JPH06197797A - 核酸物質の増幅及び検出方法並びにそれに使用するデバイス - Google Patents
核酸物質の増幅及び検出方法並びにそれに使用するデバイスInfo
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- JPH06197797A JPH06197797A JP5264813A JP26481393A JPH06197797A JP H06197797 A JPH06197797 A JP H06197797A JP 5264813 A JP5264813 A JP 5264813A JP 26481393 A JP26481393 A JP 26481393A JP H06197797 A JPH06197797 A JP H06197797A
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- B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 核酸物質を増幅及び検出するためのデバイス
（例えば、図１）及び方法を開示する。 【構成】 前記デバイス及び方法は、標識及び標識に応
答するシグナル発生性物質を使用して検出可能なシグナ
ルを生成する。前記方法及びデバイスは、驚くべきこと
に、実質的に結果に悪影響を及ぼすことなく以前は必要
であった少なくとも１つの洗浄段階を排除されたもので
ある。
（例えば、図１）及び方法を開示する。 【構成】 前記デバイス及び方法は、標識及び標識に応
答するシグナル発生性物質を使用して検出可能なシグナ
ルを生成する。前記方法及びデバイスは、驚くべきこと
に、実質的に結果に悪影響を及ぼすことなく以前は必要
であった少なくとも１つの洗浄段階を排除されたもので
ある。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、核酸物質を増幅及び検
出するのに使用される、反応パウチもしくはデバイス、
並びに方法に関する。
出するのに使用される、反応パウチもしくはデバイス、
並びに方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】極微量の核酸物質のＰＣＲ増幅及び増幅
された物質の検出を、増幅された核酸が漏出しない単一
パウチですべて実施できる方法を用いたＤＮＡ検出は、
欧州特許出願 381,501号明細書に記載されている。６つ
の一時的にシールされたブリスター（また区画（compar
tment)と称される）は、検出区画の検出部位に対してそ
れらを連絡する通路に沿って提供される。ブリスター
は、順に、ＰＣＲ反応区画；第一洗浄区画；例えば、ス
トレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ（以下本
明細書では、ＳＡ−ＨＲＰと称する）を含有する酵素標
識区画；第二洗浄区画；酵素に応答するシグナル発生性
物質を含有する区画；並びに停止溶液区画を提供する。
これらの各々が言及した順序で空になって内容物が検出
区画へ移動し、検出部位は、増幅された核酸物質を捕捉
しそして検出可能なシグナルを発生するために使用され
る。
された物質の検出を、増幅された核酸が漏出しない単一
パウチですべて実施できる方法を用いたＤＮＡ検出は、
欧州特許出願 381,501号明細書に記載されている。６つ
の一時的にシールされたブリスター（また区画（compar
tment)と称される）は、検出区画の検出部位に対してそ
れらを連絡する通路に沿って提供される。ブリスター
は、順に、ＰＣＲ反応区画；第一洗浄区画；例えば、ス
トレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ（以下本
明細書では、ＳＡ−ＨＲＰと称する）を含有する酵素標
識区画；第二洗浄区画；酵素に応答するシグナル発生性
物質を含有する区画；並びに停止溶液区画を提供する。
これらの各々が言及した順序で空になって内容物が検出
区画へ移動し、検出部位は、増幅された核酸物質を捕捉
しそして検出可能なシグナルを発生するために使用され
る。
【０００３】２つの洗浄段階を提供するために２つの洗
浄区画を使用することは、核酸物質を検出する従来の試
みのすべてと一致する。例えば、J. Clin. Microbiol.
845〜853 (1992年４月）の第30巻は、Roche ( 846〜
847 ページ）により使用された方法を記載する。その方
法は、固体壁面に対してビオチニル化生成物をハイブリ
ダイゼーションし、続いて、「プレートを４回洗浄緩衝
剤Ｉで洗浄していずれかの未ハイブリダイゼーション生
成物を除去した」と記載されている。これら４回の洗浄
は、欧州特許出願 381,501号明細書のパウチの第１洗浄
ブリスターの第１洗浄段階に対応するものであり、そし
てまた、「ハイブリダイゼーションしていない」ＤＮＡ
もしくは核酸材料が検出部位へ洗い流される。その後、
Roche 方法では、「37℃で15分間アビジン−西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ接合体と」インキュベーションせしめ
た。当然それは、ほとんど同じ目的で、EPA パウチの酵
素ブリスターを空にすることに対応する。その後、Roch
e 方法では、「再びプレートを４回洗浄して」「未結合
接合体を除去した」。勿論これは、EPA 381,501のパウ
チ中の酵素ブリスターとシグナル発生性物質ブリスター
との間に配置された第２洗浄ブリスターにより提供され
る第２洗浄段階に対応する。
浄区画を使用することは、核酸物質を検出する従来の試
みのすべてと一致する。例えば、J. Clin. Microbiol.
845〜853 (1992年４月）の第30巻は、Roche ( 846〜
847 ページ）により使用された方法を記載する。その方
法は、固体壁面に対してビオチニル化生成物をハイブリ
ダイゼーションし、続いて、「プレートを４回洗浄緩衝
剤Ｉで洗浄していずれかの未ハイブリダイゼーション生
成物を除去した」と記載されている。これら４回の洗浄
は、欧州特許出願 381,501号明細書のパウチの第１洗浄
ブリスターの第１洗浄段階に対応するものであり、そし
てまた、「ハイブリダイゼーションしていない」ＤＮＡ
もしくは核酸材料が検出部位へ洗い流される。その後、
Roche 方法では、「37℃で15分間アビジン−西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ接合体と」インキュベーションせしめ
た。当然それは、ほとんど同じ目的で、EPA パウチの酵
素ブリスターを空にすることに対応する。その後、Roch
e 方法では、「再びプレートを４回洗浄して」「未結合
接合体を除去した」。勿論これは、EPA 381,501のパウ
チ中の酵素ブリスターとシグナル発生性物質ブリスター
との間に配置された第２洗浄ブリスターにより提供され
る第２洗浄段階に対応する。
【０００４】そのような方法は、すべて洗浄によって、
十分実施できるとはいえ、時間を浪費し、従って経費が
かかる。更に、洗浄は、パウチの製造を複雑にする。し
かしながら、それらは「非特異的シグナル」、即ち、標
的ではない未結合核酸物質の存在、及び／又は標的核酸
が存在しないために存在すべきではない未結合ＳＡ−Ｈ
ＲＰのどちらかによって発生するシグナルを排除するた
めに必須であると考えられている。
十分実施できるとはいえ、時間を浪費し、従って経費が
かかる。更に、洗浄は、パウチの製造を複雑にする。し
かしながら、それらは「非特異的シグナル」、即ち、標
的ではない未結合核酸物質の存在、及び／又は標的核酸
が存在しないために存在すべきではない未結合ＳＡ−Ｈ
ＲＰのどちらかによって発生するシグナルを排除するた
めに必須であると考えられている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、信頼できないシグナルを発生することで検出中に多
量のノイズを生じることなく、少なくとも１つの、好ま
しくは両方の、以前に必要とされた洗浄段階及び洗浄ブ
リスターを排除する検出順序を提供することである。
は、信頼できないシグナルを発生することで検出中に多
量のノイズを生じることなく、少なくとも１つの、好ま
しくは両方の、以前に必要とされた洗浄段階及び洗浄ブ
リスターを排除する検出順序を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、EPA 38
1,501に記載された方法に使用されたパウチのフォーマ
ットが、１つもしくは両方の洗浄ブリスターを排除する
ことに役立ち、一方実質的に同じ結果を提供することを
発見した。これは、洗浄が必須段階であることを指図し
てきた実際の歴史に著しい驚きを与えた。
1,501に記載された方法に使用されたパウチのフォーマ
ットが、１つもしくは両方の洗浄ブリスターを排除する
ことに役立ち、一方実質的に同じ結果を提供することを
発見した。これは、洗浄が必須段階であることを指図し
てきた実際の歴史に著しい驚きを与えた。
【０００７】より詳細には、本発明の一態様に従えば、
本発明の目的は、少なくとも１つの固定化プローブを含
む検出部位に増幅された核酸物質をハイブリダイズせし
め、シグナル発生性物質であるか又はそれと相互作用し
てシグナルを生成する標識を該部位に持ってくることに
よりハイブリダイズして固定化せしめた核酸物質を標識
し、その後にシグナル発生性物質を該部位に添加して検
出可能なシグナルを生成することにより増幅された核酸
物質を検出する方法であって、標識段階が、ハイブリダ
イゼーション段階の後に、間に洗浄段階を必要とするこ
となく直接用いられるか、又は添加段階が、標識段階の
後に、間に洗浄段階を必要とすることなく直接用いられ
る方法により達成される。このような事情で使用される
「又は」が、非限定的使用であることは明らかである。
本発明の目的は、少なくとも１つの固定化プローブを含
む検出部位に増幅された核酸物質をハイブリダイズせし
め、シグナル発生性物質であるか又はそれと相互作用し
てシグナルを生成する標識を該部位に持ってくることに
よりハイブリダイズして固定化せしめた核酸物質を標識
し、その後にシグナル発生性物質を該部位に添加して検
出可能なシグナルを生成することにより増幅された核酸
物質を検出する方法であって、標識段階が、ハイブリダ
イゼーション段階の後に、間に洗浄段階を必要とするこ
となく直接用いられるか、又は添加段階が、標識段階の
後に、間に洗浄段階を必要とすることなく直接用いられ
る方法により達成される。このような事情で使用される
「又は」が、非限定的使用であることは明らかである。
【０００８】本発明の別の態様に従えば、増幅された核
酸物質を検出するための検出部位並びに標識及び共同し
て検出可能なシグナルを発生するのに有効であるシグナ
ル発生性物質を含有する保存区画を含む複数の区画、並
びに区画と部位を流動的に連絡するための通路を含んで
なる、鋳型として少なくとも１つの標的鎖を用いて核酸
物質を増幅及び検出するためのデバイスにより目的が達
成される。該デバイスは、更に、実質的に捕捉体、標識
及びシグナル発生性試薬を含まない洗浄液を含有する１
つ以下の洗浄区画、及び保存もしくは反応区画に使用さ
れるシグナル発生性試薬、並びに洗浄区画と検出部位を
連絡する１つ以下の通路を含み、そして、１つ以下の洗
浄段階が、区画の内容物を空にして検出部位へ移動せし
めることを含む一連の段階に使用されるように改良され
ている。
酸物質を検出するための検出部位並びに標識及び共同し
て検出可能なシグナルを発生するのに有効であるシグナ
ル発生性物質を含有する保存区画を含む複数の区画、並
びに区画と部位を流動的に連絡するための通路を含んで
なる、鋳型として少なくとも１つの標的鎖を用いて核酸
物質を増幅及び検出するためのデバイスにより目的が達
成される。該デバイスは、更に、実質的に捕捉体、標識
