JPH06199888A - ヌクレオシド誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 容易に除去し得るアシル型の保護基を有する
ヌクレオシド誘導体を提供すること。 【構成】 ［Ｒ³ は水素原子、オリゴヌクレオチド合成に使用され
る酸性媒体中において不安定な基、または基−ＣＯ−Ｃ
Ｈ（ＣＨ₃ ）₂ を示し、Ｒ⁴ は水素原子、オリゴヌクレ
オチド合成に使用される含燐基または基−ＣＯ−ＣＨ
（ＣＨ₃ ）₂ を示し、Ｒ⁵ は水素原子またはＯＨもしく
は保護ＯＨ基を示す］を有するヌクレオシド誘導体。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規なヌクレオシド誘
導体およびオリゴヌクレオチドを合成するためのその使
用に関するものである。

【０００２】さらに詳細には、本発明は、環外ＮＨ₂ 基
を有するピリミジンもしくはプリン塩基から生成される
ヌクレオシド誘導体、すなわちアデニン、グアニンもし
くはシトシンから生成され、特にオリゴヌクレオチドを
合成するために使用しうるヌクレオシドに関するもので
ある。

【０００３】

【従来の技術】オリゴヌクレオチドの合成は、燐酸基に
よりこれらのヌクレオシドを互いに結合させてＤＮＡ
（デオキシリボ核酸）鎖もしくはＲＮＡ（リボ核酸）鎖
を生成させることによりなっている。この結合におい
て、ヌクレオチド間の燐酸基はまだヌクレオシドの３′
位置におけるヒドロキシル基を他のヌクレオシドの５′
位置におけるヒドロキシル基と結合している。したがっ
て、合成反応に際しヌクレオシドの３′末端と５′末端
とのみが作用を受け、使用する核塩基（プリンもしくは
ピリミジン）はこの結合に際し関与してはならない。

【０００４】これらの塩基が環外ＮＨ₂ 基を含む場合、
オリゴヌクレオチドの合成に際しこれらの基を保護する
必要がある。何故なら、これらは極めて反応性が大きい
ため合成反応を阻害しうるからである。

【０００５】環外ＮＨ₂ 基のこの保護は次のことを満足
せねばならない；これは選択性でありかつ実施容易でな
ければならない；これは他のヌクレオシド部位に対する
反応性変化を誘発してはならずかつオリゴヌクレオチド
合成工程全体にわたり安定でなければならない；これは
合成されたオリゴヌクレオチドを破壊することなく緩和
な条件下で除去されうるものでなければならない。

【０００６】ヌクレオシドの環外ＮＨ₂ 基は特にしばし
ば、たとえばアデニンおよびシトシンの場合にはベンゾ
イルもしくはアニソイル基により［Ｈ．ＳＣＨＡＬＬＥ
Ｒ等、ジャーナル・アメリカン・ケミカル・ソサエティ
（１９６３）、第８５巻、第３８２１〜３８２７頁］或
いはグアニンの場合にはイソブチリル基により［Ｈ．Ｂ
ＵＣＨＩおよびＨ．ＫＨＯＲＡＮＡ、ジャーナル・モレ
キュラ・バイオロジー（１９７２）、第７２巻、第２５
１〜２８８頁］によりアミドとして保護されている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】これらの保護基は、推
奨されているように合成の終了時に６０℃の温度にて１
７時間にわたる２８％アンモニアの作用により除去する
ことができる。しかしながら、プロトンのＮＭＲ分析が
示すところでは、これら条件下においてグアニンのイソ
ブチリル基の全部は除去されない。したがって、反応時
間を７２時間まで延長させるが６０℃の温度に保つこと
が好ましい。

【０００８】保護基を除去するためのこの方法は欠点を
有する。何故なら、使用する条件は、たとえば５，６−
ジヒドロチミジンの場合のようにアルカリ性媒体中で大
して安定でない修飾ヌクレオシドについて使用しうるに
は充分緩和できないからである。

【０００９】さらに、除去するのがより容易であり、特
に支持体上での合成方法によって不安定なヌクレオシド
からオリゴヌクレオチドを合成するためにとくに使用し
うる他のアシル基を用いる可能性についても研究が行な
われており、この方法は連鎖の第１ヌクレオシドを一般
にシリカよりなる支持体に固定し、次いでこの第１ヌク
レオシドに対し所望順序で他のヌクレオシドを固定する
縮合サイクルを順次に行なうことからなっている。除去
するのがより容易なアルシ基の使用は、より良好な保護
解除収支を得ることを可能にする。この点は極めて重要
である。何故なら、不完全に保護解除された塩基の存在
は、得られる生成物の使用に対し欠点となるからであ
る。

【００１０】

【課題を解決するための手段】したがって、本発明の目
的は、容易に除去しうるアシル型の保護基を有する新規
なヌクレオシド誘導体を提供することにある。

【００１１】本発明によるヌクレオシドの誘導体は、
式：

【００１２】

【化１３】

【００１３】から選択され、その環外ＮＨ基によってＣ
Ｏ基に結合される二価の基を示し、Ｒ¹ は水素原子また
はアルキル基を示し、Ｒ² は水素原子、アルキル基、ア
ルコキシ基およびアリールオキシ基を示し、これらはい
ずれも未置換またはＮＯ₂ 、ＣＮ、アルコキシ、アリー
ルオキシ、Ｃｌ、Ｆ、

【００１４】

【化１４】

【００１５】置換されていてもいなくてもよいアルキル
もしくはアリール、ＳＲ（ここでＲはアルキルもしくは
アリール基を示す）より成る群から選択される１個もし
くはそれ以上の基により置換され、ただしＢが基（II）
もしくは（III ）である場合のＲ¹ ＝ＨかつＲ² ＝ＣＨ
₃ およびＢが基（II）である場合のＲ¹ ＝Ｒ² ＝ＣＨ₃
を除き、Ｒ³ は水素原子、酸性媒体中において不安定な
基または式：

【００１６】

【化１５】

【００１７】（ここでＲ¹ およびＲ² は上記の意味を有
する）の基を示し、Ｒ⁴ は水素原子、含燐基または式：

【００１８】

【化１６】

【００１９】（ここでＲ¹ およびＲ² は上記の意味を有
する）の基を示し、Ｒ⁵ は水素原子またはＯＨ基を示
す］に相当する。

【００２０】たとえば、式（Ｉ）の化合物におけるＲ³
を構成するために使用しうる酸性媒体中にて不安定な基
は特にオリゴヌクレオチド合成で使用しうる基であり、
たとえば式：

【００２１】

【化１７】

【００２２】［式中、Ｒ⁶ 、Ｒ⁷ およびＲ⁸ は同一でも
異なってもよく水素原子、アルキル基もしくはアルコキ
シ基を示す］によるトリチル基、たとえばモノメトキシ
トリチル基または式（Ｖ）においてＲ⁶ およびＲ⁷ がメ
トキシ基を示しかつＲ⁸ が水素原子を示すトリチル基、
並びにビキシル基および９−フェニル−キサンテニル基
である。

【００２３】たとえば、式（Ｉ）の化合物におけるＲ⁴
を構成するために使用しうる含燐基もオリゴヌクレオチ
ド合成に使用しうる基であり、たとえば式：

【００２４】

【化１８】

【００２５】のホスホネート基である。

【００２６】本発明によれば、Ｒ⁵ が保護されたＯＨ基
を示す場合、このＯＨ保護基はリボヌクレオチドの合成
に従来使用されている基によつ構成される。

【００２７】したがって、本発明によるヌクレオシドの
誘導体は、（１）グアニン、シトシンもしくはアデニン
により構成される塩基と、（２）リボースもしくはデオ
キシリボースとの結合生成物であり、これらヌクレオシ
ドは少なくともその塩基の環外ＮＨ₂ 基にて式：

【００２８】

【化１９】

【００２９】の基により修飾されている。

【００３０】さらに、これらはデオキシリボースの３′
および５′位置またはリボースの２′，３′および５′
位置にて前記の同じ基において修飾することもでき、或
いはリボースもしくはデオキシリボースの３′および
５′位置は他の基によっても修飾することができ、これ
らの基はリボースもしくはデオキシリボースの５′位置
については不安定な基Ｒ³ でありかつ３′位置について
は含燐基Ｒ⁴ である。

