トリ
    アルキルアニリニウム塩からなる群から選ばれ、該三座
    共役体が請求項９２記載の三座共役体である請求項１２
    ５記載の方法。
  127. 【請求項１２７】 該関心とする被検出体がテオフィリ
    ン及びテオフィリン−アミンからなる群から選ばれ、該
    三座共役体が請求項９３記載の三座共役体であり、かつ
    該第１及び該第３巨大分子特異結合パートナーがビオチ
    ンおよびＤＮＰからなる群から選ばれる請求項１２６記
    載の方法。
  128. 【請求項１２８】 該三座共役体が請求項９５記載の三
    座共役体である請求項１２２記載の方法。
  129. 【請求項１２９】 標識、トレーサー、レポーター基及
    び固体支持体からなる群から選ばれる意図標識をグリコ
    シル化タンパク質に（ａ）該グリコシル化タンパク質を
    請求項１７記載の三座共役体と接触させて混合物を形成
    させること及び（ｂ）混合物を紫外線露光することから
    なることにより付着結合させる方法。
  130. 【請求項１３０】 該意図標識がビオチンである請求項
    １２９記載の方法。
  131. 【請求項１３１】 個々に誘導体化され得る別個の３有
    機官能基を有する出発スペーサー基へ３三座体メンバー
    を個々に付着結合させる三座共役体製造方法。
  132. 【請求項１３２】 該出発スペーサー基が少なくとも２
    つの異った官能基を有する請求項１３１記載の方法。
  133. 【請求項１３３】 該官能基の２つが同一である請求項
    １３２記載の方法。
  134. 【請求項１３４】 該同一官能基の１つが保護基により
    保護されている請求項１３３記載の方法。
  135. 【請求項１３５】 該出発スペーサー基が保護されたア
    ミノ酸である請求項１３４記載の方法。
  136. 【請求項１３６】 該保護基がベンジルエステル、第三
    級ブチルエステル、カルボベンゾキシエステル、ベンゾ
    イロキシ−カルボニルフタリル及び９−フルオレニル−
    メチロキシ−カルボニルからなる群から選ばれる請求項
    １３５記載の方法。
  137. 【請求項１３７】 該出発スペーサー基がカルボベンゾ
    キシリシンである請求項１３６記載の方法。
  138. 【請求項１３８】 該同一官能基が自己保護基である請
    求項１３４記載の方法。
  139. 【請求項１３９】 該出発スペーサー基が環状酸無水物
    である請求項１３８記載の方法。
  140. 【請求項１４０】 該出発スペーサー基がピログルタミ
    ン酸及びＳ−アセチル−メルカプトハク酸からなる群か
    ら選ばれる請求項１３９記載の方法。
  141. 【請求項１４１】 該出発スペーサー基が３つの異った
    官能基を有する請求項１３１記載の方法。
  142. 【請求項１４２】 該出発スペーサー基がメルカプトア
    ミノ酸である請求項１４１記載の方法。
JP4225325A 1987-09-30 1992-07-31 三官能共役体、その製造方法及びその使用方法 Expired - Lifetime JP2627124B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10309387A 1987-09-30 1987-09-30
US103,093 1987-09-30

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH06222058A true JPH06222058A (ja) 1994-08-12
JP2627124B2 JP2627124B2 (ja) 1997-07-02

Family

ID=22293357

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP1989600025U Pending JPH02500023U (ja) 1987-09-30 1988-09-30
JP4225325A Expired - Lifetime JP2627124B2 (ja) 1987-09-30 1992-07-31 三官能共役体、その製造方法及びその使用方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP1989600025U Pending JPH02500023U (ja) 1987-09-30 1988-09-30

Country Status (5)

Country Link
US (3) US5168057A (ja)
EP (1) EP0310361A3 (ja)
JP (2) JPH02500023U (ja)
AU (1) AU623352B2 (ja)
WO (1) WO1989003041A2 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008111841A (ja) * 2003-01-16 2008-05-15 Hubert Koester 捕獲化合物、その収集物ならびにプロテオームおよび複合組成物を分析するための方法
JP2010509569A (ja) * 2006-11-06 2010-03-25 コーニンクレッカ フィリップス エレクトロニクス エヌ ヴィ タンパク質ラベリングにおけるアリールボロン酸の使用