及びシグナル発生性試薬を含まない洗浄液を含有する１
つ以下の洗浄区画、及び保存もしくは反応区画に使用さ
れるシグナル発生性試薬、並びに洗浄区画と検出部位を
連絡する１つ以下の通路を含み、そして、１つ以下の洗
浄段階が、区画の内容物を空にして検出部位へ移動せし
めることを含む一連の段階に使用されるように改良され
ている。
【０００９】
【具体的な態様】以下の本明細書の説明は、本発明を、
その好ましい態様について示すものであり、同一所有の
許可された米国特許出願番号第 673,053号明細書（1991
年３月21日にSchnipelsky 他により出願されたものであ
り、その内容は本明細書に特に組み入れられる）に教示
された手段で、柔軟なパウチもしくはデバイスが提供さ
れ使用される。（幾つかの開示はEPA 381,501 に記載の
ものと同様である。）更に、本発明は、１つ以下の洗浄
区画が、結果として１つ以下の介在する洗浄段階に含ま
れることを条件として、ＰＣＲが使用されるかどうかに
無関係に有用であり、且つそのパウチのすべての特徴の
存在に無関係に有用である。本明細書で用いられる「洗
液」もしくは「洗浄溶液」なる語は、別の区画、即ち標
識区画又はシグナル発生性物質区画のどちらかに使用さ
れる捕捉体、標識及びシグナル発生性試薬を実質的に含
まない溶液を意味する。
その好ましい態様について示すものであり、同一所有の
許可された米国特許出願番号第 673,053号明細書（1991
年３月21日にSchnipelsky 他により出願されたものであ
り、その内容は本明細書に特に組み入れられる）に教示
された手段で、柔軟なパウチもしくはデバイスが提供さ
れ使用される。（幾つかの開示はEPA 381,501 に記載の
ものと同様である。）更に、本発明は、１つ以下の洗浄
区画が、結果として１つ以下の介在する洗浄段階に含ま
れることを条件として、ＰＣＲが使用されるかどうかに
無関係に有用であり、且つそのパウチのすべての特徴の
存在に無関係に有用である。本明細書で用いられる「洗
液」もしくは「洗浄溶液」なる語は、別の区画、即ち標
識区画又はシグナル発生性物質区画のどちらかに使用さ
れる捕捉体、標識及びシグナル発生性試薬を実質的に含
まない溶液を意味する。
【００１０】前記米国特許出願番号第 673,053号明細書
の柔軟なパウチの、非特異的シグナルを著しく提供する
ことなく洗浄段階を排除する能力は、完全に理解されて
いるわけではない。しかしながら、「スラッグ」の前面
が、その前の「スラッグ」により残存する結合していな
い試薬を洗い出すように作用するというような、各々の
連続的な液体のスラッグを直線的に通過せしめるような
パウチの構成より得られると考えられる。このような
「前面」で生じるいずれかの相互作用は、固定化部位で
発生するシグナルに対してほとんど又は全く取るに足ら
ないものである。更に、すべての各スラッグの液体が、
検出部位を通過して効率を改良する。下記のように添加
できる任意の剪断減粘性ゲルは、この能力を増強し、ス
ラッグの前面の境界により除去される成分の後方移動を
遅らせるより粘稠なスラッグを創造することは明らかで
ある。
の柔軟なパウチの、非特異的シグナルを著しく提供する
ことなく洗浄段階を排除する能力は、完全に理解されて
いるわけではない。しかしながら、「スラッグ」の前面
が、その前の「スラッグ」により残存する結合していな
い試薬を洗い出すように作用するというような、各々の
連続的な液体のスラッグを直線的に通過せしめるような
パウチの構成より得られると考えられる。このような
「前面」で生じるいずれかの相互作用は、固定化部位で
発生するシグナルに対してほとんど又は全く取るに足ら
ないものである。更に、すべての各スラッグの液体が、
検出部位を通過して効率を改良する。下記のように添加
できる任意の剪断減粘性ゲルは、この能力を増強し、ス
ラッグの前面の境界により除去される成分の後方移動を
遅らせるより粘稠なスラッグを創造することは明らかで
ある。
【００１１】図１は、反応区画と標識区画の間の洗浄区
画及び洗浄段階を排除した、本発明の一様式を具体的に
示すものである。反応キュベットもしくはデバイス１０
は、患者の試料液を注入するための入口２２を含み、そ
の入口は通路２１を介してＰＣＲ反応区画２６に連絡す
る。シール４６は、区画２６の流出を一時的に遮断す
る。シール４６が破れると、液体は通路４４を通過し
て、好ましくは適所に定着せしめられたビーズから成る
部位４１を有する検出室４０に送られる。ビーズは、区
画２６から流れてきてそれらを通過するいずれかの標的
分析物と複合体を形成し、次いで別の試薬区画から来る
試薬と複合体を形成するであろう。それらの別の区画は
区画３０，３２，３４であり、これらの内容物は各々通
路４８及び５０を介して検出室４０に送られる。これら
の各通路は５６で一時的にシールされており、そしてこ
れらの区画は適当な試薬液を含有する。
画及び洗浄段階を排除した、本発明の一様式を具体的に
示すものである。反応キュベットもしくはデバイス１０
は、患者の試料液を注入するための入口２２を含み、そ
の入口は通路２１を介してＰＣＲ反応区画２６に連絡す
る。シール４６は、区画２６の流出を一時的に遮断す
る。シール４６が破れると、液体は通路４４を通過し
て、好ましくは適所に定着せしめられたビーズから成る
部位４１を有する検出室４０に送られる。ビーズは、区
画２６から流れてきてそれらを通過するいずれかの標的
分析物と複合体を形成し、次いで別の試薬区画から来る
試薬と複合体を形成するであろう。それらの別の区画は
区画３０，３２，３４であり、これらの内容物は各々通
路４８及び５０を介して検出室４０に送られる。これら
の各通路は５６で一時的にシールされており、そしてこ
れらの区画は適当な試薬液を含有する。
【００１２】すべての区画及び部位４１に有用な化学物
質については、前記米国特許出願番号第 673,053号明細
書により詳細に説明されている。好ましくは、洗浄区画
が緩衝剤、界面活性剤、ＥＤＴＡ、NaCl及び別の塩類を
含む。
質については、前記米国特許出願番号第 673,053号明細
書により詳細に説明されている。好ましくは、洗浄区画
が緩衝剤、界面活性剤、ＥＤＴＡ、NaCl及び別の塩類を
含む。
【００１３】本発明に従えば、数多くの必須の区画が単
一化されている。従って：使用者により添加される患者
試料に加えて、好ましくはＰＣＲ増幅に必要なすべての
伝統的な試薬を含む区画２６は、場合によっては一時的
にシール２５により適所に維持される。（試薬は、予め
インキュベーションすることができ、又は患者試料を入
れるときにそれと共に添加できる。）試薬は、バインデ
ィングペアの１メンバーに結合したプライマーを含み、
その別のメンバーは下記区画３０に認められる。プライ
マーに付着したバインディングメンバーの有用な具体例
はビオチンである。（ここで、シール２５は試料を注入
することにより破裂する。）
一化されている。従って：使用者により添加される患者
試料に加えて、好ましくはＰＣＲ増幅に必要なすべての
伝統的な試薬を含む区画２６は、場合によっては一時的
にシール２５により適所に維持される。（試薬は、予め
インキュベーションすることができ、又は患者試料を入
れるときにそれと共に添加できる。）試薬は、バインデ
ィングペアの１メンバーに結合したプライマーを含み、
その別のメンバーは下記区画３０に認められる。プライ
マーに付着したバインディングメンバーの有用な具体例
はビオチンである。（ここで、シール２５は試料を注入
することにより破裂する。）
【００１４】区画３０は、好ましくは、複合剤、例え
ば、アビジン、即ち、バインディングペアの一方のメン
バーに結合した酵素を初めとする標識を含み、そのペア
のもう一方のメンバーは上記反応区画２６で増幅中に標
的分析物の一部となるプライマーに結合している。よっ
て、区画３０中の有用な試薬は、ストレプトアビジン西
洋ワサビペルオキシダーゼ（以下本明細書では、ＳＡ−
ＨＲＰ）である。従って、そのバインディングペアのも
う一方のメンバーはビオチンである。
ば、アビジン、即ち、バインディングペアの一方のメン
バーに結合した酵素を初めとする標識を含み、そのペア
のもう一方のメンバーは上記反応区画２６で増幅中に標
的分析物の一部となるプライマーに結合している。よっ
て、区画３０中の有用な試薬は、ストレプトアビジン西
洋ワサビペルオキシダーゼ（以下本明細書では、ＳＡ−
ＨＲＰ）である。従って、そのバインディングペアのも
う一方のメンバーはビオチンである。
【００１５】また酵素以外の標識も有用である。例え
ば、蛍光標識、放射性標識及び化学ルミネセンス標識も
このような用途について周知である。また好ましくは、
化学ルミネセンス標識が、酵素標識について以下に検討
されている、シグナル発生性試薬を含有する区画３４に
使用される。好ましくは、区画３２は試薬として洗浄溶
液を含む。
ば、蛍光標識、放射性標識及び化学ルミネセンス標識も
このような用途について周知である。また好ましくは、
化学ルミネセンス標識が、酵素標識について以下に検討
されている、シグナル発生性試薬を含有する区画３４に
使用される。好ましくは、区画３２は試薬として洗浄溶
液を含む。
【００１６】好ましくは、区画３４は、シグナル発生性
物質及び有用であるいずれかの色素安定剤を含む。従っ
て、例えば、区画３４中の有用な試薬溶液は、区画３０
の酵素の伝統的な基質であるロイコ色素の溶液である。
またH2O2及びいずれかの剪断減粘性ゲルも含まれる。区
画４２は、場合によって吸収体を含有する廃棄物収集区
画である。
物質及び有用であるいずれかの色素安定剤を含む。従っ
て、例えば、区画３４中の有用な試薬溶液は、区画３０
の酵素の伝統的な基質であるロイコ色素の溶液である。
またH2O2及びいずれかの剪断減粘性ゲルも含まれる。区
画４２は、場合によって吸収体を含有する廃棄物収集区
画である。
【００１７】ローラー６０は、各区画を連続的に破裂せ
しめて、それぞれの区画の内容物を検出室４０に連続的
に進行させるために使用される外部加圧手段を例示する
ものである。処理中、すべての区画及び通路が封じられ
たままなので、デバイスから外部への漏出が生じること
は全くなく、そして繰越汚染も防止される。入口２２の
シーリングは、折り曲げ線７２でコーナー７０を折り曲
げて、孔７４を入口２２の上に嵌め、そして通路２１を
挟みつぶすことにより達成される。次いでクロージャー
キャップを用いてコーナー７０を折り曲げた状態に維持
する。
しめて、それぞれの区画の内容物を検出室４０に連続的
に進行させるために使用される外部加圧手段を例示する
ものである。処理中、すべての区画及び通路が封じられ
たままなので、デバイスから外部への漏出が生じること
は全くなく、そして繰越汚染も防止される。入口２２の
シーリングは、折り曲げ線７２でコーナー７０を折り曲
げて、孔７４を入口２２の上に嵌め、そして通路２１を
挟みつぶすことにより達成される。次いでクロージャー
キャップを用いてコーナー７０を折り曲げた状態に維持
する。
【００１８】デバイス１０を処理するのに有用な処理装
置は、EPA 402,994 に示されている。そのような処理装
置を用いて、支持体表面上にデバイス１０をきちんと並
べて置き、そして加圧メンバー、例えば、ローラーを、
各キュベットを処理する位置に平行に乗せる。便宜上ロ
ーラーを数個から１つもしくは複数の車軸にジャーナル
せしめる。これらの車軸はギアを付けることにより更に
進歩する。好ましくは、支持体表面が水平であるか、又
は水平より約15°上向きに傾斜している。更にヒーター
は、所望により、固定状態であるか、あるいはローラー
と共に運ぶことができる。
置は、EPA 402,994 に示されている。そのような処理装
置を用いて、支持体表面上にデバイス１０をきちんと並
べて置き、そして加圧メンバー、例えば、ローラーを、
各キュベットを処理する位置に平行に乗せる。便宜上ロ
ーラーを数個から１つもしくは複数の車軸にジャーナル
せしめる。これらの車軸はギアを付けることにより更に