【００３１】本発明に使用される式：

【００３２】

【化２０】

【００３３】のアシル基は、特にヌクレオシドの合成に
対し興味がある。何故なら、これらは操作の終了時にた
とえば使用する基に応じて室温にて２〜８時間のアンモ
ニア処理により容易に除去することができ、これにより
合成されている支持体上のポリヌクレオチドを支持体法
での合成を用いる場合に同時に遊離させうるからであ
る。

【００３４】本発明に使用される式：

【００３５】

【化２１】

【００３６】の保護基において、Ｒ¹ は水素原子または
アルキル基とすることができ、Ｒ² は水素原子、アルキ
ル基、アルコキシ基またはアリールオキシ基とすること
ができ、これらは適宜異なる基によって置換される。

【００３７】Ｒ¹ およびＲ² につき使用しうるアルキル
基は直鎖もしくは分枝鎖の基とすることができ、たとえ
ばメチル、エチルなどの基である。

【００３８】Ｒ² につき使用しうるアルコキシ基も直鎖
もしくは分枝鎖の基とすることができる。使用しうるア
リールオキシ基は特にベンゼン、ナフタレンおよびアン
トラセンから誘導される基（たとえばフェノキシ基）と
することができ、これらは１個もしくはそれ以上の上記
の置換基によって置換することができる。

【００３９】本発明によれば環外ＮＨ₂ 基の保護基は、
アルカリ処理に対し所望の耐性を得るため、使用する塩
基に応じて選択される。一般に使用する塩基がグアニン
である場合、Ｒ¹ は水素原子を示しかつＲ² はアルコキ
シ基または適宜置換されたアリールオキシ基を示す。た
とえば、基Ｒ² はフェノキシ基、メトキシ基または２−
クロルフェノキシ基とすることができる。

【００４０】使用する塩基がアデニンである場合、Ｒ¹
は好ましくは水素原子を示しかつＲ² は適宜置換された
アリールオキシ基、たとえばフェノキシ基を示す。

【００４１】塩基がシトシンである場合、基Ｒ¹ および
Ｒ² は好ましくは水素原子またはアルキル基、たとえば
メチル基である。

【００４２】上記保護基の使用により、本発明によりヌ
クレオシドを結合させて得られたオリゴヌクレオチドの
保護解除時間を短縮することが可能になる。何故なら、
この時間は以前に必要とされた１７〜７２時間でなく、
使用する基に応じて僅か２〜８時間としうるからであ
る。さらに、保護解除は室温で生ずるので緩和な反応条
件下で操作することが可能となり、これに対し従来は６
０℃まで加熱する必要があった。さらに、これらの一層
容易に除去しうる保護基の使用は、オリゴヌクレオチド
の合成に際し、より強力なアルカリ性条件に対し感受性
である修飾された核塩基を組込み、たとえば抗体に対し
て感受性であるリガンドを有するＤＮＡ断片を合成する
ことを可能にする。

【００４３】本発明はリボースから誘導されたヌクレオ
シドおよびデオキシリボースから誘導されたヌクレオシ
ドに適用されるが、好ましくはデオシリボースから誘導
されたヌクレオシド、すなわち式（Ｉ）においてＲ⁵ が
水素原子である誘導体につき使用される。

【００４４】本発明によるヌクレオシドの誘導体は、ベ
ンゾイルおよびアニソイル基をアデニンもしくはシトシ
ンに基づくヌクレオシドへ固定するために使用される方
法と同一の常法によって製造することができる。これら
の方法においてはグアニン、シトシンもしくはアデニン
のヌクレオシドから出発し、これを式：

【００４５】

【化２２】

【００４６】の酸クロライドまたは式：

【００４７】

【化２３】

【００４８】の酸無水物と反応させる。

【００４９】この反応に際し、酸クロライドもしくは無
水物はさらにリボースもしくはデオキシリボースの３′
および５′位置におけるヒドロキシル基と反応し、かく
して三重保護されたヌクレオシド誘導体が得られ、すな
わち式（Ｉ）において、Ｒ³およびＲ⁴ の両者が基：

【００５０】

【化２４】

【００５１】を示す誘導体が得られる。しかしながら、
３′および５′位置におけるこれらの基は選択的加水分
解によって除去することができ、これは式（Ｉ）におい
てＲ³およびＲ⁴ が水素原子を示すヌクレオシドの誘導
体を得ることを可能にする。

【００５２】予め得られたヌクレオシドの誘導体を適当
な溶媒中で対応の塩化トリチルと反応させることによ
り、式（Ｉ）においてＲ³ が式（Ｖ）のトリチル基、た
とえばジメトキシトリチル基を示しかつＲ⁴ が水素原子
を示すヌクレオシドの誘導体を製造することができる。

【００５３】式（Ｉ）においてＲ³ がトリチル基を示し
かつＲ⁴ が式（VI）の基または式（VII ）の基、或いは
式：

【００５４】

【化２５】

【００５５】［式中、Ｒ¹¹、Ｒ¹²およびＲ¹³は同一でも
異なってもよくアルキル基、たとえばエチルである］の
基を示すヌクレオシドの誘導体は、式（Ｉ）においてＲ
³ がトリチル基を示しかつＲ⁴ が水素原子を示すヌクレ
オシドの誘導体から常法により製造することができる。

【００５６】Ｒ⁴ がたとえば式（VI）の基を示す場合、
このヌクレオシド誘導体を適当な溶媒中で４−クロルフ
ェニルホスホリルビストリアゾリデートと反応させる。
この４−クロルフェニルホスホリルビストリアゾリデー
トは、４−クロルフェニルジクロルホスフェートをジオ
キサン中のトリアゾールとトリエチルアミンとの懸濁物
へ添加して製造することができる。

【００５７】Ｒ⁴ がたとえば式（VII ）の基を示す場
合、ヌクレオシド誘導体をジイソプロピルエチルアミン
の存在下で適当な溶媒中にてβ−シアノエチル−モノク
ロル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−アミノホスホルアミダ
イトと反応させることができる。

【００５８】Ｒ⁴ がたとえば式：

【００５９】

【化２６】

【００６０】［式中、Ｒ¹¹、Ｒ¹²およびＲ¹³は同一でも
異なってもよくアルキル基である］の基を示す場合、こ
のヌクレオシドの誘導体を２−クロル−（５，６−ａ）
−ベンゾ−［１，３−ジオキソ−２−ホスホル−４−イ
ノン］と反応させ、次いでたとえば酢酸トリエチルアン
モニウムのようなトリアルキルアンモニウム塩と反応さ
せることができる。

【００６１】これら３種の方法により得られるヌクレオ
シドの誘導体は、Ｒ⁴ が式（VI）の基である場合にはホ
スホトリエステル合成により、或いはＲ⁴ が式（VII ）
の基である場合にはホスホルアミダイト合成により、或
いはＲ⁴ が式：

【００６２】

【化２７】

【００６３】の基である場合にはＨ−ホスホネート合成
により、オリゴヌクレオチドの合成に使用することがで
きる。また、オリゴヌクレオチド連鎖の結合には他のヌ
クレオシドたとえばチミジンおよび２′−デオキシウリ
ジンに対応するもの、或いはアルカリ媒体中で不安定な
塩基を有するヌクレオシド、或いはアルカリ媒体中で不
安定な他のヌクレオシドを使用することができる。

【００６４】オリゴヌクレオチドを合成するための本発
明による方法は、（ｉ） ヌクレオシド誘導体もしくは
オリゴヌクレオチドに対し式：

【００６５】

【化２８】

【００６６】から選択され、その環外ＮＨ₂ 基によりＣ
Ｏ基に結合される二価の基を示し、Ｒ¹ は水素原子もし
くはアルキル基を示し、Ｒ² は水素原子、アルキル基、
アルコキシ基、アリールオキシ基を示し、これは未置換
またはＮＯ₂ 、ＣＮ、アルコキシ、アリールオキシ、Ｃ
ｌ、Ｆ、