Families Citing this family (83)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5849478A (en) * 1986-08-14 1998-12-15 Cashman; Daniel P. Blocked-polymerase polynucleotide immunoassay method and kit
EP0310361A3 (en) * 1987-09-30 1989-05-24 Beckman Instruments, Inc. Tridentate conjugate and method of use thereof
US5196351A (en) * 1987-09-30 1993-03-23 Beckman Instruments, Inc. Bidentate conjugate and method of use thereof
US5534620A (en) * 1987-09-30 1996-07-09 Beckman Instruments, Inc. Method of heterogenous purification using a bidentate conjugate
IT1235349B (it) * 1988-12-23 1992-06-30 Biodata Spa Saggio immunologico per determinazioni in fase omogenea
DE3923342A1 (de) * 1989-07-14 1991-01-24 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur herstellung mit einer immunologisch aktiven substanz beschichteten festphasenmatrix
DE4011601A1 (de) * 1990-04-10 1991-10-17 Boehringer Mannheim Gmbh Hapten-biotin-konjugate und ihre verwendung
US5512433A (en) * 1990-11-08 1996-04-30 Vysis, Inc. Methods and compounds for labeling DNA with xanthine and lower alkyl substituted xanthine derivatives and reagents for the in situ detection of chromosomes
GB9024775D0 (en) * 1990-11-14 1991-01-02 Axis Research Chemical compounds
US5447846A (en) * 1992-07-17 1995-09-05 Fuji Photo Film C., Ltd. Homogeneous Immunoassay process using covalent conjugate of enzyme and plural monoclonal antibodies for different epitopes on analyte
US5440023A (en) * 1992-09-18 1995-08-08 Beckman Instruments, Inc. Method for making valproic acid derivatives
EP0672251A4 (en) * 1992-12-03 1998-05-20 Au Membrane & Biotech Res Inst DETECTION OF ANALYZES BY COMPETETIVE INHIBITION OF THE PENTNESSITY OF ION CHANNELS.
CA2130170A1 (en) * 1993-01-06 1994-07-21 Josephine M. Michael Method for making a preconjugate
DE4310141A1 (de) * 1993-03-29 1994-10-06 Boehringer Mannheim Gmbh Homobidentale trifunktionelle Linker
DE4310142A1 (de) * 1993-03-29 1994-10-06 Boehringer Mannheim Gmbh Immunologisch aktive Konjugate und ein Verfahren zu ihrer Herstellung
DE4325317C2 (de) * 1993-07-29 1998-05-20 Univ Dresden Tech Verfahren zur radioaktiven Markierung von Immunglobulinen
EP0640836A3 (en) * 1993-08-24 1995-12-20 Wako Pure Chem Ind Ltd Immunoassay.
US5527711A (en) * 1993-12-13 1996-06-18 Hewlett Packard Company Method and reagents for binding chemical analytes to a substrate surface, and related analytical devices and diagnostic techniques
US6028190A (en) 1994-02-01 2000-02-22 The Regents Of The University Of California Probes labeled with energy transfer coupled dyes
US5747352A (en) * 1994-05-23 1998-05-05 Beckman Instruments, Inc. Reagents and methods for the rapid and quantitative assay of pharmacological agents
US5627080A (en) * 1994-07-29 1997-05-06 Beckman Instruments, Inc. Detergent-facilitated immunoassay for the rapid and quantitative assay of pharmacological agents
JPH08178926A (ja) * 1994-10-25 1996-07-12 Sumitomo Pharmaceut Co Ltd イムノアッセイプレートおよびその用途
US5997861A (en) * 1994-10-31 1999-12-07 Burstein Laboratories, Inc. Antiviral supramolecules containing target-binding molecules and therapeutic molecules bound to spectrin
US5718915A (en) * 1994-10-31 1998-02-17 Burstein Laboratories, Inc. Antiviral liposome having coupled target-binding moiety and hydrolytic enzyme
US5932462A (en) * 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US6008373A (en) 1995-06-07 1999-12-28 Carnegie Mellon University Fluorescent labeling complexes with large stokes shift formed by coupling together cyanine and other fluorochromes capable of resonance energy transfer
US5705353A (en) * 1995-06-07 1998-01-06 Beckman Instruments, Inc. Method of reducing interferences in assays