進歩する。好ましくは、支持体表面が水平であるか、又
は水平より約15°上向きに傾斜している。更にヒーター
は、所望により、固定状態であるか、あるいはローラー
と共に運ぶことができる。
【００１９】従って、区画４０の部位４１でＳＡ−ＨＲ
Ｐをインキュベーションした後に洗浄段階を提供して、
いずれの未結合ＳＡ−ＨＲＰも除去するために、唯一の
洗浄区画３２が使用される。検出部位に向けられた各試
薬がそのステーションに入る次の試薬によりほとんど洗
い流されるので、増幅された核酸物質及びＳＡ−ＨＲＰ
の、部位４１へのそれぞれの連続的な移動の間に洗浄段
階もしくは洗浄液は全く必要とされないと考えられる。
各区画の少量の内容物がこれを行うのに十分であること
は、驚くべきことである。
Ｐをインキュベーションした後に洗浄段階を提供して、
いずれの未結合ＳＡ−ＨＲＰも除去するために、唯一の
洗浄区画３２が使用される。検出部位に向けられた各試
薬がそのステーションに入る次の試薬によりほとんど洗
い流されるので、増幅された核酸物質及びＳＡ−ＨＲＰ
の、部位４１へのそれぞれの連続的な移動の間に洗浄段
階もしくは洗浄液は全く必要とされないと考えられる。
各区画の少量の内容物がこれを行うのに十分であること
は、驚くべきことである。
【００２０】あるいは（図示せず）、洗浄液が区画３０
にのみ配置されており、ＳＡ−ＨＲＰがここで区画３２
に配置されているが、図１と全く同じ構造のものが有用
である。この配置では、方法は、部位４１でＳＡ−ＨＲ
Ｐをインキュベーションした直後に、洗浄段階を間に入
れることなく、区画３４のシグナル発生性物質を部位４
１と直接相互作用するように進行させる。これが実施で
きる理由は、先の態様について記載の通りである。
にのみ配置されており、ＳＡ−ＨＲＰがここで区画３２
に配置されているが、図１と全く同じ構造のものが有用
である。この配置では、方法は、部位４１でＳＡ−ＨＲ
Ｐをインキュベーションした直後に、洗浄段階を間に入
れることなく、区画３４のシグナル発生性物質を部位４
１と直接相互作用するように進行させる。これが実施で
きる理由は、先の態様について記載の通りである。
【００２１】どちらの態様においても、所望であれば更
なる洗浄液を備えた洗浄区画を補充できる。これを行う
便利な方法（図２）は、始めに第１洗浄区画を空にして
検出部位へ流し、次いで第２洗浄区画を空にして検出部
位へ流すために、第１洗浄区画に隣接した洗浄区画を加
えることである。これらの前記と同様の部分には、同様
の参照数字を付与し、区別するためにそれの末尾に
「Ａ」を付ける。
なる洗浄液を備えた洗浄区画を補充できる。これを行う
便利な方法（図２）は、始めに第１洗浄区画を空にして
検出部位へ流し、次いで第２洗浄区画を空にして検出部
位へ流すために、第１洗浄区画に隣接した洗浄区画を加
えることである。これらの前記と同様の部分には、同様
の参照数字を付与し、区別するためにそれの末尾に
「Ａ」を付ける。
【００２２】従って、パウチ１０Ａは、更に一時的にシ
ールした洗浄液の区画３６を区画３２Ａと３４Ａの間に
置いたことを除いて、図１の態様におけるものと全く同
じ特徴を含む。通路５２は、区画３６のシール５６Ａが
破裂した後に、それを区画４０Ａに連絡するものであ
る。あるいは、大量の洗液を備えた単一洗浄区画が使用
できる。図３に示すように、結果としていかなる洗浄区
画又はいかなる洗浄段階の存在も必要ではない。これら
の前記と同様の部分には、同様の参照数字を付与し、区
別するためにそれの末尾に「Ｂ」を付ける。
ールした洗浄液の区画３６を区画３２Ａと３４Ａの間に
置いたことを除いて、図１の態様におけるものと全く同
じ特徴を含む。通路５２は、区画３６のシール５６Ａが
破裂した後に、それを区画４０Ａに連絡するものであ
る。あるいは、大量の洗液を備えた単一洗浄区画が使用
できる。図３に示すように、結果としていかなる洗浄区
画又はいかなる洗浄段階の存在も必要ではない。これら
の前記と同様の部分には、同様の参照数字を付与し、区
別するためにそれの末尾に「Ｂ」を付ける。
【００２３】従って、図３のパウチ１０Ｂは、全く洗浄
区画が存在しないことを除いて、前記態様のすべての特
徴を含む。存在する区画は、サーマルサイクリング反応
区画２６Ｂ、標識含有区画３０Ｂ（例えば、ストレプト
アビジン西洋ワサビペルオキシダーゼを含む）、並びに
シグナル発生性物質、例えば、H2O2を含有し、すぐ後に
記載する剪断減粘性ゲル及び標識酵素と反応して色素を
生成するロイコ色素を任意に含有する区画３４Ｂのみで
ある。シール４６Ｂ及び５６Ｂは、ローラー６０Ｂによ
り連続的に破裂せしめられ、内容物はそれぞれ通路４４
Ｂ及び４８Ｂを介して検出部位４０Ｂに流れ、次いで廃
棄物区画４２Ｂに流れる。
区画が存在しないことを除いて、前記態様のすべての特
徴を含む。存在する区画は、サーマルサイクリング反応
区画２６Ｂ、標識含有区画３０Ｂ（例えば、ストレプト
アビジン西洋ワサビペルオキシダーゼを含む）、並びに
シグナル発生性物質、例えば、H2O2を含有し、すぐ後に
記載する剪断減粘性ゲル及び標識酵素と反応して色素を
生成するロイコ色素を任意に含有する区画３４Ｂのみで
ある。シール４６Ｂ及び５６Ｂは、ローラー６０Ｂによ
り連続的に破裂せしめられ、内容物はそれぞれ通路４４
Ｂ及び４８Ｂを介して検出部位４０Ｂに流れ、次いで廃
棄物区画４２Ｂに流れる。
【００２４】すべての態様において、シグナル発生性物
質と共に含まれる任意の成分は、検出区画中の検出部位
での色生成を安定化するための約 0.5％のアガロース溶
液である。アガロースは、剪断速度１〜102sec-1の間の
この濃厚な液滴でその粘度が約27ポアズであり（その液
滴の60％を越える）、そして約40℃で測定した場合、一
方速度102 を越えると３ポアズのみであるという剪断減
粘性挙動を示す。同様の粘度挙動を示しそして低いパー
センテージ濃度を示す別の剪断減粘性ゲルが使用でき
る。
質と共に含まれる任意の成分は、検出区画中の検出部位
での色生成を安定化するための約 0.5％のアガロース溶
液である。アガロースは、剪断速度１〜102sec-1の間の
この濃厚な液滴でその粘度が約27ポアズであり（その液
滴の60％を越える）、そして約40℃で測定した場合、一
方速度102 を越えると３ポアズのみであるという剪断減
粘性挙動を示す。同様の粘度挙動を示しそして低いパー
センテージ濃度を示す別の剪断減粘性ゲルが使用でき
る。
【００２５】以前は洗浄段階が検出部位への増幅された
物質もしくは標識のどちらかの添加と次の試薬の添加の
間に必須であると考えられていたので、上記のように、
驚くべきことにどのようにしてパウチを用いて洗浄段階
を排除することが許容されるのか、完全に理解されてい
るわけではない。図４Ａ〜４Ｃは、例えば、図３の態様
を用いて仮定したメカニズムを具体的に説明する際の補
助として含めた。しかしながら、同様の原理がすべての
態様に作用していると信じられている。
物質もしくは標識のどちらかの添加と次の試薬の添加の
間に必須であると考えられていたので、上記のように、
驚くべきことにどのようにしてパウチを用いて洗浄段階
を排除することが許容されるのか、完全に理解されてい
るわけではない。図４Ａ〜４Ｃは、例えば、図３の態様
を用いて仮定したメカニズムを具体的に説明する際の補
助として含めた。しかしながら、同様の原理がすべての
態様に作用していると信じられている。
【００２６】示されているものは、前記EPA 381,051 に
記載のような固定化ビーズを含む、拡大した検出部位４
１Ｂである。図４Ａに示される段階では、ビオチン尾部
を有する増幅された標的核酸物質を「〜〜〜Ｂ」と示
す。そのような物質は既にビーズにハイブリダイズせし
められている。更に、標識ＳＡ−ＨＲＰを含有する区画
が空になりその部位へ流れてくる。（ＳＡ−ＨＲＰは、
標識アビジンとして「Ａ * 」と示す。）そのＳＡ−ＨＲ
Ｐの幾つかは、既に標的のビオチンに結合しているが、
しかし幾つかはビーズ上に及び区画４０Ｂの表面上に結
合していないもの又は「遊離しているもの」として示
す。
記載のような固定化ビーズを含む、拡大した検出部位４
１Ｂである。図４Ａに示される段階では、ビオチン尾部
を有する増幅された標的核酸物質を「〜〜〜Ｂ」と示
す。そのような物質は既にビーズにハイブリダイズせし
められている。更に、標識ＳＡ−ＨＲＰを含有する区画
が空になりその部位へ流れてくる。（ＳＡ−ＨＲＰは、
標識アビジンとして「Ａ * 」と示す。）そのＳＡ−ＨＲ
Ｐの幾つかは、既に標的のビオチンに結合しているが、
しかし幾つかはビーズ上に及び区画４０Ｂの表面上に結
合していないもの又は「遊離しているもの」として示
す。
【００２７】シグナル発生性物質、例えば、ロイコ色素
（「Ｌ．Ｄ．」と示す）を含有する次の区画が破裂する
と、ロイコ色素は「スラッグ」１００，図４Ｂ，として
前進する。その先導メニスカス１０２は、それが移動す
ることにより（矢印１０４）、部位４１Ｂに接近する。
「スラッグ」１００が図４Ｃの部位４１Ｂを通過すると
き、それはメニスカス１０２で結合していない前の試薬
（Ａ* ）を運び去り、結合した標識のみを残してスラッ
グ１００の後ろに引きずる部分で反応し、部位４１Ｂで
色素を生成する。それは読み取られるか又は検出される
領域１１０であるので、下流（メニスカス１０２）で生
成されたいずれかの余分な色素は無関係である。このよ
うな検出部位への余分な色素の後方への移動は、所望に
より前記剪断減粘性ゲルを使用することにより更に遅く
なる。
（「Ｌ．Ｄ．」と示す）を含有する次の区画が破裂する
と、ロイコ色素は「スラッグ」１００，図４Ｂ，として
前進する。その先導メニスカス１０２は、それが移動す
ることにより（矢印１０４）、部位４１Ｂに接近する。
「スラッグ」１００が図４Ｃの部位４１Ｂを通過すると
き、それはメニスカス１０２で結合していない前の試薬
（Ａ* ）を運び去り、結合した標識のみを残してスラッ
グ１００の後ろに引きずる部分で反応し、部位４１Ｂで
色素を生成する。それは読み取られるか又は検出される
領域１１０であるので、下流（メニスカス１０２）で生
成されたいずれかの余分な色素は無関係である。このよ
うな検出部位への余分な色素の後方への移動は、所望に
より前記剪断減粘性ゲルを使用することにより更に遅く
なる。
【００２８】
【実施例】以下の例示的な実施例は、本発明を説明する
際に役立つであろう。すべての実施例及び比較例は、特
に断らない限り、以下のように調製された試薬を用い
た。
際に役立つであろう。すべての実施例及び比較例は、特
に断らない限り、以下のように調製された試薬を用い
た。
【００２９】Ａ． 評価するためのＨＵＴ／ＨＩＶ分析物の調製 細胞１つ当たりＨＩＶのコピーを１つ含有するＨＵＴ／
ＡＡＶ／７８細胞を標準フェノール・クロロホルム抽出
方法で処理してＤＮＡを単離し、そして得られたＤＮＡ
の量を分光光度計で定量した。以下に同定される各プラ
イマー（各々１マイクロモル（μＭ））、緩衝剤〔塩化
マグネシウム10ミリモル（mM）、トリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）50mM、塩化カリウム50
mM、及びゼラチン 0.1mg/mL 〕、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、
ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰデオキシヌクレオチド三リン酸
各々 1.5mM、並びにサーマス・アクアティクス（Thermu
saquaticus ）より得られるＤＮＡポリメラーゼ 40単
位、を含有するカクテル中で、回収したＤＮＡ（ＨＩＶ
100,000コピー）をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に
より増幅した。
ＡＡＶ／７８細胞を標準フェノール・クロロホルム抽出
方法で処理してＤＮＡを単離し、そして得られたＤＮＡ