【００６７】

【化２９】

【００６８】アルキルもしくはアリール（これらは未置
換であっても置換されてもよい）、ＳＲ（ここでＲはア
ルキルもしくはアリール基を示す）から選択される１個
もしくはそれ以上の基により置換され、ただしＢが基
（II）もしくは（III ）である場合のＲ¹ ＝ＨかつＲ²
＝ＣＨ₃ およびＢが基（II）である場合のＲ¹ ＝Ｒ² ＝
ＣＨ₃ を除き、Ｒ³ は酸性媒体中で不安定な基を示し、
Ｒ⁴ は含燐基を示し、Ｒ⁵ は水素原子を示す］のヌクレ
オシド誘導体を縮合させる少なくとも１つの縮合サイク
ルと、（ii） 式：

【００６９】

【化３０】

【００７０】［式中、Ｒ¹ およびＲ² は上記の意味を有
する］の保護基を、たとえばオリゴヌクレオチドを室温
にてアンモニアと接触させることにより除去する工程と
からなっている。

【００７１】オリゴヌクレオチド合成は、溶液中での方
法或いは支持体上での合成法のいずれかによって行なう
ことができる。好ましくは、支持体上での合成法を使用
する。何故なら、これは結合に際し収率損失を生ずるこ
となくより不安定なヌクレオシドを使用するのに一層適
するからである。

【００７２】たとえば、本発明によるヌクレオシドはＤ
ＮＡもしくはＲＮＡ断片の合成に使用される塩基生成物
として興味ある用途を有する。さらに、これらは合成オ
リゴヌクレオチド中へ、特にＤＮＡ γ−放射線分解生
成物または光分解生成物に関する不安定な修飾塩基を組
み込むにも適している。本発明によるヌクレオシドによ
り、さらに抗ウィルス活性を有する新規な分子および新
規なＤＮＡプローブを得ることも可能である。

【００７３】

【実施例】以下、本発明をヌクレオシドの製造および使
用に関する実施例につき説明するが、これらのみに限定
されないことは明らかである。

【００７４】実施例１：（Ｎ₂ −フェノキシアセチル）
−２′−デオキシグアノシン（化合物１）の製造 １０８０ｍｇ（４ミリモル）の２′−デオキシグアノシ
ンを無水ピリジンの連続添加および蒸発によって乾燥さ
せ、次いでこれらを２０ｍｌの無水ピリジン中に懸濁さ
せ、次いでこの懸濁物をフラスコ中に導入した。このフ
ラスコを氷浴によって冷却し、かつこれへ６当量（４．
２５ｇ；２４ミリモル）のフェノキシアセチルクロライ
ドを０℃にて徐々に添加した。反応を室温にて９０分間
継続させた。反応媒体中に白色の塩化ピリジニウム沈殿
物が生じた一方、反応媒体は橙色から褐色となった。こ
れにより三重保護された出発ヌクレオシド誘導体、すな
わち式（Ｉ）においてＢが式（II）の基を示す誘導体
（Ｒ¹ が水素原子を示し、Ｒ² がフェノキシ基を示し、
Ｒ³ およびＲ⁴ がフェノキシアセチル基を示しかつＲ⁵
が水素原子を示すグアニン誘導体）を得た。

【００７５】次いで、過剰の酸塩化物を２ｍｌの２回蒸
留した水により０℃で分解して、反応媒体を可溶化させ
た。次いで、、これを１００ｍｌのクロロホルムで希釈
した。クロロホルム相を５０ｍｌの５％重炭酸ナトリウ
ム水溶液で４回洗浄して生成フェノキシ酢酸を除去し
た。次いで、クロロホルム相を硫酸ナトリウムで脱水
し、溶剤を蒸発させかつ橙色残留物を得た。これを１０
０ｍｌの０℃まで冷却されたピリジンに溶解させ、次い
で１００ｍｌの０．２Ｎソーダを０℃にて添加した。か
くして、３′および５′位置の選択的加水分解を２０分
間行なった。次いで、媒体を１００〜２００メッシュ
（０．０７４〜０．１４９ｍｍ）の粒子寸法を有するピ
リジニウム型の陽イオン交換樹脂ダウエックス５０Ｗ−
Ｘ８によって中和した。樹脂を濾過しかつ洗浄した後、
濾液を蒸発乾固させた。

【００７６】これに続いて、シリカカラム（直径３ｃ
ｍ、高さ１５ｃｍ）でのクロマトグラフィーによりクロ
ロホルム−メタノール濃度勾配によって溶出させ、生成
Ｎ₂ −フェノキシアセチル−２′−デオキシグアノシン
を単離した。求める生成物を含有するフラクションの蒸
発により２５０ｍｇのＮ−フェノキシアセチル−２′−
デオキシグアノシンを回収することができ、これは収率
１５％に相当した。

【００７７】得られた生成物の同定および純度を２５０
ＭＨｚでの核磁気共鳴、薄層クロマトグラフィーおよび
質量分析器によって監視し、次の結果が得られた：Ｒ_f
＝０．３６クロロホルム−メタノール移動混合物（容量
で８０／２０） （Ｍ＋Ｈ）分子ピーク（ｍ／ｅ：４０２−１３％）；フ
ェノキシアセチル化グアニン（ｍ／ｅ：２８６−５１
％）。

【００７８】実施例２：［Ｎ₂ −（２−クロルフェノキ
シ）−アセチル］−２′−デオキシグアノシン（化合物
２）の製造 １０８０ｍｇ（４ミリモル）の２′−デオキシグアノシ
ンを実施例１におけると同様に乾燥し、次いで２０ｍｌ
の無水ピリジン中に懸濁させかつ氷水浴中に入れたフラ
スコに導入した。これに続いて０℃で６当量（５．１
ｇ；２４ミリモル）の（２−クロルフェノキシ）−アセ
チルクロライドを徐々に添加した。反応を室温にて１５
０分間継続させた。反応媒体において緑色乃至栗色が出
現し、このようにして三重保護された出発ヌクレオシド
誘導体が生成され、すなわち式（Ｉ）においてＢが式
（II）の基を示す誘導体、すなわちＲ¹ が水素原子を示
し、Ｒ² が２−クロルフェノキシ基を示し、Ｒ³ および
Ｒ⁴ が２−クロルフェノキシ−アセチル基を示しかつＲ
⁵ が水素原子であるグアニン誘導体を生成した。

【００７９】過剰の酸クロライドを０℃にて２ｍｌの蒸
留水により分解して、反応媒体を可溶化させた。次い
で、これを１００ｍｌのクロロホルムで溶解させ、前記
クロロホルム相と同様に５０ｍｌの５％重炭酸ナトリウ
ム水溶液で４回洗浄してクロルフェノキシ酢酸を除去し
た。クロロホルム相を硫酸ナトリウムで脱水し、溶剤を
蒸発させかつこのようにして橙色残留物を得た。この残
留物を１００ｍｌのピリジン中に溶解し、得られた溶液
を氷水浴中に入れ、かつ０．２Ｎソーダ１００ｍｌをこ
れに加えて０．１Ｎの滴定値を有する混合物を得、ヌク
レオシドの３′および５′位置を選択的に２０分間で加
水分解することができた。次いで、この媒体をピリジニ
ウム型の実施例１に使用した陽イオン交換樹脂ダウエッ
クス５０Ｗ−Ｘ８によって中和した。この樹脂を濾過し
かつ洗浄し、次いで濾液を蒸発乾固させた。これにより
［Ｎ₂ −（２−クロルフェノキシ）−アセチル］−２′
−デオキシグアノシンが得られ、これはピリジン中にわ
すか可溶性であった。

【００８０】これをシリカカラム上でのクロマトグラフ
ィーによって精製し、その際クロロホルム−メタノール
濃度勾配を使用した。かくして、２２０ｍｇの化合物２
が単離され、これは収率１３％に相当した。この化合物
を薄層クロマトグラフィーおよび質量分析器によって特
性化し、次の結果が得られた：Ｒ_f ＝０．４、クロロホ
ルム−メタノール移動混合物（容量８０／２０）中、
（Ｍ＋Ｈ）：分子ピーク（ｍ／ｅ：４３６−１７％）；
２−クロルフェノキシアセチル化グアニン（ｍ／ｅ：３
２０−４４％）。