US20010023288A1 (en) 1999-07-07 2001-09-20 Wilbur D. Scott Trifunctional reagent for conjugation to a biomolecule
US5945526A (en) 1996-05-03 1999-08-31 Perkin-Elmer Corporation Energy transfer dyes with enhanced fluorescence
US7825237B2 (en) 1996-05-03 2010-11-02 Applied Biosystems, Llc Oligonucleotides and analogs labeled with energy transfer dyes
US7388092B2 (en) 1996-05-03 2008-06-17 Applera Corporation Oligonucleotides and analogs labeled with energy transfer dyes
US6331275B1 (en) 1996-07-08 2001-12-18 Burstein Technologies, Inc. Spatially addressable, cleavable reflective signal elements, assay device and method
AU725065B2 (en) 1996-07-08 2000-10-05 Burstein Technologies, Inc. Cleavable signal element device and method
US20050214827A1 (en) * 1996-07-08 2005-09-29 Burstein Technologies, Inc. Assay device and method
US6342349B1 (en) 1996-07-08 2002-01-29 Burstein Technologies, Inc. Optical disk-based assay devices and methods
US6287765B1 (en) 1998-05-20 2001-09-11 Molecular Machines, Inc. Methods for detecting and identifying single molecules
US20020131972A1 (en) * 1998-05-21 2002-09-19 Daniel Sem Multi-partite ligands and methods of identifying and using same
CA2329948A1 (en) * 1998-06-09 1999-12-16 Vijay Kumar Solution-phase elisa
AU8366398A (en) * 1998-07-07 2000-01-24 Department Of Radiation Oncology University Of Washington Trifunctional reagent for conjugation to a biomolecule
EP1097378A2 (en) * 1998-07-21 2001-05-09 Burstein Laboratories Inc. Optical disc-based assay devices and methods
WO2000031538A1 (en) * 1998-11-23 2000-06-02 Praxsys Biosystems, Inc. Improved lateral flow assays
US6451346B1 (en) * 1998-12-23 2002-09-17 Amgen Inc Biodegradable pH/thermosensitive hydrogels for sustained delivery of biologically active agents
US6358684B1 (en) 1999-08-27 2002-03-19 Pe Corporation UV excitable fluorescent energy transfer dyes
DE10009503A1 (de) * 2000-02-29 2001-08-30 Roche Diagnostics Gmbh Verfahren zur Immobilisierung von Konjugaten in diagnostischen Tests
US7183392B2 (en) * 2000-03-27 2007-02-27 Zyomyx, Inc. Site-specific, covalent bioconjugation of proteins
US6953656B2 (en) * 2000-07-14 2005-10-11 Massachusetts Institute Of Technology Direct, externally imposed control of polypeptides
US6797481B1 (en) 2000-10-17 2004-09-28 Dade Behring Marburg Gmbh Simultaneous screening of multiple analytes
US20040248093A1 (en) * 2000-11-27 2004-12-09 Coombs James Howard Magneto-optical bio-discs and systems including related methods
US20020172980A1 (en) * 2000-11-27 2002-11-21 Phan Brigitte Chau Methods for decreasing non-specific binding of beads in dual bead assays including related optical biodiscs and disc drive systems
US20030003464A1 (en) * 2000-11-27 2003-01-02 Phan Brigitte C. Dual bead assays including optical biodiscs and methods relating thereto
US7635571B2 (en) * 2000-12-07 2009-12-22 Siemens Healthcare Diagnostics Products Gmbh Amplified signal in binding assays
US6800608B2 (en) 2001-06-22 2004-10-05 Beckman Coulter, Inc. Homogeneous assay of vancomycin using a stable particle-vancomycin conjugate, a novel rate enhancer, and a novel dose response modulator
US20030108972A1 (en) * 2001-12-06 2003-06-12 Zweig Stephen Eliot Tethered receptor-ligand reagent and assay
US7653490B2 (en) * 2001-09-10 2010-01-26 Triad Liquidating Company LLC Nuclear magnetic resonance assembly of chemical entities
US6867005B2 (en) 2001-10-24 2005-03-15 Beckman Coulter, Inc. Method and apparatus for increasing the dynamic range and accuracy of binding assays
US20030092008A1 (en) * 2001-11-14 2003-05-15 Bell Michael L. Method and apparatus for multiplex flow cytometry analysis of diverse mixed analytes from bodily fluid samples