の量を分光光度計で定量した。以下に同定される各プラ
イマー（各々１マイクロモル（μＭ））、緩衝剤〔塩化
マグネシウム10ミリモル（mM）、トリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）50mM、塩化カリウム50
mM、及びゼラチン 0.1mg/mL 〕、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、
ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰデオキシヌクレオチド三リン酸
各々 1.5mM、並びにサーマス・アクアティクス（Thermu
saquaticus ）より得られるＤＮＡポリメラーゼ 40単
位、を含有するカクテル中で、回収したＤＮＡ（ＨＩＶ
100,000コピー）をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に
より増幅した。
【００３０】二組のプライマーを使用した。一組はＥＮ
Ｖ領域に相補的であり、そしてもう一組はＨＵＴ／ＨＩ
Ｖ ＤＮＡのＧＡＧ領域に相補的であり、それらは多重
に使用されることが知られている。各組の１つのプライ
マーが検出を促進するためにビオチニル化された。米国
特許第 4,914,210号明細書の教示に従って、２つのテト
ラエチレングリコールスペーサー基をオリゴヌクレオチ
ドに付着させた。
Ｖ領域に相補的であり、そしてもう一組はＨＵＴ／ＨＩ
Ｖ ＤＮＡのＧＡＧ領域に相補的であり、それらは多重
に使用されることが知られている。各組の１つのプライ
マーが検出を促進するためにビオチニル化された。米国
特許第 4,914,210号明細書の教示に従って、２つのテト
ラエチレングリコールスペーサー基をオリゴヌクレオチ
ドに付着させた。
【００３１】ＰＣＲプロトコールを、P. N. Schnipelsk
y 他，EPA 381,051 及び1991年３月21日に出願された
（現在は許可された）米国特許出願番号第 673,053号明
細書に記載のタイプのＰＣＲ分析要素のＰＣＲ反応ブリ
スター中で前記カクテル 250μＬを用いて実施した。よ
り詳細には、図７のパウチ１０Ｃを使用した。これらの
前記と同様の部分には、同様の参照数字を付与し、区別
するためにそれの末尾に「Ｃ」を付ける。従って、配置
又は以下本明細書に記載することを除いて、区画２６
Ｃ、３０Ｃ、３２Ｃ、３６Ｃ及び３４Ｃ；通路４４Ｃ、
４８Ｃ、５０Ｃ及び５２Ｃ；検出部位４０Ｃ並びに廃棄
物区画４２Ｃを前記のように使用した。１つは、ＰＣＲ
増幅を試験パウチ１０Ｃとは別個のパウチで行ったこと
であり、すべての反復試験、例えば、実施例１では３２
回における結果が矛盾しないように、増幅した物質をプ
ールし、次いで区画２６Ｃに注入した。
y 他，EPA 381,051 及び1991年３月21日に出願された
（現在は許可された）米国特許出願番号第 673,053号明
細書に記載のタイプのＰＣＲ分析要素のＰＣＲ反応ブリ
スター中で前記カクテル 250μＬを用いて実施した。よ
り詳細には、図７のパウチ１０Ｃを使用した。これらの
前記と同様の部分には、同様の参照数字を付与し、区別
するためにそれの末尾に「Ｃ」を付ける。従って、配置
又は以下本明細書に記載することを除いて、区画２６
Ｃ、３０Ｃ、３２Ｃ、３６Ｃ及び３４Ｃ；通路４４Ｃ、
４８Ｃ、５０Ｃ及び５２Ｃ；検出部位４０Ｃ並びに廃棄
物区画４２Ｃを前記のように使用した。１つは、ＰＣＲ
増幅を試験パウチ１０Ｃとは別個のパウチで行ったこと
であり、すべての反復試験、例えば、実施例１では３２
回における結果が矛盾しないように、増幅した物質をプ
ールし、次いで区画２６Ｃに注入した。
【００３２】EPA 402,994 に記載のタイプのサーマルサ
イクリング処理装置を使用した。標的ＤＮＡを予め90℃
で10秒間加熱し、次いで96℃で30秒間変性し、そして70
℃まで60秒間かけて冷却してプライマーをアニールし、
そしてプライマー伸長生成物を生成した。後者の２つの
段階（96℃で加熱し、次いで70℃にする）は、計40サイ
クル繰り返した。このＰＣＲプロセスを64回反復し、そ
して新たに生成したＰＣＲ生成物を含有する流体を64個
のＰＣＲブリスターから共通の容器に写してＰＣＲ生成
物のプールを調製した。このプール由来の試料を前記Ｐ
ＣＲ緩衝剤で１：20に希釈して、以下本明細書に記載さ
れる試験に使用した。
イクリング処理装置を使用した。標的ＤＮＡを予め90℃
で10秒間加熱し、次いで96℃で30秒間変性し、そして70
℃まで60秒間かけて冷却してプライマーをアニールし、
そしてプライマー伸長生成物を生成した。後者の２つの
段階（96℃で加熱し、次いで70℃にする）は、計40サイ
クル繰り返した。このＰＣＲプロセスを64回反復し、そ
して新たに生成したＰＣＲ生成物を含有する流体を64個
のＰＣＲブリスターから共通の容器に写してＰＣＲ生成
物のプールを調製した。このプール由来の試料を前記Ｐ
ＣＲ緩衝剤で１：20に希釈して、以下本明細書に記載さ
れる試験に使用した。
【００３３】Ｂ． 洗浄溶液の調製（ここで使用した） リン酸ナトリウム10ミリモル、塩化ナトリウム 150ミリ
モル及びエチエンジアミン四酢酸１ミリモルを含有する
リン酸緩衝溶液中にデシル硫酸ナトリウム１％を含み、
pH 7.4となるように洗浄溶液を調製した。
モル及びエチエンジアミン四酢酸１ミリモルを含有する
リン酸緩衝溶液中にデシル硫酸ナトリウム１％を含み、
pH 7.4となるように洗浄溶液を調製した。
【００３４】Ｃ． ストレプトアビジン／西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ）接合体溶液の調製 Zymed Labs (San Francisco, CA)より入手したストレプ
トアビジン及び西洋ワサビペルオキシダーゼの接合体
を、チメロサール防腐剤（0.01％）を含有するリン酸緩
衝溶液（pH 7.3）中にカゼイン（ 0.5％）を含む溶液で
１：8000に希釈した。
ルオキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ）接合体溶液の調製 Zymed Labs (San Francisco, CA)より入手したストレプ
トアビジン及び西洋ワサビペルオキシダーゼの接合体
を、チメロサール防腐剤（0.01％）を含有するリン酸緩
衝溶液（pH 7.3）中にカゼイン（ 0.5％）を含む溶液で
１：8000に希釈した。
【００３５】Ｄ． ロイコ色素組成物の調製 水 100mL中にポリビニルピロリドン25ｇを含む溶液を、
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１mL中に４，５−ビス
（４−ジメチルアミノフェニル）−２−（４−ヒドロキ
シ−３，５−ジメトキシフェニル）イミダゾールブルー
生成性ロイコ色素0.20ｇを含む溶液と混合し、そして１
時間攪拌した。次いでこれを、水1900mLに溶解したリン
酸一ナトリウム一水和物2.76ｇ、ジエチレントリアミン
五酢酸溶液（ 0.1Ｍ） 0.2mL及び４′−ヒドロキシアセ
トアニリド1.51ｇを混合し、そして50％水酸化ナトリウ
ム溶液でpH6.82に調整することにより調製した溶液に添
加した。次いで30％過酸化水素２mLを添加し、そして混
合物を攪拌して色素分散物を生成せしめた。最終的に、
得られた色素分散物 24.75mLを水性25μＭジメドン0.25
mL及びアガロース 0.125ｇと混合して 0.5％アガロース
を含有する色素生成性組成物を生成した。アガロースが
溶解するまで組成物全体を80℃で加熱攪拌し、次いで室
温まで冷却した。
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１mL中に４，５−ビス
（４−ジメチルアミノフェニル）−２−（４−ヒドロキ
シ−３，５−ジメトキシフェニル）イミダゾールブルー
生成性ロイコ色素0.20ｇを含む溶液と混合し、そして１
時間攪拌した。次いでこれを、水1900mLに溶解したリン
酸一ナトリウム一水和物2.76ｇ、ジエチレントリアミン
五酢酸溶液（ 0.1Ｍ） 0.2mL及び４′−ヒドロキシアセ
トアニリド1.51ｇを混合し、そして50％水酸化ナトリウ
ム溶液でpH6.82に調整することにより調製した溶液に添
加した。次いで30％過酸化水素２mLを添加し、そして混
合物を攪拌して色素分散物を生成せしめた。最終的に、
得られた色素分散物 24.75mLを水性25μＭジメドン0.25
mL及びアガロース 0.125ｇと混合して 0.5％アガロース
を含有する色素生成性組成物を生成した。アガロースが
溶解するまで組成物全体を80℃で加熱攪拌し、次いで室
温まで冷却した。
【００３６】Ｅ． プローブ試薬の調製 米国特許出願番号第 654,112号明細書（Ponticello他に
より1991年 2月12日出願）及びSutton他によるEPA 462,
644 に記載の方法を用いて、ポリ〔スチレン−コ−３−
（ｐ−ビニルベンジルチオ）プロピオン酸〕（モル比9
7.6:2.4, 重量比95:5，平均直径１μｍ）水性ポリマー
粒子分散物を調製し、そして以下本明細書に記載される
オリゴヌクレオチドをポリマー粒子の一部分に共有結合
せしめ、そして別のオリゴヌクレオチドをポリマー粒子
の別の部分に共有結合せしめた。オリゴヌクレオチドを
２つのテトラエチレングリコールスペーサー、３−アミ
ノ−１，２−プロパンジオール部分及びチミン塩基を介
してポリマー粒子に連結させた。米国特許第 4,962,029
号明細書の方法により、各オリゴヌクレオチドを３−ア
ミノ−１，２−プロパンジオール部分のアミノ基を介し
てポリマー粒子に付着せしめて試薬を生成した。
より1991年 2月12日出願）及びSutton他によるEPA 462,
644 に記載の方法を用いて、ポリ〔スチレン−コ−３−
（ｐ−ビニルベンジルチオ）プロピオン酸〕（モル比9
7.6:2.4, 重量比95:5，平均直径１μｍ）水性ポリマー
粒子分散物を調製し、そして以下本明細書に記載される
オリゴヌクレオチドをポリマー粒子の一部分に共有結合
せしめ、そして別のオリゴヌクレオチドをポリマー粒子
の別の部分に共有結合せしめた。オリゴヌクレオチドを
２つのテトラエチレングリコールスペーサー、３−アミ
ノ−１，２−プロパンジオール部分及びチミン塩基を介
してポリマー粒子に連結させた。米国特許第 4,962,029
号明細書の方法により、各オリゴヌクレオチドを３−ア
ミノ−１，２−プロパンジオール部分のアミノ基を介し
てポリマー粒子に付着せしめて試薬を生成した。
【００３７】ポリマー／オリゴヌクレオチド粒子プロー
ブを、ポリ（メチルアクリレート−コ−ナトリウム ２
−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホネート−
コ−２−アセトアセトキシエチルメタクリレート）（重
量比90:4:6）のラテックス接着剤と、粒子対接着ポリマ
ーの乾燥重量比約4/0.1 （接着剤 2.5％）で混合した。
水性分散物は固体含有量約４％であった。
ブを、ポリ（メチルアクリレート−コ−ナトリウム ２
−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホネート−
コ−２−アセトアセトキシエチルメタクリレート）（重
量比90:4:6）のラテックス接着剤と、粒子対接着ポリマ
ーの乾燥重量比約4/0.1 （接着剤 2.5％）で混合した。
水性分散物は固体含有量約４％であった。
【００３８】これらの試薬製剤を用いて、ＨＵＴ／ＨＩ
Ｖについてのアッセイ用に捕捉プローブとして試薬を含
有する一連の分析デバイスを製造した。対照試薬オリゴ
ヌクレオチド配列は、ＨＩＶゲノム由来の配列であり、
そしてナンセンス配列として使用した。このナンセンス
プローブはいかなるＨＵＴ／ＨＩＶ分析物配列も捕捉す