【００８１】生成物の純度は、２５０ＭＨｚにおける核
磁気共鳴での分析によって確認した。

【００８２】実施例３：（Ｎ₂ −メトキシアセチル）−
２′−デオキシグアノシン（化合物３）の製造 ５．４ｇ（２０ミリモル）のデオキシグアノシンを乾燥
し、次いで１００ｍｌの無水ピリジン中に懸濁させた。
０℃まで冷却し、次いで４．５当量（１０ｇ；９０ミリ
モル）のメトキシアセチルクロライドを徐々に添加し
た。反応を室温で３時間継続して三重保護された出発化
合物の誘導体、すなわち式（Ｉ）においてＢがグアニン
から誘導された式（II）の基を示し、Ｒ¹ が水素原子を
示し、Ｒ²がメトキシ基を示し、Ｒ³ およびＲ⁴ がメト
キシアセチル基を示しかつＲ⁵ が水素原子である誘導体
を生成させた。

【００８３】過剰の酸クロライドをメタノールにより３
０分間分解して、低沸点（１２９〜１３０℃）を有する
メチルメトキシアセテートを生成させた。溶剤を蒸発さ
せ、かつ残留物をクロロホルムで溶解させた。次いで、
これを５０％重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄した。クロ
ロホルム相を硫酸ナトリウムデ脱水し、次いで蒸発させ
て橙色残留物を得、これは三重保護された誘導体に相当
した。

【００８４】誘導体をシリカカラムクロマトグラフィー
（直径４ｃｍ、長さ１０ｃｍ）により精製し、その際ク
ロロホルム−メタノール濃度勾配を使用した。かくし
て、７ｇの三重保護された誘導体が回収され、これは収
率７３％に相当した。

【００８５】次いで、エステル基をトリエチルアミンと
ピリジンと水との混合物（容量で２０：２０：６０）に
より加水分解した。次いで、溶剤を蒸発させかつＮ₂ −
メトキシアセチル−２′−デオキシグアノシン（化合物
３）をシラン化したシリカカラムにおけるクロマトグラ
フィーによって精製し、その際水とアセトンとの混合物
（７０：３０ｖ／ｖ）で溶出を行なった。かくして３．
４ｇの生成物が得られ、これは収率５１％に相当した。
この生成物を２５０ＭＨｚにおける核磁気共鳴および質
量分析器によって検査し、次の結果を得た： （Ｍ−Ｈ）：分子ピーク（ｍ／ｅ：３３８−１０％）；
メトキシアセチル化グアニン：（ｍ／ｅ：２２２−３１
％）。

【００８６】実施例４：（Ｎ₆ −フェノキシアセチル）
−２′−デオキシアデノシン（化合物４）の製造 １０２５ｍｇ（４ミリモル）のデオキシアデノシンを乾
燥させ、次いで２０ｍｌの無水蒸留ピリジン中に溶解さ
せ、かつ氷水浴中に入れたフラスコに導入した。これに
続いて、０℃のピリジン２０ｍｌ中に溶解させた８当量
の無水フェノキシ酢酸（９．４ｇ；３２ミリモル）を徐
々に添加した。反応を室温にて９０分間継続し、かつ黄
色の着色が徐々に出現した。このようにしてＢがアデニ
ンから誘導された式（IV）の基を示し、Ｒ¹ が水素原子
を示し、Ｒ² がフェノキシ基を示し、Ｒ³ およびＲ⁴ が
フェノキシアセチル基を示し、Ｒ⁵ が水素原子を示す式
（Ｉ）のヌクレオシド誘導体が生成した。

【００８７】過剰の酸無水物を次いで０℃にて３ｍｌの
蒸留水を添加することにより分解し、次いで反応媒体を
１００ｍｌのクロロホルムで希釈した。クロロホルム相
を５０ｍｌの５％重炭酸ナトリウム水溶液で４回洗浄
し、かつ溶剤を蒸発させて黄色残留物を得た。これを１
００ｍｌのピリジン中に溶解し、かつ溶液を氷水浴中に
入れた後、１００ｍｌの０．２Ｎソーダを０℃で添加し
てアデノシンの３′および５′位置を１５分間選択的に
加水分解した。次いで、媒体を実施例１に使用したピリ
ジニウム型の陽イオン交換樹脂ダウエックス５０Ｗ−Ｘ
８で中和した。樹脂を濾過しかつ洗浄し、次いで濾液を
蒸発乾固させた。

【００８８】これにより（Ｎ₆ −フェノキシアセチル）
−２′−デオキシアデノシン（化合物４）を得、これを
シリカカラムクロマトグラフィー（直径４ｃｍ、長さ１
０ｃｍ）により精製し、その際クロロホルム−メタノー
ル濃度勾配（１００−０〜９６−４）を使用した。求め
る生成物を含有するフラクションを次いで蒸発させ、か
つこのようにして１０１０ｍｇの白色粉末を得、これは
収率６５％に相当した。

【００８９】次いで、生成物を薄層クロマトグラフィー
と２５０ＭＨｚにおけるプロトンの核磁気共鳴と質量分
析器と特性化した。次の結果が得られた： Ｒ_f ：０．６６、クロロホルム−メタノール移動混合物
（容量で８０：２０）。

【００９０】２５０ＭＨｚにおけるプロトンの核磁気共
鳴：¹ Ｈ−ＮＭＲ（ピリジンｄ₅ ）：２．７−３．３（ｍ，
２Ｈ，Ｈ₂ ′，Ｈ₂ ″）；４．１−４．３５（ｍ，２
Ｈ，Ｈ₅ Ｈ₅ ″）；４．６（ｍ，Ｈ₄ ′）；５．２５
（ｍ，Ｈ₅ ′）；５．６５（ｓ，２Ｈ，ＣＨ₂ ）；７．
０（ｍ，Ｈ₁ ′）；６．９−７．４（ｍ，５Ｈ，Ｃ₆ Ｈ
₅ ）；８．７５および９．０５（ｓ，Ｈ2 およびＨ₈ ） 質量分析：（Ｍ＋Ｈ）：分子ピーク（ｍ／ｅ：３８６−
１６％）；アセチル化フェノキシアデニン（ｍ／ｅ：２
７０−６６％）実施例５：（Ｎ₄ −イソブチリル）−２′−デオキシシ
チジン（化合物５）の製造 ４ミリモルのデオキシシチジンを乾燥させ、次いで１５
ｍｌの無水ピリジン中に溶解させ、かつ溶液を氷水浴入
れたフラスコに導入した。これに続いて６当量（２．５
ｍｌ；２４ミリモル）のイソブチリルクロライドを徐々
に添加した。反応を室温にて１２０分間継続し、媒体は
橙色に変化した。このようにして三重保護された出発ヌ
クレオシド誘導体、すなわち式（Ｉ）においてＢがシト
シンから誘導された式（III ）の基を示し、Ｒ¹ および
Ｒ² がメチル基を示し、Ｒ³ およびＲ⁴ がイソブチリル
基を示しかつＲ⁵ が水素原子を示す誘導体が生成した。

【００９１】過剰の酸クロライドを２ｍｌの２回蒸留し
た水で０℃にて分解し、かつ反応媒体を１００ｍｌのク
ロロホルムで希釈した。このクロロホルム相を５０ｍｌ
の重炭酸ナトリウム５％水溶液で４回洗浄して、精製し
たイソ酪酸を除去し、硫酸ナトリウムで脱水し、次いで
蒸発乾固させた。これにより橙色残留物が得られ、これ
を５ｍｌの０℃まで冷却されたピリジンに溶解した。こ
れに続いて、１００ｍｌの０．２Ｎソーダを０℃にて添
加し、デオキシリボースの３′および５′位置における
エステル基の選択加水分解反応を３０分間継続させた。
これに続いて、実施例１に使用したピリジニウム型のイ
オン交換樹脂ダウエックス５０Ｗ−Ｘ８により媒体の中
和を行なった。これに続いて、樹脂を濾過しかつ洗浄
し、そしてこの濾液を蒸発乾固させた。

【００９２】精製をシリカカラムクロマトグラフィー
（直径４ｃｍ、長さ１０ｃｍ）によって行ない、その際
クロロホルム−メタノール濃度勾配（１００−０〜９５
−５）を用いた。溶剤を蒸発させ、かつこのようにして
６３０ｍｇのイソブチリル−デオキシシチジンにより構
成される白色粉末が得られ、これは収率５０％に相当し
た。