CN1625779A (zh) * 2002-01-28 2005-06-08 长冈实业株式会社 逻辑触发光生物盘的方法和设备
EP1470424A2 (en) 2002-01-31 2004-10-27 Burstein Technologies, Inc. Method for triggering through disc grooves and related optical analysis discs and system
US20030153011A1 (en) * 2002-02-08 2003-08-14 Bell Michael L. Methods and reagents for conducting multiplexed assays of multiple analytes
US20030180797A1 (en) * 2002-03-20 2003-09-25 Lin Yu Identification of ligands for a receptor family and related methods
FR2847984B1 (fr) * 2002-11-28 2005-07-08 Commissariat Energie Atomique Procede de detection en continu d'un analyte, reactif trifonctionnel de detection mis en oeuvre et dispositif de detection
GB0229747D0 (en) * 2002-12-20 2003-01-29 Axis Shield Asa Assay
US7541152B2 (en) * 2002-12-24 2009-06-02 Agilent Technologies, Inc. Integrated light source for diagnostic arrays
US7172877B2 (en) * 2003-01-09 2007-02-06 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for peptide and protein labeling
EP2581093B1 (en) * 2003-06-16 2015-03-18 MedImmune, LLC Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants
EP2309269B1 (en) 2004-09-08 2016-10-26 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Compositions and methods for the detection of HIV-1/HIV-2 infection.
US20060198868A1 (en) * 2005-01-05 2006-09-07 Dewitt David M Biodegradable coating compositions comprising blends
US20060147491A1 (en) * 2005-01-05 2006-07-06 Dewitt David M Biodegradable coating compositions including multiple layers
US20060292559A1 (en) * 2005-06-23 2006-12-28 Beckman Coulter, Inc. Cell-based microarrays, and methods for their preparation and use
US7799534B2 (en) * 2006-05-09 2010-09-21 Beckman Coulter, Inc. Nonseparation assay methods
US20100240070A1 (en) * 2007-11-07 2010-09-23 Beckman Coulter, Inc. Nonseparation Assay Methods Using Peroxide Generating Enzymes
EP2433132B1 (en) 2009-05-21 2018-02-21 The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Compositions and methods for the detection of hiv-1/hiv-2 infection
EP2492279A1 (en) 2011-02-25 2012-08-29 Laboratorios Del. Dr. Esteve, S.A. Rapid immunogen selection method using lentiviral display
RU2491631C1 (ru) * 2012-04-02 2013-08-27 Максим Петрович Никитин Комплекс логического элемента на основе биомолекул (варианты)
RU2517161C2 (ru) * 2012-04-02 2014-05-27 Максим Петрович Никитин Способ определения содержания лиганда в образце (варианты)
EP2698377A1 (en) 2012-08-17 2014-02-19 Laboratorios Del. Dr. Esteve, S.A. Enhanced rapid immunogen selection method for HIV gp120 variants
CA3060510A1 (en) 2017-04-21 2018-10-25 Lunella Biotech, Inc. Vitamin c and doxycycline: a synthetic lethal combination therapy for eradicating cancer stem cells (cscs)
WO2018195446A1 (en) 2017-04-21 2018-10-25 Lisanti Michael P Targeting hypoxic cancer stem cells (cscs) with doxycycline: implications for improving anti-angiogenic therapy
EP3624897A4 (en) 2017-05-19 2021-07-14 Lunella Biotech, Inc. COMPANION DIAGNOSIS FOR MITOCHONDRIAL INHIBITORS
CA3063717C (en) 2017-05-19 2021-08-24 Lunella Biotech, Inc. Antimitoscins: targeted inhibitors of mitochondrial biogenesis for eradicating cancer stem cells
AU2018292283B2 (en) 2017-06-26 2020-07-23 Lunella Biotech, Inc. Mitoketoscins: mitochondrial-based therapeutics targeting ketone metabolism in cancer cells
WO2020123882A1 (en) * 2018-12-12 2020-06-18 The General Hospital Corporation Prodrugs with a tridentate self-immolative linker
WO2023242155A1 (en) 2022-06-14 2023-12-21 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Compositions and methods for the diagnosis of hiv infection