べきではなく、従って、対照試薬では色素の出現が全く
起こらないはずである。別のプローブ試薬配列は、ＨＵ
Ｔ／ＨＩＶ ＤＮＡのＥＮＶ領域の配列に相補的であっ
た。
Ｖについてのアッセイ用に捕捉プローブとして試薬を含
有する一連の分析デバイスを製造した。対照試薬オリゴ
ヌクレオチド配列は、ＨＩＶゲノム由来の配列であり、
そしてナンセンス配列として使用した。このナンセンス
プローブはいかなるＨＵＴ／ＨＩＶ分析物配列も捕捉す
べきではなく、従って、対照試薬では色素の出現が全く
起こらないはずである。別のプローブ試薬配列は、ＨＵ
Ｔ／ＨＩＶ ＤＮＡのＥＮＶ領域の配列に相補的であっ
た。
【００３９】上記試薬を用いて、各々試薬区画（それら
の１つは、試料分析物を最初に入れるＰＣＲ反応ブリス
ターである）、検出区画及び廃棄物貯蔵室を有する一連
の分析要素（パウチ）を生成した。分析デバイス（もし
くは要素）は、ポリ（エチレンテレフタレート）／ポリ
エチレンラミネート（SCOTCHPAK(商標)241, 3M Co.）の
シートを成形ステーション（もしくは型）で加熱してシ
ートの一方の側にきちんと配列された窪み（ブリスタ
ー）を形成し、そしてシートのもう一方の側の末端の近
くに、主溝が最終的に導かれる大きな窪みを形成し、第
１ブリスターから最後までの主溝を形成し、そして後で
カバーシートに積層する際に、得られたパウチが、Schn
ipelsky 他による前記米国特許出願番号第 673,053号明
細書に記載のデバイスに類似の窪みから主溝へ導く狭い
溝を有するように、各ブリスターから主溝までの支流溝
を形成した。各々主溝の末端の１つを除いて、各窪みを
適当な試薬組成物で満たした。カバーシートを積層して
窪み及び溝の上にカバーを形成し、そしてシールして各
窪みの間に破裂性シールを作り（最後の１つを除く）、
そしてそこから主溝へ導く溝を作った。しかしながら、
最初にカバーシートをコロナ放電で全体的に処理した。
次いで上記プローブ試薬製剤（Invention & Control)
を、各スポットが以下本明細書に記載されるように製剤
0.9〜1.1 μＬを有するように、直ちに処理表面上に４
つおきにスポットした。支持体の反対側を約95℃のアイ
ロンで加熱しながら、配置した製剤を約30秒間室温の気
流中で乾燥した。
の１つは、試料分析物を最初に入れるＰＣＲ反応ブリス
ターである）、検出区画及び廃棄物貯蔵室を有する一連
の分析要素（パウチ）を生成した。分析デバイス（もし
くは要素）は、ポリ（エチレンテレフタレート）／ポリ
エチレンラミネート（SCOTCHPAK(商標)241, 3M Co.）の
シートを成形ステーション（もしくは型）で加熱してシ
ートの一方の側にきちんと配列された窪み（ブリスタ
ー）を形成し、そしてシートのもう一方の側の末端の近
くに、主溝が最終的に導かれる大きな窪みを形成し、第
１ブリスターから最後までの主溝を形成し、そして後で
カバーシートに積層する際に、得られたパウチが、Schn
ipelsky 他による前記米国特許出願番号第 673,053号明
細書に記載のデバイスに類似の窪みから主溝へ導く狭い
溝を有するように、各ブリスターから主溝までの支流溝
を形成した。各々主溝の末端の１つを除いて、各窪みを
適当な試薬組成物で満たした。カバーシートを積層して
窪み及び溝の上にカバーを形成し、そしてシールして各
窪みの間に破裂性シールを作り（最後の１つを除く）、
そしてそこから主溝へ導く溝を作った。しかしながら、
最初にカバーシートをコロナ放電で全体的に処理した。
次いで上記プローブ試薬製剤（Invention & Control)
を、各スポットが以下本明細書に記載されるように製剤
0.9〜1.1 μＬを有するように、直ちに処理表面上に４
つおきにスポットした。支持体の反対側を約95℃のアイ
ロンで加熱しながら、配置した製剤を約30秒間室温の気
流中で乾燥した。
【００４０】実施例１：標識区画とシグナル発生性物質
区画の間にのみ存在せしめた洗浄区画 図２の態様を具体的に説明するために、16個の反復試験
片を製造した。上記の如く製造した16個の反復試験片の
各々のシートのブリスターを、以下のような実施例の試
験における試薬で満たした。
区画の間にのみ存在せしめた洗浄区画 図２の態様を具体的に説明するために、16個の反復試験
片を製造した。上記の如く製造した16個の反復試験片の
各々のシートのブリスターを、以下のような実施例の試
験における試薬で満たした。
【００４１】
【表１】
【００４２】（従って、余分な洗浄物質を供給したが、
ブリスター２からブリスター５を分離することのみに有
効であり、ブリスター１からブリスター２を分離するこ
とには有効ではなかった。）EPA 381,501 に示されるも
のに類似する比較例として（「停止溶液」区画が省略さ
れている，正確に読み取るためとしては、その段階は明
らかに不必要である）別の一組の16個の反復試験パウチ
を、第１洗液並びにブリスター２及び３中のＳＡ−ＨＲ
Ｐ接合体の位置、そして各々の量を逆にしたこと、即
ち、 350μＬの洗浄溶液及び 235μＬのＳＡ−ＨＲＰ溶
液を使用したことを除いて実施例１と同様に製造した。
ブリスター２からブリスター５を分離することのみに有
効であり、ブリスター１からブリスター２を分離するこ
とには有効ではなかった。）EPA 381,501 に示されるも
のに類似する比較例として（「停止溶液」区画が省略さ
れている，正確に読み取るためとしては、その段階は明
らかに不必要である）別の一組の16個の反復試験パウチ
を、第１洗液並びにブリスター２及び３中のＳＡ−ＨＲ
Ｐ接合体の位置、そして各々の量を逆にしたこと、即
ち、 350μＬの洗浄溶液及び 235μＬのＳＡ−ＨＲＰ溶
液を使用したことを除いて実施例１と同様に製造した。
【００４３】次いでカバーシートを積層し、そして３段
階でシールした。最初に、サンドウイッチを、試薬溶液
を含有するブリスターの周囲及び廃棄物ブリスターの周
囲のみ加圧して約 149℃で加熱することによりシールし
た。破裂性シールを包含する試料受容ＰＣＲブリスター
及び溝の成形は、約 163℃で適当な造形加熱ジョーの間
で試験パックを加熱することにより完成した。第３段階
は、試験パックの周囲のシールの形成であり、そして上
部取付板の温度 199℃で、一方下部取付板の温度は周囲
温度のままですべてのブリスター周囲シールを再シール
した。完成した試験パック（もしくは要素）中に成形さ
れた溝及びブリスターは、試薬ブリスターを含有する要
素の部分を横切ってローラーが通過すると、ブリスター
のシールが連続的に破裂し、そして各ブリスターから出
口の溝へ試薬が押し出され、それに沿って主溝へ進み、
捕捉プローブを含有する領域に導かれるように配置し
た。捕捉プローブスポット（被覆物）を含有するカバー
シートが、主溝に適当に整列したプローブ被覆物を有す
る完成した要素の底となるように、完成した要素を逆に
して、検出ステーションを形成した。４つのプローブス
ポットを、幾つかの試料で主溝の異なる部位に配置し
た。
階でシールした。最初に、サンドウイッチを、試薬溶液
を含有するブリスターの周囲及び廃棄物ブリスターの周
囲のみ加圧して約 149℃で加熱することによりシールし
た。破裂性シールを包含する試料受容ＰＣＲブリスター
及び溝の成形は、約 163℃で適当な造形加熱ジョーの間
で試験パックを加熱することにより完成した。第３段階
は、試験パックの周囲のシールの形成であり、そして上
部取付板の温度 199℃で、一方下部取付板の温度は周囲
温度のままですべてのブリスター周囲シールを再シール
した。完成した試験パック（もしくは要素）中に成形さ
れた溝及びブリスターは、試薬ブリスターを含有する要
素の部分を横切ってローラーが通過すると、ブリスター
のシールが連続的に破裂し、そして各ブリスターから出
口の溝へ試薬が押し出され、それに沿って主溝へ進み、
捕捉プローブを含有する領域に導かれるように配置し
た。捕捉プローブスポット（被覆物）を含有するカバー
シートが、主溝に適当に整列したプローブ被覆物を有す
る完成した要素の底となるように、完成した要素を逆に
して、検出ステーションを形成した。４つのプローブス
ポットを、幾つかの試料で主溝の異なる部位に配置し
た。
【００４４】実施例１及び比較例の両方とも、主溝の末
端に配置した最終洗浄区画は別のものよりも大きいもの
であり、且つ吸収剤と合わせて洗浄液用の貯蔵室とし
た。実施例１及び比較例の完成パウチを用いて、以下の
試薬製剤を評価した。各試験デバイス中のブリスターを
前記ＰＣＲ生成物の20倍（×）希釈物（ 190〜210 μ
Ｌ）で満たして以下のように処理した。
端に配置した最終洗浄区画は別のものよりも大きいもの
であり、且つ吸収剤と合わせて洗浄液用の貯蔵室とし
た。実施例１及び比較例の完成パウチを用いて、以下の
試薬製剤を評価した。各試験デバイス中のブリスターを
前記ＰＣＲ生成物の20倍（×）希釈物（ 190〜210 μ
Ｌ）で満たして以下のように処理した。
【００４５】実施例１ 分析物を予め95℃で 120秒間加熱し、そしてそのブリス
ターをローラーにかけてシールを破裂させ、溶液を検出
ステーション（プローブ被覆物）に向けて前進させた。
分析物及びプローブ試薬を検出ステーションで42℃で５
分間ハイブリダイズせしめ、一方第２ブリスター中のＳ
Ａ−ＨＲＰ接合体を予め65℃に加熱した。接合体ブリス
ターをローラーにかけ、シールを破裂させ、そして溶液
を検出領域に向けて分析物と置き換わるようにした。５
分後、予め55℃に加熱した第１洗浄溶液を含有する第３
のブリスターを破裂させ、そして洗液を検出ステーショ
ンに向け、そしてそこに５分間維持し、一方第２洗浄溶
液を予め55℃に加熱した。次いで第２洗浄溶液を含有す
るブリスターを破裂せしめ、そして洗浄液を検出ステー
ションに向けた。最終的に、予め加熱することなく色素
シグナル発生性組成物を含有するブリスターをローラー
にかけ、そしてシールを破裂せしめ、そして組成物を検
出ステーションに向け、そこで５分間インキュベーショ
ンした後に以下本明細書に記載する色チャートを用いて
色スコアを読み取った。色スコアを第Ｉ表に記録し、そ
して図５にグラフで示す。
ターをローラーにかけてシールを破裂させ、溶液を検出
ステーション（プローブ被覆物）に向けて前進させた。
分析物及びプローブ試薬を検出ステーションで42℃で５
分間ハイブリダイズせしめ、一方第２ブリスター中のＳ
Ａ−ＨＲＰ接合体を予め65℃に加熱した。接合体ブリス
ターをローラーにかけ、シールを破裂させ、そして溶液
を検出領域に向けて分析物と置き換わるようにした。５
分後、予め55℃に加熱した第１洗浄溶液を含有する第３
のブリスターを破裂させ、そして洗液を検出ステーショ
ンに向け、そしてそこに５分間維持し、一方第２洗浄溶
液を予め55℃に加熱した。次いで第２洗浄溶液を含有す
るブリスターを破裂せしめ、そして洗浄液を検出ステー
ションに向けた。最終的に、予め加熱することなく色素
シグナル発生性組成物を含有するブリスターをローラー
にかけ、そしてシールを破裂せしめ、そして組成物を検
出ステーションに向け、そこで５分間インキュベーショ
ンした後に以下本明細書に記載する色チャートを用いて
色スコアを読み取った。色スコアを第Ｉ表に記録し、そ
して図５にグラフで示す。
【００４６】比較例 各要素中に分析物を含有するブリスターを予め約95℃で
120秒間加熱し、次いでそのブリスターをローラーにか
けてシールを破裂させ、４つのプローブ試薬の固定化被
覆物を含有する領域、即ち、接着剤で付着せしめた２つ
の対照プローブ及び２つのＨＵＴ／ＨＩＶプローブに向
けて溶液を前進させた。分析物及びプローブ試薬を検出
ステーションで42℃で５分間ハイブリダイズせしめ、一
方洗浄溶液を含有するブリスターを予め55℃に加熱し
た。次いで洗浄溶液ブリスターをローラーにかけ、シー
ルを破裂させ、そして洗浄溶液を検出領域に向けて主溝
を一掃して未結合分析物を検出領域から除去した。次い
で、予め加熱することなく、ストレプトアビジン／西洋