【００９３】この生成物を薄層クロマトグラフィーと質
量分析器と２５０ＭＨｚにおけるプロトンの核磁気共鳴
によって特性化した。次の結果が得られた： Ｒ_f ：０．５５、クロロホルム−メタノール移動混合物
（８０：２０）、 質量分析（Ｍ＋Ｈ）：分子ピーク（ｍ／ｅ＝２９８−１
１％）、イソブチリル化シトシン（ｍ／ｅ＝１８２−１
００％）、２５０ＭＨｚにおけるプロトンの核磁気共
鳴：¹ Ｈ−ＮＭＲ（メタノールｄ₄ ）：１．２（ｉｂのｄ，
６Ｈ，２（ＣＨ））、２．１５−２．６（ｍ，２Ｈ，Ｈ
₂ ′，Ｈ₂ ″），２．７（ｍ，Ｈ^ib）；３．７−３．９
（ｍ，２Ｈ，Ｈ₅ ′，Ｈ₅ ″）；４．０（ｍ，Ｈ₄ ）；
４．４（ｍ，Ｈ₃′）；６．２５（ｔ，Ｈ₁ ′）；７．
５および８．５（ｄ，Ｈ₅ およびＨ₆ ）実施例６：（Ｎ₄ −イソブチリル）−５′−（４，４′
−ジメトキシトリチル）−２′−デオキシシチジン（化
合物６）の製造 ２．５ミリモルの化合物５を、無水ピリジンの連続添加
および蒸発によって乾燥させた。これを２５ｍｌのピリ
ジンで溶解させ、０℃まで冷却しかつ２．７５ミリモル
（１．１当量）の４，４′−ジメトキシトリチルクロラ
イドの２５ｍｌピリジン溶液（０℃）を添加した。反応
を５℃にて１７時間継続させ、次いで２ｍｌのメタノー
ルを反応媒体に添加した。３０分間後、溶剤を回転エバ
ポレータによって除去し、かつ油状残留物を１００ｍｌ
の酢酸エチルで溶解し、次いで５０ｍｌの５％ＮａＨＣ
Ｏ₃ 水溶液で３回洗浄し、かつ５０ｍｌの２回蒸留され
た水で１回洗浄した。次いで有機相を硫酸ナトリウムで
脱水しかつ濃縮した。シリカゲルカラムでの分画によ
り、得られた化合物６を分離し、これは式（Ｉ）におい
てＢがシトシンから誘導された式（III ）の基であり、
Ｒ¹ およびＲ² がメチル基であり、Ｒ³ が４，４′−ジ
メトキシトリチル基であり、Ｒ⁴ が水素原子でありかつ
Ｒ⁵ が水素原子である式（Ｉ）の誘導体に相当した。

【００９４】この化合物の物理化学的特性および反応収
率を第１表に示す。

【００９５】実施例７：（Ｎ₆ −フェノキシアセチル）
−５′−（４，４′−ジメトキシトリチル）−２′−デ
オキシアデノシン（化合物７）の製造 実施例６におけると同じ操作法を採用したが、ただし化
合物５の代りに化合物４の２．５mmolを使用し、このよ
うにして化合物７：（Ｎ₆ −フェノキシアセチル）−
５′−（４，４′−ジメトキシトリチル）−２′−デオ
キシアデノシン、すなわち式（Ｉ）においてＢが式（I
V）のアデニンから誘導された基を示し、Ｒ¹ が水素原
子であり、Ｒ² がフェノキシ基であり、Ｒ³ が４，４′
−ジメトキシトリチル基であり、Ｒ⁴ が水素原子であり
かつＲ⁵ が水素原子である化合物が生成された。

【００９６】化合物の反応収率および物理化学的特性を
第１表に示す。

【００９７】実施例８：（Ｎ₂ −メトキシアセチル）−
５′−（４，４′−ジメトキシトリチル−２′−デオキ
シグアノシン（化合物８）の製造 実施例６におけると同じ操作法を採用したが、ただし化
合物５の代りに２．５ミリモルの化合物３を使用した。

【００９８】これにより式（Ｉ）においてＢがグアニン
から誘導された式（II）基であり、Ｒ¹ が水素原子であ
り、Ｒ² がメトキシ基であり、Ｒ³ が４，４′−ジメト
キシトリチル基であり、Ｒ⁴ が水素原子でありかつＲ⁵
が水素原子である化合物８を得た。

【００９９】この化合物の反応収率および物理化学的特
性を第１表に示す。この表において、括弧内の文字は複
数のピーク、すなわちｓ＝シングレット、ｄ＝ダブレッ
ト、ｔ＝トリプレット、ｑ＝クアドラプレットおよびｍ
＝マルチプレットを示す。

【０１００】実施例９：化合物９の製造 この実施例は、ポリヌクレオチドのホスホトリエステル
合成に使用される化合物８のホスホリル誘導体の製造を
示している。

【０１０１】３ミリモルの化合物８を、無水ピリジン
（５ｍｌつづ３回）の添加及び蒸発により乾燥した。残
留物を１５ｍｌのピリジンおよび無水ジオキサン３０ｍ
ｌ中の４．５ミリモルの４−クロルフェニルホスホリル
ビストリアゾリデートに溶解させた（４−クロルフェニ
ルホスホリルビストリアゾリデートは４．５ミリモルの
４−クロルフェニルジクロルホスフェートを３０ｍｌの
ジオキサン中における９ミリモルのトリアゾールと９．
３５ミリモルのトリエチルアミンとの懸濁物に添加して
得た）。反応を２０分間継続させ、次いで６ｍｌのＨ₂
Ｏ−トリエチルアミン混合物（容量で１：１）を添加す
ることにより停止させ、次いで反応媒体の容積を蒸発に
より５ｍｌまで濃縮した。これに続いてクロロホルム１
００ｍｌ溶解させ、かつ５０ｍｌのＮａＨＣＯ₃ 水溶液
で３回洗浄し、次いで１００ｍｌの水で洗浄した。クロ
ロホルム相を硫酸ナトリウムで脱水し、次いで蒸発乾固
させた。求める化合物をシリカゲルクロマトグラフィー
によって単離した。得られた生成物を次いで質量分析器
および核磁気共鳴にかけた。得られた反応収率および結
果を第２表に示す。

【０１０２】このように得られた化合物９は、式（Ｉ）
においてＢが式（II）のグアニンから誘導された基を示
し、Ｒ¹ が水素原子を示し、Ｒ² がメトキシ基を示し、
Ｒ³が４，４′−ジメトキシトリチル基を示し、Ｒ⁴ が
式（VI）の基を示しかつＲ⁵が水素原子を示すヌクレオ
シド誘導体であった。

【０１０３】実施例１０：化合物１０の製造 この実施例は、化合物７のホスホトリエステル合成に関
するホスホリル誘導体を製造するための実施例９と同様
な操作手順を採用し、その際２．５ミリモルの化合物８
の代りに２．５ミリモルの化合物７を使用した。これに
より化合物１０が得られ、これは式（Ｉ）においてＢが
アデニンから誘導された式（IV）の基を示し、Ｒ¹ が水
素原子を示し、Ｒ² がフェノキシ基を示し、Ｒ³ が４，
４′−ジメトキシトリチル基を示し、Ｒ⁴ が式（VI）の
基を示しかつＲ⁵ が水素原子を示す誘導体に相当する。

【０１０４】上記したように、得られた化合物の特性を
質量分析器および核磁気共鳴によって決定し、得られた
結果および反応収率を第２表に示す。

【０１０５】実施例１１：化合物１１の製造 この実施例においては、実施例９の操作手順を採用し
て、ホスホトリエステル合成につき使用した化合物６の
ホスホリル誘導体を製造し、その際３ミリモルの化合物
８の代りに３ミリモルの化合物６を使用した。

【０１０６】これにより式（Ｉ）の化合物１１が得ら
れ、ここでＢはシトシンから誘導される式（III ）基を
示し、Ｒ¹ およびＲ² はメチル基を示し、Ｒ³ は４，
４′−ジメトキシトリチル基を示し、Ｒ⁴ は式（VI）の
基を示しかつＲ⁵ は水素原子を示す。