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5823795A (ja) * 1981-07-17 1983-02-12 アモコ・コ−ポレ−ション ポリヌクレオチドの検定方法およびこの方法に用いる反応剤
JPS61130263A (ja) * 1984-11-27 1986-06-18 ヘキスト・セラニーズ・コーポレイション 二官能性ハプテンおよび免疫化学的ハプテン測定法
JPS62116592A (ja) * 1985-10-17 1987-05-28 イミユノメデイツクス、インコ−ポレイテツド 二官能性リンカ−

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4067774A (en) * 1971-05-14 1978-01-10 Syva Company Compounds for enzyme amplification assay
US3935074A (en) * 1973-12-17 1976-01-27 Syva Company Antibody steric hindrance immunoassay with two antibodies
US4134792A (en) * 1976-12-06 1979-01-16 Miles Laboratories, Inc. Specific binding assay with an enzyme modulator as a labeling substance
US4130462A (en) * 1976-12-16 1978-12-19 Syva Company Receptor steric hindrance immunoassay for receptor determination
IL51667A (en) * 1977-03-16 1979-10-31 Miles Yeda Ltd Immunoassay for the determination of a hapten
US4233402A (en) * 1978-04-05 1980-11-11 Syva Company Reagents and method employing channeling
JPS5510590A (en) * 1978-05-04 1980-01-25 Wellcome Found Enzyme immunity quantity analysis
US4238565A (en) * 1978-06-22 1980-12-09 Miles Laboratories, Inc. Specific binding assay with a prosthetic group as a label component
GB2029011B (en) * 1978-09-01 1983-02-02 Coulson W Use of a synthetic bifunctional ligand for the immunimetric determination of the concentration ratio of two solutes
US4228237A (en) * 1978-09-21 1980-10-14 Calbiochem-Behring Corp. Methods for the detection and determination of ligands
GB2084317B (en) * 1980-09-30 1984-01-18 Erba Farmitalia Antigen-linked competitive enzymeimmunoassay
DE3100062A1 (de) * 1981-01-02 1982-08-05 Hans A. Dipl.-Chem. Dr. 8000 München Thoma Homogenes verfahren zur bestimmung von liganden
US4711955A (en) * 1981-04-17 1987-12-08 Yale University Modified nucleotides and methods of preparing and using same
US4604365A (en) * 1981-06-02 1986-08-05 Electro-Nucleonics, Inc. Immunoprecipitation assay
US4608336A (en) * 1981-08-27 1986-08-26 Miles Laboratories, Inc. #3B theophylline immunoassay employing 9-theophylline reagents
US4629690A (en) * 1981-09-18 1986-12-16 Syntex (U.S.A.) Inc. Homogeneous enzyme specific binding assay on non-porous surface
US4506009A (en) * 1982-03-30 1985-03-19 University Of California Heterogeneous immunoassay method
US4663278A (en) * 1982-04-30 1987-05-05 Syva Company Agglutination dependent enzyme channeling immunoassay
US4722906A (en) * 1982-09-29 1988-02-02 Bio-Metric Systems, Inc. Binding reagents and methods
US4687735A (en) * 1983-03-14 1987-08-18 Syntex (U.S.A.) Inc. Enzymatic poly-reactant channeling binding assay
US4687732A (en) * 1983-06-10 1987-08-18 Yale University Visualization polymers and their application to diagnostic medicine
US4550075A (en) * 1983-06-22 1985-10-29 Kallestad Laboratories, Inc. Method for ligand determination utilizing an immunoassay monitorable by biotin-containing enzymes, and compositions therefor
US4608339A (en) * 1983-10-25 1986-08-26 Yoakum George H Protoplast fusion method for high-frequency DNA transfection in human cells
US4582789A (en) * 1984-03-21 1986-04-15 Cetus Corporation Process for labeling nucleic acids using psoralen derivatives
GB8422452D0 (en) * 1984-09-05 1984-10-10 Serono Diagnostics Ltd Assay
US4760142A (en) * 1984-11-27 1988-07-26 Hoechst Celanese Corporation Divalent hapten derivatives
US4868104A (en) * 1985-09-06 1989-09-19 Syntex (U.S.A.) Inc. Homogeneous assay for specific polynucleotides
US4791067A (en) * 1987-06-25 1988-12-13 Fisher Scientific Co. Agglutination immunoassay for hapten involving monoclonal antibody of IgA class reagent
US5196351A (en) * 1987-09-30 1993-03-23 Beckman Instruments, Inc. Bidentate conjugate and method of use thereof
EP0310361A3 (en) * 1987-09-30 1989-05-24 Beckman Instruments, Inc. Tridentate conjugate and method of use thereof