ワサビペルオキシダーゼ接合体ブリスターをローラーに
かけ、シールを破裂させ、そして溶液を検出領域に向
け、ここで５分間に亘ってそれを固定化ビオチニル化分
析物と結合せしめた。この期間中に、第２洗浄溶液を予
め55℃に加熱し、次いでローラーを用いてブリスターの
シールを破裂せしめ、そして洗浄液を検出ステーション
に向け、そこでそれを未結合標識と置き換えた。最終的
に、ローラーを用いて最終ブリスター中の色素シグナル
発生性組成物のシールを破裂せしめ、そして流体を検出
ステーションに向け、そこでそれを第２洗浄溶液と置き
換えた。５分間プローブ被覆物上で色素生成を行ってか
ら、色濃度スコアを読み取った。各プローブ被覆物の色
を、０が濃度なしであり且つ10が最高濃度である色チャ
ートを用いて湿潤色素濃度の比較により評価した。色ス
コアを第II表に記録し、そして図６のグラフに図示す
る。（第Ｉ表及び第II表の「ＬＴＲ」及び「ＥＶＮ」の
語は、それぞれ、対照ナンセンスプローブ被覆物及び分
析物中のＨＩＶゲノムのＥＶＮ領域に相補的なプローブ
被覆物を表す。これらは、検出区画中の各々４つのビー
ズ部位を表す。左から右へ、以下の液体が出会う最初の
ビーズは「ＬＴＲ」である。第２のビーズは「ＥＮＶ」
であり、第３のビーズは「ＬＴＲ」であり、そして最後
は右手側の縦欄中の「ＥＮＶ」である。）
120秒間加熱し、次いでそのブリスターをローラーにか
けてシールを破裂させ、４つのプローブ試薬の固定化被
覆物を含有する領域、即ち、接着剤で付着せしめた２つ
の対照プローブ及び２つのＨＵＴ／ＨＩＶプローブに向
けて溶液を前進させた。分析物及びプローブ試薬を検出
ステーションで42℃で５分間ハイブリダイズせしめ、一
方洗浄溶液を含有するブリスターを予め55℃に加熱し
た。次いで洗浄溶液ブリスターをローラーにかけ、シー
ルを破裂させ、そして洗浄溶液を検出領域に向けて主溝
を一掃して未結合分析物を検出領域から除去した。次い
で、予め加熱することなく、ストレプトアビジン／西洋
ワサビペルオキシダーゼ接合体ブリスターをローラーに
かけ、シールを破裂させ、そして溶液を検出領域に向
け、ここで５分間に亘ってそれを固定化ビオチニル化分
析物と結合せしめた。この期間中に、第２洗浄溶液を予
め55℃に加熱し、次いでローラーを用いてブリスターの
シールを破裂せしめ、そして洗浄液を検出ステーション
に向け、そこでそれを未結合標識と置き換えた。最終的
に、ローラーを用いて最終ブリスター中の色素シグナル
発生性組成物のシールを破裂せしめ、そして流体を検出
ステーションに向け、そこでそれを第２洗浄溶液と置き
換えた。５分間プローブ被覆物上で色素生成を行ってか
ら、色濃度スコアを読み取った。各プローブ被覆物の色
を、０が濃度なしであり且つ10が最高濃度である色チャ
ートを用いて湿潤色素濃度の比較により評価した。色ス
コアを第II表に記録し、そして図６のグラフに図示す
る。（第Ｉ表及び第II表の「ＬＴＲ」及び「ＥＶＮ」の
語は、それぞれ、対照ナンセンスプローブ被覆物及び分
析物中のＨＩＶゲノムのＥＶＮ領域に相補的なプローブ
被覆物を表す。これらは、検出区画中の各々４つのビー
ズ部位を表す。左から右へ、以下の液体が出会う最初の
ビーズは「ＬＴＲ」である。第２のビーズは「ＥＮＶ」
であり、第３のビーズは「ＬＴＲ」であり、そして最後
は右手側の縦欄中の「ＥＮＶ」である。）
【００４７】
【表２】
【００４８】
【表３】
【００４９】容易に認められるように、特に図５及び図
６の比較から、検出部位へ増幅された核酸物質をハイブ
リダイズした後の、及び標識試薬を添加する前の洗浄段
階の排除は、結果に害を及ぼさない。実際に、良い結果
が生じた。定量的には、これもまた、16個の反復試験片
すべてについての実施例１の第２及び第４のビーズ「Ｅ
ＮＶ」を平均して比較例のものと比較することにより認
めることができる。実施例１については、平均が 6.0及
び5.69であり、それに対して比較例については平均が両
方の場合について5.44であった。
６の比較から、検出部位へ増幅された核酸物質をハイブ
リダイズした後の、及び標識試薬を添加する前の洗浄段
階の排除は、結果に害を及ぼさない。実際に、良い結果
が生じた。定量的には、これもまた、16個の反復試験片
すべてについての実施例１の第２及び第４のビーズ「Ｅ
ＮＶ」を平均して比較例のものと比較することにより認
めることができる。実施例１については、平均が 6.0及
び5.69であり、それに対して比較例については平均が両
方の場合について5.44であった。
【００５０】上記結果は、特定のアッセイに限られる訳
ではない−またそれらは、例えば、ＣＭＶ（サイトメガ
ロウイルス）についてアッセイするときにも起こる。ど
のようなアッセイが１つ又は両方の洗浄段階を排除でき
ることを示すために使用されるかということは重要では
ないと信じられているので、オリゴヌクレオチド配列は
特に同定していない。
ではない−またそれらは、例えば、ＣＭＶ（サイトメガ
ロウイルス）についてアッセイするときにも起こる。ど
のようなアッセイが１つ又は両方の洗浄段階を排除でき
ることを示すために使用されるかということは重要では
ないと信じられているので、オリゴヌクレオチド配列は
特に同定していない。
【００５１】図１に示したパウチを製造して、実施例１
のものと比較可能な結果が、第２洗浄区画を省略する場
合にも得られることを示している。即ち、そのようなパ
ウチでは、洗浄区画及び洗浄段階は、標識区画及び段階
（ＳＡ−ＨＲＰを用いる）とシグナル発生性物質区画及
び段階（ロイコ色素及びH2O2を用いる）との間にのみ存
在する。
のものと比較可能な結果が、第２洗浄区画を省略する場
合にも得られることを示している。即ち、そのようなパ
ウチでは、洗浄区画及び洗浄段階は、標識区画及び段階
（ＳＡ−ＨＲＰを用いる）とシグナル発生性物質区画及
び段階（ロイコ色素及びH2O2を用いる）との間にのみ存
在する。
【００５２】同様に、そのような、唯一の洗浄区画を有
するがそれが核酸物質を増幅するために使用される反応
区画と標識区画との間に配置されている４−区画パウチ
が、各反応区画（ハイブリダイゼーション段階）及び標
識区画（標識段階）の後に洗浄区画（及び段階）を有す
る従来の構造と比較可能である結果を生じることが認め
られている。
するがそれが核酸物質を増幅するために使用される反応
区画と標識区画との間に配置されている４−区画パウチ
が、各反応区画（ハイブリダイゼーション段階）及び標
識区画（標識段階）の後に洗浄区画（及び段階）を有す
る従来の構造と比較可能である結果を生じることが認め
られている。
【００５３】実施例２：実施例１のパウチと洗浄溶液を
全く含有しないパウチとの比較 以下のことを除いて実施例１の方法により二組のＰＣＲ
分析パウチを製造した。 １．第３プローブ組成物を、ＨＵＴ／ＨＩＶ ＤＮＡの
ＧＡＧ領域由来の配列に相補的な配列を含めて実施例１
の方法により調製した。
全く含有しないパウチとの比較 以下のことを除いて実施例１の方法により二組のＰＣＲ
分析パウチを製造した。 １．第３プローブ組成物を、ＨＵＴ／ＨＩＶ ＤＮＡの
ＧＡＧ領域由来の配列に相補的な配列を含めて実施例１
の方法により調製した。
【００５４】２．各々３つのプローブの唯一のスポット
（被覆物）を、（１）上記ＧＡＧ領域由来の新規プロー
ブ、（２）実施例１の対照プローブ、そして（３）実施
例１の試薬プローブ、の順序で各要素に取り入れた。 ３．一組のパウチが、実施例１の逆洗浄フォーマットの
５−ブリスターパウチであり（第２ブリスター中にＳＡ
−ＨＲＰ接合体があり、且つ第３ブリスター中に洗浄液
がある）、そしてその組のパウチを実施例１に記載のよ
うに処理した。
（被覆物）を、（１）上記ＧＡＧ領域由来の新規プロー
ブ、（２）実施例１の対照プローブ、そして（３）実施
例１の試薬プローブ、の順序で各要素に取り入れた。 ３．一組のパウチが、実施例１の逆洗浄フォーマットの
５−ブリスターパウチであり（第２ブリスター中にＳＡ
−ＨＲＰ接合体があり、且つ第３ブリスター中に洗浄液
がある）、そしてその組のパウチを実施例１に記載のよ
うに処理した。
【００５５】４．第２組のパウチは、図３に示されるよ
うに、３つの試薬区画のみを使用し、全く洗浄区画を使
用しなかった。それらは、プール由来の分析物組成物を
包含する同様の組成物、及び実施例１の第１組（従来の
洗浄フォーマットの組）の要素中の対応する組成物と同
じ量を含み、そしてブリスターは以下の順序であった。
うに、３つの試薬区画のみを使用し、全く洗浄区画を使
用しなかった。それらは、プール由来の分析物組成物を
包含する同様の組成物、及び実施例１の第１組（従来の
洗浄フォーマットの組）の要素中の対応する組成物と同
じ量を含み、そしてブリスターは以下の順序であった。
【００５６】
【表４】 残りのブリスターもしくは区画は空のままであった。
【００５７】第２組のパウチを以下のように処理した。
ＰＣＲブリスター中の分析物を予め95℃で 120秒間加熱
し、そしてそのブリスターをローラーにかけてシールを
破裂させ、分析物を検出ステーション中の３つのプロー
ブ被覆物に向けて前進させた。42℃で５分間ハイブリダ
イゼーションを行い、一方第２ブリスター中のＳＡ−Ｈ
ＲＰ溶液を予め65℃に加熱した。次いで第２ブリスター
をローラーにかけてシールを破裂させ、そして溝を介し
て溶液を検出ステーションに向けた。接合体を５分間検
出ステーションでインキュベーションし、次いで、予め
加熱することなく、色素生成性検出分散物を含有するブ
リスターをローラーにかけ、シールを破裂させ、そして
分散物を検出ステーションに向けてＳＡ−ＨＲＰと置き
換えた。検出ステーション中の色素分散物を５分間イン
キュベーションした後、実施例１のように色チャートを
用いて色スコアを読み取った。両組の要素の色スコアを
第IIＡ表及び第IIＢ表に記録し、そして図７及び図８に
それぞれグラフで示す。
ＰＣＲブリスター中の分析物を予め95℃で 120秒間加熱
し、そしてそのブリスターをローラーにかけてシールを
破裂させ、分析物を検出ステーション中の３つのプロー
ブ被覆物に向けて前進させた。42℃で５分間ハイブリダ
イゼーションを行い、一方第２ブリスター中のＳＡ−Ｈ
ＲＰ溶液を予め65℃に加熱した。次いで第２ブリスター
をローラーにかけてシールを破裂させ、そして溝を介し
て溶液を検出ステーションに向けた。接合体を５分間検
出ステーションでインキュベーションし、次いで、予め
加熱することなく、色素生成性検出分散物を含有するブ
リスターをローラーにかけ、シールを破裂させ、そして
分散物を検出ステーションに向けてＳＡ−ＨＲＰと置き
換えた。検出ステーション中の色素分散物を５分間イン
キュベーションした後、実施例１のように色チャートを
用いて色スコアを読み取った。両組の要素の色スコアを
第IIＡ表及び第IIＢ表に記録し、そして図７及び図８に
それぞれグラフで示す。
【００５８】データは、３−ブリスターパウチ配置が５
−ブリスター（実施例１の洗浄パウチフォーマット）の
ものと比較可能な陽性シグナルを与えるが、しかしなが
ら、ナンセンス（対照）ビーズでわずかに高いシグナル
を与えることを示す。これは、大量の色素生成性検出分
散物を用いることにより３−ブリスター配置で低減又は
排除できる。３−ブリスター配置は少量の試薬の使用、
より低い単位製造経費、狭いパウチ保存スペース、短い
処理時間、並びにより小さくあまり複雑ではない処理装
置を許容する。
−ブリスター（実施例１の洗浄パウチフォーマット）の
ものと比較可能な陽性シグナルを与えるが、しかしなが
ら、ナンセンス（対照）ビーズでわずかに高いシグナル
を与えることを示す。これは、大量の色素生成性検出分
散物を用いることにより３−ブリスター配置で低減又は
排除できる。３−ブリスター配置は少量の試薬の使用、
より低い単位製造経費、狭いパウチ保存スペース、短い
処理時間、並びにより小さくあまり複雑ではない処理装
置を許容する。
【００５９】
【表５】
【００６０】