【０１０７】実施例９および１０におけると同様に、得
られた生成物を質量分析器および該磁気共鳴によって検
査した。得られた反応収率および結果を第２表に示す。

【０１０８】実施例１２：化合物１２の製造 この実施例においては、オリゴヌクレオチドホスホルア
ミダイト合成につき使用した化合物８のホスホリル誘導
体を製造した。３ミリモルの化合物８をピリジン、トル
エンおよびテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を一緒に蒸発
させて乾燥した。残留物を１２ミリモルのＮ，Ｎ，Ｎ−
ジイソプロピルエチルアミンの存在下で１５ｍｌのＴＨ
Ｆに溶解させ、かつこれに続いて６ミリモルのβ−シア
ノエチル−モノクロル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ
ホスホルアミダイトを２分間かけて滴下した。５分間の
反応の後、このアミンの塩酸塩沈殿物が生成した。反応
を３５分間続行させかつ沈殿物を反応の終了時点で濾過
した。次いで、濾液を蒸発乾固させ、１５０ｍｌの酢酸
エチルに溶解させた。１０％のＮａ₂ ＣＯ₃ を含有する
氷冷した水溶液で洗浄を行なった。次いで、有機相を硫
酸ナトリウムで洗浄し、かつ蒸発乾固させた。

【０１０９】得られた化合物を寸法Ｂのメルク「ＬＯＢ
ＡＲ」カラムでの低圧クロマトグラフィーによって精製
し、その際ＣＨ₂ Ｃｌ₂ −ヘキサン−トリエチルアミン
（容量で７０：２０：１０）の混合物を溶出剤として使
用した。得られた化合物を最小量のジクロルメタンまた
は酢酸エチルで溶解させ、かつ−８０℃にてヘキサン中
で沈殿させた。この生成物を核磁気共鳴により分析し
た。得られた結果および反応収率を第３表に示す。

【０１１０】これにより式（Ｉ）に相当する化合物１２
が得られ、ここでＢはグアニンから誘導された式（II）
の基を示し、Ｒ¹ は水素原子を示し、Ｒ² はメトキシ基
を示し、Ｒ³ は４，４′−ジメトキシトリチル基を示
し、Ｒ⁴ は式（VII ）の基を示しかつＲ⁵ は水素原子を
示す。

【０１１１】実施例１３：化合物１３の製造 実施例１２におけると同様に、３ミリモルの化合物８の
代りに３ミリモルの化合物７を用いて化合物７のホスホ
リル誘導体を作成しかつこれをホスホルアミダイト合成
に使用することができる。さらに、得られた化合物につ
き核磁気共鳴によって分析を行なった。反応の収率およ
び結果を第３表に示す。

【０１１２】これにより化合物１３が得られ、この化合
物は式（Ｉ）においてＢがアデニンから誘導された式
（IV）の基であり、Ｒ¹ が水素原子であり、Ｒ² がフェ
ノキシ基であり、Ｒ³ が４，４′−ジメトキシトリチル
基であり、Ｒ⁴ が式（VII ）の基でありかつＲ⁵ が水素
原子である化合物に相当する。

【０１１３】実施例１４：化合物１４の製造 実施例１２におけると同様に３ミリモルの化合物８の代
りに３ミリモルの化合物６を用いて化合物６のホスホリ
ル誘導体を作成し、これはホスホルアミダイト合成に使
用することを目的とした。さらに得られた化合物を核磁
気共鳴により分析した。反応収率および得られた結果を
第３表に示す。

【０１１４】これにより化合物１４が得られ、これは式
（Ｉ）においてＢがシトシンから誘導された式（III ）
の基を示し、Ｒ¹ およびＲ² がメチル基を示し、Ｒ³ が
４，４′−ジメトキシトリチル基を示し、Ｒ⁴ が式（VI
I ）の基を示しかつＲ⁵ が水素原子を示す化合物に相当
する。

【０１１５】実施例１５：（Ｎ₆ −フェノキシアセチ
ル）−５′−（４，４′−ジメトキシトリチル）−２′
−デオキシグアノシン（化合物１５）の製造 実施例６におけると同じ操作手順を採用したが、化合物
５の代りに４ミリモルの化合物１を使用し、このように
して化合物１５を製造し、すなわちこの化合物は式
（Ｉ）においてＢが式（II）のグアニンから誘導された
基であり、Ｒ¹ が水素原子であり、Ｒ² がフェノキシ基
であり、Ｒ³ が４，４′−ジメトキシトリチル基であ
り、Ｒ⁴ が水素原子でありかつＲ⁵ が水素原子である化
合物に相当する。

【０１１６】反応収率は７０％であった。クロロホル
ム：メタノール混合物（９０：１０）におけるこの化合
物のＲ_f は０．４０であった。重水素化メタノールにお
けるこの分子の主プロトンの化学配位は次の数値を有し
た： Ｈ８：８．０７ ppm，Ｈ１′：６．４５ppm(t)，Ｈ
３′：４．７５ppm(m)，Ｈ，ジメトキシトリチルのＣＨ
₃ ：３．８６ppm(s)，Ｈ，フェノキシアセチルのＣ
Ｈ₂ ：５．０５ppm(s)。

【０１１７】実施例１６：化合物１６の製造 実施例１２におけると同様に３ミリモルの化合物８の代
りに３ミリモルの化合物１５を用いて化合物１５のホス
ホリル誘導体を作成し、これはホスホルアミダイト合成
につき使用する。最終生成物の収率は５０％であった。
この化合物は重水素化ピリジンにおいて１４６および１
４６．２ ppmに位置する３１ＰのＮＭＲタブレットを特
徴とする。重水素化アセトニトリルにおけるプロトンの
主ＮＭＲピークは、８．１２ ppm（ｓ，Ｈ８），６．４
５ ppm（ｔ，Ｈ１′），５．０５ppm（ｓ，ＣＨ₂ フェ
ノキシアセチル）および４．８８ ppm（ｍ，Ｈ３′）に
位置した。

【０１１８】ＦＡＢイオン源を用いる質量分析器によ
り、この生成物の分子ピークにつき９０３のｍ／ｅの数
値を観察することができた。

【０１１９】これにより化合物１６が得られ、これは式
（Ｉ）においてＢが式（II）グアニンから誘導された基
であり、Ｒ¹ が水素原子であり、Ｒ² がフェノキシ基で
あり、Ｒ³ が４，４′−ジメトキシトリチル基であり、
Ｒ⁴ が式（VII ）の含燐基でありかつＲ⁵ が水素原子で
ある化合物に相当する。

【０１２０】以下の実施例１７〜１９は、Ｈ−ホスホネ
ート法によってオリゴヌクレオチドを合成するために使
用する完全保護されたモノヌレオチドの製造を示してい
る。

【０１２１】実施例１７：化合物１７の製造 オリゴヌクレオチドを合成するための化合物１７を、Ｈ
−ホスホネート法により作成した。５ミリモルの化合物
７を５ｍｌの無水ジオサンと一緒に蒸発させて乾燥し、
かつこれを１５ｍｌの前記溶媒と５ｍｌの無水ピリジン
とに溶解させた。これに続いて、５ｍｌの１．２５Ｍ
２−クロル−（５，６−ａ）−ヘンゾ−［１，３−ジオ
キソ−２−ホスホル−４−イノン］または式：

【０１２２】

【化３１】

【０１２３】のサリチルクロルホスファイトを添加し、
かつ反応を室温にて１０分間継続させた。

【０１２４】これに続いて、０．５ｍｌの水を添加しか
つ加水分解を１０分間生ぜしめた。次いで、この混合物
を２５０ｍｌの１モル酢酸トリエチルアンモニウム水溶
液に注ぎ入れ、かつ所望生成物を２５０ｍｌのクロロホ
ルムで２回抽出した。有機相を無水酢酸ナトリウムで脱
水し、かつ回転エバポレータで濃縮した。このように得
られた残留物を、シリカゲルカラム（２００×４０ｍ
ｍ）上での高性能液体クロマトグラフィーによって精製
した。この生成物をクロロホルムにおける２％トリエチ
ルアミン混合物中でメタノール濃度を増大させた溶液
（０％メタノール：２５０ｍｌ；１％メタノール：２５
０ｍｌ；２％メタノール：２５０ｍｌ；３％メタノー
ル：２５０ｍｌ；５％メタノール：２５０ｍｌ；７％メ
タノール：５００ｍｌ）で溶出させた。求める生成物を
含有するフラクションを集め、かつ溶剤を蒸発させて生
成物を白色フォームとして得た。化合物１７の収率は５
５％であった。この化合物を核磁気共鳴により分析し、
かつ得られた結果を第４表に示す。