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5823795A (ja) * 1981-07-17 1983-02-12 アモコ・コ−ポレ−ション ポリヌクレオチドの検定方法およびこの方法に用いる反応剤
JPS61130263A (ja) * 1984-11-27 1986-06-18 ヘキスト・セラニーズ・コーポレイション 二官能性ハプテンおよび免疫化学的ハプテン測定法
JPS62116592A (ja) * 1985-10-17 1987-05-28 イミユノメデイツクス、インコ−ポレイテツド 二官能性リンカ−

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008111841A (ja) * 2003-01-16 2008-05-15 Hubert Koester 捕獲化合物、その収集物ならびにプロテオームおよび複合組成物を分析するための方法
US9034798B2 (en) 2003-01-16 2015-05-19 Caprotec Bioanalytics Gmbh Capture compounds, collections thereof and methods for analyzing the proteome and complex compositions
JP2010509569A (ja) * 2006-11-06 2010-03-25 コーニンクレッカ フィリップス エレクトロニクス エヌ ヴィ タンパク質ラベリングにおけるアリールボロン酸の使用

Also Published As

Publication number Publication date
EP0310361A3 (en) 1989-05-24
US5661019A (en) 1997-08-26
JPH02500023U (ja) 1990-04-26
WO1989003041A3 (en) 1989-04-20
AU623352B2 (en) 1992-05-14
US5168057A (en) 1992-12-01
US5851778A (en) 1998-12-22
AU2605688A (en) 1989-04-18
EP0310361A2 (en) 1989-04-05
JP2627124B2 (ja) 1997-07-02
WO1989003041A2 (en) 1989-04-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2627124B2 (ja) 三官能共役体、その製造方法及びその使用方法
US5196351A (en) Bidentate conjugate and method of use thereof
EP0600936B1 (en) Differential binding affinities and dissociation assays based thereon
CA1341592C (en) Ion capture reagents and methods for performing binding assays
US6083708A (en) Polypeptide: dendrimer complexes
US4780421A (en) Cleavable labels for use in binding assays
JP3267613B2 (ja) イオン捕獲結合アッセイにおける非特異的結合遮断薬を含む試薬
EP0782710B1 (en) Method for detecting antibodies
US4959306A (en) Labeling design for a binding assay reagent
JPH01227061A (ja) イオン捕捉イムノアッセイ法および装置
JPS6240662B2 (ja)
JP2002521693A (ja) 水溶性架橋結合体の製造方法
JP2670696B2 (ja) 二座共役体及びその使用方法
JPH06506058A (ja) 分離方法
US4975532A (en) Method to derivatize dextran
US5534620A (en) Method of heterogenous purification using a bidentate conjugate
JPH0340830B2 (ja)
JPH05249113A (ja) 分離・分析方法及び装置
EP0088974A2 (en) Homogeneous immunoassay with labelled monoclonal anti-analyte
JP3267614B2 (ja) カルボキシメチルアミロースに結合させた結合メンバーを使用するイオン捕獲アッセイ
US6406858B1 (en) System for the reduction of interferences in immunoassays
EP0132292A2 (en) Method of measuring biological ligands
JPH0727763A (ja) １α，２５（ＯＨ）２ビタミンＤ３に対する抗体及びその用途
JPH0786507B2 (ja) リガンドの測定方法
WO1989003042A2 (en) Bidentate conjugate and method of use thereof