【発明の効果】以前は所望の結果を得るために必要であ
ると考えられていた少なくとも１つの洗浄段階を回避す
る、核酸物質を増幅及び検出するための方法及びデバイ
スを提供することが、本発明の優れた技術効果である。
ると考えられていた少なくとも１つの洗浄段階を回避す
る、核酸物質を増幅及び検出するための方法及びデバイ
スを提供することが、本発明の優れた技術効果である。
【図１】図１は、本発明に従って構成された反応デバイ
スの平面図である。
スの平面図である。
【図２】図２は、図１のものと同様の平面図であるが、
本発明の別の様式を示すものである。
本発明の別の様式を示すものである。
【図３】図３は、図１のものと同様の平面図であるが、
本発明の別の様式を示すものである。
本発明の別の様式を示すものである。
【図４】図４は、本発明について仮定されたメカニズム
を具体的に説明する部分断面図である。
を具体的に説明する部分断面図である。
【図５】図５は、本発明の実施中に達成された反復色ス
コアを示すグラフである。
コアを示すグラフである。
【図６】図６は、比較例の実施中に達成された反復色ス
コアを示すグラフである。
コアを示すグラフである。
【図７】図７は、本発明の実施中に達成された反復色ス
コアを示すグラフである。
コアを示すグラフである。
【図８】図８は、本発明の実施中に達成された反復色ス
コアを示すグラフである。
コアを示すグラフである。
【図９】図９は、図２のものと同様の平面図であるが、
実施例に使用した変形パウチを示すものである。
実施例に使用した変形パウチを示すものである。
１０…デバイス ２１…通路 ２２…入口 ２５…シール ２６…ＰＣＲ反応区画 ３０…区画 ３２…区画 ３４…区画 ３６…区画 ４０…検出室 ４１…検出部位 ４２…廃棄物収集区画 ４４…通路 ４８…通路 ５０…通路 ５２…通路 ５６…シール ６０…ローラー ７０…コーナー ７２…折り曲げ線 ７４…孔 １００…スラッグ １０２…メニスカス １０４…矢印 １１０…読み取り領域又は検出領域
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジョン ブルース フィンドレイ アメリカ合衆国，ニューヨーク 14612, ロチェスター，クロスローズ レーン 148 (72)発明者 スーザン メリッサ アトウッド アメリカ合衆国，ニューヨーク 14543, ラッシュ，ホネオイ フォールズ シック ス ロード 365 (72)発明者 リン バーグメイヤー アメリカ合衆国，ニューヨーク 14616, ローチェスター，ロングリッジ アベニュ 187 (72)発明者 ジョン ベンジャミン チメリ アメリカ合衆国，ニューヨーク 14580, ウェブスター，ジョイレーン ドライブ 922
Claims (2)
- 【請求項１】 少なくとも１つの固定化プローブを含む
検出部位に増幅された核酸物質をハイブリダイズせし
め、シグナル発生性物質であるか又はそれを活性化して
シグナルを生成する標識を該部位に持ってくることによ
りハイブリダイズして固定化せしめた核酸物質を標識
し、その後にシグナル発生性物質を該部位に添加して検
出可能なシグナルを生成することにより増幅された核酸
物質を検出する方法であって、 標識段階が、ハイブリダイゼーション段階の後に、間に
洗浄段階を必要とすることなく直接用いられるか、又は
添加段階が、標識段階の後に、間に洗浄段階を必要とす
ることなく直接用いられる方法。 - 【請求項２】 増幅された核酸物質を検出するための検
出部位並びに標識及び共同して検出可能なシグナルを発
生するのに有効であるシグナル発生性物質を含有する保
存区画を含む複数の区画、並びに区画と部位を流動的に
連絡するための通路を含んでなり、 更に、実質的に捕捉体、標識及びシグナル発生性試薬を
含まない洗浄液を含有する１つ以下の洗浄区画、及び保
存もしくは反応区画に使用されるシグナル発生性試薬、
並びに洗浄区画と検出部位を連絡する１つ以下の通路を
含み、 そして、１つ以下の洗浄段階が、区画の内容物を空にし
て検出部位へ移動せしめることを含む一連の段階に使用
される、 鋳型として少なくとも１つの標的鎖を用いて核酸物質を
増幅及び検出するためのデバイス。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US96568392A | 1992-10-23 | 1992-10-23 | |
| US965683 | 1992-10-23 | ||
| US979569 | 1992-11-20 | ||
| US07/979,569 US5422271A (en) | 1992-11-20 | 1992-11-20 | Nucleic acid material amplification and detection without washing |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06197797A true JPH06197797A (ja) | 1994-07-19 |
| JP3795540B2 JP3795540B2 (ja) | 2006-07-12 |
Family
ID=27130480
Family Applications (1)
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Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002513936A (ja) * | 1998-05-01 | 2002-05-14 | ジェン−プロウブ インコーポレイテッド | 自動化診断用分析器および方法 |
| US7547516B2 (en) | 2005-03-10 | 2009-06-16 | Gen-Probe Incorporated | Method for reducing the presence of amplification inhibitors in a reaction receptacle |
| US8840848B2 (en) | 2010-07-23 | 2014-09-23 | Beckman Coulter, Inc. | System and method including analytical units |
| US8973736B2 (en) | 2011-11-07 | 2015-03-10 | Beckman Coulter, Inc. | Magnetic damping for specimen transport system |
| US9046507B2 (en) | 2010-07-29 | 2015-06-02 | Gen-Probe Incorporated | Method, system and apparatus for incorporating capacitive proximity sensing in an automated fluid transfer procedure |
| US9046506B2 (en) | 2011-11-07 | 2015-06-02 | Beckman Coulter, Inc. | Specimen container detection |
| JP2015154791A (ja) * | 2009-03-19 | 2015-08-27 | 株式会社カネカ | 核酸の検出方法及びキット、デバイス |
| US9446418B2 (en) | 2011-11-07 | 2016-09-20 | Beckman Coulter, Inc. | Robotic arm |
| US9482684B2 (en) | 2011-11-07 | 2016-11-01 | Beckman Coulter, Inc. | Centrifuge system and workflow |
| US9506943B2 (en) | 2011-11-07 | 2016-11-29 | Beckman Coulter, Inc. | Aliquotter system and workflow |
| US9910054B2 (en) | 2011-11-07 | 2018-03-06 | Beckman Coulter, Inc. | System and method for processing samples |
| US9915613B2 (en) | 2011-02-24 | 2018-03-13 | Gen-Probe Incorporated | Systems and methods for distinguishing optical signals of different modulation frequencies in an optical signal detector |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10006214A1 (de) | 2000-02-11 | 2001-08-16 | Roche Diagnostics Gmbh | System zur einfachen Nukleinsäureanalytik |
| TW200712495A (en) * | 2005-08-02 | 2007-04-01 | 3M Innovative Properties Co | Apparatus and method for detecting an analyte |
| TW200714898A (en) | 2005-08-02 | 2007-04-16 | 3M Innovative Properties Co | Apparatus and method for detecting an analyte |
| US9125093B2 (en) | 2005-12-22 | 2015-09-01 | Qualcomm Incorporated | Methods and apparatus related to custom control channel reporting formats |
| WO2009002447A1 (en) | 2007-06-21 | 2008-12-31 | Gen-Probe Incorporated | Instrument and receptacles for use in performing processes |
| EP2138233B1 (de) * | 2008-06-02 | 2010-10-20 | Boehringer Ingelheim microParts GmbH | Mikrofluidische Folienstruktur zum Dosierren von Flüssigkeiten |
| RU2518070C2 (ru) * | 2009-04-27 | 2014-06-10 | Телефонактиеболагет Л М Эрикссон (Пабл) | Способы и устройства в системе беспроводной связи |
| US8780688B2 (en) | 2009-04-27 | 2014-07-15 | Telefonaktiebolaget Lm Ericsson (Publ) | Methods and apparatus in a wireless communication system |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH037571A (ja) * | 1989-02-03 | 1991-01-14 | Eastman Kodak Co | Ｐｃｒ用の封入キュベットおよびその使用方法 |
| JPH03502167A (ja) * | 1989-02-03 | 1991-05-23 | イーストマン コダック カンパニー | 核酸試験片及び所定の核酸を検出するためのその使用 |