【０１２５】これにより化合物１７が得られ、これはＢ
がアデニンから誘導された式（IV）の基を示し、Ｒ¹ が
水素原子を示し、Ｒ² がフェノキシ基を示し、Ｒ³ が
４，４′−ジメトキシトリチル基を示し、Ｒ⁴ が式：

【０１２６】

【化３２】

【０１２７】の含燐基を示しかつＲ⁵ が水素原子を示す
式（Ｉ）に相当する。

【０１２８】実施例１８：化合物１８の製造 実施例１７におけると同様に５ミリモルの化合物７の代
りに５ミリモルの化合物１５を用いたＨ−ホスホネート
法により化合物１５のホスホリル誘導体を作成し、これ
はオリゴヌクレオチド合成を目的とする。反応収率は４
８％であり、かつ得られた生成物を核磁気共鳴によって
分析した。得られた結果を第４表に示す。

【０１２９】これにより化合物１８が得られ、これはＢ
がグアニンから誘導された式（II）の基を示し、Ｒ¹ が
水素原子を示し、Ｒ² がフェノキシ基を示し、Ｒ³ が
４，４′−ジメトキシトリチル基を示し、Ｒ⁴ が式：

【０１３０】

【化３３】

【０１３１】の含燐基を示しかつＲ⁵ が水素原子を示す
式（Ｉ）に相当する。

【０１３２】実施例１９：化合物１９の製造 実施例１７におけると同様に５ミリモルの化合物７の代
りに５ミリモルの化合物５を使用してＨ−ホスホネート
法により化合物１５のホスホリル誘導体を作成し、これ
をオリゴヌクレオチドを合成するために使用した。反応
収率は６２％であり、かつ得られた生成物を核磁気共鳴
によって分析した。得られた結果を第４表に示す。

【０１３３】これにより化合物１９が得られ、これはＢ
がシトシンから誘導された式（III）の基を示し、Ｒ¹
およびＲ² がメチル基を示し、Ｒ³ が４，４′−ジメト
キシトリチル基を示し、Ｒ⁴ が式：

【０１３４】

【化３４】

【０１３５】の含燐基を示しかつＲ⁵ が水素原子を示す
式（Ｉ）に相当する。

【０１３６】実施例２０ この実施例は次の配列： ｄ（ＡＡＴＴＣＡＧＡＴＵＴＧＡＴＣＡＴ）ＡＧＲＥ−
ＡＧＲＥ を有するオリゴヌクレオチドを合成するための化合物
９，１０および１１を示している。この配列において、
Ａはアデニンを用いて生成されたヌクレオチドを示し、
Ｃはシトシンを用いて生成されたヌクレオチドを示し、
かつＧはグアニンを用いて生成されたヌクレオチドであ
り、Ｔはチミンを用いて生成されたヌクレオチドであ
り、かつＵはグラシルを用いて生成されたヌクレオシド
を示す。

【０１３７】この合成を行なうため、それぞれグアニ
ン、アデニンおよびシトシンに対応する化合物９，１０
および１１並びにチミンおよびウラシルに対応するもの
を使用した。後者は、それぞれ実施例６〜１１における
と同じ操作手順を用いて４，４′−ジメトキシトリチル
基および式（VI）の基により夫々５′および３′位置に
おけるヒドロキシル基を保護することにより対応のヌク
レオシドから得た。

【０１３８】合成は、連鎖の５′末端を含む５０ｍｇ
（すなわち約１．５〜３モル）の支持体（ピアス(pierc
e)社の「調節気孔ガラス」）と、１縮合サイクル当り２
５ｍｇの実施例９〜１１で得られたヌクレオシド誘導体
と、約８〜１５当量を示すチミジンおよび２′−デオキ
シウリジン対応物（ｓｙｎｔｈｏｎ）と、１縮合サイク
ル当り２５ｍｇ（すなわちヌクレオシドに対し２当量）
のメシチレンスルホニルクロライドにより構成される活
性剤とを用いて、バイオサーチ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）
ＳＡＭ ＯＮＥオートマトン（ａｕｔｏ ｍａｔｏｎ）
により行なった。

【０１３９】各縮合サイクルは以下の工程を採る。

【０１４０】脱トリチル化：ＣＨ₂ Ｃｌ₂ における２％
トリクロル酢酸、２分間； 洗 浄 ： ＣＨ₃ ＣＮ、１分間； 乾 燥 ： 無水ＣＨ₃ ＣＮ、６分間； 縮 合 ： ＣＨ₃ ＣＮ／１−メチルイミダゾール混合
物（容量で８５：１５）におけるモノマーヌクレオシド
誘導体およびメシチレンスルホニルクロライド、１５分
間；及び 洗 浄 ： ＣＨ₃ ＣＮ、６分間。

【０１４１】かくして、これら縮合サイクルの後に、共
有結合したオリゴヌクレオチドを含有するシリカゲルが
得られた。これを全てパイレックスフラスコに移し、次
いで２８％アンモニアを添加しかつ室温にて８時間放置
した。このようにしてオリゴヌクレオチドを支持体から
遊離させ、その際本発明の目的を構成する保護基を除去
した。

【０１４２】次いで、上澄液を除去しかつシリカを１ｍ
ｌの２回蒸留された水で３回洗浄した。溶剤を蒸発さ
せ、かつ残留物を０．５ｍｌの水に溶解し、次いでセフ
ァデックスＧ２５カラム（直径１ｃｍ、高さ７ｃｍ）に
て分画した。２５４ｎｍにて紫外光の吸収を示すフラク
ションを集め、かつ凍結乾燥した。

【０１４３】Ｔ４−ポリヌクレオチドキナーゼを用いる
燐３２の標識によりかつポリアクリルアミドゲル上での
電気泳動により、得られた充分な長さの合成ＤＮＡ断片
を検査した。対応するストリップを切断しかつ化合物を
溶出させ、生物学的用途を目的として化合物を生成する
ことができる。

【０１４４】同様にして、次の配列を有するオリゴヌク
レオチドの製造を行なった： −ｄ（ＡＡＴＴＣＡＧＡＵＣＴＧＡＴＣＡＴ）、 −ｄ（ＡＡＴＴＣＡＧＵＴＣＴＧＡＴＣＡＴ）、 −ｄ（ＡＡＴＴＣＡＵＡＴＣＴＧＡＴＣＡＴ）、および −ｄ（ＣＧＡＴＧＡＴＣＡＧＡＴＣＴＧ）。

【０１４５】ここでも、良好な結果が得られると共に、
常温にてアンモニア中で緩和な条件下において保護基が
除去された。

【０１４６】実施例２１ この実施例においては、ホスホルアミダイト合成を用い
て長さ１５ヌクレオチドの単独重合体を合成するため化
合物１２，１３および１４を使用した。

【０１４７】合成を実施例２０におけると同じバイオサ
ーチＳＡＭ ＯＮＥオートマトンを用いて行ない、かつ
次の試薬量を用いた：ポリヌクレオチド連鎖の末端３′
を含む実施例１５で使用した５０ｇ（すなわち１．５〜
３モル）の支持体；１縮合サイクル当り２０ｍｇの化合
物１２，１３もしくは１４（２０〜２５当量）；および
１サイクル当り１５ｍｇ（ヌクレオチドに対し２当量）
の５−パラニトロフェニルテトラゾールにより構成され
る活性剤。