| WO1992016659A1 (en) * | 1991-03-21 | 1992-10-01 | Eastman Kodak Company | Element and method for nucleic acid amplification and detection using adhered probes |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4902624A (en) * | 1987-11-23 | 1990-02-20 | Eastman Kodak Company | Temperature cycling cuvette |
| WO1992011390A1 (en) * | 1990-12-17 | 1992-07-09 | Idexx Laboratories, Inc. | Nucleic acid sequence detection by triple helix formation |
| EP0572057A1 (en) * | 1992-05-11 | 1993-12-01 | Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. | PCR reagent composition, test kit and methods for amplification and detection with reduced nonspecific amplification of nucleic acids |
-
1993
- 1993-08-31 TW TW082107088A patent/TW313588B/zh not_active IP Right Cessation
- 1993-10-21 EP EP93202962A patent/EP0594260B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-10-21 DK DK93202962T patent/DK0594260T3/da active
- 1993-10-21 DE DE69317502T patent/DE69317502T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-10-22 FI FI934669A patent/FI934669L/fi unknown
- 1993-10-22 JP JP26481393A patent/JP3795540B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH037571A (ja) * | 1989-02-03 | 1991-01-14 | Eastman Kodak Co | Ｐｃｒ用の封入キュベットおよびその使用方法 |
| JPH03502167A (ja) * | 1989-02-03 | 1991-05-23 | イーストマン コダック カンパニー | 核酸試験片及び所定の核酸を検出するためのその使用 |
| WO1992016659A1 (en) * | 1991-03-21 | 1992-10-01 | Eastman Kodak Company | Element and method for nucleic acid amplification and detection using adhered probes |
Cited By (39)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7560256B2 (en) | 1998-05-01 | 2009-07-14 | Gen-Probe Incorporated | Automated process for detecting the presence of a target nucleic acid in a sample |
| JP2002513936A (ja) * | 1998-05-01 | 2002-05-14 | ジェン−プロウブ インコーポレイテッド | 自動化診断用分析器および方法 |
| US7384600B2 (en) | 1998-05-01 | 2008-06-10 | Gen-Probe Incorporated | Multiple ring assembly for providing specimen to reaction receptacles within an automated analyzer |
| US7396509B2 (en) | 1998-05-01 | 2008-07-08 | Gen-Probe Incorporated | Instrument for detecting light emitted by the contents of a reaction receptacle |
| US7482143B2 (en) | 1998-05-01 | 2009-01-27 | Gen-Probe Incorporated | Automated process for detecting the presence of a target nucleic acid in a sample |
| US7524652B2 (en) | 1998-05-01 | 2009-04-28 | Gen-Probe Incorporated | Automated process for detecting the presence of a target nucleic acid in a sample |
| US9150908B2 (en) | 1998-05-01 | 2015-10-06 | Gen-Probe Incorporated | Method for detecting the presence of a nucleic acid in a sample |
| US7560255B2 (en) | 1998-05-01 | 2009-07-14 | Gen-Probe Incorporated | Automated process for detecting the presence of a target nucleic acid in a sample |
| US7267795B2 (en) | 1998-05-01 | 2007-09-11 | Gen-Probe Incorporated | Incubator for use in an automated diagnostic analyzer |
| US9598723B2 (en) | 1998-05-01 | 2017-03-21 | Gen-Probe Incorporated | Automated analyzer for performing a nucleic acid-based assay |
| US7638337B2 (en) | 1998-05-01 | 2009-12-29 | Gen-Probe Incorporated | System for agitating the fluid contents of a container |
| US8883455B2 (en) | 1998-05-01 | 2014-11-11 | Gen-Probe Incorporated | Method for detecting the presence of a nucleic acid in a sample |
| US9726607B2 (en) | 2005-03-10 | 2017-08-08 | Gen-Probe Incorporated | Systems and methods for detecting multiple optical signals |
| US10006862B2 (en) | 2005-03-10 | 2018-06-26 | Gen-Probe Incorporated | Continuous process for performing multiple nucleic acid amplification assays |
| US9372156B2 (en) | 2005-03-10 | 2016-06-21 | Gen-Probe Incorporated | System for processing contents of a receptacle to detect an optical signal emitted by the contents |
| US7547516B2 (en) | 2005-03-10 | 2009-06-16 | Gen-Probe Incorporated | Method for reducing the presence of amplification inhibitors in a reaction receptacle |
| US10073040B2 (en) | 2009-03-19 | 2018-09-11 | Kaneka Corporation | Method for detecting nucleic acid, and device or kit |
| JP2015154791A (ja) * | 2009-03-19 | 2015-08-27 | 株式会社カネカ | 核酸の検出方法及びキット、デバイス |
| US9046455B2 (en) | 2010-07-23 | 2015-06-02 | Beckman Coulter, Inc. | System and method including multiple processing lanes executing processing protocols |
| US9519000B2 (en) | 2010-07-23 | 2016-12-13 | Beckman Coulter, Inc. | Reagent cartridge |
| US8840848B2 (en) | 2010-07-23 | 2014-09-23 | Beckman Coulter, Inc. | System and method including analytical units |
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| US9046506B2 (en) | 2011-11-07 | 2015-06-02 | Beckman Coulter, Inc. | Specimen container detection |
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| US9446418B2 (en) | 2011-11-07 | 2016-09-20 | Beckman Coulter, Inc. | Robotic arm |
| US9910054B2 (en) | 2011-11-07 | 2018-03-06 | Beckman Coulter, Inc. | System and method for processing samples |
| US8973736B2 (en) | 2011-11-07 | 2015-03-10 | Beckman Coulter, Inc. | Magnetic damping for specimen transport system |
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| US10274505B2 (en) | 2011-11-07 | 2019-04-30 | Beckman Coulter, Inc. | Robotic arm |
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| Publication number | Publication date |
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