【０１４８】各縮合サイクルは次の工程で構成した： 脱トリチル化：ＣＨ₂ Ｃｌ₂ における２％トリクロル酢
酸、９０秒； 洗浄：ＣＨ₃ ＣＮ、１分間； 乾燥：無水ＣＨ₃ ＣＮ：無水ジメチルホルムアミド（９
０：１０）、３分間； 縮合：ＣＨ₃ ／ＣＮ：ジメチルホルムアミド混合物（９
０：１０）におけるヌクレオシド誘導体＋活性剤、３分
間； 酸化：テトラヒドロフラン：水：ルチジン（８９．５：
１０：０．５）における０．４５％沃素、１分間； 不完全連鎖の延長を停止させるべく、反応しなかったヒ
ドロキシル基の遮蔽。無水ＣＨ₃ ＣＮにおける無水酢酸
と１−メチルイミダゾールとの混合物、２分間； 洗浄：ＣＨ₃ ＣＮ、３分間。

【０１４９】同じ化合物（化合物１２，１３もしくは１
４）を用いて行なった１４回の縮合サイクルの後、合成
された生成物を含む支持体をパイレックスフラスコに移
し、かつ２ｍｌの２８％アンモニアを添加した。フラス
コを室温にて８時間保ち、これにより本発明の目的を構
成する保護基を除去することができた。

【０１５０】次いで、上澄液を溶解し、かつシリカを１
ｍｌの２回蒸留された水で３回洗浄し、次いで溶剤を回
転エバポレータで排除した。粗製残留物を０．５ｍｌの
水に溶解させ、これをセファデックスＧ２５ゲル上での
クロマトグラフィーによって精製した。２５４ｎｍにて
吸光するフラクションを集め、その含有量をＴ４−ポリ
ヌクレオチドキナーゼによる燐３２標識の後にポリアク
リルアミドゲル上での電気泳動によって分析した。

【０１５１】かくして、３種の合成された単独重合体は
所望の長さを有し、かつこれらはそれぞれｄ（Ａ₁₅），
ｄ（Ｃ₁₅）およびｄ（Ｇ₁₅）に対応することを確認する
ことができた。

【０１５２】実施例２２：Ｈ−ホスホネート法によるオ
リゴヌクレオチドの製造 この実施例は、つぎの配列： ５′ｄ（ＡＴＧＡＴＣＴＡＣＴ）３′ を有するオリゴヌクレオチドを合成するための化合物１
７，１８および１９の使用を示している。

【０１５３】この配列においてＡ，Ｇ，ＣおよびＴは実
施例２０の配列におけると同じヌクレオチドを示す。

【０１５４】結合を行なうため化合物１７，１８および
１９をそれぞれアデニン，グアニンおよびシトシンに対
応するシントン（ｓｙｎｔｈｏｎ）、並びにチミンに対
応するシントンとして使用した。後者は５′機能を４，
４′−ジメトキシトリチル基で保護しかつ３′機能を
式：

【０１５５】

【化３５】Ｈ−Ｐ−Ｏ（Ｃ₂ Ｈ₅ ）₃ ＮＨ⁺ の含燐基で保護することによりチミジンから得られ、そ
の際アデニンのＨ−ホスホネート誘導体につき前記した
と同じ操作手順を用いた。

【０１５６】結合はバイオサーチＳＡＭ ＯＮＥオート
マトンを用いて行ない、その際次のものを使用した：
４，４′−ジメトキシトリチル基により５′位置が保護
された１μモルのチミジンでグラフトされた支持体から
なる、設計者により予備状態調節されたカラム；１縮合
サイクル当り８ｍｇのヌクレオシド誘導体１７，１８お
よび１９並びに約１０モル当量の対応するチミジン誘導
体および１縮合サイクル当り６μｌ、すなわち５０モル
当量の活性剤として使用されるトリメチルアセチルクロ
ライド。

【０１５７】各縮合サイクルの工程は次の通りである：
ジクロルメタン３ｍｌ中の２％トリクロル酢酸、１分
間；アセトニトリルによる洗浄、３ｍｌ；ピリジン：ア
セトニトリル混合物１：１、すなわち３ｍｌによる乾
燥；縮合：ピリジン−アセトニトリル混合物２ｍｌにお
けるヌクレオシド誘導体および活性剤、１分間；３ｍｌ
のピリジン−アセトニトリル混合物による洗浄；３ｍｌ
のアセトニトリルによる洗浄。

【０１５８】縮合サイクルが終了した後、２％沃素溶液
をピリジン：水混合物９８：２（３ｍｌ）中へ通すこと
により、ヌクレオチド間の燐酸化を生ぜしめた。これに
続いて、ピリジンとアセトニトリルとの混合物（５ｍ
ｌ）およびアセトニトリル（３ｍｌ）で洗浄し、次いで
上記と同様に脱トリチル化した。

【０１５９】これにより、共有結合したポリヌクレオチ
ドからなるシリカゲルが得られた。これを全てパイレッ
クスフラスコに移し、２ｍｌの２８％アンモニアを添加
し、かつ常温にて２時間放置した。かくしてオリゴヌク
レオチドが支持体から遊離され、その間本発明の目的を
構成する保護基を除去した。次いで、上澄液を溶解さ
せ、シリカを１ｍｌの２回蒸留した水で３回洗浄し、溶
剤を蒸発させかつ残留物を０．５ｍｌの水で溶解させ
た。これに続いて、セファデックスＧ２５カラム（直径
１ｃｍ、高さ７ｃｍ）での分画を行ない、次いで２５４
ｎｍにて紫外光の吸収を有するフラクションを合し、か
つこれを凍結乾燥した。

【０１６０】合成された生成物の正確な長さを放射性燐
３２標識によって検査し、その際Ｔ４−ポリヌクレオチ
ドキナーゼを使用し、次いでポリアクリルアミドゲルで
の電気泳動にかけた。

【０１６１】

【表１】

【０１６２】

【表２】

【０１６３】

【表３】

【０１６４】

【表４】

【０１６５】

【化３６】

【０１６６】

【化３７】

【０１６７】

【化３８】

【０１６８】

【化３９】

【０１６９】

【化４０】

【０１７０】

【化４１】

【０１７１】

【化４２】

【０１７２】

【化４３】

【０１７３】

【化４４】

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 式： 【化１】 ［式中、Ｒ³ は水素原子、オリゴヌクレオチド合成に使
   用される酸性媒体中において不安定な基、または式： 【化２】 の基を示し、Ｒ⁴ は水素原子、オリゴヌクレオチド合成
   に使用される含燐基または式： 【化３】 の基を示し、Ｒ⁵ は水素原子またはＯＨもしくは保護Ｏ
   Ｈ基を示す］を有するヌクレオシド誘導体。
2. 【請求項２】 Ｒ³ が式： 【化４】 （式中、Ｒ⁶ 、Ｒ⁷ およびＲ⁸ は同一でも異なってもよ
   く水素原子、アルキル基もしくはアルコキシ基を示す）
   のトリチル基、および９−フェニルキサンテニル基より
   なる群から選択される請求項１記載のヌクレオシド誘導
   体。
3. 【請求項３】 Ｒ⁴ が式： 【化５】 の基よりなる群から選択される請求項１記載のヌクレオ
   シド誘導体。
4. 【請求項４】 Ｒ³ およびＲ⁴ が水素原子を示す請求項
   １記載のヌクレオシド誘導体。
5. 【請求項５】 Ｒ³ が基： 【化６】 を示し、かつＲ⁴ が水素原子を示す請求項１記載のヌク
   レオシド誘導体。
6. 【請求項６】 Ｒ⁵ が水素原子を示す請求項１〜５のい
   ずれかに記載のヌクレオシド誘導体。
7. 【請求項７】 Ｒ³ が基： 【化７】 を示し、かつＲ⁴ が基： 【化８】 を示す請求項１記載のヌクレオシド誘導体。
8. 【請求項８】 Ｒ³ が基： 【化９】 を示し、かつＲ⁴ が基： 【化１０】 を示す請求項１記載のヌクレオシド誘導体。
9. 【請求項９】 Ｒ³ が基： 【化１１】 を示し、かつＲ⁴ が基： 【化１２】 を示す請求項１記載のヌクレオシド誘導体。
10. 【請求項１０】 Ｒ⁵ が水素原子を示す請求項７〜９の
    いずれかに記載のヌクレオシド誘導体。